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EP3233923A1 - Utilisation de pll pour améliorer la stabilité de molécules en solution - Google Patents

Utilisation de pll pour améliorer la stabilité de molécules en solution

Info

Publication number
EP3233923A1
EP3233923A1 EP15828349.9A EP15828349A EP3233923A1 EP 3233923 A1 EP3233923 A1 EP 3233923A1 EP 15828349 A EP15828349 A EP 15828349A EP 3233923 A1 EP3233923 A1 EP 3233923A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
molecule
pll
solution
conjugate
daltons
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP15828349.9A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Michel Geffard
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hydro-Fill Technology
Original Assignee
Hydro-Fill
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hydro-Fill filed Critical Hydro-Fill
Publication of EP3233923A1 publication Critical patent/EP3233923A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a particular molecular complex comprising a conjugate based on polylysine (PLL) and an unstable molecule in solution. It also relates to a composition comprising such a complex, a method of obtaining and its use. The invention also relates to the use of one or more PLL-based conjugates to improve the hydrophilicity and the effectiveness / activity of an unstable molecule in solution over a period of time compatible with the use of said molecule.
  • PLL polylysine
  • the present invention also relates to a method for identifying a conjugate or a combination of several PLL-based conjugates for improving the hydrophilicity and the efficacy / activity of an unstable molecule in solution as well as a kit for its implementation.
  • This instability has important repercussions, in particular for the industrialist having invested resources in a research and development program leading to this unusable molecule, but also for those deprived of its beneficial effects.
  • the technical solutions that are currently known to overcome this phenomenon of instability are often very expensive, require a considerable development time and are also poorly suited to therapeutic, cosmetic, nutritional or diagnostic use of the molecule.
  • unstable solutions of molecules for pharmaceutical purposes are generally stored at temperatures around -80 ° C. They must be warmed and administered to a patient under treatment. This also has a major drawback related to energy expenditure necessary to maintain a stabilization temperature of -80 ° C, a logistical problem related to the necessary synchronization between the steps of heating the solution taking care to avoid precipitation of the molecule, therefore the uncertainty as to the actual amount of active molecule administered, and the route of administration for pharmaceuticals.
  • Microencapsulation is a process by which a product, solid, liquid or pasty, is incorporated into microparticles.
  • the microparticles are used to deposit a quantity of drug that is slowly released into the body.
  • This system although effective in some cases to stabilize and release a molecule of interest in-vivo, is unable to stabilize it in liquid solution ex-vivo if it is unstable in solution.
  • the polymers generally used for the formation of these microcapsules are derivatives of lactic and glycolic acids (PLGA, PLA), ethylcellulose, or poly-epsilon-caprolactone which are biodegradable and likely to leave "traces pollutants' for the recipient and the environment.
  • Nanoparticles are used in biomedical research and medicine. Nanoparticles are ultrafine particles of which one of the three dimensions is less than 100 nm. This technology, in addition to its generally prohibitive cost, has a number of limitations and disadvantages. Indeed, the synthesis of these products must be perfectly reproducible, their physico-chemical properties must be studied in depth and with great precision, the surface of the nanoparticles must usually be covered with molecules or polymers to increase their colloidal stability and biocompatibility. Finally, the mechanisms of nanoparticle degradation must also be studied in detail, and the risks of cellular, physiological and histological toxicity must be seriously evaluated.
  • nanotechnology therefore involves significant physical risks that can be both environmental risks and health risks for the people who use them but also people who handle the nanoparticles during their production.
  • Other disadvantages are related to the fact that exposure to nanoparticles must be reduced and / or controlled by traceability which must allow at any time to know where are the nanoparticles, in which product, in which packaging.
  • a macromolecule of interest formulated with any one of the methods of the state of the art is stable in liquid solution ex vivo only for a very short time, from a few seconds to a few minutes, or even a few hours. .
  • the present invention provides a non-covalent molecular complex comprising at least one conjugate, preferably a monofunctional conjugate, of a PLL.
  • a conjugate preferably a monofunctional conjugate
  • the use of such a conjugate with an unstable molecule in solution makes it possible to improve the solubility of the molecule, its stability and to prolong and / or maintain the activity of the molecule in solution.
  • the PLL conjugates are known in particular for their use in the pharmaceutical field.
  • the international patent application WO96 / 15810 in particular discloses the use of these conjugates for the preparation of pharmaceutical compositions useful in the treatment of neuronal degeneration, autoimmunity, malignant cell proliferation. Nevertheless, these conjugates have never been used to form molecular complexes via non-covalent bonds with unstable molecules in solution to improve their stability in solution and prolong or maintain their activity.
  • At least one PLL conjugate comprising:
  • ⁇ at least one molecule F having a molecular weight of 50 Daltons and 1000 Daltons, covalently bonded to said main chain,
  • the invention also relates to a process for obtaining such a complex, compositions containing it and its use.
  • the invention also relates to the use of at least one PLL conjugate, comprising:
  • ⁇ at least one molecule F having a molecular weight of 50 Daltons and 1000 Daltons, covalently bonded to said main chain,
  • the invention also relates to a kit for implementing this use.
  • the invention also relates to a method for identifying at least one PLL conjugate capable of binding non-covalently to a given unstable M molecule in solution, as well as a kit for the implementation of this method. process.
  • the invention makes it possible to stabilize in solution a molecule M in the form of a molecular complex.
  • the invention makes it possible to give a second "life" to many unstable molecules in solution, in particular macromolecules, in particular macromolecules of therapeutic interest, neglected or not used at their true value, by combining said molecule with one or more PLL-based conjugate (s) selected according to the molecule studied.
  • PLL-based conjugate selected according to the molecule studied.
  • the complexes of the invention thus formed and stable ex-vivo, can also be directly used invivo in therapeutic, cosmetic, nutritional, surgical or diagnostic applications, and in particular to be administered to a patient, without there are no particular problems related to toxicity.
  • the complexes of the invention may also act as therapeutic vectors, protecting in vivo the molecule M complexed against attacks, in particular, enzymatic and immune metabolic systems of the human or animal body.
  • FIG. 1A represents the IRFT spectrum obtained for the cysteine-G-PLL conjugate according to the invention; in this figure we can observe the PLL identified by the area 1700-1550 cm 1 and the cysteine represented by the peaks around 1300 and 700 cm 4 ,
  • FIG. 1B represents the IRFT spectrum obtained for the methionine-G-PLL conjugate according to the invention; in this figure one can observe the PLL identified by the region 1700-1550 cm "1 and methionine represented by the peaks at 1300, 900 and 700 cm,
  • FIG. 1C represents the obtained IRFT spectrum for the glutathione-G-PLL conjugate according to the invention; in this figure we can observe the PLL identified by the 1700-1550 cm-1 zone and the glutathione represented by the peaks at 1300 and 1200 cm,
  • FIG. 1D represents the IRFT spectrum obtained for the taurine-G-PLL conjugate according to the invention; in this figure we can observe the PLL identified by the 1700-1550 cm 1 zone and the taurine represented by the peaks at 1300, 1000 and 700 cm 1 ,
  • FIG. 1E represents the IRFT spectrum obtained for the orotyl-PLL conjugate according to the invention.
  • the PLL identified by the area 1700-1550 cm 1 and the orotyl represented by the peaks around 1300 and 800 cm 4 ,
  • FIG. 2 represents the protein structure of factor VIII by in silico study
  • FIG. 3 represents the protein structure of hemoglobin by in silico study
  • FIG. 4 shows the protein structure of albumin by in silico study.
  • complex or “molecular complex” means an entity formed by contacting an unstable M molecule in solution with one or more conjugates of a bound PLL. (s) by non-covalent bond.
  • PLL conjugate means a molecule derived from a covalent coupling on a PLL of one or more F molecules.
  • PLL monofunctional conjugate is meant the coupling product of a molecule F to PLL.
  • polyfunctional PLL conjugate is meant the coupling product of at least two F molecules.
  • a bifunctional conjugate may be represented by the formula: Fl molecule - PLL - F2 molecule.
  • F molecule means a substituent or a non-immunogenic molecule.
  • substituted is meant a molecule of low molecular weight generally between about 50 Daltons and about 1000 Daltons, preferably between about 200 Daltons and about 600 Daltons, and more preferably between about 150 Daltons and about 500 Daltons, be covalently bonded or covalently bonded to a PLL in the epsilon ( ⁇ ) -amino position of the carbon chain.
  • immunogenic is meant any molecule capable of inducing an immune reaction.
  • a “non-immunogenic” molecule is therefore a molecule that does not induce an immune reaction.
  • PLL polypeptide or homopolymer consisting mainly of linear L or D-Lysine (that is to say unbranched by another or other lysines) or mainly linear L-lysine. It answers the formula: H ⁇ NHCHCO- OH
  • the term "unstable M molecule in solution” means an unstable molecule in solution, preferably a macromolecule. It can be in particular a protein, a lipid, a sugar, a nucleic acid or any other large biomolecule; By “unstable in solution” is meant a molecule exhibiting a decrease or a loss of activity when it is dissolved in a solvent, in particular in an aqueous solvent. It may be hydrophobic or slightly hydrophilic molecules, or hydrophilic molecules but whose activity is reduced in solution.
  • non-covalent bond means any bond which is not covalent, in particular a bond of ionic, hydrogen or van der Waals type.
  • pharmaceutical or biological activity is understood to mean the observed consequence that the absorption of a molecule or substance by an organism as obtained by an analysis method allowing the detection of such activity. This can be evaluated, for example, by observing and evaluating the selective occupancy of a receptor or the specific interaction with an enzyme or protein (e.g., antigen-antibody interaction) of the molecule or substance of interest.
  • the reduction or loss of the pharmacological activity of a substance or macromolecule of interest in liquid solution is an indication of the instability of said substance in liquid solution.
  • the term "initial biological activity” or “initial pharmacological activity” means the biological or pharmaceutical activity of a complex according to the invention as measured for the first time after its dissolution.
  • the time elapsed between the dissolution of the complex and the first measurement of activity can be variable and subject to the influence of various parameters, including the speed of execution of the measurement whether it is automated or manual.
  • original biological activity or “original pharmacological activity” means the biological or pharmacological activity of a molecule before it comes into contact (ie its complexation) with one or more conjugates as defined in the present application.
  • “Variation in pharmacological or biological activity” means the absolute value of the difference between the observed and measured value of the initial activity and the observed and measured value of the activity at a time “t” after the in solution of the macromolecule.
  • "Maintenance of pharmacological or biological activity” is understood to mean a variation of the pharmacological or biological activity as defined above by at most 30%, preferably at most 20%, preferably from plus 10%, more preferably not more than 5% or even more than 1%.
  • aqueous solvent means a solvent mainly or essentially aqueous, that is to say containing at least about 70% of water, preferably at least about 80% of water and water. more preferably at least about 90% water or at least about 95% water.
  • liquid phase solution or “solution in the liquid state” means a solution that has not reached its freezing point.
  • an aqueous or predominantly aqueous solution stored at a temperature below about 0 ° C, preferably below about -5 ° C, can not be considered to be in the liquid phase.
  • the invention therefore relates to a molecular complex comprising:
  • At least one PLL conjugate comprising:
  • ⁇ at least one molecule F having an average molecular weight of 50 Daltons and 1000 Daltons, covalently bonded to said main chain, and
  • conjugate (s) and the molecule (s) M being linked by non-covalent bond, that is to say interacting by non-covalent bonding.
  • the PLL conjugate can be monofunctional or polyfunctional.
  • the same complex if it contains several PLL conjugates, may contain only monofunctional conjugates, only polyfunctional conjugates or a mixture of monofunctional (s) and polyfunctional (s) conjugate (s).
  • the PLL conjugate is monofunctional.
  • the PLL conjugate may consist exclusively of a linear main chain of PLL and at least one molecule F having an average molecular weight of between 50 Daltons and 1000 Daltons, covalently bound to said main chain.
  • the PLL chain has a mean molecular weight preferably between 2000 and 300000 Daltons, which means that its degree of polymerization (ie the value of the index n of the formula given in the definition part) is between about And about 2360 or 127 lysyl residues.
  • the PLL chain present in the molecular complex according to the invention has an average molecular weight which is generally between 2,000 and 300,000 Daltons, which means that its degree of polymerization is between about And about 2360, preferably between 20,000 and 50,000 Daltons which means a degree of polymerization of 155 and 394 is between 155 and 374 lysines.
  • the PLL chain comprises between 30 and 150 lysines corresponding to an average molecular weight of between 3800 and 19100 Daltons, more preferably between 50 and 100 lysines corresponding to an average molecular weight for the PLL chain of between 6400 and 13000 Daltons. .
  • the main linear PLL chain of the conjugate is preferably an alpha linear chain.
  • the molecule F preferably has a molecular weight of between 100 Daltons and 1000 Daltons, still more preferably between 200 Daltons and 1000 Daltons, in particular between 300 Daltons and 1000 Daltons, more particularly between 400 Daltons and 1000 Daltons, and preferably between 500 Daltons and 1000 Daltons. Daltons and 1000 Daltons.
  • the F molecules are substituents or non-immunogenic molecules. Molecules as described in PCT patent application WO96 / 15810 may in particular be used for the present invention.
  • the F molecules are preferably chosen from one of the following three categories:
  • the molecules with a "fatty acid or lipid” character which comprise:
  • saturated or unsaturated (di) fatty acid with a linear or branched chain, generally comprising from 4 to 24 carbon atoms;
  • Antioxidant molecules which include:
  • cysteine and its derivatives of formula: R1S-R2-CH (NH2) -C00H wherein R1 represents H or CH3 and R2 represents a C1-C3 alkylene.
  • amino acid or neurotransmitter which include:
  • R 3 represents hydrogen, an imidazol-2-ylmethyl group, a carboxymethyl group or an aminopropyl group;
  • A represents a (C 1 -C 6) alkylene or a - (CH 2) m -NH-B- (CH 2) p- group in which m and p, independently one on the other, are integers from 1 to 5, and B represents nothing or - (CH2) n -NH-, n being an integer from 1 to 5;
  • conjugates Three types of conjugates (whether monofunctional or polyfunctional) are distinguished: the "fatty acid or lipidic”conjugates; the “anti-oxidant”conjugates; and “amino acid or neurotransmitter” conjugates.
  • the (di) fatty acid comprises from 4 to 24 carbon atoms, for example butyric, maleic, succinic, glutaric, adipic, pimelic, suberic, sebasic, caproic, caprylic, capric, lauric, myristic, palmitic acid.
  • the acid is selected from myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid or (di) acid, azelaic acid, for example.
  • the isoprenoids bound to a cysteine generally comprise from 6 to 20 carbon atoms.
  • a cysteine generally comprise from 6 to 20 carbon atoms.
  • Farnesyl-cysteine, geranyl-geranyl-cysteine or mevalonate-cysteine are used in the context of the invention.
  • hydrophobic hormone progesterone or 2-methoxyoestradiol is preferably used.
  • the indolealkyleamines and catecholamines used in the context of the invention comprise, in particular, tryptophan, 5-methoxytryptophan, serotonin, tryptamine, 5-methoxytryptaminc, melatonin, phenylalanine, 3,4-dihydroxyphenylalanine and tyrosine.
  • amino acids histidine, glycine and aspartate are preferably used.
  • the amino (C 1 -C 5) alkylsulfonic or sulfinic acids used according to the invention include, in particular, taurine, homotaurine and hypotaurine.
  • the diamines preferably used in the context of the invention are putrescine, cadaverine, spermine and spermidine.
  • PLL conjugates which may be used for the implementation of the invention include oleic acid-PLL, azelaic acid-PLL and 5-methoxytryptamine-PLL.
  • cysteine-PLL a cysteine-PLL, a methionine-PLL, a taurine-PLL, a glutathione-PLL or an acidethiotic-PLL
  • the molecule (s) F (s) covalently bound to the main PLL chain is (are) chosen from cysteine, methionine, thorine, glutathione and thiotic acid.
  • the molecular weight ratio and the peak area between the F molecule (s) and the main chain (determined by FTIR) is between about 10 and about 20.
  • the molecule M is preferably a macromolecule, that is to say a molecule having a molecular weight preferably greater than 1000, preferably 2000 Daltons, even more preferably greater than 5000 Daltons and in particular greater than 10000 Daltons.
  • the molecules M may be organic and / or mineral and may be of natural and / or synthetic origin. Preferentially it is organic molecules.
  • the M molecules are molecules useful in biological systems, preferably useful in the therapeutic, cosmetic, nutritional and / or diagnostic fields.
  • the M molecule or molecules are therefore very preferably molecules having a pharmacological and / or nutritional and / or cosmetic activity and / or is a diagnostic reagent.
  • proteins such as, for example, lipoproteins, mucoproteins, nucleoproteins, nucleic acids (such as DNA, RNA, RNA). interfering, tRNA, cRNAcyst etc.) and metal proteins (example: metalloproteins).
  • oligosaccharides saccharides composed of 2 to 10 base units of monosaccharides
  • polysaccharides examples include collagen, cellulose, starch, Factor VIII, and immunoglobulins.
  • M molecules of the protein type mention may be made especially of the structural proteins that enable the cell to maintain its organization in space; the transport proteins that transfer different molecules into and out of the cells; regulatory proteins that modulate the activity of other proteins or that control gene expression; signaling proteins that capture external signals and transmit them to the cell or organism such as, for example, hormonal proteins; receptor proteins that detect the messenger molecules and other signals for the cell to act accordingly such as, for example, sensory proteins and hormone receptors such as insulin; motor proteins that allow cells or organisms or certain elements to move or deform such as actin and myosin; defense proteins that protect the cell against viruses such as, for example, antibodies; storage proteins that allow the setting in reserve of amino acids to be able to create other proteins such as, for example, ovalbumin and enzymes.
  • protein M molecules which can be used in the invention are immunoglobulins, coagulation proteins, VI II and IX factors, albumin, etc.
  • Lipid-type M molecules include saturated and unsaturated fatty acids, glycerides, (mono, di and tri) and phospholipids.
  • lipid-type M molecules that can be used in the invention are lipoproteins, for example lipoprotein A.
  • the molecule M is a protein.
  • the molecule (s) M and the PLL conjugate (s) are non-covalently bound by at least one non-covalent bond.
  • An M molecule and a PLL conjugate can be linked by one or more non-covalent bonds.
  • the ratio between the molecular concentration of the conjugate (s) and that of the molecule (s) M is between 1 and 30.
  • the invention also relates to a composition
  • a composition comprising one or more molecular complex (s) according to the invention in solution in a hydrophilic solvent, preferably chosen from water, a phosphate buffer, physiological saline or a mixture thereof.
  • hydrophilic solvents useful for implementing the invention may be varied insofar as they allow the dissolution of the molecule (s) M and the selected conjugate (s).
  • composition may comprise, in addition to the molecular complex (s) according to the invention and the hydrophilic solvent, at least one other compound. It may be for example another pharmaceutically compatible compound selected from an excipient, a surfactant, a vehicle, etc.
  • Coupling methods between the F molecules and the PLL for obtaining the PLL conjugates according to the invention are the conventional chemical coupling methods well known to those skilled in the art, between a functional group of each molecule and the functional group. ⁇ -amine of the PLL. These couplings are carried out via a coupling agent, chosen for example from glutaraldehyde, succinic or glutaric anhydride, carbodiimides, ethyl chloroformate or hexamethylene diisocyanate. Examples of such coupling methods include those described in Geffard et al., CR Acad. Sci. Paris: 295, 797-802, (1982). The molecules can also be associated with the PLL by simple adsorption. Examples of suitable coupling methods are described in detail in the following preparations.
  • the coupling between said molecules and the PLL can be carried out between the ⁇ -amine function of the PLL and a carboxylic function of said molecules or other activatable chemical functions.
  • the binding with the PLL is carried out between an amine function of the latter and the carboxylic function of the aforementioned molecules.
  • the binding with PLL is advantageously between an amino function of the latter and the acid function of these molecules.
  • the cysteine and its derivatives may be activated beforehand by coupling with succinic or glutaric anhydride, the bond then being between the ⁇ -amine function of the PLL and the free acid function of the succinylated or glutarylated molecule.
  • the cysteine and its derivatives may be bound to PLL by reaction with glutaraldehyde, the reaction being carried out in particular as described by Geffard et al., Brain Res. : 294, 161-165, (1984).
  • the coupling with PLL is advantageously carried out via the hydroxyl group of cholesterol.
  • the cholesterol and its derivatives are adsorbed on the PLL.
  • the coupling with PLL is advantageously carried out by hexamethylene diisocyanate.
  • vitamin A retinoic acid
  • vitamin C ascorbic acid
  • vitamin E [alpha] -tocopherol
  • the bond between this molecule and the PLL is between the amino function of the latter and the free acid function of the acid succinate of the molecule.
  • aminoalkylsulphonic or sulfinic acids in particular taurine, homotaurine and hypotaurine
  • the bond between these molecules and the PLL is effected by prior activation of the molecules with an acid anhydride (succinic or glutaric acid), or well by coupling with glutaraldehyde.
  • indolealkylamine compounds especially tryptophan, and catecholamines
  • these molecules can be bonded to PLL either directly or by coupling with carbodiimide, glutaraldehyde, an acid anhydride or an acid chloride, for example ethyl chloroformate.
  • the bond between these molecules and the PLL can be made by coupling with glutaraldehyde or an acid anhydride.
  • the binding between carnitine or canosine on the one hand, and PLL on the other, is carried out by coupling with carbodiimide.
  • the molecular complex according to the invention can be obtained by a process comprising the following steps:
  • the step of providing the conjugate (s) preferably comprises providing a solution comprising the conjugate (s) in a hydrophilic solvent.
  • the contacting step is carried out at a temperature between about 4 ° C and 25 ° C and in a buffered solution.
  • the step of providing the molecule (s) M preferably comprises providing a solution comprising the molecule (s) M in a hydrophilic solvent.
  • the contact time of the (or) conjugate (s) with the molecule (s) M is between 1 hour and 24 hours.
  • the molecular complexes or the compositions containing it can be used for various applications, particularly related to the nature and the effectiveness of the M molecules.
  • the molecular complex according to the invention can be used as a drug.
  • the molecular complex is administered within a composition, in particular a composition according to the invention.
  • the molecular complex according to the invention is preferably administered intravenously, intramuscular subcutaneous or oral, nasal spray, oral or auricular or cutaneous and ophthalmic solution.
  • the complexes of the invention retain or improve the original pharmacological activity of the M molecule.
  • the presence of PLL-based conjugates therefore does not affect this ex-vivo (or in-vitro) activity. It has also been shown that their presence is not detrimental to the action of the M molecule in vivo (i.e. after administration to a patient). Moreover, and against all odds, the presence of the conjugates also has a beneficial effect on the pharmacological activity of the molecule M by improving its bioavailability.
  • the complexes according to the invention can also be used to improve the taste or texture of foods, to reduce the lipid content, or to encapsulate the nutrients, for example the vitamins of the foods, so that they do not become not degrade during the shelf life. In addition, they can be used to make packaging to keep food longer.
  • the invention also relates to the use of at least one PLL conjugate, comprising: ⁇ a linear main chain of PLL, and
  • ⁇ at least one molecule F having an average molecular weight of 50 Daltons and 1000 Daltons, covalently bonded to said main chain, and
  • hydrophilic solution for:
  • the maintenance of the pharmacological activity of the molecule M in solution preferably corresponds to a variation of the pharmacological activity of at least 5% relative to the initial pharmacological activity at a given temperature. at least 1 ° C for 1 hour.
  • the invention is also a variant of the use of at least one PLL conjugate, comprising:
  • ⁇ at least one molecule F having an average molecular weight of 50 Daltons and 1000 Daltons, covalently bonded to said main chain, and
  • the invention also relates to a kit for the implementation of these uses.
  • This kit comprises at least one hydrophilic solution comprising at least one PLL conjugate comprising:
  • the invention is also directed to a method for identifying at least one PLL conjugate capable of binding non-covalently to an M molecule having unstable pharmacological activity in solution, and to maintain the pharmacological activity of said M molecule in a hydrophilic solution, said process comprising:
  • the molecular weight of the M molecule is preferably greater than 1000 Daltons.
  • the comparison step c) is carried out between the initial pharmacological activity of the M molecule and the pharmacological activity of the molecular complex (s) measured several times at time intervals determined from the formation of the complex (s), at least every 24 hours.
  • step d) of identifying the complex (s) further comprises: comparing the evolution of the pharmacological activity of each tested molecular complex as a function of time;
  • the identification method according to the invention therefore preferably comprises at least three steps:
  • An in-silico analysis such as that described above is optional but advantageous in most cases because it allows the number of possible conjugates to be limited relatively quickly to the formation of soluble complexes and thus to simplify further the analysis of 'identification.
  • solubility of the macromolecule in the presence of the conjugate (s) or mixtures thereof is studied in liquid solution.
  • the methods used to determine such solubility are standard and known to those skilled in the art. Nevertheless, an analysis by measurement of the optical density or any method of pharmacopoeia known to those skilled in the art can be cited.
  • the preferred solvents for carrying out the process according to the invention are the physiologically compatible solvents, preferably hydrophilic, more preferably aqueous, such as distilled water, phosphate buffers and physiological saline.
  • Other solvents such as C 1 -C 3 alcohols or dimethylsulfoxide (DMSO) may be present and the total amount of which generally does not exceed 10% by volume relative to the total volume of the complex solution.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the insolubility of a molecule in solution is visible quickly to the naked eye, in a period of the order of seconds to minutes in some cases. Consequently, a simple visual study of the samples of the various complexes in solution could be sufficient to determine the solution or solutions of complexes that may be suitable for the second step of temporal analysis of activity.
  • optical density analyzes make it possible to obtain a more precise measurement of this phenomenon.
  • the original activity of the soluble complexes is first checked then the activity is then measured at different time intervals from the formation of said complex or complexes, preferably every hour, preferably every 24 hours. then every 3-4 days.
  • the measurement of the pharmacological activity can be made from any appropriate method of analysis without any limitation. These methods of analysis are well known to those skilled in the art and their use depends essentially on the nature of the macromolecule for therapeutic purposes of interest. As for example, when the macromolecule is an antibody, any method can be used to evaluate its affinity with its antigen and its analogs such as enzymatic immunoassays. When the macromolecule is a DNA or RNA sequence for example, one can use the MALDI-TDF spectrometry method, electrophoresis or high performance liquid chromatography (HPLC).
  • MALDI-TDF spectrometry method electrophoresis or high performance liquid chromatography (HPLC).
  • the molecule M has no particular therapeutic aim such as, for example, natural or synthetic polymers, resins, and other polymeric additives, it is of course no longer possible to speak of pharmacological or biological activity, but the process as described previously will be implemented by replacing the pharmacological activity by the characteristic (s) or property (s) of the molecule M. All that is described in the present application with reference to the pharmacological activity of a macromolecule for therapeutic purposes also applies with reference to the characteristics or properties of a molecule M of non-therapeutic interest.
  • the invention relates to a kit for determining a conjugate or a combination of several conjugates allowing the maintenance of the pharmacological activity of one or more macromolecules (s) in solution, preferably in phase liquid, comprising at least two identical or different monofunctional or polyfunctional conjugates or at least two identical or different monofunctional or polyfunctional conjugate mixtures, and wherein each of said conjugates comprises an alpha linear PLL-like main chain and one or more molecules each having a molecular weight of at least 50 Daltons and not more than 1000 Daltons covalently bound to said main chain.
  • the kit according to the invention may comprise at least two conjugates or mixtures of PLL conjugates as defined above, preferably between two and ten.
  • the kit according to the invention comprises PLL conjugates or conjugate mixtures packaged in separate containers.
  • the containers that can be used are, for example, vials or single-use doses.
  • the kit makes it possible to make a rapid screening by the laboratory for the choice of PLL-Fl and PLL-F2 compounds which corresponds best to the search for stability. Stability and efficacy measurement will complete the analysis and will validate whether or not the macro molecule is "treatable" with a PLL-F compound and orient the compounds that will be grafted by non-covalent bonds.
  • the "in silico" analysis is an analysis performed entirely using a computer and the Pymol software. It makes it possible to determine and select the particular PLL conjugates that can interact with a given molecule M as a function of the distribution of the polar amino acids and therefore as a function of the charges of the molecule M.
  • the sources used are:
  • Isotype immunoglobulin G Saphire EO et al. Crystal structure of a neutralizing human IGG
  • Coagulation factor VII I Ngo JC et al. Crystal structure of human factor VI II: implications for the formation of the factor IXa-factor Vi lla complex. Structure. 2008 - Coagulation Factor IX: Wang, S. et al. Studies of benzothiophene as potent factor IXa (FIXa) inhibitors in thrombosis. J. Med. 2010
  • Hemoglobin Safo, M. K. et al. The enigma of the liganded hemoglobin end state: a novel quaternary structure of human carbonmonoxy hemoglobin. Biochemistry 2005. Albumin: Bhattacharya, A.A. et al. Binding of the genome anesthetics propofol and halothane to human albumin serum. High resolution crystal structures. 2000)
  • sedimentation is the separation of proteins in solution that have the capacity to sediment in a high centrifugal field.
  • Centrifugation is a process of separating the compounds of a mixture according to their difference in density by subjecting them to centrifugal force.
  • the apparatus used is a high speed rotating machine called a centrifuge.
  • the ratio of the centrifugal force Fc to the weight Fp is called the intensity of artificial gravity and is expressed in "G" 3.
  • the values used in centrifugation are about 400 to 10,000 G, which corresponds to rotational speeds of about 2,000 to 10,000 rpm depending on the radius of the rotors.
  • Some applications such as the separation of biological macromolecules (proteins, nucleic acids), require the ultracentrifugation method developed by Svedberg which uses very high artificial gravity intensities of the order of 200 000 G, and which therefore requires rotational speeds of several tens of thousands of revolutions per minute.
  • Absorbance or optical density measures the ability of a medium to absorb light passing through it.
  • the absorbance differs according to the nature of the substance studied, according to the wavelength under which it is analyzed, and according to the concentration of this substance in the medium through which it passes.
  • This medium can be solid, liquid or gaseous, as long as it is transparent. It is measured by a spectrophotometer.
  • the Beer-Lambert law establishes a proportionality between the concentration of a chemical entity in solution (or the partial pressure of this entity in the gas phase), the absorbance of this entity and the length of the path traveled by the light in the solution.
  • the concentration is expressed in mol.L 1 or in mol. m 3 .
  • ELISA is a biochemical technique using one or two antibodies. One of these is antigen specific, while the other reacts with immune complexes (antigen-antibody) and is coupled to an enzyme. This secondary antibody can also cause the emission of a signal by a chromogenic substrate or fluorophore.
  • Control wells are made with the carrier protein modified by the coupling agent at the same concentration.
  • the plates are placed for 16 hours at 4 ° C. with stirring.
  • the plates are emptied and then filled with 200 ⁇ l of buffer "PBS-Tw bovine serum albumin (BSA) 2.5 g / l". The plates are incubated for 1 hour at 37 ° C.
  • BSA bovine serum albumin
  • the plates are emptied and washed 3 times with PBS-Tw.
  • the antibodies are diluted in different buffers:
  • control buffer the same as the saturation buffer
  • the "tests" buffer it is saturation buffer containing a PLL-F compound.
  • the antibodies thus diluted are deposited on the plate at a rate of 200 ⁇ l per well.
  • This test includes a dilution study of the antibody (1: 2500 to 1: 80000) and an affinity study (dilution of the antigen from 1.10 6 to 1.10 12 M).
  • the antibody dilution study makes it possible to determine the antibody concentration and thus to determine the antibody dilution to be used for the affinity and specificity study.
  • the wells receive 200 ⁇ l of buffer "PBS-Tw, BSA 2.5 g / l" containing immunoglobulins directed against the IgG of the host species labeled with peroxidase and diluted to 1/10 000.
  • the plates are incubated for 1 hour. at 37 ° C.
  • the plates are emptied and washed 3 times with PBS-Tw.
  • the wells receive 200 ⁇ l of revealing buffer (50 mM citrate, 100 mM phosphate, 0.03% H 2 O 2, pH 5) supplemented with 0.2% ortho-phenylene diamine.
  • the stain is allowed to develop in the dark for 10 minutes and the reaction is stopped using 50 ⁇ l of 2N HCl per well.
  • the optical density is then read at 492 nm.
  • nucleic acids DNA or RNA
  • proteins are transferred from a liquid medium directly onto a membrane without prior separation.
  • the transfer can be carried out by simple diffusion, by diffusion in an electric field (electrodiffusion) or by suction under vacuum.
  • Detection is similar to those used in separation transfers: for example, nucleotide sequences for DNA or RNA or antibodies for proteins.
  • a mouse monoclonal antibody (MAb) was taken as a model: anti-HDehydroThromboxane B2 (11DHTB2-BSA), clone 2E1-B4 (IgG1, K) (cell supernatant).
  • the corresponding antigenic compound anti-11DehydroThromboxane B2-BSA.
  • TBS Tri-NaCl buffer
  • the system is evacuated at room temperature for lh.
  • the membrane is then washed once with 1x TBS.
  • control buffer the same as the saturation buffer
  • the "tests" buffer it is saturation buffer containing a PLL-F compound.
  • three solutions i.e. three different concentrations (10 4 M, 10 5 M and 10 6 M) were tested by PLL-F compound.
  • the PLL-Fs tested are as follows:
  • the strips are washed 3 times with TBSIX-TW 0.005%.
  • the strips are immersed in TBS1XTW (0.005%) -BSA buffer (0.1%) containing immunoglobulins directed against peroxidase-labeled host species IgG and diluted 1/5000 for 1h at room temperature with shaking. .
  • the strips washed 3 times with TBSIX-TW 0.005% and a final wash with TBSIX to remove the foam.
  • the strips are immersed in revealing buffer. Staining develops in the dark for 10 minutes and the reaction is stopped using 50 ⁇ l of 2N HCl per band. The intensity of the spots is estimated by the experimenter.
  • the method used is the cell count method of Malassez and trypan blue. Trypan blue is a negatively charged chromophore (blue color) that does not interact with the membrane if it is intact. It will only stain the damaged cells, to determine the viability of a sample. The samples are diluted and mixed with trypan blue. Once placed on a conventional counting cell (Malassez cell), the number of total cells is determined then the cells appearing blue (cells with damaged membrane) are in turn enumerated. Biomass is determined from the total number of cells while viability is determined from this formula:
  • a Malassez cell is a special gridded blade that allows the counting of different types of cells.
  • the total volume of the cell is 1 mm3 (100x2.5 x 0.2 x 0.20).
  • the grid thus consists of 10 vertical bands (0.25 mm) and 10 horizontal bands (0.20 mm) thus forming 100 rectangles,
  • Cells are counted only in 10 non-contiguous rectangles taken at random from the cell.
  • the average number of cells per rectangle is calculated (total cells observed in 10 rectangles divided by the number of rectangles counted). The number obtained is multiplied by 100 to obtain the number of cellular entities per mm 3 .
  • the Fourier Transformed Red I Spectrometer (I RTF) is a widely used analytical tool for the identification and quantification of molecules and proteins.
  • the main region of vibrational spectroscopy is the infrared medium (4000 to 400 cm 1 ) of the electromagnetic spectrum.
  • the wave number is defined by the inverse of the wavelength, expressed in centimeters.
  • Spectroscopy can be defined as the study of the interaction of an electromagnetic wave with matter.
  • This technique makes it possible to identify the chemical functional groups of any molecule via the characteristic vibrations of its chemical bonds.
  • the result obtained is an IR spectrum of the studied molecule, either in transmittance mode or in absorbance mode, where the peaks can be interpreted using frequency correlation tables of the valence vibrations.
  • the analyzes carried out on the Poly-L-lysine conjugates make it possible to check the grafting of the small molecules on the PLL (shift on the peaks of the amide of the PLL) and to determine the peaks specific to the small grafted molecules. A change in the spectral pattern of a PLL-F and M-molecule mixture is observed, compared with the original spectra of the PLL-F and M-molecule conjugate.
  • the molecular weight molecules of at least 50 Daltons and at most 1000 Daltons covalently bound to the main chain of the PLL will be called “F molecules”.
  • the conjugates according to the invention are identified by the abbreviation: "molecule F” - "type of coupling” - PLL.
  • the "cysteine-G-PLL” conjugate corresponds to a cysteine grafted onto a PLL via a glutaraldehyde-type spacer (or linker in English terminology).
  • the "orotyl-PLL” conjugate for its part, corresponds to the orotic acid grafted onto a PLL via an acid chloride type linker.
  • F molecules In general, two types of activation concern F molecules, according to their molecular family (amino acids or others), synthesis by glutaraldehyde activation and synthesis by activation with an acid chloride.
  • Each molecule F is activated by glutaraldehyde (G), which acts as a coupling agent by activating the amino group of the small molecule.
  • G glutaraldehyde
  • the condensation reaction forms imines.
  • This intermediate compound, small molecule and coupling agent is bonded on the epsilon amino group of the lysyl residue of poly-L-lysine, forming an amide bond.
  • Unstable imines are stopped by sodium borohydride. This product is purified by dialysis in buffer solutions.
  • the F molecules activated by the ethyl chloroformate synthesis pathway and grafted onto the PLL follow the following reactions: hapten chloroformate of ethyl:
  • Each molecule F is activated by the ethyl chloroformate (ECF), which acts as a coupling agent by activating the carboxylic group of the small molecule.
  • ECF ethyl chloroformate
  • This intermediate compound, small molecule and coupling agent is bonded on the epsilon amino group of the lysyl residue of poly-L-lysine, forming an amide bond.
  • This product is purified by dialysis in buffer solutions.
  • the characterization of the conjugates according to the invention was carried out by the analytical technique of the Fourier Transform Infrared (FTIR). This spectroscopic technique makes it possible to identify the grafting and the specific peaks of the small molecule on the PLL. Although this method is generally very effective, other methods may also be used such as, for example, NMR, or light dynamization or crystallography. Examples of conjugate characterization according to the invention are reproduced in FIGS. 1A to 1E.
  • FTIR Fourier Transform Infrared
  • the conjugate (s) according to the invention synthesized in the previously described step and the macromolecule of interest with nitrogen inerting, if appropriate, are introduced according to the protocol specific for the molecule.
  • M see 4)
  • the M molecule is a mouse monoclonal antibody (mAb).
  • MAb cell supernatant: anti-UDehydroThromboxane B2 (11DHTB2-BSA), clone 2E1-B4 (IgG1, K)
  • anti-UDehydroThromboxane B2-BSA anti-UDehydroThromboxane B2-BSA.
  • the molecule M is factor VIII.
  • Factor VIII plays a central role in coagulation. This is the factor IX cofactor. Factor VIII, activated by thrombin, became the catalyst for the activation reaction of factor X by activated factor IX, in the presence of calcium ion and phospholipids. The factor X activation reaction is accelerated about 200,000 fold in the presence of factor VIII. Activated Factor X acquires catalytic activity that allows it to convert prothrombin into thrombin. This degrades fibrinogen to fibrin. The clot thus formed will be stabilized by the factor XIII, which makes it possible to stop the bleeding.
  • factor IX is one of the essential interveners of blood coagulation.
  • the protein (57-kDa vitamin K- Procoagulant dependent glycoprotein), encoded by the F9 gene, is inactive in the bloodstream.
  • foreign elements infiltrate.
  • thrombokinase which intervenes in the wake of the coagulation reactions resulting in the formation of a blood clot .
  • hemophilia B people suffer from hemophilia B.
  • the software allows to visualize in color on the 3D structure represented in FIG. 2:
  • o polar-side amino acids without acid-base function serine, asparagine, threonine, glutamine
  • the molecule M is a hemoglobulin.
  • hemoglobin The activity of hemoglobin is measured by oxygen saturation.
  • Human hemoglobin consists of four identical chains in pairs: two chains each of 141 amino acids each and two ⁇ chains of 146 amino acids each (giving a total of 574 amino acids for hemoglobin). Each of these chains is associated with a prosthetic grouping: Theme. It is symbolized by "Hb”.
  • a heme molecule consists of an iron ion complexed with a porphyrin.
  • the software allows to visualize in color on the 3D structure represented in FIG.
  • o polar-side amino acids without acid function base serine, asparagine, threonine, glutamine
  • Polar-side chain amino acids with anionic base function aspartate, glutamate.
  • o Polar side chain amino acids with cationic base acid function lysine, arginine
  • the molecule M is an albumin.
  • Albumin human serum is one of the most abundant proteins in the circulatory system. It plays a key role in the transport of fatty acids, metabolites and drugs and strongly stimulates the distribution of drugs in the body. Without a protein to distribute drugs such as antibiotics, it would be much more difficult to fight the disease; human albumin allows certain active substances to bind and be transported throughout the body.
  • the structure of human albumin represents a quaternary model. The molecular weight of the protein is 67,000, with 585 amino acids. The protein has about 67% of the alpha helix and surprisingly no slip. Its structure allows to bind to a wide variety of natural and synthetic molecules. Human albumin is involved in the maintenance of colloidal osmotic pressure. Colloidal osmotic pressure is a form of pressure that must be applied to prevent the excessive amount of water through the semipermeable membrane.
  • the protein structure of albumin is shown in Figure 4.
  • the software allows to visualize in color on the 3D structure represented in FIG. 4:
  • o polar-side amino acids without acid function base serine, asparagine, threonine, glutamine
  • the complexes according to the invention can be used in numerous therapeutic or non-therapeutic applications.
  • the haemophiliac must moisturize its freeze-dried solution, then prepare the right dose and finally inject it. With the invention the patient will just have to take the pre-filled syringe available to him and inject the right number of units. No more risk of under or over dosage, more risk of contamination during preparation and therefore total safety for the patient.

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Abstract

L'invention concerne un complexe moléculaire comprenant : o au moins un conjugué polylysine (PLL), comprenant : une chaîne principale linéaire de PLL et au moins une molécule F ayant un poids moléculaire moyen compris entre 50 Daltons et 1000 Daltons, liée de façon covalente à ladite chaîne principale, et o au moins une molécule M instable en solution, le ou les conjugué(s) et la ou les molécule(s) M étant liés par liaison non covalente. L'invention vise également une composition comprenant un tel complexe, un procédé d'obtention et son utilisation, ainsi que l'utilisation d'un ou plusieurs conjugués à base de PLL pour améliorer le caractère hydrophile et l'efficacité, l'activité d'une molécule instable en solution sur une période de temps compatible avec l'utilisation de ladite molécule. L'invention concerne aussi un procédé d'identification d'un conjugué ou d'une combinaison de plusieurs conjugués à base de PLL permettant d'améliorer le caractère hydrophile et l'efficacité, l'activité d'une molécule instable en solution, et un kit pour sa mise en œuvre.

Description

UTILISATION DE PLL POUR AMELIORER LA STABILITE DE MOLECULES EN SOLUTION
La présente invention a pour objet un complexe moléculaire particulier comprenant un conjugué à base de polylysine (PLL) et une molécule instable en solution. Elle vise également une composition comprenant un tel complexe, un procédé d'obtention et son utilisation. L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un ou plusieurs conjugués à base de PLL pour améliorer le caractère hydrophile et l'efficacité / l'activité d'une molécule instable en solution sur une période de temps compatible avec l'utilisation de ladite molécule.
La présente invention concerne également un procédé d'identification d'un conjugué ou d'une combinaison de plusieurs conjugués à base de PLL permettant d'améliorer le caractère hydrophile et l'efficacité / l'activité d'une molécule instable en solution ainsi qu'un kit pour sa mise en œuvre.
Un grand nombre de macromolécules d'intérêt général, en particulier dans le domaine pharmaceutique, cosmétique, nutritionnel ou du diagnostic, sont instables en solution, peu solubles ou insolubles. Elles perdent, partiellement ou en totalité, leur activité en solution et deviennent donc difficilement utilisables ou même totalement inutilisables alors qu'elles présentent une activité pharmacologique, cosmétique, nutritionnelle et/ou de diagnostic.
Les raisons d'une telle instabilité en solution sont diverses mais résultent généralement de l'inaptitude de la molécule à conserver un équilibre entre différentes interactions stabilisantes et son entropie structurelle qui tend à déstabiliser l'ensemble.
Cette instabilité a des répercussions importantes en particulier pour l'industriel ayant investi des moyens dans un programme de recherche et développement aboutissant à cette molécule inutilisable, mais également pour les personnes privées de ses effets bénéfiques. Les solutions techniques qui sont actuellement connues pour pallier ce phénomène d'instabilité, sont souvent très onéreuses, nécessitent un temps de développement considérable et sont aussi peu adaptées à une utilisation thérapeutique, cosmétique, nutritionnelle ou comme réactif de diagnostic de la molécule.
Par exemple, les solutions instables de molécules à visée pharmaceutique sont généralement conservées à des températures avoisinant les -80°C. Elles doivent être réchauffées et administrées à un patient sous traitement. Ceci présente en outre un inconvénient majeur lié aux dépenses énergétiques nécessaires au maintien d'une température de stabilisation de - 80°C, un problème logistique lié à la synchronisation nécessaire entre les étapes de réchauffement de la solution en prenant soin d'éviter la précipitation de la molécule, donc l'incertitude quant à la quantité réelle de molécule active administrée, et la voie d'administration pour les produits pharmaceutiques.
Par ailleurs, des méthodes de stabilisation de macromolécules sont déjà connues telles que la micro-encapsulation, la formation de nanoparticules ou encore la vectorisation, mais ces méthodes ne sont pas non plus satisfaisantes.
La micro-encapsulation est un procédé par lequel un produit, solide, liquide ou pâteux, est incorporé dans des microparticules. Dans le domaine de la santé on utilise les microparticules afin de réaliser un dépôt d'une quantité de médicament qui se libère lentement dans l'organisme. Ce système, bien qu'efficace dans certains cas pour stabiliser et libérer une molécule d'intérêt in-vivo, est incapable de la stabiliser en solution liquide ex-vivo si celle-ci est instable en solution. En outre, les polymères généralement utilisés pour la formation de ces microcapsules sont les dérivés des acides lactique et glycolique (PLGA, PLA), l'éthyl- cellulose, ou la poly-epsilon-caprolactone qui sont biodégradables et susceptibles de laisser des « traces polluantes » pour le receveur et l'environnement.
Les nanoparticules sont utilisées en recherche biomédicale et en médecine. Les nanoparticules sont des particules ultrafines dont une des trois dimensions est inférieure à 100 nm. Cette technologie, outre son coût généralement prohibitif, présente un certain nombre de limitations et d'inconvénients. En effet, la synthèse de ces produits doit être parfaitement reproductible, leurs propriétés physico-chimiques doivent être étudiées en profondeur et avec grande précision, la surface des nanoparticules doit le plus souvent être recouverte de molécules ou polymères permettant d'en augmenter la stabilité colloïdale et la biocompatibilité. Enfin, les mécanismes de dégradation des nanoparticules doivent également être étudiés de manière approfondie, et les risques de toxicité cellulaire, physiologique et histologique doivent être sérieusement évalués. L'utilisation de la nanotechnologie implique donc des risques physiques non négligeables pouvant être à la fois des risques environnementaux et des risques pour la santé des personnes qui les utilisent mais aussi des personnes qui manipulent les nanoparticules pendant leur production. D'autres inconvénients sont liés au fait que l'exposition aux nanoparticules doit être réduite et/ou contrôlée par une traçabilité qui doit permettre à tout moment de savoir où se trouvent les nanoparticules, dans quel produit, dans quel emballage.
Ainsi, les méthodes connues, bien que permettant dans une certaine proportion de «stabiliser» une macromolécule «in-vivo», c'est-à-dire notamment d'accroître sa biodisponibilité et sa stabilité vis-à-vis de sa dégradation par des enzymes et autres protéines telles que les protéases, les lipases et les glucosidases par exemple, sont incapables de stabiliser une macromolécule «ex-vivo», c'est-à-dire notamment :
- d'une part, de maintenir la macromolécule en solution (sans qu'elle ne précipite) en phase liquide, par exemple pour une solution principalement aqueuse, à une température supérieure à environ 0°C pendant une durée suffisamment longue (pouvant aller jusqu'à plusieurs mois ou années) pour permettre une manipulation aisée de la macromolécule en solution et son stockage en phase solide (sous forme congelée) mais aussi en phase liquide (par exemple à température ambiante),
- et d'autre part, de maintenir également son activité en phase solide et en phase liquide, à une température supérieure à 0°C, pendant toute la durée de son stockage (pouvant aller jusqu'à plusieurs mois ou années).
En général, une macromolécule d'intérêt formulée avec l'une quelconque des méthodes de l'état de la technique n'est stable en solution liquide ex-vivo que pendant très peu de temps, de quelques secondes à quelques minutes, voire quelques heures.
Il existe donc un besoin important en un système alternatif permettant, non seulement de conserver les avantages d'une bonne vectorisation de la macromolécule in-vivo, mais également, la stabilisation de la macromolécule en solution liquide ex-vivo afin d'améliorer son stockage et sa manipulation.
Il existe également un besoin tout aussi important pour un système palliant au moins l'un des inconvénients précités en référence aux systèmes déjà connus, en particulier un système : permettant la stabilisation dans une solution d'une molécule instable en solution, de préférence à une température où la solution est en phase liquide et pendant une durée suffisamment longue pour permettre la manipulation et/ou le stockage de la macromolécule,
permettant le maintien de l'activité, notamment de l'activité biologique, d'une molécule instable en solution même sous forme complexée, permettant le maintien de l'activité en solution, notamment de l'activité biologique, d'une molécule instable en solution de préférence à une température où la solution est en phase liquide et pendant une durée suffisamment longue pour permettre la manipulation et/ou le stockage de la macromolécule,
- ne possédant pas de caractère d'immunogénicité,
facile à mettre en œuvre,
peu coûteux à mettre en œuvre,
permettant de protéger la molécule instable en solution, de l'inactivation chimique, biochimique, enzymatique ou immunologique que la molécule est susceptible de subir, - permettant d'améliorer la pharmacocinétique et notamment permettant une libération contrôlée de la molécule instable en solution, et donc de garder sa concentration dans la zone d'efficacité thérapeutique,
pas ou peu toxique pour l'environnement,
permettant la réduction des effets secondaires non désirés de la molécule évitant des phénomènes de métabolisme, d'élimination ou de toxicité,
permettant de réduire les effets toxiques, tout en assurant la délivrance d'une quantité suffisante de la molécule dans le site actif,
permettant une libération sélective et spécifique de la macromolécule, par l'intermédiaire des ligands susceptibles d'interagir avec des cellules cibles,
- permettant le maintien de l'activité pharmacologique, cosmétique, nutraceutique ou autre de la molécule lorsqu'elle est utilisée.
Pour y répondre la présente invention vise un complexe moléculaire non covalent comprenant au moins un conjugué, préférentiellement un conjugué monofonctionnel, d'une PLL. L'utilisation d'un tel conjugué avec une molécule instable en solution permet d'améliorer la solubilité de la molécule, sa stabilité et de prolonger et/ou maintenir l'activité de la molécule en solution.
Les conjugués de PLL sont connus en particulier pour leur utilisation dans le domaine pharmaceutique. La demande de brevet internationale WO96/15810 notamment, divulgue l'utilisation de ces conjugués pour la préparation de compositions pharmaceutiques utiles dans le traitement de la dégénérescence neuronale, l'autoimmunité, la prolifération cellulaire maligne. Néanmoins ces conjugués n'ont jamais été utilisés pour former des complexes moléculaires via des liaisons non covalentes avec des molécules instables en solution pour améliorer leur stabilité en solution et prolonger ou maintenir leur activité.
C'est l'objet de l'invention qui vise un complexe moléculaire comprenant :
o au moins un conjugué PLL, comprenant :
■ une chaîne principale linéaire de PLL et
■ au moins une molécule F ayant un poids moléculaire compris entre 50 Daltons et 1000 Daltons, liée de façon covalente à ladite chaîne principale,
o au moins une molécule M instable en solution,
le ou les conjugué(s) et la ou les molécule(s) M étant liés / interagissant par liaison non covalente.
L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'un tel complexe, des compositions le contenant et son utilisation.
L'invention vise aussi l'utilisation d'au moins un conjugué PLL, comprenant :
■ une chaîne principale linéaire de PLL, et
■ au moins une molécule F ayant un poids moléculaire compris entre 50 Daltons et 1000 Daltons, liée de façon covalente à ladite chaîne principale,
dans une solution hydrophile, pour améliorer la stabilité en solution d'une molécule M instable en solution, en formant un complexe moléculaire avec cette molécule M par une liaison non covalente. L'invention a aussi pour objet un kit pour la mise en œuvre de cette utilisation.
Enfin, l'invention se rapporte également à un procédé d'identification d'un moins un conjugué PLL capable de se lier de façon non covalente à une molécule M donnée instable en solution, ainsi qu'un kit pour la mise en œuvre de ce procédé.
D'une manière générale, l'invention permet de stabiliser en solution une molécule M sous forme d'un complexe moléculaire. En effet, de façon inattendue et surprenante l'invention permet de donner une seconde "vie" à de nombreuses molécules instables en solution, en particulier des macromolécules, notamment des macromolécules d'intérêts thérapeutiques, délaissées ou non-utilisées à leur juste valeur, en combinant ladite molécule avec un ou plusieurs conjugué(s) à base de PLL sélectionnée(s) en fonction de la molécule étudiée. Contre toute attente, il a été montré que les molécules qui étaient instables en solution, généralement en solution à caractère hydrophile et principalement aqueuse, peuvent, grâce à la présence de certains conjugués PLL, être stockées/maintenues en solution liquide, c'est à-dire par exemple à une température supérieure à 0°C pour les solutions principalement aqueuses, et même à température ambiante, pendant plusieurs jours, mois et même probablement années, sans perte notable de leur activité pharmacologique initiale ou de l'une ou l'autre de leurs propriétés.
De manière toute aussi surprenante, les complexes de l'invention ainsi formés et stables ex- vivo, peuvent aussi être directement utilisés invivo dans des applications thérapeutiques, cosmétiques, nutritionnelles, chirurgicales ou diagnostiques, et notamment être administrés à un patient, sans qu'il n'y ait de problèmes particuliers liés à la toxicité. En ces termes, les complexes de l'invention peuvent également agir en tant que vecteurs thérapeutiques, protégeant in-vivo la molécule M complexée contre les attaques, notamment, des systèmes métaboliques enzymatiques et immunitaires du corps humain ou animal.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre, faite en regard d'exemples non limitatifs et de figures annexées sur lesquelles :
- la figure 1A représente le spectre IRFT obtenu pour le conjugué cystéine-G-PLL selon l'invention ; sur cette figure on peut observer la PLL identifiée par la zone 1700-1550 cm 1 et la cystéine représentée par les pics vers 1300 et 700 cm4,
- la figure 1B représente le spectre IRFT obtenu pour le conjugué méthionine-G-PLL selon l'invention ; sur cette figure on peut observer la PLL identifiée par la zone 1700-1550 cm" 1 et la méthionine représentée par les pics vers 1300, 900 et 700 cm ,
- la figure 1C représente le spectre IRFT obtenu pour le conjugué glutathion-G-PLL selon l'invention ; sur cette figure on peut observer la PLL identifiée par la zone 1700-1550 cm-1 et la glutathion représentée par les pics vers 1300 et 1200 cm ,
- la figure 1D représente le spectre IRFT obtenu pour le conjugué taurine-G-PLL selon l'invention ; sur cette figure on peut observer la PLL identifiée par la zone 1700-1550 cm 1 et la taurine représentée par les pics vers 1300, 1000 et 700 cm 1 ,
- la figure 1E représente le spectre IRFT obtenu pour le conjugué orotyl-PLL selon l'invention. Sur cette figure on peut observer la PLL identifiée par la zone 1700-1550 cm 1 et la orotyl représentée par les pics vers 1300 et 800 cm4,
- la figure 2 représente la structure protéique du facteur VIII par étude in silico, - la figure 3 représente la structure protéique de l'hémoglobine par étude in silico,
- la figure 4 représente la structure protéique de l'albumine par étude in silico.
DEFINITIONS
Au sens de la présente invention, on entend par «complexe» ou «complexe moléculaire», une entité formée par la mise en contact d'une molécule M instable en solution et d'un ou plusieurs conjugué(s) d'une PLL lié(s) par liaison non covalente.
Au sens de l'invention, on entend par «conjugué PLL», une molécule issue d'un couplage covalent sur une PLL, d'une ou plusieurs molécules F. Par «conjugué monofonctionnel de PLL», on entend le produit de couplage d'une molécule F à la PLL. Par «conjugué polyfonctionnel de PLL», on entend le produit de couplage d'au moins deux molécules F. Par exemple, un conjugué bifonctionnel peut être représenté par la formule : molécule Fl - PLL - molécule F2. Au sens de l'invention, on entend par «molécule F» un substituant ou une molécule non- immunogénique.
On entend par « substituant » une molécule de faible poids moléculaire généralement compris entre environ 50 Daltons et environ 1000 Daltons, de préférence compris entre environ 200 Daltons et environ 600 Daltons, et de préférence encore compris entre environ 150 Daltons et environ 500 Daltons, pouvant être liée par liaison covalente ou interagir par liaison covalente à une PLL en position epsilon (£)-aminé de la chaîne carbonée.
On entend par «immunogénique» toute molécule capable d'induire une réaction immunitaire. Une molécule «non immunogénique» est donc une molécule qui n'induit pas de réaction immunitaire.
Au sens de la présente invention, on entend par «PLL» ou «polylysine» un polypeptide ou homopolymère constitué principalement de L ou D-Lysine linéaire (c'est-à-dire non-ramifiée par une autre ou d'autres lysines) ou principalement de L-lysine linéaire. Elle répond à la formule : H ■NHCHCO- OH
NH, n
(cf Merck Index, lOème édition, abrégé N° 7444).
Au sens de l'invention, on entend par « molécule M instable en solution » une molécule instable en solution, préférentiellement une macromolécule. Il peut s'agir notamment d'une protéine, d'un lipide, d'un sucre, d'un acide nucléique ou de toute autre biomolécule de grande taille ; Par « instable en solution » on entend une molécule présentant une diminution ou une perte d'activité lorsqu'elle est mise en solution dans un solvant, notamment dans un solvant aqueux. Il peut s'agir de molécules hydrophobes ou peu hydrophiles, ou de molécules hydrophiles mais dont l'activité est diminuée en solution.
Au sens de la présente description, on entend par «liaison non-covalente» toute liaison qui n'est pas covalente, notamment une liaison de type ionique, hydrogène, ou Van Der Waals. Au sens de l'invention on entend par «activité pharmacologique ou biologique» la conséquence observée que peut avoir l'absorption d'une molécule ou d'une substance par un organisme telle qu'obtenue par une méthode d'analyse permettant la détection d'une telle activité. Celle-ci peut être évaluée, par exemple, en observant et évaluant l'occupation sélective d'un récepteur ou l'interaction spécifique avec une enzyme ou protéine (e.g. l'interaction antigène-anticorps) de la molécule ou substance d'intérêt. Dans le cadre de la présente demande, la diminution ou la perte de l'activité pharmacologique d'une substance ou macromolécule d'intérêt en solution liquide est une indication de l'instabilité de ladite substance en solution liquide.
Au sens de la présente invention, on entend par «activité biologique initiale» ou «activité pharmacologique initiale», l'activité biologique ou pharmaceutique d'un complexe selon l'invention telle que mesurée pour la première fois après sa mise en solution. Le temps écoulé entre la mise en solution du complexe et la première mesure d'activité peut être variable et sujet à l'influence de divers paramètres dont notamment la rapidité d'exécution de la prise de mesure qu'elle soit automatisée ou manuelle. Pour améliorer la reproductibilité de l'expérimentation, on pourra standardiser la prise de la première mesure qui pourra être effectuée, par exemple, environ au moins 3 minutes, de préférence environ 15 minutes, après la mise en solution du complexe selon l'invention. On entend par «activité biologique d'origine» ou «activité pharmacologique d'origine» l'activité biologique ou pharmacologique d'une molécule avant sa mise en contact (i.e. sa complexation) avec un ou plusieurs conjugués tels que définis dans la présente demande. On entend par «variation de l'activité pharmacologique ou biologique», la valeur absolue de la différence entre la valeur observée et mesurée de l'activité initiale et la valeur observée et mesurée de l'activité à un instant «t» après la mise en solution de la macromolécule. On entend par «maintien de l'activité pharmacologique ou biologique», une variation de l'activité pharmacologique ou biologique telle que définie ci-dessus d'au plus 30%, de préférence d'au plus 20%, de préférence d'au plus 10%, de préférence encore d'au plus 5% ou bien encore d'au plus 1%.
Au sens de la présente invention, on entend par «solvant aqueux» un solvant principalement ou essentiellement aqueux, c'est-à-dire contenant au moins environ 70% d'eau, de préférence au moins environ 80% d'eau et de préférence encore au moins environ 90% d'eau ou bien encore au moins environ 95% d'eau.
Au sens de l'invention, on entend par «solution en phase liquide» ou «solution à l'état liquide» une solution qui n'a pas atteint son point de congélation. A titre d'exemple, une solution aqueuse ou principalement aqueuse conservée à une température inférieure à environ 0°C, de préférence inférieure à environ -5°C, ne peut être considérée comme étant en phase liquide.
DESCRIPTION DETAILLEE
Complexe moléculaire
Selon un premier aspect, l'invention concerne donc un complexe moléculaire comprenant :
o au moins un conjugué PLL, comprenant :
■ une chaîne principale linéaire de PLL et
■ au moins une molécule F ayant un poids moléculaire moyen compris entre 50 Daltons et 1000 Daltons, liée de façon covalente à ladite chaîne principale, et
o au moins une molécule M instable en solution,
le ou les conjugué(s) et la ou les molécule(s) M étant liés par liaison non covalente, c'est-à- dire interagissant par liaison non covalente.
Conjugué PLL Le conjugué PLL peut être monofonctionnel ou polyfonctionnel. Un même complexe s'il contient plusieurs conjugués PLL, peut contenir uniquement des conjugués monofonctionnels, uniquement des conjugués polyfonctionnels ou un mélange de conjugué(s) monofonctionnel(s) et polyfonctionnel(s). Préférentiellement le conjugué PLL est monofonctionnel.
Il comprend une chaîne linéaire de PLL et au moins une molécule F ayant un poids moléculaire moyen compris entre 50 et 1000 Daltons. La ou les molécules F sont liée(s) de façon covalente à la chaîne principale. Le conjugué PLL peut être constitué exclusivement d'une chaîne principale linéaire de PLL et d'au moins une molécule F ayant un poids moléculaire moyen compris entre 50 Daltons et 1000 Daltons, liée de façon covalente à ladite chaîne principale. La chaîne PLL a un poids moléculaire moyen préférentiellement compris entre 2000 et 300000 Daltons, ce qui signifie que son degré de polymérisation (c'est à dire la valeur de l'indice n de la formule donnée dans la partie définition) est compris entre environ 15 et environ 2360 soit 127 résidus lysyl.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la chaîne PLL présente dans le complexe moléculaire selon l'invention a un poids moléculaire moyen qui est généralement compris entre 2000 et 300000 Daltons, ce qui signifie que son degré de polymérisation est compris entre environ 15 et environ 2360, préférentiellement entre 20000 et 50000 Daltons ce qui signifie un degré de polymérisation de 155 et 394 soit entre 155 et 374 lysines. Encore plus préférentiellement, la chaîne PLL comprend entre 30 et 150 lysines correspondant à un poids moléculaire moyen compris entre 3800 et 19100 Daltons, de préférence encore entre 50 et 100 lysines correspondant à un poids moléculaire moyen pour la chaîne PLL compris entre 6400 et 13000 Daltons.
La chaîne linéaire principale PLL du conjugué est préférentiellement une chaîne linéaire alpha.
La molécule F a préférentiellement un poids moléculaire compris entre 100 Daltons et 1000 Daltons, encore plus préférentiellement entre 200 Daltons et 1000 Daltons, en particulier entre 300 Daltons et 1000 Daltons, encore plus particulièrement entre 400 Daltons et 1000 Daltons, et de préférence entre 500 Daltons et 1000 Daltons.
Les molécules F sont des substituants ou des molécules non-immunogéniques. Des molécules telles que décrites dans la demande de brevet PCT WO96/15810 peuvent notamment être utilisées pour la présente invention. Les molécules F sont préférentiellement choisies dans l'une des trois catégories suivantes :
- Les molécules à caractère "acide gras ou lipidique", qui comprennent :
* les acides gras mono- ou dicarboxyliques, ci-après communément désignés par le terme (di)acide gras, à chaîne linéaire ou ramifiée, saturés ou insaturés, comprenant généralement de 4 à 24 atomes de carbone ;
* les composés impliqués dans le mécanisme d'ancrage des protéines aux membranes cellulaires, ces composés intervenant notamment dans le cycle du mévalonate, en particulier les isoprénoïdes liés à une cystéine ;
* le cholestérol et ses dérivés, notamment les hormones hydrophobes.
- Les molécules à caractère "anti-oxydant", qui comprennent :
* la vitamine A, la vitamine C, la vitamine E ou l'un de leurs dérivés ;
* la cystéine et ses dérivés, de formule : R1S-R2-CH(NH2)-C00H dans laquelle RI représente H ou CH3 et R2 représente un C1-C3 alkylène.
-Les molécules à caractère "acide aminé ou neurotransmetteur", qui comprennent :
* les indolealkylamines ;
* les catécholamines;
* les acides aminés de formule : R3-CH(NH2)-COOH dans laquelle R3 représente l'hydrogène, un groupe imidazol-2-ylméthyle, un groupe carboxyméthyle ou un groupe aminopropyle ;
* les acides amino(Cl-C5)alkylsulfoniques ou sulfiniques;
* la carnitine ou la carnosine;
* les diamines de formule : 2HN-A-NH2 dans laquelle A représente un (Cl-C6)alkylène ou un groupe -(CH2)m-NH-B-(CH2)p- dans lequel m et p, indépendamment l'un de l'autre, sont des entiers allant de 1 à 5, et B représente rien ou un groupe -(CH2)n-NH-, n étant un entier allant de 1 à 5 ;
* l'acétylcholine et
* l'acide y-aminobutyrique.
On distinguera donc trois sortes de conjugués (qu'ils soient monofonctionnels ou polyfonctionnels) : les conjugués "acide gras ou lipidiques"; les conjugués "anti-oxydants"; et les conjugués "acides aminés ou neurotransmetteurs". Généralement, le (di)acide gras comprend de 4 à 24 atomes de carbone, comme par exemple l'acide butyrique, maléique, succinique, glutarique, adipique, pimélique, subérique, sébasique, caproïque, caprylique, caprique, laurique, myristique, palmitique, palmitoléique, stéarique, oléique, linoléique, [gamma]-linolénique, [alpha]-linolénique, arachidique, gadoléique, arachidonique, béhénique, érucique ou azélaïque. De préférence, l'acide est choisi parmi l'acide myristique, l'acide palmitique, l'acide stéarique, l'acide oléique ou le (di)acide, l'acide azélaïque, par exemple.
Les isoprénoïdes liés à une cystéine comprennent généralement de 6 à 20 atomes de carbone. Préférentiellement, on utilise dans le cadre de l'invention le farnésyl-cystéine, le géranyl- géranyl-cystéine ou le mévalonate-cystéine.
Comme hormone hydrophobe, on utilise préférentiellement la progestérone ou le 2- méthoxyoestradiol.
Comme dérivé de la cystéine, on utilise préférentiellement l'homocystéine ou la méthionine. Les indolealkyleamines et catécholamines utilisées dans le cadre de l'invention comprennent notamment le tryptophane, le 5-méthoxytryptophane, la sérotonine, la tryptamine, la 5- méthoxytryptaminc, la mélatonine, la phénylalanine, la 3,4- dihydroxyphénylalanine et la tyrosine.
Comme acides aminés, on utilise de préférence l'histidine, la glycine, l'aspartate. Les acides amino(Cl-C5)alkylsulfoniques ou sulfiniques utilisés selon l'invention incluent notamment la taurine, l'homotaurine et l'hypotaurine. Les diamines utilisées de manière préférentielle dans le cadre de l'invention sont la putrescine, la cadavérine, la spermine et la spermidine.
A titre d'exemple non limitatif, on peut citer comme conjugué PLL utilisable pour la mise en œuvre de l'invention l'acide oléique-PLL, l'acide azélaïque-PLL et le 5-méthoxytryptamine- PLL.
De préférence, on utilisera une cystéine-PLL, une méthionine-PLL, une taurine-PLL, une glutathion-PLL ou une acidethiotique-PLL. Ainsi la ou les molécule(s) F liée(s) de façon covalente à la chaîne principale PLL est (sont) choisie(s) parmi la cystéine, la méthionine, la thorine, le glutathion et l'acide thiotique.
Selon un mode de réalisation adapté, le rapport massique moléculaire et l'aire des pics entre la ou les molécules F et la chaîne principale (déterminé par IRTF) est compris entre environ 10 et environ 20. Molécule M instable en solution
La molécule M est préférentiellement une macromolécule, c'est-à-dire une molécule ayant un poids moléculaire de préférence supérieur à 1000, préférentiellement à 2000 Daltons, encore plus préférentiellement supérieur à 5000 Daltons et en particulier supérieure à 10000 Daltons. Les molécules M peuvent être organiques et/ou minérales et peuvent être d'origine naturelle et/ou synthétique. Préférentiellement il s'agit de molécules organiques.
De préférence les molécules M sont des molécules utiles dans les systèmes biologiques, de préférence utiles dans les domaines thérapeutiques, cosmétiques, nutritionnels et/ou de diagnostiques. La ou les molécules M sont donc très préférentiellement des molécules présentant une activité pharmacologique et/ou nutritionnelle et/ou cosmétique et/ou est un réactif de diagnostic.
Préférentiellement, elles appartiennent à la famille des glucides, des protéines, des lipides, des protides (aussi dénommés protéines conjuguées) telles que, par exemple, les lipoprotéines, les mucoprotéines, les nucléoprotéines, les acides nucléiques (telles que ADN, ARN, ARN interférents, ARNt, ARNcyst etc..) et les protéines métalliques (exemple : métalloprotéines).
Parmi les molécules M de type glucide., on peut citer les oligosaccharides (sucres composés de 2 à 10 unités de base de monosaccharides), les polysaccharides. Les exemples de molécules M de type oligosaccharide et polysaccharide pouvant être mis en oeuvre dans l'invention sont notamment le collagène, la cellulose, l'amidon, le Facteur VIII, des immunoglobulines.
Parmi les molécules M de type protéine on peut citer notamment, les protéines de structure qui permettent à la cellule de maintenir son organisation dans l'espace ; les protéines de transport qui assurent le transfert des différentes molécules dans et en dehors des cellules ; les protéines régulatrices qui modulent l'activité d'autres protéines ou qui contrôlent l'expression des gènes ; les protéines de signalisation qui captent les signaux extérieurs et assurent leur transmission dans la cellule ou l'organisme telles que, par exemple, les protéines hormonales ; les protéines réceptrices qui détectent les molécules messagères et les autres signaux pour que la cellule agisse en conséquence telles que, par exemple, les protéines sensorielles et les récepteurs d'hormone comme l'insuline ; les protéines motrices qui permettent aux cellules ou organismes ou à certains éléments de se mouvoir ou se déformer telles que l'actine et la myosine ; les protéines de défense qui protègent la cellule contre les virus telle que par exemple, les anticorps ; les protéines de stockage qui permettent la mise en réserve d'acides aminés pour pouvoir créer d'autres protéines telle que, par exemple, l'ovalbumine et les enzymes. Les exemples de molécules M de type protéine pouvant être mis en œuvre dans l'invention sont les immunoglobulines, les protéines de la coagulation, les facteurs VI II et IX, l'albumine, etc.
Parmi les molécules M de type lipides, on peut citer les acides gras saturés et insaturés, les glycérides, (mono, di et tri) et les phospholipides. Les exemples de molécules M de type lipide pouvant être mis en oeuvre dans l'invention sont les lipoprotéines par exemple la lipoprotéine A.
Préférentiellement la molécule M est une protéine.
La ou les molécule(s) M et le ou les conjugué(s) PLL sont liés de façon non covalente par au moins une liaison non covalente. Une molécule M et un conjugué PLL peuvent être liés par une ou plusieurs liaisons non covalentes.
Selon un mode de réalisation adapté, le rapport entre la concentration moléculaire du ou des conjugué(s) et celle de la ou des molécule(s) M est compris entre 1 et 30.
Composition
Selon un autre aspect, l'invention concerne également une composition comprenant un ou plusieurs complexe(s) moléculaire(s) selon l'invention en solution dans un solvant hydrophile, de préférence choisi parmi l'eau, un tampon phosphate, du sérum physiologique ou un mélange de ceux-ci.
Les solvants hydrophiles utiles pour mettre en œuvre l'invention peuvent être variés dans la mesure où ils permettent la mise en solution de la (ou des) molécule(s) M et du (ou des) conjugué(s) sélectionné(s).
La composition peut comprendre en plus du ou des complexe(s) moléculaire(s) selon l'invention et du solvant hydrophile, au moins un autre composé. I l peut s'agir par exemple d'un autre composé pharmaceutiquement compatible choisi parmi un excipient, un tensioactif, un véhicule, etc.
Procédé d'obtention
Synthèse des conjugués PLL
Les méthodes de couplage entre les molécules F et la PLL, pour l'obtention des conjugués PLL selon l'invention sont les méthodes de couplage chimique classiques bien connues de l'homme du métier, entre un groupe fonctionnel de chaque molécule et le groupe fonctionnel ε-amine de la PLL. Ces couplages sont réalisés par l'intermédiaire d'un agent de couplage, choisi par exemple parmi le glutaraldéhyde, l'anhydride succinique ou glutarique, les carbodiimides, le chloroformiate d'éthyle ou l'hexaméthylène diisocyanate. Des exemples de telles méthodes de couplage sont notamment celles décrites dans Geffard et al., C.R. Acad. Sci. Paris : 295, 797-802, (1982). On peut également associer les molécules à la PLL par simple adsorption. Des exemples de méthodes de couplage appropriées sont décrites en détail dans les préparations ci-après.
A titre illustratif, le couplage entre lesdites molécules et la PLL peut être effectué entre la fonction ε-amine de la PLL et une fonction carboxylique desdites molécules ou autres fonctions chimiques activables.
Ainsi, dans le cas des acides gras, notamment l'acide myristique, l'acide palmitique, etc., ainsi que dans le cas des isoprénoïdes liés à une cystéine, notamment de la farnésyl-cystéine, la liaison avec la PLL est effectuée entre une fonction aminé de cette dernière et la fonction carboxylique des molécules susmentionnées.
De même, dans le cas de la cystéine et de ses dérivés, la liaison avec la PLL se fait avantageusement entre une fonction aminé de cette dernière et la fonction acide de ces molécules.
Alternativement, la cystéine et ses dérivés peuvent être préalablement activés par couplage avec l'anhydride succinique ou glutarique, la liaison se faisant alors entre la fonction ε-amine de la PLL et la fonction acide libre de la molécule succinylée ou glutarylée. Ou bien encore, la cystéine et ses dérivés peuvent être liés à la PLL par réaction avec le glutaraldéhyde, la réaction se faisant notamment comme décrit par Geffard et al., Brain Res. : 294, 161-165, (1984). Dans le cas du cholestérol et de ses dérivés, le couplage avec la PLL est avantageusement réalisé par l'intermédiaire du groupe hydroxyle du cholestérol.
Dans une variante, le cholestérol et ses dérivés sont adsorbés sur la PLL.
Dans le cas des hormones hydrophobes, le couplage avec la PLL est avantageusement réalisé par l'hexaméthylène diisocyanate.
Dans le cas de la vitamine A (acide rétinoïque), la liaison entre cette molécule et la PLL s'effectue entre la fonction aminée de cette dernière et la fonction acide de la molécule. Dans le cas de la vitamine C (acide ascorbique), la liaison entre cette molécule et la PLL s'effectue entre la fonction aminé de cette dernière et la fonction oxo de la molécule. Dans le cas de la vitamine E ([alpha]-tocophérol), la liaison entre cette molécule et la PLL s'effectue entre la fonction aminée de cette dernière et la fonction acide libre du succinate acide de la molécule.
Dans le cas des acides aminoalkylsulfoniques ou sulfiniques, notamment la taurine, l'homotaurine et l'hypotaurine, la liaison entre ces molécules et la PLL s'effectue par activation préalable des molécules avec un anhydride d'acide (succinique ou glutarique), ou bien par couplage avec le glutaraldéhyde.
Dans le cas des acides aminés, de certains composés indolealkylamines, notamment le tryptophane, et des catécholamines, on peut effectuer la liaison entre ces molécules et la PLL soit directement, soit par couplage avec le carbodiimide, le glutaraldéhyde, un anhydride d'acide ou un chlorure d'acide, par exemple le chloroformiate d'éthyle.
Dans le cas des diamines, on peut effectuer la liaison entre ces molécules et la PLL par couplage avec le glutaraldéhyde ou un anhydride d'acide. La liaison entre la carnitine ou la canosine d'une part, et la PLL d'autre part, s'effectue par couplage avec le carbodiimide. Procédé d'obtention du complexe moléculaire selon l'invention
Le complexe moléculaire selon l'invention peut être obtenu par un procédé comprenant les étapes suivantes :
o fourniture d'un ou plusieurs conjugués PLL, comprenant :
■ une chaîne principale linéaire de PLL et
■ au moins une molécule F ayant un poids moléculaire moyen compris entre 50 Daltons et 1000 Daltons, liée de façon covalente à ladite chaîne principale, et
o fourniture d'une ou plusieurs molécules M,
o mise en contact du (ou des) conjugué(s) avec la ou les molécule(s) M dans des conditions permettant la formation de liaison(s) non-covalente(s) entre le (ou les) conjugué(s) et la ou les molécule(s) M.
L" étape de fourniture du (ou des) conjugué(s) comprend préférentiellement la fourniture d'une solution comprenant le (ou les) conjugué(s) dans un solvant hydrophile.
De façon préférée l'étape de mise en contact est réalisée à une température comprise entre environ 4°C et 25°C et dans une solution tamponnée.
De même, l'étape de fourniture de la ou des molécule(s) M comprend préférentiellement la fourniture d'une solution comprenant la ou les molécule(s) M dans un solvant hydrophile. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, le temps de mise en contact du (ou des) conjugué(s) avec la ou les molécule(s) M est compris entre 1 heure et 24 heures.
Utilisations du complexe moléculaire
Les complexes moléculaires ou les compositions le contenant, peuvent être utilisés pour diverses applications, liées en particulier à la nature et à l'efficacité des molécules M.
Dans le cas d'une molécule M présentant une activité pharmacologique, c'est-à-dire un actif pharmacologique, le complexe moléculaire selon l'invention peut être utilisé en tant que médicament.
Préférentiellement pour cette utilisation le complexe moléculaire est administré au sein d'une composition, en particulier une composition selon l'invention.
Le complexe moléculaire selon l'invention est préférentiellement administré par voie intraveineuse, intra musculaire sous cutanée ou orale, spray nasal, buccal ou auriculaire ou cutané et solution ophtalmique.
Avantageusement les complexes de l'invention conservent ou améliorent l'activité pharmacologique d'origine de la molécule M. La présence de conjugués à base de PLL n'affecte donc pas cette activité ex-vivo (ou in-vitro). Il a également été démontré que leur présence n'est pas nuisible à l'action de la molécule M in-vivo (i.e. après administration à un patient). Par ailleurs, et contre toute attente, la présence des conjugués a également un effet bénéfique sur l'activité pharmacologique de la molécule M en améliorant sa biodisponibilité.
II est donc possible d'utiliser les complexes de l'invention comprenant une molécule M à visée thérapeutique en tant que médicament et dans des méthodes de traitement du corps humain ou animal par thérapie, chirurgie ou bien dans des méthodes de diagnostique.
La nature du traitement dépendra bien évidemment du type d'activité pharmacologique de la molécule M complexée.
A titre d'exemple on peut citer le traitement des troubles de l'hémostase.
Les complexes selon l'invention peuvent être utilisés également en vue d'améliorer le goût ou la texture des aliments, de réduire la teneur en lipides, ou d'encapsuler les nutriments, par exemple les vitamines des aliments, afin qu'ils ne se dégradent pas au cours de la durée de conservation. Par ailleurs, ils peuvent être utilisés en vue de fabriquer des emballages permettant de conserver les aliments plus longtemps.
Utilisation des conju ués pour stabiliser des molécules instables en solution
L'invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un conjugué PLL, comprenant : ■ une chaîne principale linéaire de PLL, et
■ au moins une molécule F ayant un poids moléculaire moyen compris entre 50 Daltons et 1000 Daltons, liée de façon covalente à ladite chaîne principale, et
dans une solution hydrophile, pour :
améliorer le caractère hydrophile, et/ou
améliorer la stabilité en solution, et/ou
améliorer et/ou maintenir en solution l'activité pharmacologique et/ou nutritionnelle et/ou cosmétique et/ou de diagnostic d'un réactif de diagnostic
d'une molécule M instable en solution, en formant un complexe moléculaire selon l'invention par liaison non covalente.
Si la molécule M est une substance active pharmaceutique, le maintien de l'activité pharmacologique de la molécule M en solution correspond préférentiellement à une variation de l'activité pharmacologique d'au moins 5% par rapport à l'activité pharmacologique initiale à une température d'au moins 1°C pendant 1 heure.
L'invention vise également selon une variante, l'utilisation d'au moins un conjugué PLL, comprenant :
■ une chaîne principale linéaire de PLL et
■ au moins une molécule F ayant un poids moléculaire moyen compris entre 50 Daltons et 1000 Daltons, liée de façon covalente à ladite chaîne principale, et
dans une solution hydrophile contenant une molécule M instable en solution non désirée dans ladite solution, pour former un complexe moléculaire selon l'invention par liaison non covalente et décontaminer ladite solution.
L'invention a également pour objet un kit pour la mise en œuvre de ces utilisations. Ce kit comprend au moins une solution hydrophile comprenant au moins un conjugué PLL comprenant :
■ une chaîne principale linéaire de PLL et
■ au moins une molécule F ayant un poids moléculaire moyen compris entre 50 Daltons et 1000 Daltons, liée de façon covalente à ladite chaîne principale. Procédé d'identification
L'invention vise aussi un procédé d'identification d'un moins un conjugué PLL capable de se lier de façon non covalente à une molécule M présentant une activité pharmacologique, instable en solution, et de maintenir l'activité pharmacologique de ladite molécule M dans une solution hydrophile, ledit procédé comprenant :
a) la fourniture d'une molécule M instable en solution présentant une activité pharmacologique ;
b) la fourniture d'au moins un complexe moléculaire comprenant ladite molécule M selon l'invention ;
c) la comparaison entre l'activité pharmacologique initiale et l'activité pharmacologique dudit ou desdits complexes moléculaires comprenant la molécule M ; d) l'identification d'un ou plusieurs complexes moléculaires dont l'activité pharmacologique en solution en phase liquide est maintenue après la mise en solution ; e) l'identification d'un conjugué PLL ou d'une combinaison de plusieurs conjugués PLL permettant ledit maintien de l'activité pharmacologique.
Le poids moléculaire de la molécule M est préférentiellement supérieur à 1000 Daltons. De façon préférée l'étape c) de comparaison est effectuée entre l'activité pharmacologique initiale de la molécule M et l'activité pharmacologique du ou des complexe(s) moléculaire(s) mesurées plusieurs fois à intervalles de temps déterminés à partir de la formation du ou des complexe(s), au moins toutes les 24 heures.
Préférentiellement, l'étape d) d'identification du ou des complexe(s) comprend en outre : la comparaison de l'évolution de l'activité pharmacologique de chaque complexe moléculaire testé en fonction du temps ;
l'identification du ou des complexe(s) dont la variation d'activité pharmacologique est d'au moins 5% par rapport à l'activité pharmacologique de référence de ladite macromolécule à une température d'au moins 1°C pendant au moins 1 heure.
La méthode d'identification selon l'invention comprend donc préférentiellement au moins trois étapes :
- l'étude de la solubilité du (ou des) complexe(s) macromolécule conjugué(s) en solution, - la vérification que la macromolécule conserve bien son activité pharmacologique d'origine, et - le suivi de l'activité pharmacologique du (ou des) complexe(s) macromolécule-conjugué(s) soluble(s), c'est-à-dire ayant « validé » l'étape précédente au cours du temps.
Une analyse in-silico telle que celle décrite ci-dessus est facultative mais avantageuse dans la plupart des cas car elle permet de restreindre relativement rapidement le nombre de conjugués possibles à la formation de complexes solubles et donc de simplifier la suite de l'analyse d'identification.
La solubilité de la macromolécule en présence du ou des conjugués ou de leurs mélanges (éventuellement sélectionnés par la méthode d'analyse in-silico) est étudiée en solution liquide. Les méthodes utilisées pour déterminer une telle solubilité sont standards et connues de l'homme du métier. On pourra néanmoins citer une analyse par mesure de la densité optique ou toute méthode de pharmacopée connue de l'homme du métier.
Les solvants préférés pour mettre en œuvre le procédé selon l'invention sont les solvants physiologiquement compatibles, de préférence hydrophiles, de préférence encore aqueux tels que l'eau distillée, les tampons phosphate et le sérum physiologique. D'autres solvants comme les alcools en C1-C3 ou le diméthylsulfoxide (DMSO) peuvent être présents et dont la quantité totale ne dépasse généralement pas 10% en volume par rapport au volume total de la solution de complexe.
En règle générale, l'insolubilité d'une molécule en solution est visible rapidement à l'oeil nu, en une durée de l'ordre de quelques secondes à quelques minutes dans certains cas. Par conséquent, une simple étude visuelle des échantillons des différents complexes en solution pourrait suffire à déterminer la ou les solutions de complexes pouvant convenir à la seconde étape d'analyse temporelle d'activité.
Cependant, des analyses de densité optique par exemple, permettent d'obtenir une mesure plus précise de ce phénomène.
L'activité d'origine des complexes solubles est tout d'abord vérifiée puis l'activité est ensuite mesurée à différents intervalles de temps à partir de la formation dudit ou desdits complexes, de préférence toutes les heures, de préférence encore toutes les 24 heures, puis tous les 3-4 jours.
Pour une molécule à visée thérapeutique, la mesure de l'activité pharmacologique peut se faire à partir de n'importe quelle méthode d'analyse appropriée sans aucune limitation. Ces méthodes d'analyse sont bien connues de l'homme du métier et leur utilisation dépend essentiellement de la nature de la macromolécule à visée thérapeutique d'intérêt. A titre d'exemple, lorsque la macromolécule est un anticorps, on pourra utiliser toute méthode permettant l'évaluation de son affinité avec son antigène et ses analogues telles que les méthodes immuno enzymatiques. Lorsque la macromolécule est une séquence ADN ou ARN par exemple, on pourra utiliser la méthode de spectrométrie MALDI-TDF, électrophorèse ou chromatographie liquide (HPLC) à haute performance.
Lorsque la molécule M n'a pas de visée thérapeutique particulière comme par exemple, les polymères naturels ou synthétiques, les résines, et autres additifs polymériques, on ne peut bien entendu plus parler d'activité pharmacologique ou biologique, mais le procédé tel que décrit précédemment sera mis en œuvre en remplaçant l'activité pharmacologique par les caractéristique(s) ou propriété(s) de la molécule M. Tout ce qui est décrit dans la présente demande en référence à l'activité pharmacologique d'une macromolécule à visée thérapeutique s'applique également en référence aux caractéristiques ou propriétés d'une molécule M d'intérêt non-thérapeutique.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un kit pour la détermination d'un conjugué ou d'une combinaison de plusieurs conjugués permettant le maintien de l'activité pharmacologique d'une ou plusieurs macromolécule(s) en solution, de préférence en phase liquide, comprenant au moins deux conjugués monofonctionnels ou polyfonctionnels identiques ou différents ou au moins deux mélanges de conjugués monofonctionnels ou polyfonctionnels identiques ou différents, et dans lequel chacun desdits conjugués comprend une chaîne principale de type PLL linéaire alpha et une ou plusieurs molécules ayant chacune un poids moléculaire d'au moins 50 Daltons et d'au plus 1000 Daltons liée de façon covalente à ladite chaîne principale.
Le kit selon l'invention peut comprendre au moins deux conjugués ou mélanges de conjugués PLL tels que définis précédemment, de préférence entre deux et dix.
La nature chimique des conjugués PLL pouvant être inclus dans le kit selon l'invention est telle que décrite dans la présente demande.
Selon une variante, le kit selon l'invention comprend des conjugués PLL ou des mélanges de conjugués conditionnés dans des récipients séparés. Les récipients pouvant être utilisés sont par exemple des flacons ou des doses à usage unique.
Le kit permet de faire un screening rapide par le laboratoire pour le choix des composés PLL- Fl et PLL-F2 qui correspond le mieux à la recherche de stabilité. Stabilité et mesure d'efficacité compléteront l'analyse et permettront de valider si oui ou non la macro molécule est «traitable» avec un composé PLL-F et d'orienter les composés qui seront greffés par liaisons non covalente.
EXEMPLE ET EXPÉRIMENTATIONS
Les propriétés remarquables des complexes selon l'invention ont été mises en évidence par les expérimentations décrites ci-après
Appareillafies et méthodes
Etude «in silico»
L'analyse «in silico» est une analyse entièrement réalisée au moyen d'un ordinateur et du logiciel Pymol. Elle permet de déterminer et sélectionner les conjugués PLL particuliers pouvant interagir avec une molécule M donnée en fonction de la répartition des acides aminés polaires et donc en fonction des charges de la molécule M .
Les sources utilisées sont les suivantes :
Protéines humaines : Pubmed/Protein Data Base/Uniprot
- Immunoglobuline d'isotypie G : Saphire EO et al. Crystal structure of a neutralizing human IGG
against HIV-1: a template for vaccine design. Science. 2001
Facteur de coagulation VII I : Ngo JC et al. Crystal structure of human factor VI II : implications for the formation of the factor IXa-factor Vi lla complex. Structure. 2008 - Facteur de coagulation IX : Wang, S. et al. Studies of benzothiophene template as potent factor IXa (FIXa) inhibitors in thrombosis. J.Med.Chem. 2010
Hémoglobine : Safo, M . K. et al. The enigma of the liganded hemoglobin end state: a novel quaternary structure of human carbonmonoxy hemoglobin. Biochemistry 2005. Albumine : Bhattacharya, A. A. et al. Binding of the gênerai anesthetics propofol and halothane to human sérum albumin. High resolution crystal structures. 2000)
J.Biol.Chem.
Le logiciel utilisé pour l'étude des structures protéiques est Pymol (http://www.pymol.org/). «Sédimentation»
En biochimie, la sédimentation est la séparation de protéines en solution qui ont la capacité de sédimenter dans un champ centrifuge élevé.
On pratique l'ultracentrifugation et dans ce cas les molécules sont mises en mouvement et sédimentées par suite de leur densité qui est supérieure à celle du solvant. On peut donc déterminer différentes macro molécules et leur masse molaire ainsi que leur constante de sédimentation mesurée en Svedberg (S).
«centrifugation»
La centrifugation est un procédé de séparation des composés d'un mélange en fonction de leur différence de densité en les soumettant à une force centrifuge.
L'appareil utilisé est une machine tournante à grande vitesse appelée centrifugeuse.
Au cours de cette opération de séparation, les composés dans le fluide situés à une distance r de l'axe de rotation sont soumis à différentes forces :
• La force de pesanteur descendante Fp
« La poussée d'Archimède ascendante Fa
• Une force de friction Fv
• La force centripète F'c
• La force centrifuge Fc
La séparation s'opère par l'action de la force centrifuge Fc sur les composés. Cette force centrifuge, exprimée en newtons, est donnée par la relation Fc = myc avec yc = rcj2 en m/s2 dont :
• La masse m du composé à séparer
• La distance r du tube à l'axe de rotation de la centrifugeuse
• La vitesse angulaire ω exprimée en radians par seconde ou en tours par minute.
Le rapport de la force centrifuge Fc sur le poids Fp est appelé intensité de la pesanteur artificielle et s'exprime en "G"3. Les valeurs utilisées en centrifugation sont d'environ 400 à 10 000 G, ce qui correspond à des vitesses de rotation de l'ordre 2 000 à 10 000 tr/min suivant le rayon des rotors.
Certaines applications comme la séparation des macromolécules biologiques (protéines, acides nucléiques), nécessite la méthode d'ultracentrifugation mise au point par Svedberg qui utilise des intensités de pesanteur artificielle très élevées de l'ordre de 200 000 G, et qui nécessite de ce fait des vitesses de rotation de plusieurs dizaines de milliers de tours par minute.
«Densité optique»
L'absorbance ou densité optique mesure la capacité d'un milieu à absorber la lumière qui le traverse. L'absorbance diffère selon la nature de la substance étudiée, selon la longueur d'onde sous laquelle elle est analysée, et selon la concentration de cette substance dans le milieu traversé. Ce milieu peut être solide, liquide ou gazeux, pour autant qu'il soit transparent. Elle est mesurée par un spectrophotomètre. La loi de Beer-Lambert établit une proportionnalité entre la concentration d'une entité chimique en solution (ou la pression partielle de cette entité en phase gazeuse), l'absorbance de celle-ci et la longueur du trajet parcouru par la lumière dans la solution.
La concentration est exprimée en mol.L 1 ou en mol. m 3.
«ELISA»
L'ELISA est une technique biochimique utilisant un ou deux anticorps. L'un de ceux-ci est spécifique de l'antigène, tandis que l'autre réagit aux complexes immuns (antigène-anticorps) et est couplé à une enzyme. Cet anticorps secondaire peut aussi causer l'émission d'un signal par un substrat chromogène ou fluorophore.
Le protocole «ELISA» dans le cadre de l'invention est le suivant :
Expériences de «titre» et «d'affinité» :
- Sensibilisation des puits «maxisorp» :
Chaque puits reçoit 200 μΙ d'une solution de tampon carbonate 0,05 M (pH = 9,6) contenant l'antigène à la concentration de 10ng/ml. Des puits contrôles sont réalisés avec la protéine porteuse modifiée par l'agent couplant à la même concentration. Les plaques sont mises 16 heures à 4°C sous agitation.
- Saturation :
Les plaques sont vidées puis remplies par 200 μΙ de tampon «PBS-Tw Sérum albumine bovine (BSA) 2,5g/l ». Les plaques sont mises à incuber pendant 1 heure à 37 °C.
- Lavages :
Les plaques sont vidées et lavées 3 fois avec du PBS-Tw.
- Incubations des anticorps :
Les anticorps sont dilués dans différents tampons :
■ Le tampon contrôle : le même que le tampon de saturation
■ Le tampon «tests» : c'est du tampon de saturation contenant un composé PLL-F.
Ainsi, trois solutions, c'est-à-dire trois concentrations différentes (10~4M, 10~5M et 10~6M) ont été testées par conjugué PLL-F. Les PLL-F testés sont les suivants :
o Méthionine-G-PLL
o Glutathion-G-PLL
o Taurine-G-PLL
o Cystéine-G-PLL
Les anticorps ainsi dilués sont déposés sur la plaque à raison de 200 μΙ par puits. Ce test comprend une étude de dilution de l'anticorps (1:2 500 à 1:80 000) et une étude d'affinité (dilution 30 de l'antigène de 1.10 6 à 1.10 12M).
L'étude de dilution de l'anticorps permet de déterminer la concentration en anticorps et donc de déterminer la dilution en anticorps à utiliser pour l'étude d'affinité et de spécificité.
[Mangas et al. Chapter 1. Brain Molécules : From Vit to molécules for axonal guidance. 2008]. L'absence de signal à la fin du test ELISA (A) indique que tous les sites d'anticorps reconnaissent la cible, c'est à dire qu'il a une haute affinité pour la cible. Un signal élevé à la fin de l'essai (B) est interprété comme une faible affinité de l'anticorps pour l'antigène.
[Mangas et al. Chapter 1. Brain Molécules : From Vit to molécules for axonal guidance. 2008] Lavages :
Les plaques sont vidées et lavées 3 fois avec du PBS-Tw (Tw=tween)
Incubation des anticorps secondaires :
Les puits reçoivent 200 μΙ de tampon «PBS-Tw, BSA 2,5g/l» contenant des immunoglobulines dirigées contre les IgG de l'espèce hôte marquées à la peroxydase et diluées au 1/10 000. Les plaques sont incubées pendant 1 heure à 37°C.
- Lavages :
Les plaques sont vidées et lavées 3 fois avec du PBS-Tw.
- Révélation :
Les puits reçoivent 200 μΙ de Tampon de révélation (Citrate 50 mM, Phosphate 100 mM, H202 0,03%, pH5) additionnée d'ortho-phénylène diamine à 0,2%.
On laisse la coloration se développer à l'obscurité pendant 10 minutes et on stoppe la réaction à l'aide 50 μΙ d'HCI 2N par puits.
La densité optique est ensuite lue à 492 nm.
«Dot Blot»
Dans un «dot blot», on transfère les acides nucléiques (ADN ou ARN) ou les protéines depuis un milieu liquide directement sur une membrane, sans séparation préalable. Le transfert peut être réalisé par diffusion simple, par diffusion dans un champs électrique (électrodiffusion) ou par aspiration sous vide.
La détection est similaire à celles utilisées dans les transferts avec séparation : par exemple des séquences de nucléotides pour l'ADN ou l'ARN ou des anticorps pour les protéines.
Protocole « Dot Blot » dans le cadre de l'invention :
A titre d'exemple, un anticorps monoclonal de souris (AcM) a été pris comme modèle: anti- HDehydroThromboxane B2 (11DHTB2-BSA), clone 2E1-B4 (IgGl, K) (surnageant de cellules). Le composé antigénique correspondant : anti-llDehydroThromboxane B2-BSA.
- Sensibilisation de la membrane de nitrocellulose :
Transfert de l'antigène depuis un milieu liquide directement sur une membrane, par aspiration sous vide. Chaque puits reçoit 200 μΙ d'une solution de tampon Tri-NaCI (TBS) IX contenant l'antigène. Des puits contrôles sont effectués avec la protéine porteuse modifiée par l'agent couplant à la même concentration.
Le système est mis sous vide à température ambiante pendant lh.
- Saturation :
Retirer la membrane et faire des légères coupures pour délimiter les futures « bandes de dépôt». Immerger ensuite la membrane dans du tampon de saturation «TBS ΙΧ-Tw, BSA 1%I» pendant 1 heure à température ambiante sous agitation.
- Lavages :
La membrane est ensuite lavée une fois avec du TBS lx .
- Incubation des anticorps :
Découper la membrane en bandes de dépôt. Chaque bande est immergée dans une solution contenant l'anticorps à une dilution donnée à 4°C pendant 16h. C'est-à-dire que les anticorps sont dilués dans différents tampons:
■ Le tampon contrôle : le même que le tampon de saturation
■ Le tampon « tests » : c'est du tampon de saturation contenant un composé PLL-F. Ainsi, trois solutions, c'est-à-dire trois concentrations différentes (10 4M, 10 5M et 10 6M) ont été testées par composé PLL-F.
Les PLL-F testés sont les suivants :
o Méthionine-G-PLL
o Glutathion-G-PLL o Taurine-G-PLL
o Cystéine-G-PLL
Ce test permet d'étudier l'influence du composé PLL-F sur l'interaction Ag/Ac en suivant la densité du « spot » de dot-blot.
- Lavages :
Les bandes sont lavées 3 fois avec du TBSIX-TW 0,005%.
Incubation des anticorps secondaires
Les bandes sont immergées dans du tampon TBS1XTW (0,005%)-BSA(0,l%) contenant des immunoglobulines dirigées contre les IgG de l'espèce hôte marquées à la peroxydase et diluées au 1/5 000 pendant lh à température ambiante sous agitation.
- Lavages :
Les bandes lavées 3 fois avec du TBSIX-TW 0,005% et un dernier lavage au TBSIX pour enlever la mousse.
- Révélation :
Les bandes sont immergées dans du tampon de révélation. La coloration se développe à l'obscurité pendant 10 minutes et la réaction est stoppée à l'aide 50 μΙ d'HCI 2N par bande. L'intensité des spots est estimée par l'expérimentateur.
«Comptage cellulaire»
La méthode utilisée est la méthode de comptage par Cellule de Malassez et bleu de trypan. Le bleu de trypan est un réactif chromophore (couleur bleue) chargé négativement et qui n'interagit pas avec la membrane si cette dernière est intacte. Il ne va donc colorer que les cellules endommagées, permettant de déterminer la viabilité d'un échantillon. Les échantillons sont dilués puis mélangés avec le bleu de trypan. Une fois placés sur une cellule de comptage classique (Cellule de Malassez), le nombre de cellules totales est déterminé puis les cellules apparaissant de couleur bleue (cellules avec membrane endommagée) sont à leur tour dénombrées. La biomasse est déterminée à partir du nombre total de cellules alors que la viabilité est déterminé à partir de cette formule :
Viabilité = [n(cellules bleues)/n(total)] .100%
Une cellule de Malassez est une lame spéciale quadrillée qui permet le comptage de différents types de cellules.
La totalité de la cellule de Malassez est composée de 100 rectangles dont les dimensions sont : Long.= 0,25 mm / larg.= 0,20 mm / Prof. = 0,20 mm. Le volume total de la cellule est de 1 mm3 (100x2,5 x 0,2 x 0,20). Le quadrillage est donc constitué de 10 bandes verticales (0,25 mm) et de 10 bandes horizontales (0,20 mm) formant ainsi 100 rectangles,
On ne compte les cellules que dans 10 des 25 rectangles non contigus pris au hasard dans la cellule.
On totalise le nombre de cellules présentes dans chaque rectangle.
Arbitrairement, il est convenu de ne tenir compte que des cellules positionnées sur les côtés droits et inférieurs.
On calcule le nombre moyen de cellules par rectangle (total des cellules observées dans 10 rectangles divisé par le nombre de rectangles comptés). On multiplie le nombre obtenu par 100 pour connaître le nombre d'entités cellulaires par mm3.
«I RFT»
Le spectromètre I nfra-Rouge à Transformée de Fourier (I RTF) est un outil d'analyse très utilisé pour l'identification et la quantification de molécules et protéines. La région principale de la spectroscopie vibrationnelle est le moyen infrarouge (4 000 à 400 cm 1) du spectre électromagnétique. Le nombre d'onde est défini par l'inverse de la longueur d'onde, exprimé en centimètre. La spectroscopie peut être définie comme l'étude de l'interaction d'une onde électromagnétique avec la matière. Ainsi cette technique permet d'identifier les groupes fonctionnels chimiques de toute molécule via les vibrations caractéristiques de ses liaisons chimiques. Le résultat obtenu est un spectre I R de la molécule étudiée, soit en mode transmittance, soit en mode d'absorbance, où les pics sont interprétables grâce à des tables de corrélation de fréquences des vibrations de valence. Les analyses effectuées sur les conjugués Poly-L-lysine permettent de vérifier le greffage des petites molécules sur la PLL (shift sur les pics de l'amide de la PLL) et de déterminer les pics spécifiques aux petites molécules greffées. I l est observé une modification de l'allure spectrale d'un mélange PLL-F et molécule M, en comparaison avec les spectres d'origine du conjugué PLL-F et molécule M.
Synthèse des conju ués selon l'invention
La synthèse des conjugués selon l'invention a été réalisée conformément aux protocoles et indications décrits dans la demande de brevet WO9615810.
Dans ce qui suit, les molécules de poids moléculaire d'au moins 50 Daltons et d'au plus 1000 Daltons liées de façon covalente à la chaîne principale de la PLL seront dénommées «molécules F». Pour des raisons de simplification de la notation, les conjugués selon l'invention sont identifiés par l'abréviation : «molécule F» - «type de couplage» - PLL.
Par exemple, le conjugué «cystéine-G-PLL» correspond à une cystéine greffée sur une PLL par l'intermédiaire d'un bras espaceur (ou linker en terminologie anglo-saxonne) de type glutaraldéhyde. Le conjugué «orotyl-PLL», quant à lui, correspond à l'acide orotique greffé sur une PLL par l'intermédiaire d'un linker de type chlorure d'acide.
Procédure générale de synthèse
D'une manière générale, deux types d'activation concernent les molécules F, suivant leur famille moléculaire (acides aminés ou autres), la synthèse par activation au glutaraldéhyde et la synthèse par activation par un chlorure d'acide.
Les molécules F activées par la voie de synthèse du glutaraldéhyde et greffées sur la PLL suivent les réactions suivantes :
1ère étape : réaction de condensation et formation des imines
- 2ème étape : réduction des imines instables
Chaque molécule F est activée par le glutaraldéhyde (G), qui agit comme agent couplant en activant le groupe aminé de la petite molécule. La réaction de condensation forme des imines. Ce composé intermédiaire, petite molécule et agent couplant, est lié sur le groupe aminé epsilon du résidu lysyl de la poly-L-lysine, formant une liaison amide. Les imines instables sont stoppées par borohydrure de sodium. Ce produit est purifié par dialyse dans des solutions tampons.
A titre d'exemple on peut citer la synthèse du composé cystéine-G-PLL. Le procédé comprend la mise en œuvre des étapes suivantes :
- Pesée de la cystéine : 400 mg - Solubilisation dans un tampon acétate : 20 ml
- Activation par glutaraldéhyde 5% : 6 ml
- Greffage sur la PLL : 10 ml
- Réduction des imines par NaBH4 5M : 2 ml
- Purification par dialyse
Les molécules F activées par la voie de synthèse de l'éthyl chloroformiate et greffées sur la PLL suivent les réactions suivantes : haptène chloroform iate d'éthyle:
ECF
Chaque molécule F est activée par l'éthyl chloroformiate (ECF), qui agit comme agent couplant en activant le groupe carboxylique de la petite molécule. Ce composé intermédiaire, petite molécule et agent couplant, est lié sur le groupe aminé epsilon du résidu lysyl de la poly-L- lysine, formant une liaison amide. Ce produit est purifié par dialyse dans des solutions tampons.
A titre d'exemple on peut citer la synthèse du composé orotyl-PLL. Le procédé comprend la mise en œuvre des étapes suivantes :
Pesée de l'acide orotique : 400 mg
Solubilisation dans le méthanol : 20 ml
Ajout de triéthylamine : 0,4 ml
Activation par éthyl chloroformiate : 0,25 ml
Greffage sur la PLL : 10 ml
Purification par dialyse
Caractérisation des conjugués selon l'invention
La caractérisation des conjugués selon l'invention a été effectuée par la technique analytique de l'infra-rouge à Transformée de Fourier (IRTF). Cette technique spectroscopique permet d'identifier le greffage et les pics spécifiques de la petite molécule sur la PLL. Bien que cette méthode soit généralement très efficace, d'autres méthodes pourront également être utilisées telles que, par exemple, la RMN, ou la dynamisation de lumière ou la cristallographie. Des exemples de caractérisation de conjugué selon l'invention sont reproduit dans les figures lA à 1E.
Formation des complexes de l'invention
Procédure générale
Dans un réacteur, on introduit le(s) conjugué(s) selon l'invention synthétisé(s) à l'étape précédemment décrite et la macromolécule d'intérêt avec inertage à l'azote le cas échéant selon le Protocole spécifique à la molécule M (Cf. 4)
Formation d'un complexe selon l'invention comprenant un anticorps monoclonal de souris (AcM)
Dans cet exemple, la molécule M est un anticorps monoclonal de souris (AcM).
Pour l'étude in vitro les conditions sont les suivantes :
L'AcM (surnageant de cellules) : anti-UDehydroThromboxane B2 (11DHTB2-BSA), clone 2E1- B4 (lgGl, K)
Le composé antigénique correspondant : anti-UDehydroThromboxane B2-BSA.
Tampon dilution AcM :
Tampon contrôle TBS1X
Composés PLL-F testés : ie Tampon Contrôle + PLL-F
Cystéine-G-PLL (10-4M, 10-5M et 10-6M)
Méthionine-G-PLL (Idem)
- Glutathion-G-PLL (ldem)
Taurine-G-PLL (Idem)
Formation d'un complexe selon l'invention comprenant le Facteur VIII
Dans cet exemple, la molécule M est le facteur VIII.
Le facteur VIII joue un rôle central dans la coagulation. Il s'agit du cofacteur de facteur IX. Le facteur VIII, activé par la thrombine, devint le catalyseur de la réaction d'activation du facteur X par le facteur IX activé, en présence d'ion calcium et de phospholipides. La réaction d'activation du facteur X est accélérée environ 200 000 fois en présence du facteur VIII. Le facteur X activé acquiert une activité catalytique qui lui permet de transformer la prothrombine en thrombine. Celle-ci dégrade le fibrinogène en fibrine. Le caillot ainsi formé sera stabilisé par le facteur XIII, ce qui permet l'arrêt du saignement.
Également appelé facteur Christmas ou facteur antihémophilique B, le facteur IX est l'un des intervenants indispensables de la coagulation sanguine. La protéine (57-kDa vitamin K- dépendent procoagulant glycoprotein), codée par le gène F9, se trouve à l'état inactif dans la circulation sanguine. Lorsqu'un vaisseau est endommagé, des éléments étrangers s'infiltrent. Dès qu'elle entre en contact avec l'un d'eux, elle s'active et permet la synthèse d'une enzyme, la thrombokinase, qui intervient dans la suite des réactions de la coagulation aboutissant à la formation d'un caillot sanguin. Dans le cas de l'absence de ce facteur IX, les personnes souffrent d'hémophilie B.
- Etude in-silico
La structure protéique du facteur VIII est représentée sur la figure 2.
Le logiciel permet de visualiser en couleur sur la structure 3D représentée sur la figure 2 :
o les acides aminés à chaîne latérale polaire sans fonction acide-base : sérine, asparagine, thréonine, glutamine
o Les acides aminés à chaîne latérale polaire avec fonction acide base anionique
: aspartate, glutamate.
o Les acides aminés à chaîne latérale polaire avec fonction acide base cationique : lysine, arginine
o Les acides aminés à chaîne latérale polaire avec fonction acide base neutre : cystéine, tyrosine, histidine
Le tableau ci-dessous représente le nombre de fonctions relevées par cette méthode
Formation d'un complexe selon l'invention comprenant une hémoglobine
Dans cet exemple, la molécule M est une hémoglobuline.
L'activité de l'hémoglobine est mesurée par saturation en oxygène. L'hémoglobine humaine est constituée de quatre chaînes identiques deux à deux : deux chaînes a de 141 acides aminés chacune et de deux chaînes β de 146 acides aminés chacune (ce qui donne un total de 574 acides aminés pour l'hémoglobine). Chacune de ces chaînes est associée à un groupement prosthétique : Thème. On la symbolise par « Hb ». Une molécule d'hème est constituée d'un ion fer complexé par une porphyrine.
- Etude in-silico
La structure protéique de l'hémoglobine est représentée sur la figure 3.
Le logiciel permet de visualiser en couleur sur la structure 3D représentée sur la figure 3 :
o les acides aminés à chaîne latérale polaire sans fonction acide base : sérine, asparagine, thréonine, glutamine
o Les acides aminés à chaîne latérale polaire avec fonction acide base anionique : aspartate, glutamate. o Les acides aminés à chaîne latérale polaire avec fonction acide base cationique : lysine, arginine
o Les acides aminés à chaîne latérale polaire avec fonction acide base neutre : cystéine, tyrosine, histidine
Le tableau ci-dessous représente le nombre de fonctions relevées par cette méthode :
Formation d'un complexe selon l'invention comprenant une albumine
Dans cet exemple, la molécule M est une albumine.
L'albumine sérum humaine est l'une des protéines les plus abondantes dans le système circulatoire. Elle joue un rôle clé dans le transport des acides gras, des métabolites et des médicaments et stimule fortement la distribution des médicaments dans le corps. Sans une protéine pour distribuer les médicaments tels que des antibiotiques, il serait beaucoup plus difficile de combattre la maladie ; l'albumine humaine permet à certaines substances actives de se lier et d'être transportées dans tout le corps. La structure de l'albumine humaine représente un modèle quaternaire. La masse moléculaire de la protéine est 67000, avec 585 acides aminés. La protéine a environ 67% de l'hélice alpha et étonnamment aucun feuillet. Sa structure permet de se lier à une grande variété de molécules naturelles et synthétiques. L'albumine humaine est impliquée dans le maintien de la pression osmotique colloïdale. La pression osmotique colloïdale est une forme de pression qui doit être appliquée pour empêcher la quantité excessive d'eau à travers la membrane semi-perméable.
Etude in-silico
La structure protéique de l'albumine est représentée sur la figure 4.
Le logiciel permet de visualiser en couleur sur la structure 3D représentée sur la figure 4 :
o les acides aminés à chaîne latérale polaire sans fonction acide base : sérine, asparagine, thréonine, glutamine
o Les acides aminés à chaîne latérale polaire avec fonction acide base anionique
: aspartate, glutamate,
o Les acides aminés à chaîne latérale polaire avec fonction acide base cationique : lysine, arginine
o Les acides aminés à chaîne latérale polaire avec fonction acide base neutre : cystéine, tyrosine, histidine
Le tableau ci-dessous représente le nombre de fonctions relevées par cette méthode
Représentation en
HSA Total % par rapport au
total des AA
Nombre
335 57%
total
Nombre de
résidus en 289 49%
surface Exemples d'Analyse de stabilité et de solubilité en solution et en culture cellulaire
a. Stabilité des Immunoqlobulines (Iq) en solution aqueuse dans différents tampons pour des applications thérapeutiques
Pour cela, des composés PLL-F sont utilisés. Deux démarches sont appliquées :
o Etude « in silico » par la recherche bibliographique et l'étude de la structure des Ig
o Etude « in vitro » par la technique ELISA / Dot Blot :
• « Binding » direct
• Affinité
· Spécificité
b. Stqbilité des hybridomes monoclonqux en solution qqueuse dqns différents «milieux de culture»
Pour cela, des composés PLL-F sont utilisés. L'évaluation est réalisée par une étude « in vitro » qui comprend :
- L'observation de l'aspect des cellules avec les différents « milieux de culture »
Le comptage cellulaire pour le suivi de la croissance
Applications
Les complexes selon l'invention peuvent être utilisés dans de nombreuses applications thérapeutiques ou non thérapeutiques.
Pour le Facteur VIII par exemple : aujourd'hui en cas de nécessité l'hémophile doit hydrater sa solution lyophilisée, puis préparer le bon dosage et enfin se l'injecter. Avec l'invention le patient aura juste à prendre la seringue pré-remplie mise à sa disposition et s'injecter le bon nombre d'unités. Plus de risque de sous ou sur dosage, plus de risque de contamination durant la préparation et donc une sécurité totale pour le patient.
Dans le domaine du diagnostic l'utilisation de complexes selon l'invention permet des dosages plus facile et dans le nutraceutique il permet de mettre en solution un actif stable dans un yaourt ou autre par exemple.

Claims

REVENDICATIONS
1. Complexe moléculaire comprenant :
o au moins un conjugué polylysine (PLL), comprenant :
■ une chaîne principale linéaire de PLL et
■ au moins une molécule F ayant un poids moléculaire moyen compris entre 50 Daltons et 1000 Daltons, liée de façon covalente à ladite chaîne principale, et
o au moins une molécule M instable en solution,
le ou les conjugué(s) et la ou les molécule(s) M étant liés par liaison non covalente.
2. Complexe moléculaire selon la revendication 1, caractérisé en ce que la molécule M est une molécule organique.
3. Complexe moléculaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la molécule M est une protéine.
4. Complexe moléculaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le rapport entre la concentration molaire du ou des conjugué(s) et celle de la ou des molécule(s) M est compris entre 1 et 30.
5. Complexe moléculaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le rapport massique moléculaire et l'air des pics entre la ou les molécules F et la chaîne principale (déterminé par la méthode IRFT) est d'environ 10 à environ 20.
6. Complexe moléculaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la ou les molécule(s) F liée(s) de façon covalente à la chaîne principale est (sont) choisie(s) parmi la cystéine, la méthionine, la taurine, le glutathion et l'acide thiotique.
7. Complexe moléculaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la au moins une molécule M liée de façon non covalente au conjugué PLL est une molécule présentant une activité pharmacologique et/ou nutritionnelle et/ou cosmétique et/ou est un réactif de diagnostic.
8. Complexe moléculaire selon des précédentes revendications, caractérisé en ce que le poids moléculaire de chaque molécule M est supérieur à 1000 Daltons.
9. Complexe moléculaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la PLL comprend entre 155 et 394 lysines.
10. Complexe moléculaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une liaison non-covalente entre un conjugué et une molécule M.
11. Complexe moléculaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la PLL du conjugué est une chaîne linéaire alpha.
12. Complexe moléculaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le poids moléculaire de chaque PLL est compris entre 3000 Daltons et 50000 Daltons.
13. Composition comprenant au moins un complexe selon l'une des revendications 1 à
12, en solution dans un solvant hydrophile.
14. Composition selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'elle comprend en plus du complexe moléculaire, au moins un autre composé.
15. Procédé d'obtention d'un complexe moléculaire selon l'une des revendications 1 à 12, comprenant les étapes suivantes :
o fourniture d'un ou plusieurs conjugués PLL, comprenant :
■ une chaîne principale linéaire de PLL et
■ au moins une molécule F ayant un poids moléculaire moyen compris entre 50 Daltons et 1000 Daltons, liée de façon covalente à ladite chaîne principale, et
o fourniture d'une ou plusieurs molécules M,
o mise en contact du (ou des) conjugué(s) avec la ou les molécule(s) M dans des conditions permettant la formation de liaison(s) non-covalente(s) entre le (ou les) conjugué(s) et la (ou les) molécule(s) M.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ladite étape de mise en contact est réalisée à une température comprise entre environ 4°C et 25°C et dans une solution tamponnée.
17. Procédé selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que l'étape de fourniture du (ou des) conjugué(s) comprend la fourniture d'une solution comprenant le (ou les) conjugué(s) dans un solvant hydrophile.
18. Procédé selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisé en ce que ladite étape de fourniture de la ou des molécule(s) M comprend la fourniture d'une solution comprenant la (ou les) molécule(s) M dans un solvant hydrophile.
19. Procédé selon l'une des revendications 15 à 18, caractérisé en ce que le temps de mise en contact du (ou des) conjugué(s) avec la (ou les) molécule(s) M est compris entre 1 heure et 24 heures.
20. Complexe moléculaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, la molécule M étant une substance active pharmaceutique, pour son utilisation en tant que médicament.
21. Complexe pour une utilisation selon la revendication 20, caractérisé en ce que le complexe moléculaire est administré au sein d'une composition selon la revendication 13 ou
14.
22. Complexe pour une utilisation selon l'une des revendications 20 ou 21, caractérisé en ce que le complexe moléculaire est administré par voie intraveineuse, IM sous cutané ou orale, spray nasal, buccal ou auriculaire ou cutané et solution ophtalmique.
23. Utilisation d'au moins un conjugué PLL, comprenant :
■ une chaîne principale linéaire de PLL et
■ au moins une molécule F ayant un poids moléculaire moyen compris entre 50 Daltons et 1000 Daltons, liée de façon covalente à ladite chaîne principale, et
dans une solution hydrophile, pour améliorer le caractère hydrophile d'une molécule M instable en solution, en formant un complexe moléculaire selon l'une des revendications 1 à 12.
24. Utilisation d'au moins un conjugué PLL, comprenant :
■ une chaîne principale linéaire de PLL et
■ au moins une molécule F ayant un poids moléculaire moyen compris entre 50 Daltons et 1000 Daltons, liée de façon covalente à ladite chaîne principale, et
dans une solution hydrophile, pour améliorer la stabilité en solution d'une molécule M instable en solution, en formant un complexe moléculaire selon l'une des revendications 1 à 12.
25. Utilisation d'au moins un conjugué PLL, comprenant :
■ une chaîne principale linéaire de PLL et
■ au moins une molécule F ayant un poids moléculaire moyen compris entre 50 Daltons et 1000 Daltons, liée de façon covalente à ladite chaîne principale, et
dans une solution hydrophile, pour améliorer en solution l'activité pharmacologique et/ou nutritionnelle et/ou cosmétique et/ou de diagnostic d'un réactif de diagnostic, d'une molécule M instable en solution, en formant un complexe moléculaire selon l'une des revendications 1 à 12.
26. Utilisation selon la revendication 23, caractérisée en ce que le maintien de l'activité pharmacologique de la molécule M en solution correspond à une variation de l'activité pharmacologique d'au moins 5% par rapport à l'activité pharmacologique initiale M à une température d'au moins 1°C pendant 1 heure.
27. Utilisation d'au moins un conjugué PLL, comprenant :
■ une chaîne principale linéaire de PLL et
■ au moins une molécule F ayant un poids moléculaire moyen compris entre 50 Daltons et 1000 Daltons, liée de façon covalente à ladite chaîne principale, et
dans une solution hydrophile contenant une molécule M instable en solution non désirée dans ladite solution, pour former un complexe moléculaire selon l'une des revendications 1 à 12 et décontaminer ladite solution.
28. Kit pour la mise en œuvre d'une utilisation selon l'une des revendications 23 à 27, caractérisé en ce qu'il comprend une solution hydrophile comprenant au moins un conjugué PLL tel que décrit dans l'une des revendications 1 à 12.
29. Procédé d'identification d'un moins un conjugué PLL capable de se lier de façon non covalente à une molécule M instable en solution et de maintenir l'activité pharmacologique de ladite molécule M dans une solution hydrophile, ledit procédé comprenant :
a) la fourniture d'une molécule M instable en solution présentant une activité pharmacologique ;
b) la fourniture d'au moins un complexe moléculaire comprenant ladite molécule M, tel que défini dans l'une des revendications 1 à 12 ;
c) la comparaison entre l'activité pharmacologique initiale et l'activité pharmacologique dudit ou desdits complexes moléculaires comprenant la molécule M ; d) l'identification d'un ou plusieurs complexes moléculaires dont l'activité pharmacologique en solution en phase liquide est maintenue après la mise en solution ; e) l'identification d'un conjugué PLL ou d'une combinaison de plusieurs conjugués PLL permettant ledit maintien de l'activité pharmacologique.
30. Procédé d'identification selon la revendication 29, caractérisé en ce que le poids moléculaire de la molécule M est supérieur à 1,000 Daltons.
31. Procédé d'identification selon l'une des revendications 29 ou 30, caractérisé en ce que l'étape c) de comparaison est effectuée entre l'activité pharmacologique initiale de la molécule M et l'activité pharmacologique du ou des complexe(s) moléculaire(s) mesurées plusieurs fois à intervalles de temps déterminés à partir de la formation du ou des complexe(s), au moins toutes les 24 heures.
32. Procédé d'identification selon l'une quelconque des revendications 29 à 31, caractérisé en ce que l'étape d) d'identification du ou des complexe(s) comprend en outre : la comparaison de l'évolution de l'activité pharmacologique de chaque complexe moléculaire testé en fonction du temps ;
- l'identification du ou des complexe(s) dont la variation d'activité pharmacologique est d'au moins 5% par rapport à l'activité pharmacologique de référence de ladite macromolécule à une température d'au moins 1°C pendant au moins 1 heure.
33. Kit pour la mise en œuvre d'un procédé selon l'une des revendications 27 à 31, caractérisé en ce qu'il comprend au moins :
- un ou plusieurs conjugué(s) PLL, comprenant :
o une chaîne principale linéaire de PLL et
o au moins une molécule F ayant un poids moléculaire moyen compris entre 50 Daltons et 1000 Daltons, liée de façon covalente à ladite chaîne principale, une solution aqueuse,
- un support pour la mise en œuvre du procédé.
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