ES2070919T5 - Separacion cromatografica de las proteinas del plasma, principalmente del factor viii, del factor de willebrand de la fibronectina y del fibrinogeno. - Google Patents
Separacion cromatografica de las proteinas del plasma, principalmente del factor viii, del factor de willebrand de la fibronectina y del fibrinogeno.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA LA SEPARACION DE PROTEINAS A PARTIR DE UNA FRACCION DE PLASMA HUMANO O ANIMAL. SEGUN ESTE PROCEDIMIENTO, SE SOMETE UNA FRACCION SOLUBILIZADA DE PLASMA CRIOPRECIPITADO A UNA ETAPA UNICA DE CROMATOGRAFIA SOBRE UNA RESINA CAMBIADORA DE ANIONES DE CARACTER IONICO MODERADO Y QUE PERMITE LA PUESTA EN JUEGO DE INTERACCIONES HIDROFOBAS QUE NO ABSORBE CIERTAS PROTEINAS Y FIJA OTRAS, QUE SE ELUYE ENSEGUIDA AUMENTANDO LA FUERZA IONICA DEL TAMPON POR ADICION DE NACL. LA EJECUCION DEL PROCEDIMIENTO DE LA INVENCION PERMITE EN ESPECIAL OBTENER UN CONCENTRADO DE FACTOR VIII DE ALTA PUREZA UTILIZABLE PARA EL TRATAMIENTO DE LA HEMOFILIA A. EL PROCEDIMIENTO PERMITE IGUALMENTE OBTENER CONCENTRADOS DE FIBRINOGENO, FACTOR VON WILLEBRAND Y FIBRONECTINA.
Description
Separación cromatográfica de las proteínas del
plasma, principalmente del factor VIII, del factor de Willebrand de
la fibronectina y del fibrinógeno.
La invención se refiere a la separación de
proteínas de una fracción de plasma humano o animal por
cromatografía de intercambio de aniones según una técnica que
permite obtener en una sola etapa un grado de purificación muy
importante, principalmente del factor VIII, del fibrinógeno y del
factor de Willebrand.
La puesta a disposición de proteínas de la sangre
necesita, para su utilización con fines terapéuticos, técnicas de
purificación que permitan obtener productos de elevada pureza y
totalmente desprovistos de contaminantes, principalmente de otras
proteínas o de substancias de origen extraño tales como
anticuerpos.
Así, es esencial, en el tratamiento de la
hemofilia A, disponer de concentrados de factor VIII de pureza muy
elevada, en efecto, los enfermos sufren inyecciones numerosas y
repetidas de concentrados de factor VIII y, simultáneamente, de
cantidades importantes de fibrinógeno y de inmunoglobulina que
pueden inducir a respuestas inmunitarias indeseables. De este modo
inyecciones repetidas de factor VIII insuficientemente purificado no
pueden realizarse más que con concentrados de plasmas isogrupos para
evitar los accidentes típicos de las transfusiones debidos a las
diferencias de grupos sanguíneos y provocados por la presencia de
inmunoglobulinas.
Los concentrados de factor VIII se preparan la
mayoría de las veces a partir de una fracción de plasma humano
crioprecipitado. La pureza de los concentrados de factor VIII
generalmente obtenidos en los concentrados industriales de
tratamiento del plasma humano es frecuentemente del orden de 1 UI/mg
y generalmente no exceden de los límites de 10 a 20 UI/mg. Las
técnicas de producción clásicas utilizan etapas de precipitación que
tratan de eliminar, frecuentemente de manera muy imperfecta, los
contaminantes protéicos tales como el fibrinógeno, la fibronectina,
y las inmunoglobulinas. Estas técnicas pueden utilizar o combinar
una precipitación a baja temperatura (10ºC) o la adición de agentes
de precipitación de las proteínas; así se han propuesto como agentes
de precipitación del factor VIII (Farrugia et coll., Thromb
Haemostas, 51:338-342, 1984), polímeros hidrófilos
tales como el PEG (Newman et al., Br. J. Haematol
21:1-20, 1971; Hao et al., in Methods of
Plasma Protein Fractionation, Academic Press 1980, pp.
57-74), la polivinilpirrolidona (Casillas et
Simonetti, Br. J. Haemato, 50:665-672, 1982), el
dextrano, el Ficoll, el Percoll, el almidón hidroxietilado y la
albúmina. Igualmente ocurre con el uso de glicocola y de cloruro de
sodio preconizado por Thorell et Blömback. De la misma forma,
algunos autores (Ng et al, Thrombosis Res.,
42:825-834, 1986) han tenido éxito en la combinación
de tres agentes de precipitación que son el PEG, la glicocola y el
cloruro de sodio para obtener concentrados de factor VIII con
actividad específica comprendida entre 10 y 16 UI/mg.
Se utilizan también técnicas de cromatografía de
exclusión estérica, o tamizado molecular, destinadas a la
recuperación de una fracción de alto peso molecular que contiene el
complejo factor VIII: factor C de Willebrand parcialmente
desprovista de fibrinógeno. Esta técnica proporciona, con bajo
rendimiento, un producto cuya actividad específica no sobrepasa de
30 UI/mg y que requiere la adición de albúmina como estabilizante
(lo que conduce a un descenso de la actividad específica hasta
aproximadamente 3 a 5 UI/mg). Esta técnica plantea algunos problemas
de adaptación a gran escala puesto que es difícil de mantener
constante en el tiempo el poder de resolución de las columnas
industriales de tamizado molecular.
Igualmente se han producido concentrados de
factor VIII por integración al protocolo de producción de un
contacto con bolas de sílice porosa destinada a aprisionar los
contaminantes protéicos de bajo peso molecular (Margolis et
al., Vox Sang. 46:341-348, 1984). La actividad
específica del producto sigue siendo relativamente baja: 1
UI/mg.
Recientemente han aparecido técnicas nuevas en la
preparación de concentrados de factor VIII de pureza muy elevada.
Así las firmas Hyland y Travenol han propuesto concentrados
obtenidos por métodos de cromatografía de inmunoafinidad (Zimmerman
et Fulcher, Thrombosis Res., Suppl. VII, p. 58, 1987; Berntorp et
Nilsson, Thrombosis Res., Suppl. VII, p. 60, 1987; Levine et
al., Thrombosis Res. Suppl. VII, 1987). Estas técnicas consisten
en purificar el factor VIII por medio de anticuerpos antifactor
VIII: C o antifactor de Willebrand inmovilizados sobre un soporte
cromatográfico. Estas técnicas dan buenos rendimientos pero exigen
el empleo de soluciones drásticas para desorber el factor VIII bien
de su anticuerpo, bien del factor de Willebrand. Por lo tanto se
necesita una etapa suplementaria de ultrafiltración que trata de
eliminar los agentes químicos indeseables pero esta puede perjudicar
la actividad biológica del factor VIII. La actividad específica del
factor VIII puede alcanzar 1.000 a 3.000 UI/mg en el curso de la
producción, pero su fragilidad exige la adición de un estabilizante,
tal como la albúmina, antes de la etapa de liofilizado, lo que
reduce la actividad específica del factor VIII a 3 a 5 UI/mg. El
mayor inconveniente de la purificación por inmunoafinidad consiste
sin embargo en la presencia de anticuerpos residuales; siendo éstos
de origen murino, pueden entrañar en el caso de los enfermos la
aparición de reacciones inmunológicas frente a ciertas proteínas
extrañas al organismo humano.
Igualmente se han utilizado técnicas de
cromatografía por intercambio de iones, pero teniendo en cuenta la
complejidad de los procesos operatorios y los bajos rendimientos
obtenidos, estas técnicas han permanecido en estadio de
laboratorio.
De este modo el artículo de J.J. Morgenthaler
(Thromb. Haemostas., Stuttgart, 47(2) 124-127
(1982) estudia la purificación de factor VIII:C a partir de
precipitado con polietilenglicol por paso sobre una resina de
sefarosa modificada. No se ha dado ninguna indicación sobre el
rendimiento ni sobre la reproductibilidad de las diferentes técnicas
ensayadas.
Por lo tanto es completamente esencial disponer
de nuevos métodos de obtención de concentrados de proteínas y
principalmente de factor VIII, aplicables a la escala industrial y
que den productos de pureza muy elevada, totalmente desprovistos de
proteínas de origen extraño tales como anticuerpos de origen
animal.
La solicitud de patente europea nº 88108458.6
publicada el 29 de Noviembre de 1.989 describe un procedimiento para
la preparación de factor VIII a partir de un crioprecipitado que se
caracteriza porque, antes del tratamiento de inactivación viral, se
extrae el crioprecipitado descongelado con agua que contiene de 1 a
3 U/ml de heparina a pH 6,5-7,5 se hace reaccionar
con una suspensión de hidróxido de aluminio y, tras refrigeración a
10-18ºC y regulación del pH a 6-7,
se centrífuga o se filtra y a continuación se prosigue la
purificación mediante un tratamiento ulterior, en particular
mediante cromatografía de permeación de gel sobre una resina
intercambiadora de iones tal como Fractogel-DEAE, de
tipo hidrófilo.
Este documento describe por lo tanto la
purificación solamente del factor VIII por asociación de una etapa
preliminar muy particular, que se caracteriza principalmente por la
ausencia total de tratamiento etanólico, con una cromatografía de
intercambio de iones sobre una resina hidrófila tal como Fractogel
DEAE.
La solicitante ha puesto a punto ahora un
procedimiento de purificación por cromatografía de intercambio de
aniones que, merced a una elección juiciosa de la resina utilizada,
permite separar en una sola columna cromatográfica las proteínas
buscadas en condiciones suficientemente controladas como para hacer
inútiles los tratamientos ulteriores, tales como la ultrafiltración,
que aumentan la complejidad del procedimiento y disminuye la
actividad de la proteína purificada.
La invención se refiere por lo tanto a un
procedimiento para la separación de las proteínas factor VIII,
fibrinógeno, fibronectina y de factor de Willebrand del plasma
humano o animal, caracterizado porque se somete una fracción
resolubilizada en agua de un crioprecipitado de plasma humano, a una
separación única por vía cromatográfica sobre una resina
intercambiadora de aniones, cuya matriz es un gel de tipo polímero
vinílico macrorreticulado capaz, por sus propiedades de porosidad y
de hidrofobicidad, de retener el complejo factor
VIII-factor de Willebrand y porque se recuperan
selectivamente las diferentes proteínas por aumentos selectivos de
la fuerza iónica del tampón de elución, según la reivindicaicón
1.
El procedimiento es aplicable igualmente a un
plasma de origen animal, por ejemplo porcino, para los casos
particulares de enfermedades hemófilas con suero inhibidor que no
puedan tratarse con factor VIII de origen humano.
También puede utilizarse como fracción de partida
una fracción de plasma crioprecipitado que haya sufrido,
eventualmente, un tratamiento de prepurificación. Este tratamiento
previo puede consistir, por ejemplo, en una precipitación con gel de
alúmina y/o una precipitación a baja temperatura según las técnicas
clásicas de tratamiento de tales fracciones.
Entre las diferentes resinas ensayadas para la
separación cromatográfica, se ha observado que los resultados más
satisfactorios se obtenían cuando se utilizaban agrupamientos DEAE
injertados sobre una matriz que presente las propiedades indicadas
anteriormente, necesarias para la fijación del complejo factor
VIII-factor de Willebrand. Una resina de este tipo
está disponible en el comercio bajo la denominación Fractogel®
TSK-DEAE (Merck).
La solicitante ha comprobado en efecto que este
tipo de resina, conocida por sus propiedades hidrófilas como se
recuerda en la solicitud de patente nº 88 108458.6, tenía de hecho
también, en las condiciones de aplicación apropiadas,
características de hidrofobicidad suficientes como para poder
retener el complejo factor VIII-factor de Willebrand
según el procedimiento de la presente invención.
La resina Fractogel® TSK-DEAE 650
de porosidad de tipo M ha proporcionado de este modo resultados
netamente superiores que otros geles ensayados, como la
DEAE-Sepharose® CL-6B,
DEAE-Sefarosa, CL-6B
Fast-Wlow (Pharmacia), DEAE-Sefarosa
4B o la DEAE-Trisacrilo LS (IBF).
Se ha preconizado la utilización de un gel
semejante al
Fractogel-TSK-DEAE(M) por Y.
Kato et al. (J. Chromato. 245, 1982, 193-211)
y se ha recomendado para separaciones cromatográficas con
rendimiento medio y a escala industrial de proteínas de tamaño muy
grande. La capacidad de retención-elución de este
gel macrorreticulado reposa sobre un bajo poder de intercambio
iónico y sobre la dimensión importante de los poros.
De este modo la solicitante ha mostrado que este
tipo de gel permitía adsorber preferentemente los complejos de
tamaño muy grande que se forman entre el factor VIII y el factor de
Willebrand. Además, la solicitante ha aprovechado, mediante la
elección de tampones de equilibrado y de elución, los enlaces
débilmente hidrófobos que se establecen merced a la retención
prolongada de los complejos de gran tamaño sobre el soporte
polivinílico. Esta ventaja del gel no había sido puesta en evidencia
anteriormente.
Mediante la utilización de una resina de este
tipo para tratar una fracción de plasma que contiene factor VIII,
por ejemplo una solución prepurificada del crioprecipitado, se
obtiene, en condiciones de tampón apropiadas, un concentrado de
factor VIII de pureza muy elevada, y de calidad asimilable a la de
un concentrado de plasma isogrupo, a una concentración del orden de
50 UI/ml (actividad específica superior a 100 UI/mg), sin tener que
recurrir a una etapa de ultrafiltración, y de gran estabilidad, es
decir que no necesita ya la adición de un estabilizante de
naturaleza protéica. De este modo se obtienen, por la misma
cromatografía, fracciones enriquecidas en fibrinógeno, en
fibronectina y en factor de Willebrand, que responden a los
parámetros físico-químicos que satisfacen a un uso
terapéutico o a título de reactivo. Además el fibrinógeno puede ser
concentrado ventajosamente para ser utilizado como cola biológica,
según la solicitud de patente europea 88.401961.3.
La realización del procedimiento según la
invención se efectúa como sigue. La fracción de plasma prepurificada
y que contiene las proteínas mayores del crioprecipitado, es decir
el fibrinógeno, el factor VIII, la fibronectina y el factor de
Willebrand, pasa sobre una resina intercambiadora de iones tal como
se ha especificado anteriormente; el factor VIII, el factor de
Willebrand (la totalidad o una gran parte, según la cantidad de
material de partida) y la fribronectina se adsorben sobre la resina
mientras que el fibrinógeno vuelve a encontrarse en el filtrado de
las proteínas no adsorbidas.
Mediante un primer aumento de la fuerza iónica
del tampón se eluye la fibronectina y una gran parte del factor de
Willebrand.
Mediante un aumento suplementario de la fuerza
iónica del tampón se eluye el factor VIII en presencia de pequeñas
cantidades de factor de Willebrand y puede liofilizarse directamente
sin que sea necesario agregarle un estabilizante o someterlo a una
etapa de ultrafiltración.
El tampón utilizado contiene ventajosamente la
lisina a una dosis del orden de 2 a 4 g/l así como glicocola a una
dosis del orden de 8 a 11 g/l. La utilización de otros ácidos
aminados o incluso de uno de estos dos ácidos aminados da resultados
netamente menos satisfactorios.
El aumento de la fuerza iónica del tampón se hace
mediante adición de cloruro de sodio. En efecto, la utilización
única de esta resina de carácter iónico moderado y de naturaleza
ligeramente hidrófoba permite utilizar esta sal para desorber el
factor de Willebrand antes de la elución del factor VIII lo que
evita tener que recurrir al cloruro de calcio, que sería necesario
eliminar a continuación por ultrafiltración, para disociar factor
VIII:C y factor de Willebrand.
Evidentemente se puede prever un tratamiento de
inactivación vial según una técnica conocida, en un estadio
cualquiera del procedimiento. En el caso en que se utilice un agente
químico de inactivación viral, será juicioso efectuar esta
inactivación justamente antes del paso de la fracción de plasma
sobre la resina. De esta forma la etapa cromatográfica servirá para
la eliminación eficaz de los agentes de inactivación.
Se han obtenido buenos resultados utilizando la
técnica de inactivación por disolvente-detergente,
tal como se describe en la solicitud de patente europea Nº 0 131
740.
Para la preparación del factor VIII la etapa de
cromatografía puede realizarse sobre cualquier fracción protéica que
lo contenga, por ejemplo sobre una fracción plasmática
crioprecipitada purificada que haya sido sometida a un tratamiento
con gel de alúmina eventualmente seguido de una precipitación a baja
temperatura, según métodos clásicos de producción de concentrados de
factor VIII, que se han descrito en la solicitud de patente europea
EP-A-0 238 701.
La actividad específica del factor VIII:C en la
fracción de partida puede ser tan baja como de 0,1 UI/mg. El factor
de purificación obtenido por una sola etapa de cromatografía de
intercambio de aniones es, según la invención del orden de 400 a 700
veces. El rendimiento de esta etapa está comprendido entre el 75 y
el 90%.
El concentrado de factor VIII obtenido es de
pureza muy alta, siendo su actividad específica mayor que 100 UI/mg
de proteínas. Está desprovisto de fibrinógeno y de inmunoglobulinas
G y está claramente empobrecido en fibronectina. Este producto está
desprovisto o no contiene más que dosis ínfimas de anticuerpos
humanos de grupo y de este modo es asimilable a un concentrado de
calidad isogrupo según las normas preconizadas por la farmacopea
europea, dándose esto mismo cuando se utiliza como material de
origen un plasma no seleccionado por el grupo sanguíneo. Por lo
tanto puede utilizarse de manera muy ventajosa en la terapéutica o
más particularmente en el tratamiento de la hemofilia A que necesita
inyecciones corrientemente repetidas. Igualmente puede utilizarse
como reactivo en todos los ensayos o análisis que necesiten un
factor VIII de pureza muy elevada.
Las otras fracciones separadas por esta columna
de cromatografía son igualmente interesantes por las proteínas que
contienen, a saber respectivamente el fibrinógeno, por una parte,
que se recupera en el primer filtrado, y por otra parte la
fibronectina y el factor de Willebrand que se eluyen por el primer
aumento de la fuerza iónica del
tampón.
tampón.
Los ejemplos siguientes ilustran la invención sin
limitar sin embargo su alcance.
Se utiliza como material de partida un
crioprecipitado de plasma humano, puesto en suspensión en una
solución acuosa de heparina sódica (con 2 U/ml) y que contiene
factor VIII con una actividad específica comprendida entre 0,6 y 1,1
UI/mg.
El pH de la suspensión se ajusta a
7-7,1 con el ácido acético 0,1 M.
Esta suspensión de crioprecipitado se somete a
una prepurificación mediante tratamiento con gel de alúmina y
precipitación en frío. Se agrega a la suspensión hidróxido de
alúmina (108 g de Al(OH)_{3} al 2% por 1 kg de
crioprecipitado) bajo agitación durante 5 minutos a temperatura
ordinaria. Se ajusta el pH a 6,5-6,6 con ácido
acético 0,1 M y a continuación se refrigera la suspensión a
14-16ºC, bajo agitación. Desde el momento en que se
alcanza la temperatura deseada, se centrífuga a
14-16ºC, se recupera el sobrenadante y se le
esteriliza por filtración.
Esta solución prepurificada se somete a un
tratamiento de inactivación viral mediante
disolvente-detergente, en presencia de Tween®-TNBP,
según el método descrito en la solicitud de patente europea nº 0 131
740.
Se prepara una columna de cromatografía con la
resina Fractogel® TSK-DEAE 650 (M) (Merck). Se prevé
una cantidad de 0,5 litros de Fractogel® por kg de crioprecipitado.
La columna se lava con 5 volúmenes de solución de NaCl 0,1 M y a
continuación se equilibra con el tampón siguiente:
Citrato de sodio trisódico (2,94 g/l), cloruro de
calcio (1 mM), cloruro de sodio (0,11 M), glicocola (9 g/l), y
lisina (3 g/l).
La solución de crioprecipitado prepurificada
descrita en el párrafo A) se inyecta sobre la columna.
El filtrado y los eluatos siguientes se recuperan
y se sigue su contenido en proteínas por la medida de la absorción a
280 nm (denominado a continuación D.O.).
El primer filtrado muestra un pico de proteínas
no adsorbidas por la columna que corresponde esencialmente al
fibrinógeno (véase el ejemplo 3).
Tras el paso de este pico, cuando la D.O. ha
vuelto a caer hasta la línea de base, se eluye la columna con el
mismo tampón cuya fuerza iónica se aumenta una primera vez por
adición de NaCl, a una concentración final de 0,15 M. Este tampón
desorbe un pico de proteínas que contiene la parte mayor del factor
de Willebrand y fibronectina (véase el ejemplo 4).
Tras pasar este pico, cuando la D.O. vuelve a
caer hasta la línea de base, se aumenta una segunda vez la fuerza
iónica del tampón por adición de NaCl hasta la concentración final
de 0,25 M.
En estas condiciones el factor VIII se eluye a
una concentración del orden de 30 a 40 UI/ml.
La solución de factor VIII obtenida por el
procedimiento cromatográfico descrito en el ejemplo 1, es
suficientemente pura y está suficientemente concentrada como para
ser directamente condicionada en frascos y ser liofilizada, sin
etapa suplementaria de ultrafiltración.
La concentración puede ajustarse eventualmente
por dilución con el mismo tampón de elución para ajustar la
actividad específica por frascos según normas legales.
La composición media de las soluciones recogidas
es la siguiente:
| Proteínas (g/l) | 0,16 - 0,5 |
| Factor VIII:C (UI/ml) | 30-45 |
| Actividad específica del factor | |
| VIII:C (UI/mg) | 120 - 250 |
| Fibrinógeno (g/l) | < 0,1 |
| Factor de Willebrand: Ag (U/ml) | 11 - 23 |
| Factor de Willebrand: RCO (U/ml) | 10 - 20 |
| Factor VIII:Ag (U/ml) | 35 - 60 |
| IgG (mg/ml)(Nefelemetría) | < 0,011 |
| Anticuerpos anti-A naturales e inmunes | 0 - 2 |
| Fibronectina (mg/l) | 15 - 40. |
Tras liofilizado, la solubilidad del producto es
instantánea y el producto es límpido. El grado de factor VIII:C es
estable durante 24 horas a temperatura ambiente.
Las inyecciones sobre los seres humanos indican
una recuperación del factor VIII:C comparable a la que se obtiene
con los productos de menor pureza. Igualmente la semiduración de
vida es equivalente a la de los otros productos.
Este concentrado se ha revelado como un producto
de valor terapéutico muy elevado, particularmente adaptado a las
inyecciones repetidas necesarias en el tratamiento de la hemofilia
A.
El primer filtrado de la cromatografía sobre
DEAE-Fractogel descrito en el ejemplo 1 contiene
principalmente fibrinógeno pero también albúmina, inmunoglobulinas y
los agentes de inactivación viral (Twenn® y TNBP).
El fibrinógeno se purifica a partir de esta
solución mediante una nueva etapa de cromatografía sobre columna de
resina de heparina-sefarosa.
Esta cromatografía se efectúa en el mismo tampón
que la anterior, ajustado a 0,06 M en NaCl, lo que permite evitar
una diálisis entre las dos cromatografías.
El filtrado de la primera cromatografía se diluye
para obtener una osmolaridad de 280 mosM a un pH de 6,5 antes de
inyectarse sobre la segunda columna. Se vuelve a encontrar en el
segundo filtrado, la albúmina, las inmunoglobulinas, el Tween® y el
TNBP. El fibrinógeno queda adsorbido sobre la columna.
Cuando la D.O. del filtrado vuelve a caer hasta
el nivel de base, se eluye la columna con el mismo tampón tras haber
aumentado su fuerza iónica por adición de NaCl hasta una
concentración final de 0,16 M.
La fracción de fibrinógeno recogida se concentra
a continuación y se dializa sobre un sistema de cassette. El
producto concentrado se distribuye en frascos y se liofiliza.
Este fibrinógeno concentrado responde a las
normas de calidad fijadas por la farmacopea europea.
Además puede servir de substrato para la
preparación de cola biológica según la solicitud de patente europea
EP-A-0 305 243.
La fracción eluida de la cromatografía sobre
DEAE-Fractogel® en presencia de 0,15 M de NaCl,
descrita en el ejemplo 1, está fuertemente enriquecida en factor de
Willebrand y en fibronectina. Esta contiene todavía Tween® y
TNBP.
Esta fracción se diluye para llevar su
osmolaridad a 385-390 mosM con el tampón de base de
cromatografía (citrato trisódico, cloruro de calcio, lisina,
glicina, pH 7, osmolaridad 18 mosM).
A continuación se inyecta sobre una segunda
columna de DEAE-Fractogel®, equilibrada con el mismo
tampón que anteriormente y que contiene NaCl a una concentración
final de 0,11 M, ajustada a pH 7 y 387 mosM.
En estas condiciones se asegura una eliminación
muy buena del Tween® y del TNBP.
Puesto que la solución de partida está ya muy
concentrada en factor de Willebrand, la fijación de ésta sobre la
columna es netamente mayor que en el curso del pasaje sobre la
primera columna. La capacidad de fijación de la columna es al menos
de 160 U Ag/ml (unidad de antígeno de factor de Willebrand) o de 100
U RCO/ml (unidad de cofactor de ristocetina).
La elución de la fracción que contiene el factor
de Willebrand se efectúa por adición al tampón de NaCl hasta una
concentración final de 0,15 M.
La solución de factor de Willebrand eluida está
suficientemente concentrada como para no necesitar ultrafiltración
suplementaria; esta se distribuye en frascos y se liofiliza.
El concentrado obtenido es de pureza muy alta y
presenta una actividad específica mayor que 100 U RCO/mg. Además
contiene fibronectina pero esta no perjudica su actividad.
Puede prepararse igualmente un concentrado de
fibronectina a partir del mismo eluato de partida que en el ejemplo
4.
En efecto puede separarse el factor de Willebrand
y la fibronectina sobre la base de su diferencia de pesos
moleculares. Mediante tamizado molecular sobre columna de Séphacryl
S-400 (R) (Pharmacia) por ejemplo, se separa una
primera fracción de alto peso molecular que contiene el factor de
Willebrand y a continuación una fracción que contiene la
fibronectina que puede condicionarse y liofilizarse
directamente.
Claims (13)
1. Procedimiento para la separación de las
proteínas F VIII, fibronógeno y factor de Willebrand del plasma
humano o animal y para la preparación de concentrados de las citadas
proteínas de uso terapéutico, caracterizado porque comprende
las etapas siguientes:
- -
- se utiliza como materia de partida la fracción del plasma crioprecipitada, constituida esencialmente por fibrinógeno, fibronectina, factor de Willebrand y factor VIII;
- -
- se somete dicho crioprecipitado, puesto nuevamente en solución acuosa, a una separación única por cromatografía sobre una resina intercambiadora de aniones, cuya matriz es un gel de tipo polímero vinílico macrorreticulado, capaz por sus propiedades de porosidad y de hidrofobicidad, de retener el complejo factor VIII-factor de Willebrand;
- -
- y se recuperan selectivamente las diferentes proteínas por aumentos sucesivos de la fuerza iónica del tampón de elución.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el gel de tipo polímero vinílico es
Fractogel^{M}-TSK.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2,
caracterizado porque el concentrado intercambiador de aniones
de la resina se aporta por agrupamientos de tipo DEAE injertado
sobre la matriz.
4. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la fracción de
partida contiene factor VIII, que puede presentar una actividad
específica mayor o igual que 0,1 UI/mg de proteína.
5. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la fracción de
partida ha sufrido un tratamiento de prepurificación que
comprende:
- -
- un tratamiento con hidróxido de aluminio,
- -
- una refrigeración a 14-16ºC,
- -
- un centrifugado y la recuperación del sobrenadante.
6. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la cromatografía
se efectúa con un tampón que contiene lisina y glicocola y cuya
fuerza iónica se aumenta por medio de cloruro de sodio a
concentraciones crecientes.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque el tampón contiene de 2 a 4 g/l de
lisina y de 8 a 11 g/l de glicocola.
8. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la concentración
en cloruro de sodio del tampón:
- -
- es de 0,11 M para el equilibrado de la columna y la carga de la muestra, lo que permite la adsorción de la fibronectina, del factor de Willebrand y del factor VIII y deja pasar el fibrinógeno al filtrado;
- -
- se aumenta hasta 0,15 M para eluir la fibronectina y la mayor parte del factor de Willebrand;
- -
- se aumenta hasta 0,25 M para eluir el factor VIII.
9. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se efectúa un
tratamiento de inactivación viral en presencia de agentes químicos
de inactivación sobre la fracción de plasma justamente antes de
someterla a la etapa de separación cromatográfica.
10. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque comprende la
recuperación del filtrado de la cromatografía y su paso sobre una
cromatografía sobre resina de heparina-sefarosa para
recuperar un concentrado de fibrinógeno.
11. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque comprende la
recuperación del primer eluato y la cromatografía y su paso sobre
una segunda columna idéntica a la primera, con el mismo tampón
ajustado a 0,15 M en cloruro de sodio, para recuperar un concentrado
de factor de Willebrand.
12. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque comprende la
recuperación del primer eluato de la cromatografía y su paso sobre
una cromatografía de tamizado molecular, para recuperar un
concentrado de fibronectina.
13. Concentrado de factor VIII susceptible de
obtenerse por el procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque presenta una
actividad específica al menos igual a 100 UI/mg de proteínas y
porque es de calidad asimilable a la de un concentrado isogrupo.
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