EP1282716A1

EP1282716A1 - Verfahren zur herstellung rekombinanter proteine durch gram-negative bakterien

Info

Publication number: EP1282716A1
Application number: EP01921369A
Authority: EP
Inventors: Gerhard Miksch; Erwin Flaschel; Roland Breves; Karl-Heinz Maurer; Sophia Kleist
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2000-04-20
Filing date: 2001-04-12
Publication date: 2003-02-12
Also published as: DE10019881A1; AU2001248368A1; US20040005695A1; WO2001081597A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine durch gram-negative Bakterien. Es zeichnet sich dadurch aus, dass die Produkte in das umgebende Medium abgegeben werden und somit hohe Expressions- und Produktionsraten erzielt werden können. Dies wird dadurch erreicht, dass das Gen des herzustellenden rekombinanten Proteins unter die Kontrolle eines Promotors aus einem gram-positiven Organismus, vorzugsweise aus einem der Gattung Bacillus gestellt wird, der dieses Gen natürlicherweise nicht reguliert, und dass ein System aktiv wird, das die äussere Membran der produzierenden Bakterien partiell öffnet. Bevorzugt sind jeweils E. coli oder Klebsiella, Promotoren, welche nicht notwendigerweise von aussen zu induzieren sind, insbesondere konstitutive Promotoren wie der β-Glucanase-Promotor von Bacillus amyloliquefaciens (bgl-Promotor) und das Colicin-System. Dadurch wird das Protein in das umgebende Medium abgegeben, aus dem es einfach aufzureinigen ist. Die fermentative Protein-Produktion kann dadurch effizienter gestaltet werden. Dieses System eignet sich beispielsweise zur Gewinnung von α-Amylasen oder bakteriellen Phytasen.

Description

Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine durch gram-negative Bakterien

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine durch gram-negative Bakterien, insbesondere E. coli oder Klebsiella. Es zeichnet sich dadurch aus, daß die Produkte in das umgebende Medium abgegeben werden und auf diese Weise hohe Expressions- und Produktionsraten erzielt werden können. Dies wird dadurch erreicht, daß das Gen des herzustellenden rekombinanten Proteins unter die Kontrolle eines Promotors aus einem gram-positiven Organismus, vorzugsweise aus einem der Gattung Bacillus gestellt wird, der dieses Gen natürlicherweise nicht reguliert, und daß ein System aktiv wird, das die äußere Membran der produzierenden Bakterien partiell öffnet.

Gram-negative Bakterien, insbesondere Escherichia coli und Klebsiella, werden in der Genetik häufig eingesetzt. Demgegenüber werden für die großtechnische Enzymgewinnung nur in wenigen Fällen gram-negative Organismen verwendet. Dort macht man sich stattdessen zunutze, daß besonders gram-positive Bakterienarten wie Bacillus oder Arthrobacter oder Pilze wie Aspergillus oder Trichoderma natürlicherweise hydroloytische Enzyme wie Cellulasen, Amylasen, Proteasen oder Pektinasen ausscheiden. Diese Enzyme lassen sich deshalb leicht und effizient aus dem jeweiligen Kulturmedium für diese Mikroorganismen gewinnen. Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces werden ebenfalls aufgrund ihrer eigenen Enzyme zur Proteinherstellung genutzt, aber auch deshalb, weil sie genetisch und mikrobiologisch ähnlich einfach wie Bakterien zu handhaben und als Eukaryonten zu den entsprechenden posttranslationalen Modifikationen der Proteine befähigt sind.

Gram-negative Bakterien können über an sich bekannte gentechnische Methoden prinzipiell zur Produktion von eukaryontischen Proteinen wie beispielsweise Insulin verwendet werden. Jedoch besteht dabei das grundlegende Problem, daß die transgen erhaltenen Proteine, nach oftmals korrekter Transkription und Translation im Inneren der Zelle als Aggregate (sogenannte inclusion bodies) vorliegen; oder sie werden, wenn sie die entsprechende, vom Bakterium erkenn- und abspaltbare, N-terminale Signalsequenz aufweisen, durch die innere Membran ins Periplasma, aber nicht noch durch die äußere Membran ins umgebende Kulturmedium transportiert. Deshalb erfordert die herkömmliche Aufreinigung des jeweiligen Produkts aus gram-negativen Bakterien einen Zellaufschluß oder eine Lyse der äußeren Membran und ist dadurch vergleichweise aufwendig und kostenintensiv.

Eine befriedigende Lösung dieses Problems würde gram-negative Bakterien einem breiten, neuen Anwendungsgebiet, nämlich der großtechnischen Proteinherstellung zuführen und erscheint gerade wegen der genetischen Erfahrungen, die man mit diesen Organismen hat, als besonders vorteilhaft und wegen ihrer kurzen Generationszeiten im Vergleich zu eukaryontischen Zellen als wirtschaftliche Alternative.

Das Ausschleusen der hergestellten Proteine in das die Zellen umgebende Medium würde zudem gegenüber der periplasmatischen Lokalisation auch die Bildung von Disulfidbrücken und damit die korrekte Faltung der Proteine (Biotechnology (1991), Vol. 9, S. 545-551; Gene (1992), Vol. 116, S. 129-138) erleichtern und sie somit besser vor einem Wiederabbau durch die produzierenden Zellen schützen (Methods Enzymol. (1990), Vol. 185, S. 166-187; Kresze, G. D., in: Seetharan, S., Sharma, S. K. (Herausgeber), Purification and analysis of recombinant proteins; Dekker, New York, S. 85-120).

Ein Beispiel für wirtschaftlich bedeutende Proteine, für die ein dringender Bedarf nach einer Verbesserung der Herstellverfahren besteht, stellen Phytasen dar. Diese Enzyme (E.C. 3.1.3.26) sind in der Tierzucht von Bedeutung. Sie werden bislang durch Kultivierung der Pilze gewonnen, die sie natürlicherweise produzieren, beispielsweise Aspergillus niger. Allerdings erfordern diese wirtschaftlich ungünstige Kultivierungsbedingungen, beispielsweise weil sie Generationszeiten von bis zu 100 h aufweisen. Mit der Arbeit von Greiner, R. Konietzky, U., Jany, K.-D. von 1993 in Arch. Biochem. Biophys., Vol. 303, S. 107-113, werden erstmalig bakterielle Phytasen, nämlich aus dem gram-negativen Bakterium Escherichia coli beschrieben. Die E. co//-Phytase verfügt demnach über eine vielfach höhere Aktivität als die der bekannten pilzlichen Phytasen. Zudem liegt die Generationszeit von E. coli bei ca. 20% der oben genannten Pilze. Allerdings stellen sich bei der Fermentation von E. coli die oben dargestellten Probleme ein. Nutzung von E. coli zur Produktion dieser £ co//-eigenen Enzyme würde die Herstellung dieser wirtschaftlich bedeutenden Enzyme erheblich effizienter gestalten.

Als ein System, die äußere Membran gram-negativer Bakterien partiell zu öffnen, wurde bereits das BRP (bacteriocin release protein) verwendet. Seine Wirkung besteht darin, heterolog exprimierte Proteine aus dem Periplasma der produzierenden gram-negativen Bakterien ins umgebende Medium auszuschleusen (vergleiche Verweise in Arch. Microbiol. (1997), Vol. ^67: S. 143-150). Ein Nachteil dieses System besteht allerdings darin, daß eine zu starke Zellyse eintreten oder die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigt werden kann.

Ein weiteres membranöffnendes System ist das Colicin-System einiger gram-negativer Bakterien wie Escherichia coli. Diese verfügen natürlicherweise über das Lysis- oder kil- Gen (J. Bacteriol. (1983), Vol. l53, S. 1479-1485), dessen Aktivität zum Absterben führt. In der europäischen Patentanmeldung EP 335567 wurde die Eigenschaft des Kil- Proteins, die äußere Membran gram-negativer Bakterien zu lysieren, eingesetzt. Damit können rekombinante Proteine, die von dem gram-negativen Bakterium gebildet und nach dem bekannten Stand der Technik mithilfe der entsprechenden Signalsequenz ins Periplasma geschleust werden, aus dem Periplasma in das umgebende Nährmedium austreten. Kritisch ist in solch einem System die Aktivität des /(//-Gens selbst. Denn in einer zu hohen Aktivität führt es wie in einer stationären Bakterienkultur zu einer vollständigen Zellyse (J. Bacteriol. (1986), V0I.J68, S. 648-654). So wird es in der zitierten Patentanmeldung unter die Kontrolle starker, induzierbarer Promotoren wie die für lacZ, trp oder Lambda-P_L gestellt. Dadurch wird eine kontrollierte Abgabe (controlled release) erreicht. Die Expression des Transgens wird in der betreffenden Anmeldung nicht individuell reguliert. Sie erfolgt über dieselben Promotoren wie die zur Kontrolle des / //-Gens. Wünschenswert wäre demgegenüber eine kontinuierliche, das Wachstum der Bakterien begleitende Protein-Herstellung und/oder eine für die Produktion ausreichende Abgabe ins Medium.

In der Arbeit „Extracellular production of a hybrid ß-GIucanase from Bacillus by Escherichia coli under different cultivation conditions in shaking cultures and bioreactors" (G. Miksch, R. Neitzel, E. Fiedler, K. Friehs und E. Flaschel (1997), App/. Microbiol. Biotechnol., Vol. 47, S. 120-126) werden Stationärphasen-induzierte E. cσ//-Promotoren (fic und bol A) zur Kontrolle der Expression des /(//-Gens eingesetzt. Als Wirtsorganismus diente Escherichia coli. Die als Indikator-Enzym verwendete ß-Glucanase wurde bei diesen Versuchen unter der Kontrolle ihres eigenen Promotors konstitutiv gebildet und ließ sich aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität im Überstand nachweisen. Es sollte in dieser Studie die Frage geklärt werden, ob überhaupt eine Expression möglich war, wofür ein Gen unter der Kontrolle seines eigenen Promotors einen geeigneten Indikator darstellen kann. Die erzielbare Stärke der Expression und/oder die Menge des gebildeten Proteins standen nicht im Interesse dieser Arbeit. Eine Verwendung gerade dieses Promotors zur Expression eines anderen Gens, insbesondere zu dessen großtechnischer Produktion konnte hiermit noch nicht in Erwägung gezogen werden.

In der Tat handelte es sich in dieser Arbeit um eine Hybridglucanase, das heißt einem zu gleichen Teilen aus den beiden ß-Glucanasen aus Bacillus macerans und ß. amyloliquefaciens zusammengesetzten Enzym (Borriss et al., Carlsberg. Res. Commun., Vol. 54 (1989), S. 41-54); die N-terminale Hälfte war die der ß-Glucanase aus Bacillus amyloliquefaciens und die C-terminale Hälfte die der ß-Glucanase aus B. macerans. Diese beiden Proteine weisen auf Aminosäure-Ebene 70% Identität auf. Somit hat in der genannten Arbeit das betreffende Gen wenigstens teilweise unter der Kontrolle seines eigenen Promotors gestanden; insbesondere war der Übergang des Promotorbereichs zum proteincodierenden Teil mit der in Vo-Situation identisch. Wenigstens muß von hochhomologen Enzymen gesprochen werden.

Bei Klebsiella planticola (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999), 51 627 - 632) war der entsprechende Versuch mit dem fic-Promotor für das /(//-Gen und dem όg/-Promotor für dasselbe Nachweisenzym ebenfalls erfolgreich. Auch hier stand das Transgen also wieder unter der Kontrolle eines Promotors, der natürlicherweise zum Teil dasselbe, oder wenigstens ein hochhomologes Protein reguliert. Auch hier konnten sowohl die Produktbildung als auch die Produktsekretion gegenüber der nicht-M-exprimierenden Kontrolle erhöht werden.

Auch in dem Fall der Anmeldung DE 19823216 ist dasselbe Indikator-Enzym in K. planticola exprimiert worden, und zwar wiederum unter der Kontrolle des Promotors der ß-Glucanase aus Bacillus amyloliquefaciens. Die Sekretion ist durch das Kil-System ermöglicht worden. Von G. Miksch, E. Fiedler, P. Dobrowolski und K. Friehs wurde in der Veröffentlichung „The kil gene of the ColE1 plasmid of Escherichia coli controlled by a growth-phase- dependent promoter mediates the secretion of a heterologous periplasmic protein during the stationary phase" (Arch. Microbiol. (1997), Vol.167, S. 143-150) wiederum die heterologe Proteinexpression in E. coli untersucht. Darin wurde gezeigt, daß sich der Promotor des f/c-Gens (filamentation induced by cAMP) aus E. coli zur Regulation der Expression des Kil-Proteins eignet, wenn gleichzeitig das Indikator-Enzym unter der Kontrolle seines eigenen natürlichen Promotors konstitutiv gebildet wird. Auch hier diente also wiederum die Hybrid-Glucanase als Indikator-Enzym. Damit erhöht sich die Produktbildung gegenüber der Kontrolle ohne Kil-Aktivität, aber mit der gleichen konstitutiven Produktion des Indikator-Enzyms.

Für die heterologe Proteinexpression durch den Wirtsorganismus Acetobacter methanolicus (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1997), Vol.47, 530-536) wurden sowohl das /(//-Gen als auch das Transgen (wiederum die Hybrid-Glucanase) vom Stationärphasen- spezifischen //c-Promotor reguliert.

All diese Versuche waren darauf ausgerichtet, das Colicin-System in den verschiedenen Wirtsbakterien zu etablieren, beziehungsweise geeignete Bedingungen zu finden, unter denen Transgen gebildet und ausgeschleust werden kann, ohne daß die Zellen durch die Aktivität des Kil-Proteins absterben. Dabei bewirkte die Sekretion eine Steigerung der Expression, also eine Erhöhung der Produktbildungsrate. Für Klebsiella führte das Ausschleusen des gebildeten Proteins überhaupt erst zu seiner Überexpression. Denn normalerweise eignet sich dieser Organismus nicht zur heterologen Protein-Expression. Allerdings wurden für jeden dieser Fälle zur Kontrolle des Transgens, das aus den Genen von gram-positiven Organismen abgeleitet worden war, Promotoren eingesetzt, die dieses Gen zum Teil oder ein hochhomologes Gen natürlicherweise regulieren. Aufgrund dieser Ergebnisse ist nicht ohne weiteres davon auszugehen, daß in einem vergleichbaren Kontext auch eine solche Expression erfolgreich sein kann, bei der das herzustellende Protein unter der Kontrolle eines Promotors steht, der nicht dieses Gen und kein hochhomologes Gen, sondern ein ganz anderes Gen natürlicherweise reguliert.

Das Gen der ß-Glucanase aus Bacillus amyloliquefaciens ist ein geläufiger Indikator für die Aktivität anderer Promotoren. Die Verwendung des ß-Glucanase-Promotors (bgl- Promotor) selbst zur kontrollierten Expression rekombinanter Proteine ist dagegen nicht geläufig, insbesondere nicht für den Fall, daß es sich um Proteine handelt, die natürlicherweise nicht von ihm selbst reguliert werden oder zu diesen hochhomolog sind (siehe oben; vergleiche Borriss et al., Carlsberg. Res. Commun., Vol.54 (1989), S. 41- 54). Dieser Promotor ist konstitutiv, das heißt, er muß nicht durch Einwirken von außen gezielt aktiviert werden. Demgegenüber werden im Stand der Technik bislang gezielt zu aktivierende Promotoren zur heterologen Proteinexpression genutzt. Beispiele hierfür sind die durch Zugabe entsprechender Chemikalien induzierbaren Promotoren P_/acZ und P_tφ oder der durch Temperatur-Erhöhung zu induzierende Promotor P aus dem Bakteriophagen Lambda (EP 335567).

Vor diesem Hintergrund stellte sich für die vorliegende Anmeldung die Aufgabe, ein System zu etablieren, nach welchem rekombinante Proteine in hoher Ausbeute aus dem Kultur-Überstand während oder nach der Fermentation von gram-negativen Bakterien gewonnen werden können.

Eine Teilaufgabe bestand darin, ein System zu finden, welches die äußere Membran der gram-negativen Bakterien partiell öffnet, ohne daß der Großteil der produzierenden Bakterien vollständig lysiert und abstirbt.

Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung bestand darin, einen in Gegenwart eines funktionierenden Colicin-Systems möglichst leistungsfähigen Promotor für die Regulation heterologer Gene zu finden. Besonders günstig für eine effiziente Produktion wäre der Einsatz eines Promotors, der nicht notwendigerweise von außen, im Verlauf der Produktion induziert zu werden braucht.

Diese Aufgaben werden erfindungsgemäß durch solche Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine durch gram-negative Bakterien gelöst, nach denen die Proteine mithilfe eines die äußere Membran dieser Bakterien partiell öffnenden Systems zumindest teilweise in das die Bakterien umgebende Medium abgegeben werden, und die weiterhin dadurch gekennzeichnet sind, daß das herzustellende rekombinante Protein unter der Kontrolle eines Promotors aus einem gram-positiven Organismus, vorzugsweise aus einem der Gattung Bacillus exprimiert wird, der das zugehörige Gen oder ein zu diesem hochhomologes Gen natürlicherweise nicht reguliert. Damit werden auch gram-negative Bakterien der großtechnischen Proteinherstellung zugänglich gemacht und somit der Stand der Technik um alternative Produktionssysteme bereichert. Diese alternativen Produktionssysteme sind deshalb besonders vorteilhaft, weil für sie im Labormaßstab hinsichtlich ihrer Genetik, ihrer Mikrobiologie und ihrem biotechnologischen Potential ein reichhaltiger Erfahrungsschatz zur Verfügung steht.

Beispielsweise gegenüber Pilzen werden mit gram-negativen Organismen kürzere Generationszeiten erzielt und damit eine insgesamt kostengünstigere Produktion erreicht. Ein weiterer Vorteil dieser Erfindung besteht darin, daß damit Proteine aus gram-negativen Organismen von diesen selbst in großtechnischem Maßstab hergestellt werden können. Es ist nicht länger notwendig, hierfür auf gram-positive oder andere Expressionssysteme auszuweichen. Damit werden die hierfür von der Evolution hervorgebrachten optimalen Verhältnisse genutzt, beispielsweise was den Transkriptions- und Translationsapparat oder die Codon-Usage betrifft.

Der erste Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins durch gram-negative Bakterien, welches mithilfe eines die äußere Membran dieser Bakterien partiell öffnenden Systems zumindest teilweise in das die Bakterien umgebende Medium abgegeben wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das herzustellende rekombinante Protein unter der Kontrolle eines Promotors aus einem gram-positiven Organismus, vorzugsweise aus einem der Gattung Bacillus exprimiert wird, der das zugehörige Gen oder ein zu diesem hochhomologes Gen natürlicherweise nicht reguliert.

Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands sind entsprechende Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich bei den gram-negativen Bakterien um coliforme Bakterien handelt, insbesondere um solche der Gattungen Escherichia coli oder Klebsiella; daß es sich bei den coliformen Bakterien um Derivate von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, ganz besonders um solche der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5 , E.coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf) handelt; und/oder daß es sich bei dem Mikroorganismus um den unter der Anmeldenummer DSM 14225 hinterlegten Stamm oder um ein Derivat dieses Stammes handelt.

Weitere Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands sind entsprechende Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich bei dem die äußere Membran partiell öffnenden Systems um das Colicin-System aus E. coli handelt, insbesondere um das Kil-Protein und/oder um ein unter der Kontrolle des //c-Promotors oder eines anderen Stationärphasen-Promotors stehendes System.

Weitere Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands sind entsprechende Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich bei dem Expressions-Promotor um einen nicht notwendigerweise von außen zu induzierenden Promotor, vorzugsweise um einen konstitutiven Promotor und besonders bevorzugt um den ß-Glucanase- Promotor von Bacillus amyloliquefaciens handelt.

Weitere Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands sind entsprechende Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Sekretionskompetenz über eine Sekretionskassette vermittelt wird, insbesondere eine, die ins Chromosom integriert vorliegt; daß die Expressionskassette auf einem anderen Replikon als die Sekretionskassette liegt; daß die Expressionskassette auf demselben Replikon wie die Sekretionskassette liegt, insbesondere in der Form, daß die Expressionskassette der Sekretionskassette unmittelbar vor oder nachgeschaltet ist; und/oder daß die Expressionskassette und die Sekretionskassette auf einem autonom replizierenden Plasmid vorliegen, das autonom replizieren kann, vorzugsweise auf demselben Plasmid.

Weitere Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands sind entsprechende Verfahren, die dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, hierunter insbesondere um eine Hydrolase, insbesondere eine Amylase, Glucanase, Protease, Lipase oder Cellulase; daß als rekombinante Proteine Phytasen, insbesondere bakterielle Phytasen hergestellt werden; daß zur Sekretion der Phytase das /(//-Gen von E. coli unter der Kontrolle eines Stationärphasenpromotors von E. coli, vorzugsweise des f/c-Promotors verwendet wird; daß das membranöffnende System, insbesondere das -Gen über eine Sekretionskassette bereitgestellt wird; daß das Gen der Phytase unter der Kontrolle des ß-Glucanase-Promotors von Bacillus amyloliquefaciens steht; daß als Wirtsstamm Escherichia coli BL21 (DE3) verwendet wird; und/oder daß als Expressionsvektoren die Vektoren pPhyt109 oder pPhyt119/4 oder von diesen abgeleitete Vektoren verwendet werden.

Den zweiten Erfindungsgegenstand bilden Sekretionskassetten, welche die für die Membran-öffnenden Eigenschaften des Membran-öffnenden Systems verantwortlichen genetischen Elemente besitzen, insbesondere das Colicin-System aus £ coli und/oder einen Stationärphasenpromotor, ganz besonders das Gen für das Kil-Protein und/oder einen Stationärphasenpromotor aus £ coli, hierunter besonders den f/c-Promotor.

Weitere Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands sind entsprechende Sekretionskassetten, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie unmittelbar vor- oder nachgeschaltet zusätzlich eine Expressionskassette enthalten, die das Transgen und einen Promotor als dessen Kontrollelement enthalten, hierunter insbesondere einen nicht notwendigerweise von außen zu induzierenden Promotor, vorzugsweise einen konstitutiven Promotor und besonders bevorzugt den ß-Glucanase-Promotor von Bacillus amyloliquefaciens; und/oder daß sie als Transgen das Gen für ein Enzym enthalten, vorzugsweise das einer Hydrolase, insbesondere das einer Amylase, Glucanase, Protease, Lipase oder Cellulase oder das einer bakteriellen Phytase.

Den dritten Erfindungsgegenstand bilden Vektoren, die in gram-negativen Bakterien replizieren können, die eine Sekretionskassette nach dem zweiten Erfindungsgegenstand enthalten, insbesondere solche, die zusätzlich die Expressionskassette enthalten. Weitere Ausführungsformen dieses

Erfindungsgegenstands sind entsprechende Expressionsvektoren für gram-negative Bakterien, insbesondere für coliforme Bakterien, hierunter insbesondere für solche der Spezies Escherichia coli oder Klebsiella, ganz besonders einen der Vektoren pAmy63, pPhyt 109 oder pPhytl 19/4 oder solche, die sich von einem dieser Vektoren ableiten lassen, insbesondere durch Austausch des zu exprimierenden Gens; und/oder Klonierungsvektoren mit einer Sekretionskassette nach dem zweiten Erfindungsgegenstand.

Den vierten Erfindungsgegenstand bilden gram-negative Bakterienstämme, die in vektorieller Lokalisation eine Sekretionskassette nach dem zweiten Erfindungsgegenstand tragen, insbesondere coliforme Bakterienstämme, ganz besonders der Gattungen Escherichia coli oder Klebsiella und hierunter insbesondere Derivate von £ coli K12, £ coli B oder Klebsiella platicola. Hierunter sind wiederum diejenigen bevorzugt, die sich von £ coli BL21 (DE3), £ coli RV308, £ coli DH5α, £ coli JM109, £ coli XL-1 oder von Klebsiella platicola (Rf) oder von dem unter der Anmeldenummer DSM 14225 hinterlegten Stamm ableiten.

Weitere Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands sind entsprechende Bakterienstämme, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie einen Expressionsvektor mit einem Promotor und ein von diesem Promotor reguliertes Gen enthalten; und/oder daß sie nach Transformation mit einem der Vektoren nach dem dritten Erfindungsgegenstand erhalten worden sind.

Diesem Erfindungsgegenstand werden auch alle Bakterienstämme zugerechnet, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie in chromosomaler Lokalisation eine Sekretionskassette nach dem zweiten Erfindungsgegenstand tragen, insbesondere coliforme Bakterien, und hierunter insbesondere Stämme von Escherichia coli oder Klebsiella, vorzugsweise von Derivaten von Escherichia coli K12 oder Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, ganz besonders von solchen der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), £ coli RV308, £ coli DH5α, E.coli JM109, £ coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf) und hierunter insbesondere von solchen des unter der Anmeldenummer DSM 14225 hinterlegten Stammes; und/oder daß sie das rekombinante Protein unter der Kontrolle eines nicht notwendigerweise von außen zu induzierenden Promotors, vorzugsweise eines konstitutiven Promotors und besonders bevorzugt des ß-Glucanase- Promotors von Bacillus amyloliquefaciens (bgl-Promotoή exprimieren. Hierunter besonders bevorzugt sind Derivate des unter der Anmeldenummer DSM 14225 hinterlegten Mikroorganismus. Eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellen Mikroorganismen dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie nach Transformation mit einem der Vektoren nach dem dritten Erfindungsgegenstand erhalten worden sind.

Den fünften Erfindungsgegenstand bilden Verfahren zur Fermentation von gramnegativen Bakterien, die ein rekombinantes Protein produzieren, welches mithilfe eines die äußere Membran dieser Bakterien partiell öffnenden Systems zumindest teilweise in das die Bakterien umgebende Medium abgegeben wird, die dadurch gekennzeichnet sind, daß das rekombinante Protein unter der Kontrolle eines Promotors aus einem gram-positiven Organismus, vorzugsweise aus einem der Gattung Bacillus exprimiert wird, der das zugehörige Gen oder ein zu diesem hochhomologes Gen natürlicherweise nicht reguliert. Diesem Erfindungsgegenstand werden entsprechende Verfahren zugerechnet, die dadurch gekennzeichnet sind, daß Bakterien nach dem vierten Erfindungsgegenstand eingesetzt werden; daß die Fermentation über eine Zulaufstrategie durchgeführt wird; daß das hergestellte Protein nachträglich aus dem Fermentationsmedium geerntet wird; und/oder daß das hergestellte Protein kontinuierlich während der Fermentation entnommen wird.

Die Beispiele der vorliegenden Anmeldung illustrieren, wie die Erfindungsgegenstände, insbesondere erfindungsgemäße Verfahren verwirklicht werden können. Vor allem verdeutlichen sie die Konstruktion entprechender Sekretionsstämme, bei denen die verantwortlichen Gene in plasmidaler oder chromosomaler Lokalisation vorliegen können. Jedes Beispiel ist aufgrund dieser Angaben prinzipiell nacharbeitbar. Bei Erzeugung eines Bakterienstammes mit chromosomaler Lokalisation der betreffenden genetischen Elemente kann man jedoch nicht vorhersagen, in welche Position des Chromosoms die betreffenden Elemente rekombinieren. Möglicherweise können dadurch essentielle Gene beeinträchtigt werden und damit nicht oder nur schlecht lebensfähige Rekombinanten erhalten werden. Aus diesem Grunde wurde ein gemäß dieser Beispiele erfolgreich rekombinierter Bakterienstamm bei einer Stammsammlung hinterlegt.

Gemäß Beispiel 3 der vorliegenden Anmeldung und gemäß Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999), Vol. 51, S. 627-632 konnte ein Klebsiella-Stamm mit chromosomaler Lage der Sekretionskassette erhalten werden. Es handelt sich dabei um Klebsiella planticola (Rf)- FIC3/19. Dieser Stamm zeichnet sich dadurch aus, daß er das zur erfindungsgemäßen Sekretion verwendbare Transposon Tn5-FIC3 als chromosomale Integration trägt.

Er ist am 09.04.2001 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, nach den Regeln des Budapester Übereinkommen vom 28.4.1977 hinterlegt worden. Er trägt die Hinterlegungsnummer DSM 14225.

Ziel der vorliegenden Anmeldung ist es, die Produktion wirtschaftlich interessanter Proteine als rekombinante Proteine durch gram-negative Bakterien zu verbessern. Unter rekombinanten Proteinen im Sinne der vorliegenden Erfindung können sowohl heterolog als auch homolog exprimierte Proteine verstanden werden; im ersten Fall werden Proteine hergestellt, die von dem als Produzentenstamm eingesetzten Wirtsbakterium natürlicherweise nicht gebildet werden; im zweiten Fall solche, die aus dem Wirtsbakterium selbst stammen.

Ein für ein erfindungsgemäß herzustellendes rekombinantes Protein codierendes Gen wird im Sinne der vorliegenden Anmeldung als Transgen bezeichnet, ungeachtet der Tatsache, daß es sich streng genommen bei jedem in die Wirtzellen eingebrachten genetischen Element um ein Transgen handelt.

Grundsätzlich bezieht sich die vorliegende Erfindung auf alle Arten von Proteinen. Voraussetzung ist allerdings, daß sie eine N-terminale Signalsequenz enthalten, die im normalen bakteriellen Proteinsynthese-Verlauf für eine periplasmatische Lokalisation sorgt. Diese Lokalisation ist eine Voraussetzung dafür, daß die rekombinanten Proteine erfindungsgemäß sekretiert werden können.

Unter Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine sind erfindungsgemäß alle gentechnischen oder mikrobiologischen Verfahren zu verstehen, die darauf beruhen, daß die Gene für die interessierenden Proteine in einen für die Produktion geeigneten Wirtsorganismus eingebracht und von diesem transkribiert und translatiert werden. Geeigneterweise erfolgt die Einschleusung der betreffenden Gene über Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren. Sie kann aber auch über solche Vektoren erfolgen, die bewirken, daß das interessierende Gen im Wirtsorganismus in ein bereits vorhandenes genetisches Element wie das Chromosom oder andere Vektoren eingefügt werden kann. Die funktioneile Einheit aus Gen und Promotor und eventuellen weiteren genetischen Elementen wird erfindungsgemäß als Expressionskassette bezeichnet. Sie muß dafür jedoch nicht notwendigerweise auch als physische Einheit vorliegen.

Die zur Produktion geeigneten Mikroorganismen werden in an sich bekannter Weise kultiviert und fermentiert, beispielsweise in diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Systemen. Im ersten Fall wird ein geeignetes Nährmedium mit den rekombinanten Bakterienstämmen beimpft und das Produkt nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium geerntet. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen eines Fließgleichgewichts aus, in dem über einen vergleichsweise langen Zeitraum Zellen teilweise absterben aber auch nachwachsen und gleichzeitig Produkt aus dem Medium entnommen werden kann.

Ein die äußere Membran der als Wirtszellen ausgewählten gram-negativen Bakterien partiell öffnendes System ermöglicht, daß die gebildeten Proteine, insbesondere die rekombinant hergestellten zumindest teilweise aus den Wirtsbakterien in das umgebende Medium austreten.

Die Abgabe von Proteinen in das die Bakterien umgebende Medium wird im Sinne der vorliegenden Erfindung als Sekretion bezeichnet, ungeachtet des biochemischen Mechanismus, der diesem Austritt zugrundeliegt. Dieser Begriff ist somit nicht auf die Prozesse beschränkt, die natürlicherweise im Zusammenhang mit der Proteinsynthese als Translokation durch die jeweiligen Membranen bezeichnet werden. Erfindungsgemäß eingesetzte, die äußere Membran gram-negativer Bakterien partiell öffnende Systeme bereichern ein bakterielles Expressionssystem um die Fähigkeit zum unspezifischen, das heißt nicht auf die Identität der Proteine bezogenen Ausschleusen der Produkte in das diese Bakterienzellen umgebende Medium.

Die hierfür wirksamen Faktoren dürfen jedoch nicht so aktiv sein, daß die Zellen vollständig lysiert werden und zu einem Großteil absterben. Beispiele hierfür sind das BRP (bacteriocin release protein; in Arch. Microbiol. (1997), Vol. ^67: S. 143-150) oder das im Rahmen des Colicin-Systems bekannte Kil-Protein (J. Bacteriol. (1986), Vol.168, S. 648-654).

Die die Sekretionskompetenz vermittelnde funktionelle Einheit, welche nicht notwendigerweise auch physisch eine Einheit bilden muß, wird als Sekretionskassette bezeichnet. Die erfindungsgemäße Protein-Herstellung ist dann möglich, wenn innerhalb derselben Bakterienzelle die Expressionsfunktion und die Sekretionskompetenz vorliegen und gleichzeitig aktiv sind, das heißt wenn der betreffende Produktionsstamm die beiden genetischen Eigenschaften Expression und Sekretion in sich vereint.

Aus dem umgebenden Medium können die interessierenden Proteine in an sich bekannter Weise während oder nach der Fermentation mit geringerem Aufwand gewonnen werden, als wenn das Produkt aus dem Bakteriencytoplasma oder dem Periplasma aufgereinigt werden müßte. Mögliche Techniken zur Aufreinigung des Proteins aus dem Medium sind beispielsweise Filtration, Zentrifugation, Ammoniumsulfatpräzipitation, Gel-, lonenaustausch- oder Affinitätschromatographie.

Neben der leichten Gewinnbarkeit besteht ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung darin, daß das Protein durch den sich über einen langen Zeitraum erstreckenden Austritt beständig dem Protein-synthetisierenden Apparat der Zelle entzogen wird und sich somit nicht im Inneren der Zelle anreichert. Ohne an diese Theorie gebunden zu sein, kann man vermuten, daß der Syntheseapparat dadurch fern eines chemischen Gleichgewichts gehalten wird, so daß die Produktion über längere Zeit andauert und insgesamt eine hohe Ausbeute erzielt wird.

Die Verwendung von Promotoren aus gram-positiven Organismen, vorzugsweise aus einem der Gattung Bacillus sorgt für die Einleitung der Proteinsynthese, vorteilhafterweise für Expressionsraten, die über der Expressionsrate liegen, die das betreffende Gen unter der Kontrolle seines eigenen konstitutiven Promotors erfährt. Zunehmend bevorzugt sind Expressions-Promotoren, mit denen zunehmend höhere Expressionsraten erzielt werden können. Dieser positive Effekt wird durch den regulierten Austritt des gebildeten Produkts in das umgebende Medium zusätzlich gesteigert. Welche Promotoren im Einzelfall geeignet sind, muß jeweils experimentell ermittelt werden. Derartige Variationen können anhand des Vorgehens in Beispiel 1 der vorliegenden Anmeldung nachvollzogen werden. Überraschenderweise konnte gefunden werden, daß Promotoren aus gram-positiven Bakterien dafür besonders geeignet sind.

Zur Realisierung der vorliegenden Erfindung werden Promotoren eingesetzt, die zusätzlich die Eigenschaft besitzen, das Transgen oder ein zu diesem hochhomologes Gen natürlicherweise nicht zu regulieren. Denn dies scheint überraschenderweise im Zusammenspiel mit dem partiell membranöffnenden System eine besonders gute Produktionsrate zu ermöglichen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich somit auf Expressionskassetten mit Promotoren aus gram-positiven Organismen und Transgenen, die zu den von diesen Promotoren natürlicherweise regulierten Genen auf Aminosäure- Ebene Identitäten von weniger als 70% und zunehmend bevorzugt von weniger als 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25% und 20% aufweisen. Dies gilt insbesondere für die N-terminalen Bereiche der betreffenden Gene und für den Übergangsbereich des Promotors zum Start-Codon. Das erfindungsgemäße Verfahren bezieht sich auf gram-negative Bakterien, weil diese über ein Periplasma verfügen. Eben bei diesen hatte sich das Problem gestellt, daß rekombinante Proteine in nur unzureichendem Maß sekretiert werden und diese Organismen somit für die großtechnische Proteinherstellung nur unzureichend zur Verfügung stehen.

Aufgrund der weitreichenden Erfahrungen, die man beispielsweise hinsichtlich der molekularbiologischen Methoden und der Kultivierbarkeit mit coliformen Bakterien hat, stellen diese bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Besonders bevorzugt sind solche der Gattungen Escherichia coli oder Klebsiella, insbesondere nichtpathogene, für die biotechnologische Produktion geeignete Stämme. An repräsentativen Vertretern dieser Gattungen wird in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung das erfindungsgemäße Verfahren vor Augen geführt.

Repräsentative Vertreter dieser Gattungen sind die K12-Derivate und die B-Stämme von Escherichia coli und die Spezies Klebsiella planticola. Stämme, die sich nach an sich bekannten genetischen und/oder mikrobiologischen Methoden von diesen ableiten lassen, und somit als deren Derivate angesehen werden können, besitzen für genetische und mikrobiologische Arbeiten die größte Bedeutung und werden vorzugsweise zur Entwicklung erfindungsgemäßer Verfahren eingesetzt. Solche Derivate können beispielsweise über Deletions- oder Insertionsmutagenese hinsichtlich ihrer Anforderungen an die Kulturbedingungen verändert sein, andere oder zusätzliche Selektionsmarker aufweisen oder andere oder zusätzliche Proteine exprimieren. Es kann sich insbesondere um solche Derivate handeln, die zusätzlich zu dem erfindungsgemäß hergestellten Protein weitere wirtschaftlich interessante Proteine exprimieren.

K12-Derivate sind in einer Vielzahl erhältlich, beispielsweise £ coli XL-1 blue, £ coli JM109 (beide Fa. Stratagene, La Jolla, USA) oder £ coli DH5α (Fa. ClonTech, Palo Alto, USA). Unter den B-Stämmen ist besonders der Stamm £ coli BL21 (DE3) (Fa. Stratagene, La Jolla, USA; und Fa. Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) zu nennen. Er bildet aufgrund der /on-Mutation keine extrazellulären Proteasen und trägt chromosomal integriert das Element D£3 als Voraussetzung für das Funktionieren eines eventuell hineinklonierten 77-Promotors. Er wird im Stand der Technik für eine Vielzahl von Klonierungen eingesetzt. Als weitere Ausgangsstämme für erfindungsgemäße Derivatisierungen sind die Stämme £ coli RV308, £ coli DH5α, E.coli JM109, £ co7 XL-1 und K. planticola (Rf) bevorzugt.

Der Stamm £ co/7 RV308 (ATCC 31608) im Hans-Knöll-Institut für Naturstoff-Forschung in Jena getestet und ist in J. Mol. Bioi, Vol. JK39 (1980), S. 147-161 beschrieben. Er zeichnet sich dadurch aus, daß er kein Acetat bildet (Appl. Microbiol. Biotechnol, Vol.46 (1996), S. 524-532), welches das Wachstum der Bakterien während der Fermentation beeinträchtigen kann.

Bei Klebsiella planticola (Rf) handelt es sich um einen durch spontane Mutation aus Klebsiella planticola hervorgegangenen, Rifamycin-resistenten Stamm (Appl. Microbiol. Biotechnol, Vol. 5_ (1999), S. 627-632). Damit ergibt sich für die molekularbiologische Handhabung und die Fermentation der Vorteil, daß mit diesem Antibiotikium selektiert, beziehungsweise die Kultur vor Infektionen geschützt werden kann.

Die genannten Stämme werden in der Genetik und Mikrobiologie häufig eingesetzt und werden von kommerziellen Anbietern vertrieben (siehe oben). Sie besitzen somit als Ausgangspunkte für die Entwicklung weiterer erfindungsgemäßer Bakterienstämme besondere Bedeutung.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem die äußere Membran partiell öffnenden Systems um das Colicin-System aus £ coli, insbesondere um das Kil- Protein.

Colicine sind die von bestimmten pathogenen Stämmen coliformer Bakterien synthetisierten Polypeptide mit bacteriociner Wirkung. Sie werden zumeist von Plasmiden (den sogenannten Col-Faktoren) codiert, lassen sich aber erst durch die Aktivität sogenannter Transfer- oder Mobilitätsgene (mob) durch Bakterien-Konjugation auf andere Bakterien übertragen (Typ I Col-Faktoren). Typ Il-Col-Faktoren tragen in der Regel selbst Transfergene, sind also mithilfe der von ihnen selbst codierten Genprodukte übertragbar. Col-Faktoren können in das Bakterienchromosom integrieren. Unter den für die Eigenschaften von Col-Faktoren verantwortlichen Genen befindet sich im selben Operon, neben denen für das Colicin selbst (cea) und dem für die Immunität verantwortlichen Gen (imm) auch das Lysis- oder -Gen (J. Bacteriol. (1983), Vol. 153, S. 1479-1485). Dieses codiert für ein kleines Lipoprotein, welches membranständige Phospholipasen (Phospholipase A2) aktiviert und zu einer Durchlässigkeit der Membran für die Colicine und damit letztlich zur Lyse der Membran führt (EMBO J., VoI._3 (1984), S. 2393-2397).

Das eine Abgabe von Produkt oder von Zeilinhaltsstoffen bewirkende Kil-Protein und/ oder das zugehörige Gen oder ein anderes aus dem Zusammenspiel mit Colicinen bekanntes gleichwirkendes Element werden in der vorliegenden Erfindung zusammenfassend als Colicin-System bezeichnet. Sie ermöglichen eine Sekretion im Sinne der vorliegenden Erfindung, das heißt sie öffnen die äußere Membran gramnegativer Bakterien partiell und bereichern bakterielle Expressionssysteme um die Fähigkeit zum unspezifischen, das heißt nicht auf die Identität der Proteine bezogenen Ausschleusen der Produkte.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein anderes membranöffnendes System, beispielsweise ein anderes BRP (bacteriocin release protein) unter seinem eigenen Promotor wirksam oder vorzugsweise unter die Kontrolle des f/c-Promotors gestellt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren steht das die Ausschleusung bewirkende Kil-Protein unter der Kontrolle eines Promotors, der nicht durch Eingriff von außen induziert zu werden braucht, vorzugsweise unter der Kontrolle seines eigenen, natürlichen Promotors (ft^'c-Promotor) und/oder eines aus dem zur Herstellung eingesetzten Organismus. Überraschenderweise ist dabei die Lysis-Rate der transgenen Bakterienzellen so niedrig, daß nur ein Teil der Zellen vollständig lysiert wird und abstirbt. Der andere Teil lebt jedoch weiter, produziert das interessierende Protein und schleust es durch die vom Kil- Protein erzeugten Poren in das umgebende Nährmedium aus.

Eine weitere Möglichkeit besteht darin, das Kil-Protein, ein anderes BRP oder ein anderes membranöffnendes System unter die Kontrolle eines anderen Stationär- Phasen-Promotors zu stellen. Dieser kann schwächer oder stärker sein als der fic- Promotor oder geringfügig früher oder später oder unter anderen Umweltbedingungen aktiviert werden. Dadurch wird eine Feinabstimmung hinsichtlich des sensiblen Gleichgewichts zwischen Zelllyse und Freisetzung der erwünschten Proteine ermöglicht. Bevorzugte Ausführungsformen sind durch Promotoren für die Expression des zu produzierenden Proteins gekennzeichnet, die nicht notwendigerweise von außen induziert werden müssen. Induzierbar bedeutet in diesem Zusammenhang: gezielt von außen, beispielsweise während einer laufenden Fermentation an- oder abzuschalten; dies erfolgt durch gezieltes menschliches Einwirken, beispielsweise durch Zugabe von Chemikalien oder durch Änderung der Inkubationsbedingungen wie beispielsweise der Temperatur (vergleiche EP 335567). Für die vorliegende Erfindung sind unter den nicht notwendigerweise von außen zu induzierenden Promotoren konstitutive Promotoren bevorzugt. Diese werden von den Bakterien selbst im Verlauf ihres Wachstums und/oder der Fermentation reguliert. Sie müssen insbesondere nicht zu einem bestimmten Zeitpunkt durch einen gezielten Eingriff von außen aktiviert werden, was die Durchführung der fermentativen Produktion wesentlich vereinfacht. Die Möglichkeit, diesen Promotor über seine natürliche Regulation hinaus trotzdem durch einen menschlichen Eingriff gezielt zu induzieren, wird dadurch jedoch nicht ausgeschlossen, sondern stellt eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar. Ganz besonders bevorzugt ist der ß-Glucanase-Promotor von Bacillus amyloliquefaciens (bgl- Promotor).

Im Einzelfall können bekannte Promotoren auf ihre Einsatzmöglichkeit in erfindungsgemäßen Verfahren und ihre Produktbildung getestet werden. Solche Testreihen sind dem Fachmann prinzipiell vertraut. Derartige Promotoren können über molekularbiologische Methoden, wie beispielsweise über PCR aus chromosomaler oder plasmidaler DNA amplifiziert und in an sich bekannte Vektoren eingefügt werden. Ihre Aktivität ist bestimmbar, indem der betreffende Vektor in Abhängigkeit von diesem Promotor das gewünschte Transgen, oder ein Indikatorgen trägt, dessen Aktivität quantifizierbar ist. Solch ein Vorgehen wird in Beispiel 1 der vorliegenden Anmeldung beschrieben.

Unter einer Sekretionskassette wird erfindungsgemäß ein genetisches Element verstanden, das die Fähigkeit zur erfindungsgemäßen Sekretion vermittelt. Sie enthält somit mindestens das Gen für den oder die Faktoren, die das membranöffnende System darstellen, geeigneterweise unter der Kontrolle eines Promotors. Hierbei kann es sich beispielsweise um einen Stationärphasenpromotor handeln. Günstigerweise enthält die Sekretionskassette zusätzlich einen Selektionsmarker, beispielsweise eine Antibiotikumresistenz und Randsequenzen wie seltene Restriktionsschnittsteien oder von Tansposons abgeleitete inverted repeats, um die Excision und die Rekombination der Sekretionskassette zu erleichtern.

Bevorzugt sind Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, bei denen die Sekretionskompetenz über eine solche Sekretionskassette vermittelt wird. Denn diese kann als eigenes Element beispielsweise auf Klonierungsvektoren gentechnisch bearbeitet werden und in verschiedene Wirtszellen übertragen werden.

Bevorzugt sind solche Ausführungsformen, bei denen die Sekretionskassette ins Chromosom integriert vorliegt. Denn solche sekretionskompetenten Stämme können zur Produktion verschiedener Proteine oder zu Expressions-Promotor-Studien genutzt werden, indem sie nur noch mit dem jeweiligen Expressionsvektor transformiert werden zu brauchen. Die Sekretionskompetenz wird bei ihnen bereits vom Chromosom zur Verfügung gestellt. Ein Beispiel hierfür stellt der in Beispiel 3 der vorliegenden Anmeldung beschriebene Stamm Klebsiella planticola (Rf)-FIC/19 dar.

Im zuletzt genannten Fall liegen die aus Promotor und Transgen gebildete Expressionskassette und die Sekretionskassette auf verschiedenen Replikon. Dies ermöglicht eine flexible Arbeitsweise, beispielsweise zur Umstellung des Produktionssystems auf andere Zielproteine, indem lediglich die Expressionskassette ausgetauscht oder innerhalb der Expressionskassette ein anderes und/oder ein weiteres Gen und/oder ein anderer Promotor eingefügt werden. Analog kann es auch wünschenswert sein, an der Sekretionskassette Veränderungen vorzunehmen, beispielsweise zur Feinregulation des Zeitpunktes oder des Ausmaßes der Öffnung der äußeren Membran.

Besonders bevorzugt sind Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Expressionskassette auf demselben Replikon wie die Sekretionskassette liegt. Damit kann sowohl die chromosomale als auch die plasmidale Lage gemeint sein. Bei chromosomaler Lage kann grundsätzlich von einer über viele Generationen hinweg stabilieren Integration ausgegangen werden. Die plasmidale Lage ermöglicht eine Variation, insbesondere Erhöhung der Kopienzahl der betreffenden Kassetten und kann somit eine hohe Ausbeute bewirken. In beiden Fällen liegen beide Elemente in gleicher Kopienzahl vor und können gentechnisch gemeinsam bearbeitet, zum Beispiel ausgeschnitten und auf ein anderes genetisches Element übertragen werden. Bevorzugt erfolgt diese Kopplung in der Form, daß die Expressionskassette der Sekretionskassette unmittelbar vor- oder nachgeschaltet ist. Solch eine Kassette wird in Beispiel 1 für den Vektor pAmy63 sowie in den Beispielen 2 und 3 verwendet. Die Konstruktion dieser Sekretionskassette wird in Arch. Microbiol. (1997), Vol. 167, S. 143- 150) beschrieben. Sie enthält folgende Elemente: Kanamycin-Resistenz-Gen (Km), kil- Gen (kil), /7c-Promotor (P_fj_C), multiple Klonierungsstelle (multiple cloning site) und als Terminator ein Omega-Interposon (Ω-Cm; nach Prentki, P., Frisch, H. M. (1984), Gene, Vol. 29, S. 303-313). Sie ermöglicht also über den //c-Promotor eine Stationärphasen- abhängige Aktivierung des /(//-Genprodukts. Sie stellt eine multiple Klonierungsstelle zur Integration des interessierenden Gens und eines für dieses Gen verantwortlichen Promotors zur Verfügung. Integration des interessierenden Transgens und des zugehörigen Promotors, vorzugsweise unmittelbar vor oder nach diesen Elementen, überführt diese eigentliche Sekretionskassette in die „vollständige" Sekretionskassette oder kombinierte Expressions-Sekretionskassette.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegen die Expressionskassette und die Sekretionskassette auf einem Plasmid, das in Bakterien autonom replizieren kann. Es handelt sich also um ein Plasmid, das über die entsprechenden genetischen Elemente verfügt, um von dem DNA-Synthese-Apparat der Bakterien erkannt und an die Tochterzellen weitergegeben werden kann. Vorzugsweise liegen die Expressions- und die Sekretionskassette auf demselben Plasmid, so daß jeweils beide weitergegeben werden und in einem festen Zahlenverhältnis zueinander gehalten werden können. Sie können dadurch auch gemeinsam auf andere Produzentenstämme übertragen werden.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können alle Oligo- oder Polypeptide, Proteine oder Enzyme hergestellt werden. Einzige Voraussetzung ist, daß sie molekularbiologisch handhabbar, das heißt daß ihre Gene nach an sich bekannten Methoden klonierbar und in Wirtsbakterien transformierbar und dort transkribierbar und translatierbar sind. Die zugehörigen Gene können mit an sich bekannten Methoden, beispielsweise über PCR an chromosomaler DNA von solchen Organismen erhalten werden, die diese Gene natürlicherweise enthalten. Bevorzugt sind Enzyme. Geeignete Wirtszellen für das jeweilige Protein müssen im Einzelfall experimentell ermittelt werden. Als mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens herstellbare Enzyme kommen in erster Linie hydrolytische Enzyme wie Amyiasen, Glucanasen, Proteasen, Lipasen oder Cellulasen in Betracht, wobei die natürlicherweise von Mikroorganismen, wie Bakterien oder Pilzen gewonnenen Enzyme bevorzugt sind. Analog können auch Gemische solcher Enzyme durch Coexpression in denselben Wirtszellen erhalten werden. Hierfür können die zugehörigen Gene beispielsweise auf verschiedenen Vektoren oder auf denselben Vektoren in die Wirtszellen eingebracht worden sein oder wenigstens zum Teil vom Chromosom codiert sein.

Ein Beispiel für ein bevorzugtes Enzym ist das gemäß den Anwendungsbeispielen der vorliegenden Anmeldung herstellbare Enzym α-Amylase. Bei der α-Amylase (E.C. 3.2.1.1) handelt es sich um eine Hydrolase fürα-1,4-glycosidische Bindungen, wie sie in Amylose, Amylopektin oder Glykogen vorkommen; durch diese Reaktion entstehen Dextrine und ß-1 ,6-verzweigte Oligosaccharide. Sie gehören zu den wichtigsten industriell genutzten Enzymen überhaupt. An erster Stelle ihrer Verwendungen steht die Herstellung von Glucosesirup. Andere Verwendungen sind beispielsweise die als aktive Komponenten in Wasch- und Reinigungsmitteln, zur Behandlung von Rohmaterialien in der Textilherstellung, zur Herstellung von Klebstoffen, zur Herstellung von zuckerhaltigen Lebensmitteln und/oder Lebensmittelbestandteilen. Ein Beispiel für eine technisch besonders intensiv eingesetzte Amylase ist die α-Amylase aus Bacillus licheniformis, die von der Fa. Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dänemark, unter dem Handelsnamen Termamyl^® angeboten wird. Die aus ß. subtilis, beziehungsweise B. amyloliquefaciens gewonnene und in der US-Anmeldung US 1 227 374 offenbarte Amylase wird von derselben Firma unter dem Namen BAN^® vertrieben.

Ein anderes Beispiel für erfindungsgemäß herstellbare Enzyme stellen ß-Glucanasen dar. Bei ß-Glucanasen handelt es sich um Enzyme, die Mischglucane, welche alternierend in 1,3- und 1 ,4-ß-glucosidischer Bindung verknüpft sind, hydrolytisch in Oligosaccharide spalten. Sie gehören zur Klasse der Endo-1,3-1,4-ß-D-glucan-4- glucanohydrolasen (EC 3.2.1.73; Lichenasen) oder der Endo-1,3-ß-D-glucosidasen (EC 3.2.1.39; Laminarinasen). Solche Mischglucane sind in praktisch allen Getreideprodukten enthalten. Enzyme, welche diese zu spalten vermögen, werden vor allem in der Nahrungsmittel-, Getränke- und Futtermittelindustrie, der Textilindustrie und der Stärkeverarbeitung benötigt. Sie dienen beispielsweise in der Getränke- und Brauindustrie dazu, Malz- und Gersten-ß-Glucan abzubauen oder im Rahmen von Wasch- oder Reinigungsmittelrezepfturen dazu, um entsprechende Verunreinigungen auf Textilien oder festen Oberflächen abzubauen. Eine ß-Glucanase aus Bacillus wird beispielsweise in der Anmeldung WO 99/06573 offenbart und ihre Einsatzmöglichkeiten in Wasch- und Reinigungsmitteln beispielsweise in den Anmeldungen WO 99/06516, beziehungsweise WO 99/06515.

Diese beiden Enzyme stehen beispielhaft für alle anderen hydrolytischen Enzyme, zu denen Proteasen, Lipasen und Cellulasen gehören, aber auch für nicht-hydrolytische Enzyme, etwa Oxidasen, wie beispielsweise Laccasen. Denn die Art des Herstellverfahrens hat prinzipiell nichts mit der Art der Reaktion zu tun, die von den jeweiligen Enzymen katalysiert werden.

In ebenfalls bevorzugten Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes werden alle bisher beschriebenen Verfahren bei prinzipiell beliebiger, jeweils zweckmäßiger Kombination der genannten Verfahrensparameter zur Herstellung von rekombinanten Phytasen, insbesondere von bakteriellen Phytasen eingesetzt.

Phytasen (E.C. 3.1.3.26) hydrolysieren Phytate; das sind die meist mit Caicium oder Magnesium gebildeten Salze der Phytinsäuren, also der organischen Verbindungen, die insbesondere in Pflanzen als Phosphatspeicher dienen. Phytasen können insbesondere in der landwirtschaftlichen Tierhaltung dem Futter monogastrischer Tiere wie Geflügel oder Schweinen zugesetzt werden und somit deren Resorption von Phosphat erleichtern. Damit müssen dem Futter weniger anorganische Phosphate zugesetzt werden. Über ein erfindungsgemäßes Verfahren können auch diese wirtschaftlich bedeutenden Enzyme kostengünstig hergestellt werden. Eine Realisierungsmöglichkeit dieser Ausführungsform wird in Beispiel 4 der vorliegenden Anmeldung dargestellt.

Bevorzugt sind entsprechende Verfahren zur Herstellung von Phytasen, bei denen das Kil-Genprodukt zur partiellen Öffnung der äußeren Membran genutzt wird. Darüberhinaus bevorzugt ist es, dieses Kil-Protein unter die Kontrolle eines Stationärphasenpromotors zu stellen, insbesondere eines aus dem zur Herstellung eingesetzten Organismus, vorzugsweise des f/c-Promotors aus £ coli. Aufgrund der molekularbiologischen Handhabbarkeit kennzeichnet es bevorzugte Ausführungsformen zur Herstellung der bakteriellen Phytasen, wenn das membranöffnende System, insbesondere das /(//-Gen in einer Sekretionskassette bereitgestellt wird. Besonders vorteilhaft ist es aus den oben genannten Gründen, eine kombinierte Expressions- und Sekretionskassette zu verwenden. Über die weiteren, oben diskutierten Ausgestaltungsmöglichkeiten, beispielsweise bezüglich der Lokalisation dieser genetischen Elemente muß im Einzelfall anhand experimenteller Daten entschieden werden.

Das Phytase-Gen von £ coli wird natürlicherweise nur unter anaeroben Bedingungen und mit niedriger Expressionsrate gebildet. Die Verwendung des ß-Glucanase-Promotors von Bacillus amyloliquefaciens ermöglicht eine hohe Expressonsrate, zudem unter aeroben Bedingungen. Dies wird durch Beispiel 4 der vorliegenden Anmeldung belegt. Verfahren, bei denen die bakteriellen Phytasen unter der Kontrolle dieses Promotors exprimiert werden, sind bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes.

In Beispiel 4 der vorliegenden Anmeldung sind verschiedene Stämme von Escherichia coli getestet worden. Sie alle kennzeichnen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Eine besonders hohe Produktbildungsrate wurde mit dem Stamm £ coli BL21 (DE3) erzielt. Dieser Stamm kennzeichnet besonders bevorzugte Ausführungsformen zur erfindungsgemäßen Herstellung von bakteriellen Phytasen.

In Beispiel 4 und Figur 4 der vorliegenden Anmeldung wird auch beschrieben, wie verschiedene Vektoren mit kombinierter Expressions- und Sekretionskassette konstruiert werden können. Der Vektor pPhyt109 enthält das /(//-Gen unter der Kontrolle des fic- Promotors (vergleiche Miksch, G. et al. (1997), Arch. Microbiol, Vol. 167, S. 143-150); und der Vektor pPhyt119/4 enthält das /(//-Gen unter der Kontrolle des όg/A-Promotors; dieser unterscheidet sich von dem zuvorgenannten außerdem darin, daß stromaufwärts des /(//-Gens kein Interposon vorhanden ist. Beide Vektoren kennzeichnen bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands.

Aufgrund ihrer universellen Übertragbarkeit auf verschiedene Wirtsorganismen stellen die weiter oben bereits beschriebenen Sekretionskassetten, welche die für die Membran- öffnenden Eigenschaften des Membran-öffnenden Systems verantwortlichen genetischen Elemente enthalten, eigene Erfindungsgegenstände dar. Denn ihr Einschleusen in einen Bakterienstamm, der bereits ein Transgen exprimiert und dieses beispielsweise in inclusion bodies einschließt oder in das Periplasma abgibt, überführt diesen in einen sekretionskompetenten Bakterienstamm. Und aufgrund der mit dieser Anmeldung bereitgestellten Lehre ist zu erwarten, daß allein durch die Übertragung einer erfindungsgemäßen Sekretionskompetenz in einen etablierten, Transgen exprimierenden gram-negativen Bakterienstamm ohne weitere Modifikationen höhere Produktbildungsraten und leichtere Gewinnbarkeit des Produkts aus dem Medium erzielt werden, in dem die produzierenden Bakterienstämme kultiviert werden.

Aufgrund der ausgeführten Beispiele stellen Sekretionskassetten mit dem Colicin- System aus £ coli, insbesondere dem Gen für das Kil-Protein und/oder um ein unter der Kontrolle des f/c-Promotors stehendes System bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands dar. Alternative, ebenfalls in diesen Erfindungsgegenstand eingeschlossene Ausführungsformen sind bereits weiter oben ausgeführt worden.

Weiterhin bevorzugt sind solche Sekretionskassetten, die unmittelbar vor- oder nachgeschaltet zusätzlich eine Expressionskassette enthalten, die aus dem Transgen und einem Promotor als dessen Kontrollelement besteht. Hierunter sind insbesondere Promotoren bevorzugt, die nicht notwendigerweise von außen zu induzieren sind, vorzugsweise konstitutive Promotoren, und besonders bevorzugt der ß-Glucanase- Promotor von Bacillus amyloliquefaciens (όg//-Promotor).

Diese Expressionskassetten ermöglichen die Herstellung jedes beliebigen Proteins. Aufgrund ihrer wirtschaftlichen Bedeutung sind solche für Enzyme, besonders für Hydrolasen, und hierunter insbesondere für Amylasen, Glucanasen, Proteasen, Lipasen, Cellulasen oder für bakterielle Phytasen bevorzugt.

In gram-negativen Bakterien replizierende, das heißt von den jeweiligen zellulären Systemen erkennbare Vektoren mit einer oben beschriebenen Sekretionskassette stellen einen eigenen Erfindungsgegenstand dar. Denn durch sie wird die vorliegende Erfindung verwirklicht. Das gilt in zunehmendem Maße für die zunehmend bevorzugten Formen der oben beschriebenen Sekretionskassetten, insbesondere für solche Vektoren, die zusätzlich eine Expressionskassette enthalten. Denn diese beiden Elemente verleihen den Wirtszellen alle erfindungswesentlichen Merkmale, nämlich Synthese des interessierenden Proteins und dessen Ausschleusung in das umgebende Medium durch ein die äußere Membran der gram-negativen Bakterien partiell öffnendes System.

Hierunter sind aufgrund der wissenschaftlichen Bedeutung von Escherichia coli und Klebsiella die Expressionsvektoren bevorzugt, die sich für den Einsatz in diesen Spezies eignen. Dafür müssen sie mit den entsprechenden genetischen Elementen wie beispielsweise dem jeweiligen Replikationsursprung und geeigneterweise mit Selektionsmarkern ausgestattet sein.

Besonders die Vektoren pAmy63, pPhyt 109 oder pPhyt119/4 stellen Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar. Sie werden bevorzugt zur Herstellung von α-Amylase, ß-Glucanase und Phytase eingesetzt. Anhand der in der Anmeldung enthaltenen Beispiele sind ausgehend von denselben oder anderen, beispielsweise kommerziell erhältlichen Vektoren entsprechende Expressionsvektoren konstruierbar, die den Erfindungsgegenstand in der gleichen Weise verwirklichen. Alle Vektoren, die sich von diesen ableiten lassen und deshalb mit diesen Vektoren die wesentlichen genetischen Elemente gemeinsam haben, sind ebenfalls in den Schutzbereich einbezogen. Das gilt insbesondere für solche, die sich durch Austausch des zu exprimierenden Gens von einem dieser Vektoren ableiten lassen. Denn wie oben bereits erklärt, ist es für die Erfindung nicht wesentlich, um welche Proteine es sich konkret handelt, da sie über das membranöffnende System unspezifisch ausgeschleust werden.

Wie solche Vektoren hergestellt werden können, ist in den Beispielen illustriert. Variationen dieser Vektoren, beispielsweise die Integration eines anderen membranöffnenden Systems, anderer Promotoren oder anderer Transgene sind nach den dem Fachmann geläufigen Methoden möglich, wie sie beispielsweise auch in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, angegeben sind.

Aber auch Klonierungsvektoren mit einer der oben beschriebenen Expressionskassetten stellen Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar. Sie stellen gewissermaßen die genetische Realisierungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung dar. Sie dienen beispielsweise der Lagerung, aber auch der Vervielfältigung der oben beschriebenen genetischen Elemente, etwa in vivo durch Transformation in andere Bakterienstämme oder in vitro als Matrize für die PCR. Sie dienen insbesondere dazu, um die betreffenden Elemente zu modifizieren, insbesondere für den konkreten Fall zu optimieren. Solch eine Optimierung kann beispielsweise in einer Promotoranalyse, also der Ermittlung eines im Einzelfall geeigneten Promotors für das Transgen bestehen. So können diese Elemente beispielsweise über PCR (Polymerasekettenreaktion) punktmutiert oder mit anderen Elementen zusammengeführt werden. Eine weitere Modifikationsmöglichkeit besteht darin, eine beispielsweise von Transposon-Elementen flankierte Region auf einem Vektor in eine Wirtszelle einzubringen und in vivo die Excision und Integration in das Wirtschromosom zu ermöglichen. Auf diese Weise werden neue sekretionskompetente Bakterienstämme mit chromosomaler Lage der Expressions- und/oder Sekretionskassette erhalten. Analog dazu ist auch das Einschleusen über homologe Rekombination möglich.

Eine von den Insertionssequenzen eines Transposons flankierte Sekretionskassette wird in in Appl. Microbiol. Biotechnol. (1997), Vol.47, S. 530-536) beschrieben und in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung eingesetzt. Die Konstruktion von Sekretionsstämmen, bei denen die Sekretionskompetenz über homologe Rekombination ins Bakterienchromosom integriert ist, wird in Beispiel 1 dargestellt.

Zur Übertragung der Sekretionskassette auf andere Bakterienspezies als die, in der die Klonierung des zu exprimierenden Gens stattgefunden hat, lassen sich auch Konjugationsprozesse ausnutzen, wie sie natürlicherweise auch zwischen gramnegativen Bakterien verschiedener Spezies, etwa zwischen £ coli und Klebsiella beobachtet werden können.

Bakterienstämme, mit denen die vorliegende Erfindung verwirklicht wird, bilden einen eigenen Erfindungsgegenstand. Hierzu behören beispielsweise solche gram-negativen Bakterien, die in vektorieller Lokalisation eine der oben beschriebenen Sekretionskassetten tragen. Denn durch ihre Kultivierung werden sowohl die Synthese als auch die Sekretion und damit die erfindungsgemäße Herstellung der interessierenden Proteine ermöglicht. Die vektorielle Lokalisation ermöglicht eine flexible molekularbiologische Weiterentwicklung dieser Stämme sowie eine weite Regulation der Kopienzahlen der wirksamen genetischen Elemente. Aufgrund der oben dargestellten Erfahrungen und der erfolgreichen, in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung dokumentierten Versuche sind darunter coliforme Bakterien bevorzugt, ganz besonders der Gattungen Escherichia coli oder Klebsiella und hierunter insbesondere Derivate von £ coli K12 oder £ coli B oder von Klebsiella platicola.

Hierunter sind wiederum die Stämme bevorzugt, die sich beispielsweise durch Transformation mit einer entsprechenden Sekretions- und/oder Expressionskassette von £ coli BL21 (DE3), £ coli RV308, £ coli DH5α, £ coli JM109, £ co/ XL-1 oder von Klebsiella platicola (Rf), insbesondere von dem unter Anmeldenummer DSM 14225 hinterlegten Stamm ableiten lassen.

Prinzipiell ist dies bereits auf Bakterienstämme anwendbar, die natürlicherweise bestimmte Proteine produzieren, an deren Gewinnung wirtschaftliches Interesse besteht. Inbesondere gilt es jedoch für Bakterienstämme, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie zusätzlich einen Expressionsvektor mit einem Promotor und ein von diesem Promotor reguliertes Gen enthalten.

Hierunter sind die Bakterienstämme bevorzugt, die nach Transformation mit einem der oben dargestellten Vektoren, insbesondere pPhyt 109 oder pPhyt119/4 oder einem, der sich von diesen Vektoren ableiten läßt, erhalten worden sind. Dies gilt insbesondere für solche, die die Herstellung anderer wirtschaftlich interessanter Proteine ermöglichen.

Eine andere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstandes stellen gram-negative Bakterienstämme mit chromosomaler Lokalisation einer der oben beschriebenen Sekretionskassetten dar. Denn diese ermöglich eine über mehrere Generationen stabilere Etablierung dieser genetischen Elemente. Aus den oben aufgeführten Gründen sind darunter coliforme Bakterien, hierunter solche, die sich von Vertretern der Gattungen Escherichia coli oder Klebsiella ableiten lassen, vorzugsweise von Derivaten von £ coli K12 oder £ coli B oder Klebsiella planticola, ganz besonders von solchen der Stämme £ coli BL21 (DE3), £ coli RV308, £ coli DH5α, E.coli JM109, £ coli XL-1 oder von K. planticola (Rf).

Unter diesen Stämmen sind jeweils die bevorzugt, die das rekombinante Protein unter der Kontrolle eines nicht notwendigerweise von außen zu induzierenden Promotors, vorzugsweise eines konstitutiven Promotors und besonders bevorzugt des ß-Glucanase- Promotors Bacillus amyloliquefaciens (bgl-Promotoή exprimieren. Denn wie oben erläutert ermöglicht eine hohe basale Transkriptions- und Translationsrate, vermutlich in der Weise, daß das gebildete Protein über die partiell geöffnete Membran permanent dem Reaktionsgleichgewicht entzogen wird, im Endeffekt eine hohe Produktionsrate, das heißt eine hohe Anreicherung des umgebenden Mediums an dem interessierenden Protein.

Eine ganz besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellen Derivate des unter der Anmeldenummer DSM 14225 hinterlegten Mikroorganismus dar.

Auch solche Mikroorganismen sind bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie nach Transformation mit einem der oben beschriebenen Vektoren erhalten worden sind. Dabei kann es sich beispielsweise um Klonierungsvektoren handeln, die zur Lagerung und/oder Modifikation in einen beliebigen Bakterienstamm eingebracht worden sind. Solche Schritte sind in der Lagerung und in der Weiterentwicklung betreffender genetischer Elemente allgemein verbreitet. Da aus diesen Mikroorganismen die betreffenden genetischen Elemente in zur Expression geeignete gram-negative Bakterien unmittelbar übertragen werden können, handelt es sich auch bei den vorangegenagenen Transformationsprodukten um Verwirklichungen des betreffenden Erfindungsgegenstands.

Fermentationsverfahren sind an sich aus dem Stand der Technik wohlbekannt und stellen den eigentlichen großtechnischen Produktionsschritt dar; gefolgt von einer geeigneten Aufreinigungsmethode. Sie stellen gegenüber der eigentlichen Proteinbildung eine technische Weiterentwicklung dar und bilden, wenn sie erfindungsgemäße Merkmal aufweisen, einen eigenen Erfindungsgegenstand. Somit werden alle Verfahren zur Fermentation von gram-negativen Bakterien beansprucht, die ein rekombinantes Protein produzieren, welches mithilfe eines die äußere Membran dieser Bakterien partiell öffnenden Systems zumindest teilweise in das die Bakterien umgebende Medium abgegeben wird, die dadurch gekennzeichnet sind, daß das rekombinante Protein unter der Kontrolle eines Promotors aus einem gram-positiven Organismus, vorzugsweise aus einem der Gattung Bacillus exprimiert wird, der das zugehörige Gen oder ein zu diesem hochhomologes Gen natürlicherweise nicht reguliert. Alle Fermentationsverfahren, die auf einem der oben ausgeführten Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Proteine beruhen, stellen entsprechend bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar.

Hierbei müssen die für die eingesetzten Herstellungsverfahren, für die Wirtszellen und/oder die herzustellenden Proteine jeweils optimalen Bedingungen anhand der zuvor optimierten Kulturbedingungen der betreffenden Stämme nach dem Wissen des Fachmanns, beispielsweise hinsichlich Fermentationsvolumen,

Medienzusammensetzung, Sauerstoffversorgung oder Rührergeschwindigkeit experimentell ermittelt werden. Einen Anhaltspunkt hierfür gibt Beispiel 4 der vorliegenden Anmeldung. Auch hier sind in die gewählten Fermentationsbedingungen die Kenntnisse eingeflossen, die zuvor anhand der Schüttelkultur gewonnen worden waren.

Bevorzugt sind darunter jene Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß das interessierende Protein unter der Kontrolle eines nicht notwendigerweise von außen zu induzierenden Promotors, vorzugsweise eines konstitutiven Promotors und insbesondere des ß-GIucanase-Promotors von Bacillus amyloliquefaciens exprimiert und/oder unter dem Einfluß des Kil-Proteins freigesetzt wird. Denn dieses Zusammenspiel gewährleistet, wie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung belegt ist, eine besonders starke Anreicherung des Kulturmediums mit dem betreffenden Protein.

Zunehmend bevorzugt sind derartige Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die oben beschriebenen bevorzugten Bakterien eingesetzt werden.

Bevorzugt sind solche Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Fermentation über eine Zulaufstrategie durchgeführt wird. Hierbei werden, wie beispielsweise anhand der Fermentation des Beispiels 4 gezeigt ist, die Medienbestandteile, die durch die fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugefüttert; man spricht auch von einer Zufütterungsstrategie. Hierdurch können beträchtliche Steigerungen sowohl in der Zelldichte, als auch in der Biotrockenmasse und/oder vor allem der Aktivität des interessierenden Proteins erreicht werden. Analog dazu kann die Fermentation auch so gestaltet werden, daß unerwünschte Stoffwechselprodukte herausgefiltert oder durch Zugabe von Puffer oder jeweils passende Gegenionen neutralisiert werden.

Das hergestellte Protein kann nachträglich aus dem Fermentationsmedium geerntet werden. Dieses Fermentationsverfahren ist gegenüber der Produktaufbereitung aus der Trockenmasse bevorzugt.

Demgegenüber sind jedoch solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß das hergestellte Protein kontinuierlich während der Fermentation entnommen wird. Hierdurch wird, insbesondere in Kombination mit der oben diskutierten Zufütterungsstrategie und/oder der Möglichkeit, Stoffwechselprodukte aus dem Medium kontinuierlich zu entfernen, eine über einen langen Zeitraum laufende Fermentation möglich. Diese wird dadurch unterstützt, daß die Wirtszellen zur Proteingewinnung nicht aufgeschlossen, das heißt abgetötet werden müssen. Eine solche Kultur kann beispielsweise über immobilisierte Produzenten erfolgen und stellt gegenüber der Batch- oder Satzkultur eine im Allgemeinen kostengünstigere Alternative dar.

Beispiele

Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, angegeben sind.

Beispiel 1

Herstellung von α-Amylase durch £. coli BL21 (DE3)

Vorversuche

Zur Kultivierung des Stammes £ coli BL21 (DE3) (Fa. Stratagene, La Jolla, USA) wurden in Vorversuchen folgende, gemäß Fritsch, Sambrook und Maniatis (siehe oben) hergestellte Medien miteinander verglichen:

- Vollmedium LB + 2% NaCI + 0,2 % Glycerin,

- Vollmedium TB + 2% NaCI und

- Minimalmedium M9 + 2% NaCI + 0,2 % Glycerin.

Alle Kulturen wurden in einem Volumen von 30 ml in 300 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen gehalten und mit 175 rp geschüttelt; die Temperatur lag jeweils bei 37°C. Es ergaben sich die höchsten Ausbeuten an Biomasse in TB-Medium + 2% NaCI, so daß dieses unter denselben Kulturbedingungen für die nachfolgenden Versuche verwendet wurde.

Konstruktion eines Expressionsvektors mit Sekretionskassette

Die Konstruktion der von Tn5 abgeleiteten Sekretionskassette an sich ist in Appl. Microbiol. Biotechnol, Band 47 (1997), S. 143-150, beschrieben. Sie enthält folgende Elemente: IS50_R, Kanamycin-Resistenz-Gen (Km), /(//-Gen (kil), fic-Promotor (P_kιι), multiple Klonierungsstelle (multiple cloning site), als Terminator ein Omega-Interposon (Ω-Cm; nach Prentki, P., Frisch, H. M. (1984), Gene, Vol. 29, S. 303-313), Mobilitätsgen (mob) und IS50_L. Sie ermöglicht also über den /7c-Promotor eine Stationärphasen- abhängige Aktivierung des /(//-Genprodukts und davon abhängig eine partielle Lyse der Zellen. Sie stellt eine multiple Klonierungsstelle zur Integration des interessierenden Gens und eines für dieses Gen verantwortlichen Promotors zur Verfügung. Die von Tn5 stammenden Enden (IS_R, IS : insertion Sites oder inverted repeats) erlauben eine Integration sowohl in Plasmide als auch ins Bakterien-Chromosom. Diese eigentliche Sekretionskassette ist von dem später als „vollständige" Sekretionskassette bezeichneten Element zu unterscheiden, welches zusätzlich das Transgen und den dieses Transgen regulierenden Promotor enthält.

Im Vektor pUC19 (Fa. Pharmacia, Freiburg) wurde das α-Amylase-Gen aus Bacillus amyloliquefaciens mit dem jbg/-Promotor zusammengebracht. Dieser Promotor ist konstitutiv und muß nicht durch Induktion aktiviert werden. Er wurde mit PCR unter Verwendung der Primer 5'AAC GAA TTC AAC GAA GAA TCG CTG CAC3' (mit der Restriktions-Schnittstelle EcoR I) und

5 CG CGG ATC CTT ACC CCT TTT TTG AAC ACG C3' (mit der Restriktions- Schnittstelle BamH \) aus dem Plasmid pLF3 (in Appl. Microbiol. Biotechnol, Band 47 (1997), S. 120-126) isoliert und in die £coR I/ BamH I-Stelle des Vektors pUC19 integriert.

Anschließend wurde das α-Amylase-Gen mittels PCR aus chromosomaler DNA von Bacillus amyloliquefaciens DSM 7 (entspricht ATCC 23350; Sequenz gemäß der Sequenzdatenbank des EMBL (Cambridge, Großbritannien) unter der Zugangsnummer J01542) erhalten. Sie erfolgte unter Verwendung der Primer PA02 (5'TTT GGA TCC GAA AAT GAG AGG3') und

PA03 (5'ATT GGG AGC TCC TAC GAT CGC3') amplifiziert. Das erhaltene Gen wurde in den Vektor pGEM Teasy (Fa. Promega, Madison, Wisconsin, USA) kloniert. Aus diesem Vektor konnte bei richtiger Orientierung des Inserts das α-Amylase-Gen auf einem BamH 1/ Sal I-Fragment gewonnen werden und hinter den όg/-Promotor in den oben genannten pUC19 kloniert werden.

Dadurch wurde der zur Expression, nicht aber zur Sekretion befähigende Vektor pAmy58 erhalten. Der Einbau der Sekretionskassette erfolgte wie oben als Pvu Il-Fragment in die Ssp I-Restriktionsschnittstelle stromaufwärts des ß-Lactamase-Gens des Vektors pUC19. Dadurch wurde der Vektor pAmy63 mit vollständiger Sekretionskassette erhalten. Die zugehörige Promotor-Struktur ist in Figur 1 dargestellt. Mit diesem Vektor wurden Präparationen von £ coli BL21 (DE3) nach Standardmethoden transformiert und der Stamm £ coli BL21 (DE3) (pAmy63) erhalten. Dieser Stamm wurde wie der Ausgangsstamm £ coli BL21 (DE3) kultiviert.

Vortest auf Amylase-Produktion

Einen qualitativen Test auf eine von diesem Stamm gebildete α-Amylase stellt der Plattentest dar, bei dem 5 μl des Überstands der flüssigen Kultur auf zu 1% Stärke (Fa. Sigma, Deisenhofen, Deutschland) enthaltenden LB-Agarplatten aufgetragen werden. Man erhält dadurch bereits nach wenigen Stunden Inkubation scharf abgegrenzte Höfe, wobei eine quantitative Unterscheidung bereits über den Durchmesser und die Schärfe der Abgrenzung der Höfe möglich ist. Auch Einzelkolonien von Amylase-positiven Klonen bilden gut sichtbare Höfe auf stärkehaltigen Agarplatten.

Bestimmung der α-Amylase-Aktivität

Die quantitative Bestimmung der α-Amylase erfolgte durch Messung der Amylaseaktivität mittels SIGMA-Amylase-Testreagenz von der Firma SIGMA DIAGNOSTICS (St. Louis, USA; Produkt No. 577). Entsprechend der Gebrauchsanweisung wurden 20 μl Probenmenge eingesetzt. Die Messungen erfolgten bei einer Kulturmenge von 30 ml in 300 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen, die bei 37°C auf einem Rotationsschüttler mit 175 U/min gehalten wurden. Die Ergebnisse werden in lU/ml erhalten, wie sie gemäß Fresenius Z. Anal. Chem., Vol. 301 (1980), S. 169, definiert sind.

Tabelle 1 : Fähigkeit der konstruierten Stämme zur Herstellung von α-Amylase

Optische Dichte und α-Amylase-Aktivität (in lU/ml) im Periplasma (PP) und im Kulturmedium (Ü) bei Verwendung des bg/-Promotors, jeweils zu zwei verschiedenen Zeitpunkten (13 h und 18 h nach Beimpfen).

Im Kontrollstamm zeigt sich eine Basisrate an periplasmatischer, aber nicht an sekretierter Enzymaktivität. Bei vektoriell codierter Expression zeigt sich eine 1 ,5fach, beziehungsweise 12fach erhöhte Enzymaktivität im Periplasma, beziehungsweise in Periplasma und Überstand zusammen. Weitere 5 h später ist jeweils ein weiterer Teil der periplasmatischen Aktivität ins umgebende Medium abgegeben worden, so daß die vektorielle Lage aber nur noch zu einer Steigerung der Enzymaktivität um das 8,9fache führt.

Bei der Verwendung des ög/-Promotors zeigt sich also ein überraschend positiver Effekt. Die vektorielle Lage der Sekretionskassette bewirkt eine Sekretion des Proteins ins umgebende Medium. Dabei beträgt der extrazelluläre Anteil 13 h nach Beimpfen 88% und nach 18 h sogar 92%. Das heißt, mit längerer Kultivierungszeit nimmt der Anteil der α-Amylase im Periplasma ab und der Anteil im Kulturmedium zu.

Beispiel 2

Herstellung von α-Amylase durch E. coli RV308

Der Stamm £ coli RV308 (ATCC 31608) wurde im Hans-Knöll-Institut für Naturstoff- Forschung in Jena getestet und ist in J. Mol. Bio!., Vol. 139 (1980), S. 147-161 beschrieben. Er zeichnet sich dadurch aus, daß er kein Acetat bildet (Appl. Microbiol. Biotechnol, Vol. 46 (1996), S. 524-532). Als Kulturbedingungen und Nachweisreaktionen eignen sich die gleichen wie in Anwendungsbeispiel 1.

Der £ co//-Stamm RV308 wurde nach dem in Anwendungsbeispiel 1 beschriebenen Vorgehen mit dem zur Expression und Sekretion von α-Amylase befähigenden Vektor pAmy63 (mit ög/-Promotor) transformiert. Dadurch wurde der Stamm £ coli RV308 pAmy63 mit vektoriell codierter vollständiger, das heißt auch das Transgen und den regulierenden Promotor enthaltender Sekretionskassette erhalten. Die damit erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt.

Tabelle 2: α-Amylase-Herstellung durch £ coli RV308 pAmy63.

Gemessen wurde die α-Amylase-Aktivität (in lU/ml) im Periplasma (PP) und im Überstand (Ü), 13 und 18 h nach Beimpfen.

Dieser £ co//-Stamm zeigt bei Expression in Abhängigkeit vom 6g/-Promotor und erfindungsgemäßer Sekretion ebenfalls eine nachweisbare α-Amylase-Produktion und Sekretion und stellt somit eine Alternative zu £ coli BL21 (DE3) dar. Beispiel 3

Herstellung von α-Amylase durch Klebsiella planticola (Rf)

Bei Klebsiella planticola (Rf) handelt es sich um einen durch spontane Mutation aus Klebsiella planticola hervorgegangenen, Rifamycin-resistenten Stamm (Appl. Microbiol. Biotechnol, Vol. 51 (1999), S. 627-632). Als Kulturbedingungen und Nachweisreaktionen für dieses Beispiel eignen sich die gleichen wie in den Beispielen 1 und 2. Für dieses Anwendungsbeispiel wurde ähnlich wie in Beispiel 1 die eigentliche Expressionskassette ohne Transgen und Promotor ins Bakterienchromosom integriert und die Expressionskassette auf einem eigenen Vektor zur Verfügung gestellt.

Die Herstellung des sekretionskompetenten /eόs/e//a-Stammes, ist in Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999), Vol. 51, S. 627-632 beschrieben; er trägt den Namen Klebsiella planticola (Rf)-FIC3/19. Dafür war, ausgehend von dem Tn5-Derivat Tn5-B13, ein Transposon mit Sekretionskassette und den für eine Plasmid-Mobilisierung notwendigen Genen konstruiert worden, so daß in Gegenwart dieses Transposons auch solche Plasmide mobilisierbar sind, die keine eigenen Mobilitäts-Gene tragen. Dieses auf dem Vektor pBR325 lokalisierte und als Tn5-KIL3 bezeichnete Transposon war von dem mobilisierenden £ co//-Stamm S17.1 in K. planticola übertragen worden. Da pBR325 in Klebsiella nicht repliziert, stellen alle Km-resistenten Transkonjuganten Transpositionsereignisse dar. Es hatte dort gezeigt werden können, daß das Tn5-KIL3 nach dem Zufallsprinzip an verschiedenen Stellen, aber jeweils nur in einer Kopie in das Bakterienchromosom integriert. In solche Transkonjuganten war in der genannten Arbeit das Plasmid pRS201L-Tc mit dem Gen für die ß-Glucanase konjugativ übertragen worden. Sie zeichnen sich dadurch aus, daß sie eine Sekretionskassette, bestehend aus Mobilisierungs-Genen, dem /(//-Gen und ein Kanamycin-Resistenz-Gen, als chromosomale Integration tragen.

In den Sekretionsstamm Klebsiella planticola (Rf)-FIC3/19 ist für die vorliegende Erfindung das Plasmid pRS-Amy konjugativ übertragen worden. Dieser Vektor leitet sich wie in Figur 2 beschrieben vom Plasmid pRS201 ab. Dieser selbst wiederum von RSF1010 abgeleitete Vektor mit großem Wirtsbereich ist deshalb erforderlich, weil £ co//-Vektoren ohne entsprechenden Replikationsursprung (ori) in Klebsiella nicht repliziert werden können. Zunächst wurde der Vektor pRS201 durch Deletion eines ca. 2 kb großen Fragments um entbehrliche Bestandteile verkleinert und anschließend in die EcoR I-Schnittstelle ein Interposon mit einem Tetracyclin-Resistenz-Gen integriert. Nach Deletion des ca. 1,4 kb großen, das Kanamycin-Resistenz-Gen tragenden Fragments wurde das Pvu WI Pst Il-Fragment aus pAmy58 (siehe Beispiel 1) eingebaut. Dieses enthält den bg/-Promotor und das unter seiner Kontrolle stehende Gen für die α- Amylase.

Dieser Vektor pRS-Amy wurde zunächst in £ coli S17-7 transformiert und von dort über Konjugation in K. planticola mobilisiert, so daß wiederum ein chromosomal codiertes Colicin-System und in vektorieller Lokalisation ein vom Dg/-Promotor kontrolliertes Gen gleichzeitig in einem gram-negativen Organismus vorlagen. Der erhaltene Stamm erhielt den Namen Klebsiella planticola (Rf)-FIC3/19. Das gesamte Vorgehen ist in Figur 3 zusammengefaßt. Als Kontrolle diente eine Transformante, die aus der Übertragung desselben Plasmids in den Ausgangsstamm Klebsiella planticola, also ohne Sekretionskompetenz erhalten worden war.

Replika-Plating auf stärkehaltige LB-Agarplatten zeigt sekretionskompetente Transkonjuganten. Nachweis und Quantifizierung der α-Amylase-Aktivität erfolgten wie bei Anwendungsbeispiel 1 beschrieben. Die durch quantitative Messungen erhaltenen Aktivitätswerte sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.

Tabelle 3: α-Amylase-Herstellung durch Klebsiella planticola

Optische Dichte und Amylase-Aktivität (lU/ml) im Periplasma (PP) und Überstand (Ü) bei K. p/anf/co/a-Stämmen mit und ohne Sekretion.

Demnach sind die periplasmatisch nachweisbaren Enzymaktivitäten gegenüber den Kontrollen ohne Sekretionskassette nicht nachweisbar erhöht, aber die in den Überstand sekretierten Aktivitäten. Dies zeigt, daß das Erfindungsprinzip auch für den gramnegativen Organismus Klebsiella planticola gilt.

Der gemäß diesem Beispiel und gemäß Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999), Vol. 51 , S. 627-632 hergestellte sekretionskompetente Bakterienstamm Klebsiella planticola (Rf)- FIC/19 ist am 09.04.2001 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, unter der Nummer DSM 14225 hinterlegt worden.

Beispiel 4

Expression von Phytase durch E. coli

Fusion des Phytasegens mit einem effektiven Promotor und Konstruktion eines Expressionsvektors

Das Gen für die E. coli-Phytase einschließlich der Ribosomenbindungsstelle wurde mittels PCR aus dem Plasmid pPH251 (Greiner, R. et al. (1993), Arch. Biochem. Biophys., Vol. 303, S. 107-113) ampflifiziert, wobei der amplifizierte Bereich mit den Restriktionsschnittstellen Barn Hl und Pst I versehen worden war. Das Phytasegen wurde dann mit dem Promotor der ß-Glucanase von Bacillus amyloliquefaciens (P _giA) fusioniert und beide zusammen in den Vektoren mit hoher Kopienzahl pUC19 integriert. Außerdem wurde in das Plasmid die Sekretionsfunktion durch Klonierung einer Kassette integriert. Die Kassette kam in zwei verschiedenen Strukturen zur Anwendung (Figur 4):

1. Kassette mit kil-Gen unter der Kontrolle des f/c-Promotors (vergleiche Miksch, G. et al. (1997), Arch. Microbiol, Vol. 167, S. 143-150); dieser Kassettentyp ist im Vektor pPhytl 09 enthalten.

2. Kassette mit kil-Gen unter der Kontrolle des bgl A-Promotors; dieser Kassettentyp unterscheidet sich von dem unter 1. bezeichneten außerdem darin, daß stromaufwärts des /(//-Gens kein Interposon vorhanden ist; dieser Kassettentyp ist im Vektor pPhyt119/4 enthalten.

Expression der Phytase in Abhängigkeit vom Promotor

Die Überexpression der Phytase erfolgte nur unter Sekretionsbedingungen, das heißt bei Anwesenheit der beschriebenen Sekretionskassette.

Tabelle 4: Phytaseaktivität (in % des Maximalwerts) in E. coli BL21 (DE3).

Kulturbedingungen: 30 ml-Schüttelkultur in 300 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen; TB-Medium; Temperatur: 37°C; Rundschüttler mit 150 rpm.

Expression der Phytase in Abhängigkeit von der Sekretion

Figur 5 zeigt die Kinetik der Phytaseaktivität gesamt, extrazellulär, im Periplasma und im Cytoplasma während einer Satzfermentation in Abhängigkeit von der Sekretion. Der Unterschied der beiden hier verwendeten Stämme bestand darin, daß bei der Sekretionsvariante (unten) die Sekretionskassette auf dem Expressionsvektor vorhanden war, während diese auf dem Expressinsvektor des Kontrollstammes (oben) fehlte. Figur 5 zeigt, daß die Phytaseaktivität gesamt und im Medium von der späten exponentiellen Phase an schnell anstieg, während bei der Kontrolle während der gesamten Kultivierungszeit keine, beziehungsweise äußerst geringe Aktivitäten zu beobachten waren.

Expression der Phytase in Abhängigkeit vom E. coli-Stamm

Um den Einfluß des Genoms des Wirtsstames auf die Phytaseaktivität zu untersuchen, wurde das Plasmid pPhyt119/4 in folgende E. coli-Stämme transformiert: BL21 (DE3), JM109 und TG1 (Fa. Stratagene, La Jolla, USA).

Die Phytaseaktivitäten im Kulturmedium wurden nach 24, beziehungsweise 48 h Kultivierung verglichen. Tabelle 5 zeigt, daß der Stamm BL21 (DE3) eine gegenüber den anderen Stämmen deutlich höhere extrazelluläre Phytaseproduktion ermöglicht.

Tabelle 5: Phytaseaktivität (in % des Maximalwerts) im Überstand von E. coli- Stämmen mit dem Plasmid pPhyt119/4 in Abhängigkeit von der Kulturdauer. Kulturbedingungen: 30 ml-Schüttelkultur in 300 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen; TB- Medium (Vollmedium); Temperatur: 37°C; Rundschüttler mit 150 rpm.

Einfluß des Fermentationsverfahrens auf die Expression und Sekretion der Phytase Der Stamm BL21 (DE3) pPhyt109 wurde in einem 7 I-Fermenter hinsichtlich Zelldichte und Phytase-Aktivität getestet. Dabei wurden folgende zwei Verfahren miteinander verglichen: Satzkultur und Zulaufverfahren. Bei dem Zulaufverfahren wurde ein synthetisches Medium, welches für Hochzelldichtefermentationen geeignet ist (Hörn, U. et al., (1996), Appl. Microbiol, Vol.46, S. 524-532), verwendet und die Zugabe von Glucose und Ammoniumsulfat durch die Sauerstoffsättigung (p0₂) geregelt. Dabei begann die Zufütterung bei einer Sauerstoffsättigung von 60% und wurde bei 30 % unterbrochen.

Figur 6 zeigt, daß, gemessen an der optischen Dichte und der Biotrockenmasse, durch die Zufütterungsstrategie wesentlich höhere Zelldichten sowie mehr als dreifach höhere Ausbeuten an Phytase (Phytaseaktivität gesamt und im Medium) erzielt werden können als bei der Satzkultur.

Beschreibung der Figuren

Figur 1 : Die Genetische Struktur des όg/-Promotors zur Kontrolle des α-Amylase-

Gens.

Figur 2: Die Konstruktion des Vektors pRS-Amy aus dem Vektor pRS201.

Figur 3: Die Konstruktion von Sekretionsstämmen bei K. planticola.

(Identisch mit Figur 1 in Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999), Vol.51_, S. 627-632)

Figur 4: Die genetische Struktur der zur extrazellulären Produktion der £ coli-

Phytase verwendeten Vektoren pPhyt109 (oben) und pPhyt119/4 (unten).

Figur 5: Phytaseherstellung und -Sekretion ins Kulturmedium im Verlauf der

Kultivierung, gemäß Beispiel 4; ermittelt bei einer Satzfermentation in einem 7 I-Fermenter.

Optische Dichte der Zellsuspension (Zelldichte): offene Kreise; y-Achse, linke Skala;

Phytaseaktivität: jeweils in U/ml; y-Achse, rechte Skala;

Phytaseaktivität gesamt: geschlossene Quadrate;

Phytaseaktivität im Medium: geschlossene Kreise;

Zeit: in h; x-Achse.

Medium: synthetisches Medium gemäß Hörn, U. et al., (1996), Appl. Microbiol, Vol.46,

S. 524-532; Temperatur: 37°C. oben: Stamm BL21 (DE3) pPhyt106 (ohne Sekretionskassette); unten: Stamm BL21 (DE3) pPhyt109 (mit Sekretionskassette).

Hier sind zusätzlich die Biotrockenmasse (in mg/ml; offene Dreiecke; y-

Achse, linke Skala), die Phytaseaktivität im Periplasma (geschlossene, nach oben weisende Dreiecke) und die Phytaseaktivität im Zytoplasma (geschlossene, nach unten weisende Dreiecke) angegeben.

Figur 6: Fermentation in einem 7 I-Fermenter des Stammes BL21 (DE3) pPhyt109 im Zulaufverfahren; die Zulaufphase ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. Kultivierungsbedingungen und Darstellung wie in Figur 5.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins durch gram-negative Bakterien, welches mithilfe eines die äußere Membran dieser Bakterien partiell öffnenden Systems zumindest teilweise in das die Bakterien umgebende Medium abgegeben wird, dadurch gekennzeichnet, daß das herzustellende rekombinante Protein unter der Kontrolle eines Promotors aus einem gram-positiven Organismus, vorzugsweise aus einem der Gattung Bacillus exprimiert wird, der das zugehörige Gen oder ein zu diesem hochhomologes Gen natürlicherweise nicht reguliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den gram-negativen Bakterien um coliforme Bakterien handelt, insbesondere um solche der Gattungen Escherichia coli oder Klebsiella.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den coliformen Bakterien um Derivate von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, ganz besonders um solche der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), £ coli RV308, £ coli DH5α, E.coli JM109, £ coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf) handelt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um den unter der Anmeldenummer DSM 14225 hinterlegten Stamm oder um ein Derivat dieses Stammes handelt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem die äußere Membran partiell öffnenden Systems um das Colicin-System aus £ coli handelt, insbesondere um das Kil-Protein und/oder um ein unter der Kontrolle des /7c-Promotors oder eines anderen Stationärphasen-Promotors stehendes System.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Expressions-Promotor um einen nicht notwendigerweise von außen zu induzierenden Promotor, vorzugsweise um einen konstitutiven Promotor und besonders bevorzugt um den ß-Glucanase-Promotor von Bacillus amyloliquefaciens handelt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Sekretionskompetenz über eine Sekretionskassette vermittelt wird, insbesondere eine, die ins Chromosom integriert vorliegt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionskassette auf einem anderen Replikon als die Sekretionskassette liegt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionskassette auf demselben Replikon wie die Sekretionskassette liegt, insbesondere in der Form, daß die Expressionskassette der Sekretionskassette unmittelbar vor- oder nachgeschaltet ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionskassette und/oder die Sekretionskassette auf einem Plasmid vorliegen, das autonom replizieren kann, vorzugsweise auf demselben Plasmid.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt.

12. Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Hydrolase, insbesondere eine Amylase, Glucanase, Protease, Lipase oder Cellulase handelt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß rekombinante Proteine Phytasen, insbesondere bakterielle Phytasen hergestellt werden.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß zur Sekretion der Phytase das kil-Gen von £ coli unter der Kontrolle eines Stationärphasenpromotors von £ coli, vorzugsweise des //c-Promotors verwendet wird.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß das membranöffnende System, insbesondere das kil-Gen über eine Sekretionskassette bereitgestellt wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen der Phytase unter der Kontrolle des ß-Glucanase-Promotors von Bacillus amyloliquefaciens steht.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß als Wirtsstamm Escherichia coli BL21 (DE3) verwendet wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß als Expressionsvektoren die Vektoren pPhyt109 oder pPhyt119/4 oder von diesen abgeleitete Vektoren verwendet werden.

19. Sekretionskassette, welche die für die Membran-öffnenden Eigenschaften des Membran-öffnenden Systems verantwortlichen genetischen Elemente besitzt, insbesondere das Colicin-System aus £ coli und/oder einen Stationärphasenpromotor, ganz besonders das Gen für das Kil-Protein und/oder einen Stationärphasenpromotor aus £ coli, hierunter besonders den f/c-Promotor.

20. Sekretionskassette nach Anspruch 19, die unmittelbar vor- oder nachgeschaltet zusätzlich eine Expressionskassette enthält, die das Transgen und einen Promotor als dessen Kontrollelement enthält, hierunter insbesondere einen nicht notwendigerweise von außen zu induzierenden Promotor, vorzugsweise einen konstitutiven Promotor und besonders bevorzugt den ß-Glucanase-Promotor von Bacillus amyloliquefaciens.

21. Sekretionskassette nach Anspruch 20, die als Transgen das Gen für ein Enzym enthält, vorzugsweise das einer Hydrolase, insbesondere das einer Amylase, Glucanase, Protease, Lipase oder Cellulase oder das einer bakteriellen Phytase.

22. Vektor, der in gram-negativen Bakterien replizieren kann, der eine Sekretionskassette nach einem der Ansprüche 19 bis 21 enthält, insbesondere einen, der zusätzlich die Expressionskassette enthält.

23. Expressionsvektor nach Anspruch 22 für gram-negative Bakterien, insbesondere für coliforme Bakterien, hierunter insbesondere für solche der Spezies Escherichia coli oder Klebsiella, ganz besonders einen der Vektoren pAmy63, pPhyt 109 oder pPhyt119/4 oder einen, der sich von einem dieser Vektoren ableiten läßt, insbesondere durch Austausch des zu exprimierenden Gens.

24. Klonierungsvektor mit einer Sekretionskassette nach einem der Ansprüche 19 bis 21.

25. Gram-negativer Bakterienstamm, der in vektorieller Lokalisation eine Sekretionskassette nach einem der Ansprüche 19 bis 21 trägt, insbesondere ein coliformer Bakterienstamm, ganz besonders der Gattungen Escherichia coli oder Klebsiella und hierunter insbesondere Derivate von £ coli K12, £ coli B oder Klebsiella platicola.

26. Bakterienstamm nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß er sich von £ coli BL21 (DE3), £ coli RV308, £ coli DH5α, £ coli JM109, £ coli XL-1 , von Klebsiella platicola (Rf) oder von dem unter der Anmeldenummer DSM 14225 hinterlegten Stamm ableitet.

27. Bakterienstamm nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich einen Expressionsvektor mit einem Promotor und ein von diesem Promotor reguliertes Gen enthält.

28. Bakterienstamm nach einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß er nach Transformation mit einem der Vektoren nach einem der Ansprüche 22 bis 24 erhalten worden ist.

29. Gram-negativer Bakterienstamm, der in chromosomaler Lokalisation eine Sekretionskassette nach einem der Ansprüche 19 bis 21 trägt, insbesondere coliforme Bakterien, und hierunter insbesondere Stämme von Escherichia coli oder Klebsiella, vorzugsweise von Derivaten von Escherichia coli K12 oder Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, ganz besonders von solchen der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1, Klebsiella planticola (Rf), und hierunter insbesondere von solchen des unter der Anmeldenummer DSM 14225 hinterlegten Stammes.

30. Bakterienstamm nach einem der Ansprüche 25 bis 29, der das rekombinante Protein unter der Kontrolle eines nicht notwendigerweise von außen zu induzierenden Promotors, vorzugsweise eines konstitutiven Promotors und besonders bevorzugt des ß- Glucanase-Promotors von Bacillus amyloliquefaciens (bgl-Promotor) exprimiert.

31. Derivat des unter der Anmeldenummer DSM 14225 hinterlegten Mikroorganismus.

32. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er nach Transformation mit einem der Vektoren nach einem der Ansprüche 22 bis 24 erhalten worden ist.

33. Verfahren zur Fermentation von gram-negativen Bakterien, die ein rekombinantes Protein produzieren, welches mithilfe eines die äußere Membran dieser Bakterien partiell öffnenden Systems zumindest teilweise in das die Bakterien umgebende Medium abgegeben wird, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Protein unter der Kontrolle eines Promotors aus einem gram-positiven Organismus, vorzugsweise aus einem der Gattung Bacillus exprimiert wird, der das zugehörige Gen oder ein zu diesem hochhomologes Gen natürlicherweise nicht reguliert.

34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß Bakterien nach einem der Ansprüche 25 bis 31 eingesetzt werden.

35. Verfahren nach Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation über eine Zulaufstrategie durchgeführt wird.

36. Verfahren zur Fermentation eines Bakterienstamms nach einem der Ansprüche 33 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß das hergestellte Protein nachträglich aus dem Fermentationsmedium geerntet wird.

37. Verfahren zur Fermentation eines Bakterienstamms nach einem der Ansprüche 33 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß das hergestellte Protein kontinuierlich während der Fermentation entnommen wird.