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EP1054960A1 - Heteroaromatische oligoamide als affinitätsliganden - Google Patents

Heteroaromatische oligoamide als affinitätsliganden

Info

Publication number
EP1054960A1
EP1054960A1 EP99907452A EP99907452A EP1054960A1 EP 1054960 A1 EP1054960 A1 EP 1054960A1 EP 99907452 A EP99907452 A EP 99907452A EP 99907452 A EP99907452 A EP 99907452A EP 1054960 A1 EP1054960 A1 EP 1054960A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
heteroaromatic
oligoamides
nitrocarboxylic acid
acid unit
amino group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99907452A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Herwig Buchholz
Michael Schulte
Burkhard König
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Publication of EP1054960A1 publication Critical patent/EP1054960A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 and B01D15/30 - B01D15/36, e.g. affinity, ligand exchange or chiral chromatography
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/42—Nitro radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the invention relates to the use of heteroaromatic oligoamides as affinity ligands in chromatography, and to particularly preferred processes for the preparation of heteroaromatic oligoamides.
  • Oligoamides are suitable as affinity ligands for the affinity chromatographic separation of DNA.
  • Heteroaromatic oligoamides belong to the classes of compounds that bind to DNA (D.S. Johnson and D.L. Boger (1996) in Comprehensive Supramolecular Chemistry; Pergamon). Other possible uses of this class of compounds are also known; these include use as model substances in sequence-specific DNA recognition, use as regulatory factors in molecular biology or as gene-specific pharmaceuticals. Heteroaromatic oligoamides are characterized by peptide bonds between aminocarboxylic acids that have a heteroaromatic core. Syntheses for this class of compounds are also known. However, previously described synthetic routes, e.g. that of E.E. Baird and P.B. Dervan (1996) in J. Am. Chem. Soc. 118. Pages 6141 - 6146, described, because of the additional protective group chemistry extremely expensive. However, the simplest possible synthetic routes should be available for the provision of an affinity ligand.
  • heteroaromatic oligoamides can be synthesized by means of solid phase synthesis without the need to introduce protective groups.
  • Known or also new heteroaromatic oligoamides can thus be provided in a simple manner; these compounds, which are accessible on improved synthetic routes, are in particular also available as affinity ligands.
  • the invention relates to chromatographic separation materials for the separation of nucleic acids comprising a base support and an affinity ligand, the affinity ligand containing a heteroaromatic radical of the formula I,
  • Y is -NCH 3 - or -O-.
  • the invention also relates to the use of these
  • the invention relates to processes for the preparation of heteroaromatic oligoamides which contain a heteroaromatic radical of the formula I,
  • step f detachment of the heteroaromatic oligoamide from the polymeric carrier; g) optional implementation of the carboxyl group formed in step f).
  • Figure 1 shows an example of the synthesis scheme according to the invention.
  • Figures 2 and 3 show some examples of heteroaromatic oligoamides as can be obtained by the process according to the invention.
  • Figure 4 shows how the chain extension can be monitored by 1 H NMR measurement.
  • Peptide syntheses on solid phases are known under the name Merrifield synthesis.
  • An insoluble resin serves as the carrier.
  • This method is used in many variants, for example different carrier materials or di- or tripeptides are used instead of individual amino acids.
  • Another variant of this synthesis in which a dissolved polymer (e.g. polyethylene glycol) serves as a carrier, was developed by M. Mutter et al. (1971) Angew. Chem 83, pages 883-884.
  • heteroaromatic oligoamides are easily accessible.
  • Monomer units from different classes of compounds such as aliphatic or aromatic aminocarboxylic acids or such as sulfonamide or urea derivatives can also be inserted into the oligoamide chain; Examples are given under numbers 2-12, 2-13 and 2-14 in Figure 2, and under numbers 3-13 and 3-15 in Figure 3.
  • the term heteroaromatic polyamides according to the invention thus also includes compounds which in some cases also contain subunits which have an aromatic nucleus and / or whose peptide bond is derived from a sulfonamide or a urea group, the - 5 -
  • Proportion of these deviating structural elements does not affect more than half of the number of monomer units or structural elements.
  • insoluble polymers e.g. crosslinked DIOL or epoxy modified poly (met) acrylates or derivatized inorganic materials, such as e.g. DIOL or epoxy modified silica gel, or also soluble polymers, such as e.g. Polyethylene glycol derivatives
  • all of these variants are combined as solid-phase syntheses on polymeric supports.
  • the first nitrated heteroaromatic carboxylic acid unit (short: nitrocarboxylic acid unit) is bound to the support as the first monomer unit. This binding can be done directly or via a spacer; the use of spacers is from D. Gravert and K.D. Janda (1997) (Proc. Natl.
  • ⁇ - ⁇ -diamines e.g. Ethylene diamine or 1, 6-diaminohexane
  • ⁇ -aminocarboxylic acids or ⁇ -hydroxycarboxylic acids can be used.
  • the polymeric carrier used is, in particular, methoxypolyethylene glycol, in particular with a molecular weight of
  • Reaction chains known to those skilled in the art are available for binding the first monomer unit: for example, an acid chloride of a nitrated heteroaromatic carboxylic acid can be reacted with an aliphatic hydroxyl group on the polymeric support. It is also possible, for example, to bind a nitrated heteroaromatic carboxylic acid to the polymeric support by reaction with water-releasing agents, such as, for example, dicylclohexylcarbodiimide, or by activating the hydroxyl group or the carboxyl group. Suitable reactions and the necessary reaction conditions are known, for example, from peptide chemistry and are described in common manuals in this field. In the following reaction step, the nitro group is reduced to an amino group.
  • water-releasing agents such as, for example, dicylclohexylcarbodiimide
  • Suitable reduction methods are known to the person skilled in the art. Catalytic reduction with ammonium formate is preferred in the presence of palladium (NH 4 HCO 2 / Pd / C in CH 2 Cl 2 : methanol). After the catalyst has been separated off by filtration, the polymer-bound amine can be precipitated by adding ether and dissolved in CH 2 CI 2 , excess NH 4 HCO 2 remaining in the residue.
  • the next monomer unit can then be inserted, the procedures already mentioned above being available for the formation of the peptide bond.
  • the nitro group of the newly inserted monomer unit is again reduced to the amino group, as already described in the preceding.
  • These reaction sequences can be repeated until the reaction product has the desired length.
  • the desired sequence can be achieved by selecting the monomer units.
  • aromatic nitrosulfonyl chlorides or nitroisocyanates or other aminocarboxylic acids can also be used, the sequence variations mentioned above being generated.
  • the nitro group of the last monomer unit can be reacted further using known processes; it is also possible to use a carboxylic acid without a nitro group as the monomer unit.
  • nitrated (hetero) aromatic carboxylic acids and their derivatives required for the process according to the invention are commercially available or can be obtained by standard methods of organic synthesis.
  • the heteroaromatic oligoamide produced can be split off from the polymeric support by known methods, for example hydrolytically. be.
  • the released heteroaromatic oligoamide can then optionally be reacted further, for example by introducing a spacer group, or by binding the heteroaromatic oligoamide directly to a chromatographic base support.
  • the polymeric support is suitable as a base support for chromatography, the heteroaromatic oligoamide can also remain on the polymeric support and the product can be used directly as a chromatographic separating material.
  • base support for chromatography means materials on the basis of which chromatographic separation materials can be provided; these include, for example: crosslinked organic polymers, such as styrene-divinylbenzene copolymers or such as copolymers based on poly (meth) acrylates, polysaccharides and their derivatives, silica gels and their derivatives.
  • Base supports can be both porous with pore sizes customary in chromatography and non-porous. Base supports can also be present in particulate form with dimensions customary in chromatography, but also in non-particulate form, for example as column-shaped shaped bodies or as membranes. Such materials are known to the person skilled in the art and their properties and use are described in manuals.
  • the chromatographic separation materials according to the present invention are used for affinity chromatography and therefore contain heteroaromatic oligoamides as affinity ligands which are responsible for the interaction between the analyte and the chromatographic separation material.
  • Figure 1 shows an example of a reaction sequence in two variants: methoxypolyethylene glycol (MeO-PEG-OH) with an average molecular weight of 5000 served as the polymeric carrier.
  • MeO-PEG-OH methoxypolyethylene glycol
  • the first heterocyclic monomer unit is introduced in ester bond (reaction step a)).
  • the binding capacity of the polymeric carrier for the first heterocyclic monomer unit is approximately 2.5 g / 100 g of carrier.
  • the nitro group is then added with NH 4 HCO 2 / Pd / C in CH 2 CI 2 : methanol (1: 8; v: v)
  • reaction step b Room temperature reduced to the amino group within one hour (reaction step b)).
  • the solid catalyst is filtered off.
  • the amine bound to the polymeric carrier is then precipitated with diethyl ether.
  • the amine bound to the polymeric support is then dissolved with CH 2 Cl 2 and can be used for the next coupling step; excess NH 4 HCO 2 remains.
  • the acid chloride (2) can be reacted in the presence of pyridine (reaction step c)).
  • reaction step c the free acid (5) instead of the acid chloride (2) and this with dicyclohexylcarbodiimide (DCC / HOBt) to the
  • reaction step d To bind amino group (reaction step d)). By repeating the reduction and coupling step, trimers and tetramers are obtained (reaction step e)). After the desired sequence and chain length have been reached, the heteroaromatic oligoamide is hydrolytically cleaved from the polymeric support by alkali treatment (reaction step f)).
  • Figures 2 and 3 show examples of some other heteroaromatic oligoamides, which are easily accessible through the process according to the invention.
  • Figures 2 and 3 show examples of some other heteroaromatic oligoamides, which are easily accessible through the process according to the invention.
  • Figures 2 and 3 show examples of some other heteroaromatic oligoamides, which are easily accessible through the process according to the invention.
  • Figures 2 and 3 show examples of some other heteroaromatic oligoamides, which are easily accessible through the process according to the invention.
  • room temperature means a temperature between 15 and 30 ° C.
  • the reference symbols used in Examples 1 and 2 below refer to Figure 1.
  • Example 1 Binding of the first monomer unit to polyethylene glycol First stage (coupling reaction): 10 g methoxypolyethylene glycol (MeO-1)
  • PEG-OH with an average molecular weight of 5000 are dissolved in 50 ml of CH 2 CI 2 .
  • the reaction solution is then filtered and the polymer-bound product is precipitated by adding 800 ml of diethyl ether and filtered off.
  • the product is reprecipitated twice and dried in vacuo, it can be analyzed by means of NMR spectroscopy.
  • Example 2 Introduction of further monomer units stage 1 (coupling): The solution from the second stage of example 1 is stirred with 570 mg of 1-methyl-4-nitro-1H-pyrrole-2-carbonyl chloride (1) and 1 ml dry pyridine was added and the mixture was stirred for a further 12 hours at room temperature. The reaction solution is then filtered and the polymer-bound product (6) is precipitated by adding 400 ml of diethyl ether and filtered off. The product is reprecipitated twice and dried in vacuo, it can be analyzed by means of NMR spectroscopy. The yield is quantitative.
  • the catalyst is filtered off and the product is precipitated by adding 400 ml of diethyl ether and filtered off.
  • the white residue obtained is treated with 25 ml of CH 2 Cl 2 , the polymer-bound product going into solution and unused ammonium formate remaining. The residue is filtered off; the solution of the polymer-bound product can be used directly for the coupling of the next monomer unit.
  • the cycle of coupling reaction and reduction can be repeated several times.
  • the oligomer ((7); (8)) As soon as the oligomer ((7); (8)) has reached the desired chain length, it is hydrolytically cleaved from the polymeric carrier by treatment with 2 N NaOH at 50 ° C. (duration 6 hours) (reaction f)). The free carboxylic acid of the heteroaromatic oligoamide ((9); (10)) is formed. The yield is quantitative.
  • Formula 3-15 mean: n 1, 2, or 3;
  • Example 5 Binding of a heteroaromatic oligoamide to an azlactone-activated carrier
  • the result is a chromatographic separating material which contains a derivatized heteroaromatic oligoamide as separation effector.
  • the result is a chromatographic separating material which contains a derivatized heteroaromatic oligoamide as separation effector.

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Abstract

Die Erfindung betrifft chromatographische Trennmaterialien für die Trennung von Nukleinsäuren umfassend einen Basisträger und einen Affinitätsliganden, wobei der Affinitätsligand einen heteroaromatischen Rest der Formel (I) enthält, worin X - CH= oder-N= und Y-NCH3- oder-O- bedeuten. Weiterhin wird ein Syntheseweg für die Herstellung von heteroaromatischen Oligoamiden offenbart, bei dem an einem polymeren Träger die heteroaromatischen Amideinheiten als nitrierte heteroaromatische Carbonsäurederivate eingeführt werden, ohne daß Schutzgruppen vonnöten wären.

Description

- 1 -
Heteroaromatische Oligoamide als Affinitätsliganden
Die Erfindung betrifft die Verwendung von heteroaromatischen Oligo- amiden als Affinitätsliganden in der Chromatographie, sowie besonders bevorzugte Verfahren zur Herstellung von heteroaromatischen Oligo- amiden.
Für die Aufreinigung von DNA-Fragmenten und für die Abreicherung von DNA aus biologischen Präparaten stehen bisher nur wenige Affinitäts- liganden zur Verfügung. Es wurde gefunden, daß heteroaromatische
Oligoamide als Affinitätsliganden für die affinitätschromatographische Trennung von DNA geeignet sind.
Heteroaromatische Oligoamide gehören zu den Verbindungsklassen, die an DNA binden (D.S. Johnson und D.L. Boger (1996) in Comprehensive Supramolecular Chemistry; Pergamon). Weitere Anwendungsmöglichkeiten dieser Verbindungsklasse sind ebenfalls bekannt; dazu gehören die Verwendung als Modellsubstanzen bei der sequenzspezifischen DNA- Erkennung, Verwendung als Reguiationsfaktoren in der Molekularbiologie oder als genspezifische Pharmaka. Heteroaromatische Oligoamide sind durch Peptidbindungen zwischen Aminocarbonsäuren, die einen heteroaromatischen Kern aufweisen, gekennzeichnet. Synthesen für diese Verbindungsklasse sind ebenfalls bekannt. Jedoch sind bisher beschriebene Synthesewege, wie z.B. der von E.E. Baird und P.B. Dervan (1996) in J. Am. Chem. Soc. 118. Seiten 6141 - 6146, beschriebene, wegen der zusätzlichen Schutzgruppenchemie äußerst aufwendig. Für die Bereitstellung eines Affinitätsiiganden sollten jedoch möglichst einfache Synthesewege zur Verfügung stehen.
Es besteht also die Aufgabe, Trennmateriaiien für die Affinitätschromatographie von Nukleinssäuren bereitzustellen. Um diese Aufgabe möglichst wirtschaftlich zu lösen, besteht insbesondere die zusätzliche Aufgabe, ein- fache Synthesewege ohne Schutzgruppenchemie für heteroaromatische Oligoamide bereitzustellen.
Es wurde gefunden, daß ausgehend von nitrierten heteroaromatischen Carbonsäurederivaten heteroaromatische Oligoamide mittels Festphasensynthese synthetisiert werden können, ohne daß Schutzgruppen eingeführt werden müssen. Somit können bekannte oder auch neue heteroaromatische Oligoamide in einfacher Weise bereitgestellt werden; diese auf verbesserten Synthesewegen zugänglichen Verbindungen stehen insbesondere auch als Affinitätsliganden zur Verfügung.
Gegenstand der Erfindung sind chromatographische Trennmaterialien für die Trennung von Nukleinsäuren umfassend einen Basisträger und einen Affinitätsliganden, wobei der Affinitätsligand einen heteroaromatischen Rest der Formel I enthält,
worin X -CH= oder -N= und
Y -NCH3- oder -O- bedeuten. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung dieser
Trennmaterialien für die chromatographische Trennung von Nukleinsäuren. — O ~
Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Herstellung von heteroaromatischen Oligoamiden, die einen heteroaromatischen Rest der Formel I enthalten,
worin
X -CH= oder -N= und Y -NCH3- oder -O- bedeuten, wobei folgende Verfahrensschritte ausgeführt werden: a) Bindung einer heteroaromatischen Nitrocarbonsäureeinheit an einen polymeren Träger, wobei die erzeugte Bindung unter Bedingungen gespalten werden kann, bei denen Amidbindungen intakt bleiben; b) Reduktion der Nitrogruppe der an den polymeren Träger gebundenen heteroaromatischen Nitrocarbonsäure zu einer Aminogruppe; c) Bindung einer weiteren heteroaromatischen Nitrocarbonsäureeinheit an die in Schritt b) entstandenen Aminogruppe, wobei dieselbe heteroaromatische Nitrocarbonsäureeinheit wie im Schritt a) oder eine heteroaromatische Nitrocarbonsäureeinheit mit anderer Struktur eingeführt wird; d) Wiederholung der Schritte b) und c) bis die gewünschte Kettenlänge und Sequenz erzielt ist; e) optionale Dehvatisierung der zuletzt eingeführten Nitro- oder Amino- gruppe; - 4 -
f) Ablösung des heteroaromatischen Oligoamids vom polymeren Träger; g) optionale Umsetzung der in Schritt f) entstandenen Carboxylgruppe.
Abbildung 1 zeigt beispielhaft das erfindungsgemäße Syntheseschema.
Einzelheiten finden sich in den Beispielen. Die Abbildungen 2 und 3 zeigen einige Beispiele für heteroaromatische Oligoamide, wie sie durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden können. Abbildung 4 zeigt, wie die Kettenverlängerung durch 1H-NMR-Messung verfolgt werden kann.
Peptidsynthesen an Festphasen sind unter der Bezeichnung Merrifield- Synthese bekannt. Als Träger dient dabei ein unlösliches Harz. Dieses Verfahren wird in vielen Varianten verwendet, beispielsweise werden unterschiedliche Trägermaterialien oder Di- oder Tripeptide anstelle von einzelnen Aminosäuren benutzt. Eine weitere Variante dieser Synthese, bei der ein gelöstes Polymer (z.B. Polyethylenglykol) als Träger dient, wurde von M. Mutter et al. (1971 ) Angew.Chem 83, Seite 883 - 884 beschrieben.
Es wurde gefunden, daß unter Verwendung von polymeren Trägern auf der Grundlage von nitrierten heteroaromatischen Carbonsäurederivaten heteroaromatische Oligoamide in einfacher Weise zugänglich sind. Dabei können in die Oligoamidkette auch Monomereinheiten aus abweichenden Verbindungsklassen wie aliphatische oder aromatischen Aminocarbon- säuren oder wie Sulfonamid- oder Harnstoffderivate eingefügt sein; Beispiele sind unter den Ziffern 2-12, 2-13 und 2-14 in Abbildung 2, sowie unter den Ziffern 3-13 und 3-15 in Abbildung 3 gegeben. Unter den erfindungsgemäßen Begriff heteroaromatische Polyamide fallen somit auch Verbindungen, die teilweise auch Untereinheiten enthalten, die einen aromatischen Kern aufweisen, und/oder deren Peptidbindung sich von einer Sulfonsäureamid- oder einer Harnstoffgruppierung ableitet, wobei der - 5 -
Anteil dieser abweichenden Strukturelemente nicht mehr als die Hälfte der Anzahl der Monomereinheiten beziehungsweise Strukturelemente betrifft.
Als polymere Träger können sowohl unlösliche Polymerisate, z.B. vernetzte DIOL- oder epoxid modifizierte Poly(met)acrylate oder derivatisierte anorganische Materialien, wie z.B. DIOL- oder epoxid modifiziertes Kieselgel, oder auch lösliche Polymerisate, wie z.B. Polyethylenglykolderivate, verwendet werden. Alle diese Varianten werden erfindungsgemäß als Festphasensynthesen an polymeren Trägern zusammengefaßt. In einer ersten Stufe wird als erste Monomereinheit die erste nitrierte heteroaromatische Carbonsäureeinheit (kurz: Nitrocarbonsäureeinheit) an den Träger gebunden. Diese Bindung kann direkt oder über einen spacer erfolgen; die Verwendung von spacern ist von D . Gravert und K.D. Janda (1997) beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92, Seiten 6419 - 6423). Als spacer können beispielsweise α-ω-Diamine, wie z.B. Ethylendiamin oder 1 ,6-Diaminohexan, sowie ω-Aminocarbonsäuren oder ω-Hydroxycarbon- säuren verwendet werden. Als polymerer Träger wird insbesondere Methoxypolyethylenglykol, insbesondere mit einem Molekulargewicht von
103 bis 104 bevorzugt.
Für die Bindung der ersten Monomereinheit stehen dem Fachmann bekannte Reaktionsketten zur Verfügung: So kann ein Säurechlorid einer nitrierten heteroaromatischen Carbonsäure mit einer aliphatischen Hydroxylgruppe auf dem polymeren Träger zur Reaktion gebracht werden. Außerdem ist es beispielsweise möglich, eine nitrierte heteroaromatische Carbonsäure durch Reaktion mit wasserabspaltenden Agentien, wie z.B. Dicylclohexylcarbodiimid, oder durch die Aktivierung der Hydroxylgruppe oder der Carboxylgruppe an den polymeren Träger zu binden. Geeignete Reaktionen und die notwendigen Reaktionsbedingungen sind beispiels- weise aus der Peptidchemie bekannt und in gängigen Handbüchern dieses Fachgebietes beschrieben. Im folgenden Reaktionsschritt wird die Nitrogruppe zu einer Aminogruppe reduziert. Geeignete Reduktionsmethoden sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugt wird die katalytische Reduktion mit Ammoniumformiat in Gegen- wart von Palladium (NH4HCO2/Pd/C in CH2CI2:Methanol). Nach Abtrennung des Katalysators durch Filtration kann das polymergebundene Amin durch Zugabe von Ether ausgefällt werden und in CH2CI2 gelöst werden, wobei überschüssiges NH4HCO2 im Rückstand verbleibt.
Anschließend kann die nächste Monomereinheit eingefügt werden, wobei für die Bildung der Peptidbindung die oben bereits genannnten Vorgehensweisen zur Verfügung stehen. Die Nitrogruppe der neu eingefügten Monomereinheit wird wiederum wie bereits im vorgehenden beschrieben zur Aminogruppe reduziert. Diese Reaktionsfolgen können wiederholt werden, bis das Reaktionsprodukt die gewünschte Länge aufweist. Durch Auswahl der Monomereinheiten kann die gewünschte Sequenz erzielt werden. Dabei können neben verschiedenen nitrierten heterocyclischen Carbonsäuren auch aromatische Nitrosulfonylchloride oder Nitroisocyanate oder andere Aminocarbonsäuren eingesetzt werden, wobei die oben genannten Sequenzvariationen erzeugt werden. Die Kettenverlängerung durch den
Einbau der Monomereinheiten kann durch NMR-Messung verfolgt werden.
Die Nitrogruppe der letzten Monomereinheit kann nach bekannten Verfahren weiter umgesetzt werden; es ist ebenfalls möglich als Monomereinheit eine Carbonsäure ohne Nitrogruppe zu verwenden.
Die für das erfindungsgemäße Verfahren benötigten nitrierten (hetero)- aromatischen Carbonsäuren und deren Derivate sind kommerziell erhältlich oder nach Standardmethoden der organischen Synthese zugänglich.
Falls gewünscht, kann das erzeugte heteroaromatische Oligoamid vom polymeren Träger nach bekannten Methoden, z.B. hydrolytisch, abgespal- ten werden. Anschließend kann das freigesetzte heteroaromatische Oligoamid gegebenenfalls weiter umgesetzt werden, z.B. indem man eine spacer-Gruppierung einführt, oder indem man das heteroaromatische Oligoamid direkt an einen chromatographischen Basisträger bindet. Falls der polymere Träger als Basisträger für die Chromatographie geeignet ist, kann das heteroaromatische Oligoamid auch auf dem polymeren Träger verbleiben und das Produkt direkt als chromatographisches Trennmaterial Verwendung finden.
Unter dem Begriff Basisträger für die Chromatographie werden Materialien verstanden, auf deren Grundlage chromatographische Trennmaterialien bereitgestellt werden können; dazu gehören beispielsweise: vernetzte organische Polymere, wie Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisate oder wie Copolymerisate auf der Grundlage von Poly(meth)acrylaten, Polysaccha- ride und deren Derivate, Kieselgele und deren Derivate. Basisträger können sowohl porös mit in der Chromatographie üblichen Porenweiten als auch unporös vorliegen. Basisträger können außerdem in partikulärer Form mit in der Chromatographie üblichen Abmessungen, aber auch in nicht-partikulärer Form beispielsweise als säulenförmige Formkörper oder als Membranen, vorliegen. Derartige Materialien sind dem Fachmann bekannt und deren Eigenschaften und Verwendung in Handbüchern beschrieben. Viele geeignete Materialien sind zudem kommerziell erhältlich. Die chromatographischen Trennmaterialien entsprechend der vorliegenden Erfindung werden für die Affinitätschromatographie eingesetzt und enthalten deswegen heteroaromatische Oligoamide als Affinitätsliganden, die für die Wechselwirkung zwischen dem Analyten und dem chromatographischen Trennmaterial verantwortlich sind.
In Abbildung 1 ist eine Reaktionsfoige in zwei Varianten beispielhaft dargestellt: Methoxypolyethylenglycol (MeO-PEG-OH) mit einem mittleren Molekulargewicht von 5000 diente als polymerer Träger. Durch Umsetzung mit 1-Methyl-4-nitro-1 H-pyrrol-2-carbonylchlorid (1 ) mit MeO- - o -
PEG-OH unter Standardbedingungen wird die erste heterocyclische Monomereinheit in Esterbindung eingeführt (Reaktionsschritt a)). Die Bindungskapazität des polymeren Trägers beträgt für die erste heterocyclische Monomereinheit ca. 2,5 g/100 g Träger. Anschließend wird die Nitrogruppe mit NH4HCO2/Pd/C in CH2CI2:Methanol (1 :8; v:v) bei
Raumtemperatur innerhalb einer Stunde zur Aminogruppe reduziert (Reaktionsschritt b)). Der feste Katalysator wird abfiltriert. Das an den polymeren Träger gebundene Amin wird anschließend mit Diethylether ausgefällt. Anschließend wird das an den polymeren Träger gebundene Amin mit CH2CI2 gelöst und kann für den nächsten Kopplungsschritt verwendet werden; überschüssiges NH4HCO2 bleibt zurück. Für den nächsten Kopplungsschritt kann das Säurechlorid (2) in Gegenwart von Pyridin zur Reaktion gebracht werden (Reaktionsschritt c)). Es ist an dieser Stelle auch möglich, statt des Säurechlorides (2) die freie Säure (5) einzusetzen und diese mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC/HOBt) an die
Aminogruppe zu binden (Reaktionsschritt d)). Durch die Wiederholung des Reduktions- und des Kopplungsschrittes werden Trimere und Tetramere erhalten (Reaktionsschritt e)). Nachdem gewünschte Sequenz und Kettenlänge erreicht sind, wird das heteroaromatische Oligoamid durch Alkalibehandlung hydrolytisch vom polymeren Träger abgespalten (Reaktionsschritt f)).
In den Abbildungen 2 und 3 sind beispielhaft einige weitere heteroaromatische Oligoamide dargestellt, wie sie durch das erfindungsgemäße Verfah- ren auf einfache Weise zugänglich sind. In den Abbildungen 2 und 3 bedeuten:
R MeO-PEG-O- oder HO-
X -CH= oder -N= n 1 , 2 oder 3
Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, daß ein Fachmann die obige Beschreibung in weitesten Umfang nutzen kann. Die - y -
bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeine Weise limitierende Offenbarung aufzufassen.
Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen, sowie der korrespondierenden Anmeldung DE 198 05 431.9, eingereicht am 1.02.1998, sind durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.
Beispiele
Im folgenden bedeutet Raumtemperatur eine Temperatur zwischen 15 und 30 °C. Die im folgenden in den Beispielen 1 und 2 benutzten Verweis- zeichen beziehen sich auf Abbildung 1.
Beispiel 1 : Bindung des ersten Monomerbausteines an Polyethylenglykol Erste Stufe (Kopplunαsreaktion): 10 g Methoxypolyethylenglykol (MeO-
PEG-OH) mit einem mittleren Molekulargewicht von 5000 werden in 50 ml CH2CI2 gelöst. Unter Rühren werden 1 ,2 g 1-Methyl-4-nitro-1 H-pyrrol-2- carbonylchlorid (1 ) und 2 ml trockenes Pyridin zugefügt und die Mischung weitere 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird die Reaktionslösung filtriert und das polymergebundene Produkt durch Zugabe von 800 ml Diethylether ausgefällt und abgefiltert. Das Produkt wird zweimal umgefällt und im Vakuum getrocknet, es kann mittels NMR- Spektroskopie analysiert werden.
Die Ausbeute ist quantitativ. 100 g MeO-PEG-OH binden ca. 2,5 g 1-
Methyl-4-nitro-1 H-pyrrol-2-carbonylchlorid. - 10 -
Zweite Stufe (Reduktion): 5 g des Produktes (3) aus Stufe 1 werden mit 200 mg Pd/C (10 %) und 1 g Ammoniumformiat in 50 ml CH2CI2 / Methanol (1 :8; v:v) gemischt und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Der Katalysator wird abfiltriert und das Produkt durch Zugabe von 400 ml
Diethylether ausgefällt und abfiltriert. Der erhaltene weiße Rückstand wird mit 25 ml CH2CI2 behandelt, wobei das polymergebundene Produkt in Lösung geht und unverbrauchtes Ammoniumformiat zurückbleibt. Der Rückstand wird abfiltriert; die Lösung des polymergebundenen Produktes (4) kann unmittelbar für die Kopplung der nächsten Monomereinheit verwendet werden.
Beispiel 2: Einführung von weiteren Monomerbausteinen Stufe 1 (Kopplung): Die Lösung aus der zweiten Stufe von Beispiel 1 wird unter Rühren mit 570 mg 1-Methyl-4-nitro-1 H-pyrrol-2-carbonylchlorid (1 ) und 1 ml trockenem Pyridin versetzt und die Mischung weitere 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird die Reaktionslösung filtriert und das polymergebundene Produkt (6) durch Zugabe von 400 ml Diethylether ausgefällt und abgefiltert. Das Produkt wird zweimal umgefällt und im Vakuum getrocknet, es kann mittels NMR-Spektroskopie analysiert werden. Die Ausbeute ist quantitativ.
- 1 1 -
Zweite Stufe (Reduktion): 5 g des Produktes (6) aus Stufe 1 werden mit 200 mg Pd/C (10 %) und 1 g Ammoniumformiat in 50 ml CH2CI2 / Methanol (1 :8; v:v) gemischt und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Der Katalysator wird abfiltriert und das Produkt durch Zugabe von 400 ml Diethylether ausgefällt und abfiltriert. Der erhaltene weiße Rückstand wird mit 25 ml CH2CI2 behandelt, wobei das polymergebundene Produkt in Lösung geht und unverbrauchtes Ammoniumformiat zurückbleibt. Der Rückstand wird abfiltriert; die Lösung des polymergebundenen Produktes kann unmittelbar für die Kopplung der nächsten Monomereinheit verwendet werden.
Der Zyklus aus Kopplungsreaktion und Reduktion kann mehrfach wiederholt werden.
Beispiel 3: Abspaltung des heteroaromatischen Oligoamids vom polymeren Träger
Sobald das Oligomere ((7); (8)) die gewünschte Kettenlänge erreicht hat, wird es durch Behandlung mit 2 N NaOH bei 50 °C (Dauer 6 Stunden) hydrolytisch vom polymeren Träger abgespalten (Reaktion f)). Es entsteht die freie Carbonsäure des heteroaromatischen Oligoamids ((9); (10)). Die Ausbeute ist quantitativ.
Beispiel 4: Weitere Umsetzungen an einem heteroaromatischen
Oligoamid
In einem nach den vorhergehenden Beispielen erhaltenen polymergebundenen heteroaromatischen Oligoamid wird die Nitrogruppe zur Aminogruppe reduziert und anschließend mit Glycin umgesetzt. Nach der hydrolytischen Abspaltung vom polymeren Träger wird die Carboxylgruppe mit N,N-Dimethylpropylendiamin umgesetzt. Beispielhafte Reaktionsprodukte sind in Abbildung 3, Formel 3-15, dargestellt. - 12 -
In Abbildung 3, Formel 3-15, bedeuten: n 1 , 2 oder 3;
X -CH= oder -N=.
Beispiel 5: Bindung eines heteroaromatischen Oligoamids an einen azlacton-aktivierten Träger
2 g eines azlactonaktivierten Trägers (Fractogel® Azlacton; Art. Nr. 10 087; Merck KGaA) werden in einer Lösung von 150 mM NaCI in 40 ml
Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und 100 mg eines nach Beispiel 4 erhaltenen derivatisierten heteroaromatischen Oligoamides (n=1 ; X= -CH=) unter Rühren zugefügt und über Nacht bei Raumtemperatur weiter gerührt.
Das erhaltene Produkt wird abfiltriert. Überschüssige Azlactongruppen werden durch Reaktion mit 0,2 M Glycin in Tris-Puffer (pH 8,0) bei 40 °C (2
Stunden) inaktiviert. Das Produkt wird abgesaugt und mit Phosphatpuffer pH 7 gewaschen.
Es resultiert ein chromatographisches Trennmaterial, das als Separations- effektor ein derivatisiertes heteroaromatisches Oligoamid enthält.
Beispiel 6: Bindung eines heteroaromatischen Oligoamids an einen epoxy-aktivierten Träger 2 g eines epoxyaktivierten Trägers (Fractogel® Epoxy; Art. Nr. 16 279; Merck KGaA) werden in einer Lösung von 150 mM NaCI in 40 ml Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und 100 mg eines nach Beispiel 4 erhaltenen derivatisierten heteroaromatischen Oligoamides (n=1 ; X= -CH=) unter Rühren zugefügt und 72 Stunden bei 40 °C weiter gerührt. Das erhaltene Produkt wird abfiltriert. Überschüssige Epoxygruppen werden durch Reaktion mit 0,2 M Glycin in Tris-Puffer (pH 8,0) bei 40 °C (2 - 13 -
Stunden) inaktiviert. Das Produkt wird abgesaugt und mit Carbonatpuffer pH 10 gewaschen.
Es resultiert ein chromatographisches Trennmaterial, das als Separationseffektor ein derivatisiertes heteroaromatisches Oligoamid enthält.

Claims

- 14 -Ansprüche
1. Chromatographisches Trennmaterial für die Trennung von Nukleinsäuren umfassend einen Basisträger und einen Affinitätsliganden, dadurch gekennzeichnet, daß der Affinitätsligand einen heteroaromatischen Rest der Formel I in Amidbindung enthält,
worin
X -CH= oder -N= und
Y -NCH3- oder -O- bedeuten.
2. Verfahren zur Herstellung von heteroaromatischen Oligoamiden, die einen heteroaromatischen Rest der Formel I in Amidbindung enthalten,
- 15 -
worin
X -CH= oder -N= und
Y -NCH3- oder -O- bedeuten, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: a) Bindung einer heteroaromatischen Nitrocarbonsäureeinheit an einen polymeren Träger, wobei die erzeugte Bindung unter Bedingungen gespalten werden kann, bei denen Amidbindungen intakt bleiben; b) Reduktion der Nitrogruppe der an den polymeren Träger gebundenen heteroaromatischen Nitrocarbonsäure zu einer Aminogruppe; c) Bindung einer weiteren heteroaromatischen Nitrocarbonsäureeinheit an die in Schritt b) entstandenen Aminogruppe, wobei dieselbe heteroaromatische Nitrocarbonsäureeinheit wie im Schritt a) oder eine heteroaromatische Nitrocarbonsäureeinheit mit anderer Struktur eingeführt wird; d) Wiederholung der Schritte b) und c) bis die gewünschte Kettenlänge und Sequenz erzielt ist; e) optionale Derivatisierung der zuletzt eingeführten Nitro- oder Aminogruppe; f) Ablösung des heteroaromatischen Oligoamids vom polymeren Träger; g) optionale Umsetzung der in Schritt f) entstandenen Carboxylgruppe.
3. Verwendung eines chromatographischen Trennmaterials nach Anspruch 1 für die Trennung von Nukleinsäuren.
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