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EP0248362A2 - Verfahren zur Gewinnung aktiver Proteine aus einer biologisch inaktiven Form - Google Patents

Verfahren zur Gewinnung aktiver Proteine aus einer biologisch inaktiven Form Download PDF

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Publication number
EP0248362A2
EP0248362A2 EP87107804A EP87107804A EP0248362A2 EP 0248362 A2 EP0248362 A2 EP 0248362A2 EP 87107804 A EP87107804 A EP 87107804A EP 87107804 A EP87107804 A EP 87107804A EP 0248362 A2 EP0248362 A2 EP 0248362A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
molecular sieve
biologically active
solution
spatial form
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
EP87107804A
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
EP0248362A3 (en
EP0248362B1 (de
Inventor
Reinhard Dr. Hermann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Original Assignee
Behringwerke AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Behringwerke AG filed Critical Behringwerke AG
Priority to AT87107804T priority Critical patent/ATE92075T1/de
Publication of EP0248362A2 publication Critical patent/EP0248362A2/de
Publication of EP0248362A3 publication Critical patent/EP0248362A3/de
Application granted granted Critical
Publication of EP0248362B1 publication Critical patent/EP0248362B1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms

Definitions

  • the invention relates to a method for converting a protein from a conformation in which it is biologically inactive into a biologically active form.
  • this process could also be called renaturation.
  • the polypeptide chain In order to increase the yield of "native" protein, that is to say that with the correct spatial structure and the biological activity of the natural protein, the polypeptide chain must first be unfolded into a "random coil” and any false disulfide bridges that are present must be reduced. This is usually done by incubation in at least 4 mol / l guanidine hydrochloride solution or at least 6 mol / l urea solution, optionally with the addition of a reducing agent such as dithiothreitol (DTT). Subsequently, the formation of the correct protein structure has so far been achieved by dilution (at least 1:40) or dialysis against a "physiological" buffer solution.
  • DTT dithiothreitol
  • the invention therefore relates to a method for producing a biologically active spatial form of a protein from a biologically inactive spatial form, characterized in that the protein is dissolved with the addition of a denaturing agent and thereby converted into the "random coil” form and the solution is passed through a material with molecular sieve properties is passed which contains a liquid medium in which the protein can take a biologically active spatial form, and which material with molecular sieve properties is chosen so that the molecules of the denaturing agent but not the protein molecules can penetrate.
  • the molecular sieve can be located, for example, in a column or a centrifuge basket.
  • the portion of the medium that is not in the pores of the molecular sieve (the "outside volume") is separated.
  • This is advantageously achieved by centrifugation, but can also be brought about, for example, by blowing out by means of a gas or suctioning off by applying a vacuum.
  • the solution containing the "unfolded" protein and denaturant is then applied to the molecular sieve.
  • the penetration of the solution through the molecular sieve material should be caused by a force beyond gravity. This is preferably done by centrifugation, but also by gas pressure or vacuum. If centrifugation is used, the workflow largely corresponds to the known technique of basket or sieve centrifugation.
  • Such a molecular sieve can be one of the materials known for gel filtration which is chemically resistant to the denaturing agent, for example ®Sephadex G-25, DG 6P (®Bio Rad, USA) or "controlled pore glass".
  • the pore size is chosen so that the denaturing agent, but not the protein, can penetrate the matrix.
  • a solution in which the protein takes its active form preferably a buffer for example transferred to a preferably centrifugable column or a centrifuging basket.
  • the solution not in the pores of the matrix (not “in the internal volume”) is preferably separated off by centrifugation at about 300-1000xg.
  • the protein solution containing denaturing agents (volume less than 30% of the gel volume) is then applied. While the molecules of the denaturing solution can be exchanged for the buffer in the inner volume, proteins (molecular weight greater than 6000) remain in the outer volume.
  • the proteins can be thrown quantitatively into a collecting vessel by centrifugation again (2 min, 300-1000 ⁇ g). According to known desalination processes, this can be done by centrifugation in a basket centrifuge. Denaturing agents are then no longer detectable.
  • the volume of the solution obtained corresponds to the volume of the solution applied.
  • the separation of the equilibration medium in the external volume and the acceleration of the exchange of the equilibration medium in the internal volume for the protein solution containing denaturing agents can also be effected by means of gas pressure or vacuum.
  • the method according to the invention enables a protein to be transferred quickly, quantitatively and without dilution, even from large volumes of a denaturing medium, into a medium in which the protein takes an active form and to achieve high yields of active protein.
  • the process is characterized by simplicity, speed and reproducibility. To carry out on existing and conventional equipment and Materials are used.
  • the gel material can be regenerated after use and, for example, guanidine hydrochloride can be recovered.
  • the protein concentration remains unchanged.
  • Denatured proteins are specifically proteins in the non-native state after heat treatment, for example for inactivating infectious material, after acid treatment, for example acid cleavage of genetically obtained fusion proteins, after treatment with structure-destroying agents, for example in the course of cleaning, extraction, or solubilization steps as well as in the inactivation of infectious material or after genetic engineering and the wrong conformation and / or incorrect formation of disulfide bridges that occur.
  • Suitable denaturing agents for the complete unfolding of the protein are, for example, high-molar solutions of guanidinium salts, urea or other chaotropic molecules, optionally in the presence of a reducing agent, for example 50-150 mmol / l dithiothreitol (DTT).
  • concentrations are typically 4-7 mol / l for guanidine salts, 6-8 for urea and 6-8 for isothiocyanate and about 400 ml / l for 2-chloroethanol.
  • the formation of the biologically active (native) structure is brought about by rapid transfer into a buffer which favors the native structure.
  • the speed of the transfer is important for a high yield.
  • the time is in the range of seconds to minutes.
  • Suitable activation buffers are, for example, Phos phat or Tris buffers or buffers known as "good buffers” (Biochem. (1966) 15, 467-477), which are adjusted to the pH of maximum activity or stability of the protein.
  • the denaturing molecules are quickly and quantitatively separated, preferably by centrifugation.
  • the medium in which the protein adopts its biologically active conformation is usually a buffer and has a composition which is advantageous for the stability of the protein (contains, for example, phosphates, sulfates, citrates). It may contain further additives, for example sugar, peptides or proteins to stabilize the native structure or detergents, for example ®Tween 20 or NP40 to prevent adhesion, aggregation and / or solvation, and / or SH reagents or redox Systems such as DTT or glutathione / glutathione disulfide (GSH / GSSG) for setting the optimal redox potential for the formation of correct disulfide bridges.
  • a buffer has a composition which is advantageous for the stability of the protein (contains, for example, phosphates, sulfates, citrates). It may contain further additives, for example sugar, peptides or proteins to stabilize the native structure or detergents, for example ®Tween 20 or NP40 to
  • Reproducible redox conditions are guaranteed by degassing and nitrogen saturation of the buffers.
  • Basket centrifugation in the sense of the invention is any centrifugation technique in any volume range with any equipment in which any macromolecule (in buffer A) is transferred to buffer B by centrifugation through a gel filtration medium equilibrated with buffer B, optionally pre-centrifuged.
  • ®Sephadex G-25 was poured into 15 tubes with a volume of 0.5 ml and 5 each were equilibrated with degassed, nitrogen-saturated PBS without additives or containing 1 mmol / l DTT or 0.02 ml / 100 ml ® Tween 20. The liquid in the external volume was spun off at 700 ⁇ g (5 minutes). One of each of the 5 solutions from GM-CSF (A to E) was applied to each of these 5 tube tubes equilibrated with PBS, with PBS + DTT or Tween.
  • the activity of the guanidine-treated samples reached up to 100% of the initial activity (about 2 ⁇ 107 units (U) / mg).
  • FIG. 1 denotes the column for the activity of the solution of the non-denatured and reactivated GM-CSF and 2 that for the in PBS, 3 that for the in PBS and ®Tween and 4 that for the reactivated in PBS and DTT GM-CSF.
  • a to E each represent a group of activities for one of five GM-CSF preparations with different degrees of glycosylation.
  • the guanidine-treated samples achieved up to 130 times the activity of the initial value. A maximum specific activity of 2 ⁇ 107 units / mg was determined. PBS (column No. 1), PBS + 0.02% ®Tween 20 (column No. 2) or PBS + 0.1 mmol / l dithiothreitol (column No. 3) were used as the reactivation buffer.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Herstellung einer biologisch aktiven räumlichen Form eines Proteins aus einer biolo­gisch inaktiven räumlichen Form beschrieben, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Protein unter Zusatz eines Denaturierungsmittels gelöst und dadurch in die "random coil"-Form übergeführt wird und die Lösung durch ein Material mit Molekularsiebeigenschaften passieren gelas­sen wird, das ein flüssiges Medium enthält, in welchem das Protein eine biologisch aktive räumliche Form annehmen kann, und wobei dieses Material mit Molekularsiebeigen­schaften so gewählt wird, daß die Moleküle des Denaturie­rungsmittels, jedoch nicht die Proteinmoleküle eindringen können. Durch Zentrifugieren kann das Medium im "Außenvo­lumen" des Molekularsiebs entfernt sowie das Passieren der Lösung durch das Molekularsieb beschleunigt werden.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Überführung eines Proteins aus einer Konformation, in der es biologisch inaktiv ist, in eine biologisch aktive Form. Im Falle eines denaturierten natürlichen Proteins könnte dieser Vorgang auch als Renaturierung bezeichnet werden.
    • Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
  • Reinigungs- sowie Sterilisierungsverfahren an Protein­präparaten können zur teilweisen Denaturierung des ein­gesetzten Proteins führen. Bisher war es vor allem aus wirtschaftlichen Erwägungen günstiger, denaturiertes Protein abzutrennen und zu verwerfen. Gentechnisch in Procaryonten hergestelltes Protein liegt weitgehend in biologisch inaktiver Form vor.
  • Um die Ausbeute an "nativem" Protein, das heißt solchem mit korrekter räumlicher Struktur und der biologischen Aktivität des natürlichen Proteins zu erhöhen, müssen die Polypeptidkette zunächst zum "random coil" aufgefaltet und eventuell vorliegende falsche Disulfidbrücken redu­ziert werden. Dies geschieht üblicherweise durch Inkuba­tion in mindestens 4 mol/l Guanidinhydrochloridlösung oder mindestens 6 mol/l Harnstofflösung, gegebenenfalls mit Zusatz eines Reduktionsmittels wie Dithiothreitol (DTT). Anschließend wurde die Ausbildung der korrekten Proteinstruktur bislang durch Verdünnen (mindestens 1:40) oder Dialyse gegen eine "physiologische" Pufferlösung bewirkt.
  • Beide Methoden sind großtechnisch kaum anwendbar. Die Verdünnung ohnehin großer Volumina mit anschließender Rekonzentrierung ist zeitaufwendig, umständlich und teuer. Ähniches gilt auch für die Dialyse großer Volu­mina. Überdies senkt langsames Entfernen von denaturie­rendem Agens die Reaktivierungs-Ausbeute erheblich, weil Nebenreaktionen wie Aggregationen vorzugsweise im Bereich intermediärer Konzentrationen an denaturierendem Agens ablaufen.
    • Beschreibung und Gegenstand der Erfindung
  • Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die Nachteile der Verfahren des Standes der Technik dadurch vermieden werden können, daß aus der das denaturierende Agenz und das Protein enthaltenden Lösung das denaturierende Agenz entfernt wird, indem man die Lösung durch ein Material mit Molekularsieb-Eigenschaften passieren läßt, welches ein Medium enthält, in welchem das Protein seine biolo­gisch aktive Form annimmt, wobei die Porengröße dieses Molekularsieb-Materials so gewählt wird, daß das denaturierende Agenz, jedoch nicht das Protein eindringen kann.
  • Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur Herstellung einer biologisch aktiven räumlichen Form eines Proteins aus einer biologisch inaktiven räumlichen Form, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein unter Zusatz eines Denaturierungsmittels gelöst und dadurch in die "random coil"-Form übergeführt wird und die Lösung durch ein Material mit Molekularsiebeigenschaften passie­ren gelassen wird, das ein flüssiges Medium enthält, in welchem das Protein eine biologisch aktive räumliche Form anneh­menkann, und wobei dieses Material mit Molekularsiebei­genschaften so gewählt wird, daß die Moleküle des Denatu­rierungsmittels, jedoch nicht die Proteinmoleküle ein­dringen können.
  • Das Molekularsieb kann sich beispielsweise in einer Säule oder einem Zentrifugenkorb befinden.
  • Vorzugsweise wird, nachdem das Molekularsieb mit dem Medium äquilibriert wurde, in welchem das Protein eine biologisch aktive Form annimmt, der Teil des Mediums, welcher sich nicht in den Poren des Molekularsiebs befindet (das "Außenvolumen"), abgetrennt. Dies wird vorteilhaft durch Zentrifugation erreicht, kann aber beispielsweise auch durch Ausblasen mittels eines Gases oder Absaugen durch Anlegen eines Vakuums herbeige­führt werden.
  • Dann wird die Lösung, die das "entfaltete" Protein und das Denaturierungsmittel enthält, auf das Molekularsieb aufgetragen. Das Durchdringen der Lösung durch das Molekularsiebmaterial sollte durch eine über die Schwer­kraft hinausgehende Kraft bewirkt werden. Vorzugsweise geschieht dies durch Zentrifugation, aber auch durch Gasdruck oder Vakuum.
    Falls eine Zentrifugation angewandt wird, entspricht der Arbeitsablauf weitgehend der bekannten Technik einer Korb- oder Siebzentrifugation.
  • Ein solches Molekularsieb kann eines der für die Gelfil­tration bekannten Materialien sein, das gegen das Dena­turierungsmittel chemisch resistent ist, beispielsweise ®Sephadex G-25, DG 6P (®Bio Rad, USA) oder "controlled pore glass". Die Porengröße wird so gewählt, daß das Denaturierungsmittel, nicht aber das Protein in die Matrix eindringen kann. Die Ausschlußgröße wird meist bei einem Mr von 6 000 bis 10 000 liegen (Mr=Molekularge­wicht).
  • Es wird mit einer Lösung, in der das Protein seine aktive Form annimmt, vorzugsweise einem Puffer, äquilibriert und zum Beispiel in eine vorzugsweise zentrifugierbare Säu1e oder einen Zentrifugierkorb übergeführt. Die nicht in den Poren der Matrix (nicht "im Innenvolumen") befindliche Lösung wird vorzugsweise durch Zentrifugation bei etwa 300-1000xg abgetrennt. Anschließend wird die Denaturie­rungsmittel enthaltende Proteinlösung (Volumen kleiner als 30 % des Gelvolumens) aufgetragen. Während die Moleküle der Denaturierungslösung gegen den Puffer im Innenvolumen ausgetauscht werden kann, bleiben Proteine (Molekulargewicht größer als 6000) im Außenvolumen. Durch erneute Zentrifugation (2 min, 300-1000×g) können die Proteine quantitativ in ein Auffanggefäß abgeschleudert werden. Dies kann entsprechend bekannter Entsalzungsver­fahren mittels Zentrifugation in einer Korbzentrifuge geschehen. Denaturierungsmittel sind dann nicht mehr nachweisbar. Das Volumen der erhaltenen Lösung entspricht dann dem Volumen der aufgetragenen Lösung.
  • Die Abtrennung des Äquilibrierungsmediums im Außenvolumen als auch die Beschleunigung des Austauschs des Äquili­brierungsmediums im Innenvolumen gegen die Denaturie­rungsmittel enthaltende Proteinlösung kann auch mittels Gasdruck oder Vakuum bewirkt werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, ein Protein auch aus großen Volumina eines Denaturierungsmediums schnell, quantitativ und ohne Verdünnung in ein Medium, in welchem das Protein eine aktive Form annimmt, zu überführen und hohe Ausbeuten an aktivem Protein zu erzielen.
  • Auf die beschriebene Weise kann kommerziell sonst nicht verwertbares Proteinmaterial verwendbar gemacht werden.
  • Das Verfahren zeichnet sich durch Einfachheit, Schnellig­keit und Reproduzierbarkeit aus. Zur Durchführung kann auf vorhandene und konventionelle Apparaturen und Materialien zurückgegriffen werden. Das Gelmaterial kann nach Gebrauch regeneriert und beispielsweise Guanidinhy­drochlorid rückgewonnen werden. Die Proteinkonzentration bleibt unverändert.
  • Denaturierte Proteine sind speziell Proteine in nicht­nativem Zustand nach einer Hitzebehandlung, zum Beispiel zur Inaktivierung von infektiösem Material, nach einer Säurebehandlung, zum Beispiel einer Säurespaltung von gentechnisch erhaltenen Fusionsproteinen, nach einer Behandlung mit strukturzerstörenden Agentien, zum Bei­spiel im Verlauf von Reinigungs-, Extraktions- oder Solubilisierungsschritten sowie bei der Inaktivierung infektiösen Materials oder nach gentechnischer Herstel­lung und dabei auftretender falscher Konformation und/­oder falscher Ausbildung von Disulfidbrücken.
  • Geeignete Denaturierungsmittel zur völligen Auffaltung des Proteins sind zum Beispiel hochmolare Lösungen von Guanidiniumsalzen, Harnstoff oder anderen chaotropen Molekülen, gegebenenfalls in Gegenwart eines Reduktions­mittels, beispielsweise 50-150 mmol/l Dithiothreitol (DTT). Die Konzentrationen betragen üblicherweise und beispielsweise für Guanidinsalze 4-7, für Harnstoff 6-8 und für Isothiocyanat 6-8 mol/l und für 2-Chlor-ethanol etwa 400 ml/l.
  • Die Ausbildung der biologisch aktiven (nativen) Struktur wird herbeigeführt durch schnelle Überführung in einen Puffer, der die native Struktur begünstigt.
  • Die Schnelligkeit der Überführung ist wichtig für eine hohe Ausbeute. Im beschriebenen Verfahren liegt die Zeit im Sekunden- bis Minutenbereich.
  • Geeignete Aktivierungspuffer sind beispielsweise Phos­ phat- oder Trispuffer oder als "Good-buffers" (Biochem. (1966) 15, 467-477) bekannte Puffer, die auf den pH-Wert maximaler Aktivität oder Stabilität des Proteins einge­stellt sind.
  • Die denaturierenden Moleküle werden schnell und quantita­tiv vorzugsweise durch Zentrifugation abgetrennt.
  • Das Medium, in dem das Protein seine biologisch aktive Konformation annimmt, ist meist ein Puffer und weist eine für die Stabilität des Proteins vorteilhafte Zusammenset­zung auf (enthält zum Beispiel Phosphate, Sulfate, Citrate). Es kann als weitere Zusätze enthalten zum Beispiel Zucker, Peptide oder Proteine zur Stabilisierung der nativen Struktur oder Detergentien, zum Beispiel ®Tween 20 oder NP40 zur Verhinderung der Adhäsion, der Aggregation und/oder zur Solvatisierung, und/oder SH-Reagentien oder Redox-Systeme zum Beispiel DTT oder Glutathion/Glutathiondisulfid (GSH/GSSG) zur Einstellung des für die Ausbildung korrekter Disulfidbrücken optima­len Redoxpotentials.
  • Reproduzierbare Redoxbedingungen werden durch Entgasen und Stickstoff-Sättigen der Puffer gewährleistet.
  • Korbzentrifugation im Sinne der Erfindung ist jede Zentrifugationstechnik in jedem Volumenbereich mit jeglicher apparativer Ausrüstung, bei der ein beliebiges Makromolekül (in Puffer A) mittels Zentrifugation durch ein mit Puffer B äquilibriertes, gegebenenfalls vorzen­trifugiertes Gelfiltrationsmedium in Puffer B überführt wird.
    • Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
    • Beispiel 1
  • Denaturierung von aktivem "mouse-GM-colony stimulating factor" (Mu GM-CSF, rekombinant aus Hefe) in Guanidin, und Reaktivierung.
  • Jeweils 3 Proben von je 1 µg einer von 5 Lösungen von GM-CSF 5 verschiedener Glycosylierungsgrade (A bis E) wurden in 40 µl 6 mol/l Guanidin-HCl in phosphatgepuf­ferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2 aufgenommen und die Lösung 60 Minuten bei Raumtemperatur gehalten.
  • ®Sephadex G-25 wurde in 15 Röhrohen mit einem Volumen von 0,5 ml eingefüllt und je 5 mit entgastem, stickstoff­gesättigtem PBS ohne Zusatz oder enthaltend 1 mmol/l DTT oder 0,02 ml/100 ml ® Tween 20 äquilibriert. Die im Außenvolumen befindliche Flüssigkeit wurde bei 700×g (5 Minuten) abgeschleudert. Auf je eines dieser jeweils 5 mit PBS, mit PBS + DTT oder Tween äquilibrierten Röhrohen wurde jeweils eine der 5 Lösungen von GM-CSF (A bis E) aufgebracht.
  • Durch zweiminütige Zentrifugation bei 700 g unmittelbar nach Auftrag der 15 verschiedenen Lösungen auf die 15 Röhrohen erhielt man 15 mal jeweils 40 µl einer guani­dinfreien GM-CSF Präparation.
  • Alle 15 Proben wurden über Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoff aufbewahrt und dann die Aktivität im Knochenmarkstest oder auf einer GM-CSF-abhängigen Zellinie bestimmt.
  • Die Aktivität der guanidin-behandelten Proben erreichte je nach Reaktivierungspuffer bis zu 100 % der Ausgangsaktivität (etwa 2×10⁷ Einheiten (U)/mg). Die Ausbeute an Protein, bestimmt in der SDS-Elektophorese und im Western-Blot war praktisch quantitativ.
  • Die Ergebnisse sind in Figur 1 dargestellt. In diesem Diagramm bezeichnet 1 jeweils die Säule für die Aktivität der Lösung des nicht mit Denaturierungsmittel behandelten und reaktivierten GM-CSF und 2 die für den in PBS, 3 die für den in PBS und ®Tween und 4 die für den in PBS und DTT reaktivierten GM-CSF. A bis E bezeichnen jeweils eine Gruppe der Aktivitäten für eine von fünf GM-CSF-Präpera­tionen mit verschiedenem Ausmaß der Glycosylierung.
    • Beispiel 2
  • Entfaltung in 6 mol/l Guanidin und Aktivierung von aggregiertem rekombinantem Human GM-CSF.
  • 2 Präparationen von durch Säurespaltung eines Fusionspro­teins aus E . coli erhaltenem aggregiertem, lyophilisier­tem Human-GM-CSF (A und B) wurden jeweils in 6 mol/l Guanidin-HCl in PBS gelöst und 60 Minuten bei Raumtempe­ratur inkubiert. Der CSF-Anteil am Gesamtprotein war etwa 20 microgramm/100 microgramm.
  • Die weitere Behandlung wurde wie in Beispiel ausge­führt.
  • Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt.
  • Die guanidin-behandelten Proben erreichten eine bis zu 130fache Aktivität des Ausgangs wertes . Es wurde eine maximale spezifische Aktivität von 2 × 10⁷ Einheiten/mg bestimmt. Als Reaktivierungspuffer wurden PBS (Säulen Nr.1), PBS + 0,02 % ®Tween 20 (Säulen Nr.2) oder PBS + 0,1 mmol/l Dithiothreitol (Säulen Nr.3) verwendet.
    • Beispiel 3
  • Entfaltung in 8 mol/l Harnstoff und Aktivierung von aggregiertem, inaktivem rekombinantem Human-GM-CSF
  • Aggregiertes, lyophilisiertes Human-GM-CSF aus E. coli (3 Proben nach Säurespaltung bezeichnet als A, B und C sowie eine Probe ungespalten bezeichnet als D; CSF-Gehalt etwa 20 µg/100 µg Gesamtprotein) wurde in 8 mol/l Harnstoff in Tris HCl, pH 8,0 gelöst (Proteinkonzentration 1 mg/ml, Probenvolumen je 0,5 ml) und 60 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die weitere Behandlung wurde wie in Beispiel 1 ausgeführt. Als Reaktivierungspuffer wurde PBS (Säulen Nr.1) oder PBS + 0,02 % Tween (Säulen Nr.2), PBS + "low"* GSH (Säulen Nr.4) oder PBS + "high"*GSH (Säulen Nr. 3) nach Säurespaltung verwendet. In allen Fällen wurde aus gänzlich inaktivem Material spezifische Aktivität nahe oder gleich der maximalen spezifischen Aktivität erhalten (Fig. 3).
  • Auch ungespaltenes Fusionsprotein zeigt erhebliche biologische Aktivität (D). Die spezifische Aktivität nach der Reaktivierung wurde zu 1-2×10⁷ Einheiten/mg bestimmt.
    * "low GSH": 25 µM GSH/50 µM GSSG (entspricht extrazellulärem Redoxpotential)
    *"high GSH": 5 mM GSH/0,1 mM GSSG (entspricht intrazellulärem Redoxpotential)
    • Beispiel 4
  • Entfaltung und komplette Reduktion aller Disulfidbrücken von aggregiertem, inaktivem, rekombinantem Human GM-CSF, Rückfaltung und Reoxidation zum biologisch aktiven Material wie in Beispiel 3.
  • Denaturierung und Reduktion in 8 mol/l Harnstoff in Tris HCl, pH 8,0 + 0,15 mol/l Dithiothreitol; Faltung zum biologisch aktiven Produkt in PBS (Säulen Nr.1) oder PBS + 0,1 % Human-Serum Albumin (Säulen Nr.2), PBS + high GSH (Säulen Nr.3) oder PBS + low GSH (Säulen Nr.4) (Fig. 4).

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung einer biologisch aktiven räumlichen Form eines Proteins aus einer biologisch inaktiven räumlichen Form, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein unter Zusatz eines Denaturierungsmittels gelöst und dadurch in die "random coil"-Form überge­führt wird und die Lösung durch ein Material mit Molekularsiebeigenschaften passieren gelassen wird, das ein flüssiges Medium enthält, in welchem das Protein eine biologisch aktive räumliche Form annehmen kann und wobei dieses Material mit Molekularsiebeigenschaf­ten so gewählt wird, daß die Moleküle des Denaturie­rungsmittels, jedoch nicht die Proteinmoleküle ein­dringen können.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der nicht im Innenvolumen des Materials mit Molekular­siebeigenschaften befindliche Teil des flüssigen Mediums, in welchem das Protein eine biologisch aktive räum­liche Form annehmen kann, durch Zentrifugieren, Ausblasen oder Absaugen entfernt wird, bevor die Proteinlösung mit diesem Material in Kontakt gebracht wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Passieren der Flüssigkeit durch Zentrifugieren beschleunigt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Material mit Molekularsiebeigenschaften ein für die Gelfiltration bekanntes Material ist, das gegen das Denaturierungsmittel chemisch resistent ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Material mit Molekularsiebeigenschaften ®Sephadex G-25, ®BioRad DG 6P oder "controlled pore glass" ist.
6. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, daß das flüssige Medium, in welchem das Protein eine biologisch aktive Form annimmt, ein wässriger Puffer ist, der für die Aktivität und Stabilität des Proteins günstige Agenzien, SH-Reagenzien oder Netzmittel enthält.
EP87107804A 1986-06-04 1987-05-29 Verfahren zur Gewinnung aktiver Proteine aus einer biologisch inaktiven Form Expired - Lifetime EP0248362B1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT87107804T ATE92075T1 (de) 1986-06-04 1987-05-29 Verfahren zur gewinnung aktiver proteine aus einer biologisch inaktiven form.

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19863618817 DE3618817A1 (de) 1986-06-04 1986-06-04 Verfahren zur gewinnung aktiver proteine aus einer biologisch inaktiven form
DE3618817 1986-06-04

Publications (3)

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