ES2074037T3 - Uso del dimero de lisozima para la fabricacion de un medicamento para modular los mecanismos de defensa naturales. - Google Patents
Uso del dimero de lisozima para la fabricacion de un medicamento para modular los mecanismos de defensa naturales.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A LOS NUEVOS USOS DE LA FORMA DIMERIZADA DE LA LISOCIMA PARA LA FABRICACION DE UN MEDICAMENTO PARA INHIBIR LA BIOSINTESIS DEL FACTOR DE NECROSIS DE TUMOR EN ANIMALES Y HUMANOS. EL DIMERO DE LA LISOZIMA ES, EN PARTICULAR, UTIL PARA EL TRATAMIENTO Y LA PROFILAXIS DE TRASTORNOS ASOCIADOS CON NIVELES EXCESIVAMENTE ALTOS DE FACTOR DE NECROSIS DE TUMOR. LA INVENCION ADEMAS SE REFIERE A FORMULACIONES FARMACEUTICAS DEL MEDICAMENTO SEGUN LA INVENCION, ES DECIR INYECCIONES QUE CONSTAN DE LA FORMA DIMERIZADA DE LA LISOZIMA EN CANTIDADES DE 0,01-10 MG/ML, DE UNA COMPOSICION ESTERIL APIROGENICA QUE CONSTA DE AL MENOS UN SOLVENTE FISIOLOGICAMENTE ACEPTABLE Y AL MENOS UN PRESERVATIVO FARMACEUTICAMENTE APROBADO, TAMBIEN COMO TAMPONES Y VENDAJES ANTISEPTICOS IMPREGNADOS CON EL, Y POMADAS O GELES QUE CONSTAN DE UNA DOSIS EFECTIVA DE LA FORMA DIMERIZADA DE LA LISOZIMA PARA LA PREVENCION Y/O TRATAMIENTO DE SEPSIS Y DE CONMOCION SEPTICA, ESPECIALMENTE DE HERIDAS INFECTADAS.
Description
Uso del dímero de lisozima para la fabricación de
un medicamento para modular los mecanismos de defensa
naturales.
La presente invención se refiere a nuevos usos
médicos del dímero de lisozima y de composiciones que contienen tal
dímero. Los nuevos usos están relacionados con el tratamiento de
ciertas disfunciones de los mecanismos de defensa naturales.
Durante mucho tiempo se ha sabido que las enzimas
en sus formas monoméricas son eficaces terapéuticamente en el
tratamiento de diferentes enfermedades.
La lisozima fue descubierta por Fleming en 1922,
pero sus funciones enzimáticas no se revelaron hasta 1950. Desde
ese momento, el compuesto ha sido objeto de intensa investigación y
se ha informado de diversos efectos terapéuticos. Entre otros, se
trataba de propiedades antivirales, antibacterianas,
antiinflamatorias y antihistamínicas. El uso terapéutico de la
lisozima, sin embargo, se ha limitado mucho debido a los efectos
secundarios negativos de la forma monomérica.
Esta limitación del uso práctico de la lisozima y
otras enzimas activas terapéuticamente se superó a finales de los
ochenta cuando se descubrió que las formas dimerizadas aisladas de
las enzimas, al tiempo que conservan todas las propiedades
beneficiosas de las formas monoméricas conocidas, no presentan
efectos secundarios negativos cuando se usan en dosis terapéuticas.
Las composiciones antivirales y antibacterianas que comprenden como
ingrediente activo el dímero de lisozima u otras enzimas
dimerizadas se han descrito en el documento WO 89/11294. En esa
solicitud se informó de que en pruebas in vitro el dímero de
lisozima ha inhibido la proliferación de un número de cepas
bacterianas cultivadas en muestras tomadas de pacientes en
concentraciones de 5-20 mg/ml del cultivo. Se
informó también allí de que el dímero era eficaz al tratar
infecciones de parvovirus canino (PVC) cuando se administraba por
vía oral dos veces al día a una dosis de 1-2 mg/kg
del peso corporal.
A medida que se continuó el trabajo de
investigación por el inventor, se encontraron características
atractivas adicionales de los dímeros de lisozima y se
desarrollaron nuevos usos terapéuticos del medicamento.
En pruebas clínicas realizados para confirmar la
eficacia antibacteriana y antiviral del dímero de lisozima se
encontró sorprendentemente que el dímero es inesperadamente potente
al curar formas agudas de enfermedades de los tractos digestivo y
respiratorio. En consecuencia, se llevaron a cabo nuevas
investigaciones para determinar el efecto del dímero de lisozima en
aquellas fases de diferentes enfermedades en las que fallan los
mecanismos de defensa naturales.
Se sabe que las toxinas bacterianas constituyen
un grupo de muchos factores de virulencia por el que la bacteria
produce enfermedades. Algunos avances recientes en el conocimiento
de las toxinas bacterianas tratan de su interacción con el sistema
inmune del huésped. Esta interacción da como resultado en primer
lugar la inmunomodulación y en segundo lugar la liberación de
citoquinas y otros mediadores, que explican muchos trastornos
fisiológicos producidos por las toxinas. El último efecto se ha
estudiado particularmente en consideración con las acciones de la
endotoxina, que juega un importante papel en la patogénesis de la
sepsis de gram-negativas (véase Bayston, D.F.,
Cohen, J.: Bacterial endotoxins and current concepts in the
diagnosis and retreatment of endotoxaemia; J. Med. Microbiol. 1990,
31:73-83). A pesar de que se ha conocido durante
mucho tiempo un papel de las endotoxinas en infecciones producidas
por Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes,
fue el reconocimiento del síndrome del shock tóxico por estafilococo
lo que condujo al interés aumentado en las exotoxinas producidas
por estos organismos.
El shock tóxico es una enfermedad grave
caracterizada por fiebre alta, hipotensión, derrame capilar,
eritroderma difuso, eritema mucoso, disfunción renal, hipocalcemia,
hipoalbuminemia y descamación de una erupción cutánea roja. Muchos
casos de síndrome del shock tóxico se han asociado al uso de
tampones vaginales durante la menstruación pero el síndrome se
describe cada vez más en entornos no menstruales en ambos sexos
frecuentemente después de procedimientos quirúrgicos cuando se deja
en el lugar el material de empaquetamiento (por ejemplo,
empaquetamientos nasales después de una rinoplastia o epistaxis
severa). Se ha demostrado que las cepas de Staphylococcus
aisladas de la vagina de pacientes con síndrome del shock tóxico
(SST) producen la toxina 1 del síndrome del shock tóxico
(SSTT-1), pero la fuente del microorganismo que
produce SSTT-1 también puede ser una infección
inaparente. La bacteremia inicial puede ser inaparente pero semanas
o meses después puede conducir al desarrollo de infecciones
localizadas. Puede haber evidencia de síndrome de sepsis o shock
séptico, concomitante con la presentación de tales infecciones.
Puede tener lugar una bacteremia más rara pero más dramática en
ausencia de cualquier portal de entrada o infecciones localizadas
asociadas, y en estas situaciones pueden ser prominentes el shock,
la endocarditis, la coagulopatía intravascular diseminada y el
fallo multiórgano (véase Stevens, D. L. y col.:
Gram-positive shock; Current Opinions in Infectious
Diseases 1992, 5: 355-363).
Se sabe que observaciones similares implican
también otras bacterias gram- positivas. Por ejemplo, la infección
por Streptococcus pyogenes se asocia con el shock y tiene
una tasa de mortalidad del 30%. La Streptococcus pneumoniae
es una causa de neumonía, que se ha documentado como de un nivel de
resistencia a la penicilina y tendencia de desarrollo de un
síndrome del shock superiores. Además, los pacientes con SIDA
tienen una incidencia mayor de infecciones pneumococcales que la
población en conjunto.
Las infecciones con bacterias
gram-negativas también pueden dar como resultado
sepsis y shock séptico. Los bacilos y vibrios
gram-negativos son la fuente de las enterotoxinas
más importantes. La enterotoxina es un componente de
lipopolisacárido (LPS) de la membrana externa de las paredes
celulares bacterianas gram-negativas. Las
enterotoxinas afectan principalmente el tracto intestinal y
normalmente producen diarrea. Las infecciones más frecuentes con
bacterias gram-negativas entre animales y humanos
son las infecciones con Escherichia coli. La deshidratación
considerable que acompaña tales infecciones puede dar como resultado
la muerte del individuo infectado. Según la OMS, la diarrea aguda
mata aproximadamente a 3,2 millones de niños en países en desarrollo
cada año. Aproximadamente el 30% de todos los casos de sepsis se
producen por bacterias gram-negativas.
La sepsis debida a infecciones con bacterias
gram-positivas y gram-negativas es
siempre una dolencia grave común en todos los países. Existen
aproximadamente 400.000 casos por año en los Estados Unidos con una
tasa de mortalidad de aproximadamente 50%.
En los últimos años, la sepsis y el shock séptico
han sido un objeto de muchas publicaciones. Se ha observado que en
la patofisiología del shock séptico, la endotoxemia y otros
mediadores de intoxicación bacteriana juegan el papel más
importante. Incluyen el factor de necrosis tumoral (TNF), la
interleucina-1 (IL- 1), el interferón (IFN), el
factor de actividad plaquetaria y los eicosanoides (derivados del
ácido araquidónico); el más importante de éstos es el TNF que tiene
efectos sobre el metabolismo así como sobre los sistemas inmune y
fagocítico (véase Berkowitz, F. E.: Bacterial toxins in
pathogenesis of infections; Current Opinions in Infectious
Diseases, 1991 4: 332-337). Se demostró que los no
supervivientes del shock séptico tenían concentraciones más elevadas
de TNF e interleucina-1. Muchos autores han
informado de niveles elevados de TNF-\alpha en el
plasma de los pacientes de shock séptico y en su sangre. Se señala
también que el efecto tóxico del TNF-\alpha puede
no depender tanto de las concentraciones de TNF como de su
persistencia dentro del cuerpo.
Muchos autores han investigado la posibilidad de
modulación de la cascada de citoquinas en la sepsis y shock
séptico. Las propuestas con éxito informadas implican el uso de
anticuerpos anti-TNF monoclonales y la
neutralización del lipopolisacárido con antipopolisacárido. Los
anticuerpos sin embargo no potencian la erradicación bacteriana. Se
observaron también efectos parcialmente beneficiosos cuando se
usaron agentes como dexametasona y pentoxifilina que bloquean la
producción de TNF por macrófagos.
Se sabe también que otras citoquinas contribuyen
al shock séptico. En esta situación, los tratamientos que modulan la
cascada de citoquinas en el shock séptico tienen el potencial de
interferir con la contención de la infección, dado que la defensa
del huésped es dependiente de estas mismas citoquinas inflamatorias.
Es de una prioridad principal encontrar los medios para la
prevención del shock séptico debido al beneficio potencial para un
gran número de pacientes. El controlar el nivel de TNF parece ser
esencial para estos fines.
Igualmente crítico es el papel del TNF en otro
mecanismo de defensa que es la fiebre, que es una respuesta
fisiológica a la infección típica para virtualmente todos los
animales superiores y humanos. Se reconocen actualmente cinco
citoquinas pirogénicas (interleucina-1, TNF,
interferón, interleucina-2 e interleucina 6) como
los mediadores endógenos principales de la respuesta febril, que
inhiben las neuronas sensibles al calor preópticas que normalmente
facilitan la pérdida de calor y suprimen la producción de calor en
el organismo humano. La fiebre y sus mediadores tienen la capacidad
de dañar tanto el organismo invasor como el huésped. Se han
acumulado datos considerables en los últimos años que sugieren que
la interleucina-1, el TNF y la
interleucina-6 median las anormalidades
patofisiológicas de las infecciones. Dado que los pirógenos
endógenos contribuyen al proceso patológico de diversas infecciones,
tanto los mediadores como la respuesta febril son potencialmente
perjudiciales para el huésped. La prueba más convincente a este
respecto ha venido de los estudios de la sepsis de
gram-negativas. También hay evidencia de que los
pirógenos endógenos median manifestaciones sistémicas y locales de
la sepsis debida a bacterias gram-positivas, SIDA,
infecciones espiroquetales, meningitis, síndrome de distrés
respiratorio adulto, artritis supurativa y micobacteriosis. Aunque
los datos citados están en contraste con la observación de que la
respuesta febril por sí misma eleva la resistencia a la infección en
animales experimentales, sin embargo, la preservación de las
especies, más que la supervivencia del individuo, es la esencia del
proceso evolutivo. Posiblemente, los efectos sistémicos
perjudiciales de las citoquinas pirogénicas en las consecuencias de
las infecciones arrolladoras (por ejemplo, sepsis
gram-negativa) se adaptan como efectos locales
beneficiosos de fiebre en infecciones menos fulminantes. Por lo
tanto, acelerando el fallecimiento de individuos infectados sin
esperanza, la naturaleza mata los individuos que son peligrosos
para las especies. De tal forma que las especies como conjunto se
puedan proteger de enfermedades epidémicas (véase Mackowiak, P.A.:
Mechanism of Fever; Current Opinions in Infectious Diseases, 1992,
5:348-354).
Un concepto fundamental de los patógenos de la
fiebre es que los pirógenos exógenos, sin importar su origen o
estructura, producen fiebre induciendo que las células huésped
(principalmente macrófagos) produzcan pirógenos endógenos. En
consecuencia, los procedimientos terapéuticos basados en el uso de
anticuerpos de pirógenos anti-endógenos y
antagonistas del receptor de pirógeno endógenos pueden ser
eficaces. Una de las posibilidades es el bloqueo de la biosíntesis
de TNF. Los estudios en animales demuestran que el TNF puede
producirse antes que la IL-1 y otras citoquinas en
la cascada de la respuesta a la infección. Según muchos
científicos, el inhibir la biosíntesis de TNF también significa
parar la biosíntesis de IL-1. Pero inhibir la
biosíntesis de TNF también significa parar los efectos perjudiciales
de algunas infecciones fulminantes y sin esperanza.
Se sabe también que el TNF es uno de los
mediadores de los procesos de inflamación. La inflamación en muchos
casos es la primera fase de una enfermedad en el curso natural de
la que se desarrolla un shock séptico. En la situación en la que la
continuidad de los tejidos se rompe, como en heridas susceptibles a
infección, heridas de tipo de guerra, especialmente heridas
abdominales (peritonitis), enfermedades en el tracto
gastrointestinal como infecciones agudas que acompañan apendicitis,
infecciones agudas bacterianas y virales como las que se ven en la
neumonía post-gripe, enfermedades neoplásmicas,
especialmente en la fase de descomposición de tumores y similares,
la inflamación es un primer síntoma del aumento de la producción de
TNF. Por lo tanto un tratamiento deseado de tales infecciones sería
controlar el nivel de TNF.
El papel del TNF en el propio SIDA es incluso más
importante. El SIDA se caracteriza por una inmunodeficiencia
profunda. El sello del SIDA es un número disminuido de linfocitos
CD4+. El número de células infectadas con VIH, el agente de
etiología del SIDA, es relativamente pequeño (<1 en
100-1000) incluso en las células mononucleares de
sangre periférica (PBMC) de pacientes de SIDA; mientras que los
linfocitos CD4+ se infectan preferencialmente, estas células no son
dianas exclusivas de la infección por VIH. La evidencia reciente ha
demostrado que el espectro de células diana de VIH puede ser
bastante amplio. Se han observado diferencias claras en las
consecuencias de la infección de VIH en monolitos/macrófagos
versus linfocitos T. Mientras que los linfocitos T tienden a
destruirse, los monolitos/macrófagos permiten una infección
persistente. El VIH puede por tanto contenerse como reservas por
monolito/macrófagos así como otras células en el cuerpo. El tipo de
respuesta monolito/macrófago a la infección por VIH puede ser
responsable de la latencia establecida en el huésped; esta
respuesta puede producir también secuelas patogénicas que resultan
de factores solubles producidos por las células infectadas (véase
Toshifumi Matsumaya y col: Cytokines y HIV infection; Is AIDS a
Tumor Necrosis Factor disease?; AIDS 1991,
5:1405-1417). Muchos científicos informaron de que
las líneas de células T humanas infectadas con
HTLV-1 son muy susceptibles a la infección por VIH,
demostrando efecto citopático dramático en asociación con la
replicación aumentada de VIH. Además las células infectadas por VIH
son susceptibles al daño por el sobrenadante de estas células. El
ensayo de las placas virales después del tratamiento con este
sobrenadante reveló que el factor producido por las células T
(MT-2) potenciaba la replicación de VIH. El factor
se identificó como TNF-\beta y este
descubrimiento es consistente con informes de que las células T
(MT-2) producen TNF-\beta. Se
observó el mismo efecto al usar TNF-\alpha.
TNF-\alpha y TNF-\beta mataban
selectivamente las células infectadas por VIH y potenciaban la
replicación de VIH. Se informó también de que las líneas de células
T infectadas por VIH y PBMC recién aisladas de individuos infectados
por VIH respondían al TNF dando como resultado niveles elevados.
Esto sugiere que es probable que la misma potenciación de la
expresión de VIH tenga lugar in vivo. De hecho, la actividad
potenciadora del TNF podría neutralizarse por anticuerpos
anti-TNF. La potenciación de la replicación de VIH
después del tratamiento con TNF-\alpha y
TNF-\beta es de hasta diez veces (véase Yakarnam,
A y col.: Tumor Necrosis Factors (\alpha,\beta) induced by
HIV-1 in peripheral blood monocellular cells
potentiate virus replication; AIDS 1990,
421-427).
Se ha confirmado también que diversas citoquinas
pueden afectar a la producción de VIH. Empleando fagocitos
mononucleares purificados de sangre periférica normal, se observó
la inducción de IL-6 y de
TNF-\alpha en unas pocas horas después de la
exposición al virus VIH. Esta inducción de citoquinas se observó
también usando VIH activado en calor. Basados en muchas
observaciones Toshifumi Matsuyama y col. (trabajo citado) están
convencidos de que el SIDA es una enfermedad de citoquina o TNF. En
la red de citoquinas del SIDA, el TNF-\alpha y el
TNF-\beta parecen ser moléculas cruciales que
potencian la replicación de VIH así como inducen su propia
expresión y la de otras citoquinas. Se ha demostrado que el
TNF-\alpha estimula la liberación de otras
citoquinas en diferentes tipos celulares, y que es por lo tanto una
citoquina clave de la cascada de citoquinas en el primer mecanismo
de defensa.
Se ha sugerido que muchos de los síntomas
asociados al SIDA pueden explicarse por la liberación de citoquinas
de diferentes funciones biológicas. La producción aumentada de
IL-1 y TNF-\alpha, los dos
pirógenos bien conocidos, podría explicar la fiebre que se ve en
los pacientes de SIDA. El TNF-\alpha puede estar
involucrado en la caquexia asociada al SIDA. Tanto el
TNF-\alpha como el TNF-\beta
funcionan como inmunomoduladores y moléculas efectoras en la
citotoxicidad mediada por monolitos. Además el TNF es responsable
de la activación de la respuesta inmune y puede matar directamente
células infectadas por VIH, potenciando así la replicación del VIH.
También se ha propuesto un mecanismo inmunológico para explicar la
disminución de células CD-4 en el SIDA (Matsuyama y
col., trabajo citado). También se informa de que el sarcoma de
Kaposi relacionado con SIDA se induce también por
TNF-\alpha: el TNF-\alpha puede
producirse por queratinocitos por estímulos fisiológicos como luz
ultravioleta, que puede contribuir a la inducción de
IL-6 en la piel y al desarrollo del sarcoma de
Kaposi en SIDA. En pruebas in vitro, el
TNF-\alpha puede dañar la mielina y los
oligodendrocitos; también se ha demostrado que algunas líneas
celulares derivadas de glioma son susceptibles al efecto
antiproliferativo del TNF-\alpha. Esto puede
conducir a la conclusión de que la disfunción del sistema nervioso
central en los pacientes de SIDA es el resultado de la implicación
del TNF-\alpha. Varios informes han demostrado
que los niveles en suero de TNF-\alpha y
IL-1 son sustancialmente elevados con el desarrollo
de SIDA y ARC (complejo relacionado con SIDA) mientras que caían
dentro del intervalo de valores control saludables en pruebas de
suero de portadores asintomáticos del VIH. Según Matsuyama y col.
(trabajo citado), el SIDA es tanto una enfermedad de TNF como lo es
de VIH. Demuestra que ganar un control sobre la inducción del TNF
puede conducir al establecimiento de la terapia eficaz para
pacientes de SIDA.
Los siguientes descubrimientos básicos
permitieron resolver los problemas descritos anteriormente y
encontrar nuevos usos terapéuticos del dímero de lisozima bajo las
condiciones patológicas descritas anteriormente:
1. El dímero de lisozima inhibe la síntesis de
TNF,
2. El dímero de lisozima estimula la síntesis de
IFN-\alpha,
3. El dímero de lisozima potencia la actividad
fagocítica.
En consecuencia, era un objeto de la presente
invención proporcionar el uso del dímero de lisozima para la
fabricación de formulaciones farmacéuticas para el tratamiento de
enfermedades asociadas con niveles excesivamente altos de TNF
(factor de necrosis tumoral) como se describe anteriormente.
Otro objeto de la presente invención era
proporcionar el uso del dímero de lisozima para la fabricación de
composiciones farmacéuticas para la profilaxis de enfermedades
asociadas con niveles excesivamente altos de TNF como se describe
anteriormente.
Aún un objeto adicional de la presente invención
era proporcionar el uso del dímero de lisozima para la fabricación
de formulaciones farmacéuticas y productos de higiene para la
terapia y prevención de enfermedades asociadas con el aumento y
niveles excesivamente altos de TNF.
Según la invención, los objetos como se
establecen anteriormente se pueden alcanzar por los siguientes
nuevos usos de la forma dimerizada de la lisozima, y de
formulaciones farmacéuticas que contienen el dímero de lisozima como
ingrediente activo:
- el uso del dímero de lisozima para la
fabricación de un medicamento para inhibir la biosíntesis del Factor
de Necrosis Tumoral en animales y humanos;
- el uso del dímero de lisozima para la
fabricación de una preparación farmacéutica para el tratamiento de
enfermedades asociadas con niveles excesivamente altos de Factor de
Necrosis Tumoral;
- el uso del dímero de lisozima para la
fabricación de una preparación farmacéutica para la profilaxis de
enfermedades asociadas con niveles excesivamente altos de Factor de
Necrosis Tumoral;
- el uso del dímero de lisozima para la
fabricación de un medicamento para controlar la liberación inducida
por VIH del Factor de Necrosis Tumoral en portadores asintomáticos
y pacientes del complejo relacionado con SIDA;
- el uso del dímero de lisozima para la
fabricación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento del
SIDA.
- el uso del dímero de lisozima para la
fabricación de una preparación farmacéutica para la prevención y/o
tratamiento de la sepsis y el shock séptico;
- el uso del dímero de lisozima para la
fabricación de una preparación farmacéutica para la prevención y/o
tratamiento de la caquexia;
- el uso del dímero de lisozima para la
fabricación de una preparación farmacéutica para la prevención y/o
tratamiento de la fiebre;
- inyecciones que comprenden el dímero de
lisozima en una cantidad de 0,01-10 mg/ml,
preferiblemente 0,1-1,0 mg/ml de una composición
estéril apirogénica que comprende un disolvente aceptable
fisiológicamente y un conservante aprobado farmacéuticamente;
- inyecciones como las anteriores para
administración intravenosa en una dosis única o repetida de 0,02
mg/kg de peso corporal;
- tampones y apósitos antisépticos impregnados
con, y pomadas o geles que comprenden dosis eficaces del dímero de
lisozima para la prevención de la sepsis y del shock séptico y para
el tratamiento de heridas infectadas;
- tampones vaginales impregnados con una dosis
eficaz de dímero de lisozima para uso durante la menstruación.
Se usa preferiblemente el dímero de lisozima
purificado aislado como una forma dimerizada de la lisozima. Para
algunas aplicaciones es posible emplear composiciones que aparte
del dímero de lisozima también contienen pequeñas fracciones del
trímero y oligómeros superiores de la enzima.
Las inyecciones según la presente invención
también se pueden administrar intramuscularmente e hipodérmicamente.
En algunas aplicaciones también puede ser apropiado administrar la
misma composición líquida (simultáneamente o independientemente)
intrauterinamente e intraubre, o localmente, finalmente junto con
otras preparaciones tópicas.
Las composiciones estériles apirogénicas
preferidas que comprenden al menos un disolvente fisiológicamente
aceptable y/o al menos un conservante farmacéuticamente aprobado
están formadas por agua esterilizada apirogénica o solución de agua
PBS como un disolvente y tiomersal como un conservante aprobado para
preparaciones farmacéuticas de proteínas.
La forma dimerizada de la lisozima es obtenible
en un procedimiento de polimerización controlada del monómero de la
enzima seguida por purificación cuidadosa, en particular, la
eliminación de la forma monomérica con los efectos secundarios
tóxicos informados y de fracciones de trímeros y oligómeros
superiores de la mezcla de post reacción. Cualquier procedimiento
conocido de polimerización puede ser útil para obtener la forma
dimérica de la enzima. Un procedimiento de fabricación que
comprende las etapas de purificación se ha descrito en el documento
WO 91/10731.
Pruebas pre-clínicas previas del
dímero de lisozima no revelaron ningún efecto mutagénico o
teratogénico, y sólo muy leves o ningún efecto de tolerancia. La
toxicidad de dosis única a administración por vía oral/dérmica DL50
fue inmensurable (>2000 mg/kg), a administración intravenosa
DL50 fue >1000 mg/kg.
Se probó que la nueva aplicación del dímero de
lisozima descrita actualmente tenía razones sólidas en pruebas
in vitro y que era eficaz en aplicacionesin vivo. Se
han llevado a cabo también algunos estudios comparativos.
Se cree que el efecto inhibitorio sobre la
liberación del TNF resulta tan eficaz debido al más amplio espectro
de actividad del dímero de lisozima, a saber su habilidad para
inducir la liberación de IFN y su efecto potenciador sobre la
fagocitosis. Las dos nuevas propiedades recién mencionadas son
factores importantes en los mecanismos de defensa naturales. En
consecuencia, los efectos terapéuticos y profilácticos de los
nuevos usos del dímero de lisozima identificados anteriormente se
respaldan por su efecto fortalecedor sobre los mecanismos de
defensa naturales.
La presente invención se explicará más adelante
en los ejemplos en los que se hará referencia a los dibujos que
acompañan ilustrando gráficamente los resultados de las pruebas de
particular interés:
La Fig. 1 ilustra una supresión in vitro
de la liberación de TNF en un cultivo de linfocitos estimulado
subóptimamente con ConA en presencia del dímero de lisozima en
diferentes diluciones.
Para determinar la inmunoactividad del dímero de
lisozima, se ha empleado un ensayo en linfocitos de sangre
periférica humana con análisis FACS.
La estimulación mitogénica en linfocitos
periféricos humanos es un procedimiento bien establecido para probar
la reactividad de las células más importantes del sistema inmune.
Para probar las influencias de sustancias terapéuticas sobre la
activación y proliferación de linfocitos de donantes de sangre
sanos, se añade el mitógeno en una dosis subóptima y se mide al
final cuantitativamente la respuesta de linfocitos con parámetros
inmunorelevantes. Los resultados se comparan con el valor control
medido sin medicación.
Para estimular los linfocitos, se usó ConA en una
concentración de 20 \mug/ml de medio. La concentración celular
inicial fue 10^{6} células/ml. Se llevaron a cabo los cultivos de
tiempo corto en un incubador de CO_{2} durante uno (receptores de
IL-2 sobre linfocitos y HLA-Dr) o
dos días (todos las demás pruebas). Se han medido los siguientes
parámetros como criterio para la activación celular:
- neopterina (Marcador para la activación
inmune)
-
\beta-2-microglobulina (también un
marcador de activación)
- interleucina-2 (sustancia
autocrina y paracrina derivada de linfocito
T-auxiliar)
- interleucina-6 (hormona de
diferenciación celular)
- factor de necrosis tumoral- TNF (interleucina
vasoactiva, multipotente)
- interferón-\alpha (factor de
diferenciación especialmente para linfocitos B)
- timidina quinasa (enzima, aumentada en número
en células de proliferación)
- linfocito receptor de
interleucina-2 (molécula aceptora para la
IL-2 autocrina y paracrina)
- linfocito Ki-67 (antígeno
expresado en células activadas y proliferativas)
- linfocito HLA-Dr (antígeno de
histocompatibilidad de clase II aumentado en número durante la
reacción inmune).
Se hicieron las siguientes observaciones con
respecto a los productos celulares en el sobrenadante del
cultivo;
La neopterina -producida por los linfocitos T
durante la respuesta inmune y en los cultivos estimulados- en los
experimentos presentes no fue marcadamente elevada por el dímero de
lisozima por encima del valor control en células estimuladas con
ConA sin el dímero probado. Los valores de neopterina fueron
ligeramente superiores con concentración aumentada del dímero
probado.
\newpage
Del mismo modo, los valores de
\beta-2-microglobulina en todas
las concentraciones de los dímeros de lisozima fluctuaron alrededor
del valor control.
Los receptores de IL-2 -siendo
liberados de la superficie de los linfocitos durante el cultivo y
dando información acerca del movimiento del receptor de
IL-2 total- estaban en un nivel comparable con los
receptores de IL-2 sobre la superficie de los
linfocitos (informado a continuación) y mostraron una clara
supresión a la concentración más elevada del dímero probado.
La interleucina-6 mostró una
clara tendencia a valores superiores dependientes de dosis en
concentraciones superiores. Esta molécula es muy importante en la
hematopoyesis, la diferenciación celular y la reacción inmune. En
la prueba, los tres primeros valores tuvieron que ser extrapolados,
ya que el patrón más elevado era sólo 2000 pg/ml.
Los resultados relacionados con las moléculas
restantes se muestran en la Tabla 1 a continuación.
Influencia del dímero de lisozima sobre los
linfocitos de sangre periférica humana
\newpage
A diferencia de la
interleucina-6, el TNF-\alpha
estaba inesperadamente presente en los sobrenadantes de los
cultivos en concentraciones dramáticamente reducidas, excepto las
dos últimas etapas de dilución, que resultaron ser ineficaces en la
supresión de la concentración de TNF.
La timidina quinasa se mide en el citoplasma del
linfocito después del congelado y descongelado del sedimento
celular. La timidina quinasa se aumenta en número en células
divisorias haciéndola un buen marcador para la proliferación
celular. Los datos de la Tabla 1 muestran una depresión por las
concentraciones de dímero de lisozima probadas más elevadas; en las
otras etapas de dilución, no se puede ver una tendencia clara. El
interferón-\alpha, por su parte, bajo las mismas
condiciones muestra valores por encima del valor control de ConA
sola a concentraciones más elevadas. Tiene lugar un aumento visible
desde el segundo valor a la tercera dilución.
El HLA-Dr/CD3, siendo un marcador
de histocompatibilidad, se expresa en linfocitos T activados durante
la reacción inmune. Los resultados obtenidos muestran un cierto
porcentaje de células T activadas en el cultivo control; con
diferentes concentraciones de dímero de lisozima en los cultivos,
los valores varían alrededor del valor control.
Receptores de IL-2 en linfocitos;
la interleucina-2 es una citoquina producida por
los linfocitos T-auxiliares después de la activación
a través de la IL-1. La IL-2 es
autocrina y paracrina. Los linfocitos T-auxiliares
no solo producen IL-2 sino que se estimulan también
para la proliferación por esta molécula. Los receptores para la
IL-2 en la superficie de los linfocitos
T-auxiliares se aumentan en número bajo activación.
La Tabla 1 muestra que a la concentración más elevada de dímero de
lisozima existe una marcada supresión de los receptores de
IL-2 en los linfocitos, mientras que los valores
restantes no difieren más que dentro del ancho de banda biológico.
La tabla 1 también contiene datos relacionados con
Ki-67/CD8 y Ki-67/CD4. La
Ki-67 es una molécula de proliferación que aparece
en células que experimentan mitosis. La Ki-67 es un
parámetro importante para calcular las células estimuladas y en la
diagnosis de tumor. En los resultados informados, se ve una leve
inhibición de la proliferación celular en las células supresoras de
Ki-67+ (CD8) con las dos dosis más elevadas de
dímero de lisozima. En los linfocitos auxiliares (CD4) con la dosis
más elevada, parece que hay un aumento sustancial en el porcentaje
de células positivas. Con dosis inferiores, el porcentaje de
células que expresan Ki-67/CD4 es levemente mayor
que el valor control.
La supresión marcada de TNF se muestra en la Fig.
1.
Los parámetros inmunológicos enumerados
anteriormente y elegidos por su importancia potencial en la
respuesta inmune se analizaron con el procedimiento basado en medir
la influencia de una sustancia probada sobre linfocitos periféricos
humanos estimulados con ConA subóptimamente, siendo el procedimiento
bien establecido, sensible y permitiendo evaluar muchos parámetros
diferentes. A algunas concentraciones de dímeros de lisozima hay
diferencias marcadas de los resultados de las pruebas comparados
con los valores de los linfocitos estimulados con ConA solo,
mientras que con respecto por ejemplo al TNF e
IFn-\alpha, los efectos observados están
claramente dentro del intervalo de todas las diluciones
probadas.
Se han llevado a cabo pruebas de laboratorio para
determinar el efecto del dímero de lisozima sobre la actividad
fagocítica de células de leche y sangre in vitro. Antes se
determinó que en la prueba patrón in vitro, el dímero de
lisozima no inhibe la proliferación de los microorganismos aislados
de las glándulas mamarias infectadas de vacas. Como el uso clínico
del dímero de lisozima administrado intrauterina y simultáneamente
intravenosamente elimina eficazmente la infección de las glándulas
mamarias en vacas, estaba claro que el mecanismo antibacteriano
principal en las glándulas mamarias de vacas es la fagocitosis. En
consecuencia, se usaron en pruebas in vitro la sangre y la
leche tanto de las vacas sanas como de las infectadas intentando
determinar el efecto del dímero de lisozima en la fagocitosis. Por
comparación, los experimentos se llevaron a cabo con la misma
concentración de sustancia probada y el mismo tiempo de incubación
usando las células aisladas de vacas sanas e infectadas o incluso
de una sección infectada y una sana de la glándula mamaria de la
misma vaca, para eliminar las diferencias de respuesta
individuales.
En las pruebas llevadas a cabo, se añadieron a la
sangre o leche de las vacas sanas e infectadas tanto la forma
dimérica purificada como una mezcla del dímero y pequeñas
fracciones de trímeros y oligómeros superiores de lisozima en
concentraciones de 25 - 0,25 \mug/ml y la mezcla se incubó a 37ºC
durante 0,5-24 horas. Se determinaron el porcentaje
de células fagocitantes (índice de fagocitosis según el método de
Wishiewski y col.) y el porcentaje de granulocitos
NBT-positivo (según Park) para cada muestra.
El dímero de lisozima potencia la actividad
fagocítica de los leucocitos en las pruebas in vitro. Los
efectos son dependientes de la dosis y del tiempo de incubación.
Son necesarias concentraciones más elevadas de dímero de lisozima
para activar los leucocitos de la leche que los leucocitos de la
sangre. Concentraciones excesivamente altas del dímero reducen
levemente la actividad fagocítica in vitro. Resultados
seleccionados -que muestran principalmente que mientras que la
mezcla de reacción de post-polimerización no
contenga ninguna forma monomérica citotóxica del dímero, se
obtienen resultados comparables para lisozima dimerizada altamente
purificada o menos pura- se muestran en las siguientes Tablas 2 y 3
en las que un término "lisozima dímero+" se usa para indicar
una composición que contiene una pequeña fracción de trímeros y
oligómeros superiores de lisozima como se menciona anteriormente en
la memoria descriptiva.
- *sobre grupo de inflamación; vaca no tratada.
\newpage
Es evidente que el grado de purificación del
dímero de lisozima no tiene efecto marcado sobre la actividad
fagocítica observada de los leucocitos de leche. Puede parecer
además que las células efectoras pueden ser granulocitos.
En los ejemplos adicionales, se informa de
resultados de estudiosin vivo. Para las pruebas clínicas, se
usó la formulación de 2 mg de dímero de lisozima en 10 ml de
solución PBS. Se hace referencia a esta preparación como
KLP-602.
Cuando se administraba intravenosamente, se
demostró que la KLP-602 estimulaba la actividad
fagocítica de los granulocitos de sangre en becerros sanos y
enfermos y en potros sanos así como en vacas lecheras tras la
administración intraubre. El efecto se manifiesta a través de un
número aumentado de neutrófilos y capacidad aumentada para absorber
staphylococcus y para reducir NBT. Este fenómeno tiene lugar
principalmente durante las primeras 12-24 horas
tras la inyección de la preparación. El efecto de la
KLP-602 en la actividad fagocítica en la ubre
dependía de la dosis y la forma del medicamento y de la respuesta
del animal individual.
El dímero de lisozima se usó en la terapia de
enfermedades infecciosas de ganado, cerdos, caballos y perros. En
dosis diferentes y a diferentes intervalos de tiempo, la
preparación se administró intravenosamente, intramuscularmente,
subcutáneamente, intraubre e intrauterinamente. La medicación se
administró a 346 vacas, 274 becerros, 110 cerdas y cerdos, 294
cochinillos, 709 lechones, 35 potros y 107 perros. Se administró
tratamiento alternativo como control. Debido a la naturaleza de los
animales de prueba, ninguno se dejó sin tratamiento terapéutico por
razones morales. Sin embargo, las conclusiones se podrían obtener en
comparación con el cuadro clínico de las enfermedades tratadas
conocidas de la bibliografía veterinaria.
En las pruebas llevadas a cabo en becerros, se
determinó el nivel en sangre de IFN y TNF para un grupo de animales
sanos e infectados, siendo los últimos no tratados en las primeras
12 horas de la infección, después tratados con antibióticos y
curados con dímero de lisozima en forma altamente purificada.
En el grupo tratado con dímero de lisozima, una o
dos inyecciones de KLP-602 curaron sobre 90% de
becerros que padecían gastroenteritis y sobre 85% de casos de
bronconeumonía aguda. Fue muy característica la rápida desaparición
de síntomas tales como fiebre y diarrea. El tratamiento con este
medicamento no requirió suministrar fluidos adicionales a los
animales. El tiempo y la tasa de recuperación fueron superiores al
grupo control tratado con antibióticos.
La KLP-602 fue más eficaz en el
tratamiento de enfermedades que afectan cerdos, 100% o casi 100% de
los animales se recuperaron de las siguientes enfermedades:
agalactia de post-parto (síndrome MMA), disentería,
piometritis, gripe y colibacilosis. La administración del
medicamento en casos de enfermedad de edema y bronconeumonía dieron
resultados levemente menos destacados pero todavía
significativamente mejores que los obtenidos por terapias
alternativas. Se pudo observar la rápida recesión de la diarrea
(normalmente durante las primeras 24 horas) y la fiebre así como la
reaparición de la secreción de leche de particular importancia en
casos de inflamaciones de ubre post-parto e
intrauterinas (salvando la vida de los cochinillos). La eficacia de
la terapia de KLP-602 en comparación con
tratamientos alternativos se muestra en la Tabla 4 a
continuación.
Cuando se trataron con KLP-602,
100% de los potros que padecían enteritis y 83,3% de los potros que
padecían bronconeumonía se han recuperado más rápido que el grupo
control con preparaciones conocidas.
La KLP-602 se probó en el
tratamiento de algunas enfermedades en perros, como foliculitis
(100% de eficacia), infección de los tractos respiratorios superior
e inferior e infección de los tractos gastrointestinales que se
manifestaban por diarrea. En este grupo fue frecuente la
parvovirosis, que se sabe que es una enfermedad prácticamente
incurable. Sin embargo, se observó una tasa de recuperación de
aproximadamente 75% en los casos de parvovirosis.
En las pruebas llevadas a cabo con los animales
afectados con enfermedades que tenían lugar naturalmente, como se
describe anteriormente, se hicieron varias observaciones
importantes:
1. La terapia resultó ser eficaz y muy sencilla
en el tratamiento de enfermedades que tienen una etiología y
patogénesis multi-factor (tales enfermedades son
frecuentes en poblaciones de animales y son difíciles de controlar
especialmente en las granjas de cría donde la difusión epidémica de
enfermedades es muy fácil). Tales descubrimientos prueban el efecto
modulador del dímero de lisozima sobre los mecanismos de defensa
naturales.
\newpage
2. La terapia resultó ser eficaz en enfermedades
que implican en su curso natural la presencia de shock endotóxico u
otras alteraciones como fiebre alta y duradera, que afecta el
estado de un animal durante un largo periodo de tiempo después de la
recuperación y así extremadamente perjudiciales para los animales
como caballos (potros)- criados para carreras y otros deportes, así
como los criados principalmente para la industria alimenticia, caso
en el que los costes de producción son la cuestión crítica. Las
recuperaciones rápidas permitirán la reducción significativa de
costes para el tratamiento de tales enfermedades.
3. Los resultados observadosin vivo
confirman niveles contenidos de TNF en diferentes infecciones que
tienen lugar naturalmente tratadas con dímeros de lisozima y apoyan
así la invención como se reivindica.
Se estudió el efecto del dímero de lisozima sobre
la actividad de los antibióticos contra varios microorganismos
diferentes para seleccionar la bacteria para pruebas adicionales,
para determinar las dosis de antibióticos más eficaces para los
microorganismos seleccionados y para encontrar el intervalo de las
concentraciones de dímero de lisozima dentro del que se observarán
los efectos esperados. En los experimentos, se usaron dos lotes de
dímero de lisozima purificado liofilizado, uno producido en 1991 y
otro producido en 1992. En los experimentos, se usaron antibióticos
accesibles en el mercado polaco, como los suministrados por Polfa,
un fabricante polaco de los medicamentos, como penicilina,
neomicina, eritromicina, cafalosporina (SEFRIL).
Los antibióticos que se iban a probar se
suspendieron en una solución de NaCl tamponada
(PBS-Biomed) o en suero bovino. Un dímero de
lisozima se añadió después a la suspensión de tal forma que en las
muestras probadas la concentración del dímero fue siempre 5
\mug/ml. Las concentraciones de los antibióticos que se estaban
probando eran diferentes en cada prueba debido a la variada
sensibilidad de los microorganismos usados.
El efecto del antibiótico solo o en combinación
con un dímero de lisozima se probó en una suspensión de PBS o de
suero bovino in vitro en Escherichia Coli, Salmonella
enteriditis, Staphylococcus aureus y Streptococcus uberis
aislados de animales enfermos. También se usaron en los
experimentos cepas de laboratorio de Sarcina Lutea 9341 ATCC
y Staphylococcus aureus.
Debido al carácter preliminar de las pruebas,
cada antibiótico se probó contra 1, 2 ó 3 tipos diferentes de
bacteria como sigue:
1. La preparación de la porción de 0,05 ml de
placas A de un cultivo de caldo de 18 horas de la cepa de la
bacteria que se iba a probar se añadió a una muestra de 14 ml de
agar enriquecido (Biomed). La mezcla se agitó y se vertió sobre una
placa de 10 mm de diámetro. Después del enfriamiento y
solidificación del agar, se colocaron en el mismo cilindros
estériles, y los cilindros se rellenaron con las soluciones del
antibiótico que se iba a probar.
2. La preparación de las muestras de 10 mg de
soluciones de antibiótico A del antibiótico que se iba a probar se
disolvió inicialmente en PBS; a continuación, el volumen requerido
de esta solución se añadió al volumen predeterminado de PBS o suero
bovino para obtener una concentración del antibiótico tan cercana
como fuera posible a la CIM (concentración inhibitoria mínima); se
prepararon siempre soluciones de 3 concentraciones diferentes.
3. La preparación de 10 mg de solución de dímero
de lisozima del dímero de lisozima liofilizado se disolvió
inicialmente en 10 ml de PBS. Se prepararon diluciones adicionales
o con PBS o con suero bovino y se añadieron a las soluciones de
antibiótico preparadas antes como se describe anteriormente. Se
probaron las siguientes combinaciones:
- antibiótico/PBS
- antibiótico/PBS + dímero de lisozima
- antibiótico/suero
- antibiótico/ suero + dímero de lisozima
La concentración de antibiótico fue la misma en
cada cilindro; la concentración del dímero de lisozima fue 5
\mug/ml. Después de que se rellenaran los cilindros con las
soluciones, las placas se mantuvieron a temperatura ambiente durante
2 horas; después, los cultivos se incubaron a 37ºC.
4. Lectura de los resultados y evaluación de la
actividad:
Las placas se retiraron del calentador después de
18 horas de incubación, y se midió el diámetro de la zona de
inhibición de crecimiento de la bacteria (ausencia de colonias)
alrededor de los cilindros.
No se encontró diferencia en el tamaño de las
zonas de inhibición de crecimiento de la bacteria alrededor de los
cilindros rellenos con las suspensiones de antibiótico en PBS sin y
con adición de dímero de lisozima en una concentración de 5
\mug/ml. El tamaño de la zona de inhibición, sin embargo,
disminuyó alrededor de los cilindros rellenos con la suspensión de
antibiótico en suero bovino, pero aumentó- alrededor de los
rellenos con las suspensiones de antibiótico + dímero de lisozima en
suero bovino. Las zonas eran más grandes que las vistas alrededor
de los cilindros rellenos con suspensiones de PBS así como más
grandes que las de alrededor de los cilindros rellenos con
suspensiones de suero de antibióticos solos, libres de dímero de
lisozima.
El fenómeno tuvo lugar en las pruebas con
penicilina usada contra Sarcina lutea. La ampicilina mostró
un sinergismo en combinación con el dímero de lisozima al inhibir
el crecimiento in vitro de Escherichia coli, Salmonella
enteriditis y Staphylococcus epidermis. Se advierte que
hay un aumento de actividad de la eritomicina en presencia del
dímero de lisozima contra Staphylococcus aureus 209 P y
Streptococcus uberis así como de SEFRIL- contra
Staphylococcus aureus 209 P. Escherichia coli y
Salmonella enteriditis fueron resistentes a este
antibiótico.
El aumento de actividad antibacteriana de los
antibióticos probados se observó solo cuando se usó como solvente
el suero bovino. Como norma, el aumento hizo un promedio de 50%,
pero en algunos casos, la presencia del dímero de lisozima dio como
resultado un aumento del 100% en la actividad de los
antibióticos.
El dímero de lisozima (sin ningún conservante) en
concentraciones de 5 \mug/ml presenta in vitro un
sinergismo con algunos antibióticos usados en CIM (concentración
inhibitoria mínima) en presencia de suero bovino al inhibir el
crecimiento de la bacteria. Los resultados obtenidos hasta ahora
dejan claro que serán esenciales estudios adicionales.
Ito y col. han informado recientemente de que el
TNF-\alpha puede antagonizar la actividad
anti-VIH del AZT (Ito, M. y col.: ''Tumor necrosis
factor antagonizes inhibitory effect of azidothimidine on human
immunodeficiency virus (HIV) replication in vitro; Biochem.
Biophys. Res. Commun. 1990, 166; 1095-1101). Los
pacientes de SIDA en un estado avanzado padecen muchas infecciones
ocasionales. Algunos agentes infectivos pueden inducir la elevación
de TNF-\alpha, IL-6 y otras
citoquinas que pueden ser o inmunosupresoras o pueden promover la
replicación del VIH.
En consecuencia, el tratamiento con AZT solo no
es suficientemente eficaz. Para aumentar la actividad
anti-VIH del AZT, se propone por lo tanto combinar
el tratamiento de AZT con la administración del dímero de lisozima
para inhibir la síntesis del TNF- el factor que antagoniza una
actividad anti-VIH del AZT.
Claims (8)
1. Uso de una forma dimerizada de lisozima para
la fabricación de un medicamento para fortalecer los mecanismos de
defensa naturales modulando dichos mecanismos de defensa naturales
que comprende al menos una de las siguientes acciones: inhibición
de la liberación del factor de necrosis tumoral (TNF), disminución
de un nivel de TNF, potenciación de la fagocitosis, aumento de la
liberación de interferón, aumento de los valores de
interleucina-6, en animales o humanos.
2. Uso según la reivindicación 1, para la
disminución de un nivel de TNF superior a 13,75 pg/ml.
3. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2 para la fabricación de un medicamento para
administrar dicha lisozima dimerizada en una dosis única o repetida
de 0,3 \mug a 1 mg por 10^{6} leucocitos.
4. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, para aplicación profiláctica o terapéutica,
preferiblemente para la prevención o tratamiento de al menos una de
las siguientes enfermedades: sepsis, shock séptico, caquexia, SIDA,
e infecciones relacionadas con SIDA.
5. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 en el que dicho medicamento comprende dicha
lisozima dimerizada en combinación con un antibiótico y/o AZT.
6. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho medicamento tiene la forma
de una solución de inyección que comprende la lisozima dimerizada
en una cantidad de 0,01-1,0 mg/ml, preferentemente
0,1-1,0 mg/ml, de una composición apirogénica
estéril que comprende al menos un disolvente fisiológicamente
aceptable y/o al menos un conservante aprobado
farmacéuticamente.
7. Uso según la reivindicación 6, para la
administración de una dosis única o repetible de 0,02 mg/kg de peso
corporal.
8. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho
medicamento tiene la forma de una de las siguientes composiciones;
un gel o una pomada que comprende una dosis eficaz de la forma
dimerizada de lisozima, o un apósito o tampón antiséptico
impregnado con una dosis eficaz de la forma dimerizada de
lisozima.
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