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EP1015023A1 - Verwendung eines sekretionsvektors zur fertilitätskontrolle durch orale vakzinierung - Google Patents

Verwendung eines sekretionsvektors zur fertilitätskontrolle durch orale vakzinierung

Info

Publication number
EP1015023A1
EP1015023A1 EP98929286A EP98929286A EP1015023A1 EP 1015023 A1 EP1015023 A1 EP 1015023A1 EP 98929286 A EP98929286 A EP 98929286A EP 98929286 A EP98929286 A EP 98929286A EP 1015023 A1 EP1015023 A1 EP 1015023A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
secretion
proteins
fertility control
gene
fragments
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP98929286A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Peter Donner
Werner Goebel
Andreas Demuth
Ivaylo Gentschev
Jürgen Hess
Stefan Kaufmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Pharma AG
Original Assignee
Schering AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Schering AG filed Critical Schering AG
Publication of EP1015023A1 publication Critical patent/EP1015023A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0006—Contraceptive vaccins; Vaccines against sex hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/16—Masculine contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/18—Feminine contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the invention relates to a method for fertility control by oral vaccination using attenuated Salmonella or other Gram-negative attenuated vaccine strains using various expression systems which allow the generation of a targeted MHCII / CD4 or MHCI / CDg immune response.
  • the antigen characterized by Moore and Lee as well as the SP-10 immunogen were described by the "World Health Organization" (special area for vaccines for fertility regulation) as primary vaccine candidates (Anderson et al., 1987).
  • the three protein components of the zona pellucida (ZP), an extracellular matrix that surrounds mammals, are also suitable as antigens. These proteins are usually referred to as ZPA, ZPB and ZPC (Wassarmann, 1987, Science 235, 553-560).
  • ZPA zona pellucida
  • ZPB ZPC
  • the egg-sperm interaction is to be blocked or influenced by an immunological blockade.
  • the zona protein which is responsible for the initial binding of the sperm to the zona, have also confirmed this.
  • (a) contains the complete hemolysin operon including the hly-specific promoter and an enhancer-like regulator hlyR and in which
  • the genes or gene fragments suitable for fertility control encode zona pellucida proteins. In a preferred embodiment of the invention, the genes or gene fragments suitable for fertility control encode zona pellucida proteins.
  • the secretion vector is pMOhlyl.
  • the Salmonella strain is Salmonella typhimurium.
  • the genes or gene fragments suitable for fertility control code for zona pellucida proteins, the secretion vector is pMOhlyl and the Salmonella strain is Salmonella typhimurium.
  • Genes or gene fragments suitable for fertility control are understood to mean all genes or gene fragments which code for proteins or protein fragments suitable for fretility control.
  • HlyA Escherichia coli hemolysin
  • HlyAg transport signal
  • the E. coli hemolysin secretion system is made up of three membrane proteins. Two of these proteins, HlyB (Gentschev & Goebel, 1990) and HlyD (Schülein et al, 1992), are located in the inner membrane and are encoded by genes that are part of the hemolysin determinant. This consists of an operon including the four genes hlyC, hlyA, hlyB and hlyD (Wagner et al, 1983; Hess et al., 1986). The third protein of the translocation system, TolC, is located in the outer membrane (Wandersman & Delepelaire, 1990).
  • HlyAg is fused with other proteins or protein fragments to secrete these fusion proteins with the aid of the hemolysin secretion system (Blight & Holland 1994; Gentschev et al., 1994).
  • the secretion efficiency depends on the folding and conformation of the reporter protein.
  • the E. coli hemolysin secretion system is functional in attenuated Salmonella, which act as vaccine strains, and can be used to export fusion proteins (Gentschev et al, 1992; Su et al., 1992).
  • the genetic systems used for this have so far been based on two components: a plasmid which carries the genes necessary for transport [hlyB and hlyD) and a plasmid which allows the expression of fusion proteins (Gentschev et al, 1992; Hess et al., 1990).
  • the secretion vector pMOhlyl (Gentschev et al., 1995) carries the complete hemolysin operon (Goebel & Hedgpeth, 1982) including the hly-specific promoter and an enhancer-like regulator hlyR (Vogel et al, 1988).
  • HlyAg carboxy terminal amino acids
  • the genetic information for antigens with a size of 10-1000 amino acids can be inserted into this secretion vector pMOhlyl, which enables the secretion of these antigens in attenuated Salmonella and other Gram-negative attenuated vaccine strains (e.g. BEcoli, Vibrio cholerae, Yeresina enterocoliticä).
  • attenuated Salmonella and other Gram-negative attenuated vaccine strains e.g. BEcoli, Vibrio cholerae, Yeresina enterocoliticä.
  • the transport of heterologous fusion proteins is made possible by a single plasmid.
  • hemolysin secretion apparatus in comparison to transport systems previously used for an antigen presentation, which are only suitable for the transport of usually only relatively short peptides to the outside of the bacterial cell (Cardenas & Clements, 1992) is the significantly more variable size of the transport-competent proteins.
  • the same antigen can be presented in suitable attenuated Gram-negative vaccine strains in a cytoplasmic, surface-bound or in secreted form.
  • listeriolysin from Listeria monocytogenes
  • Salmonella vaccine strain By using listeriolysin (from Listeria monocytogenes) made secretable in Salmonella, it can additionally be achieved that the same antigen is processed in the phagosome or, to a greater extent, in the cytosol of the antigen-presenting macrophage cell after infection with the antigen-producing Salmonella vaccine strain (Gentschev et al., 1995). With this possibility it can be achieved that enhanced CD4 + or CD8 + T-cell responses are induced (Hess et al., 1996).
  • cytokines and soluble cytokine receptors are also secreted separately or in combination with the antigen to be produced in attenuated Salmonella (Schülein, 1993; Gentschev, unpublished), the immune response (e.g. towards TJJI or Tpj2) can also be varied.
  • the efficient secretion of proteins or protein fragments / HlyAs fusions suitable for fertility control and the high stability of the vector enable a completely new, highly specific contraceptive vaccination with the help of attenuated Salmonella or other Gram-negative attenuated vaccine strains.
  • the antigen proteins or protein fragments suitable for fertility control
  • the antigen becomes accessible to the host's immune system by secretion of the proteins or protein fragment / HlyAg fusions suitable for fertility control and, depending on the protein epitope and the secretion pathway, leads to activation of B and / or T cells.
  • HlyAs is a weak antigen for B and T cells
  • HlyAg fusions induce antibodies and T cells that are mainly directed against the part of the reporter antigen.
  • Attenuated Salmonella and Yersinia strains that secrete antigens are particularly suitable for inducing a humoral, mucosal immune response and are therefore preferred.
  • Induction of mucosal immunity also results in the production of antigen-specific antibodies to distant mucosal Surfaces. Therefore, a B cell response at the site of infection also stimulates mucosal immunity in the reproductive tract.
  • Figure 1 shows a vector map of the secretion plasmid pMOhlyl.
  • Figure 2 shows a Western blot in which various pMOhlyl / (hu) ZPA / constructs were tested for expression and secretion.
  • the supernatant proteins were separated by SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) in a 15% polyacrylamide gel and, after transfer to nitrocellulose with a polyclonal antibody directed against the hemolysin portion of the fusion protein, tested for expression and secretion.
  • AI stands for the huZPA-1 construct (see Figure 7)
  • A4 stands for the huZPA-4 construct (see Figure 7)
  • pMO stands for the vector control
  • B4 stands for the huZPB-4 construct (see Figure 8) .
  • Figure 3 shows a Western blot in which various pMOhlyl / (hu) ZPB / constructs were tested for expression and secretion.
  • Bl stands for the huZPB-1 construct (see Figure 8)
  • B2 stands for the huZPB-2 construct (see Figure 8)
  • B3 stands for the huZPB-3 construct (see Figure 8)
  • B4 stands for the huZPB -4 construct (see Figure 8)
  • B5 stands for the huZPB-5 construct (see Figure 8)
  • pMO stands for vector control.
  • Figure 4 shows a Western blot in which various pMOhlyl ⁇ hu) ZPC / constructs were tested for expression and secretion.
  • the supernatant proteins were separated by SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) in a 15% polyacrylamide gel and, after transfer to nitrocellulose with a polyclonal antibody directed against the hemolysin portion of the fusion protein, tested for expression and secretion.
  • Cl stands for the huZPC-1 construct (see Figure 9)
  • C2 stands for the huZPC-2 construct (see Figure 9)
  • C3 stands for the huZPC-3 construct (see Figure 9)
  • pMO stands for vector control .
  • Figure 5 shows a Western blot in which various pMOhlyl / (m) ZPB / constructs were tested for expression and secretion.
  • the supernatant proteins were separated by SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) in a 15% polyacrylamide gel and after transfer to nitrocellulose with a polyclonal Antibody directed against the hemolysin portion of the fusion protein tested for expression and secretion.
  • Bl stands for the mZPB-1 construct (see Figure 10)
  • B2 stands for the mZPB-2 construct (see Figure 10)
  • B3 stands for the mZPB-3 construct (see Figure 10)
  • B4 stands for the mZPB -4 construct (see Figure 10)
  • pMO stands for vector control.
  • Figure 6 shows a Western blot in which various pMOhlyl (hu) ZPB constructs were tested for expression and secretion.
  • S. typhimurium SL7207 After transformation of S. typhimurium SL7207 with the various pMO / (hu) ZPB constructs, 2 ml of supernatant culture supernatant with 10% (v / v) TCA (trichloroacetic acid) was precipitated on ice for 4 h, pelleted by centrifugation and in SDS sample buffer resuspended.
  • TCA trichloroacetic acid
  • the supernatant proteins were separated by SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) in a 15% polyacrylamide gel and, after transfer to nitrocellulose, tested for expression and secretion with a polyclonal antibody which is directed against the hemolysin portion of the fusion protein.
  • Bl stands for the huZPB-1 construct (see Figure 8)
  • B2 stands for the huZPB-2 construct (see Figure 8)
  • B3 stands for the huZPB-3 construct (see Figure 8)
  • B4 stands for the huZPB -4 construct (see Figure 8)
  • B5 stands for the huZPB-5 construct (see Figure 8)
  • pMO stands for vector control.
  • Figure 7 shows a Western blot in which various pMOhlyl (hu) ZPC / constructs were tested for expression and secretion.
  • the supernatant proteins were separated by SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) in a 15% polyacrylamide gel and tested for expression and secretion after transfer to nitrocellulose with a polyclonal antibody directed against the hemolysin portion of the fusion protein.
  • Cl stands for the huZPC-1 construct (see Figure 12)
  • C2d stands for the huZPC-2 construct with a double insert (see Figure 12)
  • C3d stands for the huZPC-3 construct with double insert (see Figure 12)
  • C4 stands for the huZPC-4 construct (see Figure 12)
  • pMO stands for the vector control.
  • Figure 8 shows a gene map of the cDNA from huZPA.
  • the arrows show the positions of the primers selected for PCR amplification (Table 1), the numbers indicating the starting point at the 5 ' end of the primer in relation to the start codon of the cDNA sequence of the gene.
  • the filled rectangles show the amino terminal transport signal, the putative fusion cleavage site and a strongly hydrophobic area at the C-terminus that could act as a membrane anchor.
  • the fragments amplified by PCR are shown in the lower part with the start and end point, which result from an Nsi-I restriction endonuclease digestion of the PCR products, and are designated continuously with huZPA-1, huZPA-2 etc.
  • the length of the fragments is given both in base pairs (bp) and in amino acids (aa).
  • the calculated molecular weights are given in kDa for the zona fragments and in brackets for the zona / HlyA fusion proteins. Finally, it is indicated whether secretion of the fusion proteins was detected with an antibody directed against the HlyA portion.
  • Figure 9 shows a gene map of the CDNA from huZPB.
  • the arrows show the positions of the primers selected for PCR amplification (Table 1), the numbers indicating the starting point at the 5 'end of the primer in relation to the start codon of the cDNA sequence of the gene.
  • the filled rectangles show the amino terminal transport signal, the putative fusion cleavage site and a strongly hydrophobic area at the C-terminus that could act as a membrane anchor.
  • the fragments amplified by PCR are shown in the lower part with the start and end point, which result from an Nsi-I restriction endonuclease digestion of the PCR products, and are continuously designated with huZPB-1, huZPB-2 etc.
  • the length of the fragments is given both in base pairs (bp) and "in amino acids (aa).
  • the calculated molecular weights are given in kDa for the zona fragments and in brackets for the zona / HlyA fusion proteins indicated whether a secretion of the fusion proteins with an antibody directed against the HlyA portion was detected.
  • Figure 10 shows a gene map of the cDNA from huZPC.
  • the arrows show the positions of the primers selected for PCR amplification (Table 1), the numbers indicating the starting point at the 5 ' end of the primer in relation to the start codon of the cDNA sequence of the gene.
  • the filled rectangles show the amino terminal transport signal, the putative fusion cleavage site and a strongly hydrophobic area at the C-terminus, which could act as a membrane anchor.
  • the fragments amplified by PCR are shown in the lower part with the start and end point, which result from an Nsi-I restriction endinuclease digestion of the PCR products, and are continuously designated with huZPC-1, huZPC-2 etc.
  • the length of the fragments is given both in base pairs (bp) and in amino acids (aa).
  • the calculated molecular weights are given in kDa for the zona fragments and in brackets for the zona / HlyA fusion proteins. Finally, it is indicated whether secretion of the fusion proteins was detected with an antibody directed against the HlyA portion.
  • Figure 11 shows a gene map of the cDNA from mZPB.
  • the arrows show the positions of the primers selected for PCR amplification (Table 1), the numbers indicating the starting point at the 5 'end of the primer in relation to the start codon of the cDNA sequence of the gene.
  • the filled rectangles show the amino terminal transport signal, the putative fusion cleavage site and a strongly hydrophobic area at the C-terminus, which could act as a membrane anchor.
  • the fragments amplified by PCR are shown in the lower part with the start and end point, which result from an Nsi-I restriction endonuclease digestion of the PCR products, and are designated continuously with mZPB-1, huZPB-2 etc.
  • Figure 12 shows a gene map of the cDNA from huZPC.
  • the arrows show the positions of the primers selected for PCR amplification (Table 1), the numbers indicating the starting point at the 5 ' end of the primer in relation to the start codon of the cDNA sequence of the gene.
  • the fragments amplified by PCR are shown in the lower part with the start and end point, which result from an Nsi-I restriction endinuclease digestion of the PCR products, and are designated continuously with huZPC-1, huZPC-2 etc. Furthermore, the length of the fragments is given both in base pairs (bp) and in amino acids (aa). The calculated molecular weights are given in kDa for the zona fragments and in brackets for the zona / HlyA fusion proteins. Finally, it is indicated whether secretion of the fusion proteins was detected with an antibody directed against the HlyA portion.
  • the present invention includes pharmaceutical preparations for all uses and methods described.
  • the invention includes pharmaceutical preparations which contain the attenuated bacteria with the secretion vector according to the present invention.
  • Oral administration is preferably carried out in the form of encapsulated biodegradable polymers, for example PLPG.
  • the starting point of the cloning strategy are the plasmids pGEX-KG-huZPA, pGEX-KG-huZPB and pGEX-KG-huZPC (Peter Bringmann, Schering AG), which carry the cDNA of the human ZPA, ZPB and ZPC genes and ovarian mRNA of the mouse which enabled the cDNA synthesis of the mouse ZPB gene.
  • pGEX-KG-huZPA pGEX-KG-huZPB
  • pGEX-KG-huZPC Peter Bringmann, Schering AG
  • RNA 5 ⁇ g RNA were mixed in 32 ⁇ l DEPC-H2O with 3 ⁇ l oligo-dT primer and for 5 min at 65 ° C incubated. The mixture is allowed to cool for 10 min at room temperature and the following reagents are added: 5 ⁇ l synthesis buffer, 5 ⁇ l 0.1 M DTT, 1 ⁇ l RNase inhibitor, 3 ⁇ l 25 mM dNTPs and 1 ⁇ l MMLV reverse transcriptase (20 U / ⁇ l) ( Is Strand Synthesis Kit, Stratagene). This is followed by an incubation for 1 h at 37 ° C.
  • cDNA was amplified with the corresponding 5 'and 3' primers (each 1 ⁇ M final concentration), dNTPs (each 200 ⁇ M) and 2.5 U Taq DNA polymerase (Promega) and the manufacturer's buffer in a volume of 100 ⁇ l.
  • denaturation was carried out for 3 min at 91 ° C. This was followed by 30 cycles under the following conditions: 1 min denaturation at 91 ° C, 1 min annealing at 55 ° C and 1 min extension at 72 ° C.
  • the reaction products were separated electrophoretically in a 2% agarose gel and visualized by staining with ethidium bromide.
  • the pMOhlyl derivatives described were then transformed into the S. typhimurium LB5000 strain, which lacks the restriction system, so that E. coli DNA can be introduced efficiently into this strain.
  • the strain S. typhimurium SL7207 was successfully transformed. As already described several times, this strain is suitable as a vaccination strain.
  • the ZP / Hly fusion proteins are also secreted in this strain.
  • Figure 6 shows an example of the expression and secretion of the huZPB fragments in Salmonella. These salmonella expressing ZP / Hly should induce mucosal immunity in mice after oral administration, which is also specifically directed against the ZP portion of the fusion protein.
  • Example 2 shows an example of the expression and secretion of the huZPB fragments in Salmonella. These salmonella expressing ZP / Hly should induce mucosal immunity in mice after oral administration, which is also specifically directed against the ZP portion of the fusion protein.
  • the starting point of the cloning strategy are the plasmids pGEX-KG-huZPA, pGEX-KG-huZPB and pGEX-KG-huZPC (Peter Bringmann, Schering AG), which carry the cDNA of the human ZPA, ZPB and ZPC genes and ovarian mRNA of the mouse which enabled the cDNA synthesis of the mouse ZPB gene.
  • pGEX-KG-huZPA pGEX-KG-huZPB
  • pGEX-KG-huZPC Peter Bringmann, Schering AG
  • 5 ⁇ g RA were mixed in 32 ⁇ l DEPC-H2O with 3 ⁇ l oligo-dT primer and for 5 min at 65 ° C incubated. The mixture is allowed to cool for 10 min at room temperature and the following reagents are added: 5 ⁇ . Synthesis buffer, 5 ⁇ l 0 1 M DTT, 1 ⁇ l RNase inhibitor, 3 ⁇ l 25 ⁇ iM dNTPs and 1 ⁇ l MMLV reverse transcriptase (20 U / ⁇ l) (is Strand Synthesis Kit, Stratagene). This is followed by an incubation for 1 h at 37 ° C.
  • cDNA was amplified with the corresponding 5 'and 3' primers (each 1 ⁇ M final concentration), dNTPs (each 200 ⁇ M) and 2.5 U Taq DNA polymerase (Promega) and the manufacturer's buffer in a volume of 100 ⁇ l.
  • denaturation was carried out for 3 min at 91 ° C. This was followed by 30 cycles under the following conditions: 1 min denaturation at 91 ° C, 1 min annealing at 55 ° C and 1 min extension at 72 ° C.
  • the reaction products were separated electrophoretically in a 2% agarose gel and visualized by staining with ethidium bromide.
  • huZPA fragments huZPB fragments and hu ZPC could be detected with the help of a polyclonal antibody, which is directed against the hemolysin portion of the fusion protein (see above).
  • the pMOhlyl derivatives described were then transformed into the Y. enterocolitica LB5000 strain, which lacks the restriction system, so that E. coli ONA can be efficiently introduced into this strain.
  • the strain Y. enterocolitica WapYv-515 was successfully transformed. As already described several times, this strain is suitable as a vaccination strain.
  • the ZP / Hly fusion proteins are also secreted in this strain.
  • Figure 7 shows an example of the expression and secretion of the huZPC fragments in Y. enterocolitica. These ZP / Hly-expressing Yersinia should induce mucosal immunity in mice after oral administration, which is also specifically directed against the ZP portion of the fusion protein.
  • Underlined bases indicate a deviation from the respective ZP sequence in order to introduce the Nsi I interface necessary for cloning.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Fertilitätskontrolle durch orale Vakzinierung mittels attenuierter Salmonellen oder anderer Gram-negativer attenuierter Impfstämme unter Verwendung verschiedener Expressionssysteme, welche die Erzeugung einer gezielten MHCII/CD4 oder MHCI/CD8 Immunantwort erlaubt, beschrieben.

Description

Verwendung eines Sekretionsvektors zur Fertilitätskontrolle durch orale Vakzinierung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fertilitätskontrolle durch orale Vakzinierung mittels attenuierter Salmonellen oder anderer Gram-negativer attenuierter Impfstämme unter Verwendung verschiedener Expressionssysteme, welche die Erzeugung einer gezielten MHCII/CD4 oder MHCI/CDg Immunantwort erlauben.
Stand der Technik
Es ist seit langem bekannt, daß Frauen und Männer mit signifikant hohen Antikörpertitern gegen menschliche Spermien oft infertil sind oder eine reduzierte Fertilität aufweisen (Ingerslev und Ingerslev, 1989; Chen und Jones, 1981; Menge et al., 1982; Bronson et al., 1984). Es wurde ebenso gezeigt, daß die Immunisierung von weiblichen und männlichen Tieren mit Extrakten von gesamten Spermien zur Induktion einer Infertilität führen kann (Kummerfeld und Foote, 1979; Munoz und Metz; 1978; Tung et al., 1979; Menge et al., 1979). Primakoff et al. (1988a) verwendeten einen monoklonalen Antikörper, um das Meerschweinchen-spezifische Spermien-oberflächenantigen PH-20 zu isolieren und konnten zeigen, daß die Injektion von diesem gereinigten Antigen in weiblichen oder männlichen Meerschweinchen eine langanhaltende Immunisierung gegen Fertilität erzeugt (1988b). Für eine Anzahl anderer monoklonaler Antikörper, die gegen ejakulierte humane Spermien oder isolierte Spermien anderer Spezies gerichtet sind, konnte gezeigt werden, daß sie mit menschlichen Spermien kreuzreagieren. Einige reagieren mit Komponenten des seminalen Plasmas und andere erkennen Antigene testiculären Ursprungs. Monoklonale Antikörper, welche humane Spermien immobilisieren oder agglutinieren oder die Spermienbindung und die Penetration von zonafreien Hamsteroocyten inhibieren, sind beschrieben worden. Zur Zeit sind mehrere humane Spermienantigene bekannt, wie zum Beispiel das Mr 95,000 Antigen (Moore et al., 1987); das 55 kDa Antigen, welches von den S36-37 mAbs (HSA-63) von Lee (Liu et al., 1990) erkannt wird; und das humane Homolog der Spermienrezeptoren von ZP-C (in der Maus bestimmt von Saling und Bliel und Wassarman (Bliel, 1990; Leyton und Saling, 1989). Von weiterem Interesse ist das FA-1 Antigen der Maus und des Menschen, welches zum Teil charakteresiert wurde (Naz, 1988) und das 24kDa Antigen aus Rattentestis und menschlicher Testis (Shaha et al., 1990). Die von Moore und Lee charakterisierten Antigen wie auch das SP-10 Immunogen wurden von der "World Health Organization" (Sonderbereich für Vakzine zur Fertilitätsregulation) als primäre Vakzinekandidaten beschrieben (Anderson et al., 1987). Auch die drei Proteinkomponenten der Zona pellucida (ZP), einer extrazellulären Matrix, die das Säugerei umgibt, eignen sich als Antigene. Diese Proteine werden in der Regel als ZPA, ZPB und ZPC bezeichnet (Wassarmann, 1987, Science 235, 553-560). Durch eine immunologische Blockade soll hierbei die Ei-Spermium-Interaktion blockiert oder beeinflußt werden. Versuche mit rekombinant hergestelltem ZPC, dem Zona Protein, welches für die initiale Bindung des Spermiums an die Zona verantwortlich gemacht wird, haben dies auch bestätigt. In allen bisher berichteten Fällen kam es allerdings bei langfristiger Immunisierung zu einer irreversiblen Schädigung des Ovars (Skinner et al., 1984, Endocrinology 115, 2418- 2432). Der Mechanismus dieses Verlustes der ovariellen Funktion ist bis heute nicht aufgeklärt.
Es wurde nun gefunden, daß durch die Insertion von zur Fertilitätskontrolle geeigneten Genen oder Genfragmenten in einen Sekretionsvektor der
(a) das vollständige Hämolysin-Operon einschließlich des hly spezifischen Promotors und eines Enhancer-ähnlichen Regulators hlyR enthält und bei dem
(b) ein Großteil des hlyA Gens deletiert wurde,
(c) die zur Fertilitätskontrolle geeigneten Proteine oder Proteinfragmente synthetisiert und
(d) durch die Sekretion dieser Antigene durch attenuierte Salmonellen oder andere Gramnegative attenuierte Impfstämmen,
(e) eine orale Vakzinierung erzeugt wird.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung kodieren die zur Fertilitätskontrolle geeigneten Gene oder Genfragmente für Zona pellucida Proteine. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung kodieren die zur Fertilitätskontrolle geeigneten Gene oder Genfragmente für Zona pellucida Proteine.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung ist der Sekretionsvektor pMOhlyl.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung ist der Salmonella Stamm Salmonella typhimurium.
In einer besonders bevorzugten Ausführung kodieren die zur Fertilitätskontrolle geeigneten Gene oder Genfragmente für Zona pellucida Proteine, der Sekretionsvektor ist pMOhlyl und der Salmonella Stamm ist Salmonella typhimurium.
Unter zur Fertilitätskontrolle geeignete Gene oder Genfragmente werden alle Gene oder Genfragmente verstanden, die für zur Fretilitätskontrolle geeignete Proteine oder Proteinfragmente kodieren.
Die meisten Proteine, die über die innere Membran Gram-negativer Bakterien in das Periplasma transportiert werden, besitzen ein aminoterminales Signalpeptid, das während dieses sec-abhängigen Transportvorgangs abgespalten wird (Pugsley, 1993). Im Gegensatz hierzu wird das Hämolysin (HlyA) von Escherichia coli mit Hilfe eines Sekretionssystems über die innere und äußere Membran in das extrazelluläre Medium sezerniert. Im Gegensatz zum klassischen N-terminalen Transportsignal des sec-abhängigen Proteintransports trägt HlyA am C-Terminus ein Transportsignal (HlyAg), das von 50-60 Aminosäuren gebildet wird (Hess et al., 1990; Jarchau et al, 1994). Dieses HlyA-Signal wird im Verlauf der Sekretion nicht abgespalten und besitzt selbst kaum ein antigenes Potential.
Das Hämolysin-Sekretionssystem von E. coli wird von drei Membranproteihen gebildet. Zwei dieser Proteine, HlyB (Gentschev & Goebel, 1990) und HlyD (Schülein et al, 1992), sitzen in der inneren Membran und werden von Genen codiert, die Teil der Hämolysin-Determinante sind. Diese besteht aus einem Operon einschließlich der vier Gene hlyC, hlyA, hlyB und hlyD (Wagner et al, 1983; Hess et al., 1986). Das dritte Protein des Translokationssystems, TolC, ist in der äußeren Membran lokalisiert (Wandersman & Delepelaire, 1990). Die Translokation von HlyA über beide Membranen von Gram-negativen Bakterien erfordert Energie in Form von ATP und eines Membranpotentials der inneren Membran (Koronakis et al., 1995). In verschiedenen Fällen wurde bereits gezeigt, daß eine Fusion von HlyAg mit anderen Proteinen oder Proteinfragmenten zu einer Sekretion dieser Fusionsproteine mit Hilfe des Hämolysin-Sekretionssystems erfolgt (Blight & Holland 1994; Gentschev et al., 1994). Die Sekretionseffizienz ist hierbei von Faltung und Konformation des Reporterproteins abhängig. Das Hämolysin-Sekretionssystem von E. coli ist in attenuierten Salmonellen, die als Impfstämme füngieren, fünktionell und kann zum Export von Fusionsproteinen genutzt werden (Gentschev et al, 1992; Su et al., 1992). Die hierzu verwendeten genetischen Systeme basierten bisher auf zwei Komponenten: ein Plasmid, das die für den Transport notwendigen Gene [hlyB und hlyD) trägt, und ein Plasmid, das die Expression von Fusionsproteinen erlaubt (Gentschev et al, 1992; Hess et al., 1990).
Der Sekretionsvektor pMOhlyl (Gentschev et al., 1995) trägt das vollständige Hämolysin- Operon (Goebel & Hedgpeth, 1982) einschließlich des hly spezifischen Promotors und eines "Enhancer"-ähnlichen Regulators hlyR (Vogel et al, 1988). Ein Großteil des hlyA Gens wurde deletiert, so daß lediglich noch 34 aminoterminale und 61 carboxyterminale Aminosäuren (HlyAg) von HlyA codiert werden. Eine singuläre Nsi I Schnittstelle zwischen aminoterminalem und carboxyterminalem Rest von HlyA erlaubt eine Insertion von heterologen Genen oder Genfragmenten im Leseraster zu HlyAg. Die genetische Information für Antigene einer Größe von 10-1000 Aminosäuren kann in diesen Sekretionsvektor pMOhlyl inseriert werden, der die Sekretion dieser Antigene in attenuierten Salmonellen und anderen Gram-negativen attenuierten Impfstämmen (z. B. E.coli, Vibrio cholerae, Yeresina enterocoliticä) ermöglicht. Somit wird im Gegensatz zu anderen Sekretionssystemen der Transport von heterologen Fusionsproteinen durch ein einziges Plasmid ermöglicht. Ein weiterer wichtiger Vorteil des Hämolysinsekretionsapparates im Vergleich zu bisher für eine Antigen-Präsentation eingesetzten Transportsystemen, welche nur für den Transport von meist nur relativ kurzen Peptiden auf die Außenseite der Bakterienzelle geeignet sind (Cardenas & Clements, 1992), ist die bedeutend variablere Größe der transportkompetenten Proteine.
Durch Manipulation des HlyA Sekretionssystems läßt sich dasselbe Antigen in geeigneten attenuierten Gram-negativen Impfstämmen cytoplasmatisch, oberflächengebunden oder in sezemierter Form präsentieren. Durch Einsatz von in Salmonellen sekretionsfähig gemachtem Listeriolysin (aus Listeria monocytogenes) kann zusätzlich erreicht werden, daß dasselbe Antigen im Phagosom oder verstärkt im Cytosol der Antigen-präsentierenden Makrophagenzelle nach Infektion mit dem Antigen-produzierenden Salmonella-Impfstamm prozessiert wird (Gentschev et al., 1995). Mit dieser Möglichkeit läßt sich erreichen, daß verstärkte CD4+ oder CD8+ T-Zell-Antworten induziert werden (Hess et al., 1996) Da mit diesem Vektorsystem auch Cytokine und lösliche Cytokinrezeptoren getrennt oder in Kombination mit dem zu produzierenden Antigen in attenuierten Salmonellen sezerniert werden könnten (Schülein, 1993; Gentschev, unveröffentlicht), läßt sich die Immunantwort (z. B. in Richtung TJJI oder Tpj2) zusätzlich variieren.
Die effiziente Sekretion von zur Fertilitätskontrolle geeigneten Proteinen oder Proteinfragmenten/HlyAs-Fusionen und die hohe Stabilität des Vektors ermöglichen eine völlig neuartige, hochspezifische kontrazeptive Vakzinierung mit Hilfe attenuierter Salmonellen oder anderer Gram-negativer attenuierter Impfstämme. Nach oraler Applikation der rekombinanten Salmonellen wird durch Sekretion der zur Fertilitätskontrolle geeigneten Proteine oder Pro teinfragment/HlyAg -Fusionen das Antigen (zur.Fertilitätskontrolle geeignete Proteine oder Proteinfragmente) dem Immunsystem des Wirts zugänglich und führt je nach Protein-Epitop und nach Sekretionsweg zur Aktivierung von B- und/oder T-Zellen. Da HlyAs ein schwaches Antigen für B- und T-Zellen darstellt, werden durch HlyAg-Fusionen Antikörper und T-Zellen induziert, die hauptsächlich gegen den Teil des Reporter-Antigens gerichtet sind. Attenuierte Salmonella und Yersinia Stämme, die Antigene sezernieren eignen sich besonders zur Induktion einer humoralen, mucosalen Immunantwort und sind daher bevorzugt. Die Induktion einer mucosalen Immunität resultiert auch in der Produktion von Antigen-spezifischen Antikörpern an entfernt gelegene mucosale Oberflächen. Daher führt eine B-Zell-Antwort am Infektionsort auch zur Stimulierung einer mucosalen Immunität im Reproduktionstrakt.
Mit der hier offenbarten Erfindung ist es das erste Mal möglich, rekombinante Proteine oder Teile davon ohne aufwendige Herstellungsverfahren für die Erzeugung einer entsprechenden Immunantwort, welche zur Kontrazeption führt, direkt in situ zu erzeugen. Mit Hilfe entsprechender Vektoren können diese Proteine oder Proteinabschnitte in Phagosomen, intrazellulär oder extrazellulär zur Expression gebracht werden. Damit können bewußt humorale oder cytotoxische Immunantworten erzeugt werden.
Beschreibung der Abbildungen
Abbildung 1 zeigt eine Vektorkarte des Sekretionsplasmides pMOhlyl.
Abbildung 2 zeigt einen Western-blot, in dem verschiedene pMOhlyl/(hu) ZPA/Konstrukte auf die Expression und Sekretion getestet wurden. Nach Transformation von E. coli DH5α mit den verschiedenen pMOhlyl /(hu) ZPA/Konstrukten wurden 2 ml Überstand von Ubemachtkulturen mit 10% (v/v) TCA (Trichloressigsäure) für 4 h auf Eis präzipitiert, durch Zentrifugation pelletiert und in SDS-Probenpuffer resuspendiert. Die Überstandsproteine wurden durch SDS-PAGE (Polyacrylamidgelelktrophorese) in einem 15%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und nach Transfer auf Nitrocellulose mit einen polyklonalen Antikörper, der gegen den Hämolysinanteil des Fusionsproteinsgerichtet ist, auf die Expression und Sekretion getestet. AI steht für das huZPA-1-Konstrukt (siehe Abbildung 7), A4 steht für das huZPA-4-Konstrukt (siehe Abbildung 7), pMO steht für die Vektorkontrolle und B4 steht für das huZPB-4-Konstrukt (siehe Abbildung 8).
Abbildung 3 zeigt einen Western-blot, in dem verschiedene pMOhlyl/(hu) ZPB/Konstrukte auf die Expression und Sekretion getestet wurden. Nach Transformation von E. coli DH5α mit den verschiedenen pMOhlyl /(hu) ZPB/Konstrukten wurden 2 ml Überstand von Übemachtkulturen mit 10% (v/v) TCA (Trichloressigsäure) für 4 h auf Eis präzipitiert, durch
Zentrifügation pelletiert und in SDS-Probenpuffer resuspendiert. Die Überstandsproteine wurden durch SDS-PAGE (Polyacrylamidgelelktrophorese) in einem 15%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und nach Transfer auf Nitrocellulose mit einen polyklonalen Antikörper, der gegen den Hämolysinanteil des Fusionspro teinsgerichtet ist, auf die Expression und Sekretion getestet. Bl steht für das huZPB-1-Konstrukt (siehe Abbildung 8), B2 steht für das huZPB-2-Konstrukt (siehe Abbildung 8), B3 steht für das huZPB-3- Konstrukt (siehe Abbildung 8), B4 steht für das huZPB-4-Konstrukt (siehe Abbildung 8), B5 steht für das huZPB-5-Konstrukt (siehe Abbildung 8) und pMO steht für die Vektorkontrolle.
Abbildung 4 zeigt einen Western-blot, in dem verschiedene pMOhlyl Υhu) ZPC/Konstrukte auf die Expression und Sekretion getestet wurden. Nach Transformation von E. coli DH5α mit den verschiedenen pMOhlyl/(hu) ZPC/Konstrukten wurden 2 ml Überstand von Ubemachtkulturen mit 10% (v/v) TCA (Trichloressigsäure) für 4 h auf Eis präzipitiert, durch Zentrifügation pelletiert und in SDS-Probenpuffer resuspendiert. Die Überstandsproteine wurden durch SDS-PAGE (Polyacrylamidgelelktrophorese) in einem 15%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und nach Transfer auf Nitrocellulose mit einen polyklonalen Antikörper, der gegen den Hämolysinanteil des Fusionsproteinsgerichtet ist, auf die Expression und Sekretion getestet. Cl steht für das huZPC-1-Konstrukt (siehe Abbildung 9), C2 steht für das huZPC-2-Konstrukt (siehe Abbildung 9), C3 steht für das huZPC-3- Konstrukt (siehe Abbildung 9) und pMO steht für die Vektorkontrolle.
Abbildung 5 zeigt einen Western-blot, in dem verschiedene pMOhlyl /(m) ZPB/Konstrukte auf die Expression und Sekretion getestet wurden. Nach Transformation von E. coli DH5 mit den verschiedenen pMOhlyl /(m) ZPB/Konstrukten wurden 2 ml Überstand von Ubemachtkulturen mit 10% (v/v) TCA (Trichloressigsäure) für 4 h auf Eis präzipitiert, durch Zentrifügation pelletiert und in SDS-Probenpuffer resuspendiert. Die Überstandsproteine wurden durch SDS-PAGE (Polyacrylamidgelelktrophorese) in einem 15%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und nach Transfer auf Nitrocellulose mit einen polyklonalen Antikörper, der gegen den Hämolysinanteil des Fusionsproteinsgerichtet ist, auf die Expression und Sekretion getestet. Bl steht für das mZPB-1-Konstrukt (siehe Abbildung 10), B2 steht für das mZPB-2-Konstrukt (siehe Abbildung 10), B3 steht für das mZPB-3- Konstrukt (siehe Abbildung 10), B4 steht für das mZPB-4-Konstrukt (siehe Abbildung 10) und pMO steht für die Vektorkontrolle.
Abbildung 6 zeigt einen Western-blot, in dem verschiedene pMOhlyl (hu)ZPB Konstrukte auf Expression und Sekretion getestet wurden. Nach Transformation von S. typhimurium SL7207 mit den verschiedenen pMO/(hu)ZPB Konstrukten wurden 2 ml Überstand von Ubemachtkulturen mit 10% (v/v) TCA (Trichloressigsäure) für 4 h auf Eis präzipitiert, durch Zentrifügation pelletiert und in SDS-Probenpuffer resuspendiert. Die Überstandspro teins wurden durch SDS-PAGE (Polyacrylamidgelelktrophorese) in einem 15%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und nach Transfer auf Nitrocellulose mit einen polyklonalen Antikörper, der gegen den Hämolysinanteil des Fusionsproteinsgerichtet ist, auf die Expression und Sekretion getestet. Bl steht für das huZPB-1-Konstrukt (siehe Abbildung 8), B2 steht für das huZPB-2-Konstrukt (siehe Abbildung 8), B3 steht für das huZPB-3- Konstrukt (siehe Abbildung 8), B4 steht für das huZPB-4-Konstrukt (siehe Abbildung 8), B5 steht für das huZPB-5-Konstrukt (siehe Abbildung 8) und pMO steht für die Vektorkontrolle.
Abbildung 7 zeigt einen Western-blot, in dem verschiedene pMOhlyl (hu)ZPC/Konstrukte auf Expression und Sekretion getestet wurden. Nach Transformation von Yersinia enterocolitica WapYv-515 mit den verschiedenen pMO/(hu)ZPC/Konstrukten wurden 2 ml Überstand von Übernachtkulturen mit 10% (v/v) TCA (Trichloressigsäure) für 4 h auf Eis präzipitiert, durch Zentrifügation pelletiert und in SDS-Probenpuffer resuspendiert. Die Überstandsproteine wurden durch SDS-PAGE (Polyacrylamidgelelktrophorese) in einem 15%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und nach Transfer auf Nitrocellulose mit einen polyklonalen Antikörper, der gegen den Hämolysinanteil des Fusionsproteinsgerichtet ist, auf die Expression und Sekretion getestet. Cl steht für das huZPC-1-Konstrukt (siehe Abbildung 12), C2d steht für das huZPC-2-Konstrukt mit doppeltem Insert (siehe Abbildung 12 ), C3d steht für das huZPC-3-Konstrukt mit doppeltem Insert (siehe Abbildung 12), C4 steht für das huZPC-4-Konstrukt (siehe Abbildung 12) und pMO steht für die Vektorkontrolle.
Abbildung 8 zeigt eine Genkarte der cDNA von huZPA. Die Pfeile zeigen die Positionen der für eine PCR-Amplifikation ausgewählten primer (Tabelle 1), wobei die Zahlen den Startpunkt am 5 '-Ende des primers bezogen auf das Startcodon der cDNA-Sequenz des Gens angeben. Die gefüllten Rechtecke zeigen das aminoterminale Transportsignal, die putative Fusionsspaltstelle und einen stark hydrophoben Bereich am C-Terminus, der als Membrananker fungieren könnte. Die durch PCR amplifizierten Fragmente sind mit Start und Endpunkt, welche sich durch einen Nsi-I Restriktionsendonukleaseverdau der PCR-Produkte ergeben, im unteren Teil abgebildet und fortlaufend mit huZPA-1, huZPA-2 usw. bezeichnet. Weiterhin ist die Länge der Fragmente sowohl in Basenpaaren (bp) als auch in Aminosäuren (aa) angegeben. Die berechneten Molekulargewichte sind für die Zona-Fragmente und in Klammem für die Zona/HlyA Fusionsproteine in kDa wiedergegeben. Schließlich ist angegeben, ob eine Sekretion der Fusionsproteine mit einem gegen den HlyA- Anteil gerichteten Antikörper nachgewiesen wurde.
Abbildung 9 zeigt eine Genkarte der CDNA von huZPB. Die Pfeile zeigen die Positionen der für eine PCR-Amplifikation ausgewählten primer (Tabelle 1), wobei die Zahlen den Startpunkt am 5 '-Ende des primers bezogen auf das Startcodon der cDNA-Sequenz des Gens angeben. Die gefüllten Rechtecke zeigen das aminoterminale Transportsignal, die putative Fusionsspaltstelle und einen stark hydrophoben Bereich am C-Terminus, der als Membrananker fungieren könnte. Die durch PCR amplifizierten Fragmente sind mit Start und Endpunkt, welche sich durch einen Nsi-I Restriktionsendonukleaseverdau der PCR-Produkte ergeben, im unteren Teil abgebildet und fortlaufend mit huZPB-1, huZPB-2 usw. bezeichnet. Weiterhin ist die Länge der Fragmente sowohl in Basenpaaren (bp) als auch" in Aminosäuren (aa) angegeben. Die berechneten Molekulargewichte sind für die Zona-Fragmente und in Klammem für die Zona/HlyA Fusionsproteine in kDa wiedergegeben. Schließlich ist angegeben, ob eine Sekretion der Fusionsproteine mit einem gegen den HlyA-Anteil gerichteten Antikörper nachgewiesen wurde.
Abbildung 10 zeigt eine Genkarte der cDNA von huZPC. Die Pfeile zeigen die Positionen der für eine PCR-Amplifikation ausgewählten primer (Tabelle 1), wobei die Zahlen den Startpunkt am 5 '-Ende des primers bezogen auf das Startcodon der cDNA-Sequenz des Gens angeben. Die gefüllten Rechtecke zeigen das aminoterminale Transportsignal, die putative Fusionsspaltstelle und einen stark hydrophoben Bereich am C-Terminus, der als Membrananker füngieren könnte. Die durch PCR amplifizierten Fragmente sind mit Start und Endpunkt, welche sich durch einen Nsi-I Restriktionsendinukleaseverdau der PCR-Produkte ergeben, im unteren Teil abgebildet und fortlaufend mit huZPC-1, huZPC-2 usw bezeichnet. Weiterhin ist die Länge der Fragmente sowohl in Basenpaaren (bp) als auch in Aminosäuren (aa) angegeben. Die berechneten Molekulargewichte sind für die Zona-Fragmente und in Klammern für die Zona/HlyA Fusionsproteine in kDa wiedergegeben. Schließlich ist angegeben, ob eine Sekretion der Fusionsproteine mit einem gegen den HlyA-Anteil gerichteten Antikörper nachgewiesen wurde.
Abbildung 11 zeigt eine Genkarte der cDNA von mZPB. Die Pfeile zeigen die Positionen der für eine PCR-Amplifikation ausgewählten primer (Tabelle 1), wobei die Zahlen den Startpunkt am 5 '-Ende des primers bezogen auf das Startcodon der cDNA-Sequenz des Gens angeben. Die gefüllten Rechtecke zeigen das aminoterminale Transportsignal, die putative Fusionsspaltstelle und einen stark hydrophoben Bereich am C-Terminus, der als Membrananker füngieren könnte. Die durch PCR amplifizierten Fragmente sind mit Start und Endpunkt, welche sich durch einen Nsi-I Restriktionsendonukleaseverdau der PCR-Produkte ergeben, im unteren Teil abgebildet und fortlaufend mit mZPB-1, huZPB-2 usw. bezeichnet. Weiterhin ist die Länge der Fragmente sowohl in Basebpaaren (bp) als auch: in Aminosäuren (aa) angegeben. Die berechneten Molekulargewichte sind für die Zona-Fragmente und in Klammern für die Zona/Hly A Fusionsproteine in kDa wiedergegeben. Schließlich ist Abbildung 12 zeigt eine Genkarte der cDNA von huZPC. Die Pfeile zeigen die Positionen der für eine PCR-Amplifikation ausgewählten primer (Tabelle 1), wobei die Zahlen den Startpunkt am 5 '-Ende des primers bezogen auf das Startcodon der cDNA-Sequenz des Gens angeben. Die durch PCR amplifizierten Fragmente sind mit Start und Endpunkt, welche sich durch einen Nsi-I Restriktionsendinukleaseverdau der PCR-Produkte ergeben, im unteren Teil abgebildet und fortlaufend mit huZPC-1, huZPC-2 usw. bezeichnet. Weiterhin ist die Länge der Fragmente sowohl in Basenpaaren (bp) als auch in Aminosäuren (aa) angegeben. Die berechneten Molekulargewichte sind für die Zona-Fragmente und in Klammem für die Zona/HlyA Fusionsproteine in kDa wiedergegeben. Schließlich ist angegeben, ob eine Sekretion der Fusionsproteine mit einem gegen den HlyA-Anteil gerichteten Antikörper nachgewiesen wurde.
Es wird davon ausgegangen, daß der Fachmann die vorliegende Erfindung aufgrund der Beschreibung in ihrem ganzen Umfang ausführen kann. Viele bekannte Techniken und Protokolle zur Manipulation von Nucleinsäuren, wie beispielsweise Mutagenese, Sequenzierung, das Einführen von Nucleinsäure in Zellen oder die Analyse von Proteinen ist im Detail in Short Protocols in Moiecular Biology, Second Edition, Ausrubel et al. Eds., John Wiley & Sons, 1992; Moiecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrock et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Der Inhalt von Sambrook et al. und Ausrubel et al. ist hiermit als Referenz inkooperiert.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet für alle Verwendungen und Methoden, welche beschrieben sind pharmazeutische Präparate. So beinhaltet die Erfindung beispielsweise pharmazeutische Präparate, die die attenuierten Bakterien mit dem Sekretionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten. Die orale Administration erfolgt bevorzugt in Form von verkapselt biodegradierbaren Polymeren, beispielsweise PLPG.
Die nachfolgenden Beispiele dienen nur der näheren Beschreibung und zeigen, daß die Erfindung ausführbar ist und sollen in keiner Weise einschränkend wirken. Beispiel 1
Klonierung und Expression von huZPA, huZPB, huZPC und mZPB Fragmenten in E. coli und S. typhimurium
Ausgangspunkt der Klonierungsstrategie sind die Plasmide pGEX-KG-huZPA, pGEX-KG- huZPB und pGEX-KG-huZPC (Peter Bringmann, Schering AG), welche die cDNA des humanen ZPA, ZPB- und ZPC-Gens tragen sowie ovarielle mRNA der Maus, welche die cDNA-Synthese des Maus ZPB-Gens ermöglichte. Ausgehend von mRNA isoliert aus Ovarien superovulierender Mäuse (Uwe Eberspächer, Schering AG) wurde die entsprechende cDNA wie folgt synthetisiert: ca 5 μg RNA wurden in 32 μl DEPC-H2O mit 3 μl Oligo-dT- Primer vermischt und für 5 min bei 65°C inkubiert. Den Ansatz läßt man 10 min bei Raumtemperatur abkühlen und fügt folgende Reagenzien zu: 5 μl Synthese-Puffer, 5 μl 0.1 M DTT, 1 μl RNase Inhibitor, 3 μl 25 mM dNTPs und 1 μl MMLV Reverse Transkriptase (20 U/μl) (Ist Strand Synthesis Kit, Stratagene). Es folgt eine Inkubation für 1 h bei 37°C. Mit Hilfe von spezifischen Oligonukleotiden (Tabelle I) wurden durch PCR von der entsprechenden cDNA überlappende Genfragmente amplifiziert, die 5' und 3' Nsi I- Restriktionsschnittstellen aufweisen (Abbildungen 8 bis 12: Karten der ZP-Gene mit Angabe der Primerpositionen und den daraus resultierenden Genfragmenten). Die PCR-Amplifikation (Saiki et al., 1988) wurde in einem Thermocycler 60/2 (bio-med, Theres, Deutschland) durchgeführt. Hierzu wurde cDNA mit den entsprechenden 5'- und 3 '-Primern (je lμM Endkonzentration), dNTPs (je 200 μM) und 2.5 U Taq DNA-Polymerase (Promega) und dem Puffer des Herstellers in einem Volumen von 100 μl amplifiziert. Vor dem ersten Zyklus erfolgte eine Denaturierung für 3 min bei 91°C. Darauf folgten 30 Zyklen unter folgenden Bedingungen: 1 min Denaturierung bei 91 °C, 1 min Annealing bei 55 °C und 1 min Extension bei 72 °C. Die Reaktionsprodukte wurden in einem 2%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und durch Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Diese PCR-Produkte wurden zunächst "blunt" in die Sma I-Schnittstelle des Vektors pUC18 inseriert. Anschließend wurde das ZP-Fragment durch einen Nsi I-Verdau herausgeschnitten und in den Expressionsvektor pMOhlyl (Abbildung 1) inseriert. Nach Transformation von E. coli DH5α mit den verschiedenen pMOhlyl /ZP-Konstrukten wurden 2 ml Überstand von Ubemachtkulturen mit 10% (v/v) TCA für 4 h auf Eis präzipitiert, durch Zentrifügation pelletiert und in SDS-Probenpuffer resuspendiert. Die Uberstandsproteine wurden durch SDS- PAGE in einem 15%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und nach Transfer auf Nitrocellulose auf die Sekretion von Zona/Hämolysin-Fusionsproteinen getestet. Mit Hilfe eines polyklonalen Antikörpers, der gegen den Hämolysinanteil des Fusionsproteins gerichtet ist, konnte die Expression und Sekretion von zwei huZPA-Fragmenten (AI und A4, Abbildung 2) und vier huZPB-Fragmenten (Bl - B4, Abbildung 3) nachgewiesen werden. Für huZPC wurde eine transportkompetente Domäne identifiziert (Cl, Abbildung 4). Analog zu huZPB konnte auch die Sekretion von drei Proteinfragmenten von mZPB durch das Transpoπsystem gezeigt werden (Bl - B3, Abbildung 5).
Anschließend erfolgte die Transformation der beschriebenen pMOhlyl -Derivate in den Stamm S. typhimurium LB5000, dem das Restriktionssystem fehlt, so daß effizient E. coli- DNA in diesen Stamm eingebracht werden kann. Nach Isolierung der rekombinanten Expressionsvektoren aus S. typhimurium LB5000 konnte der Stamm S. typhimurium SL7207 erfolgreich transformiert werden. Dieser Stamm eignet sich wie schon mehrfach beschrieben als Impfstamm. Auch in diesem Stamm erfolgt die Sekretion der ZP/Hly-Fusionsproteinen. Abbildung 6 zeigt beispielhaft die Expression und Sekretion der huZPB -Fragmente in Salmonella. Diese ZP/Hly exprimierenden Salmonellen sollten in Mäusen nach oraler Applikation eine mucosale Immunität induzieren, die auch spezifisch gegen den ZP- Anteil des Fusionsproteins gerichtet ist. Beispiel 2
Klonierung und Expression von huZPC, huZPB, huZPC und mZPB Fragmenten in Y. enter ocolitica
Ausgangspunkt der Klonierungsstrategie sind die Plasmide pGEX-KG-huZPA, pGEX-KG- huZPB und pGEX-KG-huZPC (Peter Bringmann, Schering AG), welche die cDNA des humanen ZPA, ZPB- und ZPC-Gens tragen sowie ovarielle mRNA der Maus, welche die cDNA-Synthese des Maus ZPB-Gens ermöglichte. Ausgehend von mRNA isoliert aus Ovarien superovulierender Mäuse (Uwe Eberspächer, Schering AG) wurde die entsprechende cDNA wie folgt synthetisiert: ca 5 μg R A wurden in 32 μl DEPC-H2O mit 3 μl Oligo-dT- Primer vermischt und für 5 min bei 65°C inkubiert. Den Ansatz läßt man 10 min bei Raumtemperatur abkühlen und fügt folgende Reagenzien zu: 5 μ. Synthese-Puffer, 5 μl 0 1 M DTT, 1 μl RNase Inhibitor, 3 μl 25 πiM dNTPs und 1 μl MMLV Reverse Transkriptase (20 U/μl) (Ist Strand Synthesis Kit, Stratagene). Es folgt eine Inkubation für 1 h bei 37°C. Mit Hilfe von spezifischen Oligonukleotiden (Tabelle I) wurden durch PCR von der entsprechenden cDNA überlappende Genfragmente amplifiziert, die 5' und 3' Nsi I- Restriktionsschnittstellen aufweisen (Abbildungen 8 bis 12: Karten der ZP-Gene mit Angabe der Primeφositionen und den daraus resultierenden Genfragmenten). Die PCR-Amplifikation (Saiki et al., 1988) wurde in einem Thermocycler 60/2 (bio-med, Theres, Deutschland) durchgeführt. Hierzu wurde cDNA mit den entsprechenden 5'- und 3'-Primern (je lμM Endkonzentration), dNTPs (je 200 μM) und 2.5 U Taq DNA-Polymerase (Promega) und dem Puffer des Herstellers in einem Volumen von 100 μl amplifiziert. Vor dem ersten Zyklus erfolgte eine Denaturierung für 3 min bei 91 °C. Darauf folgten 30 Zyklen unter folgenden Bedingungen: 1 min Denaturierung bei 91 °C, 1 min Annealing bei 55 °C und 1 min Extension bei 72 °C. Die Reaktionsprodukte wurden in einem 2%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und durch Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Diese PCR-Produkte wurden zunächst "blunt" in die Sma I-Schnittstelle deS Vektors pUC18 inseriert. Anschließend wurde das ZP-Fragment durch einen Nsi I- Verdau herausgeschnitten und in den Expressionsvektor pMOhlyl (Abbildung 1) inseriert. Nach Transformation von E. coli DH5α mit den verschiedenen pMOhlyl /ZP-Konstrukten wurden 2 ml Überstand von Übemachtkulturen mit 10% (v/v) TCA für 4 h auf Eis präzipitiert, durch Zentrifügation pelletiert und in SDS-Probenpuffer resuspendiert. Die Uberstandsproteine wurden durch SDS- PAGE in einem 15%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und nach Transfer auf Nitrocellulose auf die Sekretion von Zona/Hämolysin-Fusionsproteinen getestet. Mit Hilfe eines polyklonalen Antiköφers, der gegen den Hämolysinanteil des Fusionsproteins gerichtet ist, konnte die Expression und Sekretion von huZPA-Fragmenten , huZPB -Fragmenten und hu ZPC nachgewiesen werden (siehe oben). Anschließend erfolgte die Transformation der beschriebenen pMOhlyl -Derivate in den Stamm Y. enterocolitica LB5000, dem das Restriktionssystem fehlt, so daß effizient E. coli-ONA in diesen Stamm eingebracht werden kann. Nach Isolierung der rekombinanten Expressionsvektoren aus Y. enterocolitica LB5000 konnte der Stamm Y. enterocolitica WapYv-515 erfolgreich transformiert werden. Dieser Stamm eignet sich wie schon mehrfach beschrieben als Impfstamm. Auch in diesem Stamm erfolgt die Sekretion der ZP/Hly-Fusionsproteinen. Abbildung 7 zeigt beispielhaft die Expression und Sekretion der huZPC-Fragmente in Y. enterocolitica. Diese ZP/Hly exprimierenden Yersinien sollten in Mäusen nach oraler Applikation eine mucosale Immunität induzieren, die auch spezifisch gegen den ZP-Anteil des Fusionsproteins gerichtet ist.
Tabelle I: Primersequenzen für die Amplifikation von ZP-Genfragmenten durch PCR und erwartete PCR-Produktgrößen
Unterstrichene Basen zeigen eine Abweichung von der jeweiligen ZP-Sequenz an, um die für eine Klonierung notwendige Nsi I Schnittstelle einzuführen.

Claims

Ansprüche
1. Verwendung eines Sekretions vektors in dem
(a) zur Fertilitätskontrolle geeignete Gene oder Genfragmente insertiert sind, der
(b) das vollständige Hämolysin-Operon einschließlich des hly spezifischen Promotors und eines Enhancer-ähnlichen Regulators hlyR enthält und bei dem
(c) ein Großteil des hlyA Gens deletiert wurde, wobei
(d) die zur Fertilitätskontrolle geeigneten Proteine oder Proteinfragmente synthetisiert werden und
(e) durch die Sektretion dieser Antigene durch attenuierte Salmonellen oder andere Gramnegative attenuierte Impfstämme,
(f) eine orale Vakzinierung erzeugt wird.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die zur Fertilitätskontrolle geeigneten Gene oder Genfragmente für Zona pellucida Proteine kodieren.
3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Sekretionsvektor pMOhlyl ist.
4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Salmonella Stamm Salmonella typhimurium ist.
5. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Stamm Yersinia enterocolitica ist.
6. Verfahren zur Fertilitätskontrolle durch Verwendung eines Sekretionsvektors in dem
(a) zur Fertilitätskontrolle geeignete Gene oder Genfragmente insertiert sind, der
(b) das vollständige Hämolysin-Operon einschließlich des hly spezifischen Promotors und eines Enhancer-ähnlichen Regulators hlyR enthält und bei dem
(c) ein Großteil des hlyA Gens deletiert wurde, wobei
(d) die zur Fertilitätskontrolle geeigneten Proteine oder Proteinfragmente synthetisiert werden und
(e) durch die Sektretion dieser Antigene durch attenuierte Salmonellen oder andere Gramnegative attenuierte Impfstämme,
(f) eine orale Vakzinierung erzeugt wird.
EP98929286A 1997-05-07 1998-05-07 Verwendung eines sekretionsvektors zur fertilitätskontrolle durch orale vakzinierung Withdrawn EP1015023A1 (de)

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DE19720761A DE19720761A1 (de) 1997-05-07 1997-05-07 Verfahren zur Synthese und Sekretion von zur Kontrazeption geeigneter Proteine oder Proteinfragmente durch attenuierte Salmonellen oder einen anderen Gram-negativen attenuierten Impfstamm zur Erzeugung einer oralen Vakzinierung
DE19720761 1997-05-07
PCT/EP1998/002679 WO1998050067A2 (de) 1997-05-07 1998-05-07 Verwendung eines sekretionsvektors zur fertilitätskontrolle durch orale vakzinierung

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