ES2203815T3

ES2203815T3 - Reactivos para analisis de acido micofenolico.

Info

Publication number: ES2203815T3
Application number: ES97933520T
Authority: ES
Inventors: Mark A. Staples
Original assignee: Dade Behring Marburg GmbH
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1996-07-18
Filing date: 1997-07-17
Publication date: 2004-04-16
Anticipated expiration: 2017-07-17
Also published as: DE69725118T2; EP0880704B1; JP2001513876A; WO1998003876A1; CA2231569A1; JP3864261B2; ATE250768T1; EP0880704A1; DE69725118D1; US6159698A

Abstract

UN ASPECTO DE LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LOS ENSAYOS PARA LA DETECCION DEL ACIDO MICOFENOLICO. EL METODO CONSISTE EN INTRODUCIR UN MEDIO DE ENSAYO SOSPECHOSO DE CONTENER ACIDO MICOFENOLICO UN AGENTE PARA LA LIBERACION DEL ACIDO MICOFENOLICO DE UN COMPLEJO CON PROTEINAS ENDOGENAS. OTRO ASPECTO DE LA PRESENTE INVENCION ES LA MEJORA DE UN METODO PARA LA DETERMINACION DEL ACIDO MICOFENOLICO EN UNA MUESTRA SUSCEPTIBLE DE CONTENER DICHO ANALITO. EL METODO INCLUYE LOS PASOS DE (A) COMBINACION EN UN MEDIO DE ENSAYO DE LA MUESTRA Y UN COMPAÑERO DE UNION PARA EL ANALITO Y (B) LA DETECCION DE LA UNION DEL COMPAÑERO DE UNION AL ANALITO. LA MEJORA CONSISTE EN INCLUIR EN EL MEDIO DE ENSAYO UN AGENTE LIBERADOR PARA PROVOCAR LA LIBERACION DEL ACIDO MICOFENOLICO DE UN COMPLEJO CON PROTEINAS ENDOGENAS. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN PROPORCIONA REACTIVOS DE ENSAYO, ASI COMO KITS EMPAQUETADOS UTILES PARA LLEVAR A CABO LOS METODOS DE LA INVENCION.

Description

Reactivos para análisis de ácido micofenólico.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

El ácido micofenólico (MPA) se produce por fermentación de varias especies de penicillium. Tiene un amplio espectro de actividades, modo específico de acción, y es tolerable en dosis grandes con efectos secundarios mínimos, Epinette, et al., Journal of the American Academv of Dermatology 17(6):962-71 (1987). Se ha demostrado que el MPA tiene actividades antitumoral, antiviral, antipsoriásica, inmunosupresora, anti-inflamatoria, Lee, et al., Pharmaceutical Research 7(2):161-166 (1990), junto con actividades antibacteriana y antifúngica, Nelson, et al., Journal of Medicinal Chemistry 33(2):833-838 (1990). Inhibe la inosina monofosfato deshidrogenasa, una enzima en la síntesis de novo de nucleótidos de purina. Puesto que los linfocitos T y B dependen en gran parte de esta síntesis de novo, el MPA puede inhibir la proliferación de linfocitos, que es un factor importante de la respuesta inmune.

El morfolinoetil éster del MPA, (E)-6-(1,3-dihidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato de morfolinoetilo ("MPA-M") se hidroliza rápidamente in vivo a MPA. La administración de MPA en la forma de este éster, mejora grandemente la biodisponibilidad de MPA.

Ya que el MPA es un potente material biológicamente activo, un inmunoensayo eficaz podría ser útil para supervisar su biodisponibilidad. Además, puede ser importante supervisar los niveles terapéuticos del fármaco, es decir, los niveles óptimos del fármaco necesarios para la inmunosupresión adecuada. Puesto que el MPA-M se hidroliza rápidamente a MPA, un análisis de MPA proporcionaría medios de regular y de optimizar las dosificaciones de MPA-M.

Los niveles de MPA en muestras de pacientes se han determinado por cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC). Antes de llevar a cabo el análisis de HPLC, la muestra que se determinará se sometió a extracción en fase sólida utilizando elución con disolvente orgánico o extracción directa con disolvente orgánico.

2. Descripción de la técnica relacionada

Nowak, et al., Clin. Chem. (1995) 41(7): 1011-1017 discute la unión del ácido micofenólico a la seroalbúmina humana: caracterización y relación a la farmacodinamia.

Langman, et al., Therapeutic Drug Monitoring (1994) 16:802-807 discute la distribución en sangre del ácido micofenólico.

La Patente Europea 0 218 309 B1 divulga un método para medir ligandos libres en fluidos biológicos. Se emplearon salicilato de sodio y 2,4-dinitrofenol para evitar que análogos marcados de triyodotironina y tetrayodotironina se unieran a la albúmina y a la pre-albúmina de unión al tiroides.

La Solicitud de Patente Europea 0 392 332 A2 divulga un inmunoensayo de polarización fluorescente y los reactivos para esto. Se divulgaron diversos compuestos para convertir un metabolito de la mariguana, que estaba unido a seroalbúmina y otras proteínas en la orina, a la forma libre. Estos compuestos incluían, entre otros, ácido 8-anilino-1-naftalenosulfónico (ANS), ácido salicílico y ácido 5-metoxisalicílico.

El documento WO 96/02004 divulga un método para medir la cantidad de ácido micofenólico (MPA) en una muestra sospechosa de contener MPA que comprende las etapas de (a) combinar en un medio acuoso dicha muestra, MPA conjugado con un marcador detectable y un anticuerpo capaz de distinguir entre MPA y un compuesto tal como ésteres de MPA o metabolitos de MPA, y determinar el efecto de dicha muestra sobre la actividad de dicho marcador. Sin embargo, la publicación es silenciosa en lo referente al uso de un agente de liberación para liberar MPA a partir de proteínas endógenas y al uso subsecuente de esta etapa de liberación en los métodos para detectar MPA.

El documento WO 83/00147 describe el ácido 8-anilino-1-naftalenosulfónico (8-ANS), su preparación y su uso en radio inmunoensayos para evitar la unión de los componentes proteínicos del suero a un fármaco u hormona ligando/trazador de ligando. La publicación divulga además que la mejora en el análisis parecería deberse a la unión del 8-ANS a la seroalbúmina en la que tal unión evita que la disoxina esté de otra manera tan unida.

El documento US 4.454.232 divulga un inmunoensayo para la detección de estriol cuyo análisis incluye una combinación de un detergente no iónico y un agente tensioactivo. Ingredientes tensioactivos adecuados incluyen el ácido 8-anilino-naftalenosulfónico (ANS).

El documento US 4.110.076 divulga un radioinmunoensayo para la determinación in vitro de L-triyodotironina. Se emplean ciertas sales del ácido 8-anilino-naftalenosulfónico (ANS) como inhibidores para inhibir la unión de L-triyodotironina a globulina de unión a tirosina.

Compendio de la invención

Un aspecto de la presente invención es un método para liberar ácido micofenólico libre a partir de un complejo de ácido micofenólico y proteínas. Un medio sospechoso de contener el complejo se combina con un agente de liberación en una cantidad eficaz para liberar el ácido micofenólico del complejo.

Otro aspecto de la presente invención es un método de análisis para medir la cantidad total de ácido micofenólico en una muestra sospechosa de contener ácido micofenólico y proteínas endógenas que se unen al ácido micofenólico. En el método se combinan en un medio, la muestra, los reactivos de análisis para medir la cantidad del ácido micofenólico, y un agente de liberación en una cantidad eficaz para liberar el ácido micofenólico de uno de sus complejos con proteínas endógenas. La cantidad de ácido micofenólico se determina por medio de los reactivos de análisis.

Otro aspecto de la presente invención es una mejora en un método para la determinación de ácido micofenólico en una muestra sospechosa de contener ácido micofenólico. El método comprende las etapas de (a) proporcionar en combinación, en un medio de análisis, la muestra y un copartícipe de unión para el ácido micofenólico y (b) detectar la unión del copartícipe de unión al ácido micofenólico. La mejora comprende incluir en el medio de análisis un agente de liberación en una cantidad eficaz para liberar el ácido micofenólico de uno de sus complejos con proteínas endógenas.

Otra realización de la presente invención es una mejora en el método arriba mencionado para la determinación de ácido micofenólico en una muestra sospechosa de contener ácido micofenólico en la que el agente de liberación es un ácido anísico o ácido 8-anilino-1-naftalenosulfónico.

Otra realización de la presente invención es un método para medir la cantidad de ácido micofenólico en una muestra sospechosa de contener ácido micofenólico y proteínas endógenas que se unen a dicho ácido micofenólico. El método comprende (a) combinar en un medio acuoso (i) muestra, (ii) ácido micofenólico conjugado con un marcador detectable, y (iii) un anticuerpo capaz de unirse al ácido micofenólico, y (b) determinar el efecto de dicha muestra sobre la actividad de dicho marcador. La mejora comprende incluir en el medio un agente de liberación en una cantidad eficaz para liberar el ácido micofenólico de uno de sus complejos con proteínas endógenas.

Otro aspecto de la presente invención es un kit para llevar a cabo un análisis para la determinación de ácido micofenólico. El kit comprende en combinación empaquetada (a) un anticuerpo capaz de unirse al ácido micofenólico, (b) un compuesto que comprende ácido micofenólico unido a un marcador detectable, y (c) una cantidad eficaz de un agente de liberación.

Descripción de las realizaciones específicas

Se sabe que el MPA está altamente unido a proteínas en el plasma (83 - >98%). También se sabe que las muestras de sangre de pacientes para ser analizadas contienen varias proteínas tales como, por ejemplo, albúmina. A pesar de este alto nivel de unión a proteínas del MPA, inicialmente encontramos que se podía obtener una curva dosis-respuesta cuando las muestras sospechosas de contener MPA se sometieron a métodos de análisis tales como métodos de inmunoensayo y similares. Por consiguiente, no hubo necesidad de liberar el MPA de las proteínas unidas para llevar a cabo un inmunoensayo para la determinación de MPA en muestras de pacientes. Parecía que se podía emplear una concentración media de proteína para los calibradores representando todas las muestras de pacientes. Además, la unión de moléculas a albúmina está típicamente en el orden de aproximadamente 10^{6} M mientras que la unión de anticuerpos a sus respectivos cognados está en el orden de aproximadamente 10^{9} M. Así, la expectativa era que la unión más fuerte del anticuerpo prevalecería sobre la unión más débil a la albúmina.

Sorprendentemente, sin embargo, descubrimos que los inmunoensayos llevados a cabo sobre las muestras de algunos pacientes sometidos a tratamiento con MPA dieron resultados discrepantes. Tras investigación, descubrimos que algunos pacientes tenían concentraciones de proteína en sangre muy bajas, lo que dio como resultado una sobre cuantificación en el análisis de muestras de tales pacientes utilizando los calibradores arriba mencionados.

Además, los pacientes bajo tratamiento con MPA y ciclosporina o tacrolimus pueden estar co-administrados con numerosos fármacos que incluyen, pero no se limitan a, azatioprina, prednisona, metilprednisolona, antivirales, antibióticos, antifúngicos, agentes cardiovasculares, agentes diabéticos y agentes diuréticos. Muchos de estos fármacos tienen profundos efectos sobre el metabolismo y dan como resultado cambios en las concentraciones de diversos componentes del suero/plasma. También, algunos fármacos, por ejemplo, el salicilato y alguno de los fármacos arriba mencionados, se sabe que causan un aumento en la fracción libre de MPA cuando se añadió salicilato a las concentraciones que se pueden observar en los pacientes (véase, por ejemplo, Nowak, supra). Existe, por lo tanto, el potencial de interferencia por estos componentes, o directamente o indirectamente, en la determinación del MPA en la población tomada como objetivo de pacientes.

Antes de proceder con la descripción de las realizaciones específicas de la invención, se definirán varias terminologías.

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Éster de micofenolato - incluyen, pero no se limitan a, ésteres de MPA en el grupo ácido carboxílico de la cadena lateral unida en la posición 1' del sistema de anillo isobenzofuranilo del MPA, tal como el MPA-M.

Metabolito de MPA - un producto del metabolismo del MPA, preferentemente un producto que contiene el sistema de anillo isobenzofuranilo, más preferentemente productos que también contiene una porción de la cadena lateral tal como el acilo o el glucorónido fenólico del MPA.

Medir la cantidad de MPA - métodos cuantitativos, semicuantitativos, y cualitativos así como cualquier otro método para determinar MPA se considera que son métodos de medir la cantidad de MPA. Por ejemplo, un método que simplemente detecta la presencia o ausencia de MPA en una muestra sospechosa de contener MPA se considera que está incluido dentro del alcance de la presente invención. Los términos "detectar" y "determinar", así como otros sinónimos comunes para medir, se contemplan dentro del alcance de la presente invención.

Muestra sospechosa de contener MPA - por lo general tejido biológico que incluye tejido cortado de un órgano u otra parte del cuerpo de un anfitrión y fluidos corporales, por ejemplo, orina, sangre total, suero, saliva, semen, deposición, esputo, fluido cerebro espinal, lagrimas, mocos, y similares. Preferentemente, la muestra es plasma o suero.

Capaz de distinguir entre - la capacidad de un receptor o anticuerpo para unirse con preferencia a un primer ligando en relación con un segundo ligando. Generalmente, cuando el anticuerpo se combina con una muestra que contiene los ligandos se unirá al menos 5 veces más del primer ligando que del segundo ligando. Preferentemente, se unirá al menos 10 veces más y, más preferentemente, al menos 20 veces más del primer ligando. Aunque la unión relativa de cada ligando dependerá de las concentraciones relativas en la muestra, generalmente estas condiciones se encuentran cuando la constante de unión del anticuerpo al primer ligando es al menos igual a la constante de unión al segundo ligando, y preferentemente, es al menos 10 veces, más preferentemente, al menos 50 veces la constante de unión al segundo ligando. La reactividad cruzada de un anticuerpo con un primer ligando se refiere a la relación entre la concentración del primer ligando y del segundo ligando que causa que los dos ligandos se unan en cantidades iguales. La cuantificación de un grado de reactividad cruzada "alto" o "bajo", es decir, la extensión de reactividad cruzada que es aceptable, depende de la concentración más alta esperada del reactante cruzado, la sensibilidad requerida para el análisis y la exactitud necesitada. Por ejemplo, si un anticuerpo es el 10% reactivo cruzado con MPA-G y el MPA-G está presente en una muestra en una cantidad cinco veces mayor que el nivel más bajo de MPA a ser detectado, entonces el nivel medido de MPA será el 50% demasiado alto cuando el MPA esté en su nivel más bajo. Si solamente es aceptable un error del 5%, entonces la reactividad cruzada tendría que ser menor que el 1%.

Conjugado - una molécula que consta de dos o más moléculas unidas juntas, opcionalmente a través de un grupo de unión, para formar una sola estructura. La unión se puede hacer o por una conexión directa (por ejemplo, un enlace químico) entre las moléculas o por el uso de un grupo de unión. Por ejemplo, un análogo de MPA conjugado con una enzima es un conjugado de análogo de MPA - enzima.

Grupo de unión - una porción de una estructura que conecta 2 o más subestructuras. El grupo de unión puede ser un enlace o puede tener por lo menos 1 cadena ininterrumpida de átomos distintos de hidrógeno (o de otros átomos monovalentes) que se extiende entre las subestructuras. El número de átomos en la cadena será por lo menos uno y se determina contando el número de átomos distintos de hidrógeno a lo largo de la ruta más corta entre las subestructuras a ser conectadas, y típicamente es 1 - 30, generalmente 2 - 10, preferentemente 3 - 8, átomos cada uno independientemente seleccionado del grupo formado por carbono, oxígeno, nitrógeno, azufre y fósforo. El número total de átomos en el grupo de unión se determina contando el total de átomos de carbono, oxígeno, nitrógeno, azufre y fósforo, es decir, los átomos distintos de hidrógeno. Típicamente, el grupo de unión tiene un total de menos de 30 átomos, preferentemente menos de 20 átomos, más preferentemente menos de 10 átomos. Como regla general, la longitud de un grupo de unión particular se puede seleccionar arbitrariamente para prever la conveniencia de la síntesis y la incorporación de cualquier grupo deseado. Los grupos de unión pueden ser alifáticos o aromáticos, aunque con grupos diazo, estarán generalmente implicados grupos aromáticos. El oxígeno normalmente estará presente como oxo u oxi, unido a carbono, azufre, nitrógeno o fósforo; el nitrógeno normalmente estará presente como nitro, nitroso o amino, normalmente unido a carbono, oxígeno, azufre o fósforo; el azufre sería análogo al oxígeno; mientras que el fósforo estará unido a carbono, azufre, oxígeno o nitrógeno, generalmente como mono- o diéster de fosfonato y fosfato.

Las funcionalidades comunes en la formación de un enlace covalente entre el grupo de unión y la molécula a ser conjugada son alquilamina, amidina, tioamida, ditiol, éter, urea, tiourea, guanidina, azo, tioéter y ésteres, amidas y tioésteres de carboxilato, sulfonato, y fosfato.

Análogo de MPA - un MPA modificado, que puede competir con el MPA análogo por un receptor, proporcionando la modificación medios para unir el MPA a otra molécula. El análogo de MPA generalmente diferirá del MPA en más que el reemplazo de un hidrógeno con un enlace que una el análogo de MPA a un nodo o marcador, pero no es necesario. El análogo de MPA puede unirse al receptor de una manera similar al MPA. El análogo podría ser, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra el idiotipo de un anticuerpo a MPA.

Miembro de un par de unión específico (miembro de "sbp") - una de dos diferentes moléculas que tienen un área en la superficie o en una cavidad que se une específicamente a y por lo tanto se define como complementario con una organización espacial y polar particular de la otra molécula. Los miembros del sbp se pueden referir como ligando y receptor tal como miembros de un par inmunológico, por ejemplo, antígeno-anticuerpo. Los miembros complementarios del sbp se unen el uno al otro, como por ejemplo, un ligando y su receptor complementario. Con respecto a los dos miembros complementarios del sbp, uno puede ser denominado como el "copartícipe de unión" por el otro. Los miembros de sbp pueden ser pares inmunológicos tales como antígeno y anticuerpo, o pares no inmunológicos tales como avidina y biotina. Los miembros de sbp también pueden ser moléculas pequeñas o residuos de moléculas pequeñas y sus receptores. Las moléculas pequeñas tienen un peso molecular de aproximadamente 100 - 2.000, preferentemente 150 - 1.000, y existe o puede ser preparado un receptor para la molécula pequeña. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen derivados de biotina, ácido lisérgico, fluoresceína o un derivado de fluoresceína, y vitamina B_{12}, con los receptores correspondientes que son avidina o estreptavidina, ácido anti-lisérgico, anti-fluoresceína y factor intrínseco, respectivamente. Las moléculas pequeñas a menudo están unidas covalentemente a otros miembros del sbp para formar un conjugado que tiene al menos una, y frecuentemente 2 - 20, moléculas pequeñas. El enlace de la molécula pequeña al miembro del sbp se puede lograr mediante reacciones químicas que dan lugar a sustituir un átomo de hidrógeno de la molécula pequeña por un enlace al miembro del sbp o por un grupo de unión entre la molécula pequeña y el miembro del sbp de cualquier tamaño pero preferentemente no mayor que lo necesario para permitir la unión al conjugado de un receptor para la molécula pequeña y del miembro del sbp.

Ligando - cualquier compuesto orgánico para el que exista un receptor natural o se pueda preparar.

Receptor (antiligando) - cualquier compuesto o composición capaz de reconocer una organización espacial y polar particular de una molécula, por ejemplo, sitio epitópico o determinante. Receptores ilustrativos incluyen receptores que se dan de forma natural, por ejemplo, globulina de unión a tirosina, anticuerpos, enzimas, fragmentos Fab, lectinas, ácidos nucleicos, proteina A, componente de complemento C1q, y similares.

Unión específica - el reconocimiento específico de una de dos diferentes moléculas por la otra comparado con el reconocimiento sustancialmente menor de otras moléculas. Generalmente, las moléculas tienen áreas en sus superficies o en cavidades que dan lugar al reconocimiento específico entre las dos moléculas. Ejemplos de unión específica son las interacciones anticuerpo-antígeno, interacciones enzima-substrato, interacciones polinucleótidas, etcétera.

Unión no específica - unión no covalente entre moléculas que es relativamente independiente de las estructuras superficiales específicas. La unión no específica puede resultar de varios factores que incluyen interacciones hidrófobas entre moléculas.

Complejo no específico de MPA - MPA no específicamente enlazado a otra sustancia, generalmente, sustancias endógenas presentes en una muestra que se va a analizar. Las sustancias endógenas son generalmente proteínas endógenas tales como proteínas del plasma, por ejemplo, albúmina, globulinas, glicoproteínas, lipoproteínas, y similares.

Anticuerpo - una inmunoglobulina que se une específicamente a y por lo tanto se define como complementaria de una organización espacial y polar particular de otra molécula. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y se puede preparar por técnicas que son bien conocidas en el campo tales como inmunización de un anfitrión y recolección del suero (policlonal) (véase, por ejemplo, Parker, Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, N.J., U.S., 1976), Butler, J. Immunol. Meth. 7: 1-24 (1975); Broughton y Strong, Clin. Chem. 22: 726-732 (1976); y Playfair, et al., Br. Med. Bull. 30: 24-31 (1974)) o preparando líneas continuas de células híbridas y recolectando la proteína secretada (monoclonal) (véase, por ejemplo, Khler y Milstein, Nature 265: 495-497, 1975, Lymphocyte Hybridomas, ed. Melchers, et al. Springer-Verlag (New York 1978), Nature 266: 495 (1977), Science 208: 692 (1980), y Methods of Enzymology 73 (Part B): 3-46 (1981)) o clonando y expresando secuencias de nucleótido o sus versiones mutadas que codifiquen por lo menos las secuencias de aminoácidos requeridas para la unión específica de los anticuerpos naturales. Los anticuerpos pueden incluir una inmunoglobulina completa o sus fragmentos, las inmunoglobulinas que incluyen las diversas clases e isotipos, tales como IgA, IgD, IgE, lgG1, IgG2a, lgG2b e lgG3, IgM, etc. Sus fragmentos pueden incluir Fab, Fv y F(ab')_{2}, Fab', y similares. Además, se pueden utilizar agregados, polímeros, y conjugados de inmunoglobulinas o sus fragmentos cuando sea apropiado siempre y cuando se mantenga la afinidad de unión por una molécula particular.

Hapteno - un compuesto capaz de unión específica a los anticuerpos correspondientes, pero que ellos mismos no actúan como inmunógenos (o antígenos) para la preparación de anticuerpos. Los anticuerpos que reconocen un hapteno se pueden preparar contra compuestos formados por el hapteno unido a un portador inmunogénico (o antigénico). Los haptenos son un subconjunto de los ligandos.

Portador inmunogénico - un grupo que, cuando se conjuga con un hapteno y se inyecta en un mamífero, inducirá una respuesta inmune y provocará la producción de anticuerpos que se unan al hapteno, en este caso MPA. Los portadores inmunogénicos también son denominados como portadores antigénicos. Los portadores inmunogénicos típicos incluyen, sin limitación, poli(aminoácidos), polisacáridos, ácidos y partículas nucleicos (materiales biológico y sintético). Una amplia variedad de tales portadores se divulgan en Davalian, et al., patente de EE.UU. Nº 5.089.390, columna 4, línea 57 a columna 5, línea 5, se incorporan en la presente memoria como referencia. Otros portadores inmunológicos adecuados incluyen albúminas, proteínas del suero, por ejemplo, globulinas, proteínas del cristalino y lipoproteínas. Proteínas ilustrativas incluyen seroalbúmina bovina, hemocianina de lapa californiana ("KLH"), ovoalbúmina y gamma-globulina bovina.

Soporte o superficie - una fase sólida, típicamente un soporte o superficie, que es un material insoluble en agua poroso o no poroso que puede tener una cualquiera de varias formas, tales como tira, barra, placa, pocillo, partícula y perla. Una amplia variedad de soportes adecuados se describen en Ullman, et al., patente de EE.UU. Nº 5.185.243, columnas 10-11, Kurn, et al., patente de EE.UU. Nº 4.868.104, columna 6, líneas 21-42 y Milburn, et al., patente de EE.UU. Nº 4.959.303, columna 6, líneas 14-31. La unión de miembros del sbp a un soporte o superficie se puede lograr por técnicas bien conocidas, comúnmente accesibles en la literatura. Véase, por ejemplo, "Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, New York (1978) y Cuatrecasas, J. Biol. Chem., 245:3059 (1970). Según se utiliza en la presente memoria, la terminología "capaz de estar unido a un soporte" significa, por ejemplo, que un reactivo, tal como el anticuerpo de anti-analito, está enlazado al primer miembro del sbp o a una molécula pequeña y un segundo miembro del sbp complementario o receptor de la molécula pequeña, está sucesivamente unido a un soporte. Alternativamente, un receptor del anticuerpo del anti-analito, tal como un anticuerpo anti-ratón, se enlaza a un soporte y se utiliza para capturar el anticuerpo del anti-analito. Por lo tanto, el anticuerpo del anti-analito no está actualmente enlazado a un soporte, pero llegará a estar enlazado, cuando se añade un miembro del sbp complementario o receptor.

Sistema de producción de señal ("sps") - uno o más componentes, siendo al menos un componente un marcador detectable, que genera una señal detectable que se relaciona con la cantidad marcador enlazado y/o no enlazado, por ejemplo, la cantidad de marcador enlazado o no enlazado al compuesto a ser detectado. El marcador es cualquier molécula que produce o puede ser inducida a producir una señal y preferentemente es un agente de fluorescencia, radio-marcador, enzima, agente de quimioluminiscencia o fotosensibilizador. Así, la señal se detecta y/o mide por detección de fluorescencia o luminiscencia, radioactividad, actividad enzimática o absorbancia de luz.

Los marcadores adecuados incluyen, a modo de ilustración y no de limitación, enzimas tales como fosfatasa alcalina, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ("G6PDH") y peroxidasa de rábano picante; ribozima; un sustrato para una replicasa tal como la replicasa QB; promotores; colorantes; agentes de fluorescencia, tales como fluoresceína, compuestos de rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftalaldehído, y fluorescamina; agentes de quimioluminiscencia tales como isoluminol; sensibilizadores; coenzimas; sustratos de enzimas; radiomarcadores tales como ^{125}I, ^{131}I, ^{14}C, ^{3}H, ^{57}Co y ^{75} Se; partículas tales como partículas de látex o carbón; sol metálico; micelas; liposomas; células, etc., que se pueden marcar además con un colorante, catalizador u otro grupo detectable. Enzimas y coenzimas adecuadas se divulgan en Litman, et al., patente de EE.UU. Nº 4.275.149, columnas 19-28, y Boguslaski, et al., patente de EE.UU. Nº 4.318.980, columnas 10-14; agentes fluorescentes y agentes luminiscentes adecuados se divulgan en Litman, et al., patente de EE.UU. Nº 4.275.149, en columnas 30 y 31.

Hay numerosos métodos por los cuales el marcador puede producir una señal perceptible por medios externos, por ejemplo, de manera deseable por examen visual o por radiación electromagnética, calor, y reactivos químicos. El marcador u otros miembros del sps también se pueden enlazar a un miembro del sbp, a otra molécula o a una soporte.

El marcador puede producir directamente una señal, y por lo tanto, no se requieren componentes adicionales para producir una señal. Numerosas moléculas orgánicas, por ejemplo agentes de fluorescencia, son capaces de absorber luz ultravioleta y visible, en los que la absorción de luz transfiere energía a estas moléculas y las eleva a un estado excitado de energía. Después esta energía absorbida se disipa por emisión de luz en una segunda longitud de onda. Otros marcadores que producen directamente una señal incluyen isótopos radioactivos y colorantes.

Alternativamente, el marcador puede necesitar otros componentes para producir una señal, y entonces el sistema de producción de señal incluiría todos los componentes requeridos para producir una señal mensurable, que puede incluir substratos, coenzimas, potenciadores, enzimas adicionales, sustancias que reaccionan con productos enzimáticos, catalizadores, activadores, cofactores, inhibidores, captadores, iones metálicos, y una sustancia de unión específica requerida para la unión de las sustancias que generan la señal. Una discusión detallada de los sistemas de producción de señal adecuados se puede encontrar en Ullman, et al. patente de EE.UU. Nº 5.185.243, columnas 1 1-13.

El marcador se puede unir covalentemente a numerosos miembros del sbp: un anticuerpo; un receptor para un anticuerpo; un receptor que es capaz de unirse a una molécula pequeña conjugada con un anticuerpo; o un análogo del ligando. El enlace del marcador al miembro del sbp se puede conseguir mediante reacciones químicas que den lugar a sustituir un átomo de hidrógeno del marcador con un enlace al miembro del sbp o puede incluir a un grupo de unión entre el marcador y el miembro del sbp. También se pueden enlazar covalentemente otros miembros del sps a los miembros del sbp. Por ejemplo, dos miembros del sps tales como un agente de fluorescencia y un extintor de fluorescencia pueden estar cada uno unido a un anticuerpo diferente que forma un complejo específico con el analito. La formación del complejo trae el agente de fluorescencia y el extintor de fluorescencia muy próximos, permitiendo así al extintor de fluorescencia interaccionar con el agente de fluorescencia para producir una señal. Los métodos de conjugación son bien conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Rubenstein, et al., patente de EE.UU. Nº 3.817.837. Esta invención también contempla tener un anticuerpo enlazado a un primer miembro del sps y un marcador detectable como el segundo miembro del sps. Por ejemplo, cuando el marcador detectable se enlaza a un análogo del ligando, la extensión de la unión del anticuerpo al análogo se puede medir detectando la señal producida por la interacción de los miembros del sps.

Materiales auxiliares - Diversos materiales auxiliares se emplearan con frecuencia en un análisis de acuerdo con la actual invención. Por ejemplo, los tampones estarán generalmente presentes en el medio de análisis, así como estabilizadores para el medio de análisis y los componentes del análisis. Frecuentemente, además de estos aditivos, se pueden incluir proteínas adicionales, tales como albúminas, o tensioactivos, particularmente tensioactivos no iónicos, potenciadores de la unión, por ejemplo, polialquilenglicoles, conservantes, antimicrobianos, o similares.

Según se menciona más arriba, un aspecto de la presente invención es un método de análisis para medir la cantidad de ácido micofenólico en una muestra sospechosa de contener ácido micofenólico y proteínas endógenas que se unen al ácido micofenólico. En el método se combinan en un medio la muestra, los reactivos de análisis para medir la cantidad del ácido micofenólico, y un agente de liberación en una cantidad eficaz para liberar el ácido micofenólico de uno de sus complejos con proteínas endógenas. La cantidad de ácido micofenólico se determina por medio de los reactivos de análisis.

El "agente de liberación" es cualquier compuesto capaz de liberar al MPA de uno de sus complejos de proteina. Los agentes de liberación adecuados incluyen ácido 8-anilino-1-naftalenosulfónico, ácido anísico, ácido clofibrico (ácido p-clorofenoxidimetilacético), ácido benzoico, ácido 3-(p-hidroxifenil)propiónico, salicilato (ácido salicílico), ácido p-metoxisalicílico, etcétera.

En la presente invención es importante que el agente de liberación no se una en un grado significativo a un miembro del sbp o copartícipe de unión para el MPA utilizado en un análisis de MPA. Lo que constituye un grado significativo depende de la sensibilidad necesaria para el análisis; cuanto mayor es la sensibilidad requerida para el análisis, menos tolerable es la cantidad de unión entre un miembro del sbp o copartícipe de unión para el analito. Por la terminología "grado significativo" se entiende que el agente de liberación particular no se une a un miembro del sbp o copartícipe de unión en una extensión que afectaría la exactitud o la naturaleza cuantitativa o cualitativa del resultado del análisis. Por consiguiente, cualquier unión entre un agente de liberación particular y un miembro del sbp o un copartícipe de unión debe ser preferentemente menor que el 1%, más preferentemente, menor que el 0,01%, lo más preferentemente, el 0%. Además, el agente de liberación particular seleccionado debe tener, si tiene, interferencia mínima con la unión de los miembros del sbp uno a otro o con la capacidad del sistema de producción de señal para producir una señal en relación con la presencia o cantidad de MPA en una muestra.

Por la terminología "cantidad eficaz" se entiende una cantidad suficiente para causar la liberación de MPA de tal complejo de modo que preferentemente al menos aproximadamente el 90%, más preferentemente, al menos aproximadamente el 95%, más preferentemente, por lo menos el 99% y lo más preferentemente el 100% del MPA esté en una forma exenta de tal complejo. La cantidad eficaz del agente de liberación que se empleará en un análisis particular dependerá de la naturaleza del análisis y los reactivos empleados en el mismo. Preferentemente, la cantidad eficaz se determina empíricamente basándose en el presunto intervalo de concentración de MPA en la muestra. En general, una cantidad eficaz de agente de liberación es una cantidad en exceso sobre la presunta cantidad de MPA. Para un análisis de MPA, como forma de ilustración y no de limitación, cuando el nivel esperado de fármaco en una muestra es aproximadamente 1,5 - 45 \muM, la cantidad eficaz de agente de liberación en el medio de análisis es aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mM, preferentemente, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 mM, más preferentemente, de aproximadamente 2 a 12 mM.

Muchos de los compuestos útiles como agentes de liberación en la presente invención están comercialmente disponibles y/o su síntesis es conocida en la literatura.

En análisis de MPA se puede realizar o sin separación (homogéneo) o con separación (heterogéneo) de cualquiera de los componentes o productos de análisis. Inmunoensayos homogéneos se ejemplifican mediante los productos de análisis EMIT® (Behring Diagnostics Inc. antes Syva Company, San José, CA), divulgados en Rubenstein, et al., patente de EE.UU. Nº 3.817.837, columna 3, línea 6 a columna 6, línea 64; métodos de inmunofluorescencia tales como los divulgados en Ullman, et al., patente de EE.UU. Nº 3.996.345, columna 17, línea 59 a columna 23, línea 25; técnicas de canalización enzimática tales como las divulgadas en Maggio, et al., patente de EE.UU. Nº 4.233.402, columna 6, línea 25 a columna 9, línea 63; y otros inmunoensayos enzimáticos tales como el ensayo con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas ("ELISA") se discuten en Maggio, E.T. supra. Ejemplo de análisis heterogéneos es el radioinmunoensayo, divulgado en Yalow, et al., J. Clin. Invest. 39:1157 (1960). Los inmunoensayos implican el uso de reactivos de inmunoensayo en la detección de un analito. Tales reactivos de inmunoensayo incluyen anticuerpos, antígenos y haptenos, y sus conjugados, marcados o no marcados.

El análisis generalmente se lleva a cabo en un medio acuoso tamponado a un pH moderado, que generalmente proporciona la sensibilidad óptima de análisis. El medio acuoso puede ser solamente agua o puede incluir cierto porcentaje de un cosolvente, por ejemplo, de 0,1 - 40 volúmenes por ciento de un solvente orgánico. El pH del medio estará generalmente en el intervalo de 4 -11, más generalmente en el intervalo de 5 - 10, y preferentemente en el intervalo de 6,5 - 9,5. El pH generalmente será un compromiso entre la unión óptima de los miembros de unión de cualquier par de unión específico, la liberación óptima del MPA de uno de sus complejos no específicos de acuerdo con la presente invención, y el pH óptimo para otros reactivos del análisis tales como los miembros del sistema de producción de señal.

Se pueden utilizar diversos tampones para conseguir el pH deseado y mantener el pH durante la determinación. Tampones ilustrativos incluyen borato, fosfato, carbonato, tris y barbital. El tampón particular empleado no es crítico para esta invención, pero en un análisis individual se puede preferir un tampón u otro.

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Normalmente se emplean temperaturas moderadas para llevar a cabo el análisis y generalmente temperaturas constantes durante el periodo de la medida, particularmente para determinaciones de velocidad. Normalmente las temperaturas de incubación estarán en el intervalo de 5 - 45ºC, más generalmente de 15 - 40ºC. Las temperaturas durante las medidas generalmente estarán en el intervalo de 10 - 50ºC, más normalmente de 15 - 40ºC.

La concentración de MPA que se puede ensayar generalmente varia desde 10^{-4} a 10^{-13} M, más normalmente desde 10^{-5} a 10^{-7} M. Consideraciones, tales como si el análisis es cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo (relativo a la cantidad de analito presente en la muestra), la técnica de detección particular y la concentración del analito determinará normalmente las concentraciones de los diversos reactivos.

Las concentraciones de los diversos reactivos el medio de análisis se determinaran generalmente por el intervalo de concentraciones de interés del MPA. Sin embargo, la concentración final de cada uno de los reactivos normalmente se determinará de forma empírica para optimizar la sensibilidad del análisis sobre el intervalo. Es decir, una variación en la concentración de MPA que sea de significación debe proporcionar una diferencia exactamente mensurable de la señal.

Mientras que el orden de adición se puede variar ampliamente, habrá ciertas preferencias dependiendo de la naturaleza del análisis. El orden más simple de adición es añadir todos los materiales simultáneamente y determinar el efecto que el medio de análisis tiene sobre la señal como en un análisis homogéneo. Alternativamente, los reactivos se pueden combinar secuencialmente. Opcionalmente, una etapa de incubación puede estar implicada subsecuentemente a cada adición, extendiéndose generalmente desde 30 segundos a 6 horas, más generalmente desde 1 minuto a 1 hora.

Los siguientes ejemplos describen adicionalmente las realizaciones específicas de la invención, y están pensados para describir y no para limitar el alcance de la invención.

En un análisis homogéneo después de que todos los reactivos se hayan combinado, la señal se determina y se relaciona con la cantidad de MPA en la muestra. Por ejemplo, en un análisis EMIT de MPA, una muestra sospechosa de contener MPA se combina en un medio acuoso o simultáneamente o secuencialmente con un conjugado MPA-enzima y el anticuerpo capaz de reconocer el MPA y el conjugado. El medio también contiene a cantidad eficaz de un agente de liberación. Generalmente, se añade un sustrato para la enzima lo cual da como resultado la formación de un producto cromogénico o fluorogénico tras la reacción catalizada por la enzima. Las enzimas preferidas son glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y fosfatasa alcalina. El agente de liberación actúa para liberar al MPA de cualquiera de sus complejos no específicos que pueda estar presente en la muestra. El MPA y el conjugado MPA-enzima compiten por los sitios de unión en el anticuerpo. Después se determina la actividad enzimática en el medio, generalmente por medios espectrofotométricos, y se compara con la actividad enzimática determinada cuando los calibradores o muestras de referencia, en las que está presente una cantidad conocida de MPA, se ensayan. Típicamente, los calibradores se ensayan de una manera similar al ensayo de la muestra sospechosa de contener MPA. Los calibradores contendrán típicamente concentraciones diferentes, pero conocidas, del analito MPA que se va a determinar. Preferentemente, los intervalos de concentración presentes en los calibradores abarcarán el intervalo de presuntas concentraciones de MPA en las muestras desconocidas.

Los análisis heterogéneos generalmente implican una o más etapas de separación y pueden ser competitivos o no competitivos. Una variedad de formatos de análisis competitivos y no competitivos se divulgan en Davalian, et al., patente de EE.UU. Nº 5.089.390, columna 14, línea 25 a columna 15, línea 9. En un típico análisis competitivo un soporte que tiene un anticuerpo para MPA enlazado a él se pone en contacto con un medio que contiene la muestra y el MPA conjugado con un marcador detectable tal como una enzima. El medio también contiene una cantidad eficaz de un agente de liberación. El MPA en la muestra compite con el conjugado para unirse al anticuerpo. Después de separar el soporte y el medio, se determina la actividad del marcador del soporte o del medio mediante técnicas convencionales y se relaciona con la cantidad de MPA en la muestra.

Según se menciona más arriba, la presente invención proporciona ciertas ventajas. Se reduce sustancialmente o se elimina la recuperación variable de MPA como una función de la concentración de proteína relativa a una matriz de calibradores. Además, se reduce sustancialmente o se elimina la recuperación variable de MPA como una función de la presencia de fármacos co-administrados porque se reduce o se elimina la competición por los sitios de unión en sustancias endógenas de unión no específica entre el MPA y otros fármacos que se unen a tales sustancias.

En un análisis de MPA según la presente invención, se emplean anticuerpos que son capaces de unirse al MPA y a sus ésteres y metabolitos. En otro análisis de MPA según la presente invención, se utilizan anticuerpos que son capaces de distinguir entre MPA y ésteres de micofenolato, tales como MPA-M. En otra realización de un análisis de MPA según la invención, los anticuerpos empleados son capaces de distinguir entre MPA y metabolitos de MPA, tales como MPA-G.

La unión del anticuerpo al MPA se puede detectar de numerosas formas que son bien conocidas en la técnica. La unión del anticuerpo y el MPA forma un inmunocomplejo que se puede detectar directa o indirectamente. Los inmunocomplejos se detectan directamente, por ejemplo, cuando el anticuerpo empleado está conjugado con un marcador. El inmunocomplejo se detecta indirectamente examinando el efecto de la formación del inmunocomplejo en un medio de análisis sobre un sistema de producción de señal o empleando un receptor marcado que se una específicamente a un anticuerpo de la invención.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a los kits útiles para realizar convenientemente un análisis para la determinación de MPA. Un kit de acuerdo con la presente invención comprende en combinación empaquetada un copartícipe de unión para MPA y un agente de liberación. El kit puede comprender además un conjugado de MPA enlazado a un marcador detectable.

Para mejorar la versatilidad de la invención objetivo, los reactivos del kit se pueden proporcionar en combinación empaquetada, en el mismo envase o en envases separados, en forma líquida o liofilizada para que la relación de los reactivos proporcione la optimización sustancial del método y el análisis. Cada uno de los reactivos puede estar en envases separados o se pueden combinar varios reactivos en uno o más envases dependiendo de la reactividad cruzada y estabilidad de los reactivos. Por ejemplo, se puede proporcionar una solución acuosa del agente de liberación en un envase separado. Alternativamente, se puede incluir un agente de liberación en uno de los reactivos para llevar a cabo un análisis. Por ejemplo, se puede incluir el agente de liberación en un medio acuoso que contenga un reactivo anticuerpo; tal medio se empaqueta en un envase separado.

El kit puede incluir además otros reactivos empaquetados por separado para llevar a cabo un análisis tales como miembros adicionales del sbp, reactivos auxiliares tales como un sustrato auxiliar de enzima, etcétera. Las cantidades relativas de los diversos reactivos en los kits se pueden variar ampliamente para mantener concentraciones de los reactivos que optimicen sustancialmente las reacciones que tienen que ocurrir durante el presente método y para adicionalmente optimizar sustancialmente la sensibilidad del análisis. Bajo las circunstancias apropiadas se puede proporcionar uno o más de los reactivos en el kit como polvo seco, generalmente liofilizado, que incluye los excipientes, que en disolución mantendrán una solución del reactivo que tiene las concentraciones apropiadas para realizar un método o análisis de acuerdo con la presente invención. El kit puede incluir además una descripción escrita de un método de acuerdo con la presente invención según se describe más arriba.

Ejemplos

La invención se demuestra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos ilustrativos. En la presente memoria, partes y porcentajes están en peso a menos que se indique lo contrario. Las temperaturas están en grados Centígrados (ºC)

Ejemplo 1 Análisis de MPA

Se prepararon los siguientes reactivos:

Reactivo A

Nº	COMPONENTE	% Comp.	Comp. en	PROCEDENCIA DEL
		(en peso)	peso/vol. (g/L)	COMPONENTE
			(a 20ºC)
1	NAD	2,346	23,88	Boehringer mannheim
2	G6P	0,615	6,26	Calzyme
3	Cloruro sódico	0,491	5,00	Mallinckrodt
4	MIT	0,098	1,00	Boehringer mannheim
5	Na2 EDTA	0,036	0,37	Sigma
6	Pluronic® 25R2	0,010	0,1028	BASF chemicals
7	Ácido o-anísico	0,149	1,52	Sigma
8	BSA	0,098	1,00	Miles diagnostics
9	Azida sódica	0,092	0,94	Amersham USB
10	Anticuerpo a MPA	0,001	0,0075	(1)
11	Agua	96,062	977,82	Desionizada por millipore

		100,00	1017,9
	Ph	5,6 \pm 0,1

Reativo B

Nº	COMPONENTE	% Comp.	Comp. en	PROCEDENCIA DEL
		(en peso)	peso/vol. (g/L)	COMPONENTE
			(a 20ºC)
12	Tris base	2,120	21,54	Sigma
13	Tris HCI	3,447	35,02	Sigma
14	BLG	0,098	1,00	International enzymes
15	Na2 EDTA	0,036	0,37	Sigma
16	MIT	0,098	1,00	Boehringer mannheim
17	Azida sódica	0,093	0,94	Amersham USB
18	Pluronic 25R2	0,030	0,3084	BASF chemicals
19	MPA-G6PDH	0,00005	0,0005	(2)
20	Anticuerpo estabilizante	0,00007	0,00075	(1)
21	Agua	94,077	955,92	Desionizada por millipore

		100,000	1016,1
	pH	8,15 \pm 0,15

(1) Preparado de una manera similar a ésa descrita por Galfre, et al., (1981). Preparación de anticuerpos monoclonales: estrategias y procedimientos, Methods Enzymol. 73: 3-46

(2) Preparado de una manera similar a ésa descrita por Grabarek, et al. (1990). Procedimiento de reticulación de longitud cero con el uso de ésteres activos. Anal. Biochem. 185:131-135.

(3) Pluronic es una marca comercial registrada de BAFS Corporation.

Abreviaturas

NAD:	dinucleótido de nicotinamida adenina
G6P:	D-glucosa-6-fosfato, sal monosódica
ácido o-anísico:	ácido o-metoxibenzoico
BSA:	seroalbúmina bovina
Na2 EDTA:	ácido etilenediaminotetraacético, sal disódica, dihidrato
MIT:	N-metilisotiazolona, hidrocloruro
MPA:	Ácido micofenólico
Tris Base:	tris(hidroximetil)aminometano
Tris HCI:	hidrocloruro de Tris
BLG:	\beta-lactoglobulina
MPA-G6PDH:	Ácido micofenólico conjugado a glucosa-6-fosfato deshidrogenasa

Los reactivos A y B se prepararon como sigue.

Se preparó una solución de Pluronic 25R2 del 1,028% peso/peso en el intervalo de 2 a 25ºC para el uso en ambos reactivo.

El Reactivo A se preparó primero haciendo una solución de ácido anísico. El ácido anísico se disolvió en NaOH 1N en una cantidad igual a 25 mL por 1,52 gramos de ácido anísico. En un recipiente separado se pesó el 70% del peso final de agua desionizada, al cual se añadieron los componentes 1 a 5 inclusive y también el componente 6 utilizando la solución preparada de Pluronic 25R2 en 10 mL de la misma por 1017,9 g (o 1,0 litro) de solución final. Esta solución se agitó y se añadió la solución de ácido anísico. Cuando fue necesario, el pH de la preparación se ajustó dentro del intervalo de 5,50 a 5,70 con NaOH 6N. Después, se añadieron los componentes 8 y 9 y se agitó la solución. Cuando fue necesario, se ajustó el pH al intervalo arriba mencionado. Después la solución se llevó a su peso final con agua desionizada y se filtró a través de un filtro de 0,2 micrón. El pH final fue de 5,50 a 5,70. La solución resultante se designó como el diluyente A. El reactivo A se completó añadiendo el anticuerpo, es decir, el componente 10, al diluyente A a una concentración final de anticuerpo de 7,5 mg/L (o 7,5 \mug/mL).

Hay que señalar que el Reactivo A contenía BSA, que como la seroalbúmina humana se une al MPA. Sin embargo, se encontró que el BSA era un estabilizador preferido del Reactivo A sobre ciertas otras proteínas que se evaluaron, y así, por esta razón, se incluyó en el Reactivo A. Se formularía, por lo tanto, cualquier agente de liberación para MPA para superar este efecto del BSA así como cualquier unión de la muestra que se analiza. La formulación anteriormente mencionada tenía un exceso mayor que un 500 molar de ácido o-anísico a BSA en el Reactivo A. Se encontró que esta concentración de ácido o-anísico era más que suficiente para liberar todo el MPA en el sistema y mantenerlo desplazado.

Para el Reactivo B se pesó agua desionizada en una cantidad igual al 80% del peso final. A esta agua se añadieron con agitación los componentes 12 a 17 inclusive así como el componente 18, utilizando 30 mL de solución de Pluronic 25R2 por 1016,1 g (o 1,0 litro) de solución final. La solución se llevó al peso final con agua desionizada, pH en el intervalo de 8,0 a 8,3, y se filtro a través del filtro de 0,2 micrón. En este punto la solución se designó como el diluyente B, que se utilizó para hacer el Reactivo B por adición de volúmenes o pesos relativamente insignificantes de los componentes 19 y 20. Por ejemplo a 10 L (o 10,18 kg) de Reactivo B se añadieron 0,37 mL de anticuerpo de estabilización a 20,6 mg/mL y 6,1 ml del conjugado a 0,8 mg/mL. El anticuerpo de estabilización, componente 20, se añadió a una concentración final de 0,75 mg/L (o 0,75 \mug/mL). El conjugado, componente 19, se añadió para alcanzar una velocidad de 300 \pm 10 mA/min; la velocidad se define como el cambio en absorbancia a 340 nm por minuto de tiempo de reacción y se expresa generalmente como mA/min.

Las velocidades se determinaron en un instrumento Cobas Mira Plus (Roche Diagnostics Systems, Inc., Branchburg, New Jersey). La temperatura se mantuvo a 37ºC durante todo el análisis. Los cronometrajes se llevaron a cabo en ciclos siendo cada ciclo de 25 segundos. En el ciclo 1, el primer ciclo, se mezclaron 75 \muL de agua y 3 \muL de una muestra con 155 \muL del diluyente A en una cubeta de 0,6 cm de longitud de paso. Esta mezcla se incubó hasta la adición del Reactivo B en el ciclo 7. para establecer la velocidad del conjugado, la muestra utilizada no contuvo nada de MPA. En el ciclo 7, se añadieron entonces a la cubeta setenta y cinco \muL de Reactivo B seguidos por 20 \muL de agua, se mezcló, y se incubó hasta el final del ciclo 25 en cuyo momento el análisis se terminó. Durante el análisis, las lecturas de absorbancia a 340 nm se hicieron al final de cada ciclo. Después se hizo un mejor ajuste lineal utilizando solamente las 12 lecturas consecutivas de absorbancia de los ciclos 14 a 25 versus el tiempo en minutos. La pendiente de esta línea fue la velocidad.

Después se hicieron las preparaciones del Reactivo A añadiendo anticuerpo a diferentes niveles al diluyente A. Después estos niveles de valoración se desarrollaron con Reactivo B y calibradores con diferentes niveles de MPA (por ejemplo, 0, 0,5, 2,0, 5,0, 10,0, y 15,0 \mug/mL). Entonces se utilizó el nivel de anticuerpo que daba la velocidad máxima de separación entre los dos calibradores del extremo inferior y entre los dos calibradores del extremo superior para formular el Reactivo A final.

Una vez que se prepararon el Reactivo A y el Reactivo B, se utilizaron junto con los calibradores para determinar concentraciones desconocidas de MPA.

Para determinar una concentración desconocida de MPA, los calibradores se desarrollaron con los Reactivos A y B, y se determinaron las velocidades para cada uno según lo descrito previamente, excepto que el Reactivo A que contiene el anticuerpo se sustituyó por el diluyente A. Típicamente se determinaron velocidades duplicadas para cada calibrador y se promediaron. Los parámetros de la curva de calibración se calcularon utilizando las concentraciones de MPA, velocidades promedio de calibrador y un modelo matemático apropiado tal como un ajuste al modelo logit/log 4. El ajuste se puede hacer en línea por el analizador o por programas de ordenador apropiados que optimicen los parámetros Ro, Kc, a y b en la ecuación siguiente:

R=Ro+ \frac{Kc}{1+exp[-(a+b*lnC)]}

en la que

Ro, Kc, a, b	son parámetros de la curva
C	es la concentración de MPA
R	es la velocidad observada con la concentración de MPA

Solucionar esta ecuación para C permitió que se determinara la concentración desconocida de MPA a partir de su velocidad, R, y los parámetros de la curva como:

C = exp[ [a+ In[ Kc/(R - Ro) -1.0 ]]/ -b]

Se resumen los resultados como sigue:

La eficacia de la formulación con ácido o-anísico se evaluó midiendo el acuerdo entre la cuantificación de una adición de cantidad conocida de 10 \mug/mL de MPA en un mezcla de plasma humano normal (NHP) y la cuantificación de una adición de cantidad conocida similar en solución salina tampón fosfato de Dulbecco (PBS), comprado a BioWhittaker, Walkersville, Maryland. Para ambos, NHP y PBS se hicieron dos adiciones de cantidades conocidas separadas. El PBS contenía 0,2 g/L de KCI, 0,2 g/L de KH_{2}PO_{4}, 2,16 g/L de Na_{2}HPO_{4}\cdot7H_{2}0, y 8,0 g/L de NaCI a un pH final de 6,4 a 7,6. El PBS no tenía ninguna proteína y por eso no podía ocurrir ninguna unión de proteína al MPA. Los calibradores fueron en NHP con 7 niveles de MPA a 0, 0,3, 0,5, 2,5, 5, 10, y 20 \mug/mL. Las adiciones de cantidad conocida en NHP y PBS cuantificaron casi igual, dando promedios respectivos de 10,2 y 10,4 \mug/mL de MPA (desviación típica combinada (sd) = 0,4 \mug/mL). Estos resultados indican que el método medía MPA total y no estaba afectado por la unión de seroalbúmina normal al MPA.

Ejemplo 2 Agentes de liberación en un análisis de MPA

En este ejemplo se compararon cuatro agentes, ácido o-anísico (o-AA), sus isómeros meta (m-AA) y para (p-AA), y ácido 8-anilino-1-naftalenosulfónico (ANS). Todos los ácidos anísicos se compraron a Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri; el ANS se obtuvo de Calbiochem, La Jolla, California.

En estos experimentos, el diluyente para el Reactivo A (Rgt A) se hizo de forma algo diferente que en la del Ejemplo 1. Sin embargo, la composición era la misma, a excepción del componente 7 (agente de liberación, ácido o-anísico) y del componente 10 (concentración del anticuerpo de MPA). Se prepararon cinco diluyentes, cuatro con uno de cada uno de los agentes arriba mencionados y un control sin agente. Primero, se hizo una solución 2x de la manera descrita en el Ejemplo 1 pero que tenía solamente los componentes 1 a 5 y 9 en dos veces las cantidades enumeradas. Después, para tres de los diluyentes, se pesó cada uno de los tres isómeros de ácido anísico para alcanzar una molaridad final de 12,5 mM y se predisolvió en un cuarto el volumen final de agua y una cantidad mínima de NaOH 6 N (aproximadamente 6 gotas por 0,2 gramo de ácido anísico). Para el cuarto diluyente, se pesó el agente, ANS, para dar una concentración final de 0,25 mM y se añadió a un cuarto del volumen final de agua. El quinto diluyente, el control, no tenía ningún agente de liberación. Para hacer cada uno de estos cinco diluyentes, se combinaron las cantidades apropiadas de la solución 2x, la cantidad 1x de BSA, el componente 8, y la cantidad 1x de la solución de Pluronic 25R, el componente 6. Después cuatro de éstos recibieron el agente apropiado. Todos fueron bien mezclados. Cuando fue necesario, se hicieron ajustes de pH según se describe previamente y cada preparación se llevó al volumen final con agua desionizada para alcanzar concentraciones 1x de los componentes. Después se filtró cada uno de estos diluyentes A a través de un filtro de 0,2 micrón. Las medidas finales de pH en cada uno estuvieron todas entre 5,5 a 5,7. Para cada uno de estos cinco diluyentes A, se hizo un Reactivo A correspondiente añadiendo el anticuerpo a MPA para una concentración final de 6.5, \mug/mL.

El Reactivo B (Rgt B) se preparó como se describe en el Ejemplo 1 excepto que se omitió el componente 20 y se sustituyó el 0,1% de BSA (Miles Diagnostics, Kankakee, Illinois) por BLG.

Debe observarse que se limitó la concentración de ANS debido a su contribución a la absorbancia de fondo. Las concentraciones más altas de ANS crearon una lectura de absorbancia fuera de escala, impidiendo la recogida de datos de velocidad. Debe observarse además que todas las preparaciones de Reactivo A eran visualmente incoloras excepto para el Reactivo A con ANS que tenía un color amarillo canela.

En un total de dos desarrollos se examinaron los efectos de cada uno de los cuatro agentes relativos a un control sin agente con respecto a (1) absorbencia de fondo a 340 nm, (2) velocidad de una muestra negativa de MPA, (3) el intervalo de velocidad entre 0 y 10 \mug/mL de MPA, y (4) la proximidad de concordancia de velocidad de una adición de cantidad conocida de 10 \mug/mL de MPA en NHP y en tampón. Ambos desarrollos incluyeron el Reactivo A de control. El primer desarrollo evaluó el Reactivo A con la ANS mientras que el segundo desarrollo evaluó las preparaciones de Reactivo A que contenían los isómeros estructurales del ácido anísico.

Se añadió una cantidad conocida de MPA en el NHP y el tampón (Buff) para alcanzar una concentración final de 10 \mug/mL de MPA. El tampón en este ejemplo fue MES (ácido (2-[N-morfolino)-etanosulfónico, obtenido de Sigma Chemical Company) 50 mM con 0,1% (peso/volumen) de azida sódica, pH 7,1. Como con el PBS, este tampón no tiene ninguna proteína y por eso no puede ocurrir ninguna unión de MPA a proteína.

En ambos desarrollos, se midió por duplicado la absorbancia de fondo a 340 nm para cada Reactivo A en una combinación de 230 \muL de 3 \muL de NHP negativa, 72 \muL de agua desionizada, y 155 \muL de Reactivo A. La longitud de paso de la celda fue de 0,6 cm. Los valores promedio A_{340} (A = absorbancia) se encuentran en la Columna C de la Tabla 1. Se determinaron velocidades duplicadas en NHP y tampón con adición y sin adición de cantidad conocida de forma similar al Ejemplo 1. Los únicos cambios del Ejemplo 1 para las determinaciones de velocidad fueron en los cronometrajes del protocolo. Estos cambios se indican como sigue. Se añadieron Reactivo B y agua en el ciclo 4. El análisis se terminó al final del ciclo 15. Las velocidades se determinaron utilizando las 5 lecturas de absorbancia de los ciclos 11 a 15.

Los promedios de estas velocidades se resumen en la Tabla 1 en las columnas E a H.

TABLA 1

1

Se determinó la eficacia del agente de liberación restando la velocidad en NHP con adición de cantidad conocida de la velocidad en tampón con adición de cantidad conocida (columna H - columna F). Cuanto más cercano sea este valor a cero, mejor es el efecto de liberación.

Los cuatro agentes demostraron un cierto efecto sobre o la velocidad negativa y/o el intervalo de velocidad con respecto a los valores de control. Esto indicó que los agentes están teniendo efectos distintos del de reducir el efecto matriz del NHP. Los ácidos anísicos tenían un marcado aumento en la velocidad negativa sobre el control mientras que el ANS tiene poco o ningún efecto. El ANS tenía el aumento más grande en intervalo de velocidad.

Ejemplo 3 Efecto del ácido o-anísico y el ANS sobre las velocidades del MPA en presencia de fármacos co-administrados y ácido salicílico

En un estudio separado, se comparó la capacidad del ácido o-anísico o del ANS para eliminar el efecto del salicilato en las velocidades en plasma con adiciones de cantidad conocida de MPA. Se prepararon tres conjuntos de reactivos de anticuerpo (Reactivo A) con la formulación básica descrita en el Ejemplo 2 de más arriba. En un reactivo, no se añadió ningún agente de liberación; en otro reactivo, se añadió ácido o-anísico 12,5 mM, y en el tercer reactivo se añadió ANS 0,27 mM. Se preparó un Reactivo B común según se describe en el Ejemplo 2.

Se midieron las velocidades para cuatro niveles con adiciones conocidas de MPA en plasma y un control de plasma con cada uno de los conjuntos de reactivo. Se preparó un conjunto similar con adiciones conocidas de MPA en plasma con plasma que contenía fármacos co-administrados que no interferían, y se preparó otro conjunto con adiciones conocidas de MPA en plasma que contenía fármacos que no interferían más salicilato. Las concentraciones de los fármacos que no interferían en \mug/mL fueron como sigue: ampicilina, 36; cefaclor, 26; cloramfenicol, 64; trimetoprim, 2; albuterol, 7; isoproterenol, 18; metoprolol, 77; diltiazem, 28; nifedipino, 22; verapamilo, 12; fenoprofeno, 16; indometacina, 36; ketoconazol, 75; miconazol, 106; isoniazida, 120; 5-fluorouracilo, 23; griseofulvina, 10; metotrexato, 2; difenhidramina, 93; dl-efedrina, 103; fenilefrina, 76; disopiramida, 52; procainamida, 64; metoclopramida, 5; niacina, 25; niacinamida, 47; acetaminofeno, 87; y lidocaina, 43. El salicilato estaba presente en 659 \mug/mL.

Las velocidades se determinaron como se describe en el Ejemplo 2 más arriba con la excepción de la ventana de lectura de absorbancia, que se extendió al ciclo 20 en el que se terminó el análisis. Las velocidades se determinaron utilizando las 10 lecturas consecutivas de absorbancia de los ciclos 11 a 20. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

TABLA 2

	Reactivo de anticuerpo	Reactivo de anticuerpo +	Reactivo de anticuerpo
	solo	ANS	ácido o-anísico
MPA + MeOH*
0 \mug/mL	149	147	161
0,5 \mug/mL	155	157	171
2,5 \mug/mL	181	212	210
5 \mug/mL	201	237	234
15 \mug/mL	240	261	264
MPA + Nl**
0 \mug/mL	149	147	161
0,5 \mug/mL	158	162	173
2,5 \mug/mL	183	213	211
5 \mug/mL	204	236	234
15 \mug/mL	242	261	263
MPA + NI + Salicilato**
0 \mug/mL	149	149	161
0,5 \mug/mL	157	159	171
2,5 \mug/mL	190	212	211
5 \mug/mL	210	237	234
15 \mug/mL	250	261	263
* MeOH = plasma con adición de cantidad conocida de metanol como control para NI con adición de
cantidad conocida.
** NI = plasma que contiene adiciones de cantidades conocidas de fármacos co-administrados que no
interfieren además del MPA.

En resumen, el salicilato aumentó las velocidades del MPA en plasma humano normal en ausencia de agentes de liberación, lo que podría dar lugar a la cuantificación inexacta del MPA en un análisis. La presencia de un agente de liberación en el reactivo de anticuerpo eliminó este problema potencial en un análisis de MPA.

La discusión de más arriba incluye ciertas teorías en cuanto a los mecanismos implicados en la presente invención. Estas teorías no se deben interpretar para limitar la presente invención de ninguna manera, puesto que se ha demostrado que la presente invención alcanza los resultados descritos.

La descripción y los ejemplos antes mencionados divulgan completamente la invención incluyendo sus realizaciones preferidas. Las modificaciones de los métodos descritos que son obvias para los expertos ordinarios en la técnica tienen la intención de estar dentro del alcance de las reivindicaciones siguientes.

Claims

1. Un método de análisis para medir la cantidad de ácido micofenólico en una muestra sospechosa de contener ácido micofenólico y proteínas endógenas que se unen a dicho ácido micofenólico, comprendiendo dicho método:

(a): combinar en un medio acuoso (i) dicha muestra, (ii) reactivos de análisis para medir la cantidad de dicho ácido micofenólico, incluyendo dichos reactivos de análisis por lo menos un reactivo marcado y (iii) un agente de liberación en una cantidad eficaz para liberar dicho ácido micofenólico de uno de sus complejos con proteínas endógenas, para proporcionar por lo menos aproximadamente el 90% de dicho ácido micofenólico en una forma exenta de dicho complejo, y

(b): determinar la cantidad de dicho ácido micofenólico por medio de dichos reactivos.

2. Un método para la determinación de ácido micofenólico en una muestra sospechosa de contener dicho ácido micofenólico y proteínas endógenas que se unen a dicho ácido micofenólico, comprendiendo dicho método las etapas de (a) proporcionar en combinación, en un medio de análisis dicha muestra y un copartícipe de unión para el ácido micofenólico y (b) detectar la unión de dicho copartícipe de unión a dicho ácido micofenólico, en el que se incluye en dicho medio de análisis un agente de liberación en una cantidad eficaz para liberar dicho ácido micofenólico de uno de sus complejos con proteínas endógenas tal que por lo menos aproximadamente el 90% de dicho ácido micofenólico esté en una forma exenta de dicho complejo.

3. Un método para medir la cantidad de ácido micofenólico en una muestra sospechosa de contener ácido micofenólico y proteínas endógenas que se unen a dicho ácido micofenólico, comprendiendo dicho método (a) combinar en un medio acuoso:

(i): dicha muestra.

(ii): ácido micofenólico conjugado con un reactivo marcado de forma detectable, y

(iii): un anticuerpo capaz de unirse al ácido micofenólico, y

(b): determinar el efecto de dicha muestra sobre la actividad de dicho marcador, en el que se incluye en dicho medio un agente de liberación en una cantidad eficaz para liberar dicho ácido micofenólico de uno de sus complejos con proteínas endógenas tal que por lo menos aproximadamente el 90% de dicho ácido micofenólico esté en una forma exenta de dicho complejo.

4. El método de análisis de la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que dicho agente de liberación se selecciona del grupo formado por los ácidos anísicos y el ácido 8-anilino-1-naftalenosulfónico.

5. El método de análisis de la reivindicación 2, en el que se incluye un reactivo marcado en dicho medio de análisis.

6. El método de análisis de la reivindicación 1, 3, 4 ó 5, en el que dicho reactivo marcado es un reactivo enzimático marcado.

7. El método de la reivindicación 2, en el que la etapa (a) comprende además poner en contacto dicha muestra con un análogo marcado del ácido micofenólico.

8. El método de la reivindicación 2, en el que dicho copartícipe de unión está unido a un soporte o es capaz de estar enlazado a un soporte.

9. El método de la reivindicación 2, en el que dicho copartícipe de unión es un anticuerpo.

10. El método de la reivindicación 3, en el que dicho reactivo marcado de manera detectable es una enzima y dicha determinación comprende medir la actividad de dicha enzima.

11. El método de la reivindicación 3, que además comprende combinar, en dicha etapa de combinación, sustratos para dicha enzima.

12. El método de la reivindicación 10, en el que dicha enzima se selecciona del grupo formado por glucosa-6 fosfato deshidrogenasa y fosfatasa alcalina.

13. El método de la reivindicación 3, en el que dicho agente de liberación es ácido o-metoxibenzoico.

14. El método de la reivindicación 3, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

15. El método de la reivindicación 3, en el que dicho anticuerpo está unido a un soporte o es capaz de estar enlazado a un soporte.

16. El método de la reivindicación 3, en el que dicho anticuerpo es capaz de distinguir entre el ácido micofenólico y uno de sus ésteres.

17. El método de la reivindicación 3, en el que dicho anticuerpo es capaz de distinguir entre el ácido micofenólico y un metabolito de ácido micofenólico.

18. El método de la reivindicación 3, que es un inmunoensayo homogéneo y además comprende la etapa de (c) comparar dicha actividad con la actividad enzimática observada con una muestra que contiene una cantidad conocida de dicho ácido micofenólico.

19. Un kit para llevar a cabo un análisis para la determinación de ácido micofenólico, comprendiendo dicho kit en combinación empaquetada:

(a): un anticuerpo capaz de unirse al ácido micofenólico,

(b): un compuesto que comprende ácido micofenólico unido a un marcador detectable, y

(c): una cantidad eficaz de un agente de liberación para proporcionar por lo menos el 90% de dicho ácido micofenólico en una forma exenta de dicho complejo.

20. El kit de la reivindicación 19, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

21. El kit de la reivindicación 19, en el que dicho anticuerpo está unido a un soporte o es capaz de estar enlazado a un soporte.

22. El kit de la reivindicación 19, en el que dicho anticuerpo es capaz de distinguir entre el ácido micofenólico y uno de sus ésteres.

23. El kit de la reivindicación 19, en el que dicho anticuerpo es capaz de distinguir entre el ácido micofenólico y un metabolito de ácido micofenólico.

24. Un método para liberar ácido micofenólico a partir de un complejo de ácido micofenólico y proteínas endógenas que se unen a dicho ácido micofenólico, en un método de análisis para medir la cantidad de ácido micofenólico en una muestra sospechosa de contener ácido micofenólico y proteínas endógenas, comprendiendo dicho método combinar un medio sospechoso de contener dicho complejo con un agente de liberación en una cantidad eficaz para liberar dicho ácido micofenólico de dicho complejo tal que por lo menos el 90% de dicho ácido micofenólico esté en una forma exenta de dicho complejo.

25. El método de la reivindicación 24, en el que dicho agente de liberación se selecciona del grupo formado por los ácidos anísicos y el ácido 8-anilino-1-naftalenosulfónico.