ES2153385T5 - Composicion acuosa a base de hormona del crecimiento humana. - Google Patents
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Abstract
SE PRESENTA UNA FORMULACION ACUOSA FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLE QUE CONTIENE UNA HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANA, UN TAMPON Y UN SURFACTANTE NO IONICO Y, OPCIONALMENTE, UNA SAL NEUTRA, MANITOL, O, UN CONSERVANTE. TAMBIEN SE PRESENTAN LOS ELEMENTOS ASOCIADOS Y METODOS PARA LA PREPARACION, CONSERVACION Y UTILIZACION DE TALES FORMULACIONES.
Description
Composición acuosa a base de hormona del
crecimiento humana.
La presente invención está dirigida a
formulaciones farmacéuticas que contienen la hormona de crecimiento
humana (hGH). En particular, esta invención hace referencia a
aquellas formulaciones farmacéuticas que tienen una estabilidad
incrementada en formulación acuosa.
Todas las formulaciones de la hormona de
crecimiento humana conocidas en la materia son preparaciones
liofilizadas que requieren reconstitución. Por cada vial, la hGH
Protropina está compuesta de 5 mg de hGH, 40 mg de manitol, 0,1 mg
de fosfato sódico monobásico, 1,6 mg de fosfato sódico dibásico,
reconstituida a pH 7,8 (Physician's Desk Reference, Medical
Economices Co., Orawell, NJ, pág. 1049, 1992). Por cada vial, la
hGH Humatrope® está compuesta de 5 mg de hGH, 25 mg de manitol, 5 mg
de glicina, 1,13 mg de fosfato sódico dibásico, reconstituida a pH
7,5 (Physician's Desk Reference, pág. 1266, 1992).
Para una revisión general de las formulaciones
de la hormona de crecimiento, ver Pearlman y col., Current
Communications in Molecular Biology, eds. D. Marshak y D. Liu,
págs. 23-30, Cold Spring Harbor Laboratory
Press,Cold Spring Harbor, NY, 1989. Otras publicaciones de interés
relacionadas con la estabilización de proteínas se describen a
continuación.
La patente americana U.S. 4.297.344 describe la
estabilización de los factores de coagulación II y VIII, la
antitrombina III y el plasminógeno frente al calor mediante la
adición de aminoácidos seleccionados como la glicina, alanina,
hidroxiprolina, glutamina y ácido aminobutírico y un carbohidrato
como un monosacárido, un oligosacárido, o un alcohol de azúcar.
La patente americana U.S. 4.783.441 describe un
procedimiento para la prevención de la desnaturalización de
proteínas como la insulina en las interfases de solución acuosa,
mediante la adición de hasta 500 ppm de sustancias tensoactivas que
contienen una cadena de zonas alternantes débilmente hidrofílicas y
débilmente hidrofóbicas a pH 6,8-8,0.
La patente americana U.S. 4.812.557 describe un
procedimiento de estabilización de la interleucina-2
mediante la utilización de albúmina sérica humana.
La publicación de la solicitud de patente
europea nº 0 303 746 describe la estabilización de hormonas
promotoras del crecimiento con polioles compuestos de azúcares
no-reductores, alcoholes de azúcares, ácidos de
azúcar, pentaeritritol, lactosa, dextranos solubles en agua y
Ficoll, aminoácidos, polímeros de aminoácidos que tienen un grupo
lateral cargado a pH fisiológico y sales de colina.
La publicación de la solicitud de patente
europea nº 0 211 601 describe la estabilización de hormonas
promotoras del crecimiento en una matriz de gel formada por un
bloque de copolímero que contiene unidades de
polioxietilén-polioxipropilén con un peso molecular
medio de aproximadamente 1.100 a 40.000.
La publicación de la solicitud de patente
europea nº 0 193 917 describe una composición biológicamente activa
para la liberación lenta caracterizada por una solución acuosa de un
complejo entre una proteína y un carbohidrato.
La publicación de la solicitud de patente
australiana nº AU-A-30771/89
describe la estabilización de la hormona de crecimiento mediante la
utilización de glicina y manitol. La patente internacional
WO91/18621 describe mezclas de hormona de crecimiento e
IGF-I formuladas en tampón a pH 6 con un
tensoactivo.
La patente internacional WO89/09614 describe una
formulación de hGH para la liofilización que contiene glicina,
manitol, un tensoactivo no-iónico y un tampón. La
mencionada invención proporciona una formulación acuosa
inesperadamente estabilizada en ausencia de glicina.
La hGH se somete a diversos procesos de
degradación, especialmente la desamidación, agregación, acortamiento
del esqueleto peptídico y la oxidación de los residuos de
metionina. Muchas de estas reacciones pueden ralentizarse de modo
significativo mediante la eliminación de agua de la proteína. Sin
embargo, el desarrollo de una formulación acuosa para hGH tiene la
ventaja de eliminar los errores de reconstitución, por lo que se
incrementa la exactitud de la dosificación, así como se simplifica
la utilización clínica del producto y se aumenta así el cumplimiento
por parte del paciente. Por ello, es un objetivo de esta invención
el proporcionar una formulación de hGH acuosa que facilite un
control aceptable de los productos de degradación, que sea estable
tras agitación vigorosa (lo que induce la agregación) y sea
resistente a la contaminación microbiana (lo que permite un
empaquetado de múltiples utilizaciones).
La presente invención proporciona formulaciones
farmacéuticas líquidas, acuosas y estables de la hormona de
crecimiento humana para su almacenamiento durante
6-18 meses a 2-8ºC. Esto puede
proporcionarse por una formulación farmacéutica líquida, acuosa y
estable para su almacenamiento durante 6-18 meses a
2-8ºC, que contenga 5 mg/ml de hGH, 8,8 mg/ml de
cloruro sódico, 2,0 mg/ml de polisorgato 20, 2,5 mg/ml de citrato
sódico y 2,5 mg/ml de fenol a pH 6,0.
La Figura 1 es un cromatograma de exclusión de
tamaño de la formulación de la hormona de crecimiento almacenada
durante 28 días a 40ºC (es decir, estresada térmicamente) y durante
un año a 5ºC (es decir, en condiciones recomendadas de
almacenamiento).
La Figura 2 es un trazado del análisis del valor
de Arrhenius de la agregación de la hormona de crecimiento en
formulación acuosa.
La Figura 3 es un cromatograma de intercambio
aniónico que compara una muestra de una formulación acuosa de hGH
estresada térmicamente (40ºC) con una muestra de formulación acuosa
de hGH almacenada en las condiciones recomendadas
(2-8ºC) durante un año.
La Figura 4 es un trazado del análisis del valor
de Arrhenius de la desamidación de hGH en formulación acuosa.
La Figura 5 es una gráfica del porcentaje de
monómero presente en diversas formulaciones en donde el manitol se
ha sustituido por una sal neutra.
Los siguientes términos pretenden tener los
significados indicados más adelante tal como se utilizan en la
especificación y reivindicaciones.
Los términos "hormona de crecimiento
humana" o "hGH" quieren decir la hormona de crecimiento
humana producida mediante procedimientos que incluyen la extracción
y purificación a partir de una fuente natural, y mediante sistemas
de cultivo de células recombinantes. Su secuencia y características
se indican, por ejemplo, en Hormone Drugs, Gueriguian y
col., U.S.P. Convención, Rockville, MD (1982). Los términos
similares engloban las equivalentes a la hormona de crecimiento
humana biológicamente activa, p. ej., las que difieren en uno o más
aminoácidos en la secuencia total. Además, los términos utilizados
en esta solicitud pretenden englobar las variantes por sustitución,
deleción e inserción aminoacídica de la hGH, o modificaciones
post-traduccionales. Dos especies a destacar son la
especie nativa de 191 aminoácidos (somatropina) y la especie
(somatrem) de 192 aminoácidos con una metionina en el extremo
N-terminal (met), que se obtiene generalmente
mediante recombinación.
El término "cantidad eficaz
farmacéuticamente" de hGH hace referencia a la cantidad que
proporciona el efecto terapéutico en un régimen de
administración.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención no requiere glicina. La
glicina es un componente opcional de la formulación acuosa, aunque
con menor interés en las formulaciones acuosas comparado con
aquellas formulaciones que están liofilizadas para su posterior
reconstitución. Las cantidades de glicina se hallarán en un margen
desde 0 mg/ml a aproximadamente 7 mg/ml.
Las formulaciones comprenden 2,0 mg/ml de
polisorbato 20, un tensoactivon no iónico. La utilización de
tensoactivos no iónicos permite que la formulación se exponga a
fuerzas de cizallamiento y estrés de superficie sin causar
desnaturalización de la proteína. Por ejemplo, dichas formulaciones
que contienen tensoactivo se utilizan en dispositivos de aerosol
como los utilizados en la dosificación pulmonar y pistolas de
inyección chorro sin aguja.
Las formulaciones comprenden un tampón de
citrato sódico a 2,5 mg/ml.
El fenol se incluyó como un conservante en la
formulación para retrasar el crecimiento microbiano y así permitir
"empaquetamiento múltiple" de la hGH a 2,5 mg/ml.
Un pH adecuado, ajustado con tampón, para las
formulaciones acuosas de hGH es 6,0. Preferentemente, se elige un
intervalo de concentraciones de tampón para minimizar la
desamidación, la agregación y la preparación de hGH.
\newpage
Opcionalmente, puede incluirse manitol en la
formulación acuosa. La cantidad preferida de manitol es
aproximadamente de 5mg/ml a 50 mg/ml. Como alternativa al manitol,
se utilizan otros azúcares o alcoholes de azúcares como la lactosa,
la trehalosa, la estaquiosa, el sorbitol, el xilitol, el ribitol el
mio-inositol, el galactiol y similares.
Las formulaciones comprenden 8,8 mg/ml de
cloruro sódico como sal neutra. La concentración de sal se ajusta
cercana a la isotonicidad, dependiendo de los ingredientes presentes
en la formulación.
La formulación de la presente invención contiene
los siguientes componentes a pH 6,0.
Además, se puede utilizar más de un agente
tamponante, conservante, azúcar, sal neutra o tensoactivo
no-iónico. Preferentemente, la formulación es
isotónica y estéril.
En general, las formulaciones de la presente
invención pueden contener otros componentes en cantidades tales que
no desvirtúen la preparación de las formas estables y en cantidades
adecuadas para una administración farmacéutica segura. Por ejemplo,
otros excipientes farmacéuticamente aceptables bien conocidos por
aquellos expertos en la materia pueden formar parte de las
composiciones presentes. Estos incluyen, por ejemplo, diversos
agentes de carga, agentes tamponantes adicionales, agentes
quelantes, antioxidantes, cosolventes y similares; ejemplos
específicos de estos podrían incluir sales de trimetilamina
("tampón Tris"), y edetato de sodio.
La cromatografía de intercambio aniónico (HPIEC)
se llevó a cabo en una columna TSK DEAE 5PW (1,0 x 7,5 cm) a 45ºC
con una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. La columna se equilibró
con fosfato potásico 50 mM, pH 5,5, que contenía acetonitrilo al
10% (p/v). La elución se realizó utilizando un gradiente constante
de 25 minutos de tampón fosfato potásico 50-100 mM,
pH 5,5 con acetonitrilo al 10% (p/v). La carga de la columna fue de
83 \mug de proteína. La detección se realizó a 230 nm.
La cromatografía de exclusión de tamaño
no-desnaturalizante se llevó a cabo en una columna
TSK 2000 SWXL con fosfato sódico 50 mM, pH 7,2 que contenía cloruro
sódico 150 mM. La velocidad de flujo fue de 1 ml/min, con una carga
de columna de 50-75 \mug y la detección a 214 o
280 nm.
La cromatografía de exclusión de tamaño
desnaturalizante se llevó a cabo en una columna Zorbax GF250 en
fosfato sódico 200 mM, pH 6,8-7,2/SDS al 0,1%. La
velocidad de flujo fue de 1,0 ml/minuto, con una carga de
50-75 \mug y la detección a 214 o 280 nm.
En general, las muestras de la formulación de
hGH para el análisis en estos ejemplos experimentales se prepararon
mediante cambio de tampón en una columna de filtración en gel. El
tampón de elución contenía cloruro sódico o manitol, tampón y el
tensoactivo no-iónico en sus proporciones finales.
Esta solución resultante se diluyó a una concentración de hGH
deseada y se añadió el conservante. La solución se filtró
estérilmente utilizando un filtro de membrana esterilizado (tamaño
del poro de 0,2 micras o equivalente) y se introdujo en viales de
vidrio del tipo 1 de 3 cc, éstos se taparon y sellaron con tapones
de goma de tipo butil acuoso y capuchones de aluminio de tipo tirar
y abrir.
La formulación de hGH acuosa utilizada en los
ejemplos experimentales consistió en 5,0 mg de somatropina
(Genentech, Inc.), 45,0 mg de manitol, 2,5 mg de fenol, 2,0 mg de
polisorbato 20 y 2,5 mg de citrato sódico, pH 6,0, por ml de
solución. La formulación liofilizada que se utilizó como referencia
para la comparación en los ejemplos consistió en 5,0 mg de
somatropina, 1,7 mg de glicina, 45,0 mg de manitol, 1,7 mg de
fosfato sódico, 9 mg de alcohol bencílico por ml de solución
estéril después de la reconstitución. La formulación acuosa de hGH
y las formulaciones de la Tabla 3 también se proporcionan como
referencias para la comparación con las formulaciones de hGH
acuosas mencionadas que son sujeto de las reivindicaciones.
Viales de la formulación acuosa de hGH (lotes
12738/55-102 y 12738/55-105) se
incubaron a cualquiera de las temperaturas de almacenamiento
recomendadas de 2-8ºC, o a temperaturas de
almacenamientos elevadas de 15ºC, o 25ºC, y luego los viales se
retiraron en diferentes tiempos y se analizaron para conocer los
cambios en el pH, color y apariencia, y la concentración de
proteína. Además, las muestras se incubaron a 40ºC con el fin de
estudiar los patrones de degradación en condiciones de estrés
extremo. Los patrones de degradación para la formulación acuosa se
compararon también con los patrones de degradación conocidos de la
hormona de crecimiento liofilizada.
Después del almacenamiento a
2-8ºC durante un año como máximo, la formulación
acuosa mostró cambios no significativos en el pH, color y
apariencia y en la concentración de proteína. La HPLC de exclusión
de tamaño no-desnaturalizante realizada con
muestras guardadas durante un año como máximo a
2-8ºC, no mostró agregación significativa del
producto del fármaco (Figura 1). Este resultado es inesperado a la
luz de las enseñanzas de la patente americana U.S. 5.096.885 donde
la glicina contribuye a prevenir la agregación en la preparación
liofilizada.
A temperaturas de aproximadamente 8ºC, se
observaron pocos o ningún cambio en el pH o en la concentración de
proteína a lo largo del tiempo. La inspección visual puso de
manifiesto un incremento en la opalescencia con el tiempo en las
muestras guardadas a 40ºC. Este cambio fue mínimo durante el
almacenamiento a 15-25ºC y no se observó durante el
almacenamiento a 2-8ºC.
La cantidad de producto de degradación se
calculó como un porcentaje del área de hGH total del cromatograma.
Se calculó entonces la constante de velocidad para cada reacción
mediante sustracción a partir del 100% del porcentaje de producto
de degradación, tomando el log_{10}, y representando el trazado
frente al tiempo en días. Para encajar estos resultados se utilizó
la pendiente de una línea recta como la constante de la reacción
(k). El análisis de Arrhenius se realizó trazando una recta con los
valores obtenidos del logaritmo natural (ln) del valor absoluto de
cada constante de velocidad de reacción, calculada a 15ºC, 25ºC y
40ºC, como una función del inverso de la temperatura absoluta; y
luego mediante prolongación de la recta se extrapoló el valor a
5ºC. El análisis de Arrhenius y la velocidad en tiempo real (Figura
2) de los resultados a partir de la HPLC de exclusión de tamaño
indican que la cantidad de agregación de la hormona de crecimiento
al cabo de 18 meses de almacenamiento será inferior al 1% (p/v).
El análisis por HPLC de intercambio aniónico
realizado sobre la formulación de hGH acuosa almacenada a 40ºC
indicó un incremento en picos acídicos alrededor de los 28 días
(Figura 3). Tres de estos picos, que se eluyeron a los 15, 17,5 y
26 minutos, se produjeron mediante desamidación de hGH en las
posiciones 149, 152 y 149 más 152. Los análisis de Arrhenius y de
velocidad en tiempo real (Figura 4) de los resultados a partir de
este procedimiento, se representaron gráficamente tal como se
describió anteriormente, e indicaron que la cantidad de hGH
desamidada en estos lotes al cabo de 18 meses de almacenamiento a
2-8ºC será de aproximadamente del 9% (p/v). Esto
incluye una cantidad inicial de aproximadamente el 2,4% (p/v) de hGH
desamidada en el tiempo cero. Para otros productos de hGH se han
citado valores tan altos como el 15% (p/v) de desamidación (Larhmar,
H., y col., (1985) Int. J. Pharmaceutics
23:13-23). Aunque la velocidad de desamidación es
más rápida en el estado acuoso, esta velocidad se minimiza a pH 6,0
y por debajo.
Cada uno de los seis viales de hormona de
crecimiento liofilizada se reconstituyeron con 1 ml de agua
bacteriostática para inyección (BWFI) U.S.P. Después de su
disolución, los contenidos se transfirieron a viales de 3 cc, se
les colocó un tapón y un capuchón para proporcionar la misma
configuración que la de la formulación acuosa. Los seis viales de
la formulación acuosa de hGH y los seis viales de hGH liofilizada
reconstituida se agitaron vigorosamente de abajo a arriba de manera
horizontal en un agitador giratorio para vidrio
("Glas-Col
Shaker-in-the-Round")
a 240 sacudidas por minuto utilizando un ajuste de golpe de 2,5,
proporcionando un desplazamiento horizontal de 8+1 cm de hasta 24
horas a temperatura ambiente para valorar los efectos de la
agitación sobre la estabilidad física de la formulación acuosa de
hGH. Las doce muestras se colocaron en línea recta sobre el
agitador para asegurar que todas se expondrían a la misma fuerza
para cada formulación. Se retiraron dos viales para analizar a los
30 minutos, 6 horas y 24 horas.
Los resultados se muestran en la Tabla I. La
agitación produjo muy poco cambio en la claridad visual de la
formulación acuosa. No hubo cambios en el contenido total del
monómero de hormona de crecimiento detectado mediante un ensayo de
HPLC de exclusión de tamaño no-desnaturalizante.
Este ensayo detecta agregados no covalentes, los cuales son
completamente dispersados mediante SDS en un ensayo de HPLC de
exclusión de tamaño desnaturalizante.
Mediante comparación, estos resultados también
demostraron que el producto liofilizado reconstituido fue más
sensible al tratamiento, aún después de sólo 30 minutos de
agitación. Esta sensibilidad es típica para todas las formulaciones
actualmente disponibles de hGH, distintas a la formulación acuosa de
la presente invención. La inclusión del tensoactivo
no-iónico es el factor más importante para prevenir
la aparición de este fenómeno.
Muestras de la formulación acuosa de hGH se
sometieron a una prueba de contaminación bacteriológico de acuerdo
con una prueba de contaminación abreviada utilizando el test
estándar U.S.P. En este test, se añadió una suspensión de E.
coli o de S. aureus a una alícuota de la formulación
acuosa de hGH para proporcionar una concentración final de
bacterias entre 10^{5} a 10^{6} CFU/ml. Se contaron las
bacterias viables que permanecieron en los tubos inmediatamente y
al cabo de 4 y 24 horas a 20-25ºC. El cambio del
porcentaje en la concentración de los microorganismos durante la
prueba de contaminación se calculó de acuerdo con la siguiente
ecuación:
% título
inicial = \frac{\text{título a T = X horas x 100}}{\text{título a T
=
0}}
Los resultados de este experimento indicaron que
para las dos especies de bacterias, las concentraciones de las
bacterias viables se redujeron a menos del 0,01% de las
concentraciones iniciales al cabo de 24 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
En este experimento, las formulaciones acuosas
de hGH se compararon con las que variaban en concentraciones de
sal, manitol y tensoactivo no-iónico. Todas las
formulaciones contenían 5 mg/ml de hGH/fenol al 0,25% (p/v)/citrato
sódico 10 mM, pH 6,0. Las muestras se almacenaron durante
3-4 meses a 2-8ºC. La Figura 5
indica el porcentaje de monómero presente en las formulaciones
indicadas. La Tabla inferior indica la composición de cada
formulación. Estos resultados demuestran la estabilidad inesperada
de hGH en una formulación en donde el manitol se ha sustituido por
una sal neutra en presencia de un tensoactivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante es únicamente para la conveniencia del lector. No forma
parte del documento de patente Europea. Aún cuando se haya tenido
sumo cuidad en rellenar las referencias, no es posible excluir
errores u omisiones, la EPO no se hace responsable a dicho
respecto.
US 4297344 A [0004]
US 4783441 A [0004]
US 4812557 A [0004]
EP 0303746 A [0004]
EP 0211601 A [0004]
EP 0193917 A [0004]
AU 3077189 A [0004]
WO 9118621 A [0004]
WO 8909614 A [0004]
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Physician's DesK Reference Medical Economics Co,
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[0002]
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1989, 23-30 [0003]
LARHAMMAR, H y col., Int J
Pharmaceutics, 1985, vol 23, 13-23
[0037]
Claims (1)
1. Formulación de acuerdo con la reivindicación
1, que comprende 5 mg/ml de hGH, 8,8 mg/ml de cloruro sódico, 2,0
mg/ml de polisorbato 20, 2,5 mg/ml de citrato sódico y 2,5 mg/ml de
fenol a pH 6,0.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US92340192A | 1992-07-31 | 1992-07-31 | |
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