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EP0502874A1 - Neue vom neuropeptid y abgeleitete peptide - Google Patents

Neue vom neuropeptid y abgeleitete peptide

Info

Publication number
EP0502874A1
EP0502874A1 EP19900917028 EP90917028A EP0502874A1 EP 0502874 A1 EP0502874 A1 EP 0502874A1 EP 19900917028 EP19900917028 EP 19900917028 EP 90917028 A EP90917028 A EP 90917028A EP 0502874 A1 EP0502874 A1 EP 0502874A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
arg
tyr
ile
asn
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP19900917028
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Johann-Christian Zechel
Sabine Schult
Liliane Unger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP0502874A1 publication Critical patent/EP0502874A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57545—Neuropeptide Y
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to new peptides derived from neuropeptide Y (NPY), their preparation and their use as medicaments.
  • NPY was isolated from pig brain in 1982 (Nature 296 (1982) 659) and has now been detected in a number of mammalian species. Human NPY has the following sequence:
  • the peptide which is widely used in the peripheral and central nervous system, is one of the most potent known vasoconstrictors. It also increases the blood pressure-increasing effects of norepinephrine and is able to cause cardiac and cerebral vasospasm. All of these observations indicate that NPY is significantly involved in the neuronal regulation of blood pressure.
  • H is a dipeptide residue composed of lipophilic amino acids
  • Z represents a hydrogen atom, an amino protecting group, a benzyl radical, a C 2-10 acyl radical or a C 1-5 alkyl radical, k, l, m, n, o, p and q denote the numbers 0 or 1, but k + 1 + m + n + o + p + q> l and two possibly present Cys residues can be connected to one another via a disulfide bridge, as well as their salts with physiologically compatible acids.
  • the partially structurally modified N- and C-terminal fragments of the NPY are connected to each other via a spacer (E) which replaces the central sequence section of the NPY.
  • the lengths of the N- and C-terminal ends and the spacer are variable.
  • Suitable protecting groups are the following: t-butyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, fluorenylmethyloxycarbonyl.
  • Hydrochloric acid citric acid, tartaric acid, lactic acid, phosphoric acid, methanesulfonic acid, acetic acid, formic acid, maleic acid, fumaric acid, malic acid, succinic acid, malonic acid, sulfuric acid, L-glutamic acid,
  • p-Hydroxyphenylacetyl- or p-Hydroxyphenylpropionylrest mean.
  • Z is a hydrogen atom, an acetyl, p-hydroxybenzoyl,
  • p-Hydroxyphenylacetyl-, p-Hydroxyphenylpropionylrest mean and A, B, D, K and k-q have the meanings given.
  • the new compounds can be prepared by methods known in peptide chemistry.
  • the peptide chain is gradually extended by one amino acid each, starting at the C terminus.
  • fragments of different lengths can be linked to one another, the fragments in turn being obtained by sequential construction from amino acids or, in turn, by fragment coupling.
  • the cyclic peptides are obtained by a cyclization reaction carried out in high dilution. Both in the sequential structure and in the fragment coupling, the building blocks must be linked by forming an amide bond. Enzymatic and chemical methods are suitable for this.
  • the coupling reagents can be used alone or in combination with additives such as N, N'-dimethyl-4-aminopyridine (DMAP), N-hydroxybenzotriazole (HOBt), N-hydroxybenzotriazine (HOOBt), N-hydroxysuccinimide (HOSu) or 2-hydroxypyridine .
  • DMAP N, N'-dimethyl-4-aminopyridine
  • HOBt N-hydroxybenzotriazole
  • HOOBt N-hydroxybenzotriazine
  • HOSu N-hydroxysuccinimide
  • 2-hydroxypyridine 2-hydroxypyridine
  • While protective groups can normally be dispensed with in enzymatic peptide synthesis, reversible protection of the reactive functional groups of the two reactants which are not involved in the formation of the amide bond is required for chemical synthesis.
  • three protecting group techniques known from the literature are preferred: the benzyloxycarbonyl (Z), the t-butyloxycarbonyl (Boc) and the 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) protective group technique.
  • the protective group of the ⁇ -amino function of the chain-extending building block is designated in each case.
  • the side chain protecting groups of the trifunctional amino acids are chosen so that they are not necessarily split off together with the ⁇ -amino protecting group.
  • the peptide is typically built up sequentially on the polymeric support using the Boc or Fmoc protective group technique, the growing peptide chain at the C-terminus being covalently linked to the insoluble resin particles (see Figs. 1 and 2). This procedure allows reagents and by-products to be removed by filtration, making recrystallization of intermediate products unnecessary.
  • the protected amino acids can be bound to any suitable polymer, which are only insoluble in the solvents used and must have a stable physical form which enables easy filtration.
  • the polymer must contain a functional group to which the first protected amino acid can be bound by a covalent bond.
  • a wide variety of polymers are suitable for this purpose, e.g.
  • All solvents which prove inert under the reaction conditions are particularly suitable for peptide synthesis in solution, in particular water, N, N'-dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), acetonitrile, dichloromethane (DCM), 1,4- Dioxane, tetrahydrofuran (THF), N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) and mixtures of the solvents mentioned.
  • DMF N, N'-dimethylformamide
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DCM dichloromethane
  • THF tetrahydrofuran
  • NMP N-methyl-2-pyrrolidone
  • the peptide synthesis on the polymeric support can be carried out in all inert organic solvents in which the amino acid derivatives used are soluble; however, solvents which additionally have resin-swelling properties, such as DMF, DCM, NMP, acetonitrile and DMSO, and mixtures of these solvents are preferred.
  • solvents which additionally have resin-swelling properties such as DMF, DCM, NMP, acetonitrile and DMSO, and mixtures of these solvents are preferred.
  • the peptide is split off from the polymeric carrier.
  • the conditions under which the peptides can be split off from the various types of resin are known from the literature.
  • Acid and palladium-catalyzed cleavage reactions are most commonly used, in particular the cleavage in liquid anhydrous hydrogen fluoride, in anhydrous trifluoromethanesulfonic acid, in dilute or concentrated trifluoroacetic acid or the palladium-catalyzed cleavage in THF or THF-DCM mixture in the presence of a weak base such as, for example, morpholine.
  • a weak base such as, for example, morpholine.
  • these can be retained under the cleavage conditions or can also be split off. Partial deprotection of the peptide can also be useful if certain derivatization reactions or a cyclization are to be carried out.
  • the new peptides bind with high affinity to NPY receptors, but without triggering the physiological effect of the NPY, are therefore competitive antagonists and suppress the effect of the endogenous NPY.
  • the new peptides have hypotensive properties and are valuable medicinal products that are suitable for the treatment of circulatory diseases, in particular high blood pressure, and vascular spasms. They can be combined with ACE inhibitors, Ca antagonists or diuretics.
  • the new peptides are also valuable diagnostic and analytical reagents for biochemical and medical research, for researching hypertension and especially for studying the biochemistry and pathophysiology of NPY.
  • Receptor binding assay (rabbit kidney cortex)
  • Rabbit renal cortex was prepared immediately after the kidney was removed and homogenized in 0.32 M sucrose solution (4 ° C.). The homogenate was filtered and then centrifuged at 480 g (5 min, 4 ° C), the supernatant collected and centrifuged at 45,000 g (10 min, 4 ° C). The resulting residue was washed by resuspension and recentrifugation twice with incubation buffer (25 mM Tris, 5 mM MgCl 2 , 0.5% bovine serum albumin and 0.1% bacitracin, pH 7.4) and taken up in incubation buffer.
  • incubation buffer 25 mM Tris, 5 mM MgCl 2 , 0.5% bovine serum albumin and 0.1% bacitracin, pH 7.4
  • test batches (1 ml) were composed of: 100 ⁇ g membrane protein (BCA protein assay, Pierce, Rockford, Illinois, USA), 0.5 nM 3H-NPY (Amersham, Braunschweig, specific radioactivity 3 TBq / mmol) in incubation buffer (total binding) or a) with an additional 0.3 ⁇ M NPY (non-specific binding) or b) with test substance.
  • the batches were made as triplicates.
  • the batches were filtered through glass fiber filters (Whatman GF / B) and washed with ice-cold washing buffer (50 mM Tris, 0.5 mM EDTA, 0.2% bovine serum ibumin, pH 7.4) .
  • the radioactivity retained on the filters was determined by means of liquid scintillation measurement.
  • the nonspecific binding was approx. 20 to 30% of the total binding at 0.5 nM 3H-NPY.
  • the competition curves are evaluated using iterative nonlinear regression analysis based on the "Ligand" program (Munson and Rodbard: Anal. Biochem. 107, 220, 1980).
  • NPY injections (3 ⁇ g / kg IV) were given 15 min before and 5 min after substance administration.
  • the blood pressure in the carotid artery was measured with Statham pressure transducers, the amplifiers and recording devices were from Hellige.
  • the relative inhibition ( ⁇ %) of the increase in blood pressure caused by NPY was measured.
  • mice Male Sprague-Dawley rats of 250 to 300 g body weight were used for the experiments. The feeding was 16 to Suspended 24 h before the start of the experiment, water was available ad libitum. The animals were anesthetized with urethane 1.7 g / kg ip 30 to 40 min before the start of the experiment. Breathing was spontaneous via tracheal cannula.
  • the trachea, carotid artery and jugular vein were dissected 20 minutes after induction of anesthesia. Subcutaneous electrode needles were used to record the ECG. The mean carotid pressure MAP (mmHg) was measured via Statham transducer P23Db. The heart rate HR (min -1 ) was determined from the blood pressure amplitude. Both parameters were registered with Heilige writers.
  • proteogenic amino acids are abbreviated in the examples with the three-letter code (according to Eur. J. Biochem. 138, 1984, 9-37).
  • Abs 4-aminobutyric acid
  • Abu 2-aminobutyric acid
  • Ac acetic acid
  • Ahx aminohexanoic acid
  • Aoc 8-aminooctanoic acid
  • Ape 5-aminopentanoic acid
  • HBz p-hydroxybenzoic acid
  • Hpac p-hydroxyphenylacetic acid
  • Hpp p-hydroxyphenylpropionic acid
  • Boc-Tyr (Br-Z) -p-methylbenzhydrylamine resin with a substitution of 0.49 mmol / g, corresponding to a batch size of 0.25 mmol, were, according to A, with 1 mmol of Boc-Arg (Tos) - OH Boc-Ile-OH
  • the peptide resin obtained (1.06 g) was subjected to HF cleavage (10 ml HF / 1 ml anisole; 0 ° C, 45 min). HF and most of the anisol were removed in vacuo, the resin was washed with ethyl acetate, and extracted the peptide with 10% acetic acid. The extract was lyophilized. The crude peptide was purified by medium pressure chromatography (HD-SIL® reversed phase C 18 material, 100 ⁇ , 25-45 ⁇ grain size) with a gradient of 50-70% B in 80 min
  • Boc-Asn-OH Hpp-OH implemented.
  • the peptide resin obtained (1.01 g) was subjected to HF cleavage (10 ml HF, 1 ml m-cresol; 0 ° C., 45 min).
  • the HF was in a vacuum

Landscapes

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  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Neue vom Neuropeptid Y abgeleitete Peptide
Beschreibung Die Erfindung betrifft neue, vom Neuropeptid Y (NPY) abgeleitete Peptide, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel.
NPY wurde 1982 aus Schweinehirn isoliert (Nature 296 (1982) 659) und ist inzwischen in einer ganzen Reihe von Säugerspezies nachgewiesen worden. Humanes NPY besitzt die folgende Sequenz:
H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala
Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-
NH2
Das im peripheren und zentralen Nervensystem weit verbreitete Peptid ist einer der potentesten bekannten Vasokonstriktoren. Es verstärkt zudem die blutdrucksteigernde Wirkung von Noradrenalin und ist in der Lage, kardiale und cerebrale Vasospasmen hervorzurufen. Alle diese Beobachtungen weisen darauf hin, daß NPY maßgeblich an der neuronalen Regulation des Blutdrucks beteiligt ist.
Es wurden nun Peptide gefunden, mit denen man NPY antagonisieren kann. Gegenstand der Erfindung sind Peptide der Formel
Z-Ak-B1-Cm-Dn-Eo-Fp-Gq-H-Thr-I-Gln-J-K-NH2 worin
A Phe oder Tyr,
B Pro, Ser, Abu, Gly, Ala, Cys, Pro-Ser, Cys-Ser, Abu-Ser, Gly-Ser, Ala- Ser oder Pro-Ala,
C eine Aminosäure mit basischer Seitenkette,
D Pro oder Cys,
E die Gruppierung -NH-(CH2)t_CO_ (mit t in der Bedeutung einer ganzen Zahl von 0 bis 10), F Cys, Abu, Gly oder Ala,
G Ile-Asn, Leu-Asn, Val-Asn oder Asn,
H ein aus lipophilen Aminosäuren zusammengesetzter Dipeptidrest,
I eine Aminosäure mit basischer Seitenkette, J eine Aminosäure mit basischer Seitenkette,
K Phe oder Tyr und
Z ein Wasserstoffatom, eine Aminoschutzgruppe, einen Benzylrest, einen C2-10-Acylrest oder einen C1-5-Alkylrest darstellen, k, l, m, n, o, p und q die Zahlen 0 oder 1 bedeuten, wobei jedoch k + 1 +m + n + o + p + q > l sein muß, und zwei gegebenenfalls vorhandene Cys-Reste über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sein können, sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren.
In den neuen Peptiden sind die teilweise strukturell modifizierten N- und C-terminalen Fragmente des NPY über einen den mittleren Sequenzabschnitt des NPY ersetzenden Spacer (E) miteinander verbunden. Die Längen der N- und C-terminalen Enden und des Spacers sind variabel.
Als basische Aminosäuren für C, I und J kommen Arg, hArg, His, Lys und Orn in Betracht. Als lipophile Aminosäuren (vgl. H) sind Ile, Leu, Val, Phe, Trp, Nie, Pro zu nennen. Geeignete Schutzgruppen (vgl. Z) sind folgende: t-Butyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Fluorenylmethyloxycarbonyl.
Als physiologisch verträgliche Säuren sind insbesondere zu nennen:
Salzsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Phosphorsäure, Methan- sulfonsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, Malonsäure, Schwefelsäure, L-Glutaminsäure,
L-Asparaginsäure, Brenztraubensäure, Schleimsäure, Benzoesaure, Glucuron- säure, Oxalsäure, Ascorbinsäure, Acetylglycin. Von den neuen Peptiden sind diejenigen bevorzugt, in denen C Lys, Orn, Arg oder hArg, G Ile-Asn, Leu-Asn, Val-Asn oder Asn, H Leu-Ile, Leu-Val, Leu-Leu, Val-Leu, Val-Val, Val-Ile, Ile-Ile, Ile-Leu oder Ile-Val, I orn, Lys, Arg oder hArg, J Orn, Lys, Arg oder hArg und Z ein Wasserstoffatom, eine Aminoschutzgruppe, einen Acetyl-, p-Hydroxybenzoyl-,
p-Hydroxyphenylacetyl- oder p-Hydroxyphenylpropionylrest bedeuten.
Besonders bevorzugt sind die Peptide, in denen
C Lys oder Arg,
E die Gruppierung -NH-(CH2)t-CO- (mit t in der Bedeutung einer ganzen Zahl von 1 bis 7)
F Cys oder Abu,
G Ile-Asn oder Asn H Leu-Ile
I Arg
J Arg
Z ein Wasserstoffatom, einen Acetyl-, p-Hydroxybenzoyl-,
p-Hydroxyphenylacetyl-, p-Hydroxyphenylpropionylrest bedeuten und A, B, D, K sowie k-q die angegebenen Bedeutungen haben.
Die neuen Verbindungen lassen sich nach in der Peptidchemie bekannten Methoden herstellen.
So kann man die Peptide sequentiell aus Aminosäuren oder durch Fragment- Verknüpfung geeigneter kleiner Peptide aufbauen. Beim sequentiellen Aufbau wird die Peptidkette beginnend am C-Terminus stufenweise um jeweils eine Aminosäure verlängert. Bei der Fragmentkupplung können Fragmente unterschiedlicher Länge miteinander verknüpft werden, wobei die Fragmente wiederum durch sequentiellen Aufbau aus Aminosäuren oder ihrerseits durch Fragmentkupplung gewonnen werden können. Die cyclischen Peptide werden nach Synthese der offenkettigen Peptide durch eine in hoher Verdünnung durchgeführte Cyclisierungsreaktion erhalten. Sowohl beim sequentiellen Aufbau, als auch bei der Fragmentkupplung müssen die Bausteine durch Bildung einer Amidbindung verknüpft werden. Hierzu eignen sich enzymatische und chemische Methoden. Chemische Methoden zur Amidbindungsbildung sind ausführlich behandelt bei Müller, Methoden der Organischen Chemie Vol XV/2, pp 1 - 364, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974; Stewart, Young, Solid Phase Peptide Synthesis, pp 31 - 34, 71 - 82, Pierce Chemical Company, Rockford, 1984; Bodanszky, Klausner, Ondetti, Peptide Synthesis, pp 85 - 128, John Wiley & Sons, New York, 1976 und anderen Standardwerken der Peptidchemie. Besonders bevorzugt sind die Azidmethode, die symmetrische und gemischte Anhydridmethode, in situ erzeugte oder präformierte Aktivester und die Amidbindungsbildung mit Hilfe von Kupplungsreagenzien (Aktivatoren), insbesondere Dicyclo- hexylcarbodiimid (DCC), Diisopropylcarbodi imid (DIC), 1-Ethoxycarbonyl- 2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin (EEDQ), 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimidhydrochlorid (EDCI), n-Propanphosphonsäureanhydrid (PPA), N,N- Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)amidophosphorsäurechlorid (BOP-Cl), Diphenyl- phosphorylazid (DPPA), Castro's Reagenz (BOP), 0-Benzotriazolyl-N,N,N',N'- tetramethyluronium-Salze (HBTU), 2,5-Diphenyl-2,3-dihydro-3-oxo-4-hydroxy- thiophendioxid (Steglichs Reagenz; HOTDO) und 1, 1'-Carbonyl-diimidazol (CDI). Die Kupplungsreagenzien können allein oder in Kombination mit Additiven wie N,N'-Dimethyl-4-aminopyridin (DMAP), N-Hydroxybenzotriazol (HOBt), N-Hydroxybenzotriazin (HOOBt), N-Hydroxysuccinimid (HOSu) oder 2-Hydroxypyridin eingesetzt werden.
Während bei der enzymatisehen Peptidsynthese normalerweise auf Schutzgruppen verzichtet werden kann, ist für die chemische Synthese ein reversibler Schutz der an der Bildung der Amidbindung nicht beteiligten reaktiven funktionellen Gruppen der beiden Reaktionspartner erforderlich. Bei den chemischen Peptidsynthesen werden drei literaturbekannte Schutzgruppentechniken bevorzugt: Die Benzyloxycarbonyl(Z)-, die t-Butyloxy- carbonyl (Boc)- und die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-Schutzgruppentechnik. Bezeichnet ist jeweils die Schutzgruppe der α-Aminofunktion des kettenverlängernden Bausteines. Die Seitenkettenschutzgruppen der trifunktionellen Aminosäuren werden so gewählt, daß sie nicht notwendigerweise zusammen mit der α-Aminoschutzgruppe abgespalten werden. Eine ausführliche Übersicht über Aminosäureschutzgruppen gibt Müller, Methoden der Organischen Chemie Vol XV/1, pp 20 - 906, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974. Die Bausteine, die dem Aufbau der Peptidkette dienen, können in Lösung, in Suspension oder nach einem ähnlichen Verfahren, wie es von Merrifield in 3. Amer. Chem. Soc. 85, 2149, 1963 beschrieben ist, zur Reaktion gebracht werden. Besonders bevorzugt sind Verfahren, bei denen Peptide sequentiell oder durch Fragmentkupplung unter Verwendung der Z-, Boc- oder Fmoc- Schutzgruppentechnik aufgebaut werden, wobei die Reaktionspartner in Lösung zur Reaktion gebracht werden, sowie Verfahren, bei denen, ähnlich der genannten Merrifield-Technik, ein Reaktionspartner an einen unlös- liehen polymeren Träger (im folgenden auch Harz genannt) gebunden zur Reaktion gebracht wird. Dabei wird das Peptid typischerweise unter Verwendung der Boc- oder Fmoc-Schutzgruppentechnik sequentiell am polymeren Träger aufgebaut, wobei die wachsende Peptidkette am C-Terminus kovalent mit den unlöslichen Harzteilchen verbunden ist (vgl. Abb. 1 und 2). Diese Arbeitsweise erlaubt es, Reagentien und Nebenprodukte durch Filtration zu entfernen, die Umkristallisation von Zwischenprodukten wird somit überflüssig.
Die geschützten Aminosäuren können an beliebige geeignete Polymeri sate gebunden werden, die lediglich in den verwendeten Lösungsmitteln unlöslich sein und eine beständige physikalische Form, die leichte Filtration ermöglicht, aufweisen müssen. Das Polymerisat muß eine funktionelle Gruppe enthalten, an die die erste geschützte Aminosäure durch eine kovalente Bindung fest gebunden werden kann. Für diesen Zweck eignen sich die ver- schiedensten Polymerisate, z.B. Cellulose, Polyvinylalkohol, Polymeth- acrylat, sulfoniertes Polystyrol, chlormethyliertes Copolymerisat von Styrol und Divinylbenzol (Merrifield-Harz), 4-Methylbenzhydrylamin-Harz (MBHA-Harz), Phenylacetamidomethyl-Harz (Pam-Harz), p-Benzyloxybenzyl- alkohol-Harz, Benzhydrylamin-Harz (BHA-Harz), 4-(Hydroxymethyl)-benzoyl- oxymethyl-Harz, Harz nach Breipohl et al. (Tetrahedron Lett. 28, 565, 1987; Fa. BACHEM), HYCRAM-Harz (Fa. ORPEGEN) oder SASRIN-Harz
(Fa. BACHEM).
Für die Peptidsynthese in Lösung eignen sich alle Lösungsmittel, die sich unter den Reaktionsbedingungen als inert erweisen, insbesondere Wasser, N,N'-Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril, Di- chlormethan (DCM), 1,4-Dioxan, Tetrahydrofuran (THF), N-Methyl-2-pyrroli- don (NMP) sowie Gemische der genannten Lösungsmittel. Die Peptidsynthese am polymeren Träger kann in allen inerten organischen Lösungsmitteln, in denen die verwendeten Aminosäurederivate löslich sind, durchgeführt werden; bevorzugt sind jedoch Lösungsmittel, die zusätzlich harzquellende Eigenschaften besitzen, wie DMF, DCM, NMP, Acetonitril und DMSO, sowie Gemische dieser Lösungsmittel. Nach erfolgreicher Synthese wird das Peptid vom polymeren Träger abgespalten. Die Bedingungen, unter denen sich die Peptide von den verschiedenen Harztypen abspalten lassen, sind literaturbekannt. Am häufigsten finden saure und Palladium-katalysierte Spaltreaktionen Anwendung, insbesondere die Spaltung in flüssigem wasserfreiem Fluorwasserstoff, in wasserfreier Trifluor-methansulfonsäure, in verdünnter oder konzentrierter Trifluoressigsäure oder die Palladium-katalysierte Spaltung in THF oder THF-DCM-Gemisehen in Anwesenheit einer schwachen Base wie z.B. Morpholin. Je nach Wahl der Schutzgruppen können diese unter den Spaltbedingungen erhalten bleiben oder ebenfalls abgespalten werden. Auch eine teilweise Entschützung des Peptids kann sinnvoll sein, wenn bestimmte Derivatisie- rungsreaktionen oder eine Cyclisierung durchgeführt werden sollen. Die neuen Peptide binden mit hoher Affinität an NPY-Rezeptoren, ohne aber die physiologische Wirkung des NPY auszulösen, sind also kompetitive Anta- gonisten und unterdrücken die Wirkung des endogenen NPY. Die neuen Peptide besitzen blutdrucksenkende Eigenschaften und sind wertvolle Arzneimittel, die sich zur Behandlung von Kreislauferkrankungen, insbesondere des Blut- hoehdrucks, und von Gefäßspasmen eignen. Sie können dabei mit ACE-Hemmern, Ca-Antagonisten oder Diuretika kombiniert werden.
Die neuen Peptide sind außerdem wertvolle diagnostische und analytische Reagentien für die biochemische und medizinische Forschung, für die Erfor- schung des Bluthochdrucks und besonders für die Untersuchung der Biochemie und Pathophysiologie von NPY.
Die biologische Charakterisierung der neuen Peptide wurde in folgenden Testsystemen durchgeführt:
1. Rezeptorbindungsassay (Kaninchennierenkortex)
2. funktionelle Tests an der despinalisierten und an der narkotisierten Ratte.
1. Rezeptorbindungsassay
Nierenrinde von Kaninchen wurde sofort nach Entnahme der Niere präpariert und in 0,32 M Saccharoselösung (4°C) homogenisiert. Das Homoge- nat wurde filtriert und anschließend bei 480 g zentrifugiert (5 min, 4°C), der Überstand gesammelt und bei 45.000 g zentrifugiert (10 min, 4°C). Der resultierende Rückstand wurde durch Resuspension und Rezen- trifugation 2x mit Inkubationspuffer (25 mM Tris, 5 mM MgCl2, 0,5% Rinderserumalbumin und 0,1% Bacitracin, pH 7,4) gewaschen und in Inkubationspuffer aufgenommen. Die Testansätze (1 ml) setzten sich zusammen aus: 100 μg Membranprotein (BCA Protein Assay, Pierce, Rockford, Illinois, USA), 0,5 nM 3H-NPY (Amersham, Braunschweig, spez. Radioaktivität 3 TBq/mmol) in Inkubationspuffer (totale Bindung) oder a) mit zusätzlich 0,3 μM NPY (unspezifische Bindung) oder b) mit Prüfsubstanz. Die Ansätze wurden als Triplikate hergestellt.
Nach beendeter Inkubation (60 min, 30°C) wurden die Ansätze über Glasfaserfilter (Whatman GF/B) filtriert und mit eiskaltem Waschpuffer (50 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 0,2% Rinderserumaibumin, pH 7,4) gewaschen. Die auf den Filtern zurückgehaltene Radioaktivität wurde mittels Flüssigkeitsszintillationsmessung bestimmt. Die unspezifische Bindung betrug bei 0,5 nM 3H-NPY ca. 20 bis 30% der totalen Bindung. Die Auswertung der Kompetitionskurven erfolge über iterative nichtlineare Regressionsanalyse in Anlehnung an das Programm "Ligand" (Munson und Rodbard: Anal. Biochem. 107, 220, 1980).
2. a) Funktioneller Test auf NPY-Antagonismus an der despinalisierten normotonen Ratte
Für die Versuche wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten von 250 bis 300 g Körpergewicht verwendet. Die Fütterung wurde 16 bis
24 h vor Versuchsbeginn ausgesetzt, Wasser war ad libitum verfüg- bar. Die Tiere wurden 30 bis 40 min vor Versuchsbeginn mit
Amobarbital 120 mg/kg i.p. narkotisiert. Die Beatmung erfolgte künstlich über eine Atempumpe mit einem Atemvolumen von 3 ml/Hub und 50 Atemhüben/min. Die Substanzapplikation erfolgte i.v. über die Vena jugularis mit einem Injektionsvolumen von 1 ml/kg und einer Injektionsdauer von 20 sec.
10 min nach Nachkoseeinleitung wurden die Trachea, Arteria carotis und Vena jugularis präpariert und anschließend die Despinalisierung und Vagotomie durchgeführt. NPY-Injektionen (3 μg/kg i.v.) erfolgten 15 min vor sowie 5 min nach Substanzapplikation. Der Blutdruck in der Arteria carotis wurde mit Statham-Druckauf- nehmern gemessen, die Verstärker und Registriergeräte waren von der Firma Hellige. Gemessen wurde die relative Hemmung (Δ %) der durch NPY ausgelösten Blutdrucksteigerung (Δ mmHg).
2. b) Blutdruckmessung an der normotonen Ratte
Für die Versuche wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten von 250 bis 300 g Körpergewicht verwendet. Die Fütterung wurde 16 bis 24 h vor Versuchsbeginn ausgesetzt, Wasser war ad libitum verfügbar. Die Tiere wurden 30 bis 40 min vor Versuchsbeginn mit Urethan 1,7 g/kg i.p. narkotisiert. Die Atmung erfolgte spontan über Trachealkanüle.
20 min nach Narkoseeinleitung erfolgte die Präparation der Trachea, Arteria carotis und Vena jugularis. Subkutane Elektrodennadeln zur Ableitung des EKGs wurden angelegt. Der mittlere Carotis-Druck MAP (mmHg) wurde über Statham-Transducer P23Db gemessen. Die Herzfrequenz HR (min-1) wurde aus der Blutdruckamplitude bestimmt. Beide Meßgrößen wurden mit Heilige-Schreibern registriert.
Die Dosiswirkungsbeziehung wurde beschrieben durch eine lineare Regressionsanalyse zwischen log-Dosis (mg/kg) und der relativen Blutdruckänderung (y = a + b . log x). Tiere, bei denen EKG-Veränderungen auftraten, wurden registriert.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Die proteo- genen Aminosäuren sind in den Beispielen mit dem Dreibuchstabencode abgekürzt (gemäß Eur. J. Biochem. 138, 1984, 9-37). Darüberhinaus bedeuten: Abs = 4-Aminobuttersäure, Abu = 2-Aminobuttersäure, Ac = Essigsäure, Ahx = Aminohexansäure, Aoc = 8-Aminooktansäure, Ape = 5-Aminopentansäure, HBz = p-Hydroxybenzoesäure, Hpac = p-Hydroxyphenylessigsäure,
Hpp = p-Hydroxyphenylpropionsäure.
A. Allgemeine Arbeitsvorschrift
Die Synthese der Peptide gemäß Anspruch 1 erfolgte mit Hilfe der Standardmethoden der Festphasenpeptidsynthese an einem vollautomatischen Gerät Modell 430 A der Firma APPLIED BIOSYSTEMS.
Folgender Synthesezyklus für die Boc-Schutzgruppentechnik wurde verwendet:
1. 30 % Trifluoressigsäure in DCM 1 x 3 min
2. 50 % Trifluoressigsäure in DCM 1 x 17 min
3. DCM-Waschschritt 5 x 1 min
4. 5 % Diisopropylethylamin in DCM 1 x 1 min 5. 5 % Diisopropylethylamin in NMP 1 x 1 min
6. NMP-Waschschritt 5 x 1 min 7. Zugabe der voraktivierten geschützten Aminosäure (Aktivierung durch 1 Äquivalent DCC und
1 Äquivalent HOBt in NMP/DCM);
Peptidkupplung (1. Teil) 1 x 30 min 8. Zugabe von DMSO zur Reaktionsmischung bis zu
einem Volumenanteil von 20 % DMSO
9. Peptidkupplung (2. Teil) 1 x 16 min
10. Zugabe von 3,8 Äquivalenten Diisopropylethylamin
zur Reaktionsmischung
11. Peptidkupplung (3. Teil) 1 x 7 min
12. DCM-Waschschritt 3 x 1 min
13. bei unvollständigem Umsatz Wiederholung der
Kupplung (zurück zu 5.)
14. 10 % Essigsäureanhydrid, 5 % Diisopropylethylamin
in DCM 1 X 2 min
15. 10 % Essigsäureanhydrid in DCM 1 X 4 mi n
16. DCM-Waschschritt 4 X 1 min
17. zurück zu 1. B. Spezielle Arbeitsvorschriften
Beispiel 1
H-Tyr-Abu-Ser-Lys-Aoc-Abu-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
0,5 g Boc-Tyr(Br-Z)-p-Methylbenzhydrylaminharz mit einer Substitution von 0,49 mmol/g, entsprechend einer Ansatzgröße von 0,25 mmol, wurden gemäß A mit je 1 mmol Boc-Arg(Tos)-OH Boc-Ile-OH
Boc-Gln-OH Boc-Abu-OH
Boc-Arg(Tos)-OH Boc-Aoc-OH
Boc-Thr(Bzl)-OH Boc-Lys-(Cl-Z)-OH
Boc-Ile-OH Boc-Ser(Bzl)-OH
Boc-Leu-OH Boc-Abu-OH
Boc-Asn-OH Boc-Tyr(Br-Z)-OH umgesetzt. Nach Beendigung der Synthese wurde das Harz N-terminal entschützt. (Ausführung der Schritte 1 - 3 gemäß A) .
Das erhaltene Peptidharz (1,06 g) wurde e i ner HF-Spaltung unterworfen (10 ml HF/1 ml Anisol; 0°C, 45 min). HF und der größte Teil des Anisols wurden im Vakuum abgezogen, das Harz mit Essigester gewaschen, und das Peptid mit 10% Essigsäure extrahiert. Der Extrakt wurde lyophilisiert. Die Reinigung des Rohpeptides erfolgte durch Mitteldruckchromatographie (HD-SIL®-Reversed-Phase-C18-Material, 100 Å, 25-45 μ Korngröße) mit einem Gradienten von 50-70% B in 80 min
(A = 0,1% TFA in H2O; B = 0, 1% TFA in MeOH). Ausbeute: 93 mg.
Analyt. HPLC: Retentionszeit 14,3 min (VYDACR 218TP54-C18-RP-Säule; Fluß 2 ml/min; to = 1,8 min; linearer Gradient von 0% - 50% B in 50 min; A = 0, 1% TFA in H2O; B = 0, 1% TFA in Acetonitril). FAB-MS : M = 1864,2; berechnete monoisotopische Molekülmasse: 1864,1.
Analog Beispiel 1 wurden hergestellt (bei den N-terminal acetylierten Peptiden wurden nach beendeter Synthese die Schritte 1 - 6 und 14 - 16 gemäß A ausgeführt):
2. H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
3. H-Tyr-Pro-Ser-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2 4. H-Tyr-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
5. H-Tyr-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
6. H-Tyr-Pro-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
7. H-Tyr-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
8. H-Tyr-Pro-Arg-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2 9. H-Gly-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
10. H-Tyr-Arg-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
11. H-Phe-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
12. H-Phe-Pro-Ser-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
13. H-Tyr-Pro-Ser-Arg-Aoc-Ile-Asn-Leu-lle-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2 14. H-Phe-Pro-Ser-Arg-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
15. H-Tyr-Pro-Ahx-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
16. H-Tyr-Pro-Abs-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2 17. Ac-Tyr-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-lle-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
18. Hpp-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
19. Hpac-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
20. Hbz-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
21. H-Tyr-Aoc-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
22. H-Tyr-Lys-Aoc-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
23. Ac-Tyr-Aoc-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
24. Hpp-Pro-Ser-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
25. H-Tyr-Lys-Ahx-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
26. H-Tyr-Lys-Abs-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
27. H-Tyr-Lys-Aoc-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
28. H-Tyr-Lys-Ahx-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
29. H-Tyr-Lys-Abs-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
30. H-Tyr-Lys-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
31. H-Tyr-Pro-Aoc-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
32. H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Aθc-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
33. Ac-Phe-Pro-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2 34. H-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
35. Ac-Tyr-Lys-Aoc-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2 Beispiel 36
Hpp-Cys-Ser-Lys-Aoc-Cys-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2 0,5 g Boc-Tyr(Br-Z)-p-Methylbenzhydrylaminharz mit einer Substitution von 0,49 mmol/g, entsprechend einer Ansatzgröße von 0,25 mmol wurden gemäß A mit je 1 mmol Boc-Arg(Tos)-OH Boc-Ile-OH
Boc-Gln-OH BθC-Cys(pMB)-OH
Boc-Arg(Tos)-OH Boc-Aoc-OH
Boc-Thr(Bzl)-OH Boc-Lys-(Cl-Z)-OH
Boc-Ile-OH Boc-Ser (Bzl )-OH
Boc-Leu-OH Boc-Cys(pMB)-HO
Boc-Asn-OH Hpp-OH umgesetzt. Das erhaltene Peptidharz (1,01 g) wurde einer HF-Spaltung unterworfen (10 ml HF, 1 ml m-Kresol; 0°C, 45 min). Der HF wurde im Vakuum
abgezogen, das Harz mit Essigester gewaschen, und das Peptid mit 10% Essigsäure extrahiert. Das lyophilisierte Rohpeptid wurde in 1 1 entgastem Wasser gelöst und der pH der Lösung mit wäßrigem Ammoniak auf 8,4 eingestellt. 0,01 n wäßrige K3Fe(CN)6-Lösung wurde langsam zugetropft, bis die gelbe Farbe bestehen blieb. Es wurde 1 h
nachgerührt und mit Eisessig auf pH 4,5 angesäuert. Nach Zugabe von BIORAD® AG3-X4A-Anionenaustauscherharz wurde 2 h gerührt, filtriert und das Filtrat lyophilisiert.
Die Reinigung des Rohpeptides erfolgte durch Gelchromatographie
(SEPHADEX® G-25, 10% HOAc) und anschließende Mitteldruckchromatographie (HD-SIL®-Reversed-Phase-C18-Material, 100 A, 25-45 μ Korngröβe) mit einem Gradienten von 50 - 70% B in 40 min (A = 0,1% TFA in H2O; B = 0,1% TFA in MeOH). Ausbeute: 87 mg.
Analyt. HPLC: Retentionszeit 13,9 min (VYDAC® 218TP54-C18-RP-Säule; Fluß 2 ml/min; to = 1,8 min; linearer Gradient von 0% - 50% B in
50 min; A = 0, 1% TFA in H2O; B = 0, 1% TFA in Acetonitril). FAB-MS: M = 1882,9; berechnete monoisotopische Molekülmasse: 1883,0.
Analog Beispiel 36 wurden hergestellt:
37. H-Tyr-Cys-Ser-Lys-Aoc-Cys-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
38. H-Tyr-Cys-Ser-Lys-Ahx-Cys-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
39. H-Tyr-Cys-Ser-Lys-Abs-Cys-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
40. H-Tyr-Cys-Ser-Lys-Cys-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
41. H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Cys-Aoc-Cys-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg- Tyr-NH2

Claims

Patentansprüche 1. Peptide der Formel Z-AK-Bl-Cm-Dn-Eo-Fp-Gq-H-Thr-I-Gln-J-K-NH2 worin
A Phe oder Tyr,
B Pro, Ser, Abu, Gly, Ala, Cys, Pro-Ser, Cys-Ser, Abu-Ser, Gly-Ser, Ala-Ser oder Pro-Ala,
C eine Aminosäure mit basischer Seitenkette,
D Pro oder Cys,
E die Gruppierung -NH-(CH2)t-CO- (mit t in der Bedeutung einer
ganzen Zahl von 0 bis 10),
F Cys, Abu, Gly oder Ala, G Ile-Asn, Leu-Asn, Val-Asn oder Asn, H ein aus lipophilen Aminosäuren zusammengesetzter Dipeptidrest, I eine Aminosäure mit basischer Seitenkette,
J eine Aminosäure mit basischer Seitenkette, K Phe oder Tyr und
Z ein Wasserstoffatom, eine Aminoschutzgruppe, einen Benzylrest, einen C2-10-Acylrest oder einen C1-5-Alkylrest, darstellen, k, l, m, n, o, p und q die Zahlen 0 oder 1 bedeuten, wobei jedoch k + l + m + n + o + p + q ≥ 1 sein muß, und zwei gegebenenfalls vorhandene Cys-Reste über eine Disulfidbrucke miteinander verbunden sein können, sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren.
2. Verfahren zur Herstellung der Peptide gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man diese nach in der Peptidchemie bekannten Methoden herstellt.
3. Peptide gemäß Anspruch 1 zur Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.
4. Verwendung der Peptide gemäß Anspruch 1 zur Bekämpfung von Bluthochdruck
5. Verwendung der Peptide gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von diagnostischen und analytischen Reagenzien für die biochemische und medizinische Forschung.
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