DE2602443C2

DE2602443C2 -

Info

Publication number: DE2602443C2
Application number: DE2602443A
Authority: DE
Inventors: Robert N. La Jolla Calif. Us Hamburger
Original assignee: University of California Berkeley
Current assignee: University of California Berkeley
Priority date: 1975-04-04
Filing date: 1976-01-23
Publication date: 1987-10-01
Also published as: JPS51118702A; JPS602318B2; US4161522A; DE2602443A1; BE840193A

Description

Die Symptome allergischer Erkrankungen beim Menschen, insbesondere das allergische Syndrom, werden durch die Freisetzung vascaktiver Amine, insbesondere Histamin, in den Organismus hervorgerufen. Das Histamin wird normalerweise in besonderen, als Mastzellen bekannten Zellen und Basophilleucocyten gelagert, die über den gesamten Organismus verteilt sind. Die Mastzellen sind über die gesamte Gewebestruktur beim Menschen verteilt, während die Basophilen mit dem Blut im Körper, d. h. innerhalb des vaskularen Systems, zirkulieren.

Die oben genannten Zellen produzieren und lagern Histamin innerhalb ihrer inneren Strukturen, in welchen das Histamin verbleibt, wenn nicht einen besondere Folge von Ereignissen eintritt, um die Freisetzung des Histamins aus innerhalb den Zellstrukturen in das umgebende Gewebe und Vaskularsystem auszulösen.

Das Hixtamin wird insbesondere im Ansprechen auf die Anwesenheit spezifischer Antigene (Allergene) freigesetzt, die sich in den Organismus Eingang verschaffen oder durch den Organismus im Ansprechen auf ein traumatisches Geschehen freigesetzt werden können. Die übliche Histaminfreisetzung aus den Mastzellen oder Basophilen wird jedoch durch eine notwendige Folge chemischer und immunologischer Ereignisse ausgelöst, die auf und in den Mastzellen- und Basophilstrukturen stattfinden.

Die Allergen-Mastzellen (Basophil)-Reaktion wird insbesondere durch eine als Immunoglobulin E (IgE) bekannte Gruppe von Proteinen begünstigt, die innerhalb des Körpers produziert werden. Das durch den menschlichen Organismus gebildete IgE ist ein komplexes Gebilde von Polypeptidketten, deren Moleküle jeweils bestimmte Variationen in der Folge der Aminosäuren in der Polypeptidkette aufweisen können, von denen jedoch alle im wesentlichen dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine "Y"-förmige Struktur haben, wobei der "Fuß" (d. h. der untere Teil des "Y") in Form des (Fc) Polypeptid anteil oder -fragmentes eine fixierte Folge (Sequenz) oder "konstante Region" von Peptiden entlang der Kette enthält. Der "Kopf" (entsprechend den nach oben weisenden Armen der "Y"-Struktur) kann Regionen aufweisen, in welchen die Polypeptidkette variiert (die variable Region des Fab), und zwar von Molekül zu Molekül. So haben die IgE Moleküle gewöhnlich identische "Fuß"-Peptidfolgen, können jedoch eine große Anzahl unterschiedlicher "Kopf"-Peptidfolgen haben.

Die allergische oder immunologische Histaminfreisetzung innerhalb des Organismus aus den spezialisierten Mastzellen und Basophilen kann unter den folgenden Umständen auftreten:

Alle Mastzellen oder Basophilen besitzen eine Anzahl von Rezeptor stellen, die zum "Ankoppeln" der konstanten Region oder des Fc-Anteils der IgE Moleküle verfügbar sind. Diese "Bindestellen" sind spezialisierte Gebiete auf der Zellmembran, in welchen ein besonderes geometrisches oder räumliches Molekulararrangement erfolgt, wodurch diese "Binder- oder Rezeptorstelle" an das Fc Fragment oder eine Stelle in der konstanten Region des IgE Moleküls "ankoppeln" kann.

Sollte ein wanderndes IgE Molekül eine freie "Binderrezeptorstelle" auf einer Mastzelle oder einem Basophilen finden, koppelt es mit seinem Fc Teil an die Binde(Rezeptor)Stelle der Zelle, um das IgE Molekül an der Mastzelle oder dem Basophil festzumachen.

Wenn der Fc Teil des IgE Moleküls an die bindende "Rezeptorstelle" festgemacht ist, sind die nach oben weisenden Arme der "Y" förmigen Moleküle (der F(ab) Anteil) frei, sich oberhalb der Zelloberfläche auszudehnen. Diese verlängerten, bzw. hinausweisenden oberen Peptidketten wirken ihrerseits als Rezeptoren für Allergene, die in der Umgebung des Organismus anwesend sein können. Wenn die Polypeptidstruktur der Fab Anteile mit einem besonderen Allergen verträglich ist, kann sich das Allergen an das sich nach außen erstreckende Fab der IgE Polypeptidkette binden. Im Fall einer Bindung wird die Mastzelle oder das Basophil automatisch stimuliert, um das Histamin aus der inneren Zellstruktur in die örtliche Umgebung der Mastzelle oder des Basophils freizusetzen. Ist das Histamin erst einmal freigesetzt, dann treten die bekannten "allergischen Symptome" auf.

Die derzeitige Therapie allergischer Erkrankungen umfaßt die Hypo sensibilisierung (wiederholte Injektionen schädlicher Allergene zur Bildung von "Blockierungsantikörpern"), die systemische Therapie mit Antihistaminen (die mit den während der allergischen Reaktion freigesetzten Histaminen konkurrieren) und Dinatriumcromoglykat (das die durch allergische Reaktionen freigesetzte Histaminmenge verringern kann). Auch Corticosteroide, Isoprenalin und Theophyllin sowie andere Arzneimittel sind bei der Allergietherapie verwendet worden. Keines der oben genannten Arzneimittel oder Verfahren stört jedoch die grundsätzliche Reaktion der IgE Mastzelle (Basophil), und alle haben wesentliche Einschränkungen bezüglich ihrer Eignung.

Ein anderer Therapieweg, der durch die obige Analyse der Allergen-IgE- Mastzell(Basophil)-Reaktion vorgeschlagen wird, wäre die Einführung eines Arzneimittels in den Organismus, das die Rezeptor- oder Bindestellen von Mastzellen (Basophilen) gegen die Bindung des IgE Moleküls "blockieren" würde. Von gleicher Wichtigkeit wäre ein Arzneimittel, das nicht nur die Bindestellen "blockieren", sondern weiterhin das IgE von den Bindestellen, an welches es sich bereits angelagert hat, entfernen würde. Jedes Auffüllen oder Vermindern der zur IgE Anlagerung verfügbaren Bindestellen würde selbstverständlich die Anzahl der Allergen-IgE-Mastzellen- (Basophil)-Reaktion verringern, wodurch die Histaminfreisetzung in den Organismus vermindert und so allergische Reaktionen herab gesetzt oder verhindert würden.

Es gibt bereits einige Versuche, diesen therapeutischen Weg zu begehen. So wurde z. B. in "Lancet 1968 - II, 17" eine Untersuchung veröffentlicht, in welcher der gesamte Fc Anteil des IgE, sowie kleine proteolytische Verdauungsfragmente desselben, auf ihre Fähigkeit zum Unterdrücken allergischer Reaktionen getestet wurden. Diese Untersuchung legte nahe, daß nur das gesamte Fc Fragment von IgE ebenso wirksam wie das intakte IgE Molekül bei der Inhibierung allergischer Reaktionen war, während die Verdauungs fragmente unwirksam waren. Das heißt, alle Bruchteile der Fc Peptidkette kleiner als das gesamte Polypeptid waren bei der Verhütung induzierter allergischer Reaktionen ungeignet. Das Fc Fragment selbst kann als therapeutisches oder Arzneimittel nicht verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf niedrig molekulare Oligopeptide, die bei der Behandlung allergischer Erkrankungen oder des allergischen Syndroms geeignet sind.

Die relativ kurzkettigen Oligopeptide mit 3-6 Aminosäureresten, die ein allergisches Ansprechen beim Menschen blockieren können, entsprechen Folgen (Sequenzen), die in der zweiten (C-2), dritten (C-3) und vierten (C-4) Domäne der konstanten (Fc) Region der ( ε )-Peptid kette des IgE Moleküls vorkommen.

Die Aminosäurefolge der gesamten ( ε )-Kette wurde neuerdings von Bennich et al bestimmt und in "Progress in Immunology II-Bd. 1: Immunochemical Aspects", Juli 1974, Seite 49-58, North Holland Publishing Company, Amsterdam, (1974) veröffentlicht.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind Oligopeptide aus 3-6 Aminosäuren in einer Folge, die aus einem Teil der obigen Aminosäurefolge ausgewählt ist, sowie deren Salze, Ester, Amide, N-Acyl- und O-Acylderivate.

Zur einfacheren Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die üblichen Abkürzungen für die verschiedenen Aminosäuren verwendet, die dem Fachmann geläufig sind. Zur besseren Klarheit werden jedoch die erfindungsgemäß in Frage kommenden Verbindungen im folgenden noch aufgeführt. Alle hier erwähnten, chiralen Aminosäurereste haben, falls nicht anders angegeben, die natürliche oder L-Konfiguration. Alle hier aufgeführten Peptidfolgen sind in üblicher Weise geschrieben, wodurch die N-endständige Aminosäure links und die C-endständige Aminosäure rechts steht.

Asp - Asparginsäure
Ala - Alanin
Arg - Arginin
Asn - Asparagin
Asp - Asparginsäure
Cys - Cystein
Gly - Glycin
Gln - Glutamin
Glp - Glutaminsäure
His - Histidin
Ile - Isoleucin
Leu - Leucin
Lys - Lysin
Met - Methionin
Phe - Phenylalanin
Pro - Prolin
Ser - Serin
Thr - Threonin
Trp - Tryptophan
Tyr - Tyrosin
Val - Valin

Die hier verwendete Bezeichnung "Salze" bezieht sich sowohl auf Salze einer Carboxylgruppe der Peptidkette als auch auf Säure additionssalze einer Aminogruppe der Peptidkette. Salze einer Carboxylgruppe können mit anorganischen oder organischen Basen gebildet werden. Anorganische Salze umfassen z. B. die Alkali metallsalze, wie das Natrium-, Kalium- und Lithiumsalz; Erdalkalisalze, wie das Calcium-, Barium- und Magnesiumsalz; und das Ammonium-, Ferro-, Ferri-, Zink-, Mangano-, Aluminium-, Manganisalz. Salze mit organischen Aminen umfassen solche, die z. B. mit Trimethylamin, Triäthylamin, Tri-(n-propyl)-amin, Dicyclo hexylamin, β-(Dimethylamino)-äthanol, Tris-(Hydroxymethyl)-amino methan, Triäthanolamin, β-(Diäthylamino)-äthanol, Arginin, Lysin, Histidin, N-Äthylpiperidin, Hydrabamin, Cholin, Betain, Äthylendiamin, Clucosamin, Methylglucamin, Theobromin, Purinen, Piperazinen, Piperidinen, Coffein oder Procain gebildet werden.

Säureadditionssalze umfassen z. B. Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure oder Salpetersäure; und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Gluconsäure, Zitronensäure, Apfelsäure, Ascorbinsäure oder Benzoesäure.

Die hier verwendete Bezeichnung "Ester" bezieht sich auf Ester einer Carboxylgruppe des Peptids, gebildet mit geraden oder verzweigkettigen gesättigten aliphatischen Alkoholen mit 1-12 C-Atomen, wie der Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, tert.-Butyl-, n-Amyl-, n-Hexyl-, Octyl-, Decyl- und Dodecylester.

Die hier verwendete Bezeichnung "Amide" bezieht sich auf Amide einer Carboxylgruppe des Peptids, gebildet mit Ammoniak oder mit primären oder sekundären Aminen mit bis zu 12 C-Atomen, wie Dimethylamin, Diäthylamin, Di-(n-butyl)-amin, n-Hexylamin, Piperidin, Pyrrolidin, Morpholin, Di-(n-hexyl)-amin oder N-Methylpipera zin.

Die "N-Acylderivate" beziehen sich auf Derivate einer Aminogruppe des Peptids, gebildet mit Acylteilen (z. B. einer Alkanoyl- oder carbocyclischen Aroylgruppe) mit bis zu 12 C-Atomen, wie Formyl, Acetyl, Benzoyl, Butyryl, Hexanoyl, Octanoyl, Decanoyl oder Dodecanoyl.

Die "O-Acylderivate" beziehen sich auf Derivate einer Hydroxyl gruppe der Peptidkette, gebildet mit Acylteilen (z. B. Alkanoyl- oder carboxcyclischen Aroylgruppen) mit bis zu 12 C-Atomen, wie Formyl, Acetyl, Propionyl, Benzoyl, Butyryl, Octanoyl, Hexanoyl, Decanoyl oder Dodecanoyl.

Es wird eine wirksame Menge eines Peptids oder eines Derivates desselben oder eine diese enthaltenden pharmazeutischen Präparates in üblicher, anerkannter Weise einzeln oder in Kombination mit einer oder mehreren erfindungs gemäßen Verbindungen oder anderen pharmazeutischen Mitteln verabreicht. Somit können die Verbindungen oder Präparate oral, sublingual, örtlich (d. h. auf die Haut oder in die Augen), parenteral (z. B. intramuskulär, intravenös, subkutan oder intradermal) oder durch Inhalation und in Form fester, flüssiger oder gasförmiger Dosen einschließlich Tabletten, Suspensionen und Aerosolen verabreicht werden, wie im folgenden noch näher beschrieben wird. Die Verabreichung kann in kontinuierlicher Therapie mit Einzeldosierungsformen oder ad libitum in Einzeldosistherapie erfolgen.

Aufgrund der obigen Angaben sowie unter Berücksichtigung von Ausmaß oder Schwere der zu behandelnden Erkrankung, dem Alter des Patienten - Faktoren, die vom Fachmann durch Routineversuche bestimmbar sind - kann die wirksame Dosis über einen weiten Bereich variieren. Da einzelne Patienten in ihrem IgE-Gehalt variieren, wird eine wirksame systemische Dosis als zwischen dem 2×10³- bis 2×10⁶fachen des IgE-Gehaltes, auf molarer Basis, angegeben. Für einen Durchschnitts patienten würde dies zwischen etwa 0,5-500 mg/kg/Tag in Abhängigkeit von der Stärke der Verbindung liegen. Selbstverständlich wird für eine lokalisierte Behandlung, z. B. des Atmungs systems, proportional weniger Material benötigt.

Geeignete pharmazeutische Träger zur Herstellung der erfindungs gemäßen Präparate können Feststoffe, Flüssigkeiten oder Gase sein; so können die Präparate die Form von Tabletten, Pillen, Kapseln Pulver, enterisch überzogenen oder anders geschützten Formulierungen (z. B. durch Binden auf Ionenaustauscherharze oder andere Träger, durch Verpacken in Lipid-Protein-Vesikel oder Ersetzen einer endständigen Aminosäure in der L-Form durch eine in der D-Form), Depotformulierungen, Lösungen (z. B. Augentropfen), Suspensionen, Elixieren oder Aerosolen annehmen. Der Träger kann aus verschiedenen Ölen einschließlich solchen von Erdöl, sowie tierischem, pflanzlichem oder synthetischem Ursprung, wie z. B. Erdnußöl, Soja bohnenöl, Mineralöl oder Sesamöl, ausgewählt werden. Wasser, Kochsalzlösung, wäßrige Dextrose und Glykole werden als flüssige Träger, insbesondere (wenn isotonisch) für injizierbare Lösungen, bevorzugt. Geeignete pharmazeutische Streckmittel umfassen Stärke, Cellulose, Talkum, Glucose, Lactose, Sucrose, Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kreide, Kieselsäuregel, Magnesiumstearat, Natriumstearat, Glycerinmonostearat, Natriumchlorid, Trockenmagermilch, Glycerin, Propylenglykol, Wasser oder Äthanol. Die Präparate können den üblichen pharmazeutischen Maßnahmen, wie Sterilisation, unterworfen werden und die üblichen pharmazeutischen Zusätze, wie Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Netzmittel oder Emulgatoren, Salze zur Einstellung des osmotischen Druckes oder Puffermittel enthalten. Geeignete pharmazeutische Träger und ihre Formulierung werden in "Remington′s Pharmaceutical Sciences" von E.W. Martin beschrieben. Die Präparate enthalten in jedem Fall eine wirksame Menge der aktiven Verbindung zusammen mit einer geeigneten Trägermenge zur Herstellung der richtigen Dosierungsform für die entsprechende Verabreichung an den Patienten.

Um zur Verhütung der Behandlung allergischer Reaktionen wirksam zu sein, ist es wichtig, daß die therapeutischen Mittel relativ nicht-toxisch, nicht-antigenisch und nicht-irritierend sind bei den Konzentrationen ihrer tatsächlichen Verwendung. Dies ist, wie festgestellt wurde, bei allen erfindungsgemäßen Verbindungen der Fall, deren Herstellung im folgenden beschrieben wird.

Die erfindungsgemäßen Peptide können nach jedem in der Peptid technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Eine ausgezeichnete Zusammenfassung der vielen verfügbaren Verfahren findet sich bei J. Meienhofer "Hormonal Proteins and Peptides", Bd. 2, Seite 46, Academic Press, New York (1973) für die Peptidsynthese in fester Phase und bei E. Schröder und K. Lübke "The Peptides", Bd. 1, Academic Press, New York (1965) für die klassische Synthese in Lösung.

Gewöhnlich umfassen diese Verfahren die aufeinanderfolgende Addition einer oder mehrerer Aminosäuren oder entsprechend geschützter Aminosäuren an die wachsende Kette. Normalerweise wird entweder die Amino- oder Carboxylgruppe der ersten Aminosäure geschützt, und zwar durch eine geeignete schützende Gruppe. Die geschützte oder in ein Derivat umgewandelte Aminosäure kann dann entweder an einen inerten festen Träger gebunden oder in Lösung durch Zugabe der nächsten Aminosäure in der Reihenfolge mit einer zweckmäßig geschützten, komplementären (Amino- oder Carboxyl)- Gruppe unter geeigneten Bedingungen zur Bildung der Amidbindung verwendet werden. Dann wird die schützende Gruppe von diesem neu addierten Aminosäurerest entfernt, worauf die nächste (zweckmäßig geschützte) Aminosäure addiert wird usw. Nachdem alle gewünschten Aminosäuren in der richtigen Reihenfolge gebunden sind, werden irgendwelche verbliebenen schützenden Gruppen (und alle festen Träger) nacheinander oder gleichzeitig zur Bildung des endgültigen Peptids entfernt. Durch einfache Modifikation dieses allgemeinen Verfahrens kann man mehr als eine Aminosäure gleichzeitig an eine wachsende Kette addieren, z. B. durch Kuppeln (unter Bedingungen, die chirale Zentren nicht racemisieren) eines geschützten Tripeptids mit einem entsprechend geschützten Dipeptid, um nach Entfernung der schützenden Gruppen ein Pentapeptid zu erhalten.

Die schützenden Gruppen sollten gegen die Bedingungen der Bildung der Peptidbindung stabil sein und gleichzeitig ohne Zerstörung der wachsenden Peptidkette oder Racemisierung eines der darin enthaltenen chiralen Zentren leicht entfernbar sein.

Zu den Klassen von Schutzgruppen für Aminogruppen bei der stufenweisen Synthese von Polypeptiden gehören (1) acylartige schützende Gruppen, wie Formyl, Trifluoracetyl, Phthalyl, Toluolsulfonyl (Tosyl), Benzolsulfonyl, o-Nitrophenylsulfenyl, Tritylsulfenyl, o-Nitrophenoxyacetyl, Chloracetyl, Acetyl oder γ-Chlorbutyryl; (2) aromatische urethanartige schützende Gruppen, wie Benzyloxy carbonyl und substituiertes Benzyloxycarbonyl, z. B. p-Chlorbenzyl oxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, 2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl, 2-Benzoyl-1-methylvinyl; (3) aliphatische urethanartige schützende Gruppen wie tert.-Butyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, Diisopropylmethoxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Äthoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl; (4) cycloalkylurethanartige schützende Gruppen, wie Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Cyclohexyloxy carbonyl; (5) thiourethanartige schützende Gruppen, wie Phenyl thiocarbonyl; (6) alkylartige schützende Gruppen, wie Triphenyl methyl (Trityl) und Benzyl; und (7) Trialkylsilylgruppen, wie Trimethylsilyl.

Bevorzugte schützende Gruppen sind tert.-Butyloxycarbonyl (t-BOC) und tert.-Amyloxycarbonyl (AOC).

Zu den Klassen der für die stufenweise Synthese von Peptiden geeigneten Carboxyschutzgruppen gehören (1) substituierte und unsubstituierte aliphatische Estergruppen, wie Methyl-, Äthyl-, tert.-Butyl-, 2,2,2-Trichloräthyl- und tert.-Butylester; (2) Aralkylestergruppen, wie Benzyl-, p-Nitrobenzyl-, p-Methoxybenzyl-, Diphenylmethyl- oder Triphenylmethyl-(Trityl)ester; (3) N-substituierte Hydrazide, wie tert.-Butyloxycarbonylhydrazide und Carbobenzyloxycarbonylhydrazide; (4) amidschützende Gruppen, gebildet durch Kondensation eines Carboxylteils mit z. B. Ammoniak, Methylamin, Äthylamin oder Diphenylmethylamin.

Hydroxylgruppen in Aminosäuren, wie in Serin, Threonin und Hydroxy prolin, können als Aralkyläther, z. B. Benzyläther, geschützt werden.

Geeignet als feste Träger für die obige Synthese sind Materialien, die gegenüber den Reaktionsteilnehmern und Reaktionsbedingungen der stufenweisen Kondensations-Schutzgruppenentfernungs-Reaktionen inert und in den verwendeten Medien unlöslich sind. Verwendbare Materialien umfassen z. B. vernetzte Polystyroldivinylbenzolharze, vernetzte Polyamidharze, Polyäthylenglykolharze oder entsprechend funktionalisierte Glasperlen.

Der erste Aminosäurerest wird durch Bildung einer kovalenten Bindung mit einer aktiven Gruppe auf dem Harz an den festen Träger gebunden. Zu diesem Zweck geeignete aktive Gruppen umfassen z. B. Chlormethyl, Benzhydrilamino, Hydroxylmethyl, Phenacylhalogenid oder Dehydroanlanin, wobei Chlormethyl als aktive Gruppe bevorzugt wird. Die erste Aminosäure wird an das bevorzugte Chlormethylharz nach einem basisch katalysierten Verfahren gebunden, in welchem das Triäthylamin-, Tetramethylammonium- oder Cäsiumsalz (oder ein ähnliches Salz) der Carbonsäure mit dem Harz in einem Lösungsmittel, wie Äthanol, Dioxan oder Dimethylformamid erhitzt wird.

Geeignete Reaktionsteilnehmer zur Amidbildung zwischen Carboxyl- und Aminogruppen sind bekannt und umfassen z. B. (1) Carbodiimide, wie Dicyclohexylcarbodiimid (DCC); (2) ein Carbodiimid plus einem Zusatz, wie 1-Hydroxybenzotriazol oder Äthyl-2-hydroximino-2- cyanacetat; (3) Alkylchlorformiate, wie Isobutylchlorformiat oder Äthylchlorformiat; (4) N-geschützte Aminosäuren, die durch Bildung eines geeigneten Esters aktiviert sind, z. B. substituierte Phenylester, Aryl- oder Alkylthioester, substituierte 8-Hydroxy isochionolinester, 2-Thiopyridylester und ähnliche bekannte Ester.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Peptide ist das sog. "Merrifield"-Verfahren, das im einzelnen von R. B. Merrifield in "Syntesis of a Tetrapeptide", J. Am. Chem. Soc., Bd. 85, Seite 2149-2154 (1963), sowie durch die oben genannte Meienhofer-Veröffentlichung beschrieben wurde.

Bei diesem Verfahren wird ein Peptid jeder gewünschten Länge und Folge durch stufenweise Addition von Aminosäuren an eine wachsende Peptidkette hergestellt, die durch eine kovalente Bindung an ein festes Harzteilchen gebunden ist.

Bei diesem Verfahren wird das C-ständige Ende der wachsenden Peptidkette kovalent an ein Harzteilchen gebunden, und Aminosäure mit geschützten Aminogruppen werden in oben dargestellter Weise stufenweise addiert. Eine bevorzugte, die Aminogruppe schützende Gruppe ist die t-BOC Gruppe, die bei den Kondensationsbedingungen stabil und dennoch leicht ohne Zerstörung der Peptidbindungen oder Racemisierung der chiralen Zentren in der Peptidkette entfernbar ist. Am Ende des Verfahrens wird das endgültige Peptid vom Harz abgespalten, und irgendwelche verbliebenen schützenden Gruppen werden durch Behandlung unter sauren Bedingungen z. B. mit einer Mischung aus Bromwasserstoffsäure und Trifluoressigsäure oder mit Fluorwasserstoffsäure entfernt; oder die Abspaltung vom Harz kann unter basischen Bedingungen, z. B. mit Triäthylamin, erfolgen, wobei die schützenden Gruppen dann unter sauren Bedingungen entfernt werden.

Die abgespaltenen Peptide werden in bekannter Weise isoliert und gereinigt, z. B. durch Lyophilisierung und anschließende Ausschluß- oder Teilungschromatographie auf Polysaccharidgelmedien, wie "Sephadex® G-25", oder Gegenstromverteilung. Die Zusammensetzung des endgültigen Peptids kann durch Aminosäureanalyse nach Abbau des Peptids durch Standardmaßnahmen bestätigt werden.

Salze der Carboxylgruppen des Peptids können in üblicher Weise durch Berührung des Peptids mit einem oder mehreren Äquivalenten einer gewünschten Base, wie eine metallische Hydroxybase, z. B. Natriumhydroxid, eine Metallcarbonat- oder -bicarbonatbase, wie Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat, oder eine Aminbase, wie Triäthylamin oder Triäthanolamin hergestellt werden.

Säureadditionssalze der Peptide kann man durch Berührung des Polypeptids mit einem oder mehreren Äquivalenten der gewünschten anorganischen oder organischen Säure, z. B. Salzsäure herstellen.

Ester von Carboxylgruppen der Peptide kann man in üblicher Weise herstellen. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Estern der erfindungsgemäßen Peptide unter Verwendung des oben beschriebenen Merrifield-Syntheseverfahrens besteht im Abspalten des vollständigen Peptids vom Harz in Anwesenheit des gewünschten Alkohols unter basischen oder sauren Bedingungen, was vom Harz abhängt. So wird das C-endständige Ende des Peptids nach Befreiung vom Harz direkt ohne Isolierung der freien Säure verestert.

Amide der erfindungsgemäßen Peptide können ebenfalls in üblicher Weise hergestellt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Amidbildung an der C-endständigen Carboxylgruppe ist die Abspaltung des Peptids von einem festen Träger mit einem entsprechenden Amin oder die Abspaltung in Anwesenheit eines Alkohols, die zu einem Ester führt, sowie die anschließende Aminolyse mit dem gewünschten Amin.

Die N-Acylderivate einer Aminogruppe der erfindungsgemäßen Peptide können unter Verwendung einer N-Acyl-geschützten Aminosäure für die endgültige Kondensation oder durch Acylierung eines geschützten oder ungeschützten Peptids hergestellt werden. Die D-Acylderivate können z. B. durch Acylierung eines freien Hydroxy peptids oder Peptidharzes hergestellt werden. Jede Acylierung kann mit üblichen Acylierungsmitteln, wie Acylhalogenide, Anhydride oder Acylimidazole durchgeführt werden. Gegebenenfalls können N- und O-Acylierung zusammen durchgeführt werden.

Die Kupplung, Schutzentfernungs/Spaltungs-Reaktion und die Herstellung von Derivaten der erfindungsgemäßen Peptide erfolgen zweckmäßig bei Temperaturen zwischen etwa -10°C und +50°C, vorzugsweise etwa 20-25°C. Selbstverständlich hängt die genaue Temperatur für jede besondere Reaktion von den Substraten, Reaktionsteilnehmern und Lösungsmitteln ab, wie dies dem Fachmann geläufig ist. Beispiele für Reaktionsbedingungen zu diesen Verfahren können den Beispielen entnommen werden.

Zur pharmazeutischen Anwendung:

Die "Blockierungs"-aktivität der erfindungsgemäßen Oligopeptide kann an der klassischen Prausnitz-Kustner (P-K) Reaktion untersucht werden. Dabei wird einem Menschen ein bekanntes allergisches Serum, d. h. ein solches, das ein für ein bekanntes Antigen oder Allergen spezifisches IgE enthält, intradermal injiziert. Nach einer gewissen Zeit, z. B. 20 Stunden oder mehr, werden die Injektionsstellen durch einen Stich oder die Injektion einer Lösung des für das IgE im injizierten Serum spezifischen Antigens gereizt. Innerhalb der nächsten 10-30 Minuten zeigt sich eine positive Reaktion durch Bildung einer Schwellung (und Rötung) an der Injektionsstelle. Je größer der Schwellungsdurchmesser, um so intensiver ist die allergische Reaktion. Das heißt, eine stärkere Schwellung bedeutet eine größere Hintaminfreisetzung in das Gewebe an der Injektionsstelle. Umgekehrt zeigt die Bildung einer Schwellung mit geringerem Durchmesser oder das Fehlen jeglicher Schwellung eine verminderte und/oder überhaupt keine allergische Reaktion. Diese dargestellte P-K Reaktion ist ein klassischer, allgemein bekannter und von Allergieforschern angewendeter Test.

Wie erwähnt, wird die klassische P-K Reaktion zur Untersuchung der "Blockierungs"-Fähigkeiten der erfindungsgemäßen Polypeptide verwendet.

Die folgenden Untersuchungen verschiedener erfindungsgemäßen Oligopeptide, deren Synthese beschrieben worden ist, erfolgten unter Verwendung eines einzigen, als sicher erkannten P-K Spenderserums, das ein für Meerschweinchenallergene spezifisches IgE enthielt.

Die Peptidlösungen wurden entweder intradermal 1-24 Stunden vor dem P-K Serum injiziert oder zur gleichzeitigen Injektion mit Verdünnungen des P-K Serums gemischt. Die anfänglichen Tests erfolgten mit einem P-K Serum bei Verdünnungen von 1 : 4 bis 1 : 200. Weitere Versuche erfolgten bei einer fixierten P-K Verdünnung von 1 : 32, wobei die erfindungsgemäßen Peptidlösungen variiert wurden, so daß sie etwa 1 Millimol bis 2 Mol des zu testenden Peptids enthielten. Die Injektionsstellen der Versuchspersonen wurden durch Stichpunktur von Meerschweinchen BCA 1 : 40 Gew./Vol. (Firma Berkeley Biologicals, Inc.) gereizt.

Es wurden Versuchspersonen mit Serum IgE Werten unter 100 U/ml (242 ng/ml) hatten; von diesen Werten ist bekannt, daß sie eine erfolgreiche P-K Reaktionsfähigkeit sicherstellen. Weiter wurden für diese Tests Personen mit einem negativen direkten Hauttest aus Meerschweinchenantigen ausgewählt. Die P-K und Hauttests erfolgten am Rücken und/oder am Unterarm. Mehrfachteststellen von etwa 25 mm Durchmesser wurden durch eine Markierung bezeichnet, und alle Injektionen erfolgten innerhalb der umrahmten Haut flächen.

Eine typische Folge bestand in der intradermalen Injektion von 0,1 ml der Peptidlösung oder einer gepufferten Kontrollösung mit Kochsalzlösungverdünnung; in 1-24 Stunden schloß sich daran die intradermale Injektion von 0,5 ml P-K Serum in jede vorherige Injektionsstelle an. Nach Verstreichen von 22-24 Stunden wurde jede Stelle mit der Antigenlösung stichpunktiert, in 5 Minuten trocken getupft, und dann erfolgten, gewöhnlich 15, 20 und 25 Minuten nach der Stichpunktur, die dreimaligen Messungen auf Schwellung und Rötung in ihrem engsten und weitesten Durchmesser.

Die Untersuchungen auf Blockierungs-Aktivität erfolgten mit folgenden Peptiden: Asp-Pro-Arg; Ser-Asp-Pro-Arg; Asp-Ser-Asp-Pro-Arg; Asp-Thr-Glu-Ala-Arg und Ala-Asp-Ser-Pro-Arg.

Zum Vergleich wurde Tosyl-L-Arginylsarcosinmethylester (TASME) Science, 189 (1975), S. 389, synthetisiert und untersucht.

Die genannten Peptide wurden wie oben an sechs verschiedenen Personen mit den folgenden Ergebnissen untersucht:

Für Asp-Pro-Arg lag die durchschnittliche Inhibierung bei 15% mit einem individuellen Bereich von nur 0% bis zu 38%.

Für Ser-Asp-Pro-Arg lag die durchschnittliche Inhibierung bei 18% mit einem individuellen Bereich von nur 0% bis 50%.

Für Asp-Ser-Asp-Pro-Arg lag die durchschnittliche Inhibierung bei 72% mit einem individuellen Bereich von 60% bis 89%.

Für Ala-Asp-Ser-Asp-Pro-Arg lag die durchschnittliche Inhibierung bei 46% mit einem individuellen Bereich zwischen 10 bis 61%.

Für Asp-Thr-Glu-Ala-Arg lag die durchschnittliche Inhibierung bei 58% mit einem individuellen Bereich zwischen 30 bis 80%.

Für TASME lag die durchschnittliche Inhibierung bei 24% mit einem individuellen Bereich zwischen 0 bis 40%.

Die obigen Ergebnisse sind der Durchschnitt doppelter Messungen bei drei Zeitabständen für jede Reaktion jeder Person, subtrahiert von den durchschnittlichen Kontrollschwellungsmessungen und dividiert durch die durchschnittliche Messung der Kontroll schwellung bei jeder Versuchsperson. Die Kontrollschwellungen bei den verschiedenen Versuchspersonen variierten von 8-40 mm² mit einem Durchschnittswert von 17 mm². Jedes Peptid wurde in etwa 6 µg/ml Verdünnung verwendet, und an jede Stelle wurde 0,1 ml und anschließend 0,05 ml verdünntes P-K Serum mit einem IgE Gehalt von 0,2 ng injiziert. Somit konkurrierten 10^-9M des Peptids mit 10^-15M IgE bzgl. der Bindestellen der Mastzellen; oder das Verhältnis betrug 1 IgE Molekül pro 10⁶ Peptidmoleküle. Aus den obigen Untersuchungen geht hervor, daß das Pentapeptid, d. h. Asp-Ser-Asp-Pro-Arg, die stärkere "Blockierungs"-aktivität zeigt, wobei das Hexapeptid, d. h. Ala-Asp-Ser-Asp-Prop-Arg, eine etwas geringere Aktivität zeigt. Das Tetrapeptid Ser-Asp-Pro-Arg und das Tripeptid Asp-Pro-Arg zeigten die geringste Wirksamkeit.

Es wird darauf hingewiesen, daß das Pentapeptid Asp-Thr-Glu-Ala- Arg entsprechend den anderen Peptiden hergestellt und untersucht wurde. Dieses Peptid hat nicht die analoge Folge der in den C2, C3 oder C4 Domänen des IgE Molekül erscheinenden Aminosäuren, zeigt jedoch im obigen Test eine hohe Wirksamkeit.

Weiterhin wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Peptide offenbar die Fähigkeit zum "Entfernen" des IgE aus den Mastzellenstellen sowie zum Verhindern einer Bindung des IgE an diese Stellen haben. Bei einem Einzeltest an einer Versuchs person mit bekannter, extremer Sensibilität auf Meerschweinchenantigene, d. h. eine Person mit hoher natürlicher Konzentration an gegen Meerschweinchenantigen sensitivem IgE, wurden die erfindungs gemäßen Polypeptide injiziert, und es wurde die Reaktion der Versuchsperson auf Meerschweinchenantigen festgestellt.

Im einzelnen wurden jeweils etwa 2 nM Asp-Ser-Asp-Pro-Arg und Ala-Asp-Ser-Asp-Pro-Arg intradermal in 3 markierte Stellen injiziert. Vergleichsweise wurde TASME sowie eine Kontrolle des Pufferverdünnungsmittels allein ebenfalls in 3 markierte Stellen injiziert. 1, 5 und 24 Stunden nach der Peptid- und Kontrollinjektion wurde jeweils eine Peptid- und Verdünnungsmittelstelle durch Stichpunktur mit Meerschweinchenantigen gereizt. Zu den Zeitabständen von 1 und 5 Stunden wurde keine Inhibierung der Schwellungs- und Rötungsreaktion an irgendeiner der Stellen festgestellt. Bei der Reizung nach 24 Stunden war jedoch die Schwellung an der Asp-Ser-Asp-Pro-Arg Stelle etwa 45% kleiner, während an der Ala-Asp-Ser-Asp-Pro-Arg Stelle die Schwellung etwa 23% kleiner war. An der TASME Stelle wurde keine Verringerung der Schwellungsgröße im Vergleich zur Stelle der Injektion mit gepuffertem Kochsalzlösungsverdünnungsmittel festgestellt.

Somit "entfernen" mindestens die aktivsten erfindungsgemäßen Peptide offenbar ein bereits an Mastzellenstellen gebundenes IgE und inhibieren somit eine natürliche allergische Reaktion. Wie bereits gezeigt, ist dasselbe Pentapeptid bei der Inhibierung einer passiv übertragenen (P-K) allergischen Reaktion äußerst wirksam.

Die akute Toxizität wurde wie folgt bestimmt:
Weiße BBA Mäuse mit einem Durchschnittsgewicht von 15 g wurden jeweils mit 1,4 cm³ einer Lösung des Peptids in phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei einem pH-Wert von 7,4 wie folgt injiziert:

0,1 ml × 3intradermal 0,1 ml × 3subkutan 0,2 mlintravenös 0,6 mlintraperitoneal

24-72 Stunden nach der Injektion wurden die Mäuse, die alle noch lebten, getötet und untersucht.

Die verwendeten Peptide und ihre Konzentrationen waren wie folgt:

Ala-Asp-Ser-Asp-Pro-Arg (Beisp. 4) 5 µg/ml (375 mg/kg)-6 Mäuse Asp-Ser-Asp-Pro-Arg (Beisp. 3)10 µg/ml (1 mg/kg)-8 Mäuse Asp-Ser-Asp-Pro-Arg (Beisp. 3)13 µ/ml (1,3 mg/kg)-8 Mäuse

Die visuelle und mikroskopische Untersuchung von Gewebe und Organen zeigte keine örtlichen oder systemischen toxico-logikalen Abnormalitäten.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung

Beispiel 1 Herstellung des Tripeptids Asp-Pro-Arg

1,6 g (5 Millimol) t-BOC-Nitroarginin wurde mit 10 g Chlormethylharz (Perlen aus Kopolystyrol - 2% Divinylbenzol mit 0,5-1 meg Chlormethylgruppen pro g Harz) in einer Mischung aus 1,4 ml (10 Millimol) Triäthylamin und 100 cm³ Äthanol 24 Stunden bei 22°C unter ständigem Rühren umgesetzt. Das argininierte Harz wurde anschließend nacheinander gründlich mit Essigsäure, abs. Äthanol, Wasser mit sich erhöhenden Äthanolmengen, Methanol und schließlich mit Methylenchlorid gewaschen. Dann wurde das Harz gründlich unter Vakuum getrocknet. Die Analyse ergab 0,05 Millimol Arg/g Harz. 2,5 g des so hergestellten Harzes wurden in ein Merrifield-Gefäß für die Reaktion in fester Phase gegeben, das mit Rührmitteln versehen war und dem folgenden Schutzgruppenentfernungszyklus unterworfen:

(a) unter Rühren wurde bei 22°C die t-BOC-Gruppe mit 10 ml 4N HCl in Dioxan während 30 Minuten abgespalten
(b) es wurde zweimal mit 10 ml Dioxan gewaschen
(c) es wurde zweimal mit 10 ml Methylenchlorid gewaschen
(d) es wurde zweimal mit 10 ml Chloroform gewaschen
(e) das Hydrochlorid wurde mit 10 ml 5 : 95 Triäthylamin/Chloroform neutralisiert
(f) es wurde zweimal mit 10 ml Methylenchlorid gewaschen
(g) es wurde zweimal mit 10 ml Chloroform gewaschen

Dann wurde das Harz dem folgenden Synthesezyklus unterworfen:
ein 10facher Überschuß aus t-BOC-Prolin (1,25 Millimol) in Methylen chloridlösung wurde zugefügt, dann wurden 258 mg (1,25 Millimol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) zugegeben und die Mischung 2 Stunden bei 22°C geschüttelt. Anschließend wurde das Harz dreimal mit je 10 ml Dioxan, Chloroform bzw. Methylenchlorid gewaschen.

Das Dipeptidharz wurde dann dem Schutzgruppenentfernungszyklus unterworfen und mit einem 4fachen Überschuß an t-BOC-β-Benzyl aspartat (0,5 Millimol) wie im oben beschriebenen Synthesezyklus umgesetzt. Dann wurde ein 0,5 g Anteil des Harzes aus dem Reaktions gefäß entfernt und wie folgt einem Abspaltungsverfahren unter worfen:

0,5 g des Tripeptidharzes wurden in 5 ml trockener Trifluor essigsäure suspendiert, dann wurde 90 Minuten ein langsamer Strom aus wasserfreiem HBr durch die Lösung geleitet. Das Harz wurde abfiltriert und zweimal mit 5 ml Trifluoressigsäure gewaschen. Die kombinierten Filtrate wurden unter Vakuum konzentriert und die überschüssige HBr vom Peptid durch wiederholtes Abdampfen von 1 : 1 Methanol/Wasser-Lösungen entfernt. Das Peptid wurde schließlich in Wasser gelöst und lieferte nach Lyophilisieren Aspartyl- Prolyl-ε-Nitroarginin. Dann wurde die Nitrogruppe durch Hydrieren in einer Parr-Niederdruck-Schüttelhydrierungsvorrichtung wie folgt entfernt: das nitrogeschützte Tripeptid wurde in einer 10 : 1 : 1 Methanol/Essigsäure/Wasser-Mischung gelöst (etwa 10-20 mg/ml) und ein gleiches Gewicht eines 5%igen Palladium-auf- BaSO₄-Katalysators zugefügt und die Mischung über Nacht bei einem Wasserstoffdruck von etwa 3,5 at geschüttelt. Der Katalysator wurde abfiltriert und die Filtrate unter Vakuum konzentriert. Der Peptidrest wurde auf einer Sephadex® G-25 Kolonne chromato graphiert. Die durch übliche Aminosäureanalyse festgestellte Ausbeute an gereinigtem Tripeptid betrug etwa 24%, bezogen auf das in das Harz einverleibte Arginin. Ein Teil des Produktes wurde mit 5,7N HCl in Wasser hydrolysiert und in einer Aminosäure analysevorrichtung untersucht; es zeigte sich ein Verhältnis von Asp 1,05, Pro 0,95, Arg 1,00.

Die Reinheit wurde in üblicher Weise durch Papierelektrophorese bei einer Anzahl von pH-Werten bestimmt.

Beispiel 2 Herstellung des Tetrapeptids Ser-Asp-Pro-Arg

Das nicht zur Synthese des Tripeptids verwendete Tripeptidharz von Beispiel 1 wurde dem Schutzgruppenentfernungszyklus (vgl. Beispiel 1) unterworfen und dann mit 0,111 g t-BOC-O-Benzylserin und 0,13 g Dicyclohexylcarbodiimid in 20 ml Methylenchlorid wie im Synthesezyklus von Beispiel 1 umgesetzt.

Dann wurde ein Teil des Harzes den in Beispiel 1 beschriebenen Abspaltungs- und Hydrierungsverfahren unterworfen und wie in Beispiel 1 gewonnen, wodurch man Ser-Asp-Pro-Arg in 20%iger Ausbeute, bezogen auf das an das Harz veresterte Arginin, gewann. Nach Hydrolyse mit HCl wurde eine Probe des gewonnenen Tetrapeptids in einer Aminosäureanalysevorrichtung untersucht und zeigte ein Verhältnis von Ser 0,79, Asp 1,18, Pro 1,02 und Arg 1,01 (Serin wurde teilweise während der Säurehydrolyse zerstört).

Die Reinheit wurde in üblicher Weise bei einer Anzahl von pH- Werten durch Papierelektrophorese bestimmt.

Beispiel 3 Herstellung des Pentapeptids Asp-Ser-Asp-Pro-Arg

A. Das nicht abgespaltene Tetrapeptidharz von Beispiel 2 wurde dem Schutzgruppenentfernungszyklus von Beispiel 1 unterworfen und unter Verwendung von 0,152 g t-BOC-β-Benzylaspartat im Synthese zyklus behandelt.

Das Pentapeptid wurde vom Harzteil mit HBr in Trifluoressigsäure wie oben abgespalten. Das gewonnene Polypeptid wurde unter Vakuum getrocknet, gründlich mit Wasser gewaschen und dann lyophilisiert. Die Analyse zeigte eine Ausbeute von 16%, bezogen auf das Arginin.

Das Pentapeptid wurde mit HCl hydrolysiert und in der Aminosäureanalysevorrichtung untersucht; es zeigte sich ein Verhältnis von Asp 2,12, Ser 0,74, Pro 1,12 und Arg 1,01.

B. Das Pentapeptid kann auch durch Modifikation der Verfahren der Beispiele 1-3A hergestellt werden:

Zu einer Lösung aus 3,02 g (6,82 Millimol) α-t-Amyloxycarbonyl- N^ε-tosyl-L-arginin (t-Aoc-Tosyl-Arg) in 15 ml Äthanol und 6 ml Wasser wurde eine Lösung aus Cäsiumbicarbonat (1,4 g in 3 ml H₂O) eingetropft, bis der pH-Wert der Lösung 7,0 betrug. Die Lösung wurde unter Vakuum zu einem Schaum konzentriert, der unter Hochvakuum über P₂O₅ gründlich getrocknet wurde. Zu diesem Rückstand wurden 25 ml trockenes Dimethylformamid (DMF) und 4,5 g chlor methyliertes Harz (Perlen aus Copolystyrol-1% Divinylbenzol mit 1,10 meq Chlormethylgruppen/g Harz) zugefügt und die Mischung 3 Tage bei 50°C geschüttelt. Das Harz wurde filtriert und 5mal mit je 20 ml Dimethylformamid, 3mal mit je 20 ml 90%igem Dimethylformamid/Wasser, 2mal mit je 20 ml Dimethylformamid und 2mal mit je 20 ml Äthanol gewaschen und dann unter Vakuum über P₂O₅ getrocknet; so erhielt man 5,54 g argininiertes Harz (Einverleibung von etwa 50%).

Dann wurde das Harz 4 Schutzgruppenentfernungs- und Synthesezyklen unter Verwendung von 4 Äquivalenten der entsprechenden t-BOC- Aminosäure in jeder Kettenverlängerungsstufe unterworfen, wodurch man ein geschütztes Pentapeptidharzmaterial erhielt.

Dieses Harzmaterial wurde dann in ein HF beständiges Reaktionsgefäß gegeben, es wurden 8 cm³ Anisol zugefügt und das Gefäß an eine HF-Leitung angeschlossen. Es wurden etwa 70 ml HF bei 0°C in das Reaktionsgefäß hineindestilliert, und die Mischung wurde weitere 30 Minuten bei 0°C gerührt. Das HF wurde abgepumpt und das Harz 5mal mit je 30 ml Äther gewaschen und dann 5mal mit je 30 ml Wasser extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde zu einem gelben glasigen Pulver lyophilisiert, das nach Reinigung gemäß Beispiel 1 das Pentapeptid Asp-Ser-Asp-Pro-Arg lieferte.

Das Pentapeptid zeigt ein -78,6° (c=1, H₂O). Die Reinheit wurde in üblicher Weise bei einer Anzahl von pH-Werten durch Papierelektrophorese bestimmt.

Beispiel 4 Herstellung des Hexapeptids Ala-Asp-Ser-Asp-Pro-Arg

Ein weiterer Ansatz des argininierten Harzes (0,20 Millimol) wurde den Verfahren der Beispiele 1-3A unterworfen, wobei jedoch nach Bindung des zweiten Aspartinsäurerestes und Schutzgruppenentfernung eine äquivalente Menge t-BOC-Alanin in üblicher Weise mit Dicyclohexylcarbodiimid gekoppelt wurde.

Dann wurde das Harz wie in Beispiel 1 den Abspaltungs- und Hydrierungs verfahren unterworfen und wie dort gewonnen. So erhielt man 0,026 Millimol Ala-Asp-Ser-Asp-Pro-Arg in 13%iger Ausbeute.

Das gewonnene Peptid wurde in einer Aminosäureanalysevorrichtung untersucht und zeigte ein Aminosäureverhältnis von Ala 0,95, Asp 2,05, Ser 0,80, Pro 0,98 und Arg 1,00.

Beispiel 5

Nach den Syntheseverfahren der Beispiele 1-4 kann das folgende Pentapeptid hergestellt werden:

Herstellung von Asp-Thr-Glu-Ala-Arg

1,6 g (5 mmol) t-BOC-Nitroarginin wurden mit 10 g Chlormethyl- Harz (Copolystyrol-2 %-Divinylbenzol-Perlen, die 0,5 bis 1 meq. Chlormethylgruppen pro Gramm Harz enthielten) in einer Mischung von 1,4 ml (10 mmol) Triethylamin und 100 ml Ethanol 24 Stunden bei 22°C unter Rühren umgesetzt. Das mit Arginin versehene Harz wurde dann gründlich nacheinander mit Essigsäure, absolutem Ethanol, Wasser, das mit zunehmenden Mengen an Ethanol versetzt wurde, Methanol und schließlich Methylenchlorid gewaschen. Daraufhin wurde es gründlich im Vakuum getrocknet. Die Analyse ergab 0,05 mmol Arginin/g Harz. 2,5 g des so hergestellten Harzes wurden in ein Merrifield-Festphasenreaktionsgefäß, das mit Rührer ausgestattet war, gegeben und dann dem folgenden Schutzgruppen-Abspaltungszyklus unterworfen:

(a) Abspaltung der t-BOC-Gruppe mit 10 ml 4N HCl in Dioxan unter 30minütigem Rühren bei 22°C
(b) zwei Wäschen mit 10 ml Dioxan
(c) zwei Wäschen mit 10 ml Methylenchlorid
(d) zwei Wäschen mit 10 ml Chloroform
(e) Neutralisation des Hydrochlorids mit 10 ml Triethylamin/ Chloroform (5 : 95)
(f) zwei Wäschen mit 10 ml Methylenchlorid
(g) zwei Wäschen mit 10 ml Chloroform.

Dann wurde das Harz dem folgenden Synthese-Zyklus unterworfen: Es wurde ein 10facher Überschuß von t-BOC-Alanin (1,25 mmol) in Methylenchloridlösung zugegeben, gefolgt von 258 mg (1,25 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (DDC) und die Mischung wurde dann 2 Stunden bei 22°C geschüttelt. Daraufhin wurde das Harz dreimal mit jeweils 10 ml Dioxan, Chloroform und Methylenchlorid gewaschen.

Das Dipeptid-Harz wurde dann dem obigen Schutzgruppen- Abspaltungszyklus unterworfen und dann mit einem vierfachen Überschuß an t-Boc-β-Benzylglutaminsäure (0,5 mmol), wie oben im Synthesezyklus beschrieben, umgesetzt.

Das Tripeptid-Harz wurde dann dem Schutzgruppen-Abspaltungs zyklus unterworfen und daraufhin mit einem vierfachen Überschuß an t-Boc-Threonin (0,5 mmol), wie oben im Synthese- Zyklus beschrieben, umgesetzt.

Das Tetrapeptid-Harz wurde dann dem Schutzgruppen-Abspaltungs zyklus unterworfen und daraufhin mit einem vierfachen Überschuß an t-Boc-β-Benzylasparaginsäure (0,5 mmol), wie oben im Synthesezyklus beschrieben, umgesetzt. 0,5 g dieses Harzes wurden dann aus dem Reaktionsgefäß entnommen und dem folgenden Abspaltungs-Prozeß unterworfen:

Das Pentapeptid-Harz (0,5 g) wurde in trockener Trifluoressig säure (5 ml) suspendiert und man ließ einen langsamen Strom von wasserfreiem HBr 90 Minuten lang durch die Lösung strömen. Das Harz wurde dann filtriert und zweimal mit 5 ml Trifluoressigsäure gewaschen. Die kombinierten Filtrate wurden im Vakuum konzentriert und überschüssiges HBr wurde durch mehrmaliges Abziehen von Methanol-Wasser- Lösung (1 : 1) vom Peptid entfernt. Das Peptid wurde schließlich im Wasser aufgelöst und lyophilisiert, wodurch man Aspartyl-threonyl-glutamyl-alanyl-ε-nitroarginin erhielt. Die Nitrogruppe wurde dann wie folgt durch Hydrieren in einem Parr-Niederdruckschüttel-Hydrierapparat entfernt: Das durch die Nitrogruppe geschützte Pentapeptid wurde in einer Mischung von Methanol-Essigsäure-Wasser (10 : 1 : 1) in einer Menge von ungefähr 10 bis 20 ml/mg aufgelöst und eine gleiche Menge von 5% Palladium auf BaSO₄ wurde dann zugegeben und daraufhin die Mischung über Nacht bei einem Wasserstoffdruck von ungefähr 0,345 MPa geschüttelt. Daraufhin wurde der Katalysator durch Filtration entfernt und man konzentrierte die Filtrate im Vakuum. Der Peptid-Rückstand wurde an einer Sephadex®-G-25-Säule chromatographiert. Die durch konventionelle Aminosäure- Analyse bestimmte Ausbeute an gereinigtem Pentapeptid betrug ungefähr 20%, bezogen auf das dem Harz einverleibte Arginin. Ein Teil des Produkts wurde mit 5,7N HCl in Wasser hydrolysiert und danach einer Bestimmung im Aminosäure- Analysator unterzogen, wobei das erwartete Aminosäure- Verhältnis festgestellt wurde.

Die Reinheit wurde in üblicher Art und Weise durch Papier- Elektrophorese bei mehreren pH-Werten bestimmt.

Beispiel 6 Herstellung von Metall- und Aminsalzen

A. Das Pentapeptid Asp-Ser-Asp-Pro-Arg wurde wir folgt in sein Natriumsalz umgewandelt:

Eine Lösung aus 0,05 Millimol des Pentapeptids in Wasser wurde vorsichtig mit genau 1 Äquivalent 0,1N NaOH behandelt und das Mononatriumsalz des Peptids durch Lyophilisierung isoliert. Durch Verwendung von genau 2 oder 3 Äquivalenten 0,1N NaOH wurden die entsprechenden Di- bzw. Trinatriumsalze erhalten.

B. Das Pentapeptid Asp-Ser-Asp-Pro-Arg wurde wie folgt in sein Triäthylaminsalz umgewandelt:

Die vorsichtige Zugabe von 1, 2 oder 3-Äquivalenten Triäthylamin zur Lösung des Peptids in Methanol und anschließende vorsichtige Abdampfung des Lösungsmittels lieferte das Mono-, Bis- bzw. Tris triäthylammoniumsalz.

Beispiel 7

Das Pentapeptid Asp-Ser-Asp-Pro-Arg kann wir folgt in sein Salzsäure- Additionssalz umgewandelt werden:

Die vorsichtige Neutralisation einer Lösung des Peptids in Wasser oder Methanol mit genau 1 oder 2 Äquivalenten Salzsäure lieferte das Mono- bzw. Dihydrochloridsalz. Die Salze wurden durch Lyophili sierung einer wäßrigen Lösung oder durch Ausfällung mit Äther aus einer methanolischen Lösung isoliert.

Beispiel 8 Herstellung von Estern

A. 1,0 g des entsprechenden Peptidharzes von Beispiel 5 wurde in 40 ml wasserfreiem Methanol pro g Harz suspendiert, es wurden 50 Millimol Triäthylamin zugefügt und die Mischung 20 Stunden bei 22°C gerührt. Das Harz wurde abfiltriert und die vereinigten Filtrate unter Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst, mit 5 ml Chlorwasserstoff gesättigt und die Lösung 30 Minuten bei 22°C gerührt. Das Produkt wurde durch Zugabe von Äther ausgefällt und lieferte ein Hydrochloridsalz des Peptids. Die schützenden O-Benzyläthergruppen von Ser oder Thr wurden durch Hydrogenolyse unter Verwendung von Pd/BaSO₄ in der in Beispiel 1 zur Entfernung der Nitrogruppe in Nitroargininderivaten beschriebenen Weise entfernt.

Durch Verwendung anderer Alkohole anstelle von Methanol und Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 45-80°C sowie der Reaktionszeit auf 45-90 Stunden erhielt man die entsprechenden Äthyl-, Propyl-, Butyl-, Hexyl-, Octyl- oder Dodecylester.

B. Bei diesem Verfahren wurde eine andere Art von verankernder Bindung zum Binden des Argininrestes verwendet, nämlich die von S. Wang und R. B. Merrifield in J. Am. Chem. Soc., 91, 6488 (1969) beschriebene Harz-Ø-CH₂-CH₂-C(CH₃)₂-OCONHNH₂ Bindung. Weiter wurden bei dem Verfahren N^α-2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl- Schutzgruppen (Bpoc) anstelle von t-BOC für den Schutz der α-Aminogruppe verwendet, da die Bpoc Gruppe bei jedem Zyklus der Synthese mit einer sehr milden Säure unter Bedingungen entfernt werden kann, bei welchen die verankernde Bindung stabil ist. Das Bpoc-N^ε-Nitro-Arg wird an das Harz nach dem DCC Verfahren gebunden, und die Synthese erfolgt im wesentlichen gemäß Beispiel 1-3, wobei jedoch 1% Trifluoressigsäure (TFA)/CH₂Cl₂ für den Schutzgruppen entfernungszyklus zwecks Abspaltung der Bpoc Gruppe verwendet wird. Die endgültige einverleibte Aminosäure wird als N^α-Benzyloxycarbonylderivat (Z) geschützt, so daß die N-end ständige Gruppe während der Abspaltung des geschützten Peptids vom Harz geschützt bleibt. Die Abspaltung erfolgt wie folgt: 500 mg des Peptidharzes wurden in 12 ml 50%iger Trifluoressigsäure in CH₂Cl₂ suspendiert und die Mischung 30 Minuten bei Zimmertemperatur geschüttelt. Das Harz wurde abfiltriert, 2mal mit je 10 ml CH₂Cl₂ gewaschen und die kombinierten Filtrate unter Vakuum konzentriert; so erhielt man Z-β-Benzyl-Asp-O-Benzyl-Ser-β-Benzyl- Asp-Pro-N^ε-Nitro-Arg-NHNH₂ als weißes Pulver.

Eine Lösung aus 0,2 Millimol des geschützten Peptidhydrazids in 1 ml Dimethylformamid wurde auf -20°C abgekühlt, dann wurde 3,35N HCl in Dioxan (0,5 Millimol) zugefügt. Das Bad wurde auf -15°C erwärmt, es wurden 0,03 ml tert.-Butylnitrit zugefügt und die Mischung 10 Minuten bei -10°C stehengelassen, wodurch man das Peptidazidderivat erhielt. Dann wurde überschüssiges Methanol bei -15°C sowie 0,5 Millimol Äthyldiisopropylamin zugefügt und die Mischung 24 Stunden bei 0°C gehalten. Während der ersten 6 Stunden wurden jede Stunde 5 µl der Base zugefügt. Dann wurde das geschützte Peptid durch Eingießen der Mischung in 15 ml kalte, 1%ige Essigsäure ausgefällt und der gesammelte Niederschlag durch Filtrieren gewonnen und gewaschen. Dann wurden die Schutzgruppen auf Benzylbasis durch Hydrogenolyse gemäß Beispiel 1 entfernt und das Produkt durch Verteilungschromatographie auf Sephadex® G-25 oder durch Gegenstromverteilung gereinigt, wodurch man Asp-Ser-Asp-Pro-Arg-OMe erhielt.

Beispiel 9 Herstellung von Amiden

A. Die Produkte der Beispiele 8A und 8B wurden mit einer gesättigten Lösung aus Ammoniak in Methanol 2 Tage bei Zimmertemperatur behandelt; nach Entfernung des Lösungsmittels unter Vakuum erhielt man:

B. Das Peptidazid von Beispiel 8B wurde mit Ammoniak in Dimethyl formamidlösung unter den in Beispiel 8B zur Reaktion mit Methanol beschriebenen Bedingungen umgesetzt. Das geschützte Peptidamid wurde isoliert und die Schutzgruppen in beschriebener Weise entfernt, wodurch man Asp-Ser-Asp-Pro-Arg-NH₂ erhielt.

C. Das geschützte Peptidharzprodukt von Beispiel 3A wurde in einer gesättigten Lösung aus Ammoniak in Methanol suspendiert und die Mischung 2 Tage bei Zimmertemperatur gerührt. Das Harz wurde abfiltriert, mit Methanol gewaschen und die vereinigten Filtrate unter Vakuum konzentriert; so erhielt man t-BOC-Asn-O-Benzyl- Ser-Asn-Pro-N^ε-Nitro-Arg-NH₂-. Die t-BOC Gruppe und die N^ε-Nitrogruppe wurden anschließend durch saure Hydrolyse bzw. Hydrogenolyse wie oben entfernt und lieferten Asn-Ser-Asn-Pro-Arg-NH₂.

Beispiel 10 Herstellung von N-Acylderivaten

N^α-Acylderivate von Asp-Ser-Asp-Pro-Arg wurden hergestellt, indem man die endständige t-BOC-Aminosäure (t-BOC-β-Benzylaspartat) durch die entsprechende N^α-Acylaminosäure (z. B. N^α-Acetyl-β- benzylaspartat) ersetzte, wobei alle anderen Stufen von Schutzgruppen entfernungs-, Synthese- und Abspaltungszyklen gleichblieben.

Beispiel 11 Herstellung von O-Acylderivaten

Zur Herstellung des geschützten Pentapeptidharzmaterials, in welchem die Hydroxylgruppe von Serin ungeschützt ist, wurde die folgende Modifikation des Syntheseverfahrens in fester Phase angewendet:

Das Tripeptidharzmaterial von Beispiel 1 wurde dem Schutzgruppen entfernungszyklus unterworfen und dann mit dem t-BOC-Serin-N- Hydrosuccinimidester reagieren gelassen, wodurch man ein t-BOC- Ser-β-Benzyl-Asp-Pro-N^ε-Nitro-Arg-Harz erhielt, das nach Schutz gruppenentfernung unter üblichen Bedingungen mit p-Nitrophenyl-t- BOC-β-benzylaspartat gekoppelt wurde, wodurch man ein t-BOC- β-Benzyl-Asp-Ser-β-Benzyl-Asp-Pro-N^e-Nitro-Arg-Harz erhielt.

0,5 Millimol dieses geschützten Peptidharzmaterials wurden gründlich mit CHCl₃ und CH₂Cl₂ gewaschen, dann wurden 1,5 Millimol Hexansäure in 1 : 1 Dimethylformamid/CHCl₃ gelöst, sowie 1,5 Millimol Carbonyldiimidazol, in denselben Lösungsmitteln gelöst, zugefügt. Die Mischung wurde bei Zimmertemperatur 2 Stunden in einem Merrifield Reaktionsgefäß geschüttelt und das Peptid dann in oben beschriebener Weise vom Harz abgespalten. Die N^ε-Nitro- Gruppe wurde hydrogenolytisch entfernt und das Peptid wie oben gereinigt, wodurch man Asp-O-Hexanoyl-Ser-Asp-Pro-Arg erhielt.

Claims

1. Tripeptid mit der Aminosäuresequenz Asp-Pro-Arg und seine pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen Salze, Ester, Amide und N-Acylderivate.

2. Tetrapeptid mit der Aminosäuresequenz Ser-Asp-Pro-Arg und seine pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen Salze, Ester, Amide, N-Acyl- und O-Acylderivate.

3. Pentapeptid mit der Aminosäuresequenz Asp-Ser-Asp-Pro- Arg und seine pharmazeutisch annehmbaren, nicht toxischen Salze, Ester, Amide, N-Acyl- O-Acylderivate.

4. Pentapeptid mit der Aminosäuresequenz Asp-Thr-Glu-Ala- Arg und seine pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen Salze, Ester, Amide, N-Acyl- und O-Acyl derivate.

5. Hexapeptid mit der Aminosäuresequenz Ala-Asp-Ser- Asp-Pro-Arg und seine pharmazeutisch annehmbaren, nicht toxischen Salze, Ester, Amide, N-Acyl- und O-Acylderivate.

6. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise

(i) a) eine erste Aminosäure oder ein Peptid, das wahlweise kovalent an einen festen Träger gebunden sein kann und/oder eine geschützte Carboxyl- oder Aminogruppe hat, mit einer zweiten Aminosäure oder einem Peptid mit wahlweise einer geschützten Carboxyl- oder Aminogruppe kondensiert; und
b) nacheinander oder gleichzeitig die Schutzgruppen und/oder den festen Träger vom Produkt aus Stufe a) abspaltet;
(ii) das Produkt aus Stufe a) oder b) wahlweise in ein pharmazeutisch annehmbares, nicht-toxisches Salz, einen Ester, ein Amid, ein N-Acyl- oder O- Acylderivat umwandelt.

7. Verwendung der Verbindungen nach den Ansprüchen 1 bis 5 als Arzneimittel.

8. Verwendung der Verbindungen nach den Ansprüchen 1 bis 5 zum Blockieren, Inhibieren und Verhindern allergischer Reaktionen.