ES2205481T3 - Microparticulas biodegradables para la liberacion sostenida de farmacos terapeuticos. - Google Patents
Microparticulas biodegradables para la liberacion sostenida de farmacos terapeuticos.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a procedimientos que mejoran la producción de micropartículas de polímeros que contienen una variedad de ingredientes activos, por ejemplo medicamentos proteínicos. Además la presente invención se refiere al empleo de las anteriores proteínas activas que contienen micropartículas de polímeros para preparar composiciones para suministro sostenido de productos terapéuticos.
Description
Micropartículas biodegradables para la liberación
sostenida de fármacos terapeúticos.
La presente invención se refiere en general a
procedimientos mejorados para fabricar micropartículas poliméricas
biodegradables que contienen un principio activo. Además la
presente invención se refiere a la utilización de dichas
micropartículas para preparar composiciones para la administración
prolongada de fármacos.
Debido a los avances recientes en las tecnologías
de ingeniería genética y celular, se pueden producir en grandes
cantidades proteínas conocidas por presentar diversas acciones
farmacológicas in vivo para aplicaciones farmacéuticas.
Dichas proteínas incluyen la eritropoyetina (EPO), el factor
estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF),
interferones (alfa, beta, gamma, de consenso), proteína que se al
factor de necrosis tumoral (TNFbp), antagonista del receptor de
interleucina-1 (IL-1ra), factor
neurotrófico obtenido del cerebro (BDNF), factor de crecimiento de
queratinocitos (KGF), factor de células madre (SCF), factor de
diferenciación de crecimiento de megacariocitos (MGDF),
osteoprotegerina (OPG), factor neurotrófico procedente de líneas
celulares gliales (GDNF) y proteína de la obesidad (proteína OB). La
proteína OB se puede también denominar leptina en la presente
memoria.
Debido a que estas proteínas presentan
generalmente vidas medias cortas in vivo, y
biodisponibilidad oral insignificante, se administran típicamente
mediante inyección frecuente, poniendo de este modo una carga
física importante sobre el paciente y los costos administrativos
asociados. Propiamente dicho, existe actualmente mucho interés en
desarrollar y evaluar formulaciones de liberación lenta. Las
formulaciones de liberación lenta eficaces pueden proporcionar un
medio para controlar las concentraciones en sangre del principio
activo, y además proporcionar mayor eficacia, seguridad,
conveniencia y conformidad del paciente. Desgraciadamente, la
inestabilidad de la mayoría de las proteínas, (p. ej.: la
desnaturalización y pérdida de bioactividad por exposición al
calor, a los disolventes orgánicos, etc.) ha limitado en gran
medida el desarrollo y la evaluación de las formulaciones de
liberación lenta.
Los intentos para desarrollar formulaciones de
liberación lenta han incluido la utilización de una variedad de
micropartículas de polímeros biodegradables y no biodegradables (p.
ej.:
poli(lactida-co-glucolida))
que contienen el principio activo (véase p. ej.: Wise et al.,
Contraception, 8:227-234 (1973) y
Hutchinson et al., Biochem. Soc. Tans.,
13:520-523 (1985) y se conocen una variedad
de técnicas mediante las cuales se pueden incorporar principios
activos, p. ej.: proteínas, dentro de microesferas poliméricas
(véase p. ej.: la patente U.S. nº 4.675.189 y referencias citadas en
la presente memoria).
Una tal técnica es el secado por pulverización,
en la que el polímero y el principio activo se mezclan
conjuntamente en un disolvente del polímero y a continuación se
evapora el disolvente pulverizando la solución, dejando gotitas de
polímero que contienen el principio activo. Para un examen
detallado del secado por pulverización véase Master, K.,
"Spray Drying Handbook" (John Wiley & Sons, eds.,
Nueva York 1984). Aunque la técnica de secado por pulverización ha
demostrado ser útil en determinados casos, todavía adolece del
hecho de que las proteínas biológicamente activas se desnaturalizan
con frecuencia debido al contacto con el polímero orgánico y el
disolvente o debido al calor generado durante los procesos de
secado por pulverización.
Otra técnica que se puede utilizar para formar
microesferas es la evaporación del disolvente. La evaporación del
disolvente implica la disolución del polímero en un disolvente
orgánico que contiene el principio activo disuelto o dispersado. La
mezcla polímero/principio activo se añade a continuación a una fase
continua agitada que es típicamente acuosa. Se incluyen
emulsionantes en la fase acuosa para estabilizar la emulsión aceite
en agua. El disolvente orgánico se evapora a continuación durante
un periodo de varias horas o más, depositando de este modo el
polímero en torno al material del núcleo. Para un examen completo
del procedimiento de evaporación del disolvente véase p. ej.: la
patente U.S. nº 4.389.330 (y las referencias citadas en la presente
memoria). Como en la técnica de secado por pulverización, las
técnicas de evaporización del disolvente han demostrado ser útiles
en determinados casos. Sin embargo, con frecuencia no se prefiere
esta técnica debido a que, con frecuencia, se pierde el principio
activo durante el proceso de extracción del disolvente. Esto es
debido a que el proceso implica la emulsificación en una fase
acuosa y un fármaco soluble en agua se repartirá con frecuencia
rápidamente desde la fase de la solución con el polímero más
hidrófobo en el medio acuoso.
Todavía otra técnica que se puede utilizar para
formar microesferas es la separación de fase, que implica la
formación de una emulsión de agua en aceite o una emulsión de
aceite en agua. Se precipita el polímero procedente de la fase
continua sobre el principio activo mediante un cambio de
temperatura, pH, fuerza iónica o adición de precipitantes. Para un
examen de las técnicas de separación de fase, véase p. ej.: la
patente U.S. nº 4.675.800 (y las referencias citadas en la presente
memoria). De nuevo, este proceso adolece principalmente de pérdida
del principio activo debido a la desnaturalización.
Las características de liberación del principio
activo procedente de las micropartículas preparadas mediante
procedimientos tales como los descritos anteriormente pueden ser
continuas o discontinuas, y en algunos casos, la concentración
inicial de liberación del principio activo es demasiado alta o
demasiado baja. Por lo tanto, se utilizan con frecuencia varios
aditivos en un intento de controlar la liberación del principio
activo (véase p. ej.: la patente EP 0 761 211 A1, publicada el 12 de
marzo de 1997).
El documento EP 0442671 A2 describe las
microcápsulas de liberación prolongada producidas preparando una
emulsión de agua en aceite. La emulsión comprende una capa acuosa
interna que contiene un polipéptido fisiológicamente activo y una
capa de aceite que contiene un copolímero u homopolímero. La
emulsión de agua en aceite se somete a microencapsulación para
preparar las microcápsulas.
Para evitar la desnaturalización de las proteínas
y de otras moléculas biológicas frágiles que aparecen en el secado
por pulverización, evaporación del disolvente o separación de
fases mediante técnicas clásicas, se puede atomizar la emulsión de
polímeros y de principio activo en un recubrimiento no disolvente
congelado con gas licuado tal como nitrógeno para formar partículas
y a continuación extraer a muy bajas temperaturas. Las temperaturas
extremadamente bajas del tratamiento pueden preservar la actividad
e integridad de las moléculas biológicas frágiles tales como las
proteínas. Sin embargo, el procedimiento conduce a eficacias y
rendimientos de carga reducidos, que producen la pérdida de
material biológico valioso, y es incómodo, difícil y costoso de
realizar a las grandes escalas necesarias para la producción
comercial.
Existe claramente todavía la necesidad de un
procedimiento mejorado para preparar micropartículas poliméricas
que contienen un principio activo que es sencillo, económico,
versátil y, lo más importante, que protege frente a la pérdida de
actividad de la proteína y que proporciona grandes eficacias y
rendimientos de carga, permitiendo de este modo la liberación del
principio activo más constante durante un periodo de tiempo
prolongado.
Como se describe de forma completa más adelante,
la presente invención proporciona un procedimiento mejorado para
preparar micropartículas poliméricas que contienen un principio
activo para utilización exclusiva de la liofilización directa de
la emulsión o de la suspensión. Este procedimiento mejorado aporta
varias ventajas significativas sobre los procedimientos descritos en
la materia, incluyendo, por ejemplo, 1) facilidad de fabricación
del principio activo cargado en las micropartículas (es decir,
menos o menores etapas incómodas); y 2) la provisión de
formulaciones de liberación lenta que mantienen la actividad e
integridad del principio activo durante la liberación,
proporcionando de este modo la liberación controlada del principio
activo durante un periodo prolongado de tiempo. Además, los
procedimientos de la invención proporcionan las ventajas de
versatibilidad referidas a la clase de polímeros y/o principio
activo que se pueden utilizar, además de la consecución de altos
rendimientos, cargas elevadas y mayores eficacias de carga.
Por consiguiente, un aspecto de la presente
invención se refiere a un procedimiento nuevo y mejorado para
preparar una composición que comprende un principio activo contenido
dentro de micropartículas poliméricas, en la que se dispersan una
mezcla de principio activo y de polímero en una fase continua, la
dispersión resultante se congela y el agua y los disolventes
orgánicos se separan de la dispersión por liofilización. De forma
significativa, el presente procedimiento es más refinado y más
simple que los descritos en la técnica y la actividad e integridad
del principio activo se mantiene durante todo el procedimiento.
El presente procedimiento se puede describir
generalmente comprendiendo las etapas de: (a) preparar una solución
polimérica; (b) añadir un principio activo para producir una
mezcla; (c) dispersar dicha mezcla en una fase continua, es decir
sin disolvente(s), para producir una dispersión; (d) añadir
un excipiente a dicha dispersión; (e) congelar dicha dispersión
para producir una mezcla congelada; y (f) liofilizar dicha mezcla
congelada para producir el principio activo deseado que contiene
micropartículas. Por otra parte, se puede omitir la etapa (b) y las
micropartículas del "blanco" preparadas, en las que el
principio activo se carga a continuación poniendo en suspensión las
micropartículas del blanco en la solución de principio activo.
Un segundo aspecto de la presente invención es
una composición farmacéutica para la liberación lenta de un
principio activo que comprende un principio biológicamente activo
contenido dentro de las partículas poliméricas, o, como alternativa,
un principio biológicamente activo cargado en las partículas
poliméricas. De forma importante, las composiciones de liberación
lenta de la presente invención mantienen la actividad e integridad
de principio activo durante la encapsulación y liberación, lo que
ayuda a proporcionar periodos más prolongados de liberación
constante.
Según la presente invención, se aporta un
procedimiento para preparar una composición que comprende un
principio activo contenido dentro de micropartículas poliméricas,
en el que se dispersa una mezcla de principio activo y de polímero
dentro de una fase continua, la dispersión resultante se congela y
el agua y los disolventes orgánicos se separan de la dispersión por
liofilización.
Ventajosamente, dicha fase continua es acuosa u
orgánica o una mezcla de las mismas.
Preferentemente, la mezcla principio
activo-polímero se obtiene dispersando una solución
acuosa del principio activo en una segunda fase no acuosa que
contiene el polímero, antes de la adición de la fase continua.
Convenientemente, la mezcla de principio
activo-polímero se obtiene disolviendo ambos
componentes en un disolvente no acuoso antes de la adición a la fase
continua.
Preferentemente, el principio activo está
presente como una dispersión de partículas sólidas en una solución
no acuosa del polímero, que se añade a continuación a la fase
continua.
Según la presente invención, se proporciona
además un procedimiento para preparar una composición que comprende
micropartículas poliméricas del blanco en las que se dispersa el
polímero en una fase continua, se congela la dispersión resultante y
se separa el agua y los disolventes orgánicos de la dispersión por
liofilización.
Preferentemente, el procedimiento comprende
además un principio activo que se carga en dichas micropartículas
poliméricas del blanco poniendo en suspensión dichas
micropartículas poliméricas del blanco en la solución del principio
activo.
Ventajosamente, se combinan uno o más excipientes
con la mezcla principio activo-polímero antes de la
incorporación a la dispersión.
Convenientemente, dicha fase continua contiene
uno o más excipientes.
Ventajosamente, se mezcla uno o más excipientes
con el principio activo y el mismo o diferentes excipientes está
presente en la fase continua.
Convenientemente, dicho polímero se selecciona de
entre el grupo constituido por polímeros biodegradables y/o
biocompatibles.
Preferentemente, dichos polímeros biodegradables
se seleccionan de entre el grupo constituido por
\hbox{poli(lactida)s,}
poli(glicolida)s, poli(ácido láctico)s,
poli(ácido glicólico)s, polianhídridos, poliortoésteres,
polieterésteres, policaprolactona, poliesteramidas, policarbonato,
policianoacrilato, poliuretanos, poliacrilato, mezclas y
copolímeros de los mismos. Convenientemente, dicho polímero es
poli(lactida-co-glicolida)
(PLGA) y en el que dicho polímero se disuelve en un disolvente
orgánico seleccionado de entre el grupo constituido por cloroformo,
acetato de etilo, cloruro de metileno, acetonitrilo, THF y
acetona.
Preferentemente, el principio activo se
selecciona de entre el grupo constituido por péptidos, pequeñas
moléculas, azúcares, hidratos de carbono, lípidos y proteínas.
Ventajosamente, dicho principio activo es una
proteína seleccionada de entre el grupo constituido por
G-CSF, GM-CSF,
M-CSF, MGDF, los interferones (alfa, beta y gamma),
el interferón de consenso las interleucinas (1 a 12), eritropoyetina
(EPO), factor de crecimiento fibroblástico, TNF, TNFbp,
IL-1ra, factor de células madre, factor de
crecimiento de nervios, GDNF, BDNF, NT3, factor de crecimiento
derivado de plaquetas, factor de crecimiento tumoral (alfa, beta),
OPG y leptina; o derivados, análogos, fusiones, conjugados o formas
modificadas químicamente de los mismos.
Convenientemente, dicha proteína es la proteína
OB, o un derivado, análogo, fusión, conjugado o forma modificada
químicamente de la misma.
Convenientemente, dicha forma modificada de la
proteína OB se selecciona de entre el grupo constituido por fusión
Fc-leptina, leptina succinilada y leptina derivada
de cinc.
Preferentemente, dicha proteína es
G-CSF o un derivado, análogo, fusión, conjugado o
forma modificada químicamente de la misma.
Ventajosamente, dicha proteína es BDNF, o un
derivado, análogo, fusión, conjugado o forma modificada
químicamente de las mismas.
Según la presente invención, también se ha
proporcionado una composición farmacéutica para la liberación lenta
de un principio activo, obtenible dicha composición por el
procedimiento de la presente invención.
Preferentemente, el principio activo comprende la
proteína OB o un derivado, análogo, fusión, conjugado o forma
modificada químicamente de la misma.
Ventajosamente, el principio activo comprende
G-CSF o un derivado, análogo, fusión, conjugado o
forma modificada químicamente de la misma.
Convenientemente, el principio activo comprende
BDNF, o un derivado, análogo, fusión, conjugado o forma modificada
químicamente de la misma.
La Figura 1 es un esquema del proceso de la
presente invención para preparar el principio activo que contiene
micropartículas.
La Figura 2 es un diagrama que representa la
liberación in vitro de varias micropartículas cargadas de
proteínas. Las micropartículas que contienen leptina, (incorporada
en forma líquida, se representan por la línea -\blacktriangle-;
micropartículas que contienen Zn:leptina (incorporado en forma de
suspensión) se representan por la línea -\bullet-; y las
micropartículas que contienen Zn:leptina (incorporada en forma de
polvo) se representan por la línea -\blacksquare-. El % de leptina
liberada (concentración de leptina que se ha determinado por el
espectrómetro UV a 280 nm) se representa frente al tiempo
(días).
La Figura 3 muestra los datos del dicroismo
circular (CD) comparando la liberación de leptina con las
micropartículas cargadas de leptina (in vitro) el día 7
(línea continua) frente a una muestra de referencia de leptina en
tampón de la formulación (línea de trazos). Se obtuvieron los
espectros CD con un espectropolarímetro Jasco J-720
(Japan Spectroscopic Co., Tokyo, Japón). Las muestras (3,5 \muM
determinadas a A_{280}) se analizaron a 22ºC con una longitud de
recorrido celular de 0,1 cm.
La Figura 4 muestra los datos de la cromatografía
líquida de alto rendimiento (HPLC) para la leptina liberada de las
micropartículas cargadas de leptina (in vitro) en varios
puntos de tiempo (0 a 168 horas). Se realizó la cromatografía
analítica por exclusión de tamaño (SEC) con una columna TosoHaas
G2000 SW (Montgomery, PA) utilizando un HPLC de Waters (Milford, MA)
con fosfato de sodio 20 mM, NaCl 125 mM, pH 7,4 a 0,8 ml/min. Se
representa la absorbancia a 280 nm frente al tiempo transcurrido
(minutos).
La Figura 5 es una visión de un gel de
SDS-PAGE (gel Tris-glicina del 2 al
20% (Novex, San Diego, CA)) que contiene las muestras siguientes:
vía 1: leptina patrón; vía 2: patrones de peso molecular; vías 3 a
9: leptina liberada de las micropartículas cargadas de leptina
(in vitro) a las 2 doras, 24 horas, 68 horas, 92 horas,
116 horas, 140 horas y 168 horas, respectivamente; vía 10, patrones
de peso molecular. Se diluyeron las muestras con tampón SDS no
reductor, calentado a 100ºC durante cinco minutos y 1 \mug de
proteína cargada en cada pocillo. Los geles se tiñeron con Azul de
Coomassie R-250.
La Figura 6 muestra la bioactividad in
vivo de micropartículas cargadas de leptina en ratones
normales, en función del % de pérdida de peso corporal comparada con
la del tampón de referencia durante un periodo de 7 días. Se
representa el tampón de referencia (-*-)frente a la leptina
inyectada @ 10 mg/kg al día (-\bullet-), frente a la leptina
inyectada @ 50 mg/kg únicamente el día 0 (-x-), frente a las
micropartículas cargadas de leptina inyectadas @ 50 mg/kg
únicamente el día 0 (-\blacksquare-), frente a las
micropartículas de referencia inyectadas únicamente el día 0
(-\circ-).
La Figura 7 es un gráfico que representa la
liberación in vitro de BDNF procedente de las
micropartículas en las que BDNF se había absorbido. Se representa el
% de BDNF liberado (concentración de proteína BDNF que se ha
determinado por el espectrofotómetro UV a 280 nm) frente al tiempo
(días).
Los polímeros se pueden seleccionar de entre el
grupo constituido por el polímero biocompatible y/o biodegradable.
Tal como se define en la presente memoria, biodegradable significa
que la composición mermará o se degradará in vivo para
formar especies químicas más pequeñas. La degradación puede tener
lugar, por ejemplo, por procedimientos enzimáticos, químicos o
físicos. Los polímeros biodegradables adecuados contemplados para
su utilización en la presente invención incluyen
poli(lactida)s, poli(glicolida)s,
poli(ácido láctico)s, poli(ácido glicólico)s,
polianhídridos, poliortoésteres, polieterésteres, policaprolactona,
poliesteramidas, policarbonato, policianoacrilato, poliuretanos,
poliacrilato, mezclas y copolímeros de los mismos.
El intervalo de pesos moleculares contemplados
para los polímeros que se han de utilizar en los presentes procesos
puede ser fácilmente determinado por un experto en la materia
basándose en factores tales como la velocidad de degradación del
polímero deseada. Típicamente, el intervalo de peso molecular estará
comprendido entre 2.000 y 2.000.000 de daltons. Se puede utilizar
casi cualquier tipo de polímero con la condición de que se
encuentren los disolventes y no disolventes apropiados.
El término "PLGA" tal como se utiliza en la
presente memoria tiene por objeto referirse a un polímero de ácido
láctico solo, a un polímero de ácido glicólico solo, a una mezcla
de dichos polímeros, a un copolímero de ácido glicólico y ácido
láctico, a una mezcla de dichos copolímeros, o a una mezcla de
dichos polímeros y copolímeros. Preferentemente, el polímero
biodegradable será
polilactida-co-glicolida (PLGA).
A menos que se indique de otro modo, el término
micropartículas se puede utilizar para abarcar micropartículas,
microesferas y microcápsulas. Los agentes activos que se han de
incorporar en las micropartículas son compuestos sintéticos o
naturales que demuestran un efecto biológico cuando se introducen
en un ser vivo. Los agentes activos contemplados incluyen péptidos,
pequeñas moléculas, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, lípidos y
proteínas. Las proteínas contempladas para su utilización incluyen
potentes citocinas, incluyendo varios factores hematopoyéticos tales
como los factores estimulantes de colonias de granulocitos (véase
las patentes U.S. nº 4.810.643, nº 4.999.291, nº
5.581.476, nº 5.582.823 y la publicación TCP nº 94/17185,
GM-CSF, M-CSF, MGDF, los
interferones (alfa, beta, gamma, omega), el interferón de consenso
(véase, las patentes U.S. nº 5.372.808, nº 5.541.293, nº 4.897.471 y
nº 4.695.623, las interleucinas (1 a 12) (véase, la patente U.S. nº
5.075.222), eritropoyetina (EPO) (véase, las patentes U.S. nº
4.703.008, nº 5.441.868, nº 5.618.698, nº 5.547.933 y nº 5.621.080,
factor de crecimiento fibroblástico, TNF, TNFbp,
IL-1ra, factor de células madre (publicaciones TCP
nº 91/05795, nº 92/17505 y nº 95/17206), factor de crecimiento de
nervios, GDNF, BDNF, NT3, factor de crecimiento derivado de
plaquetas y factor de crecimiento tumoral (alfa, beta),
osteoprotegerina (OPG) y proteína OB (leptina).
También están contemplados para la incorporación
en las composiciones de la presente invención los derivados,
proteínas de fusión, conjugados, análogos o formas modificadas de
los principios activos naturales. Se ha observado que la
modificación química de las proteínas biológicamente activas
proporciona ventajas adicionales en determinadas circunstancias,
tales como el aumento de la estabilidad y del tiempo de circulación
de la proteína terapéutica y la disminución de la inmunogenicidad.
Por ejemplo, la patente U.S. nº 4.179.337, Davis et al.,
concedida el 18 de diciembre de 1979, da a conocer la conjugación
de polipéptidos solubles en agua tales como enzimas e insulina
hasta polietilenglicol (PEG); véase también el documento
WO 87/00056, publicado el 15 de enero de 1987.
Otro tipo de modificación química contemplada
para los principios activos de la presente invención es la
succinilación. Las propiedades de varias proteínas succiniladas
están descritas en Holcenberg et al., J. Biol. Chem.,
250:4165-4170 (1970) y en el documento WO
88/01511 (y referencias citadas en la presente memoria), publicado
el 10 de marzo de 1988.
Las presentes leptinas utilizadas son
preferentemente las que tienen la secuencia de aminoácidos de la
proteína OB natural humana; véase Zhang et al., Nature
372:425-432 (1994); véase también, la
Corrección en Nature 374:479 (1995), opcionalmente se
utiliza con un residuo N-terminal de metionilo
incidente en la expresión bacteriana. (Véase, Materiales y
procedimientos, infra). La publicación TCP nº WO 96/05309,
publicada el 22 de febrero de 1996, titulada "Modulators of
Body Weight, Corresponding Nucleic Acids and Proteins, and
Diagnostic and Therapeutic Uses Thereof" indica de forma
completa la proteína OB y las composiciones y procedimientos
relacionados.. En el documento WO 96/05309 Sec ID nº 4 y nº 6 (en
las páginas 172 y 174 de esta publicación), se indica una secuencia
de aminoácidos para la proteína OB humana y el primer residuo de
aminoácido de la proteína madura está en la posición 22 y es un
residuo de valina. La proteína madura es de 146 residuos (o de 145
si la glutamina en posición 49 está ausente, Seq ID nº 4). Los
derivados específicos de leptina contemplados para su utilización en
la presente invención incluyen las fusiones
Fc-leptina, leptina succinilada y leptina derivada
de cinc (Zn:leptina). Es deseable tener dicha leptina conteniendo
composiciones de liberación lenta tales como las composiciones que
podrían servir para aumentar la efectividad de la leptina
administrada por vía endógena o exógena, o que se puedan utilizar,
por ejemplo, para reducir o eliminar la necesidad de administración
exógena de leptina.
En general, se puede mezclar una solución acuosa,
una suspensión, o una forma sólida del agente activo con el
disolvente orgánico que contiene el polímero. Cuando se utiliza una
solución acuosa del principio activo, se forman emulsiones
polímero:principio activo y se utilizan para preparar las
micropartículas. Cuando se utiliza una forma en suspensión o sólida
del principio activo, se forman suspensiones polímero:principio
activo y se utilizan para preparar las micropartículas.
La principal realización del procedimiento para
producir las micropartículas cargadas de proteína comprende: (a)
disolver un polímero en un disolvente orgánico para producir una
solución polimérica; (b) añadir un principio activo en una forma
seleccionada de entre el grupo constituido por una solución acuosa,
una suspensión y un polvo para que dicha solución polimérica
produzca una mezcla principio activo-polímero que
comprende una primera emulsión o suspensión; (c) dispersar dicha
primera emulsión o suspensión en una fase continua; es decir, sin
disolvente(s), para producir una dispersión; (d) añadir un
excipiente a dicha dispersión para producir una dispersión final;
(e) congelar dicha dispersión final; y (f) liofilizar dicha
dispersión final congelada para eliminar los diferentes disolventes
(acuosos y orgánicos) para producir las micropartículas cargadas de
la proteína deseada. El proceso se muestra esquemáticamente en la
Figura 1. Tal como se representa en la Figura 1, la etapa c) puede
comprender alternativamente diluir dicha primera emulsión o
suspensión con un polímero no disolvente. Además, la etapa a) puede
comprender el principio activo que se disuelve directamente en la
solución de polímero orgánico para forma una primera mezcla
homogénea.
El disolvente que se ha de utilizar para disolver
el PLGA en la etapa a) de los presentes procesos incluye, por
ejemplo, cloroformo, acetato de etilo, cloruro de metileno,
acetonitrilo, THF y acetona. En una realización de la presente
invención, el disolvente que se ha de utilizar es el cloroformo.
Los no-disolventes contemplados para su utilización
en la etapa c) incluyen agua, hexano, etanol, metanol y tetracloruro
de carbono o mezclas de los mismos (p. ej.: agua/etanol).
Las concentraciones de polímero contempladas para
su utilización en los procedimientos de la presente invención están
comprendidas en el intervalo de 5 a 70 g/100 ml. En las
realizaciones de la presente invención que utilizan PLGA, la
concentración del polímero estará comprendida preferentemente en el
intervalo de 10 a 20 g/100 ml.
Las concentraciones de proteína contempladas para
su utilización en los procedimientos de la presente invención están
comprendidas en el intervalo de 0 a 300 mg/ml cuando están en
solución o en suspensión o en proteína sólida equivalente. En las
realizaciones de la presente invención que utilizan leptina, la
concentración de proteína es preferentemente de 100 mg/ml.
Para las emulsiones producidas por los
procedimientos de la presente invención, las relaciones
orgánico:acuoso contempladas para su utilización son de 1:1 a 12:1.
En las realizaciones de la presente invención que utilizan PLGA y
leptina, la relación orgánico:acuoso será preferentemente 4:1 para
la primera emulsión. En general, las micropartículas preparadas por
los procedimientos de la presente invención comprenderán
generalmente del 0 al 60% en peso de proteína.
La adición de un excipiente de liofilización en
la etapa d) del proceso descrito anteriormente se observó que era
útil para asegurar que las micropartículas no se agregan o se
fusionan durante la liofilización. Se pueden añadir uno o más
excipientes. De forma significativa, dicho(s)
excipiente(s) se podría(n) también añadir en la etapa
b) o c) del proceso. El/los excipiente(s) de liofilización
contemplado(s) para su utilización en los presentes procesos
incluyen lactosa, manitol, dextrano, sacarosa, heparina, glicina,
glucosa, ácido glutámico, gelatina, sorbitol, dextrosa, trehalosa,
metocel, hidroetilcelulosa, hidroxietil almidón,
poli(etilenglicol),
poli(vinil-pirrolidona) y alcohol
polivinílico, o varias combinaciones de los mismos, además de otros
tampones, estabilizantes de proteínas, crioprotectores y
crioconservantes utilizados habitualmente por los expertos en la
materia.
Las temperaturas contempladas para su utilización
en la etapa de congelación (etapa e de los presentes procesos están
comprendidas en el intervalo de -283ºC (nitrógeno líquido) a -20ºC.
Estas temperaturas se utilizan con el fin de estabilizar las
emulsiones o suspensiones. La emulsión o suspensión final se puede
congelar inmediatamente utilizando las temperaturas descritas
anteriormente, o se puede almacenar a temperatura ambiente antes de
congelar. En una realización de la presente invención, la emulsión
final se congeló inmediatamente y la temperatura utilizada para la
congelación fue de -80ºC.
Las temperaturas contempladas para su utilización
en la etapa f) de los presentes procedimientos están comprendidas
en el intervalo de -100ºC a la temperatura ambiente.
Preferentemente, la temperatura de la muestra congelada de la etapa
e) se reducirá a -80ºC y se mantendrá durante una hora antes de ser
conectada al sistema de vacío. Se eleva la temperatura a
continuación paso a paso en incrementos de 5ºC/hora hasta -25ºC
para efectuar la eliminación de la fase acuosa y de cualquier fase
orgánica residual. Se mantiene la muestra a continuación al vacío
durante 4 a 5 días (o siempre que el vacuómetro indique no más
eliminación de vapor), y a continuación se aumenta la temperatura a
-5ºC durante 6 a 8 horas antes de retirar la muestra del sistema de
vacío. Es la utilización de esta única etapa, es decir, la
liofilización directa de la emulsión o suspensión final, la que
refina y simplifica el presente proceso por encima de los procesos
descritos anteriormente, que requieren etapas múltiples y son a
menudo incómodos. Y, de forma significativa, esta liofilización
directa proporciona el aumento de estabilidad para una gran variedad
de principios activos in vivo, además de la consecución de
cargas mayores, mayores eficacias de carga y mayores rendimientos.
Por lo tanto, las ventajas significativas de los presentes procesos
comparadas con los procesos descritos en esta materia, incluyen por
ejemplo, 1) facilidad de preparación de las micropartículas
cargadas de principio activo; 2) versatilidad en relación con la
clase de polímeros y/o principios activos que se pueden utilizar;
3) mayores rendimientos y eficacias de carga; y 4) el aporte de
formulaciones de liberación lenta que liberan el principio activo
intacto in vivo, proporcionando de este modo la libración
controlada del principio activo durante un periodo de tiempo
prolongado (p. ej.: hasta 180 días). Tal como se utiliza en la
presente memoria "contenido dentro" indica un procedimiento
para formular un principio activo dentro de una composición útil
para la liberación controlada del principio activo, durante un
periodo de tiempo prolongado.
En las composiciones de liberación lenta de la
presente invención, se puede utilizar una cantidad eficaz de
principio activo. Tal como se utiliza en la presente memoria,
liberación lenta se refiere a la liberación gradual del principio
activo procedente de la matriz de polímero, durante un periodo de
tiempo prolongado. La liberación lenta puede ser continua o
discontinua, lineal o no-lineal y ésta se puede
realizar utilizando una o más composiciones de polímero, cargas de
fármaco, selección de excipientes u otras modificaciones.
En general, en la presente invención están
comprendidas las composiciones farmacéuticas que comprenden
cantidades eficaces de proteína o de productos derivados de la
invención junto con diluyentes, estabilizantes, conservantes,
solubilizantes, adyuvantes y/o excipientes farmacéuticamente
aceptables. Dichas composiciones incluyen diluyentes de diversos
contenidos en tampón (p. ej.: Tris-HCl, fosfato),
pH y fuerza iónica; aditivos tales como detergentes y agentes
solubilizantes (p. ej.: Tween 80, Polisorbato 80), antioxidantes
(ácido arcórbico, metabisulfito de sodio), conservantes (p. ej.:
Thimersol, alcohol bencílico) y sustancias de carga (p. ej.:
lactosa, manitol); véase, p. ej.: Remington's Pharmaceutical
Sciencies, 18ª ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA
18042) páginas 1435-1712. Una cantidad eficaz de
principio activo es una cantidad terapéutica, profilácticamente o
de diagnóstico eficaz, que un experto en la materia puede
determinar fácilmente teniendo en cuenta factores tales como el
peso corporal, la edad el objetivo terapéutico, profiláctico o de
diagnóstico y el ritmo de liberación deseado. Una suspensión de
micropartículas cargadas de proteína preparada según la presente
invención, se administra preferentemente por inyección
intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Sin embargo, para un
experto en la materia sería evidente que se pueden utilizar además
otras vías de administración, utilizando eficazmente las
composiciones de la presente invención.
Los ejemplos siguientes se ofrecen para ilustrar
la invención de forma más completa. El Ejemplo 1 describe el
procedimiento nuevo para preparar micropartículas cargadas de
proteína. Se utiliza leptina (en forma de solución acuosa) como
ejemplo de proteína y se demuestra la capacidad de las
micropartículas cargadas de leptina para proporcionar la liberación
lenta de la leptina, tanto in vitro como in vivo. El
Ejemplo 2 demuestra que se pueden utilizar distintos polímeros para
preparar micropartículas cargadas de leptina. El Ejemplo 3
demuestra que se pueden utilizar distintos derivados de leptina,
además de proteínas totalmente diferentes (todas en forma de
solución acuosa), en los nuevos procedimientos de la presente
invención. El Ejemplo 4 demuestra los efectos de la temperatura
sobre la etapa de congelación y sobre la etapa de liofilización del
procedimiento de la presente invención. El Ejemplo 5 demuestra que
en los procedimientos de la presente invención se pueden utilizar
diferentes disolventes orgánicos para disolver los polímeros PLGA.
El Ejemplo 6 demuestra que se puede utilizar una suspensión de
Zn:leptina y un polvo liofilizado de Zn:leptina en los nuevos
procedimientos de la presente invención. El Ejemplo 7 demuestra que
se puede utilizar una proteína secada por pulverización,
IL-1ra secada por pulverización, en los nuevos
procedimientos de la presente invención. El Ejemplo 8 demuestra que
las micropartículas del "blanco" sobre las que se ha absorbido
el principio activo (p. ej.: BDNF) puede proporcionar además la
liberación lenta in vitro del principio activo. Siguen
Materiales y procedimientos.
Este ejemplo describe los nuevos procedimientos
para preparar micropartículas cargadas de proteína; específicamente,
la preparación de microesferas de
poli(D,L-lactida-co-glicolida)
que contienen leptina.
Se disolvió 0,6 g de RG-502H,
poli(D,L-lactida-co-glicolida)
(Boehringer Ingelheim Chemicals (B.I. Chemicals), Henley Div.,
Montvale, NJ) en 4 ml de cloroformo y se filtró a través de un
filtro de 0,2 \mum de PTFE. 1 ml de leptina en 100 mg/ml de
acetato de sodio 10 mM, pH 4,8 (preparado como se describe en
Materiales y procedimientos, infra), se filtró en primer
lugar en medio estéril y a continuación se añadió poco a poco a la
parte superior de la solución de polímero. Se homogeneizaron las dos
capas utilizando un homogeneizador Polytron
(PT-DA3012/2T generator, Brinkman, Westbury, NY) de
15.000 a 20.000 rpm durante 30 a 45 segundos mientras se sumergía el
recipiente de la emulsión en un baño con hielo.
Se añadió la primera emulsión resultante
(agua/aceite) a 10 ml de agua mientras se homogeinizaba a 15.000
rpm durante 20 a 30 seg. A la segunda emulsión resultante
(agua/aceite/agua) se añadió 1 ml de excipiente de liofilización
(100 mg/ml de glicina, 100 mg/ml de sacarosa, 10 mg/ml de alcohol
polivinílico (PVA) [P.M. 22.000, 88% hidrolizado), 10% de etanol
(v/v) y se homogeneizó brevemente para asegurar la mezcla completa.
La emulsión final mostró al microscopio óptico esferas sueltas de 1
a 10 \mum. Se vertió la emulsión final en un matraz y se congeló
a -45ºC.
A continuación se redujo la temperatura del baño
en una hora hasta -80ºC. Después de una hora a -80ºC, se conectó el
matraz al sistema de vacío y se realizó en primer lugar la
liofilización a -80ºC. Se controló el nivel de vacío con el fin de
que se pudiera determinar la eliminación del disolvente orgánico por
una pérdida de vacío en el nivel del sistema. A continuación se
subió gradualmente la temperatura en incrementos de 5ºC/hora hasta
-25ºC para efectuar la eliminación de la fase acuosa y de cualquier
fase orgánica residual.
Después de 4 a 5 días cuando el vacuómetro no
indicaba más eliminación de vapor, se aumentó la temperatura del
baño a -5ºC durante 6 a 8 horas antes de retirar las muestras del
sistema de vacío. Se pesaron las micropartículas y se almacenaron a
continuación a -20ºC hasta que fue necesario.
El proceso descrito anteriormente se probó además
con las siguientes modificaciones: 1) se añadió la primera emulsión
(agua/aceite) o suspensión (suspensión/aceite) a 20 ml de
agua/etanol (75%/25%) mientras se homogeneizaba a 5000 rpm durante
30 segundos; 2) se añadió lentamente de 10 a 40 ml de agua o de
etanol frío a la segunda emulsión (agua/aceite/agua o
suspensión/aceite/agua) y a continuación se incubó la emulsión
final a temperatura ambiente durante hasta tres horas antes de la
congelación; y 3) se solidificó la emulsión final incubándola a
temperatura ambiente durante diferentes intervalos de tiempo (0 a 4
horas) antes de la congelación. En cada caso, se obtuvieron
micropartículas cargadas de leptina.
Se determinaron las cinéticas de liberación
"in vitro" de leptina procedente de las micropartículas
preparadas como se describió anteriormente preparando una
suspensión de 20 mg/ml de partículas en fosfato de sodio 20 mM,
sorbitol al 5%, pH 7,4 (como alternativa, se podría utilizar
histidina 20 mM en lugar de fosfato). En cada intervalo de tiempo,
se centrifugó la suspensión de microesferas y se determinó la
concentración en el sobrenadante por el espectrómetro UV a 280 nm
además de por SEC-HPLC a 220 nm. En la Figura 2 se
representa el % de leptina liberada a lo largo del tiempo. La
integridad de la leptina liberada de las micropartículas de PLGA se
confirmó por dicroismo circular (CD) (Figura 3), HPLC (Figura 4),
bioanálisis in vitro y electroforesis
(SDS-PAGE) (Figura 5). Los datos de CD mostraron
conservación de la estructura secundaria y HPLC y la electroforesis
de gel no mostraron evidencias de degradación química ni de
agregación.
Se evaluó la bioactividad "in vivo"
de micropartículas cargadas de leptina en ratones y ratas normales
poniendo en suspensión 80 a 100 mg/ml de micropartículas en fosfato
de sodio, sorbitol al 5%, pH 7,4 y tampón. Se prepararon
suspensiones una hora antes de la inyección subcutánea colocando
las micropartículas y el tampón en un agitador en una cámara fría a
5ºC. Todas las manipulaciones posteriores se realizaron
inmediatamente antes de la inyección con jeringuillas refrigeradas y
agujas del calibre 25. Se determinó el % de pérdida de peso
corporal comparado con la referencia del tampón durante un periodo
de 7 días. Después de 7 días, se sacrificaron los animales para
examen histólogico del punto de inyección. Una sola inyección de
micropartículas cargadas de leptina produjo pérdida de peso continua
en los ratones durante un periodo de 7 días (Figura 6). El examen
histólogico del punto de inyección puso de manifiesto un mínimo
localizado en una reacción inflamatoria leve, que fue completamente
reversible en la biodegradación de las partículas a lo largo del
tiempo.
Este ejemplo se diseñó para probar la eficacia de
diferentes pesos moleculares de PLGA o de mezclas en la preparación
de las micropartículas cargadas de leptina. Se utilizaron los
procedimientos de preparación y evaluación descritos en el Ejemplo
1 para probar varios polímeros relacionados en la Tabla 2 a
continuación.
| Polímeros: | Fuente: |
| RG-501H | B.I. Chemicals |
| RG-502H | B.I. Chemicals |
| RG-502 | B.I. Chemicals |
| RG-503H | B.I. Chemicals |
| Mezclas (RG-500H)-(RG-502H)* | B.I. Chemicals |
| (RG-501H)-(PEG/PLGA)** | B.I. Chemicals |
| *Mezclas de polímeros preparadas mezclando relaciones en peso 20:80 y 50:50 de RG-501H y RG-502H | |
| ** Mezcla 80:20 (en peso) de PLGA (501H) y copolímero del bloque AB PLGA(501H):PEG(1000). |
Utilizando cada uno de los polímeros relacionados
en la Tabla 2, se pudieron preparar eficazmente micropartículas
cargadas de proteína.
Este ejemplo describe la preparación de
micropartículas que contienen derivados de leptina además de otras
proteínas. Se utilizaron los procedimientos de preparación y
evaluación descritos en el Ejemplo 1 para probar varias proteínas
relacionadas en la Tabla 3 a continuación.
| Proteína | Peso molecular | Concentración | Formulación |
| (Daltons) | (mg/ml) | ||
| Leptina | 16.158 | 50-130 | NaAcO 10 mM, pH 4,8-8,0 |
| 80 | NaAcO 10 mM, pH 4,8 + | ||
| sacarosa al 10% | |||
| 100 | Tampón Lyo^{a} | ||
| 60 | Lípido acomplejado^{b} | ||
| PEG-leptina de | \sim36.158 | 64-122 | NaAcO 10 mM, pH 4,8-8,0 |
| 20 kd | |||
| Leptina | 16.258 | 60-80 | NaFos 10 mM, pH 7,0-8,0 |
| succinilda | |||
| G-CSF | 18.798 | 50-100 | NaAcO 10 mM, pH 4,8-8,0 |
| 60-100 | NaAcO 10 mM, pH 4,8-8,0 + | ||
| sacarosa al 10% | |||
| 55 | NaCl 1 mM, Trehalosa al | ||
| 10%, pH 7,6 | |||
| 60 | Lípido acomplejado^{b} |
| Proteína | Peso molecular | Concentración | Formulación |
| (Daltons) | (mg/ml) | ||
| BDNF | 13.513 | 45-120 | NaFos 10 mM, pH 7 |
| IL-1ra | 17.258 | 100-200 | NaCitrato 10 mM, NaCl 140 |
| mM, pH 6,5 | |||
| TNFbp | 18.278 | 105 | NaFos 10 mM, Gly al 2%, pH |
| 7 | |||
| BSA | 66.262 | 100 | NaAcO 10 mM, pH 4,8 |
| ^{a} Tampón de liofilización = 10 mg/ml de glicina, 5 mg/ml de sacarosa, ácido glutámico 10 mM, pH 4,8. | |||
| ^{b} DPMG o DCPG con relación molar 30:1 de lípido acomplejado a proteína en NaAcO 20 nM, pH 4,8. |
Con cada una de las proteínas relacionadas
anteriormente, se obtuvieron micropartículas cargadas de proteína,
demostrando de este modo la flexibilidad del nuevo proceso de la
presente invención. Y de forma significativa se demuestra que se
pueden preparar también de forma eficaz micropartículas cargadas de
proteína utilizando diferentes derivados de leptina.
En este ejemplo, se evaluaron los efectos de la
temperatura sobre la etapa de congelación y la etapa de
liofilización del proceso de la presente invención. Según se
refiere en la etapa de congelación (etapa 5), se probó nitrógeno
líquido a -80ºC y -45ºC. Según se refiere en la etapa de
liofilización (etapa 6), se probaron a -80ºC, -45ºC y -25ºC. Se
utilizó el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 para probar varias
temperaturas y se determinó que las temperaturas probadas tenían un
efecto muy pequeño en ambas etapas del proceso.
En este ejemplo, se probaron distintos
disolventes orgánicos para disolver los polímeros PLGA en los
procedimientos de la presente invención. Se repitió el procedimiento
descrito en el Ejemplo 1 utilizando acetato de etilo y cloruro de
metileno. Se observó que cada uno de los disolventes orgánicos
polares era eficaz en los procedimientos de la presente
invención.
Este ejemplo prueba la capacidad de una
suspensión de principio activo y/o polvo liofilizado para ser
utilizada en los procedimientos de la presente invención.
Se probaron 100 mg/ml de suspensión de proteína
Zn/OB en Tris 10 mM, cloruro de cinc 50 \muM, pH 7,0 (preparado
tal como se describe en el apartado Materiales y procedimientos más
adelante) y se evaluó como se describe en el Ejemplo 1. También se
probó y se evaluó 100 mg de un polvo liofilizado de Zn:leptina
(preparado tal como se describe en el apartado Materiales y
procedimientos más adelante). Se demostró que la suspensión de
Zn:leptina y el polvo de Zn:leptina incorporados podrían ser
utilizados eficazmente para preparar micropartículas según los
nuevos procedimientos de la presente invención (véase la Figura 2
para los datos de liberación in vitro).
Este ejemplo probó la capacidad de una proteína
secada por pulverización, IL-1ra secada por
pulverización, para ser utilizada en los procedimientos de la
presente invención. 150 mg de un polvo de IL-1ra
secado por pulverización (preparado tal como se describe en el
apartado Materiales y procedimientos más adelante) se probaron y se
evaluaron tal como se describe en el Ejemplo 1. Se demostró que la
preparación IL-1ra secada por pulverización podía
ser utilizada de forma eficaz para preparar micropartículas según
los nuevos procedimientos de la presente invención.
En este ejemplo, se modificó el procedimiento
descrito en el Ejemplo 1 de modo que se mezcló NaAcO 20 mM, pH 4,8,
inicialmente con el polímero, produciendo la preparación de
micropartículas del "blanco". A continuación se diluyeron 6 mg
de micropartículas del blanco con 1 ml de BDNF (4,4 mg/ml en
fosfato de sodio 0,1 M, pH 6,9) y se incubó la mezcla a 37ºC en
agitación. Después de 2 horas, se aislaron las micropartículas por
centrifugación y se determinó la fracción de proteína sin unir por
el espectrofotómetro UV. Se unieron al polímero 1,76 mg de BDNF para
dar una carga de proteína del 22% sobre las micropartículas. Se
determinaron a continuación las cinéticas de liberación in
vitro tal como se describe en el Ejemplo 1. En la Figura 7 se
representa el % de BNF liberado a lo largo del tiempo.
La presente leptina humana metionil recombinante
se puede preparar según la anterior publicación TCP incorporada como
referencia, documento WO 96/05309 en las páginas 151 a 159. Para
los presentes ejemplos de trabajo, se utilizó una leptina humana
que tiene (en comparación con la secuencia de aminoácidos de la
página 158) lisina en la posición 35 en lugar de arginina e
isoleucina en la posición 74 en lugar de isoleucina. Se pueden
preparar otras leptinas humanas recombinantes según los
procedimientos de expresión de proteínas conocidos generalmente en
la materia utilizando la tecnología del ADN recombinante.
Se preparó la presente leptina humana succinilada
metionil recombinante por reacción de la leptina humana recombinante
a \sim150 mg/ml en tampón de fosfato de sodio a pH 7,0 con un
exceso 3 a 7 molar de anhídrido succínico a 4ºC durante dos horas.
La reacción se enfrió bruscamente mediante la adición de
hidroxilamina sólida hasta una concentración final de 0,5 M y pH
8,5. La mezcla reacción se dializó a continuación frente a fosfato
de sodio 10 mM, pH 7,0 y se separó la forma de leptina
monosuccinilada de las formas de leptina di- y polisucciniladas por
cromatografía de intercambio iónico.
Se preparó la presente suspensión de leptina
humana metionil recombinante derivada con cinc tomando una muestra
de 752 \mul de leptina recombinante humana a 133 mg/ml en HCl 1
mM y añadiendo 48 \mul de agua, seguido de
100 \mul de cloruro de cinc 500 \muM, seguido de 100\mul de TRIS 1 M, pH 8,5. Aparece un precipitado inmediato de Zn:leptina que sedimentará rápidamente en la solución a temperatura ambiente, pero que se puede volver a poner en suspensión fácilmente.
100 \mul de cloruro de cinc 500 \muM, seguido de 100\mul de TRIS 1 M, pH 8,5. Aparece un precipitado inmediato de Zn:leptina que sedimentará rápidamente en la solución a temperatura ambiente, pero que se puede volver a poner en suspensión fácilmente.
La liofilización del presente polvo liofilizado
de leptina humana metionil recombinante derivada con cinc se
realizó en un autoliofilizador Virtis. Brevemente, se congeló una
suspensión de Zn:leptina en el autoliofilizador a -50ºC y se mantuvo
durante 2 horas. Las muestras se templaron a -25ºC durante 2 horas y
a continuación se congelaron de nuevo a -50ºC. La presión de la
cámara se redujo a 100 mTorr mientras que se mantenía la temperatura
del autoliofilizador en -50ºC durante 2 horas. El secado primario se
realizó aumentando la temperatura del autoliofilizador a -25ºC y
manteniéndola durante 10 horas mientras se conserva la presión en la
cámara en 100 Mtorr. Se realizó el secado secundario subiendo
gradualmente la temperatura del autoliofilizador a 25ºC durante 7
horas y manteniéndola durante 10 horas mientras se mantienen la
presión en la cámara en 100 mTorr. Se finalizó el ciclo y al final
del secado secundario, se aireó la cámara a la presión atmosférica y
se retiró el producto liofilizado del liofilizador.
Se preparó la presente proteína
IL-1ra recombinante secada por pulverización
secando por pulverización una solución de 20 mg/ml de
IL-1ra, utilizando un minisecador por pulverización
Buchi 190. Las temperaturas a la entrada y a la salida durante la
pulverización fueron de 130ºC y 90ºC, respectivamente. El caudal de
alimentación fue de 1 a
2 ml/min y se obtuvo un polvo de IL-1ra secado por pulverización.
2 ml/min y se obtuvo un polvo de IL-1ra secado por pulverización.
Aunque la presente invención se ha descrito desde
el punto de vista de determinadas realizaciones preferidas, se
comprende que para los expertos en la materia pueden tener lugar
variaciones y modificaciones.
Claims (24)
1. Un procedimiento para preparar una composición
que comprende un principio activo contenido dentro de las partículas
poliméricas, en el que se dispersa una mezcla de principio activo y
de polímero dentro de una fase continua, se congela la dispersión
resultante y se separan por liofilización los disolventes orgánicos
de la dispersión.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha fase continua es acuosa, orgánica o una mezcla de las
mismas.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la mezcla principio activo-polímero se
obtiene dispersando una solución acuosa del principio activo en una
segunda fase no acuosa que contiene el polímero, antes de la adición
a la fase continua.
4. Un procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la mezcla principio activo-polímero se
obtiene disolviendo ambos componentes en un disolvente no acuoso
antes de la adición a la fase continua.
5. Un procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el principio activo está presente en una dispersión de
partículas sólidas en una solución no acuosa del polímero, que se
añade a continuación a la fase continua.
6. Un procedimiento para preparar una composición
que comprende micropartículas poliméricas del blanco, en el que el
polímero se dispersa en una fase continua, la dispersión resultante
se congela y el agua y los disolventes orgánicos se separan por
liofilización.
7. Un procedimiento según la reivindicación 6,
que comprende además el principio activo que está cargado en dichas
micropartículas poliméricas del blanco poniendo en suspensión
dichas micropartículas poliméricas del blanco en la solución del
principio activo.
8. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que uno o más excipientes se combinan
con la mezcla principio activo-polímero antes de la
incorporación en la dispersión.
9. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha fase continua contiene uno o
más excipientes.
10. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que uno o más excipientes se mezclan
con el principio activo y el mismo o un excipiente diferente está
presente en la fase continua.
11. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicho polímero se selecciona de entre el grupo constituido
por polímeros biodegradables y/o biocompatibles.
12. Un procedimiento según la reivindicación 11,
en el que dichos polímeros biodegradables se seleccionan de entre el
grupo constituido por poli(lactida)s,
poli(glicolida)s, poli(ácido láctico)s,
poli(ácido glicólico)s, polianhídridos, poliortoésteres,
polieterésteres, policaprolactona, poliesteramidas, policarbonato,
policianoacrilato, poliuretanos, poliacrilato, mezclas y copolímeros
de los mismos.
13. Un procedimiento según la reivindicación 12,
en el que dicho polímero es
poli(lactida-co-glicolida)
(PLGA) y en el que dicho polímero se disuelve en un disolvente
orgánico seleccionado de entre el grupo constituido por cloroformo,
acetato de etilo, cloruro de metileno, acetonitrilo, THF y
acetona.
14. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 y 7 a 10, en el que el principio activo se
selecciona de entre el grupo constituido por péptidos, pequeñas
moléculas, azúcares, hidratos de carbono, lípidos, ácidos nucleicos
y proteínas.
15. Un procedimiento según la reivindicación 14,
en el que dicho principio activo es una proteína seleccionada de
entre el grupo constituido por G-CSF,
GM-CSF, M-CSF, MGDF, los
interferones (alfa, beta y gamma), interferón de consenso, las
interleucinas (1 a 12), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento
fibroblástico, TNF, TNFbp, IL-1ra, factor de células
madre, factor de crecimiento de nervios, GDNF, BDNF, NT3, factor de
crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento tumoral
(alfa, beta), OPG y leptina; o derivados, análogos, fusiones,
conjugados o formas modificadas químicamente de los mismos.
16. Un procedimiento según la reivindicación 15,
en el que dicha proteína es la proteína OB o un derivado, análogo,
fusión, conjugado o forma modificada químicamente de la misma.
17. Un procedimiento según la reivindicación 16,
en el que dicha forma modificada de la proteína OB se selecciona de
entre el grupo constituido por fusión Fc-leptina,
leptina succinilada y leptina derivada con cinc.
18. Un procedimiento según la reivindicación 15,
en el que dicha proteína es G-CSF o un derivado,
análogo, fusión, conjugado o forma modificada químicamente de la
misma.
19. Un procedimiento según la reivindicación 15,
en el que dicha proteína es BDNF o un derivado, análogo, fusión,
conjugado o forma modificada químicamente de la misma.
20. Composición farmacéutica para la liberación
lenta de un principio activo, obtenible dicha composición por el
procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
21. Composición farmacéutica según la
reivindicación 20, en la que el principio activo comprende la
proteína OB o un derivado, análogo, fusión, conjugado o forma
modificada químicamente de la misma.
22. Composición farmacéutica según la
reivindicación 20, en la que el principio activo comprende
G-CSF o un derivado, análogo, fusión, conjugado o
forma modificada químicamente de la misma.
23. Composición farmacéutica según la
reivindicación 20, en la que el principio activo comprende BDNF o un
derivado, análogo, fusión, conjugado o forma modificada
químicamente de la misma.
24. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 20 a 23, para administración mediante inyección
intraperitoneal, subcutánea o intramuscular.
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