EA048725B1

EA048725B1 - Коньюгаты антитело-лекарственное средство

Info

Publication number: EA048725B1
Application number: EA202193042
Authority: EA
Inventors: Дилан Брэдли Ингланд; Стив П. Лэнгстон; Хонг Миунг Ли; Литин Ма; Чжань Ши; Степан Вискосил; Цзянин Ван; Хи Су; Ютака Нисимото; Юмико Исии
Original assignee: Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2020-05-08
Publication date: 2024-12-27

Description

Ссылка на перечень последовательности, представленный в электронном виде

Содержимое представленного в электронном виде перечня последовательностей (имя: 3817_053PC03_Seqlisting_ST25; размер: 7104 байта и дата создания: 22 апреля 2020 г.), полностью включено в данный документ посредством ссылки.

Область техники

В данном изобретении представлены конъюгаты антитело-лекарственное средство, содержащие модуляторы STING. Также представлены композиции, содержащие конъюгаты антитело-лекарственное средство. Соединения и композиции применимы для стимуляции иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта.

Уровень техники

Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC), быстрорастущий класс целевых терапевтических средств, представляют собой многообещающий новый подход к повышению селективности и цитотоксической активности лекарственных средств. Эти терапевтические агенты состоят из антитела (или фрагмента антитела), которое может быть связано с полезным лекарственным средством с образованием иммуноконъюгата. Антитело направляет ADC для связывания с клеткой-мишенью. Затем ADC может быть поглощен и освобожден от полезной нагрузки, которая обеспечивает лечение клетки. Поскольку ADC направлен на свою клетку-мишень, побочные эффекты конъюгированных лекарственных средств могут быть ниже, чем те, которые встречаются при систематическом введении одного и того же агента.

Было показано, что адаптерный белок STING (англ.: Stimulator of Interferon Genes; стимулятор генов интерферона) играет важную роль в системе врожденного иммунитета. Активация пути STING запускает иммунный ответ, который приводит к образованию специфических Т-клеток-киллеров, которые уменьшают опухоли и могут обеспечить длительный иммунитет, чтобы опухоли не рецидивировали. Активированный путь STING также способствует противовирусному ответу, производя противовирусные и провоспалительные цитокины, которые борются с вирусом и мобилизуют как врожденную, так и адаптивную иммунные системы, что в конечном итоге приводит к длительному иммунитету против патогенного вируса. Потенциальные терапевтические преимущества усиления как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа делают STING привлекательной мишенью для открытия новых лекарственных средств. Циклические динуклеотиды могут действовать как агонисты STING и проходят клинические испытания. Однако их анионные свойства делают их плохо проницаемыми для мембран, что может ограничивать их способность взаимодействовать со STING внутри клетки, что часто приводит к нежелательному распределению этих соединений в кровотоке.

По-прежнему существует потребность в новых агонистах STING, а также в улучшенных способах их доставки в клетку-мишень.

Сущность изобретения

В первом аспекте данное изобретение предлагает соединение формулы (I):

или его фармацевтически приемлемую соль, где:

а является целым числом от 1 до 20;

b является целым числом от 1 до 20;

m равно 0, 1, 2, 3, или 4;

n равно 0 или 1;

D-NH- представляет собой часть аминозамещенного соединения, где аминозамещенное соединение имеет формулу D-NH2;

каждый R¹ независимо выбран из С₁-С₄-алкила, О-С₁-С₄-алкила и галогена;

R² выбран из С₁-С₄-алкила и -(CH₂CH₂O)_s-CH₃; где s является целым числом от 1 до 10;

R³ и R³ каждый независимо выбран из водорода и С₁-С3-алкила;

L представляет собой расщепляемый линкер; и

Ab представляет собой антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающий фрагмент.

В первом варианте реализации первого аспекта а является целым числом от 1 до 4; b является целым числом от 1 до 10; и m равно 0.

Во втором варианте реализации первого аспекта а является целым числом от 1 до 4; m равно 0; n равно 0; и каждый из R³ и R³ представляет собой водород.

В третьем варианте реализации первого аспекта L представляет собой

- 1 048725

где г представляет собой точку присоединения к атому азота;

* представляет собой точку присоединения к Ab;

t является целым числом от 1 до 10;

W отсутствует или представляет собой саморасщепляющуюся группу;

Z отсутствует или представляет собой пептид из 2-5 аминокислот;

U и U' независимо отсутствуют или являются спейсером; и

Q представляет собой гетеробифункциональную группу;

при условии, что W и Z не отсутствуют одновременно.

В четвертом варианте реализации первого аспекта W представляет собой саморасщепляющуюся группу, выбранную из где

В шестом варианте реализации первого аспекта W представляет собой представляет собой точку присоединения к карбонильной группе; и / представляет собой точку присоединения к Z.

В пятом варианте реализации первого аспекта W выбран из

- 2 048725

В седьмом варианте реализации первого аспекта Z представляет собой пептид, способный к ферментативному расщеплению. В восьмом варианте реализации Z расщепляется катепсином. В девятом варианте реализации Z представляет собой пептид из двух аминокислот, выбранный из Val-Cit, Cit-Val, Val-Ala, Ala-Val, Phe-Lys и Lys-Phe. В десятом варианте реализации первого аспекта Z представляет собой Val-Ala или Ala-Val.

В одиннадцатом варианте реализации первого аспекта U и U' независимо отсутствуют или выбраны из

где ³¹ представляет собой точку присоединения к Z;

* представляет собой точку присоединения к Q;

р является целым числом от 1 до 6;

q является целым числом от 1 до 20;

X представляет собой О или -СН2-; и каждый r независимо равен 0 или 1.

В двенадцатом варианте реализации первого аспекта U' отсутствует, a U

представляет собой

В тринадцатом варианте реализации первого аспекта Q представляет собой гетеробифункциональную группу, которая способна присоединяться к Ab посредством химической или ферментноопосредованной конъюгации. В четырнадцатом варианте реализации Q выбран из

- 3 048725

где А. представляет собой точку присоединения к U или, когда U отсутствует, точку присоединения к Z;

\ и * представляет собой точку присоединения к U' или, когда U' отсутствует, точку присоединения к Ab.

В пятнадцатом варианте реализации первого аспекта данное изобретение относится к соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, где L представляет собой:

и где t равно 1; W отсутствует или представляет собой саморасщепляющуюся группу; и Z отсутствует или представляет собой пептид из 2 аминокислот.

В шестнадцатом варианте реализации первого аспекта данное изобретение относится к соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, где R² представляет собой -СН3 или (CH₂CH₂O)_S-CH3, и s является целым числом от 1 до 10.

В семнадцатом варианте реализации первого аспекта данное изобретение относится к соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, где D-NH2 представляет собой аминозамещенное соединение, которое модулирует активность STING. В восемнадцатом варианте реализации первого аспекта аминозамещенное соединение, которое модулирует активность STING, включает производное гуанина или аденина.

В девятнадцатом варианте реализации аминозамещенное соединение, которое модулирует активность STING, представляет собой соединение формулы (II):

X¹⁰ представляет собой SH или ОН;

X²⁰ представляет собой SH или ОН;

Y^a представляет собой О, S или СН2;

Y^b представляет собой О, S, NH или NR^a, причем R^a представляет собой С1-С₄алкил;

R¹⁰ представляет собой водород, фтор, ОН, NH2, ORb или NHRb;

R²⁰ представляет собой водород или фтор;

R³⁰ представляет собой водород; R⁴⁰ представляет собой водород, фтор, ОН, NH2, ORb или NHRb; или R³⁰ и R⁴⁰ взятые вместе с образованием СН₂О;

R⁵⁰ представляет собой водород или фтор;

Rb представляет собой С1-С6-алкил, галоген(С1-С6)алкил или С₃-С6-циклоалкил;

кольцо А представляет собой необязательно замещенное 5- или 6-членное моноциклическое гетероарильное кольцо, содержащее 1-4 гетероатома, выбранных из N,

- 4 048725

О или S, или необязательно замещенное 9- или 10-членное бициклическое гетероарильное кольцо, содержащее 1-5 гетероатомов, выбранных из N, О, или S; где кольцо А¹⁰ содержит по меньшей мере один атом N в кольце, и где Y^b присоединен к атому углерода кольца А¹⁰; и кольцо В¹⁰ представляет собой необязательно замещенное 9- или 10-членное бициклическое гетероарильное кольцо, содержащее 2-5 гетероатомов, выбранных из N, О или S; причем кольцо В содержит по меньшей мере два атома N в кольце;

при условии, что кольцо А¹⁰ или кольцо В¹⁰ присоединено к карбонильной группе формулы (I) через группу -NH-.

В двадцатом варианте реализации аминозамещенное соединение, которое модулирует активность STING, представляет собой

или его фармацевтически приемлемую соль, где А представляет собой точку присоединения к карбонильной группе формулы (I).

В двадцать первом варианте реализации первого аспекта аминозамещенное соединение, которое модулирует активность STING, представляет собой соединение формулы (III):

или его фармацевтически приемлемую соль, где

X¹⁰ представляет собой SH или ОН;

X²⁰ представляет собой SH или ОН;

Y^c представляет собой О, S или СН₂;

Y^d представляет собой О, S или СН₂;

В¹⁰⁰ представляет собой группу, представленную формулой (В1-А) или формулой (В¹-В):

_R1000

В-А В¹-В

R¹³, R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶ и R¹⁷, каждый независимо, представляет собой атом водорода или заместитель;

R¹⁰⁰⁰ представляет собой водород или связь с карбонильной группой формулы (I);

Y¹¹, Y¹², Y¹³, Y¹⁴, Y¹⁵ и Y¹⁶ каждый независимо представляет собой N или CR^1a, где R^1a представляет собой водород или заместитель;

Z¹¹, Z¹², Z¹³, Z¹⁴, Z¹⁵ и Z¹⁶ каждый независимо представляет собой N или С;

R¹⁰⁵ представляет собой атом водорода или заместитель;

В представляет собой группу, представленную формулой (В²-А) или формулой (В²-В):

- 5 048725

R²³, R²⁴, R²⁵, R²⁶ и R²⁷, каждый независимо, представляет собой атом водорода или заместитель;

R¹⁰⁰ представляет собой водород или связь с карбонильной группой формулы (I);

Y²¹, Y²², Y²³, Y²⁴, Y²⁵ и Y²⁶ каждый независимо представляет собой N или CR^2a, где R^2a представляет собой водород или заместитель;

Z²¹, Z²², Z²³, Z²⁴, Z²⁵ и Z²⁶ каждый независимо представляет собой N или С; и

R²⁰⁵ представляет собой атом водорода или заместитель; где R¹⁰⁵ и R²⁰⁵ каждый независимо присоединен к 2- или 3-положению 5-членного кольца, к которому они присоединены соответственно;

при условии, что:

один из В¹⁰⁰ или В²⁰⁰ присоединен к карбонильной группе формулы (I) через группу -NH-.

В двадцать втором варианте реализации первого аспекта аминозамещенное соединение, которое модулирует активность STING, представляет собой соединение формулы (IIIa),

О, SI I

В представляет собой группу, представленную формулой (В1-А) или формулой (В1-В):

^1000

О HN^

В-А В¹-В

В представляет собой группу, представленную формулой (В2-А) или формулой (В²-В):

R™'

О NH

R²⁰⁵ представляет собой атом водорода или заместитель; где R¹⁰⁵ и R²⁰⁵ каждый независимо присое

- 6 048725 динен к 2- или 3-положению 5-членного кольца, к которому они присоединены соответственно;

при условии, что:

один из В¹⁰⁰ или В²⁰⁰ представляет собой:

где R¹⁸ представляет собой водород или С^алкил; и

R¹⁹ представляет собой атом галогена;

а другой присоединен к карбонильной группе формулы (I) через группу -NH-.

В двадцать третьем варианте реализации первого аспекта аминозамещенное соединение, которое модулирует активность STING, представляет собой:

или его фармацевтически приемлемую соль, бонильной группе формулы (I).

где +представляет собой точку присоединения к карВо втором аспекте данное изобретение предлагает соединение формулы (IV):

а является целым числом от 1 до 20;

b является целым числом от 1 до 20;

k равно 0, 1, 2 или 3;

m равно 0, 1, 2, 3, или 4;

R² выбран из Н, С1-С₄-алкила и -(CH₂CH₂O)_S-CH₃; где s является целым числом от 1 до 10;

R² выбран из водорода и любой боковой цепи встречающейся в природе аминокислоты;

R⁵ выбран из С₁-С₄-алкила и О-С₁-С₄-алкила;

L представляет собой расщепляемый линкер; и

В первом варианте реализации второго аспекта L представляет собой где + представляет собой точку присоединения к карбонильной группе;

W представляет собой саморасщепляющуюся группу;

Z отсутствует или представляет собой пептид из 2-5 аминокислот; и

Q представляет собой гетеробифункциональную группу.

- 7 048725

В третьем аспекте данного изобретения предлагается соединение формулы (V):

D-NH- представляет собой

X представляет собой О или СН2;

f равно целому числу от 1 до 10;

g равно целому числу от 1 до 20;

U и U' независимо отсутствуют или представляют собой спейсер;

Q представляет собой гетеробифункциональную группу; и

В первом варианте реализации третьего аспекта X представляет собой О.

В четвертом аспекте данного изобретения предлагается соединение формулы (VI):

а является целым числом от 1 до 20;

m равно 0, 1, 2, 3, или 4;

n равно 0 или 1;

D-NH- представляет собой часть аминозамещенного соединения, где аминозамещенное соединение имеет формулу D-NH₂;

каждый R¹ независимо выбран из С1-С₄-алкила, О-С1-С₄-алкила и галогена;

R² выбран из С1-С₄-алкила и -(CH₂CH₂O)_S-CH₃; где s является целым числом от 1 до 10;

R³ и R³ каждый независимо выбран из водорода и С1-С₃-алкила;

L представляет собой расщепляемый линкер; и

LP представляет собой липид.

В первом варианте реализации четвертого аспекта липид представляет собой холестерин или фосфолипид. Во втором варианте реализации четвертого аспекта липид представляет собой фосфолипид. В третьем варианте реализации четвертого аспекта фосфолипид выбран из фосфатидилхолина, фосфатидилгицерина, фосфатидной кислоты, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, сфингомиелина, фосфолипида соевых бобов и фосфолипида яичного желтка. В пятом варианте реализации четвертого аспекта фосфолипид представляет собой фосфатидилэтаноламин, где фосфадтидилэтаноламин представляет собой 1,2-дистеароил^п-глицеро-3-фосфорилэтаноламин.

В шестом варианте реализации четвертого аспекта данное изобретение относится к липидному комплексу, содержащему соединение формулы (VI) или его фармацевтически приемлемую соль. В седь

- 8 048725 мом варианте реализации липидный комплекс находится в форме липосомы.

В восьмом варианте реализации четвертого аспекта липидный комплекс дополнительно содержит один или более фосфолипидов. В девятом варианте реализации один или более фосфолипидов выбраны из фосфатидилхолина, фосфатидилгицерина, фосфатидной кислоты, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, сфингомиелина, фосфолипида соевых бобов и фосфолипида яичного желтка. В десятом варианте реализации фосфолипид представляет собой фосфатидилхолин, где фосфатидилхолин представляет собой 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3 -фосфохолин.

В одиннадцатом варианте реализации четвертого аспекта липидный комплекс дополнительно содержит жирный спирт и/или холестерин.

В двенадцатом варианте реализации четвертого аспекта липидный комплекс дополнительно содержит по меньшей мере один ПЭГ илированный липид. В тринадцатом варианте реализации ПЭГ илированный липид выбран из ПЭГилированного фосфолипида и ПЭГилированного диацилглицерина. В четырнадцатом варианте реализации ПЭГилированный липид представляет собой N(карбонилметоксиполиэтиленгликоль 2000)-1,2-дистеароил-sn-глицеро-3 -фосфоэтаноламин.

В пятом аспекте данное изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую соединение или комплекс, описанные в данном документе, или его фармацевтически приемлемую соль и один или более фармацевтически приемлемых носителей.

В шестом аспекте данное изобретение обеспечивает способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту фармацевтически приемлемого количества соединения или комплекса, описанного в данном документе.

В седьмом аспекте данное изобретение обеспечивает способ стимуляции иммунного ответа у субъекта, нуждающегося в этом, способ, включающий введение субъекту фармацевтически приемлемого количества соединения или комплекса, описанного в данном документе.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показано получение конъюгатов агонистов Ab-STING через стохастическую конъюгацию цистеина.

На фиг. 2 показано получение конъюгатов агонистов Ab-STING через конъюгацию трансглутаминазы.

На фиг. 3 показано получение конъюгатов агонистов Ab-STING через конъюгацию трансглутаминазы.

На фиг. 4 показано получение конъюгатов агонистов Ab-STING через конъюгацию сортазы (SEQ ID3 и SEQ ID4)

На фиг. 5 показано высвобождение полезной нагрузки ADC-1 в анализе тритосом.

На фиг. 6 показано высвобождение полезной нагрузки ADC-3 в анализе тритосом.

На фиг. 7 показано высвобождение полезной нагрузки ADC-9 в анализе тритосом.

На фиг. 8 представлена плазменная PK ADC-1 у GCC, экспрессирующих СТ26, несущих мышей Balb/C (доза полезной нагрузки 0,1 мг/кг).

На фиг. 9 представлена плазменная PK ADC-8 у GCC, экспрессирующих СТ26, несущих мышей Balb/C (доза полезной нагрузки 0,055 мг/кг, высвобожденный CDN BLQ).

На фиг. 10 представлена плазменная PK ADC-9 у GCC, экспрессирующих СТ26, несущих мышей Balb/C (доза полезной нагрузки 0,05 мг/кг, высвобожденный CDN BLQ).

На фиг. 11 показана эффективность ADC-1 у GCC, экспрессирующих СТ26, несущих мышей Balb/C (показаны полезные дозы).

На фиг. 12 показана эффективность ADC-5 у GCC, экспрессирующих СТ26, несущих мышей Balb/C (показаны полезные дозы).

На фиг. 13 показана эффективность ADC-8 у GCC, экспрессирующих СТ26, несущих мышей Balb/C (показаны полезные дозы).

На фиг. 14 показана эффективность ADC-9 у GCC, экспрессирующих СТ26, несущих мышей Balb/C (показаны полезные дозы).

Подробное описание

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области, к которой относится это изобретение. Все патенты и публикации, упомянутые в данном документе, полностью включены в качестве ссылки.

Формы единственного числа включают в себя ссылки во множественном числе, если явно не указано иное.

Используемый в данном документе термин или является логическим разделением (т. е. и/или) и не указывает на исключительное разделение, если явно не указано иное, например, с помощью терминов либо, кроме, альтернативно и слов с аналогичным эффектом.

Используемый в данном документе термин около относится к ±10%.

Конъюгаты антитело-лекарственное средство.

- 9 048725

В некоторых вариантах реализации данного изобретения предлагается соединение формулы (I),

а является целым числом от 1 до 20;

b является целым числом от 1 до 20;

m равно 0, 1, 2, 3, или 4;

n равно 0 или 1;

R и R³ каждый независимо выбран из водорода и С₁-С₃-алкила;

L представляет собой расщепляемый линкер; и

В некоторых вариантах реализации данного изобретения предлагается соединение формулы (IV),

а является целым числом от 1 до 20;

b является целым числом от 1 до 20;

k равно 0, 1,2 или 3;

m равно 0, 1, 2, 3, или 4;

R⁴ выбран из водорода и любой боковой цепи встречающейся в природе аминокислоты;

R⁵ выбран из С1-С₄-алкила и О-С₁-С₄-алкила;

L представляет собой расщепляемый линкер; и

В некоторых вариантах реализации данного изобретения предлагается соединение формулы (V):

D-NH представляет собой

- 10 048725

X представляет собой О или СН₂;

f равно целому числу от 1 до 10;

g равно целому числу от 1 до 20;

В соединениях формулы (I) и (IV) аминозамещенное соединение D-NH2 может быть любым аминосодержащим лекарственным средством. В некоторых вариантах реализации D-NH₂ представляет собой иммуномодулятор. Используемый в данном документе термин иммуномодулятор относится к соединению, которое вызывает иммунный ответ у субъекта, нуждающегося в этом. Примеры иммуномодуляторов включают, но не ограничиваются ими, ингибиторы IDO, ингибиторы MEK, модуляторы

STING, антагонисты CCR4, ингибиторы PD-1/PD-L1, агонисты TLR7/8 и т.п. В некоторых вариантах реализации D-NH2 представляет собой модулятор STING. В некоторых вариантах реализации D-NH2 представляет собой производное гуанина или аденина. В некоторых вариантах реализации модулятор STING представляет собой циклический динуклеотид или циклическое динуклеотидоподобное соединение (каждое, CDN) формулы:

где А' и А, каждый независимо, представляют собой нуклеозиды или их синтетические аналоги; и каждый из Q, Q', Q² и Q² независимо представляет собой кислород или серу. В некоторых вариантах реализации Q' и Q² представляют собой серу. Примеры CDN, включая циклические динуклеотиды и циклические динуклеотидоподобные соединения, которые входят в объем данного изобретения, включают, но не ограничиваются ими, описаны в US 9724408, US 10106574, US 9549944, US 9695212, US 9718848, US 9994607, US 10047115, US 20180230178, US 20180064745, US 2018028132, US 20180002369, US 20180186828, US 20190016750, US 20180162899, US 20180369268, US 2018273578, US 20180092937, WO 2017/027646 и WO 2018/100558; a также такие соединения, как c-di-GMP, 2'3'-cGAMP и SB 11285 (Spring Bank Pharmaceuticals).

В некоторых вариантах реализации модулятор STING представляет собой соединение Формулы (II):

X¹⁰ представляет собой -SH или -ОН;

X²⁰ представляет собой -SH или -ОН;

Ya представляет собой -О-, -S- или -СН₂-;

Y^b представляет собой -О-, -S-, -NH- или -NRa-, где Ra представляет собой С1-С₄-алкил;

R¹⁰ представляет собой водород, фтор, -ОН, -NH₂, -OR^b или -NHR^b;

R²⁰ представляет собой водород или фтор;

R³⁰ представляет собой водород; R⁴⁰ представляет собой водород, фтор, -ОН, -NH2, -OR^b или -NHR^b; или R³⁰ и R⁴⁰, взятые вместе, образуют -СН2О-;

- 11 048725

R⁵⁰ представляет собой водород или фтор;

R^b представляет собой С1-С₆-алкил, галогено(С1-С₆)алкил, или С3-С6циклоалкил;

кольцо А¹⁰ представляет собой необязательно замещенное 5- или 6-членное моноциклическое гетероарильное кольцо, содержащее 1-4 гетероатома, выбранные из N, О или S, или необязательно замещенное 9- или 10-членное бициклическое гетероар ильное кольцо, содержащее 1-5 гетероатомов, выбранных из N, О или S; причем кольцо А¹⁰ содержит по меньшей мере один атом N в кольце, и где Y присоединен к атому углерода кольца А¹⁰; и кольцо В¹⁰ представляет собой необязательно замещенное 9- или 10-членное бициклическое гетероарильное кольцо, содержащее 2-5 гетероатомов, выбранных из N, О или S; причем кольцо В¹⁰ содержит по меньшей мере два атома N в кольце.

Как описано в данном документе, кольцо А¹⁰ и кольцо В¹⁰ могут содержать один или более заместителей и, таким образом, могут быть необязательно замещены. Подходящие заместители у ненасыщенного атома углерода гетероарильной группы включают и обычно выбираются из галогена,

-NO₂, -CN, -R⁺, -C(R⁺)=C(R⁺)₂, -OC-R⁺,

- OR⁺, -SR°, -S(O)R°, -SO2R°, -SO3R⁺, -SO2N(R⁺)2, -N(R⁺)2, -NR⁺C(O)R⁺, -NR⁺C(S)R⁺, -NR⁺C(O)N(R⁺)2, -NR⁺C(S)N(R⁺)2, -N(R⁺)C(=NR⁺)-N(R⁺)2, -N(R⁺)C(=NR⁺)-R°, -nr⁺co2r⁺, -NR⁺SO2R^o, -NR⁺SO2N(R⁺)2, -O-C(O)R⁺, -O-CO2R⁺, -OC(O)N(R⁺)2, -C(O)R⁺, -C(S)R°, -CO2R⁺, -C(O)-C(O)R⁺, -C(O)N(R⁺)2, -C(S)N(R⁺)2. -C(O)N(R⁺)-OR⁺,

- C(O)N(R⁺)C(=NR⁺)-N(R⁺)2, -N(R⁺)C(=NR⁺)-N(R⁺)-C(O)R⁺, -C(=NR⁺)-N(R⁺)2,

- C(=NR⁺)-OR⁺, -N(R⁺)-N(R⁺)2, -C(=NR⁺)-N(R⁺)-OR⁺, -C(R°)=N-OR⁺, -P(O)(R⁺)2, -P(O)(OR⁺)2, -O-P(O)-OR⁺, и -P(O)(NR⁺)-N(R⁺)2, где R⁺, независимо, представляет собой водород или необязательно замещенную алифатическую, арильную, гетероарильную, циклоалифатическую или гетероциклильную группу, или два независимых присутствия R⁺ взяты вместе с их промежуточным атомом (ами) с образованием необязательно замещенного 5-7-членного арила, гетероарила, циклоалифатической группы или гетероциклила. В некоторых вариантах реализации R , независимо, представляет собой водород, C1.6 алифатическую группу или С3-6 циклоалифатическую группу. Каждый R° независимо представляет собой необязательно замещенную алифатическую, арильную, гетероарильную, циклоалифатическую или гетероциклильную группу.

Как подробно описано выше, в некоторых вариантах реализации два независимых присутствия R⁺(или любой другой переменной, аналогично определенной в описании и формуле изобретения), взяты вместе с их промежуточным атомом (ами) с образованием моноциклического или бициклического кольца, выбранного из 3-13-членного циклоалифатического кольца, 3-12-членного гетероциклильного, имеющего 1-5 гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода или серы, 6-10-членного арила или 5-10-членного гетероарила, имеющего 1-5 гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода или серы.

В некоторых вариантах реализации модулятор STING представляет собой соединение формулы (IIA):

или его фармацевтически приемлемую соль, где каждый из R¹⁰ и R⁴⁰ независимо представляет собой водород, фтор, -ОН или -OCH2CF3 и кольца А¹⁰ и В¹⁰ имеют значения, указанные для соединения формулы (II), при условии, что кольцо А¹⁰ или кольцо В¹⁰ присоединено к карбонильной группе фрагмента исходной молекулы соединения (I), (IV) или (V) через группу -NH-.

В некоторых вариантах реализации кольцо А¹⁰ представляет собой необязательно замещенное 6членное моноциклическое гетероарильное кольцо, содержащее 1, 2 или 3 атома азота.

В некоторых вариантах реализации кольцо В представляет собой:

где Z¹⁰, Z²⁰, Z³⁰ и Z⁴⁰ каждый независимо представляют собой N или CR²⁰⁰; R²¹⁰ представляет собой водород или С1-С₆-алкил, галогено(С1-С₆)алкил или С₃-С₆циклоалкил;

- 12 048725

R²³⁰ представляет собой водород или -NH2; и

R²⁰⁰, R²²⁰, и R²⁴⁰ каждый независимо представляет собой водород, галоген, -ОН, -NH₂, -CN, С1-С6алкил, галогено(С1-С6)алкил или С₃-С6циклоалкил.

В некоторых вариантах реализации модулятор STING представляет собой:

или его фармацевтически приемлемую соль, где представляет собой точку присоединения к карбонильной группе исходного молекулярного фрагмента.

В некоторых вариантах реализации модулятор STING представляет собой циклический бинуклеотид формулы (X):

или его фармацевтически приемлемую соль, где: частичная структура, представленная формулой (А-1):

является частичной структурой, представленной формулой (Z-A) или формулой (Z-В):

R¹⁰⁵ и R²⁰⁵ каждый независимо представляет собой гидроксигруппу или атом галогена;

Y¹¹, Y¹², Y¹³, Y¹⁴, Y¹⁵ и Y¹⁶ каждый независимо представляет собой N или CR^1a;

R^1a представляет собой атом водорода или заместитель;

В²⁰⁰ представляет собой группу, представленную формулой (В²-А) или формулой (В²-В):

- 13 048725

Y²¹, Y²², Y²³, Y²⁴, Y²⁵ и Y²⁶ каждый независимо представляет собой N или CR^2a;

Z²¹, Z²², Z²³, Z²⁴, Z²⁵ и Z²⁶ каждый независимо представляет собой N или С;

R^2a представляет собой атом водорода или заместитель;

X¹ и X² каждый независимо представляет собой атом кислорода или атом серы; и

Q^1a, Q^2a, Q^3a и Q^4a каждый независимо представляет собой атом кислорода или атом серы; и один из В¹⁰⁰ или В²⁰⁰ присоединен к 5-членному кольцу исходной структуры через группу -NH-.

В другом варианте реализации один из В¹⁰⁰ или В²⁰⁰ представляет собой:

р1Э О +Г где R¹⁸ представляет собой водород или ^^алкил; а другой присоединен к 5-членному кольцу исходной структуры через группу -NH-; и

R¹⁹ представляет собой атом галогена; а другой присоединен к карбонильной группе формулы (I) через группу -NH-.

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает конъюгат антитело-лекарственное средство, как описано в данном документе.

Как описано в данном документе, определенные группы R выбраны из водорода и заместителя. Примеры заместителя включают атом галогена, цианогруппу, нитрогруппу, необязательно замещенную углеводородную группу, необязательно замещенную гетероциклическую группу, ацильную группу, необязательно замещенную аминогруппу, необязательно замещенную карбамоильную группу, необязательно замещенную тиокарбамоильную группу, необязательно замещенную сульфамоильную группу, необязательно замещенную гидроксигруппу, необязательно замещенную сульфанильную (SH) группу и необязательно замещенную силильную группу.

В данном описании примеры углеводородной группы (включая углеводородную группу из необязательно замещенной углеводородной группы) включают ^^алкильную группу, С_2-6алкенильную группу, С_2-6алкинильную группу, С₃.₁₀циклоалкильную группу, С₃.₁₀циклоалкенильную группу, С₆. ₁₄арильную группу и С₇.₁₆ аралкильную группу.

В данном описании примеры необязательно замещенной углеводородной группы включают углеводородную группу, необязательно имеющую заместитель (заместители), выбранный из следующей группы заместителей А, которая включает:

(1) атом галогена, (2) нитрогруппу, (3) цианогруппу, (4) оксогруппу, (5) гидроксигруппу, (6) необязательно галогенированную ^^алкоксигруппу, (7) С₆.₁₄арилокси-группу (например, фенокси, нафтокси), (8) С₇.₁₆аралкилокси группу (например, бензилокси), (9) 5-14-членную ароматическую гетероциклилокси группу (например, пиридилокси), (10) 3-14-членную неароматическую гетероциклилокси группу (например, морфолинилокси, пиперидинилокси), (11) ^^алкилкарбонилокси группу (например, ацетокси, пропаноилокси), (12) С₆.₁₄арилкарбонилокси группу (например, бензоилокси, 1-нафтоилокси, 2-нафтоилокси), (13) ^^алкоксикарбонилокси группу (например, метоксикарбонилокси, этоксикарбонилокси, пропоксикарбонилокси, бутоксикарбонилокси), (14) моно- или ди-^^алкилкарбамоилокси группу (например, метилкарбамоилокси, этилкарбамоилокси, диметилкарбамоилокси, диэтилкарбамоилокси), (15) С₆.₁₄-арилкарбамоилокси группу (например, фенилкарбамоилокси, нафтилкарбамоилокси), (16) 5-14-членную ароматическую гетероциклилкарбонилокси группу (например, никотиноилокси),

- 14 048725 (17) 3-14-членную неароматическую гетероциклилкарбонилокси группу (например, морфолинилкарбонилокси, пиперидинилкарбонилокси), (18) необязательно галогенированную С_1-6алкилсульфонилокси группу (например, метилсульфонилокси, трифторметилсульфонилокси), (19) С_6-1₄арилсульфонилокси группу, необязательно замещенную С1_-6алкильной группой (например, фенилсульфонилокси, толуолсульфонилокси) (20) необязательно галогенированную С1_-6алкилтиогруппу, (21) 5-14-членную ароматическую гетероциклическую группу, (22) 3-14-членную неароматическую гетероциклическую группу, (23) формильную группу, (24) карбоксигруппу, (25) необязательно галогенированную С1_-6алкил-карбонильную группу, (26) С_6-1₄арил-карбонильную группу, (27) 5-14-членную ароматическую гетероциклилкарбонильную группу, (28) 3-14-членную неароматическую гетероциклилкарбонильную группу, (29) С1_-6алкокси-карбонильную группу (30) С_6-1₄арилоксикарбонильную группу (например, фенилоксикарбонил, 1-нафтилоксикарбонил, 2нафтилоксикарбонил), (31) С_7-1₆аралкилоксикарбонильную группу (например, бензилоксикарбонил, фенетилоксикарбонил), (32) карбамоильную группу, (33) тиокарбамоильную группу, (34) моно- или ди-С1_-6алкилкарбамоильную группу, (35) С_6-1₄-арилкарбамоильную группу (например, фенилкарбамоил), (36) 5-14-членную ароматическую гетероциклилкарбамоильную группу (например, пиридилкарбамоил, тиенилкарбамоил), (37) 3-14-членную неароматическую гетероциклилкарбамоильную группу (например, морфолинилкарбамоил, пиперидинилкарбамоил), (38) необязательно галогенированную С1_-6алкилсульфонильную группу, (39) С_6-1₄арилсульфонильную группу, (40) 5-14-членную ароматическую гетероциклилсульфонильную группу (например, пиридилсульфонил, тиенилсульфонил), (41) необязательно галогенированную С1_-6алкилсульфинильную группу, (42) С_6-1₄арилсульфинильную группу (например, фенилсульфинил, 1-нафтилсульфинил, 2нафтилсульфинил), (43) 5-14-членную ароматическую гетероциклилсульфинильную группу (например, пиридилсульфинил, тиенилсульфинил), (44) аминогруппу, (45) моно- или ди-С_1-6алкиламино группу (например, метиламино, этиламино, пропиламино, изопропиламино, бутиламино, диметиламино, диэтиламино, дипропиламино, дибутиламино, К-этил-Кметиламино), (46) моно- или ди-С_6-14ариламиногруппу (например, фениламино), (47) 5-14-членную ароматическую гетероциклиламиногруппу (например, пиридиламино), (48) С_7-1₆аралкиламиногруппу (например, бензиламино), (49) формиламиногруппу, (50) С1_-6алкилкарбониламиногруппу (например, ацетиламино, пропаноиламино, бутаноиламино), (51) (C_1-6 алкил) (С_1-6алкил-арбонил) аминогруппу (например, N-ацетил-К-метиламино), (52) С_6-14арил-карбониламиногруппу (например, фенилкарбониламино, нафтилкарбониламино), (53) С_1-6алкокс-карбониламиногруппу (например, метоксикарбониламино, этоксикарбониламино, пропоксикарбониламино, бутоксикарбониламино, трет-бутоксикарбониламино), (54) С₇-16 аралкилокси-карбониламиногруппу (например, бензилоксикарбониламино), (55) С_1-6алкилсульфониламиногруппу (например, метилсульфониламино, этилсульфониламино), (56) С_6-14арилсульфониламиногруппу, необязательно замещенную С_1-6алкильной группой (например, фенилсульфониламино, толуолсульфониламино), (57) необязательно галогенированную С_1-6алкильную группу, (58) С_2-6алкенильную группу, (59) С_2-6алкинильную группу, (60) С_3-10циклоалкильную группу, (61) С_3-10циклоалкенильную группу, (62) С_6-14арильную группу.

Число вышеупомянутых заместителей в необязательно замещенной углеводородной группе составляет, например, от 1 до 5, обычно от 1 до 3. Когда количество заместителей равно двум или более,

- 15 048725 соответствующие заместители могут быть одинаковыми или разными.

В данном описании примеры гетероциклической группы (включая гетероциклическую группу из необязательно замещенной гетероциклической группы) включают (i) ароматическую гетероциклическую группу, (ii) неароматическую гетероциклическую группу и (iii) 7-10-членную мостиковую гетероциклическую группу, каждая из которых содержит в качестве образующего кольцо атома, помимо атома углерода, от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из атома азота, атома серы и атома кислорода.

В данном описании примеры ароматической гетероциклической группы (включая 5-14-членную ароматическую гетероциклическую группу) включают 5-14-членную (обычно 5-10-членную) ароматическую гетероциклическую группу, содержащую в качестве образующего кольцо атома, помимо атома углерода, от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из атома азота, атома серы и атома кислорода.

Подходящие примеры ароматической гетероциклической группы включают 5- или 6-членные моноциклические ароматические гетероциклические группы, такие как тиенил, фурил, пирролил, имидазолил, пиразолил, тиазолил, изотиазолил, оксазолил, изоксазолил, пиридил, пиразинил, пиримидинил, пиридазинил, 1,2,4-оксадиазолил, 1,3,4-оксадиазолил, 1,2,4-тиадиазолил, 1,3,4-тиадиазолил, триазолил, тетразолил, триазинил и т.п.; а также 8-14-членные конденсированные полициклические (обычно би- или трициклические) ароматические гетероциклические группы, такие как бензотиофенил, бензофуранил, бензимидазолил, бензоксазолил, бензизоксазолил, бензотиазолил, бензизотиазолил, бензотриазолил, имидазопиридинил, тиенопиридинил, фуропиридинил, пирролопиридинил, пиразолопиридинил, оксазолопиридинил, тиазолопиридинил1, имидазопиразинил, имидазопиримидинил, тиенопиримидинил, фуропиримидинил, пирролопиримидинил, пиразолопиримидинил, оксазолопиримидинил, тиазолопиримидинил, пиразолотриазинил, нафтоРД-ЭДтиенил, феноксатиинил, индолил, изоиндолил, Ш-индазолил, пуринил, изохинолил, хинолил, фталазинил, нафтиридинил, хиноксалинил, хиназолинил, циннолинил, карбазолил, β-карболинил, фенантридинил, акридинил, феназинил, фенотиазинил, феноксазинил и тому подобное.

В данном описании примеры неароматической гетероциклической группы (включая 3-14членную неароматическую гетероциклическую группу) включают 3-14-членную (обычно 4-10членную) неароматическую гетероциклическую группу, содержащую в качестве атома, образующего кольцо, помимо атома углерода, от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из атома азота, атома серы и атома кислорода.

Подходящие примеры неароматической гетероциклической группы включают 3-8-членные моноциклические неароматические гетероциклические группы, такие как азиридинил, оксиранил, тииранил, азетидинил, оксетанил, тиетанил, тетрагидротиенил, тетрагидрофуранил, пирролинил, пирролидинил, имидазолинил, имидазолидинил, оксазолинил, оксазолидинил, пиразолинил, пиразолидинил, тиазолинил, тиазолидинил, тетрагидроизотиазолил, тетрагидрооксазолил, тетрагидроизооксазолил пиперидинил, пиперазинил, тетрагидропиримидинил, тетрагидропиридазинил, дигидропиранил, тетрагидропиранил, тетрагидротиопиранил, морфолинил, тиоморфолинил, азепанил, диазепанил, азепинил, оксепанил, азоканил, диазоканил и тому подобное; а также 9-14-членные конденсированные полициклические (обычно би- или трициклические) неароматические гетероциклические группы, такие как дигидробензофуранил, дигидробензимидазолил, дигидробензоксазолил, дигидробензотиазолил, дигидробензизотиазолил, дигидронафто[2,3-b]тиенил, тетрагидроизохинолил, тетрагидрохинолил, 4Н-хинолизинил, индолинил, изоиндолинил, тетрагидротиено[2,3-с]пиридинил, тетрагидробензазепинил, тетрагидрохиноксалинил, тетрагидрофенантридинил, гексагидрофенотиазинил, гексагидрофеноксазинил, тетрагидрофталазинил, тетрагидронафтиридинил, тетрагидрохиназолинил, тетрагидроциннолинил, тетрагидрокарбазолил, тетрагидро-в-карболинил, тетрагидроакридинил, тетрагидрофеназинил, тетрагидротиоксантенил, октагидроизохинолил и тому подобное.

В данном описании подходящие примеры 7-10-членной мостиковой гетероциклической группы включают хинуклидинил и 7-азабицикло[2.2.1]гептанил.

В данном описании примеры азотсодержащей гетероциклической группы включают гетероциклическую группу, содержащую по меньшей мере один атом азота в качестве атома, образующего кольцо.

В данном описании примеры необязательно замещенной гетероциклической группы включают гетероциклическую группу, необязательно имеющую заместитель (заместители), выбранный из вышеупомянутой группы заместителей А.

Число заместителей в необязательно замещенной гетероциклической группе составляет, например, от 1 до 3. Когда количество заместителей равно двум или более, соответствующие заместители могут быть одинаковыми или разными.

В данном описании примеры ацильной группы включают формильную группу, карбоксигруппу, карбамоильную группу, тиокарбамоильную группу, сульфиногруппу, сульфогруппу, сульфамоильную группу и фосфоногруппу, каждая из которых необязательно имеет 1 или 2 заместителя, выбранные из C1₆алкильной группы, С_2-6алкенильной группы, С_3-10циклоалкильной группы, С_3-10циклоалкенильной группы, С_6-14 арильной группы, С_7-16 аралкильной группы, 5-14-членной ароматической гетероциклической

- 16 048725 группы и 3-14-членной неароматической гетероциклической группы, каждая из которых необязательно имеет от 1 до 3 заместителей, выбранных из атома галогена, необязательно галогенированной C.'i₆алкоксигруппы, гидроксигруппы, нитрогруппы, цианогруппы, аминогруппы и карбамоильной группы.

Примеры ацильной группы также включают углеводород-сульфонильную группу, гетероциклилсульфонильную группу, углеводородную сульфинильную группу и гетероциклилсульфинильную группу.

В данном документе углеводород-сульфонильная группа означает связанную с углеводородной группой сульфонильную группу, гетероциклилсульфонильная группа означает связанную с гетероциклической группой сульфонильную группу, углеводород-сульфинильная группа означает связанную с углеводородной группой сульфинильную группу, а гетероциклилсульфинильная группа означает связанную с гетероциклической группой сульфинильную группу.

Подходящие примеры ацильной группы включают формильную группу, карбоксильную группу, Cl_-6алкuл-карбонильную группу, С_2-6алкенил-карбонильную группу (например, кротоноил), С₃10циклоалкил-карбонильную группу (например, циклобутанкарбонил, циклопентанкарбонил, цикло гексанкарбонил, циклогептанкарбонил), С_3-10циклоалкенил-карбонильную группу (например, 2циклогексенкарбонил), С_6-14арил-карбонильную группу, С_7-16 аралкил-карбонильную группу, 5-14членную ароматическую гетероциклилкарбонильную группу, 3-14-членную неароматическую гетероциклилкарбонильную группу, С^алкокси-карбонильную группу, С_6-14арилокси карбонильную группу (например, фенилоксикарбонил, нафтилоксикарбонил), С_7-16аралкилокси-карбонильную группу (например, бензилоксикарбонил, фенетилоксикарбонил), карбамоильная группа, моно- или ди-С_1-6 алкилкарбамоильную группу, моно- или ди-С2-6алкенил-карбамоильную группу (например, диаллилкарбамоил), моно- или ди-С3-10циклоалкил-карбамоильную группу (например, циклопропилкарбамоил), моноили ди-С6-14арил-карбамоильную группу (например, фенилкарбамоил), моно- или ди-С7-16аралкилкарбамоильную группу, 5-14-членную ароматическую гетероциклилкарбамоильную группу (например, пиридилкарбамоил), тиокарбамоильную группу, моно- или ди-С^алкил-тиокарбамоильную группу (например, метилтиокарбамоил, №этил-Ы-метилтиокарбамоил), моно- или ди-С_2-6алкенилтиокарбамоильную группу (например, диаллилтиокарбамоил), моно- или ди-С_3-10циклоалкилтиокарбамоильную группу (например, циклопропилтиокарбамоил, циклогексилтиокарбамоил), моноили ди-С_6-14арил-тиокарбамоильную группу (например, фенилтиокарбамоил), моно- или ди-С_7-16аралкилтиокарбамоильную группу (например, бензилтиокарбамоил, фенэтилтиокарбамоил), 5-14-членную ароматическую гетероциклилтиокарбамоильную группу (например, пиридилтиокарбамоил), сульфиногруппу, С^алкилсульфинильную группу (например, метилсульфинил, этилсульфинил), сульфогруппу, C₁₆алкилсульфонильную группу, С_6-14арилсульфонильную группу, фосфоно группу и моно-или ди-С₁6алкилфосфоно группу (например, диметилфосфоно, диэтилфосфоно, диизопропилфосфоно, дибутилфосфоно).

В данном описании примеры необязательно замещенной аминогруппы включают аминогруппу, необязательно имеющую 1 или 2 заместителя, выбранных из С^алкильной группы, С_2-6алкенильной группы, С_3-10циклоалкильной группы, С_6-14арильной группы, С_7-16аралкильной группы, С^алкилкарбонильной группы, С_6-14арил-карбонильной группы, С_7-16аралкил карбонильной группы, 5-14-членной ароматической гетероциклилкарбонильной группы, 3-14-членной неароматической гетероциклилкарбонильной группы, С^алкокси-карбонильной группы, 5-14-членной ароматической гетероциклической группы, карбамоильной группы, моно- или ди-С_1-6 алкил-карбамоильной группы, моно- или ди-С_7-16аралкил-карбамоильной группы, C_1-6алкuлсульфонильной группы и С_6-14арилсульфонильной группы, каждая из которых необязательно имеет от 1 до 3 заместителей, выбранных из группы заместителей А.

Подходящие примеры необязательно замещенной аминогруппы включают аминогруппу, моно- или ди- (необязательно галогенированный C_1-^km) аминогруппу (например, метиламино, трифторметиламино, диметиламино, этиламино, диэтиламино, пропиламино, дибутиламино), моно- или ди-С2₆алкениламиногруппу (например, диаллиламино), моно- или ди-С_3-10циклоалкиламиногруппу (например, циклопропиламино, циклогексиламино), моно- или ди-С_6-14ариламиногруппу (например, фениламино), моно- или ди-С_7-16 аралкиламиногруппу (например, бензиламино, дибензиламино), моно- или ди- (необязательно галогенированный С^алкилфкарбониламиногруппу (например, ацетиламино, пропиониламино), моно- или ди-С_6-14арил-карбониламиногруппу (например, бензоиламино), моно- или ди-С_7-16 аралкил-карбониламиногруппу (например, бензилкарбониламино), моно- или ди-5-14-членную ароматическую гетероциклилкарбониламиногруппу (например, никотиноиламино, изоникотиноиламино), моноили ди-3-14-членную неароматическую гетероциклилкарбониламиногруппу (например, пиперидинилкарбониламино), моно- или ди^^алкокси-карбониламиногруппу (например, третбутоксикарбониламино), 5-14-членную ароматическую гетероциклиламиногруппу (например, пиридиламино), карбамоиламиногруппу, (моно- или ди-С^алкпл-карбамоил) аминогруппу (например, метилкарбамоиламино), (моно- или ди-С_7-16 аралкил-карбамоил) аминогруппу (например, бензилкарбамоиламино), C_1-6 алкилсульфониламиногруппу (например, метилсульфониламино, этилсульфониламино), С_6-14арилсульфониламиногруппу (например, фенилсульфониламино), (С^алкил)^^ алкил-карбонил) аминогруппу (например, №ацетил-Ы-метиламино) и (С^алкил) (С_6-14 арил-карбонил) аминогруппу (напри

- 17 048725 мер, Н-бензоил-Н-метиламино).

В данном описании примеры необязательно замещенной карбамоильной группы включают карбамоильную группу, необязательно имеющую 1 или 2 заместителя, выбранных из С1_-6алкильной группы, С_2-балкенильной группы, С_3-10циклоалкильной группы, С_6-14арильной группы, С_7-16 аралкильной группы, С_1-6алкил-карбонильной группы, С_6-14арил-карбонильной группы, С_7-16 аралкил-карбонильной группы, 514-членной ароматической гетероциклилкарбонильной группы, 3-14-членной неароматической гетероциклилкарбонильной группы, С_1-6алкокси-карбонильной группы, 5-14-членной ароматической гетероциклической группы, карбамоильной группы, моно-или ди-С_1-6 алкил-карбамоильной группы и моноили ди-С_7-1₆ аралкил-карбамоильной группы, каждая из которых необязательно имеет от 1 до 3 заместителей, выбранных из группы заместителей А.

Подходящие примеры необязательно замещенной карбамоильной группы включают карбамоильную группу, моно- или ди-С1_-6алкил-карбамоильную группу, моно-или ди-С_2-6алкенил-карбамоильную группу (например, диаллилкарбамоил), моно- или ди-С_3-10 циклоалкил-карбамоильную группу (например, циклопропилкарбамоил, циклогексилкарбамоил), моно- или ди-С_6-1₄арил-карбамоильную группу (например, фенилкарбамоил), моно- или ди-С_7-16 аралкил-карбамоильную группу, моно- или ди-C,₆алкил-карбонил-карбамоильную группу (например, ацетилкарбамоил, пропионилкарбамоил), моно- или ди-С_6-14арил-карбонил-карбамоильную группу (например, бензоилкарбамоил) и 5-14- членную ароматическую гетероциклилкарбамоильную группу (например, пиридилкарбамоил).

В данном описании примеры необязательно замещенной тиокарбамоильной группы включают тиокарбамоильную группу, необязательно имеющую 1 или 2 заместителя, выбранных из С_1-6алкильной группы, С_2-6алкенильной группы, С_3-10циклоалкильной группы, С_6-14арильной группы, С_7-16 аралкильной группы, С_1-6алкил-карбонильной группы, С_6-14арил-карбонильной группы, С_7-16 аралкил-карбонильной группы, 5-14-членной ароматической гетероциклилкарбонильной группы, 3-14-членной неароматической гетероциклилкарбонильной группы, С_1-6алкокси-карбонильной группы, 5-14-членной ароматической гетероциклической группы, карбамоильной группы, моно-или ди-С_1-6 алкил-карбамоильной группы и моно- или ди-С_7-16 аралкил-карбамоильной группы, каждая из которых необязательно имеет от 1 до 3 заместителей, выбранных из группы заместителей А.

Подходящие примеры необязательно замещенной тиокарбамоильной группы включают тиокарбамоильную группу, моно- или ди-С_1-6 алкил-тиокарбамоильную группу (например, метилтиокарбамоил, этилтиокарбамоил, диметилтиокарбамоил, диэтилтиокарбамоил, Н-этил-Н-метилтиокарбамоил), моноили ди-С_2-6алкенил-тиокарбамоильную группу (например, диаллилтиокарбамоил), моно- или ди-С₃₁₀циклоалкил-тиокарбамоильную группу(например, циклопропилтиокарбамоил), моно- или ди-С_6-14арилтиокарбамоильную группу (например, фенилтиокарбамоил), моно- или ди-С_7-16 аралкилтиокарбамоильную группу (например, бензилтиокарбамоил, фенэтилтиокарбамоил), моно- или ди-С_1-6алкил-карбонил-тиокарбамоильную группу (например, ацетилтиокарбамоил, пропионилтиокарбамоил), моно- или ди-С_6-14арил-карбонил-тиокарбамоильную группу (например, бензоилтиокарбамоил) и 5-14членную ароматическую гетероциклилтиокарбамоильную группу (например, пиридилтиокарбамоил).

В данном описании примеры необязательно замещенной сульфамоильной группы включают сульфамоильную группу, необязательно имеющую 1 или 2 заместителя, выбранных из С_1-6алкильной группы, С_2-6алкенильной группы, С_3-10циклоалкильной группы, С_6-14арильной группы, С_7-16 аралкильной группы, С_1-6алкил-карбонильной группы, С_6-14арил-карбонильной группы, С_7-16 аралкил-карбонильной группы, 5-14-членной ароматической гетероциклилкарбонильной группы, 3-14-членной неароматической гетероциклилкарбонильной группы, С_1-6алкокси-карбонильной группы, 5-14-членной ароматической гетероциклической группы, карбамоильной группы, моно-или ди-С_1-6 алкил-карбамоильной группы и моно- или ди-С7-16 аралкил-карбамоильной группы, каждая из которых необязательно имеет от 1 до 3 заместителей, выбранных из группы заместителей А

Подходящие примеры необязательно замещенной сульфамоильной группы включают сульфамоильную группу, моно- или ди-С_1-6 алкил-сульфамоильную группу (например, метилсульфамоил, этилсульфамоил, диметилсульфамоил, диэтилсульфамоил, Н-этил-Н-метилсульфамоил), моно- или ди-С₂₆алкенил-сульфамоильную группу (например, диаллилсульфамоил), моно- или ди-С_3-10циклоалкилсульфамоильную группу (например, циклопропилсульфамоил, циклогексилсульфамоил), моно- или диС_6-14арил-сульфамоильную группу (например, фенилсульфамоил), моно- или ди-С_7-16аралкилсульфамоильную группу (например, бензилсульфамоил, фенэтилсульфамоил), моно- или ди-С_1-6алкилкарбонил-сульфамоильную группу (например, ацетилсульфамоил, пропионилсульфамоил), моно- или диС_6-14арил-карбонил-сульфамоильную группу (например, бензоилсульфамоил) и 5-14-членную ароматическую гетероциклилсульфамоильную группу (например, пиридилсульфамоил).

В данном описании примеры необязательно замещенной гидроксигруппы включают гидроксигруппу, необязательно имеющую заместители, выбранные из С_1-6алкильной группы, С_2-6алкенильной группы, С_3-10циклоалкильной группы, С_6-14арильной группы, С_7-16 аралкильной группы, С_1-6алкилкарбонильной группы, С_6-14арил-карбонильной группы, С_7-16 аралкил-карбонильной группы, 5-14членной ароматической гетероциклилкарбонильной группы, 3-14-членной неароматической гетероциклилкарбонильной группы, С_1-6алкокси-карбонильной группы, 5-14-членной ароматической гетероцикли

- 18 048725 ческой группы, карбамоильной группы, моно- или ди-С_1-6 алкил-карбамоильной группы и моно- или диС_7-16 аралкил-карбамоильной группы, С^алкилсульфонильной группы и С₆.₁₄арилсульфонильной группы, каждая из которых необязательно имеет от 1 до 3 заместителей, выбранных из группы заместителей А.

Подходящие примеры необязательно замещенной гидроксигруппы включают гидроксигруппу, C1. ₆алкокси группу, С₂.₆алкенилокси группу (например, аллилокси, 2-бутенилокси, 2-пентенилокси, 3гексенилокси), С₃.₁₀циклоалкилокси группу, (например, циклогексилокси), С₆.₁₄арилокси группу (например, фенокси, нафтилокси), С₇.₁₆ аралкилокси группу (например, бензилокси, фенетилокси), С^алкилкарбонилокси группу (например, ацетилокси, пропионилокси, бутирилокси, изобутирилокси, пивалоилокси), С₆.₁₄арил-карбонилокси (например, бензоилокси), С₇.₁₆ аралкил-карбонилокси (например, бензилкарбонилокси), 5-14-членную ароматическую гетероциклилкарбонилокси группу (например, никотиноилокси), 3-14-членную неароматическую гетероциклилкарбонилокси группу (например, пиперидинилкарбонилокси), С1.₆алкокси-карбонилокси группу (например, трет-бутоксикарбонилокси), 5-14-членную ароматическую гетероциклилокси группу (например, пиридилокси), карбамоилокси группу, С1.₆алкилкарбамоилоксигруппу (например, метилкарбамоилокси), С₇.₁₆ аралкил-карбамоилокси группу (например, бензилкарбамоилокси), С1.₆алкилсульфонилокси группу (например, метилсульфонилокси, этилсульфонилокси) и С₆.₁₄арилсульфонилокси (например, фенилсульфонилокси).

В данном описании примеры необязательно замещенной сульфанильной группы включают сульфанильную группу, необязательно имеющую заместитель, выбранный из С1.₆алкильной группы, С₂. ₆алкенильной группы, С₃.₁₀циклоалкильной группы, С₆.₁₄арильной группы, С₇.₁₆ аралкильной группы, C1. ₆алкилкарбонильной группы, С₆.₁₄арил-карбонильной группы и 5-14-членной ароматической гетероциклической группы, каждая из которых необязательно имеет от 1 до 3 заместителей, выбранных из группы заместителей А и галогенированной сульфанильной группы.

Подходящие примеры необязательно замещенной сульфанильной группы включают сульфанил(SH) группу, С1.₆алкилтио группу, С₂.₆алкенилтио группу (например, аллилтио, 2-бутенилтио, 2пентенилтио, 3-гексенилтио), С₃.₁₀циклоалкилтио группу (например, циклогексилтио), С₆.₁₄арилтио группу (например, фенилтио, нафтилтио), С₇.₁₆ аралкилтио группу (например, бензилтио, фенэтилтио), С1.₆алкил-карбонилтио группу (например, ацетилтио, пропионилтио, бутирилтио, изобутирилтио, пивалоилтио), С₆.₁₄арил-карбонилтио группу (например, бензоилтио), 5-14-членную ароматическую гетероциклилтио группу (например, пиридилтио) и галогенированную тиогруппу (например, пентафтортио).

В данном описании примеры необязательно замещенной силильной группы включают силильную группу, необязательно имеющую от 1 до 3 заместителей, выбранных из С1.₆алкильной группы, С₂. ₆алкенильной группы, С₃.₁₀циклоалкильной группы, С₆.₁₄арильной группы и С₇.₁₆ аралкильной группы, каждая из которых необязательно имеет от 1 до 3 заместителей, выбранных из группы заместителей А. Примеры необязательно замещенной силильной группы включают три-С1.₆ алкилсилильную группу (например, триметилсилил, трет-бутил(диметил)силил).

В некоторых вариантах реализации модулятор STING представляет собой соединение формулы (III):

R¹⁰⁵ и R²⁰⁵ каждый независимо представляет собой гидроксильную группу или атом галогена;

В¹⁰⁰ представляет собой группу, представленную формулой (B1-A) или формулой (В1-В):

- 19 048725

R²³,R²⁴,R²⁵,R²⁶ и R²⁷, каждый независимо, представляет собой атом водорода или заместитель;

γ²¹,γ²²,γ²³,γ²⁴,γ²⁵ и y²⁶ каждый независимо представляет собой N или CR^2a;

Z²¹, Z²², Z²³, Z²⁴, Z²⁵ и Z²⁶ каждый независимо представляет собой N или С; R^2a представляет собой атом водорода или заместитель;

Q¹, Q2, Q3 и Q⁴ каждый независимо представляет собой атом кислорода или атом серы.

при условии, что:

один из В¹⁰⁰ или В²⁰⁰ представляет собой:

R¹³ θ πΎ

Ν'

Ά где R¹⁸ представляет собой водород или С1.₆алкил; и

R¹⁹ представляет собой атом галогена, а другой из В¹⁰⁰ или В²⁰⁰ присоединен к 5-членному кольцу исходной структуры через группу -NH-.

В некоторых вариантах реализации модулятор STING представляет собой соединение формулы (III) или его фармацевтически приемлемую соль, где R²⁰⁵ представляет собой F, а В¹⁰⁰ представляет собой

F θ

С-м

В некоторых вариантах реализации циклический бинуклеотид представляет собой:

Группа L представляет собой расщепляемый линкер. Используемый в данном документе термин линкер относится к любому химическому фрагменту, способному связывать антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающий фрагмент (Ab) с фрагментом, содержащим лекарственное средство, в соединениях формулы (I) и (IV). Линкер может быть разветвленным и может быть замещен от 1 до 20 фрагментами, содержащими лекарственное средство. В некоторых вариантах реализации линкер может быть замещен от 1 до 10 фрагментами, содержащими лекарственное средство. В некоторых вариантах реализации линкер может быть замещен от 1 до 5 фрагментами, содержащими лекарственное средство. В некоторых вариантах реализации линкер может быть замещен одним или двумя фрагментами, содержащими лекарственное средство. В некоторых вариантах реализации линкер может быть замещен одним фрагментом, содержащим лекарственное средство.

Линкер L расщепляем. В некоторых вариантах реализации линкер может быть чувствительным к кислотно-индуцированному расщеплению, фотоиндуцированному расщеплению, ферментативному расщеплению и т.п. в условиях, при которых лекарственное средство и/или антитело могут оставаться ак

- 20 048725 тивными. В некоторых вариантах реализации расщепляемый линкер можно расщеплять ферментативно. В некоторых вариантах реализации расщепляемый линкер может расщепляться протеазой, пептидазой, эстеразой, гликозидазой, фосфодиэстеразой, фосфатазой или липазой. В некоторых вариантах реализации расщепляемый линкер может расщепляться протеазой. Примеры протеаз включают, но не ограничиваются ими, катепсин В, тетрапептид VAGP и т.п. В некоторых вариантах реализации линкер может быть любым из линкеров, раскрытых в публикациях РСТ WO 2018/200812, WO 2018/100558, которые полностью включены посредством ссылки.

В некоторых вариантах реализации L имеет формулу:

где + представляет собой точку присоединения к атому азота; и * представляет собой точку присоединения к Ab.

где:

Чпредставляет собой точку присоединения к атому азота;

* представляет собой точку присоединения к антителу;

Группа W отсутствует или представляет собой саморасщепляющуюся группу. Используемый в данном документе термин саморасщепляющаяся относится к группе, которая подвергается электронному каскаду, приводящему к высвобождению группы, к которой она присоединена. В некоторых вариантах реализации саморасщепляющаяся группа включает одну или более групп, которые могут подвер гаться 1,4-элиминированию, 1,6-элиминированию, 1,8-элиминированию, 1,6-циклизацииэлиминированию, 1,5-циклизации-элиминированию, 1,3-циклизации-элиминированию, внутримолекулярной 5-экзо-триггерной циклизации и/или 6-экзо-триггерной циклизации. В некоторых вариантах реализации саморасщепляющаяся группа может быть любой из тех, что раскрыты в публикациях РСТ WO 2018/200812, WO 2018/100558, которые полностью включены посредством ссылки.

Группа Z отсутствует или представляет собой пептид из 2-5 аминокислот. В некоторых вариантах реализации пептид представляет собой сайт расщепления линкера, тем самым облегчая высвобождение лекарственного средства при воздействии внутриклеточных протеаз, таких как лизосомальные ферменты (Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784). Примеры пептидов, содержащих две аминокислоты, включают, но не ограничиваются ими, аланин-аланин (ala-ala), валин-цитруллин (vc или val-cit), аланинфенилаланин (af или ala-phe); фенилаланин-лизин (fk или phe-lys); фенилаланин-гомолизин (phehomolys); и N-метил-валин-цитруллин (Me-val-cit). Примеры пептидов, содержащих три аминокислоты, включают, но не ограничиваются ими, глицин-валин-цитруллин (gly-val-cit) и глицин-глицин-глицин (gly-gly-gly). Комбинации аминокислот, указанные выше, также могут присутствовать в обратном порядке (т. е. cit-val).

Пептиды по данному изобретению могут содержать природные и/или неприродные аминокислотные остатки. Термин природная аминокислота относится к Ala, Asp, Cys, Glu, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Туг. Неприродные аминокислоты (т.е. аминокислоты, не встречающиеся в природе) включают, в качестве неограничивающего примера, гомосерин, гомоаргинин, цитруллин, фенилглицин, таурин, йодтирозин, селеноцистеин, норлейцин (Me), норвалин (Nva), бета-аланин, L- или D-нафталанин, орнитин (Orn) и т.п. Пептиды могут быть сконструированы и оптимизированы для ферментативного расщепления конкретным ферментом, например, ассоциированной с опухолью протеазой, катепсином В, С и D или протеазой плазмина.

Аминокислоты также включают D-формы природных и неприродных аминокислот. D- обозначает аминокислоту, имеющую D (правовращающую) конфигурацию, в отличие от конфигурации в встречающихся в природе (L-) аминокислотах. Природные и неприродные аминокислоты можно приобрести коммерчески (Sigma Chemical Co., Advanced Chemtech) или синтезировать с использованием способов, известных в данной области.

Группы U и U' независимо отсутствуют или являются спейсером. Используемый в данном документе термин спейсер относится к химическому фрагменту, который служит соединителем. В данном изобретении спейсер может соединять антитело, фрагмент антитела или фрагмент антигена с гетеробифункциональной группой и/или соединять гетеробифункциональную группу с пептидом Z или, когда Z отсутствует, с группой W. Неограничивающие примеры спейсеров включают -NH-, -S-, -О-, NHC(=O)CH2CH2-, -S(=O)2-CH2CH2-, - C(=O)NHNH-, -C(=O)O-, -C(=O)NH-, -CH2-, -СН2СН2-, СН2СН2СН2-, -СН₂=СН₂-, -С=С-, -CH=N-O-, полиэтиленгликоль (ПЭГ),

- 21 048725

В соединениях данного изобретения, когда U присутствует, то может быть разветвленной группой, замещенной от 1 до 10 -C(O)-W-Z- группами. В некоторых вариантах реализации U замещена от 1 до 5 -C(O)-W-Z- группами. В некоторых вариантах реализации U замещена от 1 до 2 -C(O)-W-Z- группами. В некоторых вариантах реализации U замещена 1 -C(O)-W-Z- группой. В некоторых вариантах реализации спейсер может быть любым из спейсеров, раскрытых в публикациях РСТ WO 2018/200812, WO 2018/100558, которые полностью включены посредством ссылки.

Группа Q представляет собой гетеробифункциональную группу. В данном изобретении термин гетеробифункциональная группа относится к химическому фрагменту, который соединяет линкер, частью которого он является, с антителом, фрагментом антитела или антигенсвязывающим фрагментом. См., например, WO 2017/191579. Гетеробифункциональные группы характеризуются наличием разных реакционноспособных групп на обоих концах химического фрагмента. Гетеробифункциональная группа может быть присоединена непосредственно к Ab или, в альтернативном варианте, может соединяться через линкер U'. Присоединение к Ab может осуществляться химическими или ферментативными методами. Химическая конъюгация включает контролируемую реакцию доступных аминокислотных остатков на поверхности антитела с меткой реакции на Q или U'. Примеры химической конъюгации включают, но не ограничиваются ими, связывание лизин-амида, связывание цистеина и связывание с помощью неприродной аминокислоты, введенной с помощью генной инженерии, где неприродные аминокислотные остатки с желаемой реакционной меткой устанавливаются на Ab. При ферментативной конъюгации фермент опосредует связывание линкера с доступным аминокислотным остатком на антителе, фрагменте антитела или антигенсвязывающем фрагменте. Примеры ферментативной конъюгации включают, но не ограничиваются ими, транспептидацию с использованием сортазы, транспептидацию с использованием микробной трансглутаминазы и инженерию N-гликанов. Химическая конъюгация и ферментативная конъюгация также могут использоваться последовательно. Например, ферментативная конъюгация также может быть использована для установки уникальных маркеров реакции на Ab, которые будут использоваться в последующей химической конъюгации. В некоторых вариантах реализации гетеробифункциональная группа может быть любой из тех, что раскрыты в публикациях РСТ WO 2018/200812, WO 2018/100558, которые полностью включены посредством ссылки.

В некоторых вариантах реализации Q выбран из

- 22 048725

О

где ⁴ представляет собой точку присоединения к U или, когда U отсутствует, точку присоединения к Z; и представляет собой точку присоединения к U' или, когда U' отсутствует, точку присоединения к Ab.

В некоторых вариантах реализации данное изобретение относится к соединению формулы (XX):

или его фармацевтически приемлемой соли, где n, m, a, t, D-NH-, R¹, R², R³, R³, W, Z и U имеют значения, указанные в данном документе, и где Q* представляет собой реакционноспособную функциональную группу, способную к конъюгированию с антителом, фрагментом антитела или антигенсвязывающим фрагментом. Примеры подходящих групп Q* включают, но не ограничиваются ими, группы активированных карбоновых кислот, такие как хлорангидрид -C(O)-Cl и ангидриды кислот, галогенацетамид, малеимид, алкин, циклоалкин, такой как циклооктин, оксаноборадиен, норборнен, азид, диарилтетразин, моноарилтетразин, альдегид, кетон, гидроксиламин, винилсульфон и азиридин.В некоторых вариантах реализации реакционноспособная функциональная группа может быть любой из тех, что раскрыты в публикациях РСТ WO 2018/200812, WO 2018/100558, которые полностью включены посредст вом ссылки.

Группа Ab представляет собой антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающий фрагмент. Антитело представляет собой белок, вырабатываемый иммунной системой, который способен распознавать и связываться с конкретным антигеном. Антиген-мишень обычно имеет множество сайтов связывания, также называемых эпитопами, распознаваемых CDR на множестве антител. Каждое антитело, которое специфически связывается с разными эпитопами, имеет разную структуру. Таким образом, один антиген может иметь более одного соответствующего антитела. Термин антитело в данном документе используется в самом широком смысле и, в частности, охватывает моноклональные антитела, однодоменные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность. Антитела могут быть мышиными, человеческими, гуманизированными, химерными или происходить от других видов. (Janeway, С, Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York).

Используемый в данном документе термин антитело также относится к полноразмерной молекуле иммуноглобулина или иммунологически активной части полноразмерной молекулы иммуноглобулина, то есть к молекуле, которая содержит антигенсвязывающий сайт, который иммуноспецифически связывает антиген мишени, представляющие интерес или его часть, такие мишени, включая, но не ограничиваясь ими, раковые клетки или клетки, которые продуцируют аутоиммунные антитела, связанные с аутоиммунным заболеванием. Раскрытый в данном документе иммуноглобулин может быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD и IgA), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса молекулы иммуноглобулина. Иммуноглобулины могут происходить от любого вида. Однако в одном аспекте иммуноглобулин имеет человеческое, мышиное или кроличье происхождение.

- 23 048725

Термин однодоменное антитело, также известный как нанотело, представляет собой фрагмент антитела, состоящий из одного мономерного вариабельного домена антитела с молекулярной массой от около 12 кДа до около 15 кДа. Антитела одного тела могут быть основаны на вариабельных доменах тяжелой цепи или легких цепях. Примеры однодоменных антител включают, но не ограничиваются ими, фрагменты VHH и фрагменты V_NAR. См., например, Harmsen M. M. et al. Applied Microbiology and Biotechnology 77 (1): 13-22.

Фрагменты антител включают часть интактного антитела, обычно его антигенсвязывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab').sub.2 и Fv; диатела; линейные антитела; фрагменты, продуцируемые библиотекой экспрессии Fab, антиидиотипическими (анти-Id) антителами, CDR (определяющей комплементарную область) и эпитоп-связывающими фрагментами любого из вышеперечисленных, которые иммуноспецифически связываются с антигенами раковых клеток, вирусными антигенами или микробными антигенами, одиночные - цепные молекулы антител; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Интактное антитело представляет собой антитело, которое включает антигенсвязывающую вариабельную область, а также константный домен легкой цепи (CL) и константные домены тяжелой цепи, CH1, CH₂ и СН3. Константные домены могут быть константными доменами нативной последовательности (например, константными доменами нативной последовательности человека) или их вариантом аминокислотной последовательности.

Используемый в данном документе термин моноклональное антитело относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, содержащие популяцию, идентичны, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела высокоспецифичны и направлены против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты антигена. В дополнение к их специфичности моноклональные антитела имеют то преимущество, что они могут быть синтезированы без загрязнения другими антителами. Модификатор моноклональное указывает на характер антитела как полученного из по существу гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать как требующий получения антитела каким-либо конкретным методом. Например, моноклональные антитела, которые будут использоваться в соответствии с данным изобретением, могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным Kohler et al (1975) Nature 256: 495, или могут быть получены методами рекомбинантной ДНК (см. патент США № 4816567). Моноклональные антитела также могут быть выделены из библиотек фаговых антител с использованием методик, описанных в Clackson et al (1991) Nature, 352: 624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597; например.

Моноклональные антитела, описанные в данном документе, в частности, включают химерные антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, происходящих от определенного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, а остальная часть цепи (цепей) идентичны или гомологичны соответствующим последовательностям в антителах, происходящих от другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность (патент США № 4816567 и Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855). Представляющие интерес химерные антитела включают приматизированные антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена, полученные от приматов, не являющихся человеком (например, обезьяны Старого Света, обезьяны и т. д.), и последовательности константных областей человека.

Для получения моноклональных антител (MAb) применялись различные методы. Технология гибридом, которая относится к клонированной клеточной линии, которая продуцирует один тип антитела, использует клетки различных видов, включая мышей (мышиных), хомяков, крыс и людей. Другой метод получения MAb использует генную инженерию, включая методы рекомбинантной ДНК. Моноклональные антитела, полученные с помощью этих методов, включают, среди прочего, химерные антитела и гуманизированные антитела. Химерное антитело объединяет кодирующие области ДНК более чем одного типа видов. Например, химерное антитело может быть получено вариабельной областью от мыши и константной областью от человека. Гуманизированное антитело происходит преимущественно от человека, даже если оно содержит нечеловеческие части. Подобно химерному антителу, гуманизированное антитело может содержать полностью человеческую константную область. Но в отличие от химерного антитела вариабельная область может частично происходить от человека. Нечеловеческие синтетические части гуманизированного антитела часто происходят из CDR в мышиных антителах. В любом случае эти области имеют решающее значение для того, чтобы антитело могло распознавать специфический антиген и связываться с ним. Хотя мышиные антитела полезны для диагностики и краткосрочной терапии, их нельзя вводить людям в течение длительного времени без увеличения риска вредного иммуногенного ответа. Этот ответ, называемый человеческим антимышиным антителом (НАМА - англ.: Human Anti-Mouse Antibody), возникает, когда иммунная система человека распознает мышиное антитело как чужеродное и

- 24 048725 атакует его. Реакция НАМА может вызвать токсический шок или даже смерть.

Химерные и гуманизированные антитела снижают вероятность ответа НАМА за счет минимизации нечеловеческих частей вводимых антител. Кроме того, химерные и гуманизированные антитела могут иметь дополнительное преимущество активации вторичных иммунных ответов человека, таких как антителозависимая клеточная цитотоксичность.

Интактное антитело может иметь одну или несколько эффекторных функций, которые относятся к биологическим активностям, присущим Fc-области (Fc-области с нативной последовательностью или Fc-области с вариантами аминокислотной последовательности) антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают связывание Clq; комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание с рецептором Fc; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; подавление рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора; BCR) и т. д.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей интактные антитела можно отнести к разным классам. Существует пять основных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть далее разделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам антител, называются а, дельта, эпсилон, гамма и мю соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

Полезные неиммунореактивные белковые, полипептидные или пептидные антитела включают, помимо прочего, трансферрин, эпидермальные факторы роста (EGF), бомбезин, гастрин, гастринрилизинг пептид, фактор роста тромбоцитов, IL-2, IL-6, трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGF-α и TGF-β, фактор роста коровьей оспы (VGF), инсулин и инсулиноподобные факторы роста I и II, лектины и апопротеин из липопротеинов низкой плотности.

Подходящие поликлональные антитела представляют собой гетерогенные популяции молекул антител, полученных из сывороток иммунизированных животных. Для получения поликлональных антител к представляющему интерес антигену можно использовать различные процедуры, хорошо известные в данной области. Например, для продуцирования поликлональных антител различные домашние животные можно иммунизировать путем инъекции представляющего интерес антигена или его производного, включая, но не ограничиваясь ими, кроликов, мышей, крыс и морских свинок. Различные адъюванты могут использоваться для усиления иммунологического ответа в зависимости от вида хозяина, включая, помимо прочего, адъювант Фрейнда (полный и неполный), минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианины лимфы улитки, динитрофенол и потенциально полезные адъюванты для человека, такие как БЦЖ (бацилла Кальметта-Герена) и corynebacterium parvum. Такие адъюванты также хорошо известны в данной области.

Подходящие моноклональные антитела представляют собой гомогенные популяции антител к определенной антигенной детерминанте (например, антигену раковых клеток, вирусному антигену, микробному антигену, белку, пептиду, углеводу, химическому веществу, нуклеиновой кислоте или их фрагментам). Моноклональное антитело (mAb) к представляющему интерес антигену может быть получено с использованием любой методики, известной в данной области, которая обеспечивает продукцию молекул антитела непрерывными клеточными линиями в культуре. К ним относятся, но не ограничиваются ими, метод гибридомы, первоначально описанный Kohler и Milstein (1975, Nature 256, 495-497), метод гибридомы В-клеток человека (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), и метод EBV-гибридомы (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., стр. 77-96). Такие антитела могут относиться к любому классу иммуноглобулинов, включая IgG, IgM, IgE, IgA и IgD и любой их подкласс. Гибридома, продуцирующая mAb, используемая в этом изобретении, может культивироваться in vitro или in vivo.

Подходящие моноклональные антитела включают, но не ограничиваются ими, человеческие моноклональные антитела, гуманизированные моноклональные антитела, фрагменты антител или химерные моноклональные антитела человека и мыши (или других видов). Человеческие моноклональные антитела могут быть получены любым из многочисленных методов, известных в данной области (например, Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4, 72-79; и Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92, 3-16).

Антитело также может быть биспецифическим антителом. Способы получения биспецифических антител известны в данной области. Традиционное получение полноразмерных биспецифических антител основано на коэкспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, где две цепи имеют разные специфичности (Milstein et al., 1983, Nature 305:537-539). Из-за случайного набора тяжелых и легких цепей иммуноглобулина эти гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь 10 различных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Очистка правильной молекулы, которую обычно проводят с использованием стадий аффинной хроматографии, довольно обременительна, а выход продукта низок. Подобные процедуры раскрыты в WO 93/08829 и в Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659(1991).

- 25 048725

Согласно другому подходу вариабельные домены антител с желаемой специфичностью связывания (сайты объединения антитело-антиген) сливают с последовательностями константных доменов иммуноглобулина. Слияние может происходить с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим, по меньшей мере, часть шарнирной, СН2 и СН3 областей. Первая константная область тяжелой цепи (СН1) может содержать сайт, необходимый для связывания легкой цепи, присутствующий по меньшей мере в одном из слияний. Нуклеиновые кислоты с последовательностями, кодирующими слияния тяжелой цепи иммуноглобулина и, если желательно, легкую цепь иммуноглобулина, вставляют в отдельные векторы экспрессии и котрансфицируют в подходящий организм-хозяин. Это обеспечивает большую гибкость в регулировании взаимных пропорций трех полипептидных фрагментов в вариантах реализации, когда неравные соотношения трех полипептидных цепей, используемых в конструкции, обеспечивают оптимальные выходы. Однако возможно вставить кодирующие последовательности для двух или всех трех полипептидных цепей в один вектор экспрессии, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит к высоким выходам или когда соотношения не имеют особого значения.

Биспецифические антитела могут иметь гибридную тяжелую цепь иммуноглобулина с первой специфичностью связывания в одном плече и пару гибридных тяжелой цепи-легкой цепи иммуноглобулина (обеспечивающую вторую специфичность связывания) в другом плече. Эта асимметричная структура облегчает отделение желаемого биспецифического соединения от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулина, поскольку присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы обеспечивает легкий способ разделения (WO 94/04690; Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121:210; Rodrigues et al., 1993, J. of Immunology 151:6954-6961; Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167; Carter et al., 1995, J. of Hematotherapy 4:463-470; Merchant et al., 1998, Nature Biotechnology 16:677-681. Используя такие методы, биспецифические антитела могут быть получены для конъюгации в качестве ADC при лечении или профилактике заболевания, как определено в данном документе.

Гибридные или бифункциональные антитела могут быть получены либо биологическим путем, то есть методами слияния клеток, либо химическим путем, особенно с помощью сшивающих агентов или реагентов, образующих дисульфидный мостик, и могут включать целые антитела или их фрагменты (ЕР 105360; WO 83/03679; ЕР 217577).

Антитело может быть функционально активным фрагментом, производным или аналогом антитела, которое иммуноспецифически связывается с антигенами раковых клеток, вирусными антигенами или микробными антигенами или другими антителами, связанными с опухолевыми клетками или матрицей. В этом отношении функционально активный означает, что фрагмент, производное или аналог способен вызывать анти-антиидиотипические антитела, которые распознают тот же антиген, что и антитело, из которого получен фрагмент, производное или аналог. В частности, в примерном варианте осуществления антигенность идиотипа молекулы иммуноглобулина может быть усилена делецией последовательностей каркаса и CDR, которые являются С-концевыми по отношению к последовательности CDR, которая специфически распознает антиген. Чтобы определить, какие последовательности CDR связывают антиген, синтетические пептиды, содержащие последовательности CDR, можно использовать в анализах связывания с антигеном любым методом анализа связывания, известным в данной области (например, анализ ядра BIA) (см., например, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md.; Kabat E et al., 1980, J. of Immunology 125 (3):961-969).

Другие полезные антитела включают фрагменты антител, такие как, но не ограничиваясь ими, фрагменты F(ab')2, которые содержат вариабельную область, константную область легкой цепи и домен СН1 тяжелой цепи, которые могут быть получены путем расщепления пепсином молекулы антитела и фрагменты Fab, которые могут быть получены путем восстановления дисульфидных мостиков фрагментов F(ab')2. Другими полезными антителами являются димеры тяжелых и легких цепей антител или любые их минимальные фрагменты, такие как Fv или одноцепочечные антитела (SCA) (например, как описано в патенте США № 4946778; Bird, 1988, Science 242:423- 42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; and Ward et al., (1989) Nature 334:544-54), или любую другую молекулу с такой же специфичностью, что и антитело.

Кроме того, рекомбинантные антитела, такие как химерные и гуманизированные моноклональные антитела, содержащие как человеческие, так и нечеловеческие части, которые могут быть получены с использованием стандартных методов рекомбинантной ДНК, являются полезными антителами. Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой разные части происходят от разных видов животных, например, имеющих вариабельную область, полученную из константных областей мышиного моноклонального и человеческого иммуноглобулина. (См., например, Cabilly et al., патент США № 4816567; и Boss et al., патент США № 4816397). Гуманизированные антитела представляют собой молекулы антител из нечеловеческих видов, имеющих одну или несколько определяющих комплементарность областей (CDR) из нечеловеческих видов и каркасную область из молекулы иммуноглобулина человека. (См., например, Queen, патент США № 5585089). Такие химерные и гуманизированные моноклональные антитела могут быть получены методами рекомбинантной ДНК, известными в данной области,

- 26 048725 например, с использованием способов, описанных в WO 87/02671; ЕР 184187; ЕР 171496; ЕР 173494; WO 86/01533; Патент США № 4816567; ЕР 12023; Berter et al., 1988, Science 240: 1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Cancer. Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314:446-449; и Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214; U.S. Pat. No. 5,225,539; Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; и Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060.

Полностью человеческие антитела можно получить с использованием трансгенных мышей, которые неспособны экспрессировать гены тяжелой и легкой цепей эндогенного иммуноглобулина, но которые могут экспрессировать гены тяжелой и легкой цепей человека. Трансгенных мышей иммунизируют обычным способом выбранным антигеном, например, всем полипептидом по изобретению или его частью. Моноклональные антитела, направленные против антигена, можно получить с использованием общепринятой гибридомной технологии. Трансгены человеческого иммуноглобулина, содержащиеся в трансгенных мышах, перестраиваются во время дифференцировки В-клеток, а затем претерпевают переключение классов и соматические мутации. Таким образом, используя такой метод, можно получить терапевтически полезные антитела IgG, IgA, IgM и IgE. Для обзора этой технологии получения человеческих антител см. Lonberg and Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Для подробного обсуждения этой технологии производства человеческих антител и человеческих моноклональных антител и протоколов получения таких антител. См., например, патент США No. №5625126; 5633425; 5569825; 5661016; 5545806. Другие человеческие антитела можно получить коммерчески, например, от Abgenix, Inc. (Фримонт, Калифорния) и Genpharm (Сан-Хосе, Калифорния).

Полностью человеческие антитела, распознающие выбранный эпитоп, можно получить с использованием метода, называемого управляемый отбор. В этом подходе выбранное моноклональное антитело нечеловеческого происхождения, например мышиное антитело, используется для выбора полностью человеческого антитела, распознающего тот же эпитоп. (Jespers et al. (1994) Biotechnology 12:899-903). Человеческие антитела также могут быть получены с использованием различных методов, известных в данной области, включая библиотеки фагового дисплея (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)).

Антитело может быть слитым белком антитела или его функционально активным фрагментом, например, в котором антитело слито посредством ковалентной связи (например, пептидной связи) либо на N-конце, либо на С-конце с аминокислотной последовательностью другого белка (или его части, например, по меньшей мере, 10, 20 или 50 аминокислотной части белка), которая не является антителом. Антитело или его фрагмент могут быть ковалентно связаны с другим белком на N-конце константного домена.

Антитела включают аналоги и производные, которые также модифицированы, то есть ковалентным присоединением любого типа молекулы, при условии, что такое ковалентное присоединение позволяет антителу сохранять свою антигенсвязывающую иммуноспецифичность. Например, но не в качестве ограничения, производные и аналоги антител включают те, которые были дополнительно модифицированы, например, гликозилированием, ацетилированием, пегилированием, фосфорилированием, амидированием, дериватизацией известными защитными/блокирующими группами, протеолитическим расщеплением, присоединением к единице клеточного антитела или другому белку и т. д. Любая из многочисленных химических модификаций может быть проведена известными методами, включая, но не ограничиваясь ими, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез в присутствии туникамицина и т. д. Кроме того, аналог или производное могут содержать одну или более неприродных аминокислот.

Антитела в конъюгатах антитело-лекарственное средство включают антитела, имеющие модификации (например, замены, делеции или добавления) в аминокислотных остатках, которые взаимодействуют с рецепторами Fc. В частности, антитела включают антитела, имеющие модификации аминокислотных остатков, идентифицированных как участвующие во взаимодействии между доменом анти-Fc и рецептором FcRn (см., например, WO 97/34631). Иммуноспецифические антитела к антигену раковых клеток можно получить коммерчески, например, от Genentech (Сан-Франциско, Калифорния) или получить любым способом, известным специалисту в данной области, таким как, например, химический синтез или методы рекомбинантной экспрессии. Нуклеотидная последовательность, кодирующая антитела, иммуноспецифические к антигену раковых клеток, может быть получена, например, из базы данных GenBank или подобной базы данных, литературных публикаций или путем рутинного клонирования и секвенирования.

Антитело ADC может быть моноклональным антителом, например, мышиным моноклональным антителом, химерным антителом или гуманизированным антителом. Антитело может быть фрагментом антитела, например, фрагментом Fab.

Известные антитела для лечения или профилактики рака могут быть конъюгированы как ADC. Иммуноспецифические антитела к антигену раковых клеток можно получить коммерчески или получить любым способом, известным специалисту в данной области, таким как, например, методы рекомбинант

- 27 048725 ной экспрессии. Нуклеотидная последовательность, кодирующая антитела, иммуноспецифические к антигену раковых клеток, может быть получена, например, из базы данных GenBank или подобной базы данных, литературных публикаций или путем рутинного клонирования и секвенирования. Примеры антител, доступных для лечения рака, включают, но не ограничиваются ими, гуманизированное моноклональное антитело против HER2 для лечения пациентов с метастатическим раком молочной железы; RITUXAN.RTM. (ритуксимаб; Genentech), которое представляет собой химерное моноклональное антитело против CD20 для лечения пациентов с неходжкинской лимфомой; OvaRex (AltaRex Corporation, MA), которое представляет собой мышиное антитело для лечения рака яичников; Panorex (Glaxo Wellcome, NC), который представляет собой мышиное антитело IgG 2a для лечения колоректального рака; Цетуксимаб Эрбитукс (Imclone Systems Inc., Нью-Йорк), который представляет собой химерное антитело против EGFR IgG для лечения злокачественных опухолей с положительным эпидермальным фактором роста, таких как рак головы и шеи; Витаксин (Medlmmune, Inc., MD), который представляет собой гуманизированное антитело для лечения саркомы; Campath I/H (лейкозит, Массачусетс), который представляет собой гуманизированное антитело IgG 1 для лечения хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL); Smart MI95 (Protein Design Labs, Inc., Калифорния), которое представляет собой гуманизированное антитело IgG к CD33 для лечения острого миелоидного лейкоза (AML); LymphoCide (Immunomedics, Inc., NJ), который представляет собой гуманизированное антитело IgG к CD22 для лечения неходжкинской лимфомы; Smart ID10 (Protein Design Labs, Inc., Калифорния), которое представляет собой гуманизированное антитело против HLA-DR для лечения неходжкинской лимфомы; Онколим (Techniclone, Inc., Калифорния), который представляет собой мышиное антитело против HLA-Dr10, меченное радиоактивной меткой, для лечения неходжкинской лимфомы; Allomune (BioTransplant, Калифорния), которое представляет собой гуманизированное mAb против CD2 для лечения болезни Ходжкина или неходжкинской лимфомы; Авастин (Genentech, Inc., Калифорния), который представляет собой гуманизированное антитело против VEGF для лечения рака легких и колоректального рака; Эпратузамаб (Immunomedics, Inc., Нью-Джерси и Амджен, Калифорния), который представляет собой антитело против CD22 для лечения неходжкинской лимфомы; и CEAcide (Immunomedics, NJ), который представляет собой гуманизированное антитело против СЕА для лечения колоректального рака.

Другие антитела, полезные при лечении рака, включают, но не ограничиваются ими, антитела против следующих антигенов: СА125 (яичники), СА15-3 (карциномы), СА19-9 (карциномы), L6 (карциномы), Lewis Y (карциномы), Lewis X (карциномы), альфа-фетопротеин (карциномы), СА 242 (колоректальный), плацентарная щелочная фосфатаза (карциномы), простатоспецифический антиген (простата), кислая фосфатаза простаты (простата), эпидермальный фактор роста (карциномы), MAGE-1 (карциномы), MAGE-2 (карциномы), MAGE-3 (карциномы), MAGE-4 (карциномы), рецептор против трансферрина (карциномы), р97 (меланома), MUC1-KLH (рак груди), СЕА (колоректальный), gp100 (меланома), MART1 (меланома), PSA (простата), рецептор IL-2 (Т-клеточный лейкоз и лимфомы), CD20 (неходжкинская лимфома), CD52 (лейкемия), CD33 (лейкемия), CD22 (лимфома), хорионический гонадотропин человека (карцинома), CD38 (множественная миелома), CD40 (лимфома), муцин (карциномы), Р21 (карциномы), MPG (меланома) и онкогенный продукт Neu (карциномы). Некоторые специфические полезные антитела включают, но не ограничиваются ими, mAb BR96 (Trail, PA, et al., Science (1993) 261, 212-215), BR64 (Trail, PA, et al. Cancer Research (1997) 57, 100-105, mAb против антигена CD40, такие как mAb S2C6 (Francisco, JA, et al. Cancer Res. (2000) 60:3225-3231), mAb против антигена CD70, такие как mAb 1F6, и mAb против антигена CD30, такие как АС10 (Bowen, MA, et al. (1993) J. Immunol., 151:5896-5906; Wahl et al., 2002 Cancer Res. 62 (13):3736-42). Могут быть использованы многие другие интернализующие антитела, которые связываются с опухолевыми антигенами, и они были рассмотрены (Franke, A. E., et al Cancer Biother Radiopharm. (2000) 15:459-76; Murray, J. L., (2000) Semin Oncol., 27:64-70; Breitling, F., и Dubel, S., Recombinant Antibodies, John Wiley, and Sons, New York, 1998).

Антитела, которые связываются с антигенами, связанными с антигенпрезентирующими клетками, такими как CD40, OX40L, эндоглин, DEC-205, 4-1BBL, CD36, CD36, CD204, MARCO, DC-SIGN, CLEC9A, CLEC5A, дектин 2, CLEC10A, CD206, CD64, CD32A, CD1A, HVEM, CD32B, PD-L1, BDCA-2, XCR-1 и CCR2 также могут быть конъюгированы как ADC.

Известные антитела для лечения или профилактики аутоимунных расстройств могут быть конъюгированы как ADC. Аутоиммунные расстройства включают системную красную волчанку (SLE), ревматоидный артрит, синдром Шегрена, иммунную тромбоцитопению и рассеянный склероз. Иммуноспецифические антитела к антигену клетки, ответственной за продукцию аутоиммунных антител, можно получить любым способом, известным специалисту в данной области, таким как, например, химический синтез или методы рекомбинантной экспрессии. SLE характеризуется сверхэкспрессией генов цитокинов интерферона-альфа (IFN-альфа) (Bennett et al (2003) Jour. Exp. Med. 197:711-723). Интерфероны типа 1 (IFN-.альфа./.бета.) играют важную роль в патогенезе волчанки (Santiago-Raber (2003) Jour. Exp. Med. 197:777-788). Нокаутные мыши (-IFN-.альфа./.бета.) показали значительно сниженные аутоантитела к эритроцитам, эритробластоз, гемолитическую анемию, аутоантитела к ДНК, заболевание почек и смертность. Эти результаты дают основания предполагать, что IFN типа 1 опосредуют мышиную волчанку и что снижение их активности у человека может быть полезным. Анти-IFN Ab, конъюгированные с бис

- 28 048725

1,8-нафталимидными составляющими лекарственного средства, могут быть эффективными терапевтическими агентами против SLE и других аутоиммунных заболеваний.

В другом варианте реализации полезные антитела в ADC являются иммуноспецифическими для лечения аутоиммунных заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, антиядерные антитела; антидцДНК; анти-оцДНК, антитела к кардиолипину IgM, IgG; антифосфолипидные антитела IgM, IgG; антитело к SM; антитело к митохондриям; антитела к щитовидной железе; микросомальные антитела; антитело к тироглобулину; анти-SCL-70; анти-Jo; анти-U1RNP; анти-La/SSB; анти-SSA; анти-SSB; антитело к перитальным клеткам; антигистоны; анти-РНП; C-ANCA; P-ANCA; антицентромера; анти-фибрилларин и антитело к GBM.

Антитела ADC могут связываться как с рецептором, так и с рецепторным комплексом, экспрессируемым на активированном лимфоците. Рецептор или рецепторный комплекс может содержать член суперсемейства генов иммуноглобулинов, член суперсемейства рецепторов TNF, интегрин, рецептор цитокинов, рецептор хемокинов, основной белок гистосовместимости, лектин или белок контроля комплемента. Неограничивающими примерами подходящих членов суперсемейства иммуноглобулинов являются CD2, CD3, CD4, CD8, CD 19, CD22, CD28, CD79, CD90, CD 152/CTLA-4, PD-1 и ICOS. Неограничивающими примерами подходящих членов суперсемейства рецепторов TNF являются CD27, CD40, CD95/Fas, CD134/OX40, CD137/4-1BB, TNF-R1, TNFR-2, RANK, TACI, ВСМА, остеопротегерин, Apo2/TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4 и АРО-3. Неограничивающими примерами подходящих интегринов являются CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD29, CD41, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD 103 и CD 104. Неограничивающими примерами подходящих лектинов являются лектины С-типа, S-типа и I-типа.

Используемый в данном документе термин вирусный антиген включает, но не ограничивается ими, любой вирусный пептид, полипептидный белок (например, gp120 ВИЧ, nef ВИЧ, гликопротеин F RSV, нейраминидазу вируса гриппа, гемагглютинин вируса гриппа, HTLV tax, гликопротеин вируса простого герпеса (например, Gb, Gc, Gd и Ge) и поверхностный антиген гепатита В), который способен вызывать иммунный ответ. Используемый в данном документе термин микробный антиген включает, но не ограничивается ими, любой микробный пептид, полипептид, белок, сахарид, полисахарид или липидную молекулу (например, бактериальный, грибковый, патогенные простейшие или полипептид дрожжей, включая, например, LPS и капсульный полисахарид 5/8), который способен вызывать иммунный ответ.

Иммуноспецифические антитела к вирусному или микробному антигену могут быть получены коммерчески, например, от BD Biosciences (Сан-Франциско, Калифорния), Chemicon International, Inc. (Темекула, Калифорния) или Vector Laboratories, Inc. (Бурлингейм, Калифорния) или производятся любым способом, известным специалисту в данной области, таким как, например, химический синтез или методы рекомбинантной экспрессии. Нуклеотидная последовательность, кодирующая антитела, которые являются иммуноспецифическими в отношении вирусного или микробного антигена, может быть получена, например, из базы данных GenBank или подобной базы данных, литературных публикаций или путем обычного клонирования и секвенирования.

В некоторых вариантах реализации полезные антитела в данных ADC представляют собой антитела, которые лечат или предотвращают вирусную или микробную инфекцию в соответствии с раскрытыми в данном документе способами. Примеры антител, доступных для лечения вирусной инфекции или микробной инфекции, включают, но не ограничиваются ими, SYNAGIS (Medlmmune, Inc., MD), которое представляет собой моноклональное антитело против гуманизированного респираторно-синцитиального вируса (RSV), пригодное для лечения пациентов с инфекцией RSV; PRO542 (Progenies), которое представляет собой гибридное антитело CD4, используемое для лечения ВИЧ-инфекции; ОСТАВИР (Protein Design Labs, Inc., Калифорния), который представляет собой человеческое антитело, полезное для лечения вируса гепатита В; ПРОТОВИР (Protein Design Labs, Inc., Калифорния), который представляет собой гуманизированное антитело IgG, применимое для лечения цитомегаловируса (CMV); и антитела против ЛПС.

- 29 048725

Другие антитела, полезные в ADC для лечения инфекционных заболеваний, включают, но не ограничиваются ими, антитела против антигенов из патогенных штаммов бактерий (Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenas, Klebsiella rhinoscleromotis, Staphylococcus aureus, Vibrio colerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter (Vibrio) fetus, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Edwardsiella tarda, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Treponema carateneum, Borrelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, Mycobacterium tuberculosis, Pneumocystis carinii, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugumushi, Chlamydia spp.); патогенных грибов (Coccidioides immitis, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum); простейших (Entomoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Trichomonas tenas, Trichomonas hominis, Trichomonas vaginalis, Tryoanosoma gambiense, Trypanosoma rhodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Pneumocystis pneumonia, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malaria); или гельминтов (Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides, Trichinella spiralis, Strongyloides stercoralis, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, и анкилостом).

Другие антитела, используемые в ADC для лечения вирусного заболевания, включают, но не ограничиваются ими, антитела против антигенов патогенных вирусов, в том числе в качестве примеров, но не в качестве ограничения:

Poxviridae, Herpesviridae,

Herpes Simplex virus 1, Herpes Simplex virus 2, Adenoviridae, Papovaviridae, Enteroviridae, Picornaviridae, Parvoviridae, Reoviridae, Retroviridae, вирусы гриппа, вирусы парагриппа, эпидемический паротит, корь, респираторно-синцитиальный вирус, краснуха, Arboviridae, Rhabdoviridae, Arenaviridae, вирус гепатита А, вирус гепатита В, вирус гепатита С, вирус гепатита Е, вирус гепатита не-А/не-В, Rhinoviridae, Coronaviridae, Rotoviridae и вирус иммунодефицита человека.

Термин вариант аминокислотной последовательности относится к полипептидам, имеющим аминокислотные последовательности, которые в некоторой степени отличаются от полипептида с нативной последовательностью. Обычно варианты аминокислотной последовательности будут обладать по меньшей мере около 70% идентичностью последовательности по меньшей мере с одним рецепторсвязывающим доменом нативного антитела или по меньшей мере с одним лигандсвязывающим доменом нативного рецептора, и обычно они будут по меньшей мере около 80%, более типично, по меньшей мере, около 90% гомологичны по последовательности таким доменам связывания рецептора или лиганда. Варианты аминокислотной последовательности содержат замены, делеции и/или вставки в определенных положениях в аминокислотной последовательности нативной аминокислотной последовательности. Аминокислоты обозначают условными названиями, однобуквенным и трехбуквенным кодами.

Идентичность последовательностей определяется как процент остатков в варианте аминокислотной последовательности, которые идентичны после выравнивания последовательностей и введения пробелов, если необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательностей. Способы и компьютерные программы для выравнивания хорошо известны в данной области. Одной из таких компьютерных программ является Align 2, созданная Genentech, Inc., которая была подана вместе с пользовательской документацией в Бюро регистрации авторских прав США, Вашингтон, округ Колумбия, 20559, 10 декабря 1991 г.

Термины рецептор Fc или FcR используются для описания рецептора, который связывается с областью Fc антитела. Иллюстративный FcR представляет собой человеческий FcR с нативной последовательностью. Более того, FcR может быть таким, который связывает антитело IgG (гамма-рецептор) и включает рецепторы Fc.гамма.RI, Fc.гамма.RII и Fc.гамма. Подклассы RIII, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов. Рецепторы Fc.гамма.RII включают Fc.гамма.RIIA (активирующий рецептор) и Fc.гамма.RIIB (ингибирующий рецептор), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, которые отличаются главным образом их цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор

- 30 048725

Fc.raMMa.RIIA содержит иммунорецепторный мотив активации на основе тирозина (ITAM) в своем цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор Fc.гaммa.RIIB содержит иммунорецепторный мотив ингибирования на основе тирозина (ITIM) в своем цитоплазматическом домене. (См. обзор М. in Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). Обзор по FcR представлен в Ravetch и Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Другие FcR, включая те, которые будут идентифицированы в будущем, охватываются в данном документе термином FcR. Термин также включает неонатальный рецептор FcRn, который отвечает за передачу материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)).

Комплемент-зависимая цитотоксичность или КЗЦ относится к способности молекулы лизировать мишень в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антителом) в комплексе с родственным антигеном. Для оценки активации комплемента анализ КЗЦ, например, как описано в GazzanoSantoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996), может быть выполнен.

Нативные антитела обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины около 150 000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как количество дисульфидных связей варьируется между тяжелыми цепями разных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет симметрично расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (VL) и константный домен на другом конце. Константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Считается, что определенные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи.

Термин вариабельный относится к тому факту, что определенные части вариабельных доменов сильно различаются по последовательности среди антител и используются для связывания и специфичности каждого конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако вариабельность неравномерно распределена по вариабельным доменам антител. Она сконцентрирована в трех сегментах, называемых гипервариабельными областями, как в легкой цепи, так и в вариабельных доменах тяжелой цепи. Более высококонсервативные участки вариабельных доменов называются каркасными областями (FR). Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, в основном имеющих конфигурацию β-листа, соединенных тремя гипервариабельными участками, которые образуют петли, соединяющие и в некоторых случаях образующие часть структуры β-листа.

Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости с помощью FR и вместе с гипервариабельными областями из другой цепи вносят вклад в формирование антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.). Константные домены не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но обладают различными эффекторными функциями, такими как участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ).

Термин гипервариабельная область при использовании в данном документе относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Гипервариабельная область обычно содержит аминокислотные остатки из определяющей комплементарность области или CDR (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al выше) и/или эти остатки из гипервариабельной петли (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia и Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196:901-917). Остатки каркасной области или FR представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельной области, как определено в данном документе.

Расщепление антител папаином дает два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых Fab''-фрагментами, каждый с одним антигенсвязывающим сайтом, и остаточный Fc''-фрагмент, название которого отражает его способность легко кристаллизоваться. Обработка пепсином дает фрагмент F(ab')2, который имеет два антигенсвязывающих сайта и все еще способен перекрестно связывать антиген.

Fv представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный сайт распознавания антигена и связывания антигена. Эта область состоит из димера одной тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в тесной нековалентной связи. Именно в этой конфигурации три гипервариабельные области каждого вариабельного домена взаимодействуют для определения антигенсвязывающего сайта на поверхности димера VH-VL. В совокупности шесть гипервариабельных областей придают антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако даже один вариабельный домен (или

- 31 048725 половина Fv, содержащая только три гипервариабельные области, специфичные для антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с более низкой аффинностью, чем весь сайт связывания.

Фрагмент Fab также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab добавлением нескольких остатков на карбокси-конце домена СН1 тяжелой цепи, включая один или несколько цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH представляет обозначение в данном документе для Fab', в котором остаток (остатки) цистеина константных доменов несут по меньшей мере одну свободную тиольную группу.

Фрагменты антитела F(ab')2 первоначально были продуцированы как пары фрагментов Fab', между которыми расположены шарнирные цистеины. Также известны другие химические связывания фрагментов антител.

Легкие цепи антител любого вида позвоночных можно отнести к одному из двух четко различающихся типов, называемых каппа и лямбда, на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов.

Фрагменты антител одноцепочечный Fv или scFv содержат домены VH и VL антитела, причем эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Полипептид Fv может дополнительно содержать полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет scFv формировать желаемую структуру для связывания антигена. Для обзора scFv см. Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). Фрагменты scFv антитела против ErbB2 описаны в WO 93/16185; патент США №5 571 894; и 5 587 458.

Термин диатела относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, причем эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в той же полипептидной цепи (VH-VL). При использовании линкера, который слишком короткий для образования пары между двумя доменами в одной цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта. Диатела описаны более полно, например, в ЕР 404097; WO 93/11161; и Hollinger et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. США 90:6444-6448.

Гуманизированные формы нечеловеческих антител (например, грызунов) представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. Гуманизация представляет собой метод передачи информации о связывании мышиного антигена на неиммуногенный акцептор человеческого антитела, результатом которого стали многие терапевтически полезные лекарства. Метод гуманизации обычно начинается с переноса всех шести определяющих комплементарность областей (CDR) мыши на каркас человеческого антитела (Jones et al, (1986) Nature 321:522-525). Эти антитела с привитыми CDR обычно не сохраняют свою первоначальную аффинность к связыванию антигена, и фактически аффинность часто сильно нарушена. Помимо CDR, для поддержания надлежащей конформации CDR также должны быть включены выбранные остатки каркасной области нечеловеческого антитела (Chothia et al (1989) Nature 342:877). Было показано, что перенос ключевых мышиных каркасных остатков на человеческий акцептор для поддержки структурной конформации привитых CDR восстанавливает связывание антигена и сродство (Riechmann et al., (1992) J. Mol. Biol. 224, 487-499; Foote and Winter, (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499; Presta et al., (1993) J. Immunol. 151, 2623-2632; Werther et al., (1996) J. Immunol. Methods 157:4986-4995; и Presta et al (2001) Thromb. Haemost. 85:379-389). По большей части гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентные антитела), в которых остатки гипервариабельной области реципиента заменены остатками гипервариабельной области не относящегося к человеку вида (донорское антитело), такого как мышь, крыса, кролик или отличный от человека примат, имеющий желаемую специфичность, аффинность и способность. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменяются соответствующими остатками нечеловеческого происхождения. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которых нет в антителе-реципиенте или в антителедоноре. Эти модификации сделаны для дальнейшего улучшения характеристик антител. В целом, гуманизированное антитело будет включать практически все по меньшей мере из одного, а обычно из двух вариабельных доменов, в которых все или практически все гипервариабельные петли соответствуют петлям нечеловеческого иммуноглобулина, и все или практически все FR являются последовательностями человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело необязательно также будет включать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, иммуноглобулина человека. Для получения дополнительных сведений см. патент США. №. 6407213; Jones et al (1986) Nature, 321:522-525; Riechmann et al (1988) Nature 332:323-329; and Presta, (1992) Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596.

Родительское антитело представляет собой антитело, содержащее аминокислотную последовательность, в которой один или более аминокислотных остатков заменены одним или более остатками цистеина. Родительское антитело может содержать последовательность природного или дикого типа. Родительское антитело может иметь ранее существовавшие модификации аминокислотной последовательности (такие как добавления, делеции и/или замены) по сравнению с другими нативными, дикими типами или модифицированными формами антитела. Родительское антитело направлено против интере

- 32 048725 сующего антигена-мишени. Также предусмотрены антитела, направленные против неполипептидных антигенов (таких как ассоциированные с опухолью гликолипидные антигены; см. патент США № 5091178).

Изолированное антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано и отделено и/или выделено из компонента его естественного окружения. Загрязняющие компоненты его естественной окружающей среды представляют собой материалы, которые могут мешать диагностическому или терапевтическому использованию антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В конкретных вариантах реализации антитело будет очищено (1) до более чем 95% по массе антитела, как определено методом Лоури, или до более чем 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием газофазного белкового секвенатора или (3) до гомогенности с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием кумасси синего или окрашивания серебром. Выделенное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, поскольку по крайней мере один компонент естественного окружения антитела не будет присутствовать. Однако обычно выделенное антитело получают по меньшей мере с помощью одной стадии очистки.

Антитело, которое связывает молекулярную мишень или интересующий антиген, способно связывать этот антиген с достаточной аффинностью, так что антитело может быть использовано для нацеливания на клетку, экспрессирующую антиген.

Термины лечить или лечение относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам, цель которых состоит в том, чтобы предотвратить или замедлить (уменьшить) нежелательное физиологическое изменение или нарушение, такое как развитие или распространение рака. Для целей данного изобретения полезные или желаемые клинические результаты включают, но не ограничиваются ими, облегчение симптомов, уменьшение степени заболевания, стабилизацию (т.е. не ухудшение) состояния заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, улучшение или временное ослабление болезненного состояния и ремиссии (частичной или полной), обнаруживаемой или необнаружимой. Лечение также может означать увеличение продолжительности жизни по сравнению с ожидаемой выживаемостью при отсутствии лечения. Те, кто нуждается в лечении, включают тех, кто уже имеет состояние или расстройство, а также тех, кто склонен к состоянию или расстройству, или тех, у которых состояние или расстройство необходимо предотвратить.

Фаговый дисплей представляет собой метод, с помощью которого вариантные полипептиды отображаются в виде слитых белков с белком оболочки на поверхности частиц фага, например нитчатого фага. Одно из преимуществ фагового дисплея заключается в том, что большие библиотеки рандомизированных вариантов белков могут быть быстро и эффективно отсортированы по тем последовательностям, которые связываются с целевой молекулой с высоким сродством. Отображение библиотек пептидов и белков на фаге использовалось для скрининга миллионов полипептидов на предмет тех, которые обладают специфическими связывающими свойствами. Методы поливалентного фагового дисплея использовались для отображения небольших случайных пептидов и небольших белков, обычно посредством слияния с PIII или PVIII нитчатого фага. Wells и Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol., 3:355-362 (1992), и цитируемые там ссылки. При моновалентном фаговом дисплее библиотека белков или пептидов сливается с белком оболочки фага или его частью и экспрессируется на низких уровнях в присутствии белка дикого типа. Эффекты авидности снижаются по сравнению с поливалентным фагом, так что сортировка осуществляется на основе внутренней аффинности лиганда, и используются фагмидные векторы, которые упрощают манипуляции с ДНК. Lowman and Wells, Methods: A companion to Methods in Enzymology, 3:2050216 (1991). Фаговый дисплей включает методы получения антителоподобных молекул (Janeway, С, Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, p 627628).

Фагмида представляет собой плазмидный вектор, имеющий бактериальную природу репликации, например Co1E1, и копию межгенной области бактериофага. Фагмида может использоваться на любом известном бактериофаге, включая нитчатый бактериофаг и лямбдоидный бактериофаг. Плазмида также обычно будет содержать селектируемый маркер устойчивости к антибиотикам. Сегменты ДНК, клонированные в эти векторы, можно размножать как плазмиды. Когда клетки, несущие эти векторы, снабжены всеми генами, необходимыми для продуцирования фаговых частиц, режим репликации плазмиды изменяется на репликацию по методу катящегося круга для создания копий одной цепи плазмидной ДНК и упаковки фаговых частиц. Фагмида может образовывать инфекционные или неинфекционные фаговые частицы. Этот термин включает фагмиды, которые содержат ген белка оболочки фага или его фрагмент, связанный с геном гетерологичного полипептида в виде слияния генов, так что гетерологичный полипептид отображается на поверхности фаговой частицы. Описанные в данном документе соединения могут быть в форме фармацевтически или фармацевтически приемлемых солей. В некоторых вариантах реализации такие соли получают из неорганических или органических кислот или оснований. Обзор подходящих солей см., например, Berge et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19 and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., A. Gennaro (ed.), Lippincott Williams & Wilkins (2000).

- 33 048725

В данном изобретении группа Ab (т.е. антитела, фрагменты антител и/или фрагменты антигена) может быть конъюгирована с более чем одной составляющей, содержащей лекарственное средство. В некоторых вариантах реализации Ab можно конъюгировать с 1-20 фрагментами, содержащими лекарственное средство. В некоторых вариантах реализации Ab можно конъюгировать с 1-10 фрагментами, содержащими лекарственное средство. В некоторых вариантах реализации Ab может быть сопряжен с 1-5 фрагментами, содержащими лекарственное средство. В некоторых вариантах реализации Ab может быть сопряжен с 1 или 2 фрагментами, содержащими лекарственное средство. В некоторых вариантах реализации Ab может быть сопряжен с одной группой, содержащей лекарственное средство.

Описанные в данном документе соединения могут быть в форме фармацевтически или фармацевтически приемлемых солей. В некоторых вариантах реализации такие соли получают из неорганических или органических кислот или оснований. Обзор подходящих солей см., например, Berge et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19 and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., A. Gennaro (ed.), Lippincott Williams & Wilkins (2000).

Примеры подходящих кислотно-аддитивных солей включают ацетат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат, люкогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, оксалат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, тартрат, тиоцианат, тозилат и ундеканоат.

Примеры подходящих основно-аддитивных солей включают соли аммония; соли щелочных металлов, такие как соли натрия и калия; соли щелочноземельных металлов, такие как соли кальция и магния; соли с органическими основаниями, такие как соли дициклогексиламина, №метил-Э-глюкамин; и соли с аминокислотами, такими как аргинин, лизин и т.п.

Например, Berge перечисляет следующие одобренные FDA коммерчески продаваемые соли: анионы ацетат, безилат (бензолсульфонат), бензоат, бикарбонат, битартрат, бромид, эдетат кальция (этилендиаминтетраацетат), камсилат (камфорсульфонат), карбонат, хлорид, цитрат, дигидрохлорид, эдетат (этилендиаминтетраацетат), эдисилат (1,2-этандисульфонат), эстолат (лаурилсульфат), эзилат (этансульфонат), фумарат, глюцептат (глюкогептонат), глюконат, глутамат, гликоллиларсанилат (гликолламидофениларсонат), гексилрезорцинат, гидрабамин (N, И-ди(дегидроабиетил) этилендиамин), гидробромид, гидрохлорид, гидроксинафтоат, йодид, изетионат (2-гидроксиэтансульфонат), лактат, лактобионат, малат, малеат, манделат, мезилат (метансульфонат), метилбромид, метилнитрат, метилсульфат, мукат, напсилат (2-нафталинсульфонат), нитрат, памоат (эмбонат), пантотенат, фосфат/сальтеактуронат, фосфат/дифосфат, полигалактуронат, салицилат, стеарат, субацетат, сукцинат, сульфат, таннат, тартрат, теоклат (8-хлортеофиллинат) и триэтиодид; органические катионы бензатин (N, N'-дибензилэтилендиамин), хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, меглумин (N-метилглюкамин) и прокаин; и катионы металлов алюминия, кальция, лития, магния, калия, натрия и цинка.

Berge дополнительно перечисляет следующие не одобренные FDA коммерчески продаваемые (за пределами США) соли: анионы адипат, альгинат, аминосалицилат, ангидрометиленцитрат, ареколин, аспартат, бисульфат, бутилбромид, камфорат, диглюконат, дигидробромид, дисукцинат, глицерофосфат, гемисульфат, гидрофторид, гидроиодид, метиленбис(салицилат), нападисилат(1,5нафталиндисульфонат), оксалат, пектинат, персульфат, фенилэтилбарбитурат, пикрат, пропионат, тиоцианат, тозилат и ундеканоат; органические катионы бенетамин (N-бензилфенэтиламин), клемизол (1-рхлорбензил-2-пирролилдин-1'-илметилбензимидазол), диэтиламин, пиперазин и трометамин (трис(гидроксиметил)аминометан); и катионы металлов бария и висмута.

Описанные в данном документе соединения могут также включать подходящие носители, наполнители и вспомогательные средства, которые могут различаться в зависимости от способа введения.

В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции могут быть составлены в виде подходящей лекарственной формы для парентерального введения. Указанные составы можно приготовить различными способами, известными в данной области. Фармацевтические композиции можно вводить непосредственно в кровоток, в мышцу или непосредственно в орган. Подходящие способы парентерального введения включают внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, интратекальное, внутрижелудочковое, внутриуретральное, внутригрудинное, внутричерепное, внутримышечное и подкожное. Подходящие устройства для парентерального введения включают игольчатые инъекторы, безыгольные инъекторы и методы инфузии.

Композиции для парентерального введения обычно представляют собой водные растворы, которые могут содержать вспомогательные вещества, такие как соли, углеводы и буферные агенты. Однако композиция также может быть приготовлена в виде стерильного неводного раствора или в виде высушенной формы для использования в сочетании с подходящим носителем, таким как стерильная апирогенная вода.

Приготовление парентеральных композиций в стерильных условиях, например, путем лиофилизации, может быть легко выполнено с использованием стандартных методик, хорошо известных специалистам в данной области.

- 34 048725

Композиции для парентерального введения могут быть составлены с немедленным и/или модифицированным высвобождением. Составы с модифицированным высвобождением включают отсроченное, замедленное, импульсное, контролируемое, целевое и запрограммированное высвобождение. Таким образом, композиции могут быть составлены в виде твердой, полутвердой или тиксотропной жидкости для введения в виде имплантированного депо, обеспечивающего модифицированное высвобождение активного агента.

Парентеральные составы могут быть смешаны с другими подходящими фармацевтически приемлемыми наполнителями, используемыми в парентеральных лекарственных формах, такими как, но не ограничиваясь ими, консерванты.

В другом варианте реализации фармацевтические композиции могут быть составлены в виде подходящих пероральных лекарственных форм, таких как таблетки, капсулы, порошки, гранулы, суспензии, растворы, эмульсии и тому подобное. Могут присутствовать другие подходящие носители, такие как разрыхлители, разбавители, хелатирующие агенты, связующие, глиданты, смазывающие вещества, наполнители, наполнители, антиадгезирующие агенты и тому подобное.

Препараты для перорального введения могут также содержать другие подходящие фармацевтические эксципиенты, такие как подсластители, несущие среды/смачивающие агенты, красители, ароматизаторы, консерванты, повышающие вязкость/загустители и т.п.

Доза фармацевтических композиций по данному изобретению может быть адаптирована к индивидуальному пациенту.

Липидные конъюгаты.

В некоторых вариантах реализации данное изобретение относится к соединению формулы (VI):

а является целым числом от 1 до 20;

m равно 0, 1, 2, 3, или 4;

n равно 0 или 1;

R³ и R³ каждый независимо выбран из водорода и C₁-С₃-алкила;

L представляет собой расщепляемый линкер; и

LP представляет собой липид.

В некоторых вариантах реализации D-NH2 представляет собой модулятор STING. В некоторых вариантах реализации D-NH2 представляет собой циклический динуклеотид (CDN) или CDN-подобное соединение. В некоторых вариантах реализации D-NH₂ представляет собой одну из формул, описанных в данном документе.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предлагается соединение формулы (VI), где L имеет формулу

где W, Z, t, U, Q и U' имеют значения, описанные в данном документе.

В некоторых вариантах реализации соединение формулы (VI) связано с липидным комплексом. Термин липидный комплекс является общепризнанным термином при получении фармацевтических соединений. Липидные комплексы характеризуются нековалентной связью между липидом и соединением формулы (VI). Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, соединение формулы (VI) может быть связано с липидным комплексом посредством электростатического взаимодействия, гидрофильного взаимодействия, гидрофобного взаимодействия или любой их комбинации.

В некоторых вариантах реализации описанные в данном документе липидные комплексы имеют форму липидных частиц. В одном варианте реализации комплексы находятся в форме липидных наночастиц. В одном варианте реализации комплексы находятся в форме липосом. В некоторых вариантах реализации липосомы по данному изобретению содержат липидный монослой или липидный многослой. В некоторых вариантах реализации липосома содержит липидный бислой и водное ядро. В некоторых ва

- 35 048725 риантах реализации средний размер частиц липосомы составляет от около 5 нм до около 1 мкм. В некоторых вариантах реализации средний размер частиц липидной наночастицы или липосомы составляет от около 5 нм до около 500 нм, от около 10 нм до около 150 нм и от около 30 нм до около 100 нм. В некоторых вариантах реализации соединение формулы (V) находится в водном ядре, липидном бислое или их комбинации.

В некоторых вариантах реализации LP может представлять собой холестерин или фосфолипид. В некоторых вариантах реализации LP представляет собой фосфолипид. В некоторых вариантах реализации фосфолипид выбран из фосфатидилхолина, фосфатидилгицерина, фосфатидной кислоты, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфолипида соевых бобов и фосфолипида яичного желтка. В некоторых вариантах реализации фосфолипид представляет собой фосфатидилэтаноламин. В некоторых вариантах реализации фосфолипид представляет собой 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3фосфорилэтаноламин.

В некоторых вариантах реализации данное изобретение представляет липидный комплекс, содержащий соединение формулы (VI). В некоторых вариантах реализации липидный комплекс может быть липосомой.

В некоторых вариантах реализации липидный комплекс включает от около 0,5 до около 40 мол.% соединения формулы (VI) или его фармацевтически приемлемой соли. В некоторых вариантах реализации липидный комплекс включает от около 1 до около 35 мол.% соединения формулы (VI) или его фар мацевтически приемлемой соли. В некоторых вариантах реализации липидный комплекс включает от около 1 до около 30 мол.% соединения формулы (VI) или его фармацевтически приемлемой соли. В некоторых вариантах реализации липидный комплекс включает от около 1 до около 20 мол.% соединения формулы (VI) или его фармацевтически приемлемой соли. В некоторых вариантах реализации липидный комплекс включает от около 1 до около 15 мол.% соединения формулы (VI) или его фармацевтически приемлемой соли.

В некоторых вариантах реализации липидный комплекс дополнительно содержит один или более дополнительных фосфолипидов. В некоторых вариантах реализации фосфолипид выбран из фосфатидилхолина, фосфатидилгицерина, фосфатидной кислоты, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, сфингомиелина, фосфолипида соевых бобов и фосфолипида яичного желтка.

В некоторых вариантах реализации липидный комплекс включает от около 30 до около 90 мол.% одного или более фосфолипидов. В некоторых вариантах реализации липидный комплекс включает от около 40 до около 85 мол.% одного или более фосфолипидов. В некоторых вариантах реализации липидный комплекс включает от около 50 до около 80 мол.% одного или более фосфолипидов.

В некоторых вариантах реализации липидный комплекс дополнительно содержит жирный спирт или холестерин. В некоторых вариантах реализации липидный комплекс содержит от примерно 5 до примерно 35 мольных процентов холестерина. В некоторых вариантах реализации липидный комплекс включает от около 5 до около 30 мольных процентов холестерина. В некоторых вариантах реализации липидный комплекс включает от около 5 до около 25 мольных процентов холестерина.

В некоторых вариантах реализации липидный комплекс дополнительно содержит по меньшей мере один ПЭГилированный фосфолипид. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ПЭГилированный липид представляет собой ПЭГилированный фосфолипид. В некоторых вариантах реализации ПЭГилированный фосфолипид выбран дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, диπальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, диπальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина,

5000)-1,22000)-1,22000)-1,25000)-1,22000)-1,25000)-1,22000)из №(карбонил-метоксиполиэтиленгликоль №(карбонил-метоксиполиэтиленгликоль №(карбонил-метоксиполиэтиленгликоль №(карбонил-метоксиполиэтиленгликоль №(карбонил-метоксиполиэтиленгликоль №(карбонил-метоксиполиэтиленгликоль №(карбонил-метоксиполиэтиленгликоль дистеароил-рац-глицерина и №(карбонил-метоксиполиэтиленгликоль 5000)-дистеароил-рац-глицерина, фармацевтически приемлемой соли или их смеси. В некоторых вариантах реализации ПЭГилированный фосфолипид представляет собой №(карбонилметоксиполиэтиленгликоль 2000) -1,2-дистеароил-snглицеро-3-фосфоэтаноламин.

В некоторых вариантах реализации липидный комплекс включает от около 0 до около 6 мол.% одного или более ПЭГилированных фосфолипидов. В некоторых вариантах реализации липидный комплекс включает от около 0,5 и 5 мол.% одного или более ПЭГилированных фосфолипидов. В некоторых вариантах реализации липидный комплекс включает от около 1 и 5 мол.% одного или более ПЭГилированных фосфолипидов. В некоторых вариантах реализации липидный комплекс включает около 3 мол.% одного или более ПЭГилированных фосфолипидов. В некоторых вариантах реализации липидный комплекс включает около 4 мол.% одного или более ПЭГилированных фосфолипидов. В некоторых вариантах реализации липидный комплекс включает около 5 мол.% одного или более ПЭГилированных фосфо липидов.

Способ применения соединений и композиций.

Некоторые описанные в данном документе соединения являются агонистами STING и, таким обра

- 36 048725 зом, полезны для стимуляции иммунного ответа у их субъектов. Композиции можно использовать при лечении вирусов.

Соединения по данному изобретению проявляют модулирующую/агонистическую активность в отношении STING. Некоторые соединения по данному изобретению могут быть лучше с точки зрения эффективности, фармакокинетики (например, абсорбции, распределения, метаболизма, экскреции), растворимости (например, растворимости в воде), взаимодействия с другими лекарственными средствами (например, ингибирующего действия ферментов, метаболизирующих лекарственные средства), безопасности (например, острая токсичность, хроническая токсичность, генетическая токсичность, репродуктивная токсичность, кардиотоксичность, канцерогенность, центральная токсичность) и/или стабильности (например, химическая стабильность, устойчивость к ферменту) и могут быть полезны в качестве лекарственного средства.

Соединение по данному изобретению можно использовать для увеличения активности STING у млекопитающего (например, мыши, крысы, хомяка, кролика, кошки, собаки, коровы, овцы, обезьяны, человека).

Соединение по данному изобретению может быть использовано в качестве лекарственного средства, такого как средство для профилактики или лечения заболеваний, на которые может влиять STING (в настоящем описании, иногда сокращенно обозначается как заболевания, связанные с STING), например, раковые заболевания, например, колоректальный рак (например, колоректальный рак, рак прямой кишки, рак заднего прохода, семейный колоректальный рак, наследственный неполипозный колоректальный рак, стромальная опухоль желудочно-кишечного тракта), рак легких (например, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого рак, злокачественная мезотелиома), мезотелиома, рак поджелудочной железы (например, протоковая карцинома поджелудочной железы, эндокринная опухоль поджелудочной железы), рак глотки, рак гортани, рак пищевода, рак желудка (например, папиллярная аденокарцинома, муцинозная аденокарцинома, аденосквамозная карцинома), рак двенадцатиперстной кишки, рак тонкого кишечника, рак груди (например, инвазивная карцинома протоков, неинвазивная карцинома протоков, воспалительный рак молочной железы), рак яичников (например, эпителиальный рак яичников, опухоль внегонадных зародышевых клеток, опухоль зародышевых клеток яичников, опухоль яичников с низким потенциалом злокачественности), опухоль яичка, рак простаты (например, гормонозависимый рак простаты, негормонозависимый рак простаты, устойчивый к кастрации рак простаты), рак печени (например, гепатоцеллюлярный рак, первичный рак печени, рак внепеченочных желчных протоков), рак щитовидной железы (например, медуллярная карцинома щитовидной железы), рак почек (например, почечно-клеточный рак (например, светлоклеточный рак почечных клеток), переходноклеточный рак почечной лоханки и мочеточника), рак матки (например, рак шейки матки, рак тела матки, саркома матки), гестационная хориокарцинома, опухоли мозга (например, медуллобластома, глиома, астроцитарные опухоли пинеальной железы, пилоцитарная астроцитома, диффузная астроцитома, анапластическая астроцитома), ретинобластома, рак кожи (например, базалиома, злокачественная меланома), саркомы (например, рабдомиосаркома, лейомиосаркома, саркома мягких тканей, веретено-клеточная саркома), злокачественная опухоль костей, рак мочевого пузыря, рак крови (например, множественная миелома, лейкемия (например, острый миелогенный лейкоз), злокачественная лимфома, болезнь Ходжкина, хроническое миелопролиферативное заболевание), первичный рак неизвестной формы; ингибитор роста рака; ингибитор метастазирования рака; промотор апоптоза; средство для лечения предраковых поражений (например, миелодиспластических синдромов); и тому подобное.

В некоторых вариантах реализации соединение по данному изобретению можно использовать в качестве лекарственного средства от колоректального рака, рака молочной железы, рака кожи, злокачественной лимфомы или рака легких.

Кроме того, соединение по данному изобретению или комбинированный агент по данному изобретению можно использовать одновременно с немедикаментозной терапией. Точнее, соединение по данному изобретению или комбинированный агент по данному изобретению можно комбинировать с немедикаментозной терапией, такой как (1) хирургическое вмешательство, (2) гипертоническая химиотерапия с использованием ангиотензина II и т.д., (3) генная терапия, (4) термотерапия, (5) криотерапия, (6) лазерное прижигание и (7) лучевая терапия.

Например, при использовании соединения по данному изобретению до или после вышеупомянутой хирургической операции и т.п., или до или после комбинированного лечения двумя или тремя их видами, можно получить такие эффекты, как предотвращение появления резистентности, продление безболезненной выживаемости, подавление метастазов или рецидивов рака, продление жизни и т.п.

Кроме того, можно комбинировать лечение соединением данного изобретения или комбинированным агентом данного изобретения с поддерживающей терапией: (i) введение антибиотика (например, типа Р-лактама, такого как панспорин и т.п., макролида такого типа, как кларитромицин и т.п.) для осложнений с различными инфекционными заболеваниями, (ii) назначение высококалорийного переливания крови, препарата аминокислот или общего витаминного препарата для улучшения недостаточности питания, (iii) введение морфина для уменьшения боли, (iv) введение фармацевтического агента для облегчения побочных эффектов, таких как тошнота, рвота, анорексия, диарея, лейкопения, тромбоцитопе

- 37 048725 ния, снижение концентрации гемоглобина, выпадение волос, гепатопатия, ренопатия, ДВС-синдром, лихорадка и тому подобное, и (v) введение фармацевтического препарата для подавления множественной лекарственной устойчивости рака и т.п.

Примеры

Общие синтетические методы и промежуточные продукты.

Соединения данного изобретения могут быть получены обычным специалистом в данной области в свете данного изобретения и знаний в данной области и/или путем ссылки на схемы, показанные ниже, и синтетические примеры. Типичные пути синтеза представлены на схемах ниже и в примерах. Следует понимать, что переменные (например, группы R), представленные на следующих схемах и примерах, должны считываться независимо от переменных, встречающихся в других местах изобретения. Специалист в данной области легко поймет, как схемы и примеры, показанные ниже, иллюстрируют получение описанных в данном документе соединений.

Схема 1. Общий способ превращения карбоновой кислоты в соответствующий хлорангидрид или (изобутилкарбонат) пропионовый ангидрид.

О R⁶

НО Yc Вос

I

или (COCI)₂. THF, DCM или реагент Гхозе, DCM

О R⁶

Ж А

Е Yc Вос а

Схема 1 показывает общий путь активации карбоновой кислоты i до соответствующего хлорангидрида кислоты или (изобутилкарбоновой) пропионовой кислоты, такого как ii, где Yc представляет собой алкильную или ароматическую цепь, R⁶ представляет собой метил или алкильную цепь, содержащую простой полиэфир. Получение ii, где Е представляет собой OCO₂CH₂CH(CH3)₂, может быть достигнуто обработкой i изобутилхлорформиатом в присутствии основания. Когда Е представляет собой Cl, образо вание ii достигается обработкой i оксалилхлоридом или реагентом Ghosez (см. α-Chloro enamines, reactive intermediates for synthesis: 1-Chloro-N, N,2-trimethylpropenylamine. Haveaux В., et al. Org. Synth. 1980, 59, 26.)

Схема 2. Общий способ присоединения спейсера к аминогруппе в фрагменте лекарственного сред ства с использованием поэтапного подхода.

1. ТМSCI,пиридин

2.

D-NH2 ____ε

Вос

D

3. N&3-3HF. МеОН vl

На схеме 2 показан общий способ присоединения спейсера, такого как ii к аминогруппе в фрагменте лекарственного средства, таком как iii. После того как соединение iii подвергается глобальной силильной защите путем обработки триметилсилилхлоридом и пиридином, оно реагирует с активированным спейсером ii. Удаление силильных групп с помощью NEt₃-3HF дает iv. Снятие защиты амина iv осуществляется обработкой кислотой, такой как ТФУ или HCl, и полученная соль амина обрабатывается активированным дипептидным карбонатом v для получения vi.

Схема 3. Общий способ присоединения спейсера к аминогруппе в фрагменте лекарственного средства с использованием поэтапного подхода.

- 38 048725

На схеме 3 показан общий метод присоединения спейсера, такого как ii, к аминогруппе в фрагменте лекарственного средства, таком как iii-a, где X¹ и X³ представляют собой кислород, серу или СН2, X³представляет собой азот или СН, R³ представляет собой водород или фтор, R⁴ представляет собой гидроксил, водород, фтор или взятые вместе с R³ с образованием ОСН2, R^c представляет собой ОН или SH, R^dпредставляет собой метил или (CH2)₃NHC(O)NH2. После того как соединение iii-a подвергается глобальной силильной защите путем обработки триметилсилилхлоридом и пиридином, оно реагирует с активированным спейсером ii. Удаление силильных групп с помощью NEt₃-3HF дает iv-a. Снятие защиты амина iv-a осуществляется обработкой кислотой, такой как ТФУ или HCl, и полученная соль амина обрабатывается активированным дипептидным карбонатом v для получения vi-a.

Схема 4. Общий способ присоединения спейсера к аминогруппе в фрагменте лекарственного средства с использованием поэтапного подхода.

На схеме 4 показан общий способ присоединения спейсерной группы, такой как ii, к аминогруппе в фрагменте лекарственного средства, таком как iii-b, в соответствии с общим методом, описанным на схеме 3.

- 39 048725

Схема 5. Общий путь создания спейсерного пептида хлорангидрида.

но

Вос (COCIh

THF. DCM

Ϊ f=^^NY^A’N^JlV^NBoc о ^н Ж о

ИИ

На схеме 5 показан общий метод получения хлорангидрида viii. Снятие защиты Вос-амина i с помощью кислоты, такой как ТФУ или HCl, сопровождается обработкой активированным карбонатом v с получением карбоновой кислоты vii. Превращение vii в хлорангидрид viii можно осуществить обработкой оксалилхлоридом или сульфонилхлоридом.

Схема 6. Альтернативный общий способ присоединения спейсера к аминогруппе в фрагменте лекарственного средства.

На схеме 6 показан альтернативный общий метод прямого преобразования полезной нагрузки ш в соединение ix. После общей силильной защиты триметилсилилхлоридом ш обрабатывают хлорангидридом viii. Удаление силильной группы дает ix.

Схема 7. Альтернативный общий способ присоединения спейсера к аминогруппе в фрагменте лекарственного средства.

На схеме 7 показан альтернативный общий метод прямого преобразования полезной нагрузки iii-a в соединение ix-a в соответствии с общим методом, описанным на схеме 6.

- 40 048725

Схема 8. Альтернативный общий способ присоединения спейсера к аминогруппе в фрагменте ле карственного средства.

гх-Ь

На схеме 8 показан альтернативный общий метод присоединения спейсера к аминогруппе в фрагменте лекарственного средства, таком как iii-b, в соответствии с общим методом, описанным на схеме 6.

Схема 9. Общий путь для подготовки линкер-полезных нагрузок

На схеме 9 показан общий способ получения линкер-полезной нагрузки xi из vi, где Yd представляет собой линейную или разветвленную алкильную цепь или полиэфирную цепь, a Z представляет собой маркер конъюгации, такой как малеимид, BCN или DBCO. Снятие защиты амина vi кислотой, такой как ТФУ или HCl, сопровождается реакцией с активированным сложным эфиром х с получением линкерполезной нагрузки xi.

- 41 048725

Схема 10. Общий путь для подготовки линкер-полезных нагрузок

О

На схеме 10 показан общий метод получения линкер-полезной нагрузки xi-a из vi-a в соответствии с общим методом, описанным на схеме 9.

Схема 11. Общий путь для подготовки линкер-полезных нагрузок

На схеме 11 показан общий метод присоединения маркера конъюгации к таким соединениям, как vi-b, в соответствии с общим методом, описанным на схеме 9.

- 42 048725

Схема 12. Общий путь для подготовки линкер-полезных нагрузок

XI

На схеме 12 показан альтернативный метод подготовки линкер-полезной нагрузки xi из iv. Снятие защиты амина iv кислотой, такой как ТФУ или HCl, сопровождается реакцией xii с получением xi.

Схема 13. Общий путь для подготовки линкер-полезных нагрузок

На схеме 13 показан альтернативный метод подготовки линкер-полезной нагрузки xi-a из iv-a в соответствии с общим методом, описанным на схеме 12.

Схема 14. Общий путь для подготовки линкер-полезных нагрузок

На схеме 14 показан общий способ получения глюкуронидат-содержащего линкера-полезной на- 43 048725 грузки xvi. Снятие защиты амина iv кислотой, такой как ТФУ или HCl, сопровождается реакцией с активированным карбонатом xiii с получением xiv. Общий гидролиз ацетата и удаление группы FMOC в xiv с помощью основания, такого как гидроксид лития, дает xv. Обработка xv активированным маркером конъюгации х дает глюкуронидат-содержащий линкер-полезную нагрузку xvi.

Схема 15. Общий путь для подготовки линкер-полезных нагрузок • ι;·Λί

На схеме 15 показан общий способ получения глюкуронидат-содержащего линкера-полезной нагрузки xvi-a, в соответствии с общим способом, описанным на схеме 14.

Схема 16. Общий путь для подготовки линкер-полезных нагрузок vJ

TFA D-CM

МИВ».

3. TFA, DCM ж® о Ай

На схеме 16 показан общий способ получения концевой амин-содержащего линкера-пол езной нагрузки xviii, где Ye представляет собой линейную алкильную цепь или алкильную цепь, содержащую простой полиэфир. Снятие защиты амина vi кислотой, такой как ТФУ или HCl, сопровождается реакцией с активированным маркером конъюгации xvii. Удаление концевой защитной группы кислотой, такой как ТФУ, дает концевой амин-содержащий линкер-полезная нагрузка xviii.

- 44 048725

Схема 17. Общий путь для подготовки линкер-полезных нагрузок

На схеме 17 показан общий способ получения концевой амин-содержащего линкера-полезной нагрузки xviii-a, следуя общему способу, описанному на схеме 16.

Схема 18. Общий путь для подготовки линкер-полезных нагрузок

1.TMSCI, пиридин d-nh₂

Ui

NEt_:i DMF

О н χχϋ

На схеме 18 показан общий способ получения линкера-полезной нагрузки, такого как xxii, который включает дипептидный спейсер, где R⁷ представляет собой водород, алкильную или ароматическую группу. Соединение iii глобально защищается обработкой триметилсилилхлоридом и пиридином, а затем обрабатывается Вос-пролинсукцинимидным эфиром. Удаление силильной группы с помощью источника фторида, такого как NEt3-3HF, дает xix. Снятие защиты амина xix кислотой, такой как ТФУ или HCl, сопровождается реакцией с активированной сукцинимидным эфиром аминокислотой хх, с получением xxi. Снятие защиты амина xxi кислотой, такой как ТФУ или HCl, сопровождается установкой маркера малеимида для получения линкера-полезной нагрузки xxii.

- 45 048725

Схема 19. Общий путь для подготовки линкер-полезных нагрузок

На схеме 19 показан общий метод подготовки линкера-полезной нагрузки, такой как xxii-a, в соответствии с общим методом, описанным на схеме 18.

Приготовление приводимых в качестве примера ADC и промежуточных продуктов Определения АА ЖХМС метод с использованием ацетата аммония

Ас ацетат

ACN ацетонитрил атм атмосфера води, водный

BCN бицикло[6.1.0]нонин

НПКО ниже предела количественного определения

- 46 048725

Bn бензил

Вос m/tem-бутоксикарбонил tBu щрети-бутил

Bz бензоил

С Цельсия вычисл. вычислено

Cbz бензоилоксикарбонил

DAR соотношение лекарственного средства и антитела

DBCO дибензоциклооктин

DCC N, N-дициклогексилкарбодиимид

DCM дихлорметан

DIPEA N, N-диизопропилэтиламин

DMAP 4-диметиламинопиридин

DMA N, N-диметилацетамид

DMB 2,4-диметоксибензил

ДМФА N, N-диметилформамид

ДМСО диметилсульфоксид

DTT дитиотреитол ε коэффициент экстинкции

Е 0.1% 0.1% раствор коэффициент экстинкции

EDC 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид

EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота

Et этил

EtOH этанол

EtOAc этилацетат

МА метод ЖХМС с использованием муравьиной кислоты

Fmoc флуоренилметилоксикарбонил ч часы

HATU 1-[бис (диметиламино)метилен]-1Н-1,2,3-триазоло[4,5-Ь]пиридиния 3 оксид гексафторфосфат

HIC хроматография гидрофобного взаимодействия

HOAt 1-гидрокси-7-азабензотриазол

ВЭЖХ жидкостная хроматография высокого давления

МСВР масс-спектрометрия высокого разрешения

IC50 ингибирующая концентрация 50%

ЖХ жидкостная хроматография

ЖХМС жидкостная хроматография, масс-спектрометрия.

M/z масса к заряду

МГц мега герц

Me метил

- 47 048725

МеОН метанол μΜ микрон мин минуты мл миллилитры

МС масс-спектр

MWCO отсечка по молекулярной массе

ЯМР ядерный магнитный резонанс

PBS Фосфатно-солевой буферный раствор

ПЭ петролейный эфир

Ph фенил psi фунтов на квадратный дюйм psig манометрическое давление в фунтах на квадратный дюйм

Руг пиридин

QTOF квадрупольный время пролетный кт комнатная температура

SEC Эксклюзионная хроматография по размеру

SFC сверхкритическая жидкостная хроматография

TBS отреот-бутилметилсилил

ТСЕР (трис(2-карбоксиэтил)фосфин)

TEA триэтиламин

TFA трифторуксусная кислота

ТГФ тетрагидрофуран

TIPS триизопропилсилил

TMS триметилсилил

Tris трис(гидроксиметил)аминометан

УЭЖХ Ультраэффективная жидкостная хроматография

Аналитические методы.

Условия ЯМР.

Спектры 1Н ЯМР регистрировали на спектрометре Bruker 400 МГц, если не указано иное. Спектры ³¹Р ЯМР записывали при 162 МГц на спектрометре Bruker 400 МГц и получали с развязкой 1Н, если не указано иное. Спектры ¹⁹F ЯМР записывали при 376 МГц на спектрометре Bruker 400 МГц, если не указано иное.

Условия МСВР.

Спектры МСВР получали с использованием биоинертного мультисэмплера Agilent 1260 Infinity II, отделения для биоинертной колонки, биоинертного четвертичного насоса, мультиволнового детектора DAD и масс-спектрометрических приборов Agilent 6545 LC-QTOF с Osaka Soda Capcell РАК. C1 UG120 (5 мкм, внутренний диаметр 2,0 ммх длина 35 мм) обращенно-фазовая колонка. Системы растворителей для ЖХ состояли из 0,1% муравьиной кислоты в воде для подвижной фазы А и 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле для подвижной фазы В или эквивалентной системы растворителей. Обычно элюирование ЖХ начинали при соотношении подвижной фазы А/В 95%/5%. После интервала изократического потока, обычно 0,5 мин, подвижную фазу заменяли на 100% В в течение 1,5 мин линейного градиента. Скорость потока составляла 0,7 мл/мин за 5-минутный пробег.

Обычно в масс-спектрометр вводили 2 мкл 1 мМ раствора в ДМСО. Настройки QTOF: температура газа 35°С, скорость потока сушильного газа=10 л/мин, давление распылителя 55 фунтов на кв. дюйм, температура и поток газа в оболочке 35°С и 12 л/мин соответственно. Были применены следующие настройки напряжения: напряжение капилляра 4500 В, напряжение на сопле 2000 В, напряжение фрагментатора 75 В.

Данные анализировали с помощью программного обеспечения Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis, версия 8.07.00 SP2. Ошибка массы [ч/млн] выражалась как разница между точной и наблюдаемой массой, деленная на точную массу, умноженную на 1х10⁶.

Условия ЖХМС.

Спектры ЖХМС регистрировали в системе ЖХ Hewlett-Packard HP1100 или Agilent 1100 Series, подключенной к масс-спектрометру Micromass, с использованием колонок С18 с обращенной фазой. Были выбраны различные градиенты и время анализа, чтобы наилучшим образом охарактеризовать соеди

- 48 048725 нения. Подвижные фазы были основаны на градиентах ACN/вода или МеОН/вода и содержали либо 0,1% муравьиной кислоты (методы обозначены как МК), либо 10 мМ ацетата аммония (методы обозначены как АА). Одним из примеров градиента растворителя, который был использован, был от 100% подвижной фазы А (подвижная фаза А=99% воды+1% ACN+0,1% муравьиной кислоты) до 100% подвижной фазы В (подвижная фаза В=95% ACN+5% вода+0,1% муравьиной кислоты) при скорости потока 1 мл/мин в течение 16,5 мин.

В некоторых случаях спектры ЖХМС регистрировали на системе Agilent 1290 Infinity UPLC, подключенной к масс-спектрометру Agilent 6130, системе Waters Acquity UPLC, подключенной к массспектрометру Waters Acquity SQ, или системе ВЭЖХ Agilent серии 1100, подключенной к Waters Micromass ZQ. масс-спектрометр с использованием колонок С18 с обращенной фазой.Были выбраны различные градиенты и время анализа, чтобы наилучшим образом охарактеризовать соединения. Подвижные фазы были основаны на градиентах ACN/вода или МеОН/вода и содержали либо 0,1% муравьиной кислоты (методы обозначены как МК), либо 10 мМ ацетата аммония (методы обозначены как АА).Одним из примеров градиента растворителя, который был использован, был от 95% подвижной фазы А (подвижная фаза А=99% воды+1% ACN+0,1% муравьиной кислоты) до 100% подвижной фазы В (подвижная фаза В=95% ACN+5% вода+0,1% муравьиной кислоты) при скорости потока 0,5 мл/мин в течение 5 мин.

Препаративная ВЭЖХ.

Препаративное разделение методом ВЭЖХ проводили с использованием колонок Sunfire С-18 18x150 мм, элюируя градиентами вода-ACN, используя прибор Gilson, управляемый 322 насосами, с детектором 155, запускаемым УФ/видимым светом, установленным в диапазоне от 200 до 400 нм.Сбор масс-закрытых фракций проводится на приборе Agilent 1100 LC/MSD.

Обычный специалист в данной области поймет, что возможны модификации градиента, длины колонки и скорости потока и что некоторые условия могут быть более подходящими для характеристики соединения, чем другие, в зависимости от анализируемых химических веществ.

Препаративная SFC.

Препаративную SFC проводили с использованием колонок ChiralPak 10, 20 или 30 мм x 250 мм (обычно IA, IB, IC, ID, IE и IF), колонок 10 или 20 мм x 250 мм Phenomenex Lux Cellulose-4 или 2этилпиридина, элюированием с использованием соответствующего процента сверхкритического диоксида углерода и спирта, содержащего 0,3% диэтиламина, 0,3% TEA, 0,3% муравьиной кислоты или без каких-либо кислотных или основных добавок. Изократические условия с расходами в диапазоне 10-100 мл /мин и температурой колонки 40°С являются типичными. Препаративная SFC проводится в системе предварительной очистки Jasco SFC с набором фракций, инициируемых УФ/видимым излучением, от 200 до 400 нм и регулировкой противодавления на уровне 10 МПа.

Аналитические условия SEC.

Спектры SEC регистрировали на системах ЖХ Hewlett-Packard HP1100 или Agilent 1100 Series с детектором на диодной матрице с использованием колонки SEC (обычно Tosoh Biosep TSK Gel, G3000SWxl; P/N 8541; 250A; 5 мкм; 7,8 мм x 300 мм) при 280 нм. Подвижная фаза представляла собой 100 мМ фосфат натрия, 300 мМ хлорид натрия, рН 6,8, 10% ацетонитрил (об./об.) или 1xPBS. Типичный цикл является изократическим при скорости потока 1 мл/мин в течение 20 минут.

Аналитические условия HIC.

Спектры HIC регистрировали на системах ЖХ Hewlett-Packard HP1100 или Agilent 1100 Series с детектором на диодной матрице с использованием колонки HIC (обычно Tosoh Butyl-NPR, 4,6x35 мм, 2,5 мкм, P/N: 14947) при 280 нм. Подвижная фаза А представляла собой 25 мМ фосфат натрия, 1,5 М сульфат аммония, рН 7, а подвижная фаза В представляла собой 75% 25 мМ фосфата натрия, рН 7, 25% изопропанол. Для типичного 20-минутного пробега между начальным и конечным интервалами изократического потока будет использоваться 12-минутный линейный градиент от 95%/5% А/ В до 100% В.

Условия ЖХ-QTOF:

Спектры ЖХМС регистрировали на системе ВЭЖХ Agilent 1260 Bioinert Series, подключенной к масс-спектрометру Agilent 6545 QTOF, с использованием обращенно-фазовой колонки, нагретой до 80 °С (обычно Agilent, PLRP-S, 5 мкм, 1000 А, 2,1 мм x 50 мм). Были выбраны различные градиенты и время анализа, чтобы наилучшим образом охарактеризовать соединения. Подвижные фазы были основаны на градиентах ACN/вода и содержали 0,1% муравьиной кислоты. Одним из примеров градиента растворителя, который был использован, был от 95% подвижной фазы А (подвижная фаза А=99% воды+1% ACN+0,1% муравьиной кислоты) до 100% подвижной фазы В (подвижная фаза В=95% ACN+5% вода+0,1% муравьиной кислоты) с условиями, указанными в табл. 1.

- 49 048725

Таблица 1

Время (мин)	Поток (мл/мин)	%А	%В
0	0,35	82	18
1	0,35	82	18
2	0,35	70	30
19	0,5	50	50
19,5	0,5	10	90
21	0,5	10	90
21,1	0,5	82	18
22	0,5	82	18

Образцы были либо нативными, либо уменьшенными (20 мкл раствора ADC 1~5 мг/мл обрабатывали 4 мкл 0,5 М раствора DTT при 37°С в течение 30 минут). Необработанные данные были деконволютированы в соответствующем диапазоне масс с использованием программного обеспечения Agilent BioConfirm для получения молекулярной массы белка, а для расчета DAR использовался калькулятор Agilent DAR.

Условия ЖХ/МС/МС.

Анализ ЖХ/МС/МС выполняли с использованием бинарного насоса Shimadzu UFLC LC-20AD XR и системы автоматического пробоотборника SIL-30AC МР и масс-спектрометрии АВ SCIEX Triple Quad 4500 ESI.

Обычно аликвоты 5 мкл вводили в ЖХ/МС/МС после прохождения через колонку Waters Xselect C18 CSH 3,5u 2,1 мм ID x 30 мм. Подвижная фаза А содержала 0,1% муравьиной кислоты в воде, а подвижная фаза В содержала 0,1% муравьиной кислоты в 5% воды с 95% ацетонитрила. Общее время пробега составляло 3 мин при 1,5 мл/мин с линейным градиентом от 100% А до 100% В за 1,5 мин скорости потока. Первоначально прибор работал со 100% водным растворителем подвижной фазы в течение 0,5 мин, а затем он был увеличен до 100% органического растворителя в следующие 1,5 мин.

Препаративная SEC.

Очистку препаративной SEC проводили в системе Gilson Preparative HPLC с УФ-детектором с использованием колонки SEC (обычно GE Superdex 200 Increase 10/300 GL). Подвижная фаза - 1xPBS (pH 7,4). Типичный цикл является изократическим при скорости потока 1 мл/мин в течение 30 минут. Сбор фракций запускали на основании УФ-порога (при 214 и 280 нм).

Концентрация ADC:

Концентрацию ADC рассчитывали по поглощению УФ-излучения при 280 нм, измеренному с помощью коэффициента NanoDrop (2000c; Fisher Scientific) после вычитания УФ-поглощения из соответствующих конструкций линкер-полезная нагрузка.

Пример 1.

трет-Бутил №[(2-хлоркарбонилфенил)метил]4-метилкарбамат (промежуточный продукт 1)

ПС-1

Стадия 1: 2-(((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)метил)бензойная кислота

К раствору 2-[(метиламино)метил]бензойной кислоты (7,50 г, 44 ммоль) в 1,4-диоксане (136 мл) и 1 н. гидроксида натрия в воде (182 мл) добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (19,2 г, 88 ммоль). Реакционной смеси давали перемешиваться при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем реакционную смесь упаривали для удаления органического растворителя и доводили рН до 3 с помощью 1 н. HCl. Неочищенный продукт экстрагировали EtOAc (3х). Объединенные органические фазы промывали солевым раствором, сушили (Na2SO4), фильтровали и упаривали. Неочищенное соединение очищали хроматографией на силикагеле (0-50% EtOAc/ДХМ) с получением 2-(((третбутоксикарбонил)(метил)амино)метил)бензойной кислоты (8,88 г, 75%). ЖХМС (АА): m/z=264,l (M-H).

Стадия 2: трет-бутил №[(2-хлоркарбонилфенил)метил]4-метилкарбамат, промежуточный продукт 1.

1-Хлор4,^2-триметилпропениламин (0,52 мл, 4,0 ммоль) медленно добавляли к раствору 2(((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)метил)бензойной кислоты (525 мг, 2,0 ммоль) в ДХМ (16 мл) при

- 50 048725 °С. Затем реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа. Затем реакционную смесь упаривали досуха с получением неочищенного трет-бутил N-[(2хлоркарбонилфенил)метил]-№метилкарбамата (промежуточный продукт 1, 562 мг, 100%).

Пример 2.

трет-Бутил №[[2-(2-хлор-2-оксоэтил)фенил]метил]-№метилкарбамат (промежуточный продукт 2)

ПС-2

Стадия 1: 2-[2-[[трет-бутоксикарбонил(метил)амино]метил]фенил]уксусная кислота.

К раствору 2-(2-(((трет-бутоксикарбонил)амино)метил)фенил)уксусной кислоты (1,50 г, 5,7 ммоль) в ТГФ (20 мл) добавляли йодметан (2,8 мл, 45,2 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь охлаждали до 0°С и 3 порциями добавляли гидрид натрия (60% дисперсия в минеральном масле, 905 мг, 22,6 ммоль). Затем реакционной смеси давали перемешиваться при комнатной температуре в течение 16 часов. Реакционную смесь гасили водой и органический растворитель удаляли путем упаривания. Водную фазу подкисляли до рН 3, используя 1 н. HCl, и неочищенный продукт экстрагировали Et₂O (2x). Объединенные органические фазы промывали солевым раствором, сушили (Na2SO4), фильтровали и упаривали, получая 2-[2-[[трет-бутоксикарбонил(метил)амино]метил]фенил]уксусную кислоту (1,36 г, 86%). ЖХМС (АА): m/z 280,2 (M+H).

Стадия 2: трет-бутил №[[2-(2-хлор-2-оксоэтил)фенил]метил]-Ы-метилкарбамат, промежуточный продукт 2.

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в Примере 1, стадия 2, начиная с 2-[2-[[трет-бутоксикарбонил(метил)амино]метил]фенил]уксусной кислоты (650 мг, 2,33 ммоль) с получением неочищенного промежуточного продукта 2 (693 мг, 100%).

Пример 3.

Изобутоксикарбонил 4-[трет-бутоксикарбонил(метил)амино]бутаноат (промежуточный продукт 3) о

ПС-3

Стадия 1: 4-(((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)метил)бутановая кислота

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в Примере 2, Стадия 1, с использованием 4-(трет-бутоксикарбониламино)бутановой кислоты (2,92 г, 14,4 ммоль) вместо 2-(2-(((трет-бутоксикарбонил)амино)метил)фенил)уксусной кислоты с получением 4-((третбутоксикарбонил)(метил)амино)бутановой кислоты (2,89 г, 93%). ЖХМС (АА): m/z=216,1 (М-Н).

Стадия 2: изобутоксикарбонил 4-[трет-бутоксикарбонил(метил)амино]бутаноат, промежуточный продукт 3.

К раствору 4-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)бутановой кислоты (360 мг, 1,57 ммоль) и триэтиламина (0,24 мл, 1,73 ммоль), растворенных в ДХМ (7 мл) и охлажденных до 0 °С, добавляли по каплям изобутил хлорформиат (0,22 мл, 1,73 ммоль). После добавления реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем смесь упаривали досуха, чтобы получить неочищенный изобутоксикарбонил 4-[трет-бутоксикарбонил(метил)амино]бутаноат (промежуточный продукт 3, 499 мг, 100%).

Пример 4.

Перечисленные ниже соединения были получены, как описано в Примере 3, с заменой 2, 4-(третбутоксикарбониламино)бутановой кислоты исходным материалом, показанным в таблице.

- 51 048725

Таблица 2

Исходный материал	Продукт	Протокол
ноАХА._к;	О О ·, . । . д д X 'Вос Пром. соед.-4
^Η0γΟ О Вос	.Λ^γγΟ о О Вос Пром. соед.-5	Стадия 1 пропущена

Пример 5.

N-{ 9-[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15 aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)2,10-дисульфанилдекагидро-5,8метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Нпурин-2-ил}-2-[(метиламино)метил]бензамид (промежуточный продукт 6)

Стадия 1: трет-бутил [2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Шпурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат

2-Amuho-9-[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклоциклотетрадецин-7-ил]-1,9-дигидро-6Нпурин-6-он в виде соли N, N-диэтилэтанамина (Соединение I-5c, см. PCT/IB2O18/O58846, 160 мг, 0,19 ммоль) растворяли в сухом пиридине и упаривали досуха (3x2 мл), а затем помещали в вакуум на 15 мин. Остаток растворяли в пиридине (3 мл) в атмосфере аргона и добавляли хлортриметилсилан (0,15 мл, 1,13 ммоль). Реакционной смеси оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем с помощью шприца добавляли промежуточный продукт 1 (800 мг, 2,82 ммоль), растворенный в пиридине (3 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере аргона в течение 16 часов. Затем реакционную смесь упаривали досуха, добавляли МеОН (10 мл) и гидроксид аммония (28-30% раствор в воде, 10 мл) и оставляли перемешиваться в течение 30 минут. Реакционную смесь упаривали досуха и остаток растворяли в МеОН (15 мл). Добавляли тригидрофторид триэтиламина (0,12 мл, 0,75 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакционную смесь упаривали досуха, неочищенный остаток адсорбировали на целите и очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии с обращенной фазой (0-50% ACN/водный ацетат триэтиламмония (10 мМ)) с получением трет-бутил [2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8

- 52 048725 метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Нпурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамата в виде соли N, N-диэтилэтанамина (120 мг, 58%). ЖХМС (АА): m/z=897,3 (М+Н). 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD) δ 8,70 (с, 1H), 8,49 (с, 1H), 8,41 (д, J=6,0 Гц, 1H), 7,70 (д, J=7,5 Гц, 1H), 7,58-7,52 (м, 1H), 7,44-7,39 (м, 1H), 7,33 (д, J=7,8 Гц, 1H), 6,85 (д, J=6,0 Гц, 1H), 6,17 (д, J=8,3 Гц, 1H), 5,64-5,58 (м, 1H), 5,49-5,44 (м, 1H), 5,08-5,02 (м, 1H), 4,88-4,78 (м, 1H), 4,76-4,67 (м, 2Н), 4,37-4,21 (м, 3Н), 4,06-4,00 (м, 1H), 3,83-3,74 (м, 1H), 2,82 (с, 3Н), 2,60-2,32 (м, 4Н), 1,54-1,46 (м, 1H), 1,42 (с, 9Н). ³¹Р ЯМР (162 МГц, CD3OD) δ 55,19 (с, 1P), 53,20 (с, 1P).

Стадия 2: N-{9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}-2-[(метиламино)метил]бензамид, промежуточный продукт 6.

трет-Бутил [2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат в виде соли N, N-диэтилэтанамина (50 мг, 0,045 ммоль) добавляли в круглодонную колбу и охлаждается до 0 °С. Затем через шприц добавляли раствор трифторуксусной кислоты (0,24 мл, 3,2 ммоль) и ДХМ (0,58 мл) и реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 30 минут. Затем реакционную смесь упаривали досуха и помещали под вакуум на 2 часа, чтобы получить промежуточный продукт 6 в виде 2,2,2трифторацетатной соли (41 мг, 100%). ЖХМС (АА): m/z 797,1 (М+Н).

Пример 6.

4-{ [(2S)-2-{ [(2S)-2-{ [6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-Ш-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил [2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси-2,10диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат, соединение 1 (С-1).

- 53 048725

Стадия 1: 4-['[(^)-2-(['(^)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил [2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-rHgpoKCH-2,10-gHOKCHgo-14-(nHpHMHдин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Н-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат, промежуточный продукт 7

К раствору трет-бутилоксикарбонил-валил-аланил-(4-аминобензил)-(4-нитрофенил)карбоната (58 мг, 0,10 ммоль) и 4-диметиламинопиридина (12 мг, 0,10 ммоль) в ДМФА (0,38 мл) и триэтиламине (0,055 мл, 0,40 ммоль) добавляли раствор Промежуточного продукта 6 (45 мг, 0,05 ммоль) в ДМФА (1,5 мл) при комнатной температуре. Реакционной смеси давали перемешиваться при комнатной температуре в течение 15 минут. Добавляли целит и смесь упаривали досуха. Неочищенный остаток, абсорбированный на целите, очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии с обращенной фазой (0-40% ACN/водный ацетат триэтиламмония (10 мМ)) с получением 4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил [2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Шпурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамата в виде соли N, N-диэтилэтанамина (Промежуточный продукт 7, 10 мг, 16%). ЖХМС (АА): m/z=1216,3 (М+Н). ¹Н ЯМР (400 МГц, CD3OD) δ 8,70 (с, 1H), 8,43 (шир. с, 1H), 8,40 (д, J=5,9 Гц, 1H), 7,70 (д, J=7,5 Гц, 1H), 7,56-7,46 (м, 3Н), 7,42-7,38 (м, 1H), 7,32-7,19 (м,

3Н), 6,84 (д, J=5,5 Гц, 1H), 6,15 (д, J=7,3 Гц, 1H), 5,62-5,56 (м, 1H), 5,54-5,48 (м, 1H), 5,08-5,02 (м,1H),

5,04 (с, 2Н), 4,88-4,83 (м, 1H), 4,81-4,76 (м, 2Н), 4,53-4,47 (м, 1H), 4,37-4,22 (м, 3Н), 4,08-4,03 (м,1H),

3,92-3,89 (м, 1H), 3,82-3,74 (м, 1H), 2,88 (с, 3Н), 2,58-2,30 (м, 4н), 2,10-2,03 (м, 1H), 1,54-1,47 (м,1H),

- 54 048725

1,46-1,44 (м, 3Н), 1,44 (с, 9Н), 0,98 (д, J=6,8 Гц, 3Н), 0,93 (д, J=6,8 Гц, 3Н). ³¹Р ЯМР (162 МГц, CD3OD) δ 55,01 (с, 1P), 53,03 (с, 1P).

Стадия 2: 4—{[(2S)—2—{[(2S)—2—амино—3—метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил [2-({9[(2R,5R,7R, 8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7 ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Н-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат, промежуточный продукт 8

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в Примере 5, Стадия 2, с использованием Промежуточного продукта 7 (10 мг, 0,008 ммоль) вместо трет-бутил[2-({9[(2R,5R,7R, 8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7 ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Н-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамата и перемешиванием при комнатной температуре в течение 10 минут с получением 4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-амино-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил [2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента [1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамата в виде 2,2,2-трифторацетатной соли (промежуточный продукт 8, 9 мг, 100%). ЖХМС (АА): m/z=1116,3 (М+Н).

Стадия 3: 4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}-3-метилбутаноил]амино}про-паноил]амино}бензил[2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат, соединение С-1.

К раствору промежуточного продукта 8 (8 мг, 0,007 ммоль) и \-сукцинимидил-6малеимидогексаноата (3,1 мг, 0,010 ммоль) в ТГФ (0,20 мл) и ДМФА (0,10 мл) добавляли по каплям N, N-диизопропилэтиламин (2,5 мкл, 0,014 ммоль) Реакционной смеси давали перемешиваться при комнатной температуре в течение 1 часов. Затем реакционную смесь упаривали досуха и неочищенный остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии с обращенной фазой (0-100% ACN/водный ацетат аммония (10 мМ)) с получением 4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1ил)гексаноил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил[2-({9[(2R,5R,7R, 8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7 ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамата в виде аммониевой соли (С-1, 4,2 мг, 45%). ЖХМС (АА): m/z=1309,4 (M+H). MCBP (m/z): [M+H]⁺ вычисл. для C₅₅H6₆N₁₂O₁₈P₂S₂1309,3607; найдено, 1309,3639.

Пример 7.

2-[трет-Бутоксикарбонил(метил)амино]этил карбонохлоридат (Промежуточный продукт 9) трифосген

DIPEA, THF

CI^O'^^x^'^N'Boc пс-9

Стадия 1: 2-[трет-бутоксикарбонил(метил)амино]этил карбонохлоридат, Промежуточный продукт 9

К раствору трет-бутил №(2-гидроксиэтил)-№метилкарбамата (296 мг, 1,69 ммоль) в ТГФ (4,2 мл) и N, N-диизопропилэтиламина (1 мл, 5,9 ммоль) медленно добавляли охлажденный до 0°С трифосген (752 мг, 2,53 ммоль). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа. Реакционную смесь фильтровали, твердые вещества промывали ТГФ и фильтрат упаривали досуха с получением неочищенного 2-[трет-бутоксикарбонил(метил)амино]этил карбонохлоридата (промежуточный продукт 9, 402 мг, 100%).

Пример 8.

[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(трет-Бутоксикарбониламино)-3-метилбутаноил]амино] пропаноил]амино] фенил]метил N- [(2-хлоркарбонилфенил)метил]-№метил-карбамат (промежуточный продукт 10)

- 55 048725

Стадия 1: 2-[[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-3-метилбутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метоксикарбонил-метил-амино]метил]бензойная кислота.

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в Примере 6, Стадия 1, исходя из 2-[(метиламино)метил]бензойной кислоты HCl (150 мг, 0,72 ммоль) вместо Промежуточного продукта 6. После очистки хроматографией на силикагеле (0-25% МеОН/ДХМ) была получена 2-[[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-3-метилбутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метоксикарбонил-метил-амино]метил]бензойная кислота (306 мг, 67%). ЖХМС (АА): m/z=583,4 (MH).

Стадия 2: [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-3-метил-бутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метил N- [(2-хлоркарбонилфенил)метил]-У-метил-карбамат, Промежуточный продукт 10.

К раствору 2-[[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-3-метилбутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метоксикарбонил-метил-амино]метил]бензойной кислоты (295 мг, 0,50 ммоль) в ТГФ (1,5 мл), охлажденного до 0 °С, добавляли оксалилхлорид (2,0 М раствор в ДХМ, 0,25 мл, 0,50 ммоль), а затем 3 капли ДМФА. Реакционной смеси давали перемешиваться при 0°С в течение 45 минут. Затем смесь упаривали досуха, чтобы получить неочищенный Промежуточный продукт 10 (304 мг, 100%).

Пример 8А.

4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил(4-хлор-4-оксобутил)метилкарбамат.

(Промежуточный продукт 34)

Стадия 1: метил 4-[{[(4-{[(^)-2-({(^)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил] амино } бензил)окси] карбонил } (метил)амино]бутаноат.

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в примере 6, стадия 1, исходя из метил 4-(метиламино)бутаноата HCl (1,44 г, 8,16 ммоль) вместо промежуточного продукта 6. После очистки хроматографией на силикагеле (0-70% EtOAc/ДХМ) получали метил 4-[{[(4{[(2S)-2-({(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил)окси] карбонил}(метил)амино]бутаноат (3,45 г, 92%). ЖХМС (АА): m/z=549,3 (M-H).

Стадия 2: 4-[{[(4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил)окси] карбонил}(метил)амино]бутановая кислота.

К раствору метилового эфира 4-[{[(4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил)окси] карбонил}(метил)амино]бутаноата (3,45 г, 6,27 ммоль) в ТГФ (40,7 мл) и воде (20,3 мл) добавляли моногидрат гидроксида лития (657 мг, 15,7 ммоль) при 0°С. Затем гомогенную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 2 ча

- 56 048725 сов. Эту реакционную смесь охлаждали до 0°С и соляной кислотой (1,0 моль/л в воде, 1,83 мл). Доводят эту смесь до рН < 4, добавляя дополнительно 1н. HCl. Этот раствор нагревали до комнатной температуры и разбавляли EtOAc и водой. Водную фазу дополнительно экстрагировали EtOAc. Объединенные органические фазы промывали рассолом и сушили над сульфатом магния. После фильтрации и удаления растворителей остаток очищали хроматографией на силикагеле (0-10% MeOH/EtOAc). Удаление растворителей дает 4-[{[(4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил)окси] карбонил}(метил)амино]бутановую кислоту (3,17 г, 94%) в виде белого твердого вещества. ЖХМС (АА): m/z=535,3 (M-H).

Стадия 3: 4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил(4-хлор-4-оксобутил)метилкарбамат.

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в Примере 8, стадия 2, начиная с 4-[{[(4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил)окси]карбонил}(метил)амино]бутановой кислоты (387 мг, 0,721 ммоль) вместо 2-[[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-3метилбутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метоксикарбонилметиламино]метил]бензойной кислоты с получением сырого промежуточного продукта 34 (400 мг, 100%) при упаривании реакционной смеси.

Пример 9.

4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил [2-({9-[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2Д0-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1H-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат (промежуточный продукт 7)

О

Соединение I - 5с

3. NEt_r3HF. МеОН

4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил [2-({9-[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1H-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат, промежуточный продукт 7

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в Примере 5, Стадия 1, заменяя трет-бутил-№[(2-хлоркарбонилфенил)метил]-Ы-метилкарбамат (Промежуточный продукт 1) Промежуточным продуктом 10. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэшхроматографии с обращенной фазой (0-50% ACN/водный бикарбонат аммония (5 мМ)) с получением Промежуточного продукта 7 в виде соли аммония. Затем материал растворяли в МеОН (2 мл) и добавляли триэтиламин (5 мл). Смесь встряхивали в течение 1 мин, удаляли растворители и лиофилизировали в течение ночи с получением 4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил] амино } бензил [2-({9-[(2R,5R,7R, 8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамата в виде соли N, N-диэтилэтанамина (147 мг, 48%). ЖХМС (АА): m/z=1216,3 (М+Н). ¹Н ЯМР идентичен примеру 6, стадия 1.

- 57 048725

Пример 10.

4-{[(^)-2-({(^)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино} бензил [2-(хлоркарбонил)бензил]2,5,8,11-тетраоксатридекан-13-илкарбамат (промежуточный продукт 11)

Стадия1: 2-(2,5,8,11-тетраокса-14-азапентадекан-15-ил)бензойная кислота.

К раствору 2-карбоксибензальдегида (1,10 г, 7,3 ммоль), растворенного в МеОН (15 мл), добавляли 2,5,8,11-тетраоксатридекан-13-амин (1,82 г, 8,8 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при к.т. в течение 1 ч. Затем медленно порциями добавляли боргидрид натрия (139 мг, 3,7 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь гасили, добавляя ацетон (0,65 мл), а затем упаривали досуха. Неочищенный остаток очищали хроматографией на силикагеле (0-25% МеОН/ДХМ) с получением 2-(2,5,8,11-тетраокса-14-азапентадекан-15-ил)бензойной кислоты (2,25 г, 87%). ЖХМС (АА): m/z=342,3 (M+H).

Стадия 2: 2-(14-{[(4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил)окси] карбонил}-2,5,8,11 -тетраокса-14-азапентадекан- 15-ил)бензойная кисло та

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в примере 6, Стадия 1, исходя из 2-(2,5,8,11-тетраокса-14-азапентадекан-15-ил)бензойной кислоты (764 мг, 2,24 ммоль) вместо Промежуточного продукта 6 с использованием ДХМ в качестве растворителя и перемешивая в течение 16 часов. После очистки хроматографией на силикагеле (0-25% МеОН/ДХМ) получали 2-(14-{[(4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил)окси] карбонил}-2,5,8,11-тетраокса-14-азапентадекан-15-ил)бензойную кислоту (855 мг, 47%). ЖХМС (АА): m/z=759,4 (M-H).

Стадия 3: 4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил [2-(хлоркарбонил)бензил]2,5,8,11-тетраоксатридекан-13-илкарбамат, промежуточный продукт 1.1

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в Примере 8, стадия 2, исходя из 2-(14-{[(4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил)окси] карбонил}-2,5,8,11-тетраокса-14-азапентадекан-15-ил)бензойной кислоты (591 мг, 0,777 ммоль) вместо 2-[[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-3метилбутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метоксикарбонил-метил-амино]метил]бензойной кислоты с получением сырого Промежуточного продукта 11 (605 мг, 100%) при упаривании реакционной смеси.

Пример 11.

Соединения, перечисленные ниже в табл. 3, получали, как описано в Примере 5, заменяя третбутил-Ы-[(2-хлоркарбонилфенил)метил]-Ы-метилкарбамат (Промежуточный продукт 1) исходным материалом, показанным в таблице.

- 58 048725

Таблица 3

Исходный материал	Продукт	Аналитические данные
^С1ГП о _г И -^Л'- Вос Пром. соед.-2 10 экв. используется на Стадии 1	⁰ < tlT 1 X) θ'· 1 Ο ’ϊ Ν -'Χ-'-'ΧΧ » у 4 н 1 / \ j / ΝΗ Ν οΊ ^Η<^ Λ ⁽ f Τ Ό^ρ/ HS' ^υ Пром. соед.-12	ЖХМС (АА): m/z=811,2 (М+Н)
О 0 \| 'Вос Пром. соед.-З 6 экв. используется на Стадии 1	О о^р-о-дД-1_н+_йЛ.^мн nJ НО б О ^ν% HS ^υ Пром. соед.-13	ЖХМС (АА): m/z=749,2 (М+Н)
О о , , I ^хаХч 0 О Вос Пром. соед.-4 6 экв. используется на Стадии 1	0 о -5Н //^NJ~NH 0,, I Ух VLxxKA ⁰ VO.) N N ГА \ / N. ,0⁴^ ^Н°^е Р Ao HS ^и Пром. соед.-14	ЖХМС (АА): m/z=777,2 (М+Н)
^°т°тА О О Вос Пром. соед.-5* 8 экв. используется на Стадии 1	0 о. -^SH ДуАн о 'Р-п \,Л Ά A, - о '_Ν Ν^Αγ^_> /•-\ \_х нгхУ К И 4 i 1 х ---1 £ ί У г у ^но/° nJ 'J HS' ^u Пром. соед.-15	ЖХМС (АА): m/z=747O (М+Н)
DMB : А X Вос о Г ¥% д 1 А ^н ^α IL L Пром. соед.-24 6 экв. используется на Стадии 1	Ϊ ^н ' „ SH ^N У, NH О r’^N'H^'NH- Р-0 1 J. б ‘ 3 YJ ^N г V J _N . 1 ^Ηθ ί О H S' ⁰ Пром. соед.-16	ЖХМС (АА): m/z=854,l (М+Н)

* На стадии 2 для стадии снятия защиты использовали 4М HCl в 1,4-диоксане с метанолом в качестве растворителя.

- 59 048725

Пример 12.

N-{9-[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15R,15aR,16R)-15-фтор-7-(5-фтор-4-оксо-3,4-дигидро-7Нпирроло[2,3А]пиримидин-7-ил)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-2,10-дисульфанилоктагидро-12Н-5,8метанофуро[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-14-ил]-9Н-пурин-6-ил }-4(метиламино)бутанамид (промежуточный продукт 17)

Стадия 1: трет-бутил [4-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-фтор-7-(5-фтор-4-оксо3,4-дигидро-7Н-пирроло[2,3А]пиримидин-7-ил)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-2,10-дисульфанилоктагидро-12Н-5,8-метанофуро[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-14-ил]-9Н-пурин-6ил}амино)-4-оксобутил]метилкарбамат.

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в примере 5, Стадия 1, с использованием 7-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-14-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-15фтор-16-гидрокси-2,10-диоксидо-2,10-дисульфанилоктагидро-12Н-5,8-метанофуро[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-5-фтор-3,7-дигидро-4Н-пирроло[2,3А]пиримидин-4-она в виде натриевой соли (Соединение № 14, см. WO2018100558A2, 200 мг, 0,265 ммоль) и Промежуточного продукта 3 (503 мг, 1,59 ммоль) вместо 2-амино-9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси-2,10диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-1,9-дигидро-6Н-пурин-6-она и промежуточного продукта 1 соответственно. Очистка с помощью колоночной флэш-хроматографии с обращенной фазой (0-50% ACN/водный бикарбонат аммония (5 мМ)) давала трет-бутил [4-({9[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15R, 15aR, 16R)-15-фтор-7-(5-Фтор-4-оксо-З,4-дигидро-7Н-пирроло[2,ЗА]пиримидин-7-ил)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-2,10-дисульфанилоктагидро-12Н-5,8-метанофуро[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-14-ил]-9Н-пурин-6-ил}амино)-4-оксобутил]метилкарбамат в виде аммониевой соли (148 мг, 59%). ЖХМС (АА): m/z=910,5 (М+Н). ¹Н ЯМР (400 МГц, D2O) δ 8,70 (с, 1H), 8,34 (с, 1H), 8,01 (с, 1H), 7,28 (с, 1H), 6,56 (д, J=16,1 Гц, 1H), 6,43 (д, J=8,4 Гц, 1H), 5,67 (дд, J=51,0, 3,9 Гц, 1H), 5,18-4,99 (м, 2Н), 4,82-4,77 (м, 1H), 4,63-4,58 (м, 1H), 4,49-4,38 (м, 3Н), 4,314,25 (м, 1H), 4,12-4,06 (м, 1H), 3,43-3,36 (м, 2Н), 2,88 (с, 3Н), 2,73-2,68 (м, 2Н), 2,04-1,97 (м, 2Н), 1,34 (с, 9Н). ³¹Р ЯМР (162 МГц, D2O) δ 55,47 (с, 1P), 52,07 (с, 1P). ¹⁹F ЯМР (376 МГц, CD3OD) δ -165,50 (м, 1F), -203,45 (м, 1F).

Стадия 2: N-{9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-фтор-7-(5-фтор-4-оксо-3,4-дигидро7Н-пирроло[2,3А]пиримидин-7-ил)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-2,10-дисульфанилоктагидро-12Н-5,8метанофуро[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-14-ил]-9Н-пурин-6-ил } -4-(метиламино)бутанамид, промежуточный продукт 17.

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в Примере 5, стадия 2, с использованием трет-бутил [4-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-фтор-7-(5фтор-4-оксо-3 ,4-дигидро-7Н-пирроло [2,3 А]пиримидин-7-ил)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-2,10-дисульфанилоктагидро-12Н-5,8-метанофуро[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-14-ил]-9Нпурин-6-ил}амино)-4-оксобутил] метилкарбамата в виде соли аммония (42 мг, 0,045 ммоль) вместо третбутил [2-({9-[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Н-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамата и перемешивание при комнатной температуре в течение 30 минут. N-{9[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15R, 15aR,16R)-15-Фтор-7-(5-фтор-4-оксо-3 ,4-дигидро-7Н-пирроло[2,З

- 60 048725

d]пиримидин-7-ил)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-2,10-дисульфанилоктагидро-12Н-5,8-метанофуро[3,21][1,3,6,9,11,2,10] пентаоксадифосфациклотетрадецин-14-ил] -9Н-пурин-6-ил}-4-(метиламино)бутанамид был получен в виде 2,2,2-трифторацетатной соли (промежуточный продукт 17, 41 мг, 100%). ЖХМС (АА): m/z=810,2 (M+H).

Пример 13.

Соединения, перечисленные ниже в табл. 5, получали, как описано в Примере 12, заменяя изобутоксикарбонил 4-[трет-бутоксикарбонил(метил)амино]бутаноат (Промежуточный продукт 3) исходным материалом, показанным в табл. 4.

Таблица 4

Исходный материал	Продукт	Аналитические данные
О \| Пром. соед.-9* 15 экв. используется на Стадии 1	Пром. соед.-18	ЖХМС (АА): m/z=812,l (М+Н)
С1''^ЛлА^г*''1 - о ТО н ; н Н zrx χΝν A·. A Г ,·ί^ уд дк Ν зГ Boe Η η 1 Ο ,χΎ Пром. соед.-10 6 экв. используется на Стадии 1	Пром. соед.-31	ЖХМС (АА): m/z^l 177,1 (М+Н)
н I S н и । ГПГ ]Г Y Y _c\|A/^yYJ θ ' О Пром. соед.-34 6 экв. используется на Стадии 1	Пром. соед.-35	ЖХМС (АА): ш/2^1129,2 (М+Н)

* На стадии 2 для стадии снятия защиты использовали 4М HCl в 1,4-диоксане.

- 61 048725

Таблица 5

Продукт	Структура
Пром, соед,- 18	X \ — / , \ Энр О / '-'СЛ X / Ох сл,. / X .....Ζ о^С.Т θ θ''' 4/+⁷¹ ~Z ϊ=θ
Пром, соед,- 31	F 0 O SH ^F. u z^p\ Si’ 'nh F o 0 \ J ] ΛΛ V³ / ^N /^NY> \ Η ό ά их „ ΜΑ ^HS'⁰ О J р Y й J jQyA ⁰ НА ¥ α -
Пром, соед,- 35	ο ^{SH F} 1 P NII Ц V? N iQ N _N < a = i II ¹ θ^^0Η0 ⁰ T ^N % JL n JL. ,JL J I о ΗζΝ'γ' γΉΆ^ 0 *

- 62 048725

Таблица 6

Исходный материал	Продукт	Аналитические данные
о _n ЗН Д'-if ''NH О (АХ 'P-η b J । L L ϊ \·^ ^Ν'^; Ή ' Т о Уч Чн N 0 1 ^Но р ¹ О Άζ V HS' О Пром. соед.-12	С-2	ЖХМС (АА): m/z=1323,4(M+H); МСВР (m/z): [М+Н]⁺вычисл. для C56H68N12O18P2S2 1323,3764; найдено, 1323,3790.
о _п SH PxfSffl 0 \| A. Jk J g ,Ν^,Ο 1 ^но p О HS' ^и Пром. соед.ЛЗ*	С-3	ЖХМС (АА): m/z=1261,4(M+H); МСВР (m/z): [М+Н]⁺вычисл. для C₅1H₆₆N12O18P2S2 1261,3607; найдено, 1261,3630.
°'^;?н Vjl 7γ \ V Ο NH HN— γ • о Пром. соед.-18	С-4	ЖХМС (АА): m/^1324,1 (М+Н); МСВР (m/z): [М+Н]⁺вычисл. для C51H61F2N13O19P2S2 1324.3164; найдено, 1324.3186.

* На стадии 2 к реакционной смеси добавляли п-крезол в соотношении 2:1 (п-крезол:ТФУ).

Таблица 7

Продукт	Структура
С-2	0 о -SH 0 АХ А_о (JI 1 L J 0' \ 0 -χΑΖγ ₀ Z-A \ 7 ^H k Д Λ Λ A А нМ να-να 0 _H v 9 Ya z -54 \ / N у if N (I О °X ^H * I и ь

- 63 048725

Соединение, указанное в табл. 8 (Промежуточный продукт 19), получали, как описано в примере 6, стадия 1, заменяя трет-бутилоксикарбонил-валил-аланил-(4-аминобензил)-(4-нитрофенил)карбонат исходным материалом, показанным в таблице.

Таблица 8

Исходный материал	Продукт	Аналитически e данные
ОуМН₂ НН^ Н = 9 Н Α\|Γ^νυ^χ'η J ^Ν'^Βκо ^н А ⁰	о °γ^ΝΗ2 (Й А О' 107 ^{N N} lA u - θ u ? V^u4 η h r η h R Й ) ί I Y if π N Boc i¥A₀ ^H0/ -Y-O о ^H A nA Ao ⁰ Пром. соед.-19	ЖХМС (АА): m/z= 1302,4 (М+Н)

Пример 16.

Соединение, указанное в табл. 10, получали, как описано в примере 6, стадии 2 и 3, заменяя промежуточный продукт 7 исходным материалом, показанным в табл. 9.

Таблица 9

Исходный материал	Продукт	Аналитические данные
₀ °γ^ΝΗ2 _оа е 1Й^н i “Ί О ί П w N N tj _u % 0 ί, I Η H » 81 H О „Н i '' । 'fl 'й Г Л..О I HO 0 ζΝγΑν^{1 0} A. ί A A „/ Y nA °Ά ⁰ HS' ^u Пром. соед.-19	С-5	ЖХМС (АА): m/z=1395,2(M+H); МСВР (m/z): [М+Н]⁺ вычисл. ДЛЯ C58H72N14O19P2S2 1395,4088; найдено, 1395,4125.

- 64 048725

Таблица 10

Пример 17.

Соединения, перечисленные в табл. 12, получали, как описано в Примере 6, Стадия 3, заменяя Nсукцинимидил-6-малеимидогексаноат исходным материалом, показанным в табл. 11.

Таблица 11

Исходный материал	Продукт	Аналитические данные
г ⁰ 0 о	С-6	ЖХМС (АА): m/z=1431,2(M+H); МСВР (m/z): [М+Н]⁺ вычисл. ДЛЯ C66H72N12O17P2S2 1431,4128; найдено, 1431,4153.

- 65 048725

о. о о V-\ / \/ Η к. κζ^н	С-7	ЖХМС (АА): m/z=726,3 (М/2+Н); HRMS (m/z): [М+Н]⁺вычисл. для СбзНзоИ 12O20P2S2 1451.4601; найдено, 1451.4608.
Ό θκ 4~f ° Va у-^Ν 4 0 0	С-8	ЖХМС (АА): m/z=1487,2(M+H); МСВР (m/z): [М+Н]⁺ вычисл. ДЛЯ СбгНзоХ 12O23P2S2 1487,4449; найдено, 1487,4474.
ΖΡ ο oV\	С-9	ЖХМС (АА): m/z=913,9 (М/2+Н)
0 Ο^ΝΗ 0 К.,+х„л4-о._и J ΚΙ о К/ 0 ο Пром. соед.-20	С-10	ЖХМС (АА): m/z=1586,0(M+H); МСВР (m/z): [М+Н]⁺ вычисл. ДЛЯ C67H89N13O24P2S2 1586,5133; найдено, 1586,5150.

- 66 048725

^{н н} °	С-11*	ЖХМС (АА): ш/2^1715,8 (М+Н)
„о о, /Ύ о Ад \Jl ЛА А /f '0 0 0	С-12	ЖХМС (АА): nVz= 1253,3 (М+Н)
s Z, л ζθ /А 2 н 9 1 \\ +—Χ,Α,Λ^Η, JI J ΐ-Ζ N γ /к ι L Д н о 'да s°l5 Пром. соед.-27	С-13	ЖХМС (АА): m/z^920,9 (М/2+Н); МСВР (m/z): [М+Н]⁺вычисл. для C83H104N14O26P2S2 1839.6236; найдено, 1839.6307.
₀ζ·«^^0_{4 0 н} н/Д кА 1 ^н/ N Д Пром. соед.-Зб	С-35	ЖХМС (АА): nVz= 1726,3 (М-Н); МСВР (m/z): [М+Н]⁺ вычисл. ДЛЯ C75H103N13O26P2S2 1728.6127; найдено, 1728.6148
ΟΎ ₀-Д ₀Д оД J о^Д ^οχχΊ θΑ А 0 hnAd о °у^ Χ_Ν^γΑ^χ^_Ν Аа у Ак о ^н о 0 Пром. соед.-40	С-39	ЖХМС (АА): m/z= 1775,8 (М+Н); МСВР (m/z): [М+Н]⁺вычисл. для C75H104N14O28P2S2 1775.6134; найдено, 1775.6138.

- 67 048725 * Использовали триэтиламин в качестве основания вместо N, N-диизопропилэтиламина.

Таблица 12

- 68 048725

С-8	0 о -^{SH ΝΗ 0} °''ρ\_η < J J I °' °Ί 0 1 'тЛ'уА Η - ⁰ и 0 υΛ 9 5хгГ«УГ'°^⁰^⁰^⁰~⁰^ р V/ ΐ US' °
С-9	ο. *? А° д Q Μ “ ⁰ Η Η ⁰ Г³» . Л .·- . ·, f J W ϊ..... HS' ⁰
С-10	< τ^τ ι S °' Ί О . ο Ο^ΝΗ 0 η и ^й AJ ^VnV>A^nA ,Ν„Ο °/ ^γΟ'.-Μ Λ ’ +2 Ο °-4 ϊ
С-11*	’•α «Ά a ? Ά°·ΐ ^Ν ίΐ ΑΊι η ? « η η ^иа ) Ν„ο Ί «5 4 ..γΟ-^ΧΑ ϊ ” Д, 4 <Γ 1J po ϊ

- 69 048725

С-12	0 о SH /-γ^’ΝΗ О Ап .1 ϊί л ν ДА А- да,YxU N .Al А О ^Н Д оА U ϊ ⁰ Hi ⁰
С-13	n S 9 о. . _n Д > г 5 ΆΑ-Λ-'Α V' « J .11 . ,Β Ϊ В ΐ ’ А » 11 η.; о .» о j: ί J ί з - i 1 ^ϋ f ., ί _H<. ‘J
С-35	Q -4^·--Q χ 0 %% е j[A^H £ Ί θ н Г И ^Ν «Vl a i iW^r Ο Η Γ^ [Ar γ^Λ''Ν^Λτ^ηΑ ° A l НО 0 J _o rj 0 H I J [I T o—Pt Y NA HS' ⁰ °
С-39	0 о ~^SH /ii nh ° °A °A °A °A Λ-^ΡΌ, SAkA..A^\ J oA О A oA Д Д A ¹ JO 'JU. X »A ГД У-< ДЧ-^ A y о _H hnA о A \ ^нб/ zAoJU ЛЛ^ IJ °A s ^н ΛI ^н о HS' ^u

Пример 18.

Соединения, перечисленные в табл. 14, получали, как описано в Примере 6, стадии 2 и 3, заменяя Промежуточный продукт 7 и Асукцинимидил-6-малеимидогексаноат соответственно исходными материалами, показанными в табл. 13.

- 70 048725

Таблица 13

Исходный материал на Стадии 2	Исходный материал на Стадии 3	Продукт	Аналитические данные
Пром. соед.-19	°.ч Г У-²' О Д—\ dy ^N 1	C-14	ЖХМС (AA): m/z^759,5 (M/2+H); MCBP (m/z): [M+H]⁺вычисл. для C69H78N14O18P2S2 1517.4608; найдено, 1517.4635.
Пром. соед.-19	н 0 ο °V-A Cz^{h H}	C-15	ЖХМС (AA): m/z^769,8 (M/2+H); MCBP (m/z): [M+H]⁺вычисл. для CeeHseN 14O21P2S2 1537.5081; найдено, 1537.5120.
Пром. соед.-21	0 0 b о'	C-16	ЖХМС (АА): m/z=1485,3(M+H); MCBP (m/z): [М+Н]⁺ вычисл. ДЛЯ C63H82N12O22P2S2 1485,4656; найдено, 1485,4680.

- 71 048725

Пром. соед.-21	о о ,^_О-Д_М γ 1 \с_ н л	С-17	ЖХМС (АА): m/z=l 627,2 (М+Н)
Пром. соед.-28*	О Д	С-18	ЖХМС (АА): m/z=1718,3(M+H); МСВР (m/z): [М+Н]⁺ вычисл. ДЛЯ C73H101N13O27P2S2 1718,5919; найдено, 1718,5936.
Пром. соед.-29	О О U i >-/ о (У	С-19	ЖХМС (АА): m/z=1789,0(M+H); МСВР (m/z): [М+Н]⁺ вычисл. ДЛЯ C76H106N14O28P2S2 1789,6290; найдено, 1789,6286.
Пром. соед.-31**	/° О. γγ о γ-Ά γΝ^._ο^Ο^_ο^Ο^_οΛΥΙ_ο._Νγ 0 О	С-32	ЖХМС (АА): m/z= 1547,9 (М+Н); МСВР (m/z): [М+Н]⁺ вычисл. ДЛЯ C63H77F2N13O23P2S 2 1548.4213; найдено, 1548.4236.

- 72 048725

Пром. соед.-ЗЗ	,0 0, 0 0	С-33	ЖХМС (АА): nVz= 1498,3 (М+Н); МСВР (m/z): [М+Н]⁺ вычисл. ДЛЯ C₆2H₇₇FNi₅O₂₂PS₂1498.4603; найдено, 1498.4604.
Пром. соед.-38	0 0 Χ_Ν Α^ζχ/\Ζ'··· у -'у VA о λ-ί Ό с	С-36	ЖХМС (АА): m/z=1659,l (М-Н); МСВР (m/z): [М+Н]⁺ вычисл. ДЛЯ C₇iH9sNi₂O₂6P₂S₂1661.5705; найдено 1661.5759.
Пром. соед.-31**	.0 Ок 0 X А. А. Ж Ν.Ζ ⁰ 0 Пром. соед.-39	С-38	ЖХМС (АА): nVz= 1777,6 (М-Н); МСВР (m/z): [М+Н]⁺ вычисл. ДЛЯ C₇₄H₉₈F₂N mO₂₇P₂S 2 1779.5683; найдено, 1779.5716.
Пром. соед.-29	о υ Ζ“~-η· ' О г'^’⁴ ^л 1 i ·. ' ^N. Ж N ' Г ' ⁰ ’1 0 0	С-40	ЖХМС (АА): m/z=1731,4 (М-Н); МСВР (m/z): [М+Н]⁺ вычисл. для;? найдено,?.

- 73 048725

Пром. соед.-38	.0 А' ? V'/ \ ,Ν Ж Ν. Z у 0 Д 0 ό	С-41	ЖХМС (АА): m/z=1605,4 (М+Н); МСВР (m/z): [М+Н]⁺ вычисл. ДЛЯ C67H90N12O26P2S2 1605.5079; найдено, 1605.5148
Пром. соед.-41	А W 0 уА О 0	С-42	ЖХМС (АА): m/z=1542,l (М-Н); МСВР (m/z): [М+Н]⁺ вычисл. для C64H83N13O24P2S2 1544.4663; найдено, 1544.4722.
Пром. соед.-31**	о °Д'\ 0 Ο^ΝΗ О °χ/^χ _ο ^ζΚ'°χ/4^ζ Пром. соед.-44	С-45	ЖХМС (АА): m/z= 1777,5 (М-Н).

* Использовали триэтиламин в качестве основания вместо N, N-диизопропилэтиламина.

** стадия 2 в примере 6 была пропущена.

- 74 048725

Таблица 14

- 75 048725 но ϋ о

о

HS ³¹Р ЯМР (162 МГц, Метанол-ф) δ ppm 52,93 (с, 1 Р) 54,97 (с, 1 Р).

о м 11

ЬН NH О

P-tJ mJ -J U о Д ,- N 'N N

Ή ЯМР (400 МГц, Метанол-сЦ) δ ppm 0,97 (т, J=7,15 Гц, 6 Н) 1,24-1,40 (м, 2 Н) 1,45 (д, J=7,09 Гц, 3 Н) 1,55-1,88 (м, 5 Н) 2,13 (м, 1 Н) 2,25-2,40 (м, 1 Н) 2,44-2,62 (м, 5 Н) 2,89 (с, 3 Н) 3,35 (с, 3 Н) 3,46 (т, J=7,03 Гц, 2 Н) 3,50-3,57 (м, 2 Н) 3,62 (м, 28 Н) 3,67-3,83 (м, 3 Н) 3,98-4,08 (м, 1 Н) 4,18 (д, J=6,97 Гц, 1 Н) 4,22-4,40 (м, 4 Н) 4,48 (д, J=7,09 Гц, 1 Н) 4,78 (м, 2 Н) 5,04 (с, 2 Н) 5,455,64 (м, 2 Н) 6,08-6,21 (м, 1 Н) 6,78 (с, 2 Н) 6,83 (д, J=6,11 Гц, 1 Н) 7,12-7,35 (м, 3 Н) 7,35-7,44 (м, 1 Н) 7,45-7,61 (м, 3 Н) 7,70 (уш. д, J=7,58 Гц, 1 Н) 8,40 (д, J=5,99 Гц, 2 Н) 8,70 (с, 1 Н).

- 76 048725

³¹Р ЯМР (162 МГц, Метанол-сЦ) δ ppm 52,26 (с, 1 Р) 56,88 (с, 1 Р)

Ή ЯМР (400 МГц, Метанол-сЦ) δ ppm 0,97 (м, 6 Η) 1,34 (м, 2 Η) 1,47 (д, J=7,09 Гц, 3 Η) 1,52-1,61 (м, 2 Η) 1,63-1,75 (м, 1 Η) 1,77-1,88 (м, 1 Η) 2,112,24 (м, 1 Η) 2,44-2,59 (м, 2 Η) 2,94 (шир. с, 3 Η) 3,35 (с, 3 Η) 3,45 (м, 2 Η) 3,49-3,56 (м, 2 Η) 3,58-3,66 (μ, 28 Η) 3,73 (τ, J=6,05 Гц, 2 Η) 4,01 (дд, J=11,25, 3,42 Гц, 1 Η) 4,20 (д, J=6,85 Гц, 1 Η) 4,29 (с, 1 Η) 4,33-4,59 (м, 5 Η) 4,86 (м, 2 Η) 4,96-5,08 (м, 3 Η) 5,15-5,30 (м, 1 Η) 5,72 (д, J=52,0 Гц, 1 Η) 6,35-6,53 (м, 2 Η) 6,77 (с, 2 Η) 7,09-7,24 (м, 2 Η) 7,26-7,35 (м, 1 Η) 7,38 (с, 1 Η) 7,43-7,59 (м, 4 Η) 7,76 (с, 1 Η) 7,80 (уш. д, J=7,46 Гц, 1 Н) 8,42 (с, 1 Н) 8,62-8,69 (с, 1 Н)

- 77 048725

Р ЯМР (162 МГц, Метанол-сЦ) δ ppm 52,35 (с, 1 Р) 56,91 (с, 1 Р)

Н ЯМР (400 МГц, Метанол-сЦ) δ ppm 0,98 (дд, J=12,90, 6,91 Гц, 6 Н) 1,231,40 (м, 2 Н) 1,47 (д, J=7,21 Гц, 3 Н) 1,58 (м, 2 Н) 1,73 (м, 2 Н) 2,17-2,30 (м, 2

Н) 2,35 (м, 1 Н) 2,91 (с, 3 Н) 3,31 (с, 3 Н) 3,40 (м, 2 Н) 3,46-3,60 (м, 30 Н) 3,97 (дд, J=11,55, 3,36 Гц, 1 Н) 4,12 (д, J=5,62 Гц, 1 Н) 4,19-4,28 (м, 2 Н) 4,30-4,54 (м, 6 Н) 4,83 (м, 2 Н) 4,93-5,07 (м, 3 Н) 5,10-5,25 (м, 1 Н) 5,72 (д, J=52,0 Гц, 1

Н) 6,36-6,48 (м, 2 Н) 6,76 (с, 2 Н) 7,05-7,32 (м, 3 Н) 7,35 (с, 1 Н) 7,38-7,68 (м, 4

Н) 7,75 (с, 1 Н) 7,76-7,83 (м, 1 Н) 8,41 (с, 1 Н) 8,61-8,68 (с, 1 Н)

- 78 048725

Пример 19.

4-{[(^)-2-{[(^)-2-{[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-Ш-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}-3 - метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил [4-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-rugpoKCu-2,10диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфатациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Н-пурин-2-ил}амино)2,2-диметил-4-оксобутил]метилкарбамат, соединение 20 (С-20)

Стадия 1: 4-{ [(2S)-2-{ [(2S)-2- {[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1 H-пиррол-1 -ил)гексаноил] амино }-3метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил [4-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфатациклотетрадецин-7-ил] -6-оксо-6,9-дигидро-1 Н-пурин-2-ил } амино)-2,2-диметил-4-оксобутил]метилкарбамат, соединение 20.

К раствору [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[6-(2,5-диоксопиррол-1-ил) гексаноиламино]-3метилбутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метил (4-нитрофенил) карбоната (47,9 мг,0,037 ммоль) и 1-гидрокси-7-азабензотриазола (4,08 мг, 0,03 ммоль) в ДМФА (0,60 мл) и N, N-диизопропилэтиламина (26 мкл, 0,15 ммоль) добавляли раствор N-{9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси-2,10диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Н-пурин-2-ил}-3,3Диметил-4-(метиламино) бутанамида в виде 2,2,2-трифторацетатной соли (Промежуточный продукт 14, 20 мг, 0,02 ммоль) в ДМФА (0,54 мл) при комнатной температуре. Реакционной смеси давали перемешиваться при комнатной температуре в течение 16 часов. Добавляли целит и смесь упаривали досуха. Неочищенный остаток, абсорбированный на целите, очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии с обращенной фазой (0-100% ACN/водный раствор ацетата аммония (10 мМ)) с получением 4-{[(2S)-2{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил[4-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1H-пурин-2-ил}амино)-2,2-диметил-4-оксобутил]метилкарбамата в виде соли аммония (С-20, 4 мг, 17%). ЖХМС (АА): m/z=1287,4 (M-H).

Пример 20.

Соединения, перечисленные в табл. 16, получали, как описано в Примере 19, заменяя Промежуточный продукт 14 и [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[6-(2,5-диоксопиррол-1-ил)гексаноиламино]-3-метилбутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метил (4-нитрофенил) карбонат соответственно исходными материалами А и В, показанными в табл. 15.

- 79 048725

Таблица 15

Исходный материал А	Исходный материал В	Продукт	Аналитические данные
Пром. соед.-17*	оа/Ч ....... /=° ο	С-21	ЖХМС (АА): m/z= 1322,3 (М+Н); МСВР (m/z): [М+Н]⁺вычисл. для C52H63F2N13O18P2S2 1322.3371; найдено, 1322.3394.
Пром. соед.-17**	' s - s Ο ...от К Пром. соед.-25	С-22	ЖХМС (АА): m/z= 1444,8 (М+Н)
Пром. соед.-17**	Η τ 0 _Η Ο / Λ θ ^Η Α ° 1, ) 1 J ¥ /А 0^-^++ ⁰ Пром. соед.-26	С-23	ЖХМС (АА): т/^1416,8 (М+Н)
Пром. соед.-18**	_γθ JU о ^Η Α ° α+ _ΟΝΟΐ Ο₂Ν '	С-44	ЖХМС (АА): nVz= 1304,4 (М+Н); МСВР (m/z): [М+Н]⁺вычисл. для C50H63N15O19P2S2 1304.3414; найдено 1304.3465.

* В реакции использовали 1-гидроксибензотриазол и триэтиламин вместо 1-гидрокси-7азабензотриазола и N, N-диизопропилэтиламина.

** В реакции использовали 4-диметиламинопиридин и триэтиламин вместо 1-гидрокси-7азабензотриазола и N, N-диизопропилэтиламина.

- 80 048725

Таблица 16

Пример 21.

^-{(^)-6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-Ш-пиррол-1-ил)-1-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-1оксогексан-2-ил}-2,5,8,11,14-пентаоксагептадекан-17-амид (Промежуточный продукт 20)

- 81 048725

Стадия 1: (19S)-19-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)бутил]-17-оксо-2,5,8,11,14пентаокса-18-азайкозан-20-овая кислота.

К раствору 1-[(17-оксо-2,5,8,11,14-пентаоксагептадекан-17-ил)окси]пирролидин-2,5-диона (4,0 г, 10,5 ммоль) в безводном ДХМ (10 мл) добавляли гидрохлорид ^)-2-амино-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидроШ-пиррол-Еил^ексановой кислоты (3,4 г, 12,9 ммоль), растворенный в ДМФА (40 мл), а затем N, Nдиизопропилэтиламин (6,9 мл, 42 ммоль). Реакционной смеси давали перемешиваться при комнатной температуре в течение 18 часов. Реакционную смесь фильтровали и упаривали досуха. Неочищенный остаток очищали препаративной ВЭЖХ с получением (19S)-19-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1ил)бутил]-17-оксо-2,5,8,11,14-пентаокса-18-азайкозан-20-овой кислоты (1,26 г, 24%). ЖХМС (АА): m/z=489,3 (M+H).

Стадия 2: N-{(2S)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-1-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-1-оксогексан-2-ил}-2,5,8,11,14-пентаоксагептадекан-17-амид, промежуточный продукт 20.

К раствору (19S)-19-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1 H-пиррол-1 -ил)бутил]-17-оксо-2,5,8,11,14пентаокса-18-азаикозан-20-овой кислоты (65 мг, 0,133 ммоль) и N, N'-дициклогексилкарбодиимида (30 мг, 0,145 ммоль) в 1,4-диоксане (0,68 мл) добавляли N-гидроксисукцинимид (15,3 мг, 0,133 ммоль) при комнатной температуре. Реакционной смеси давали перемешиваться при комнатной температуре в течение 16 часов. Добавляли целит, и смесь фильтровали, промывали 1,4-диоксаном и упаривали досуха. Неочищенный остаток, абсорбированный на целите, очищали хроматографией на силикагеле (0-10% МеОН/ДХМ) с получением промежуточного продукта 20 (14,6 мг, 19%). ЖХМС (АА): m/z=586,3 (M+H).

Пример 22.

Соединения, перечисленные в табл. 17, получали, как описано в Примере 9, заменяя Промежуточный продукт 10 исходным материалом, показанным в таблице.

- 82 048725

Таблица 17

Исходный материал	Продукт	Аналити
		веские данные
,о. -х z. ΑΑ,αΑ - — о ^ν 'ЛА..... о о А. Пром. соед.-П 6 экв. использовали	н f jj н ⁰ °А (ХХЗГХ 1(^N'®^K _о^н Φ0-ΝΗ 0 ?у°А> 0 X / ° γΧА'Х ° К ' 4 Αν, HS ^υ Пром. соед.-21	ЖХМС (АА): m/z=1392 ,2 (М+Н)
_о/ _о + -JU-XLa 0 1 · >1 i ?, - Пром. соед.-37 6 экв. использовали	। о о +А О-Х 0-4 у 9 н 1 θ н о S fY^NYAV'^B« °0 я χ_γ°·ΆΥ ⁰ о- уу N 01 ^НС^ Я /У К/ Ν Ηί? θ Пром. соед.-38	ЖХМС (АА): m/zA785, 3 (М/2+Н)
у’ Пром. соед.-42 6 экв. использовали	.—0 [ί /° I An / 0 iV “ / ^?Jl°K ci /^'li NH o X ZPX 0 0 Y\ ο'^₽·⁰>ο ν A α_ν Ay. o-Jy Αο-α+Ο _Ν й Л ^Μ ο ί χ Ν-Υ HS' ^υ Пром. соед.-43	ЖХМС (АА): m/z=1923 ,2 (М+Н)

Пример 23.

(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{2-[(3-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}пропаноил)амино]-4-[({[2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Н-пурин-2-ил}карбамоил)бензил](метил)карбамоил}окси)метил]фенокси}-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2Н-пиран-2-карбоновая кислота, соединение 24 (С-24)

- 83 048725

Стадия 1: метил (2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-триaцетокси-6-{2-[(3-{[(9H-флуорен-9unMeTOKCu)kap6oHun]aMUHo}nponaHOun)aMUHo]-4-[({[2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Н-пурин-2-ил}карбамоил)бензил](метил)карбамоил}окси)метил]фенокси}тетрагидро-2Н-пиран-2-карбоксилат.

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в примере 6, Стадия 1, начиная с Промежуточного продукта 6 (104 мг, 0,094 ммоль) и метил (2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5триацетокси-6-[2-[3-(9Н-флуорен-9-илметоксикарбониламино)пропаноиламино]-4-[(4-нитрофенокси)карбонилоксиметил]фенокси]тетрагидропиран-2-карбоксилата (150 мг, 0,16 ммоль) (синтез см. Jeffrey, S.C. и другие. Bioconjugate Chem. 2006, 17, 831-840) с использованием N, N-диизопропилэтиламина в качестве основания для получения метил (2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-триaцетокси-6-{2-[(3-{[(9Н-флуорен-9илметокси)кaрбонил]aмино}пропaноил)aмино]-4-[({[2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)бензил](метил)карбамоил}окси)метил]фенокси}тетрагидро-2Н-пиран-2-карбоксилата в виде аммониевой соли (71 мг, 48%). ЖХМС (АА): m z 1570,9(\|·| 1).

Стадия 2: (2S,3S,4S,5R,6S)-6-{2-[(3-aминопропaноил)aмино]-4-[({[2-({9[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS,16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Н-пурин-2-ил}карбамоил)бензил](метил)карбамоил}окси)метил]фенокси}-3,4,5тригидрокситетрагидро-2Н-пиран-2-карбоновая кислота, промежуточный продукт 22.

К раствору метил (2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-триaцетокси-6-{2-[(3-{[(9Н-флуорен-9илметокси)кaрбонил]aмино}пропaноил)aмино]-4-[({[2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфатациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Н-пурин-2-ил}карбамоил)бензил](метил)карбамоил}окси)метил]фенокси}тетрагидро-21-пиран-2-карбоксилата в виде аммониевой соли (66 мг, 0,042 ммоль), растворенной в ТГФ (13 мл) добавляли LiOH (0,5 М водный раствор, 1,25 мл, 0,625 ммоль) при комнатной температуре, и реакционную смесь перемешивали в течение 2,5 часа. Реакционную смесь нейтрализовали до рН 7 с помощью 1М HCl и смесь упаривали досуха. Неочищенный остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии с обращенной фазой (0-30% ACN/водный бикарбонат аммония (5 мМ)) с получением Промежуточного продукта 22 в виде соли аммония (26 мг, 50%). Затем это вещество растворяли в МеОН (5 мл) и добавляли триэтиламин (1 мл). Смесь встряхивали 1 мин. Растворители удаляли и полученный остаток лиофилизировали в течение ночи с получением (2S,3S,4S,5R,6S)-6-{2-[(3-aминопропaноил)aмино]-4- [({[2-({9- [(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR,

- 84 048725

14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Hпурин-2-ил}карбамоил)бензил](метил)карбамоил}окси)метил]фенокси}-3,4,5-тригидрокситетрагидро2Н-пиран-2-карбоновой кислоты в виде соли N, N-диэтилэтанамина (Промежуточный продукт 22, 30 мг, 100%). ЖХМС (АА): m/z=1209,0 (М+Н).

Стадия 3: (2S,3S,4S,5R,6S)-6-{2-[(3-{[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}пропаноил)амино]-4- [({[2-({9- [(2R,5R,7R, 8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксид-14(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфатетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)бензил](метил)карбамоил}окси)метил]фенокси}-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2Н-пиран-2-карбоновая кислота, соединение 24

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в примере 6, стадия 3, с использованием промежуточного продукта 22 (24 мг, 0,02 ммоль) вместо Промежуточного продукта 8 с получением (2S,3S,4S,5R,6S)-6-{2-[(3-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}пропаноил)амино]-4-[({[2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси-2,10диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил] -6-оксо-6,9-дигидро-1 Н-пурин-2-ил карбамоил)бензил](метил)карбамоил}окси)метил]фенокси}-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2Н-пиран-2-карбоновой кислоты в виде аммониевой соли (С-24, 17 мг, 71%). ЖХМС (АА): m/z=1402,4 (M+H). MCBP (m/z): [M+H]⁺ вычисл. для C56H65N11O24P2S2 1402,3193; найдено, 1402,3232.

Пример 24.

Соединение, указанное в табл. 18 (Соединение 25), получали, как описано в примере 23, стадия 3, заменяя соответственно №сукцинимидил-6-малеимидогексаноат исходным материалом, показанным в таблице.

Таблица 18

Аналитические данные

Исходный материал

Продукт найдено, 1544,4232.

С-25 Структура:

ЖХМС (АА): m/z=l 544,8(М+Н); MCBP (m/z): [М+Н]⁺ вычисл. для C₆4H₇₉N11O26P₂S2 1544,4187;

Пример 25.

4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}-3 - метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил{2-[(2R)-2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)пирролидин-1-ил]-2-оксоэтил}карбамат, соединение 26 (С-26).

- 85 048725

ПС-15

С-26

Стадия 1: 2-[[4-[[(^)-2-[[(^)-2-[6-(2,5-диоксопиррол-1-ил)гексаноиламино]-3-метил-бутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метоксикарбониламино]уксусная кислота.

К раствору глицина (24 мг, 0,32 ммоль) в триэтиламине (0,10 мл, 0,72 ммоль), ДМФА (0,50 мл) и ДМСО (0,50 мл) добавляли [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[6-(2,5-диоксопиррол-1-ил)гексаноиламино]-3метилбутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метил (4-нитрофенил) карбонат (220 мг, 0,34 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часа. Затем реакционную смесь охлаждали до 0°С. Добавляли воду (1 мл) и раствор подкисляли до рН 4 путем добавления муравьиной кислоты. Смесь упаривали досуха и неочищенный остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии с обращенной фазой (0-100% ACN/водная муравьиная кислота (0,1%)) с получением 2-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[6-(2,5-диоксопиррол-1-ил)гексаноиламино]-3-метилбутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метоксикарбониламино]уксусной кислоты (87 мг, 44%). ЖХМС (АА): m/z=586,3 (M-H).

Стадия 2: 4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}-3метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил{2-[(2R)-2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфатетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)пирролидин-1-ил]-2-оксоэтил}карбамат, соединение 26.

К раствору 2-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[6-(2,5-диоксопиррол-1-ил)гексаноиламино]-3-метилбутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метоксикарбониламино]уксусной кислоты (40 мг, 0,068 ммоль) и триэтиламина (35 мкл, 0,25 ммоль) в ДМФА (1 мл) добавляли 1-[бис(диметиламино)метилен]-1Н-1,2,3трицзоло[4,5-Ь] пиридиний-3-оксид гексафторфосфат (46 мг, 0,12 ммоль) при комнатной температуре, и реакционную смесь перемешивали в течение 10 минут. Затем к этому раствору добавляли по каплям при комнатной температуре раствор (2R)-N-{9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси-2,10диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}пирролидин-2-карбоксамида в виде 2,2,2-трифторацетатной соли (Промежуточный продукт 15, 50 мг, 0,047 ммоль) в ДМФА (0,60 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем смесь охлаждали до 0 °С, добавляли воду (1 мл) и раствор подкисляли до рН 4 путем добавления муравьиной кислоты. Смесь упаривали досуха и неочищенный остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии с обращенной фазой (0-100% ACN/водная муравьиная кислота (0,1%)) с получением 4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}-3метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил{2-[(2R)-2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10] пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил] -6-оксо-6,9-дигидро-1 Н-пурин-2

- 86 048725 ил}карбамоил)пирролидин-1-ил]-2-оксоэтил}карбамата (С-26, 32 мг, 50%). ЖХМС (АА): m/z=1316,4 (M+H). MCBP (m/z): [M+H]⁺ вычисл. для C₅₃H₆₇N₁₃O₁₉P₂S₂ 1316,3666; найдено, 1316,3705.

Пример 26.

(2R)-1-({ [(2S)-2- {[(2S)-2-{ [6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1 H-пиррол-1 -ил)гексаноил] амино }-3метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}ацетил)-Х- {9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}пирролидин-2-карбоксамид, соединение 27 (С-27)

Стадия 1: трет-бутил {2-[(2R)-2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси-2,10диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)пирролидин-1 -ил] -2-оксоэтил } карбамат.

К смеси Промежуточного продукта 15 (60 мг, 0,05 ммоль) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил (третбутоксикарбонил)глицината (19 мг, 0,07 ммоль) в ДМФА (1,6 мл) добавляли триэтиламин (50 мкл, 0,355 мкмоль), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь гасили водой, добавляли целит и реакционную смесь упаривали досуха. Неочищенный остаток, абсорбированный на целите, очищали с помощью колоночной хроматографии с обращенной фазой (0-100% ACN/водный бикарбонат аммония (5 мМ)). К водному раствору продукта добавляли триэтиламин (14 мкл, 0,1 ммоль). Лиофилизация в течение ночи дала трет-бутил {2-[(2R)-2-({9[(2R,5R,7R, 8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10дисульфанилдеклотетрадецкагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациин-7 ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)пирролидин-1-ил]-2-оксоэтил} карбамат в виде соли N, N-диэтилэтанамина (49 мг, 87%). ЖХМС (АА): m/z=904,4 (M+H).

Стадия 2: (2R)-1 -(Аминоацетил)^- {9-[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R,15 aS, 16R)-16-гидрокси-2,10диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8метаноциклопента[ 1 ] [ 1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Hпурин-2-ил}пирролидин-2-карбоксамид

К раствору трет-бутил (2-[(2R)-2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси-2,10диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)пирролидин-1-ил]-2-оксоэтил}карбамата в виде соли N, N-диэтилэтанамина (37 мг, 0,033 ммоль) в МеОН (1 мл) добавляли соляную кислоту (4М раствор в диоксане, 1 мл, 4 ммоль), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем реакционную смесь упаривали досуха и помещали в вакуум на 2 часа, чтобы получить (2R)-1-(аминоацетил)-N-{9[(2R,5R,7R, 8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7 ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}пирролидин-2-карбоксамид в виде гидрохлоридной соли (37 мг, 100%). ЖХМС (АА): m/z=804,2 (M+H).

Стадия 3: (2R)-1-({[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}ацетил)-N-{9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8

- 87 048725 этаноциклопента[ 1] [1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил] -6-оксо-6,9-дигидро-1Hпурин-2-ил}пирролидин-2-карбоксамид, соединение 27

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в примере 26, стадия 1, начиная с (2R)-1-(аминоацетил)-N-{9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси-2,10диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}пирролидин-2-карбоксамида в виде гидрохлоридной соли (30 мг, 0,027 ммоль) и (2,5-диоксопирролидин-1-ил) (2S)-2-[[(2S)-2-[6-(2,5-диоксопиррол-1-ил)гексаноиламино]-3-метилбутаноил]амино]пропаноата (24 мг, 0,04 ммоль) (синтез см. в US 20180015176 A1). Очистка колоночной флэш-хроматографией с обращенной фазой (0-100% ACN/водная муравьиная кислота (0,1%)) давала (2R)-1-({[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}ацетил)-N-{9-[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}пирролидин-2-карбоксамид (С-27, 20 мг, 64%). ЖХМС (АА): m/z=1167,1 (М+Н). МСВР (m/z): [M+H]⁺ вычисл. для C₄₅H₆₀N₁₂O₁₇P₂S₂ 1167,3189; найдено, 1167,3206.

Пример 27.

4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(Аминоацетил)амино]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил [2({9-[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7 ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат, соединение 28 (С-28)

JSH

DIPEA. THF, DMF

Стадия 1: трет-бутил (2-{[(2S)-1-{[(2S)-1-({4-[({[2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопен та[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)бензил](метил)карбамоил}окси)метил]фенил}амино)-1-оксопропан-2-ил]амино}-3-метил-1оксобутан-2-ил]амино}-2-оксоэтил)карбамат.

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в примере 6, Стадия 3, начиная с Промежуточного продукта 8 (23 мг, 0,016 ммоль) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил (трет-бутоксикарбонил)глицината (11 мг, 0,039 ммоль) вместо N-сукцинимидил 6-малеимидогексаноата. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Очистка с помощью колоночной флэш-хроматографии с обращенной фазой (0-100% ACN/водный ацетат триэтиламмония (10 мМ)) давала трет-бутил(2-{[(2S)-1-{[(2S)-1-({4-[({[2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1 ] [ 1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1 Н-пурин-2ил}карбамоил)бензил](метил)карбамоил}окси)метил]фенил}амино)-1-оксопропан-2-ил]амино}-3-метил

- 88 048725

1-оксобутан-2-ил]амино}-2-оксоэтил)карбамат в виде соли N, N-диэтилэтанамина (13 мг, 57%). ЖХМС (АА): m/z=1273,l (M+H).

Стадия 2: 4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(Аминоацетил)амино]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил [2-({9-[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1H-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат, Соединение 28

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в Примере 5, Стадия 2, исходя из трет-бутил (2-{[(2S)-1-{[(2S)-1-({4-[({[2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10] пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил] -6-оксо-6,9-дигидро-1 Н-пурин-2ил}карбамоил)бензил](метил)карбамоил}окси)метил]фенил}амино)-1-оксопропан-2-ил]амино}-3-метил1-оксобутан-2-ил]амино}-2-оксоэтил)карбамата в виде соли N, N-диэтилэтанамина (6,6 мг, 0,005 ммоль) вместо трет-бутил [2-({9-[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамата. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут с получением 4-{[(2S)2-({ (2S)-2-[(аминоацетил)амино]-3 -метилбутаноил } амино)пропаноил] амино } бензил [2-( { 9[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамата в виде 2,2,2трифторацетатной соли (С-28, 5,6 мг, 91%). ЖХМС (АА): m/z=1173,3 (М+Н).

Пример 28.

Соединения, перечисленные в табл. 20, были получены, как описано в примере 27, с заменой 2,5диоксопирролидин-1-ил(трет-бутоксикарбонил)глицината исходным материалом, показанным в табл. 19.

Таблица19

Исходный материал	Продукт	Аналитические данные
Вос J. JL, л J и д и д I / О 0 0- Подготовлено, как описано в патенте США №. 6022966	С-29	ЖХМС (АА): m/z=l 287,2 (М+Н)
Вос л ,0. Ж. А н у 1/ Пром. соед.-23	С-30	ЖХМС (АА): m/z= 1349,3 (М+Н)

- 89 048725

Таблица 20

Продукт	Структура
С-29	о 0 /ХЧн О P-о \ 1 J J Г νΓΧγΊΐ Н ; 9 Н 9 Н ,.....Л ..н ( ! Г; ': *;'· ‘.т Л ¹
С-30	0 о_г я е X'F ⁰

- 90 048725

Стадия 1: 2-[[(2,4-диметоксифенил)метиламино]метил]бензойная кислота Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в примере 10, Стадия 1, исходя из 2карбоксибензальдегида (6,0 г, 40 ммоль) и 2,4-диметоксибензиламина (12 мл, 80 ммоль) с получением 2[[(2,4-диметоксифенил)метиламино]метил]бензойной кислоты (7,6 г, 61%). ЖХМС (АА): m/z=302,2 (m+h).

Стадия 2: 2-[[[(2S)-2-(mрет-бутоксикарбониламино)пропаноил]-[(2,4-диметоксифенил)метил]амино]метил]бензойная кислота.

К раствору 2-[[(2,4-диметоксифенил)метиламино]метил]бензойной кислоты (380 мг, 1,26 ммоль) и триэтиламина (0,5 мл, 3,55 ммоль) в ДМФА (6 мл) добавляли 2,5-диоксопирролидин-1-ил (третбутоксикарбонил)-Е-аланината (640 мг, 2,2 ммоль). Добавляли воду (2 мл), чтобы помочь солюбилизировать реакционную смесь, которую оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 1 дня. Затем реакционную смесь упаривали досуха и неочищенный остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии с обращенной фазой (0-100% ACN/водная муравьиная кислота (0,1%)) с получением 2-[[[(2S)-2-(трет-бутоксикарбониламино)пропаноил]-[(2,4-диметоксифенил)метил]амино]метил]бензойной кислоты (322 мг, 51%). ЖХМС (АА): m/z=473,3 (M+H).

Стадия 3: трет-бутил №[(^)-2-[(2-хлоркарбонилфенил) метил-[(2,4-диметоксифенил)метил]амино]1-метил-2-оксоэтил]карбамат, Промежуточный продукт 24

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в Примере 1, стадия 2, начиная с 2-[[[(2S)-2-(трет-бутоксикарбониламино)пропаноил]-[(2,4-диметоксифенил)метил]амино]метил]бензойной кислоты (270 мг, 0,57 ммоль) вместо 2-(((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)метил)бензойной кислоты с получением сырого промежуточного продукта 24 (280 мг, 100%).

Пример 31.

2-({[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}метил)-N-{9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси-2,10диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1 ] [1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Н-пурин-2-ил}бензамид, соединение 31 (С-31)

Стадия 1: трет-бутил [(2S)-1-{[(2S)-1-{[2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Н-пурин-2-ил}карбамоил)бензил] амино }-1 -оксопропан-2-ил] амино} -3 -метил-1 -оксобутан-2-ил] карбамат.

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в примере 26, стадия 1, исходя из промежуточного продукта 16 (45 мг, 0,53 ммоль) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил (третбутоксикарбонил)Ж-валината (100 мг, 0,32 ммоль) вместо Промежуточного продукта15 и 2,5диоксопирролидин-1-ил (трет-бутоксикарбонил)глицината соответственно. Очистка обращенно-фазовой флэш-хроматографией на колонке (0-100% ACN/водный ацетат аммония (10 мМ)) давала трет-бутил [(2S)-1-{[(2S)-1-{[2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Н-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]амино}-1-оксопропан-2ил]амино}-3-метил-1-оксобутан-2-ил]карбамат в виде аммониевой соли (24 мг, 44%). ЖХМС (АА):

- 91 048725 m/z=1053,0 (М+Н).

Стадия 2: 2-({[(2S)-2-{[(2S)-2-aMUHO-3-MeTun6ymaHOun]aMUHo}nponaHOun]aMUHo}MeTun)-N-{9[(2R,5R,7R, 8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7 ил] -6-оксо-6,9-дигидро-1 H-пyрин-2-ил}бензамид.

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в примере 5, стадия 2, исходя из трет-бутил [(2S)-1-{[(2S)-1-{[2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]амино}-1-оксопропан-2-ил]амино}-3-метил-1-оксобутан-2-ил]карбамата в виде соли аммония (24 мг, 0,023 ммоль) вместо трет-бутил [2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамата с получением 2-({[(2S)-2-{[(2S)-2-амино-3-метилбyтаноил]амино}пропаноил]амино}метил)-N-{9-[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1 ] [ 1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил} бензамида в виде 2,2,2-трифторацетатной соли (24 мг, 97%). ЖХМС (АА): m/z=953,l (M+H).

Стадия 3: 2-({[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}-3метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}метил)-Ы- {9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Нпурин-2-ил}бензамид, соединение 31.

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в Примере 6, Стадия 3, начиная с 2-({[(2S)-2-{[(2S)-2-амино-3-метилбyтаноил]амино}пропаноил]амино}метил)-N-{9[(2R,5R,7R, 8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7 ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}бензамида в виде 2,2,2-трифторацетатной соли (24 мг, 0,022 ммоль) вместо Промежуточного продукта 8 для получения 2-({[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5дигидро-1 H-пиррол-1 -ил)гексаноил]амино } -3 -метилбутаноил] амино} пропаноил]амино }метил)-№ -{9[(2R,5R,7R, 8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7 ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Н-пурин-2-ил}бензамида в виде аммониевой соли (С-31, 6,2 мг, 23%). ЖХМС (АА): m/z=1146,1 (M+H). MCBP (m/z): [M+H]⁺ вычисл. для C₄₆H₅₇NnO₁₆P₂S₂ 1146,2974; найдено, 1146,2998.

Пример 32.

4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(11,12-дидегидродибензо[b,f]азоцин-5(6Н)-ил)-6-оксогексаноил]амино}-3метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил 4-нитрофенилкарбонат (Промежуточный продукт 25)

Стадия 1: 6-(11,12-дидегидродибензо[b, f]азоцин-5(6Н)-ил)-N-[(2S)-1-{[(2S)-1-{[4(гидроксиметил)фенил]амино}-1-оксопропан-2-ил]амино}-3-метил-1-оксобутан-2-ил]-6-оксогексанамид

К раствору (2S)-2-амино-N-[(1S)-2-[4-(гидроксиметил)анилино]-1-метил-2-оксоэтил]-3метилбутанамида (240 мг, 0,82 ммоль), растворенного в ДМФА (2 мл) и ТГФ (5,5 мл), добавляли N, Nдиизопропилэтиламин (0,39 мл, 2,24 ммоль). Реакционную смесь охлаждали до 0°С и добавляли 1-{[6(11,12-дидегидродибензо[К ^азоцин-5(6Н)-ил)-6-оксогексаноил]окси}пирролидин-2,5-дион (320 мг, 0,75 ммоль). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и оставляли перемешиваться в течение 30 минут. Реакционную смесь разбавляли водой и экстрагировали EtOAc (3х). Объединенные органические фазы промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и солевым раствором, сушили (Na₂SO₄), фильтровали и упаривали досуха. Неочищенный остаток очищали хроматографией на силикагеле (50-100% EtOAc/ДХМ) с получением 6-(11,12-дидегидродибензо[b, £]азоцин-5(6Н)-ил)-Ы

- 92 048725

[(2S)-1-{ [(2S)-1-{ [4-(гидроксиметил)фенил]амино }-1 -оксопропан-2-ил]амино } -3 -метил-1 -оксобутан-2ил]-6-оксогексанамида (347 мг, 76%). ЖХМС (АА): m/z=609,4 (M+H).

Стадия 2: 4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(11,12-дидегидродибензо[b, £]азоцин-5(6Н)-ил)-6-оксогексаноил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил 4-нитрофенилкарбонат, Промежуточный продукт 25.

К раствору 6-(11,12-дидегидродибензо[b, f]азоцин-5(6Н)-ил)-N-[(2S)-1-{[(2S)-1-{[4-(гидроксиметил)фенил]амино}-1-оксопропан-2-ил]амино}-3-метил-1-оксобутан-2-ил]-6-оксогексанамида (257 мг, 0,42 ммоль) в ТГФ (4,2 мл) и N, N-диизопропилэтиламина (0,37 мл, 2,1 ммоль), охлажденному до 0 °С, добавляли 4-нитрофенилхлорформиат (362 мг, 1,69 ммоль) одной порцией. Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 3 часа. Реакционную смесь разбавляли водой и экстрагировали ДХМ (3х) Объединенные органические фазы промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и солевым раствором, сушили (Na₂SO₄), фильтровали и упаривали досуха. Неочищенный остаток очищали хроматографией на силикагеле (0-100% EtOAc/ДХМ), получая 4-{[(2S)-2{[(2S)-2-{[6-(11,12-дидегидродибензо[b, £]азоцин-5(6Н)-ил)-6-оксогексаноил]амино}-3метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил 4-нитрофенилкарбонат (Промежуточный продукт 25, 137 мг, 42%). ЖХМС (АА): m/z=774,4 (М+Н).

Пример 33.

Соединение, указанное в табл. 21 (промежуточный продукт 26), было получено, как описано в примере 32, с заменой исходного материала, указанного в таблице, на 1-{[6-(11,12-дидегидродибензо[b, f] азоцин-5(6Н)-ил)-6-оксогексаноил] окси }пирролидин-2,5-дион.

Таблица 21

Пример 34.

(2S)-2-{[4-(l1,12-дидегидродибензо[b,f]азоцин-5(6Н)-ил)-4-оксобутаноил]амино}-4-[(2,5-диоксопирролидин-1 -ил)окси]-Ы-(2,5,8,11,14,17,20-гептаоксадокозан-22-ил)-4-оксобутанамид (Промежуточный продукт 27) и (25S)-25-{[4-(11,12-дидегидродибензо[b, £]азоцин-5(6Н)-ил)-4-оксобутаноил]амино}-24оксо-2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23-азагептакозан-27-овая кислота (промежуточный продукт 27А)

- 93 048725

Стадия 1: трет-бутил (25S)-25-{[(6eH3unoKCu)Kap6oHun]aMUHo}-24-OKCO-2,5,8,11,14,17,20-renTaoKca23-азагептакозан-27-оат.

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в Примере 26, стадия 1, исходя из трет-бутил (3S)-3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-4-[(2,5-диоксопирролидин-1ил)окси]-4-оксобутаноата (2,2 г, 5,3 ммоль) и 2,5,8,11,14,17,20-гептаоксадокозан-22-амина (2,0 г, 5,9 ммоль) вместо промежуточного соединения 15 и 2,5 -диоксопирролидин-1-ил (третбутоксикарбонил)глицинат, соответственно. Очистка хроматографией на силикагеле (0-10% МеОН/ДХМ) давала трет-бутил (25S)-25-{[(бензилокси)карбонил]амино}-24-оксо-2,5,8,11,14,17,20гептаокса-23-азагептакозан-27-оат (3,8 г, 100%).

Стадия 2: трет-бутил (25S)-25-амино-24-оксо-2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23-азагептакозан-27-оат трет-бутил(25S)-25-{[(бензилокси)карбонил]амино}-24-оксо-2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23-азагептакозан-27-оат (3,8 г, 5,9 ммоль) растворяли в этаноле (100 мл). Добавляли палладий (10% на угле, 1,38 г, 1,17 ммоль) и смесь перемешивали в атмосфере водорода (15 фунтов на кв. дюйм) в течение 3 часов. Реакционную смесь фильтровали, промывали метанолом и фильтрат упаривали досуха, получая трет-бутил (25S)-25-амино-24-оксо-2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23-азагептакозан-27-оат (2,56 г, 85%).

Стадия 3: трет-бутил (25S)-25-{[4-(11,12-дидегидродибензо[b, £]азоцин-5(6Н)-ил)-4оксобутаноил]амино}-24-оксо-2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23-азагептакозан-27-оат

К раствору трет-бутил (25S)-25-амино-24-оксо-2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23-азагептакозан-27-оата (3,32 г, 6,5 ммоль), 4-(11,12-дидегидродибензо[b, Дазоцин-5(6Н)-ил)-4-оксобутановой кислоты (1,5 г, 4,91 ммоль) и 1-гидрокси-7-азабензотриазола (884 мг, 6,57 ммоль) в ДХМ (50 мл) добавляли 1-(3диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид (1,25 г, 6,56 ммоль) и триэтиламин (1,26 мл, 9,1 ммоль) при 0°С. Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Реакционную смесь разбавляли EtOAc и добавляли карбонат калия (20 мл, 4,0 М в воде). Смесь перемешивали в течение 15 мин, и органическую фазу отделяли, промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, солевым раствором, сушили (Na₂SO₄), фильтровали и упаривали досуха. Неочищенный остаток очищали хроматографией на силикагеле (0-10% МеОН/ДХМ) с получением третбутил

- 94 048725 (25S)-25{[4-(11,12-дидегидродибензо [b, f] азоцин-5(6Н)-ил)-4-оксобутаноил]амино } -24-оксо2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23-азагептакозан-27-оата (2,27 г, 44%).

Стадия 4: (25S)-25-{[4-(11,12-gugerugpogu6eH3o[b, ^азоцин-5(6Н)-ил)-4-оксобутаноил]амино}-24оксо-2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23-азагептакозан-27-овая кислота.

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в Примере 5, Стадия 2, исходя из трет-бутил (25S)-25-{[4-(11,12-дидегидродибензо[b, £]азоцин-5(6Н)-ил)-4оксобутаноил]амино}-24-оксо-2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23-азагептакозан-27-оата (278 мг, 0,35 ммоль) вместо третбутил[2-({9-[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат. Очистка хроматографией на силикагеле (0-20% МеОН/ДХМ) давала (25S)-25-{[4-(11,12дидегидродибензо[Ц £]азоцин-5(6Н)-ил)-4-оксобутаноил]амино}-24-оксо-2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23азагептакозан-27-овую кислоту (Промежуточный продукт 27А, 180 мг, 70%). ЖХМС (АА): m/z=742,4 (М+Н).

Стадия 5: (2S)-2-{[4-(11,12-дидегидродибензо[b, ^азоцин-5(6Н)-ил)-4-оксобутаноил]амино}-4[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-Ы-(2,5,8,11,14,17,20-гептаоксадокозан-22-ил)-4-оксобутанамид, Промежуточный продукт 27.

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в Примере 29, исходя из (25S)-25-{[4-(11,12-дидегидродибензо[b, ^азоцин-5(6Н)-ил)-4-оксобутаноил]амино}-24-оксо2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23-азагептакозан-27-овой кислоты (60 мг, 0,08 ммоль) вместо 2,2-диметил-4оксо-3,8,11,14,17-пентаокса-5-азанонадекан-19-овая кислоты. Реакционную смесь перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре с получением (2S)-2-{[4-(11,12-дидегидродибензо[b, £]азоцин5(6Н)-ил)-4-оксобутаноил]амино}-4-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-Ы-(2,5,8,11,14,17,20гептаоксадокозан-22-ил)-4-оксобутанамид (Промежуточный продукт 27, 68 мг, 100%). ЖХМС (АА): m/z=839,4 (M+H).

Пример 35.

Соединения, перечисленные в табл. 23, получали, как описано в Примере 6, Стадия 3, заменяя Nсукцинимидил-6-малеимидогексаноат исходным материалом, показанным в табл. 22.

Таблица 22

Исходный материал	Продукт	Аналитические данные
, ,_1Г,Вос О HN О N ’ ° rt' Д О О'	Пром, соед,- 28*	ЖХМС (АА): m/z= 1424,0 (М+Н)
Вос^ О ΝΗ _н О A- Ν 'θ Пром. соед.-ЗО	Пром. соед.-29	ЖХМС (АА): m/z= 1696,0 (М+Н)
О A· Ν '° '^Вос VL о ^н Ό	Пром. соед.-41	ЖХМС (АА): m/z= 1504,7 (М-Н)

- 95 048725

Таблица 23

Пример 36.

трет-Бутил{(29S)-30-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-26,30-диоксо-2,5,8,11,14,17,20,23октаокса-27-азатриаконтан-29-ил}карбамат (Промежуточный продукт 30)

о

Стадия 1: (29S)-29-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-26-оксо-2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса-27азатриаконтан-30-овая кислота.

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в Примере 21, Стадия 1, исходя из ^)-3-амино-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропановой кислоты (238 мг, 1,17 ммоль) и 1-[(26-оксо-2,5,8,11,14,17,20,23-октаоксагексакозан-26-ил)окси]пирролидин-2,5-диона (300 мг, 0,58 ммоль) вместо (S)-2 -амино-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексановой кислоты гидрохлорида и 1-[(17-оксо-2,5,8,11,14-пентаоксагептадекан-17-ил)окси]пирролидин-2,5-диона с использованием ДМФА в качестве растворителя и перемешивания при комнатной температуре в течение 2 часов. Очистка колоночной флэш-хроматографией с обращенной фазой (0-100% ACN/водный ацетат триэтиламмония (10 мМ)) дала (29S)-29-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-26-оксо-2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса27-азатриаконтан-30-овая кислота (344 мг, 99%). ЖХМС (АА): m/z=599,4 (M+H).

Стадия 2: трет-бутил {(29S)-30-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-26,30-диоксо

- 96 048725

2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса-27-азатриаконтан-29-ил} карбамат, Промежуточный продукт 30.

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в Примере 21, Стадия 2, исходя из (29S)-29-[(третбутоксикарбонил)амино]-26-оксо-2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса-27азатриаконтан-30-овой кислоты (100 мг, 0,166 ммоль) вместо (19S)-19-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Hпиррол-1-ил)бутил]-17-оксо-2,5,8,11,14-пентаокса-18-азаикозан-20-овой кислоты с использованием ДХМ в качестве растворителя и перемешивания при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь фильтровали и упаривали, получая неочищенный трет-бутил {(29S)-30-[(2,5-диоксопирролидин-1ил)окси]-26,30-диоксо-2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса-27-азатриаконтан-29-ил}карбамат (Промежуточный продукт 30, 116 мг, 100%).

Пример 37.

[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-3-метил-бутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метил №[[2-[[9-[(2К,3К^)-5-[[бис(4-метоксифенил)-фенил-метокси]метил]-3-гидрокси-тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-Ш-пурин-2-ил]карбамоил]фенил]метил]-Ы-метил-карбамат (Промежуточный продукт 32) о

о

ПС-32

Стадия 1: [4-[[^)-2-[[^)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-3-метилбутаноил] амино]пропаноил] амино] фенил] метил N-[[2-[[9-[(2R,3R,5 S)-3-[трет-бутил(диметил)силил]окси-5-[[трет-бутил(диметил)силил]оксиметил]тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-1Н-пурин-2-ил]карбамоил] фенил] метил] -N-метилкарбамат.

2-Амино-9-[(2К,3К^)-3-[трет-бутил(диметил)силил]окси-5-[[трет-бутил(диметил)силил]оксиметил]тетрагидрофуран-2-ил]-1Н-пурин-6-он (1,62 г, 3,27 ммоль) (синтез см. Prakash, Т.Е. J. Med. Chem. 2005, 48, 1199-1210) растворяли в сухом пиридине и упаривали досуха (3x3 мл), а затем помещали в вакуум в течение 15 мин. Остаток растворяли в пиридине (43 мл) в атмосфере аргона и добавляли раствор Промежуточного продукта 10 (5,91 г, 9,80 ммоль) в пиридине (32 мл). Реакционной смеси давали перемешиваться при комнатной температуре в течение 16 часов. Добавляли МеОН (20 мл) и реакционную смесь упаривали досуха. Добавляли МеОН (100 мл) и гидроксид аммония (28-30% раствор в воде, 50 мл) и полученной смеси давали возможность перемешиваться в течение 60 минут. Реакционную смесь упаривали досуха, неочищенный остаток адсорбировали на целите и очищали хроматографией на силикагеле (0-100% EtOAc/гексаны) с получением [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-3-метилбутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метила №[[2-[[9-[(2К,3К^)-3-[третбутил(диметил)силил]окси-5-[[трет-бутил(диметил)силил]оксиметил]тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-1Н-пурин-2-ил]карбамоил]фенил]метил]-Ы-метилкарбамат (2,17 г, 63%). ЖХМС (АА): ш4=1062,0(М+Н).

Стадия 2: [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-3-метил-бутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метил N-[[2-[[9-[(2R,3R,5S)-3-гидрокси-5-(гидроксиметил)тетрагидрофуран-2-ил]-6оксо-Ш-пурин-2-ил]карбамоил]фенил]метил]-Ы-метил-карбамат.

В полипропиленовую трубку добавляли [4-[^[(2S)-2-[[(2S)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-3-метилбутаноил] амино]пропаноил] амино] фенил] метил N-[[2-[[9-[(2R,3R,5 S)-3- [трет-бутил(диметил)силил]окси-5-[[трет-бутил(диметил)силил]оксиметил]тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-1Н-пурин-2-ил]карбамоил]фенил]метил]-Ы-метил-карбамат (2,17 г, 2,04 ммоль), растворенный в ТГФ (27 мл). Добавляли триэтиламин (2,26 мл, 16,1 ммоль), затем триэтиламин тригидрофторид (1,19 мл, 7,33 ммоль), и реакцион- 97 048725 ную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Реакционную смесь медленно гасили добавлением водного насыщенного раствора бикарбоната натрия, а затем разбавляли EtOAc. Органическую фазу отделяли и промывали солевым раствором, сушили (Na₂SO₄, фильтровали и упаривали досуха. Неочищенный остаток очищали хроматографией на силикагеле (0-20% МеОН/ДХМ) с получением [4-[[^)-2-[[^)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-3-метилбутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метил N-[[2-[[9-[(2R,3R,5S)-3-гидрокси-5-(гидроксиметил)тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-1H-пурин2-ил]карбамоил]фенил]метил]-Ы-метилкарбамат (1,18 г, 69%). ЖХМС (АА): m/z=834,4 (М+Н).

Стадия 3: [4-[[^)-2-[[^)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-3-метилбутаноил]амино]пропаноил] амино]фенил]метил N-[[2-[[9-[(2R,3R,5S)-5-[[бис(4-метоксифенил)фенилметокси]метил]-3-гидрокситетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-Ш-пурин-2-ил]карбамоил]фенил]метил]-Н-метилкарбамат, Промежуточный продукт 32

[4-[[^)-2-[[^)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-3-метилбутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метил N-[[2-[[9-[(2R,3R,5S)-3-гидрокси-5-(гидроксиметил)тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-1H-пурин2-ил]карбамоил]фенил]метил]-Ы-метил-карбамат (1,13 г, 1,36 ммоль) растворяли в сухом пиридине и упаривали досуха (3 х 15 мл). Остаток растворяли в пиридине (13,3 мл) и добавляли 4,4'диметокситритилхлорид (650 мг, 1,9 ммоль), а затем 4-диметиламинопиридин (8 мг, 0,068 ммоль). Реакционной смеси давали перемешиваться при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь упаривали досуха и адсорбировали на целите и очищали хроматографией на силикагеле (0-5% МеОН/ДХМ, с 0,5% NEt₃) с получением [4-[[^)-2-[[^)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-3метилбутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метил N- [[2-[[9-[(2R,3R,5S)-5- [ [бис(4-метоксифенил)фенил-метокси]метил]-3-гидрокси-тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-Ш-пурин-2ил]карбамоил]фенил]метил]-Ы-метил-карбамат (Промежуточный продукт 32, 1,12 г, 73%). ЖХМС (АА): m/z=1136,5 (М+Н).

Пример 38.

4-{[^)-2-({^)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил [2-({9-[(2S,5S,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR)-15-фтор-2,10,10-триоксидо-14-(9Н-пурин-9-ил)-2сульфанилдекагидро-5,8-метанофуро[2,3-m][1,3,6,9,10,11,2]тетраоксатиазафосфациклотетрадецин-7-ил]6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат или 4-{ [^)-2-({^)-2-[(третбутоксикарбонил)амино] -3 -метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил [2-({9[(2R,5S,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR)-фтор-2,10,10-триоксидо-14-(9H-пурин-9-ил)-2-сульфанилдекагидро5,8-метанофуро[2,3-m][1,3,6,9,10,11,2]тетраоксатиазафосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидроШ-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат (промежуточный продукт 33)

- 98 048725

Стадия 1: [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(TpeT-0yTOi<cui<ap00Hu.iaMUHo)-3-MeTu.i0yTaHOu.i]aMUHo]iipoiiaHOu.i] амино]фенил]метил N-[[2-[[9-[(2R,3R,5S)-5-[[бис(4-метоксифекил)-фекил-метокси]метил]-3[[(2R,3R,4R,5R)-3-[трет-бyтил(диметил)силил]окси-4-фтор-5-пyрик-9-илтетрагидрофyрак-2ил]метилсyльфамоилокси]тетрагидрофyрак-2-ил]-6-оксо-1H-пyрик-2-ил]карбамоил]фекил]метил]-Nметил-карбамат

Смесь [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(трет-бyтоксикарбокиламико)-3-метилбyтакоил]амико]пропакоил]амино]фенил]метил N-[[2-[[9-[(2R,3R,5S)-5-[[бис(4-метоксифекил)-фекил-метокси]метил]-3-гидрокситетрагидрофyран-2-ил]-6-оксо-1H-пyрин-2-ил]карбамоил]фенил]метил]-N-метилкарбамата (Промежyточный продукт 32, 1,1 г, 0,97 ммоль), (4-нитрофенил) N-[[(2R,3R,4R,5R)-3-[трет-бyтил(диметил)силил]окси-4фтор-5-пyрин-9-ил-тетрагидрофyран-2-ил]метил]-сyльфамата (667 мг, 1,17 ммоль) (синтез см. в заявке РСТ № PCT/IB2019/052364), 4-диметиламинопиридина (122 мг, 0,97 ммоль) и молекулярные сита 4А (1,74 г) в сухом ДХМ (13,6 мл) перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем добавляли триэтиламин (0,60 мл, 4,3 ммоль) и реакционной смеси давали перемешиваться при 40°С в течеыие 16 часов. Реакциоыыую смесь фильтровали и упаривали, а получеыыый остаток очищали колокочкой хроматографией с обращеккой фазой (10-100% ACN/водный бикарбояат аммояия (5 мМ)) с получением [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(третбyтоксикарбокиламико)-3метилбyтакоил]амико]пропакоил]амико]фекил]метил N-[[2-[[9-[(2R,3R,5S)-5-[[бис(4-метоксифекил)фекил-метокси]метил]-3-[[(2R,3R,4R,5R)-3-[трет-бyтил(диметил)силил]окси-4-фтор-5-пyрик-9-илтетрагидрофyрак-2-ил]метилсyльфамоилокси]тетрагидрофyрак-2-ил]-6-оксо-1H-пyрик-2ил]карбамоил]фенил]метил]-Ы-метилкарбамата (0,94 г, 62%). ЖХМС (АА): m/z=1565,0 (М+Н).

Стадия 2: [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(трет-бyтоксикарбокиламико)-3-метилбyтакоил]амико]пропакоил] амино]фенил]метил N-[[2-[[9-[(2R,3R,5S)-5-[[бис(4-метоксифекил)фекилметокси]метил]-3

- 99 048725

[[(2R,3R,4R,5R)-4-фтор-3-гидрокси-5-пурин-9-илmетрагидрофуран-2-ил]метилсульфамоилокси]тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-1Н-пурин-2-ил]карбамоил]фенил] метил]-Ы-метилкарбамат.

К раствору [4-[[^)-2-[[^)-2-(третбутоксикарбониламино)-3-метилбутаноил]амино]пропаноил] амино]фенил]метил N-[[2-[[9-[(2R,3R,5S)-5-[[бис(4-метоксифенил)фенилметокси]метил]-3[[(2R,3R,4R,5R)-3-[трет-бутил(диметил)силил]окси-4-фтор-5-пурин-9-ил-тетрагидрофуран-2ил]метилсульфамоилокси]тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-Ш-пурин-2-ил]карбамоил]фенил]метил]-Нметилкарбамата (939 мг, 0,60 ммоль) в ТГФ (12 мл) в полипропиленовой трубке добавляли триэтиламин тригидрофторид (0,52 мл, 3,17 ммоль) и триэтиламин (0,98 мл, 6,95 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, затем разбавляли дихлорметаном и последовательно промывали насыщенным водным NaHCO₃ и солевым раствором. Органическую фазу сушили над безводным MgSO₄, фильтровали и упаривали. Полученный остаток очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (10-100% ACN/водный бикарбонат аммония (5 мМ)) с получением [4-[[(2S)-2[[(2S)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-3-метилбутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метил N-[[2-[[9[(2R,3R,5S)-5-[[бис(4-метоксифенил)фенилметокси]метил]-3-[[(2R,3R,4R,5R)-4-фтор-3-гидрокси-5пурин-9-ил-тетрагидрофуран-2-ил]метилсульфамоилокси]тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-1H-пурин-2ил]карбамоил]фенил]метил]-Ы-метилкарбамат (795 мг, 89%). ЖХМС (АА): m/z=1452,2 (М+Н).

Стадия 3: [^^^^)-2-[[[(2К3^)-2-[2-[[2-[[[4-[[^)-2-[[^)-2-(трет-Бутоксикарбониламино)-3-метил-бутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метоксикарбонил-метиламино]метил]бензоил]амино]-6-оксо-Ш-пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)тетрагидрофуран-3ил]оксисульфониламино]метил]-4-фтор-5-пурин-9-ил-тетрагидрофуран-3-ил]оксифосфиновая кислота

Дифенилфосфит (0,225 мл, 1,17 ммоль) добавляли при температуре 0°С к раствору [4-[[(2S)-2[[(2S)-2-(третбутоксикарбониламино)-3 -метил-бутаноил]амино]пропаноил] амино] фенил]метил N-[[2[[9-[(2R3R5S)-5-[[бис(4-метоксифенил)-фенил-метокси]метил]-3-[[(2R,3R,4R,5R)-4-фтор-3-гидрокси-5пурин-9-ил-тетрагидрофуран-2-ил]метилсульфамоилокси]тетрагидрофуран-2-ил]-6-оксо-1H-пурин-2ил]карбамоил]фенил]метил]-Ы-метил-карбамат (792 мг, 0,55 ммоль) в пиридине (2 мл). После завершения добавления реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем добавляли триэтиламин (0,62 мл, 4,37 ммоль) и воду (0,51 мл, 28,3 ммоль), и реакционную смесь перемешивали еще 60 минут при комнатной температуре, а затем упаривали досуха. Затем остаток растворяли в уксусной кислоте (1,25 мл, 21,8 ммоль) и воде (0,33 мл, 18,6 ммоль) и оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь гасили, добавляя триэтилсилан (4,3 мл, 26,2 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем реакционную смесь упаривали досуха и остаток очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (10-100% ACN/водный бикарбонат аммония (5 мМ)) с получением [(2R,3R,4R,5R)-2-[[[(2R,3R,5S)-2-[2-[[2-[[[4[[^)-2-[[^)-2-(третбутоксикарбониламино)-3-метил-бутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метоксикарбонилметиламино]метил]бензоил]амино]-6-оксо-Ш-пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)тетрагидрофуран-3-ил]оксисульфониламино]метил]-4-фтор-5-пурин-9-ил-тетрагидрофуран-3-ил]оксифосфиновая кислота в виде аммониевой соли (396 мг, 59%). ЖХМС (АА): m/z=1213,4 (М+Н).

Стадия 4: 4-{ [^)-2-({^)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил[2-({9-[(2S,5S,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR)-15-фтор-2,10,10-триоксидо-14-(9Н-пурин-9ил)-2-сульфанилдекагидро-5,8-метанофуро[2,3-m][1,3,6,9,10,11,2]тетраоксатиазафосфациклотетрадецин7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат или 4-{ [(2S)-2-({(2S)-2[(трет-бутоксикарбонил)амино] -3 -метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил[2-({9[(2R,5S,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR)-15-фтор-2,10,10-триоксидо-14-(9H-пурин-9-ил)-2-сульфанилдекагидро-5,8-метанофуро[2,3-m][1,3,6,9,10,11,2]тетраоксатиазафосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)бензил ]метилкарбамат, промежуточный продукт 33.

Дифенилфосфорохлоридат (0,055 мл, 0,26 ммоль) добавляли к пиридину (1,6 мл) и этот раствор охлаждали до -35°С. Раствор [^^^^)-2-[[[(2К3^)-2-[2-[[2-[[[4-[[^)-2-[[^)-2-(третбутоксикарбониламино)-3-метилбутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метоксикарбонилметиламино]метил]бензоил]амино]-6-оксо-Ш-пурин-9-ил]-5-(гидроксиметил)тетрагидрофуран-3-ил]оксисульфониламино]метил]-4-фтор-5-пурин-9-ил-тетрагидрофуран-3-ил]оксифосфиновой кислоты в виде соли аммония (80 мг, 0,065 ммоль) в ДХМ (2,5 мл) и пиридин (3,2 мл) добавляли по каплям к охлажденной реакционной смеси в течение 15 минут. Полученный раствор перемешивали при -35°С в течение 30 минут. Твердый 3Н-1,2-бензодитиол-3-он (25 мг, 0,15 ммоль) и воду (0,056 мл) добавляли соответственно к охлажденной реакционной смеси, которую дополнительно перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем реакционный раствор охлаждали на ледяной бане до 0°С и гасили добавлением раствора водного тиосульфата натрия (0,2 М в воде, 0,14 мл, 0,70 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут и концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (0-50% ACN/водный ацетат триэтиламмония (10 мМ)) с получением 4-{[^)-2-({^)-2-[(третбутоксикарбонил)амино]-3метилбутаноил}амино)nропаноил]амино}бензил[2-({9-[(2S,5S,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR)-15-фтор2,10,10-триоксидо-14-(9Н-пурин-9-ил)-2-сульфанилдекагидро-5,8-метанофуро[2,3-m][1,3,6,9,10,11,2]тет- 100 048725 раоксатиазафосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1И-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат или 4-['[(А)-2-(['(А)-2-[(третбутоксикарбонил)амино]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил] амино} бензил [2-( {9-[(2R, 5 S,7R, 8RJ2aR, 14R, 15R45aR)-15-Top-2,10,10-триоксидо-14-(9И-пурин-9-ил)2-сульфанилдекагидро-5,8-метанофуро[2,3-т][1,3,6,9,10,11,2]тетраоксатиазафосфациклотетрадецин-7ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1H-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат в виде соли N, Nдиэтилэтанамина (промежуточный продукт 33, 27 мг, 31%). ЖХМС (АА): m/z=1227,9 (М+Н). ¹Н ЯМР (400 МГц, CD3OD) δ 9,14 (с, 1H), 8,75 (с, 1H), 8,63 (с, 1H), 8,30 (с, 1H), 7,53-7,36 (м, 5Н), 7,34-7,17 (м, 3Н), 6,47 (д, J=19,3 Гц, 1H), 6,16 (д, J=5,1 Гц, 1H), 5,87-5,82 (м, 1H), 5,76-5,55 (м, 1H), 5,50-5,40 (м, 1H), 5,00 (с, 2Н), 4,79-4,75 (м, 2Н), 4,68-4,61 (м, 1H), 4,58-4,47 (м, 2Н), 4,44-4,39 (м, 1H), 4,09-4,02 (м, 1H), 3,92-3,89 (м, 1H), 3,67-3,62 (м, 1H), 3,57-3,53 (м, 1H), 3,01-2,94 (м, 1H), 2,87 (с, Зн), 2,74-2,68 (м, 1И), 2,11-2,03 (м, 1H), 1,45-1,43 (м, 3Н), 1,44 (с, 9Н), 0,98 (д, J=6,7 Гц, 3Н), 0,93 (д, J=6,7 Гц, 3Н). ³¹Р ЯМР (162 МГц, CD3OD) δ 57,35 (с, 1P).

Пример 3 8А

4-{[(25S,29S,32S)-25-{[4-(11,12-дидегидродибензо[b, Г]азоцин-5(6Н)-ил)-4-оксобутаноил]амино}29-изопропил-32-метил-24,27,30,33-тетраоксо-2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23,28,31 -триазатритриаконтан33-ил]амино}бензил [4-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-фтор-7-(5-фтор-4-оксо-3,4дигидро-7И-пирроло[2,3^]пиримидин-7-ил)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-2,10-дисульфанилоктагидро12Н-5,8-метанофуро[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-14-ил]-9Н-пурин-6ил}амино)-4-оксобутил]метилкарбамат (С-34)

ПС-35

С-34

К суспензии 4-{[(2S)-2-{ [(2S)-2-амино-3 -метилбутаноил] амино} пропаноил] амино} бензил[4-( {9[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-фтор-7-(5-фтор-4-оксо-3,4-дигидро-7Н-пирроло[2,3d]пиримидин-7-ил)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-2,10-дисульфанилоктагидро-12Н-5,8-метанофуро[3,21][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-14-ил]-9Н-пурин-6-ил} амино)-4-оксобутил]метилкарбамата (Пром. соед.-35, 17,4 мг, 0,0154 ммоль), гидрохлорида 1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимида (3,49 мг, 0,0182 ммоль) и (25S)-25-{[4-(l 1,12-дидегидродибензо[Ь, £]азоцин-5(6Н)-ил)-4-оксобутаноил]амино}-24-оксо-2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23-азагептакозан-27-овой кислоты (Пром. соед.-27А) (10,4 мг, 0,0140 ммоль) добавляли триэтиламин (0,004 мл, 0,0266 ммоль) в ДХМ (0,37 мл). Смесь оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 20 минут, затем добавляли ДМФА (0,15 мл, 2,23 ммоль). После этого смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, растворитель упаривали. Неочищенный остаток очищали с помощью колоночной флэшхроматографии с обращенной фазой (0-50% ACN/водный ацетат триэтиламмония (10 мМ)) с получением 4-{[(25S,29S,32S)-25-{[4-(11,12-дидегидродибензо[b, Г]азоцин-5(6Н)-ил)-4-оксобутаноил]амино}-29изопропил-32-метил-24,27,30,33-тетраоксо-2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23,28,31-триазатритриаконтан-33ил]амино}бензил [4-({9-[(2R5R7R8R10R12aR14R15R15aR16R)-15-фтор-7-(5-фтор-4-оксо-3,4-дигидро7Н-пирроло[2,3^]пиримидин-7-ил)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-2,10-дисульфанилоктагидро-12Н-5,8метанофур[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-14-ил]-9Н-пурин-6-ил} амино)-4оксобутил]метилкарбамата (С-34) (2,0 мг, 6,9%) в виде соли N, N-диэтилэтанамина ЖХМС (АА): m/z=926,9 (M/2+И) МСВР (m/z): [M+H]⁺ вычисл. для C₈₀H₁₀₁F₂N₁₅O₂₆P₂S₂ 1852,6000; найдено, 1852,6006.

Пример 38В.

(^88,98)-бицикло[6.1.0]нон-4-ин-9-илметил{(258)-27-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-24,27

- 101 048725 диоксо-2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23-азагептакозан-25-ил}карбамат (промежуточный продукт 36)

Стадия 1: трет-бутил (25S)-25-{[(0eH3u.ioi<cu)i<ap0OHu.i]aMUHo}-24-oi<co-2.5.8.11.14.17.20)-ге11таокса23-азагептакозан-27-оат.

Стадия 2: трет-Бутил (25S)-25-амино-24-оксо-2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23-азагептакозан-27-оат.

трет-бутил (25S)-25-{ [(бензилокси)карбонил]амино}-24-оксо-2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23азагептакозан-27-оат (3,8 г, 5,9 ммоль) растворяли в этаноле (100 мл). Добавляли палладий (10% на угле, 1,38 г, 1,17 ммоль) и смесь перемешивали в атмосфере водорода (15 фунтов на кв. дюйм) в течение 3 часов. Реакционную смесь фильтровали, промывали метанолом и фильтрат упаривали досуха, получая трет-бутил (25S)-25-амино-24-оксо-2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23-азагептакозан-27-оат (2,56 г, 85%).

Стадия 3: (25S)-25-({[(1R,8S,9s)-бицикло[6.1.0]нон-4-ин-9-илметокси]карбонил}амино)-24-оксо2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23-азагептакозан-27-овая кислота.

К раствору (25S)-25-амино-24-оксо-2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23-азагептакозан-27-оата (587 мг, 1,15 ммоль) в ДХМ (11,3 мл) добавляли ТФУ (11,3 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь упаривали и подвергали азеотропной перегонке с толуолом, а затем сушили в высоком вакууме с получением сырого промежуточного продукта в виде масла. К сырому в виде масла промежуточному продукту добавляли 1-({[(^^^)-бицикло[6.1.0]нон-4-ин-9илметокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-дион (279 мг, 0,959 ммоль) и ДХМ (9,8 мл), триэтиламин (1,34 мл, 9,59 ммоль) при комнатной температуре. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь разбавляли EtOAc (50 мл) и раствором карбоната калия (10 мл, 4,0 М в воде). Отделенный органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2SO4, фильтровали и упаривали. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии с обращенной фазой (0100% ACN/водный бикарбонат аммония (5 мМ)). Требуемые фракции упаривали в вакууме, получая (25S)-25-({[(1R,8S,9s)-бицикло[6.1.0]нон-4-ин-9-илметокси]карбонил}амино)-24-оксо-2,5,8,11,14,17,20гептаокса-23-азагептакозан-27-овую кислоту (19 мг, выход 3,1%). ЖХМС (АА): m/z=629,2 (М-Н); 1H ЯМР (400 МГц, Метанол^4) δ=4,46 (дд, J=5,7, 7,4 Гц, 1 Н), 4,25-4,12 (м, 2 Н), 3,68-3,51 (м, 28 Н), 3,413,34 (м, 5 Н), 2,80-2,60 (м, 2 Н), 2,33-2,12 (м, 4 Н), 1,69-1,54 (м, 2 Н), 1,40 (квин, J=8,7 Гц, 1 Н), 1,02-0,89 (м, 2 Н).

Стадия 4: (1R,8S,9s)-бицикло[6.1.0]нон-4-ин-9-илметил{(25S)-27-[(2,5-диоксопирролидин-1ил)окси]-24,27-диоксо-2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23-азагептакозан-25-ил}карбамат (промежуточный продукт 36).

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в Примере 29, исходя из (25S)-25-({[(1R,8S,9s)-бицикло[6.1.0]нон-4-ин-9-илметокси]карбонил}амино)-24-оксо2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23-азагептакозан-27-овой кислоты вместо 2,2-диметил-4-оксо-3,8,11,14,17пентаокса-5-азанонадекан-19-овой кислоты. Реакционную смесь перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре с получением (^^^)-бицикло[6.1.0]нон-4-ин-9-илметил {(25S)-27-[(2,5диоксопирролидин-1-ил)окси]-24,27-диоксо-2,5,8,11,14,17,20-гептаокса-23-азагептакозан-25-ил}карбамата(промежуточное соединение 36, 22 мг, 100%). ЖХМС (АА): m/z=728,4 (М+Н).

- 102 048725

Пример 38С.

Соединения, перечисленные в табл. 22А (Промежуточный продукт 37 и Промежуточный продукт 42), были получены, как описано в Примере 10, с заменой исходных материалов, показанных на стадии 1 и стадии 2, на 2,5,8,11,14,17,20-гептаоксадокозан-22-амин (промежуточный продукт 37 и промежуточный продукт 42) и метил (2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-триацетокси-6-{2-[(3-{[(9Н-флуорен-9илметокси)карбонил]амино}пропаноил)амино]-4-({[(4-нитрофенокси)карбонил]окси}метил)фенокси}тетрагидро-2Н-пиран-2-карбоксилата (промежуточный продукт 42).

Таблица 22А

Исходные

Исходные материалы (стадия 1) материалы (стадия 2)

Аналитические данные промежуточного кислоты стадии 2 продукта бензойной

ЖХМС (АА): m/z=935,6 (М-Н);

ЖХМС (АА): m/z= 1290,2 (М-Н);

* DMAP не использовался на стадии 2.

Пример 38D.

4-{[(2S,5S)-57-амино-5-изопропил-2-метил-4,7-диоксо10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55-гексадекаокса-3,6-диазагептаспентаконтан-1-оил]амино}бензил [2-({9-[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопентау[1 ] [ 1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1H-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат (С-37)

- 103 048725

Стадия 1: 4-{[(53S,56S)-1-a3ugo-53-u3onponun-56-MeTun-51,54,57-TpuoKCO3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48-гексадекаокса-52,55-диазагептапентаконтан-57-ил]амино}бензил [2-({9-[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Н-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат.

К раствору промежуточного продукта 8 (18,68 мг, 0,01674 ммоль), 1-[(1-азидо-51-оксо3,6,9,12,15,18,21,24,27,3 0,3 3,3 6,39,42,45,48-гексадекаоксахенпентаконтан-51 -ил)окси]пирролидин-2,5диона (32,3 мг, 0,03348 ммоль), ТГФ (0,6 мл) и ДМФА (0,2 мл) добавляли DIEA (0,044 мл, 0,2511 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч, затем гасили МеОН (5 мл). После выпаривания большей части растворителя остаток очищали с помощью колоночной хроматографии с обращенной фазой (0-50% ACN/водный раствор бикарбоната аммония (5 мМ)). Желаемые фракции упаривали и лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения (17,8 мг, 55%) в виде белого порошка. ЖХМС (АА): m/z=1915 (M-H).

Стадия 2: 4-{[(2S,5S)-57-амино-5-изопропил-2-метил-4,7-диоксо10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55-гексадекаокса-3,6-диазагептапентаконтан-1-оил]амино}бензил [2-({9-[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат (С-37).

В круглодонную колбу на 50 мл добавляли 4-{[(53S,56S)-1-азидо-53-изопропил-56-метил-51,54,57триоксо-3,6,9,12,15,8,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48-гексадекаокса-52,55-диазагептапентаконтан-57-ил]амино}бензил [2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Н-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат (17,7 мг, 0,00923 ммоль), ТГФ (1,0 мл) и трифенилфосфин (24,2 мг, 0,0923 ммоль). Эту смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. К реакционной смеси добавляли гидроксид натрия (0,0554 мл, 1,0 моль/л в воде). После перемешивания смеси при комнатной температуре в течение 1 ч ее упаривали. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии с обращенной фазой (0-50% ACN/водный бикарбонат аммония (5 мМ)). Желаемые фракции собирали и лиофилизировали с получением 4-{[(2S,5S)-57амино-5-изопропил-2-метил-4,7-диоксо-10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55-гексадекаокса-3,6диазагептапентаконтан- 1-оил]амино}бензил [2-({ 9-[(2R, 5R,7R,8R,10R, 12aR, 14R, 15aS,16R)-16-гидрокси2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Шпурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамата (С-37) (5,7 мг, 32%) в виде белого пушистого порошка. ЖХМС (АА): m/z=1889 (M-H). MCBP (m/z): [M+H]+ вычисл. для C₈₀Hi₂₄N₁₂O₃₂P₂S₂ 1891,7434; найдено, 1891,7433.

Пример 38Е.

N-{(2S)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-1-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-1оксогексан-2-ил}-2,5,8,11,14,17,20,23-октаоксагексакозан-26-амид (промежуточный продукт 39)

- 104 048725

Стадия 1: (28S)-28-[4-(2,5-guoKCO-2,5-gurugpo-1 H-пиррол-1 -ил)бутил]-26-оксо-2,5,8,11,14,17,20,23октаокса-27-азанонакозан-29-овая кислота.

К смеси гидрохлорида (2S)-2-амино-6-(2,5-диоксопиррол-1-ил)гексановой кислоты (1,05 г, 4,00 ммоль) и 1-[(26-оксо-2,5,8,11,14,17,20,23-октаоксагексакозан-26-ил)окси]пирролидин-2,5-диона (2,08 г, 4,04 ммоль) в пиридине (21,0 мл) добавляли DIEA (1,43 мл, 8,20 ммоль), и смесь оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 30 минут, затем охлаждали до 0°С и перемешивали в течение ночи. Летучий растворитель удаляли, а остаток подвергали азеотропной перегонке с толуолом (3x20 мл) и ацетонитрилом (10 мл) с получением (28S)-28-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)бутил]26-оксо-2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса-27-азанонакозан-29-овой кислоты (4,00 г, выход 100%) в виде бесцветного масла. ЖХМС (АА): m/z=619,3 (M-H).

Стадия 2: N-{(2S)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-1-[(2,5-диоксопирролидин-1ил)окси]-1-оксогексан-2-ил}-2,5,8,11,14,17,20,23-октаоксагексакозан-26-амид (промежуточный продукт 39).

Смесь N-гидроксисукцинимида (469 мг, 4,08 ммоль), N, N'-дициклогексилкарбодиимида (824 мг, 4,00 ммоль) и неочищенного (28S)-28-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)бутил]-26-оксо2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса-27-азанонакозан-29-овой кислоты со Стадии 1 (4,00 г, 4,00 ммоль) в ДХМ (76,7 мл, 1200 ммоль) перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Твердое вещество, выпавшее из этой реакции, фильтровали и фильтрат упаривали с получением неочищенного масла. Очистка хроматографией на силикагеле (0-20% ИПС/ДХМ) давала N-{(2S)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Hпиррол-1-ил)-1- [(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-1-оксогексан-2-ил}-2,5,8,11,14,17,20,23октаоксагексакозан-26-амида (Промежуточный продукт 39) (1,70 г, 52%) в виде бесцветного масла. ¹H ЯМР (400 МГц, метанол®) δ м.д. 1,42-1,55 (м, 2 Н) 1,64 (м, 2 Н) 1,81-1,93 (м, 1 Н) 1,94-2,01 (м, 1 Н) 2,52 (м, 2 Н) 2,81-2,86 (м, 4 Н) 3,36 (с, 3 Н) 3,51-3,57 (м, 4 Н) 3,60-3,66 (м, 26 Н) 3,68-3,76 (м, 2 Н) 4,03-4,17 (м, 2 Н) 4,74-4,80 (м, 1 Н) 6,74-6,86 (с, 2 Н).

Пример 38F.

N-{(2S)-6-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил) ацетил]амино}-1-[(2,5-диоксопирролидин-1ил)окси]-1-оксогексан-2-ил}-2,5,8,11,14,17 ,20,23-октаоксагексакозан-26-амид (Промежуточный продукт 40)

Стадия 1: (28S)-28-{4-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутил}-26-оксо-2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса27-азанонакозан-29-овая кислота.

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в примере 38Е, стадия 1, исходя из ^-(трет-бутоксикарбонил)Ж-лизина (0,49 г, 1,99 ммоль) вместо гидрохлорида (2S)-2-амино-6-(2,5-диоксопиррол-1-ил) гексановой кислоты. Очистка колоночной хроматографией с обращенной фазой (0-60% ACN/водная муравьиная кислота (0,1%)) давала (28S)-28-{4-[(третбутоксикарбонил)амино]бутил}-26-оксо-2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса-27-азанонакозан-29-овую кислоту(1,14 г, 90%) в виде бесцветного масла. ЖХМС (АА): m/z=639,4 (M-H).

- 105 048725

Стадия 2: (28S)-28-(4-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}бутил)-26-оксо2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса-27-азанонакозан-29-овая кислота.

К раствору (28S)-28-{4-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутил}-26-оксо-2,5,8,11,14,17,20,23октаокса-27-азанонакозан-29-овой кислоты (148 мг, 0,2310 ммоль) в ДХМ (2,0 мл) добавляли ТФУ (2,0 мл) при комнатной температуре. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут, упаривали и затем упаривали совместно с толуолом (х3), получая неочищенную соль ТФУ. После дополнительной сушки этого неочищенного продукта в высоком вакууме в течение 2 часов добавляли NHSэфир малеимидоуксусной кислоты (69,89 мг, 0,2772 ммоль) в ДХМ (2650 мг, 2,00 мл, 31,2 ммоль) и DIEA (0,121 мл, 0,6929 ммоль), и эту реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Реакционную смесь упаривали. Очистка колоночной хроматографией с обращенной фазой (1030% ACN/водный раствор ацетата аммония (10 мМ)) давала (28S)-28-(4-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Hпиррол-1-ил)ацетил]амино}бутил)-26-оксо-2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса-27-азанонакозан-29-овую кислоту (120 мг, 38%) в виде масла. ЖХМС (АА): m/z=676,3 (M-H).

Стадия 3: N-{(2S)-6-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}-1-[(2,5диоксопирролидин-1 -ил)окси] -1 -оксогексан-2-ил }-2,5,8,11,14,17,20,23 -октаоксагексакозан-26-амид (Промежуточный продукт 40).

В колбу, содержащую (28S)-28-(4-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}бутил)26-оксо-2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса-27-азанонакозан-29-овую кислоту (311 мг, 0,459 ммоль) и ДХМ (2,94 мл) добавляли N, N'-дициклогексилкарбодиимид (94,7 мг, 0,459 ммоль) и N-гидроксисукцинимид (53,9 мг, 0,459 ммоль). Суспензию перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем реакционную смесь охлаждали до 0 °С, фильтровали через целит и промывали MeCN. Фильтрат упаривали. Остаток повторно растворяли в ДХМ, промывали водой (х2), сушили MgSO4 и упаривали с получением N-{(2S)-6-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}1-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-1-оксогексан-2-ил}-2,5,8,11,14,17,20, 23-октаоксагексакозан-26амида (Промежуточное соединение 40) (300 мг, 84,4%) в виде липкого масла. ЖХМС (АА): m/z=773,2 (M-H).

Пример 38G.

Соединение, указанное в табл. 22С (С-43), получали, как описано в примере 23, стадии 2 и стадии 3, заменяя исходный материал, показанный в таблице, на метил (2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-триацетокси-6- {2[(3-{[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]амино}пропаноил)амино]-4-[({[2-({9[(2R,5R,7R, 8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7 ил]-6-оксо-6,9-дигидро-Ш-пурин-2-ил}карбамоил)бензил](метил)карбамоил}окси)метил]фенокси}тетрагидро-2Н-пиран-2-карбоксилат.

Таблица 22В

Исходный материал	Продукт	Аналитические данные
0 г ° ° > / о I 1 Л Ai о Ал /тА ii ГА° ПЛ 9 ?' Л А) ° аМ Н<5 б О А нА HS'⁰ Пром. соед.-43	С-43	ЖХМС (АА): m/z=1755 (М+Н); МСВР (m/z): [М+Н]⁺ вычисл. ДЛЯ C72H97N11032P2S2 1754,5291; найдено, 1754,5321.

- 106 048725

Таблица 22С

Пример 38Н.

Промежуточный продукт 44, указанный в табл. 22D, получали, как описано в Примере 38Е, заменяя гидрохлорид (^)-2-амино-6-(2,5-диоксопиррол-1-ил)гексановой кислоты на стадии 1 на исходный материал гидрохлорид (2R)-2-амино-6-(2,5-диоксопиррол-1-ил)гексановой кислоты, показанный в табл. 22D,

Таблица 22D

Пример 39.

Процедура приготовления конъюгатов агонистов Ab-STING посредством стохастической конъюгации цистеина (изображена на фиг. 1).

К раствору антитела против GCC (клон 5F9, см. Публикацию РСТ № WO 2011/050242, 60 мг/мл) в 50 мМ гистидине, 100 мМ аргинине, буфер рН 6,0 добавляли буфер 0,5 М Трис/25 мМ EDTA рН. 8,0 буфера до тех пор, пока рН раствора не станет 7,5-8,0. К вышеуказанному раствору добавляли ТСЕР (10 мМ раствор в Н2О, 3-5 экв.). Реакционную смесь продували аргоном и инкубировали при комнатной температуре или 37°С в течение 2 часов при осторожном встряхивании. Затем к указанной выше смеси медленно добавляли желаемую конструкцию линкер-полезная нагрузка (10 мМ раствор в DMA, 5-9 экв.). Реакционную смесь продували аргоном и инкубировали при 37°С еще 1,5-2 ч при осторожном встряхивании. Реакционную смесь очищали, следуя описанному в данном документе препаративному методу SEC, с получением ADC. Концентрацию ADC, процент агрегации и DAR определяли с помощью УФпоглощения, аналитического SEC и ЖХ-QTOF соответственно, как описано в аналитических методах.

Вышеуказанная процедура может быть использована для получения конъюгатов других антител. Пример 40.

Конъюгаты антитело-лекарственное средство, перечисленные в табл. 24, получали, как описано в Примере 39, с использованием исходных конструкций линкер-полезная нагрузка, показанных в качестве исходного материала.

- 107 048725

Таблица 24

Исходный материал	ADC продукт	Полезная нагрузка	DAR	Агрегация %	Выход %
С-21	ADC-1	Соединение № 14	4,5	3,09	100
С-27	ADC-2	Соединение 1-5с	3,7	2,08	56
С-3	ADC-3	Соединение 1-5с	2,9	нпко	57
С-16	ADC-4	Соединение 1-5с	3,5	2,13	69
С-8	ADC-5	Соединение 1-5с	3,6	1,54	50
С-24	ADC-6	Соединение 1-5с	2,5	2,58	56
С-26	ADC-7	Соединение 1-5с	4,1	НПКО	42
С-18	ADC-8	Соединение 1-5с	3,9	0,59	83
С-1	ADC-9	Соединение 1-5с	4,3	НПКО	29
С-4	ADC-15	Соединение № 14	3,1	нпко	63
С-38	ADC-16	Соединение № 14	3,7	нпко	60

Пример 41.

Процедура приготовления конъюгатов агонистов Ab-STING с помощью конъюгации трансглутаминазы (изображена на фиг. 2).

Дегликозилирование: раствор антитела против GCC (клон 5F9, см. Публикацию РСТ № WO 2011/050242, 60 мг/мл) в 50 мМ гистидине, 100 мМ аргинине, буфер рН 6,0 разбавляли равным объемом PBS с рН 7,2. К раствору добавляли N-гликозидазу F (New England Biolabs, P0704S, 500 000 единиц/мл, 300 единиц на 1 мг антитела) и реакционную смесь нагревали до 37°С при осторожном перемешивании в течение ночи. Полученный дегликозилированный 5F9 заменяли буфером PBS, рН 7,2.

Конъюгация трансглутаминазы: к раствору дегликозилированного 5F9 (10-20 мг/мл) в PBS, полученному выше, добавляли 0,1 М ДМСО раствор 29-азидо-3,6,9,12,15,18,21,24,27-нонаоксанонакозан-1амина (азидо-PEG9-амин, BroadPharm, BP-23556, 40 эквивалентов), за которым следует трансглутаминаза (ACTIVA™, Ajinomoto, 5~10 мг на 1 мг антитела). Реакционную смесь нагревали до 37°С при осторожном перемешивании в течение ночи. Продукт очищали описанным в данном документе препаративным методом SEC с получением 5F9-NH-PEG-азида.

Штамм-промотируемое азид-алкиновое циклоприсоединение: К раствору конъюгата 5F9-NH-PEGазид, полученному выше (2-15 мг/мл в PBS), добавляли 4~10 мМ ДМСО раствор напряженного алкина, содержащего конструкции линкер-полезная нагрузка (3-5 эквивалентов, в которых ДМСО <10% от общего объема растворителя). Реакционную смесь осторожно перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Продукт очищали описанным в данном документе препаративным методом SEC, чтобы получить ADC. Концентрацию ADC, процент агрегации и DAR определяли с помощью УФ-поглощения, аналитического SEC и ЖХ-QTOF соответственно, как описано в аналитических методах.

Вышеуказанная процедура может быть использована для получения конъюгатов других антител.

Пример 42.

Конъюгаты антитело-лекарственное средство, перечисленные в табл. 25, получали, как описано в Примере 41, с использованием исходных конструкций линкер-полезная нагрузка, показанных в качестве исходного материала в таблице.

Таблица 25

Исходный материал	ADC продукт	Полезная нагрузка	DAR	Агрегация %	Выход %
С-15	ADC-10	Соединение 1-5с	1,8	НПКО	40
С-13	ADC-11	Соединение 1-5с	2	нпко	81

Пример 43.

Получение конъюгатов агонистов Ab-STING с помощью конъюгации трансглутаминазы (изображено на фиг. 3).

К дегликозилированному раствору 5F9 (10~20 мг/мл, полученному в соответствии с процедурой дегликозилирования, описанной в Примере 41) в PBS добавляли 1 М Трис, 5 М NaCl, буфер рН 8,0 (10~20% от общего объема), чтобы довести рН до 8.0. К раствору добавляли 10 мМ раствор DMSO первичных аминсодержащих конструкций линкер-полезная нагрузка (20 экв.), а затем трансглутаминазу (ACTIVA™, Ajinomoto, 100-150 мг на 1 мг антитела). Реакционную смесь нагревали до 37°С при осто

- 108 048725 рожном перемешивании в течение ночи. Продукт очищали с использованием колонки HiTrap Protein A HP (GE Healthcare, 17-0402-01), сначала промывая раствором 20 мМ фосфата, рН 7,0, а затем элюируя ADC 0,1 М лимонной кислотой, рН 4,0.

Пример 44.

Конъюгаты антитело-лекарственное средство, перечисленные в табл. 26, получали, как описано в Примере 43, с использованием исходных конструкций линкер-полезная нагрузка, показанных в качестве исходного материала в таблице.

Таблица 26

Исходный материал	ADC продукт	Полезная нагрузка	DAR	Агрегация %	Выход %
С-30	ADC-17	Соединение 1-5с	1,6	нпко	72
С-37	ADC-18	Соединение 1-5с	1,2	нпко	72

Пример 45.

2-амино-№(2-((2-(2-азидоацетамидо)этил)амино)-2-оксоэтил)ацетамид

EDC

HOAt

ΝΕΕ

Cbz

Вос

DMF

H₂, Pd/C этанол

Вос

EDC, HOAt. iPrNEt₂, DMF

Стадия 1: бензил (2,2-диметил-4,7,10-триоксо-3-окса-5,8,11-триазатридекан-13-ил)карбамат

К раствору Boc-Gly-Gly-OH (550 мг, 2,32 ммоль), EEDC-HCl (437 мг, 2,28 ммоль) и HOAt (317 мг, 2,33 ммоль) в ДМФА (8,0 мл) добавляли триэтиламин (0,340 мл, 2,44 ммоль) при 0 °С. Полученной желтой гетерогенной смеси давали перемешиваться в течение 15 минут. Медленно добавляли раствор бензил (2-аминоэтил)карбамата (500 мг, 2,44 ммоль) в ДМФА (6,0 мл). Через 10 минут смеси давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 3 дней. Реакционную смесь распределяли в воду (100 мл) и EtOAc (50 мл). Отделенный водный слой экстрагировали EtOAc (50 мл). Объединенный органический слой промывали 50 мл воды, затем солевым раствором, сушили над Na2SO4 и упаривали. Неочищенный продукт очищали хроматографией на силикагеле (0-6% MeOH/CH₂Cl₂) с получением третбутил №[2-[[2-[2-(бензилоксикарбониламино)этиламино]-2-оксоэтил]амино]-2-оксоэтил]карбамата (617 мг, 1,51 ммоль, выход 65%) в виде белого твердого вещества. ЖХМС (МК): m/z=431,2 (M+Na). ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-06) δ 7,97-7,97 (м, 1H), 7,86-7,84 (м, 1H), 7,39-7,29 (м, 5Н), 7,27-7,24 (м, 1H), 7,01-6,98 (м, 1H), 5,02 (с, 2Н), 3,67 (д, J=5,62 Гц, 2Н), 3,58 (д, J=5,87 Гц, 2Н), 3,03-3,18 (м, 4Н), 1,39 (с, 9Н).

Стадия 2: трет-бутил (2-((2-((2-аминоэтил)амино)-2-оксоэтил)амино)-2-оксоэтил)карбамат.

К раствору трет-бутил №[2-[[2-[2-(бензилоксикарбониламино)этиламино]-2-оксоэтил]амино]-2оксоэтил]карбамата (615 мг, 1,51 ммоль) в этаноле (20,0 мл) добавляли 10% Pd/C (62,0 мг, 0,0583 ммоль). Смесь продували Н₂ (1 атм) и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. К реакционной смеси добавляли целит и суспензию фильтровали через небольшой слой целита. Фильтрат упаривали и остаток сушили совместным выпариванием с толуолом с последующим высоким вакуумом с получением трет-бутил №[2-[[2-(2-аминоэтиламино)-2-оксоэтил]амино]-2-оксо-этил]карбамата (407 мг, 1,48 ммоль, выход 98,5%) в виде не совсем белого твердого вещества. ЖХМС (МК): m/z=275,2 (М+Н). 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-06) δ 8,05-7,89 (м, 1H), 7,80-7,63 (м, 1H), 7,08-6,96 (м, 1H), 3,67 (д, J=5,75 Гц, 2Н), 3,56 (д, J=5,87 Гц, 2Н), 3,06 (к, J=6,24 Гц, 2Н), 2,59-2,53 (м, 2Н), 1,87-1,61 (м, 2Н), 1,39 (с, 9Н).

Стадия 3: трет-бутил №[2-[[2-[2-[(2-азидоацетил)амино]этиламино]-2-оксоэтил]амино]-2оксоэтил]карбамат.

Смесь EDC-HCl (57,6 мг, 0,300 ммоль), HOAt (43,6 мг, 0,320 ммоль) и 2-азидоуксусной кислоты (27,0 мкл, 0,315 ммоль) в дихлорметане (2,70 мл) перемешивали в течение 10 минут. Смесь охлаждали на ледяной бане, а затем добавляли трет-бутил №[2-[[2-(2-аминоэтиламино)-2-оксоэтил]амино]-2

- 109 048725 оксоэтил]карбамат (75,0 мг, 0,273 ммоль), а затем через несколько минут добавляли N, Nдиизопропилэтиламин (55,8 мкл, 0,320 ммоль). Смесь оставляли перемешиваться в течение 5 минут при 0 °С, а затем при комнатной температуре в течение ночи. Добавляли воду (2 мл) и EtOAc (5 мл), и смесь интенсивно перемешивали в течение 20 минут. Смесь разбавляли EtOAc (25 мл), а затем промывали 50%-ным солевым раствором/водой (20 мл) и солевым раствором. Отделенный органический слой сушили над Na2SO4 и упаривали. Очистка хроматографией на силикагеле (0-8% MeOH/CH₂Cl₂) дала третбутил №[2-[[2-[2-[(2-азидоацетил)амино]этиламино]-2-оксоэтил]амино]-2-оксоэтил]карбамат (88,0 мг, 0,246 ммоль, выход 90,1%) в виде стекловидного твердого вещества. ЖХМС (МК): m/z=356,2 (М-Н). 1H ЯМР (400 МГц, ДСО-de) δ 8,16-8,08 (м, 1H), 8,04-7,92 (м, 1H), 7,92-7,81 (м, 1H), 7,05-6,94 (м, 1H), 3,82 (с, 2Н), 3,67 (д, J=5,62 Гц, 2Н), 3,58 (д, J=5,87 Гц, 2Н), 3,10-3,19 (м, 4Н), 1,39 (с, 9Н).

Стадия 4: 2-амино-Ы-[2-[2-[(2-азидоацетил)амино]этиламино]-2-оксоэтил]ацетамид (Промежуточный продукт 34).

К раствору трет-бутил №[2-[[2-[2-[(2-азидоацетил)амино]этиламино]-2-оксоэтил]амино]-2-оксоэтил]карбамата (86,0 мг, 0,241 ммоль) в дихлорметане (4,0 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (1,00 мл, 8,77 ммоль). Смесь оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 30 минут. Смесь разбавляли 5 мл толуола и упаривали. Остаток растворяли в 5 мл воды и лиофилизировали, получая 2-амино-Ы-[2-[2-[(2-азидоацетил)амино]этиламино]-2-оксоэтил]ацетамид 2,2,2-соль трифторуксусной кислоты (102 мг, 0,275 ммоль, количественно) бесцветный сироп. ЖХМС (МК): m/z=258,l (М+Н). ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСОЛ₆) δ 8,55-8,62 (м, 1H), 8,12-8,20 (м, 1H), 8,02-8,09 (м, 1H), 7,90-8,02 (м, ЗН), 3,743,82 (с, 2Н), 3,80 (м, 2Н), 3,55-3,68 (м, 2Н), 3,11-3,19 (м,4Н).

Пример 46.

Производство и очистка 5F9-LPETGG-His6.

Белок 5F9-LPETGG-His6 продуцировали с использованием набора для системы временной экспрессии белков млекопитающих Expi293F от Thermo Fisher, кат. №. А14635, который включает клетки Expi293FTM, среду для выращивания Expi293TM Expression и набор для трансфекции Expifectamine 293TM. 1,8 литра клеток Expi293FTM при плотности 2.8x10 клеток/мл в вентилируемой встряхиваемой колбе объемом 5 л трансфицировали с 0,666 мг ДНК легкой цепи плюс 0,334 мг ДНК тяжелой цепи, смешанной с 5,4 мл реагента для трансфекции Expifectamine 293 ТМ, и инкубировали в течение ночи в 37°С, инкубатор с 8% СО₂ и встряхивали со скоростью 100 об/мин. На следующий день в колбу добавляли 10 мл энхансера 1 и 100 мл энхансера 2 из набора. Колбу инкубировали при вышеуказанных условиях и собирали на 5 день после трансфекции. Клетки центрифугировали при 9000 об/мин в течение 10 минут при 4°С, затем стерилизовали фильтрованием через фильтрующий элемент 0,22 мкм и хранили при 4°С до очистки на колонке с 30 мл MabSelect SuRe LX Protein A (GE Healthcare, каталог 17-5474-03), который был свежеупакованным. После того, как супернатант был нанесен на колонку с использованием перисталического насоса, смолу промыли 60 мл [2 объема колонки (CV]) буфера с низким содержанием соли (25 мМ тринатрийцитрат рН 7,6, 125 мМ NaCl), затем промыли 60 мл (2CV) буфера с высоким содержанием соли (25 мМ тринатрийцитрата, рН 7,6, 2М NaCl) с последующей промывкой еще 60 мл (2CV) буфера с низким содержанием соли. Белок элюировали элюированием в градиенте рН 25 мМ лимонной кислотой, 125 мМ NaCl, рН от 8 до рН2,2, и собирали фракции пиков. Каждую фракцию нейтрализовали 1 М тринатрийцитратом рН 8,2 до 70 мМ для приблизительного рН 6. Фракции в основном пике (2А5-2С5) объединяли. Объединенные фракции концентрировали и буфер заменяли на 25 мМ цитрат натрия, рН 5,5, 125 мМ NaCl буфер с использованием картриджа Sartorius VIVAFLOW200 с отсечкой по молекулярной массе 50 кДа. Затем образец фильтровали через блок шприцевого фильтра 0,22 мкМ, разделяли на аликвоты и хранили при -80°С. Конечный выход составил 623 мг очищенного антитела 5F9-LPETGG-His6 с чистотой > 95% и эндотоксином 0,64 EU/мл.

Последовательность тяжелой цепи:

MGWSCIILFLVATATGVHSOVOLOOWGAGLLKPSETLSLTCAVFGGSFSGYYWSWIRO PPGKGLEWIGEINHRGNTNDNPSLKSRVTISVDTSKNQFALKLSSVTAADTAVYYCARE RGYTYGNFDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKA GGGSLPETGGHHHHHH (сигнальная последовательность подчеркнута) (SEQ Ш NO. 1) Последовательность легкой цепи:

- 110 048725

MGWSCIILFLVATATGVHSEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASOSVSRNLAWYOOKP GQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTIGSLQSEDFAVYYCQQYKTWPRTFGQ GTNVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (сигнальная последовательность подчеркнута) (SEQ Ш NO. 2)

Пример 47.

Процедура приготовления конъюгатов агонистов Ab-STING с помощью Sortase конъюгации (изображено на фиг. 4) Sortase конъюгация: антитело 5F9, содержащее LPETGG-His6 на его С-конце тяжелых цепей, было получено в соответствии с процедурами, описанными в Примере 46. Раствор 5F9, содержащий метки LPETG-His6 на С-конце (5F9-LPETGG-His6) тяжелых цепей в 25 мМ цитрате, 125 мМ NaCl, буфере рН 5,5, разбавляли буфером 50 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, рН 7,45, так что концентрация белка составляла 48 мкМ. К раствору добавляли CaCl₂ (4 мМ водный раствор, 80~100 эквивалентов) и 2-амино№[2-[2-[(2-азидоацетил)амино]этиламино]-2-оксоэтил]ацетамид (Промежуточный продукт 34, 800 мкМ раствор в 50 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, буфер рН 7,45 с 0,1% ДМСО, 20 эквивалентов), затем следует Sortase A Q60-K206-P94S-D160N-D165A-K196 His6 (выраженный, как описано в Antos, J. M., Ingram, J., Fang, Т., Pishesha, N., Truttmann, M. С, Ploegh, H. L. (2017). Сайт-специфическое мечение белков посредством транспептидации, опосредованной сортировкой. Current Protocols in Protein Science, 89, 15.3.115.3.19, 2,0 мкМ раствор в 50 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, буфер рН 7,45, 0,03 эквивалента). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часа. Продукт очищали на никелевой колонке Capturem (от Takara, промывали PBS) с последующим диализом или описанным в данном документе препаративным методом SEC с получением 5F9-LPETG-азида.

Штамм-промотируемое азид-алкиновое циклоприсоединение: к раствору конъюгата 5F9- LPETGGNH(CH₂)₂NHCOCH₂-азида, полученному выше (2~15 мг/мл в PBS), добавляли раствор 4~10 мМ в ДМСО напряженного алкина, содержащего конструкцию линкер-полезная нагрузка (3-5 эквивалентов, в которых ДМСО < 10% от общего объема растворителя). Реакционную смесь осторожно перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Продукт очищали описанным в данном документе препаративным методом SEC, чтобы получить ADC. Концентрацию ADC, процент агрегации и DAR определяли с помощью УФ-поглощения, аналитического SEC и ЖХ-QTOF соответственно, как описано в аналитических методах.

Пример 48.

Конъюгаты антитело-лекарственное средство, перечисленные в табл. 27, получали, как описано в Примере 47, с использованием исходных конструкций линкер-полезная нагрузка, показанных в качестве исходного материала в таблице.

Таблица 27

Исходный материал	ADC продукт	Полезная нагрузка	DAR	Агрегация %	Выход %
С-15	ADC-12	Соединение 1-5с	1,4	3,67	60
С-9	ADC-13	Соединение 1-5с	1,8	нпко	66
С-13	ADC-14	Соединение 1-5с	1,4	3,7	84

Пример 49.

Биологические протоколы и данные клеточного анализа sting.

Условия анализа тритосом.

Тестируемое соединение (121 мкМ раствор линкер-полезная нагрузка конструкции в ДМСО или раствор ADC в PBS, 4,65 мкл) добавляли к смеси 125 мкл тритосом печени крысы (приобретены у XenoTech) и 433 мкл водного буферного раствора (54,7 мг/мл фосфата, 1,7 мг/мл ЭДТА, рН 6,0), и раствор инкубировали при 37°С. 40 мкл образца удаляли через 10 и 30 мин, 1, 3, 5 и 24 часа и обрабатывали 160 мкл 0,1% муравьиной кислоты в растворе метанола на 96-луночном планшете, а затем хранили при 80°С. После сбора последней временной точки каждый образец оттаивали и обрабатывали 200 мкл 0,1% муравьиной кислоты в метанольном растворе, содержащем 150 нМ карбутамида (внутренний стандарт). Образцы центрифугировали при 4000 g в течение 10 минут и анализировали в соответствии с методом ЖХ/МС/МС, описанным в данном документе. Для расчета t_1/2 использовалась программа Excel-Fit. Расчетное значение t_1/2 представлено в табл. 28. Как показано в табл. 28, свободное высвобождение полезной нагрузки из ADC-3 в этом тритосомном анализе не наблюдалось в течение 24 часов, в то время как ADC9, имеющий ту же полезную нагрузку, успешно высвободил полезную нагрузку с t_1/2, равным 7 часов, что указывает на то, что линкер ADC-9 привел к заметно улучшенной скорости высвобождения полезной нагрузки в условиях суррогатного высвобождения клеток по сравнению с ADC-3.

- 111 048725

Таблица 28

ADC	Полезная нагрузка	ti/2 (час)
ADC-1	Соединение № 14	2,4
ADC-3	Соединение 1-5с	.*
ADC-9	Соединение 1-5с	7,0
ADC-15	Соединение № 14	2,9
ADC-16	Соединение № 14	3,7

* Свободное высвобождение полезной нагрузки в течение 24 часов не наблюдалось.

Графическое представление высвобождение полезной нагрузки в течение времени для ADC-1, ADC-3 и ADC-9 в табл. 28 показано на фиг. 5, 6 и 7.

Условия анализа стабильности плазмы.

Тестируемые соединения вносили в 1 мл плазмы при концентрации 10 мкг/мл, а затем 5 аликвот равного объема распределяли в 2 мл микроцентрифужные пробирки Eppendorf (обозначенные 0, 24, 48, 72 и 96 часов). Пробирки с образцами времени 0 немедленно хранили при -80°С, а остальные пробирки инкубировали при 37°С при умеренном встряхивании. Аликвоты удаляли из инкубатора в соответствующий момент времени и хранили при -80°С. После того, как все образцы были собраны, их разморозили при комнатной температуре и поместили на влажный лед. 50 мкл каждого образца трижды разливали в 96-луночный микротитровальный планшет. Образцы гасили 200 мкл ледяного метанола, содержащего 50 нМ внутреннего стандарта. Образцы встряхивали в течение 2 минут, затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут. 185 мкл супернатанта переносили на чистый планшет для инъекций, затем сушили в атмосфере N2 газа при 40°С. Экстракты высушенных образцов восстанавливали 100 мкл воды класса ЖХМС, затем встряхивали в течение 1 мин для подготовки к анализу ЖХ-МС/МС.

Каждый образец разделяли обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием колонки Synergi 2.5ц Polar-RP 100А C18 (2,0 мм х 30 мм) (Phenomenex®) при 40°С с использованием градиента, состоящего из 0,1% муравьиной кислоты в воде (растворитель А) и 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (растворитель В). Аналиты были обнаружены с помощью распыления положительных ионов в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) с использованием прибора SCIEX API 4500 QTRAP. Процент потери полезной нагрузки в плазме человека, приматов и мышей в различные моменты времени представлен в табл. 29.

Таблица 29

AD С	Потеря полезной нагрузки (%) в плазме человека	Потеря полезной нагрузки (%) в плазме обезьяны	Потеря полезной нагрузки (%) в плазме мышей
1д	2д	Зд	4д	1д	2д	Зд	4д	1д	2д	Зд	4д
AD С-9	0,1	0,7	1,1	1,7	0,3	0,3	1,0	1,2	1,4	2,1	3,0	3,4
AD С-2	5,7	ИД	13,2	20,8	7,3	14,2	20,9	25,8	5,8	9,4	14,1	18,8
AD	0,1	0,8	1,6	1,8	0	0,7	1,3	1,6	0,4	0,8	1,0	5,6

- 112 048725

С-4
AD С-3	1,3	3,7	5,4	7,3	1,4	3,2	5,5	7,6	0,7	1,5	1,0	1,3
AD С-1	11,5	21,6	32,1	40,9	Нет дани ых	Нет дани ых	Нет дани ых	Нет дани ых	9,2	16,0	23,3	30,4
AD С- 10	0	0	1,2	1,7	0	0	1,1	1,5	2	1,8	1,9	2,6
AD С-5	0	0,9	1,6	2,1	0,5	0,7	1,3	1,8	2,2	1,5	2,2	6,3
AD С-6	0	0	1,7	2,4	0,6	1,1	1,5	2,3	0,3	0,7	1,0	0,9
AD С-7	6,3	12,0	15,5	23,4	6,0	11,6	16,3	20,5	4,0	6,0	3,6	19,9
AD С-8	0,2	0,6	0,9	1,2	0,3	0,5	0,7	1,0	0,5	0,7	1,3	1,3
AD С- 12	0	0	0,3	1,7	0	0,4	1,1	1,3	21,2	25,6	27,2	28,8
AD С- 14	0	0,7	2,2	2,6	0,5	1,0	1,6	2,4	16,5	15,0	17,6	17,8
AD С- 15	0,9	2,0	3,0	4,1	0	1,6	2,2	3,1	3,6	3,7	6,6	8,0
AD С- 16	1,0	2,0	2,5	3,6	0,9	1,1	1,7	2,6	2,5	8,6	8,4	11,7

Условия анализа репортерного гена ТНР1 Dual Lucia.

Клетки THP1-Dual™ KI-hSTING-R232 (InvivoGen # thpd-r232) были получены из линии моноцитов человека ТНР-1 путем стабильного двуаллельного нокаута эндогенного гена STING человека HAQ и нокаута варианта R232 человеческого STING. Эти клетки также стабильно экспрессируют индуцибельный секретируемый репортерный ген люциферазы Lucia под контролем минимального промотора ISG54 (интерферон-стимулированный ген) в сочетании с пятью IFN-стимулированными ответными элементами (ISRE). Экспрессия репортерного гена позволяет изучить путь регулирующего фактора IFN (IRF) путем оценки активности люциферазы Lucia. В дополнение к человеческому STING и люциферазе эти клетки были сконструированы для стабильной экспрессии человеческой гуанилилциклазы С (GCC), что позволило изучить опосредованную мишенью активацию пути IRF. В качестве контроля использовали неэкспрессирующие GCC векторные клетки.

В день эксперимента клетки высевали на белый 384-луночный планшет (Corning 356661) при плотности 15000 клеток/25 мкл на лунку в питательной среде (RPMI 1640, 2 мМ L-глутамин, 25 мМ HEPES, 10% термоинактивированная фетальная бычья сыворотка, 100 мкг/мл Normocin™, 100 U/μλ-ΙΟΟ мкг/мл Pen-Strep, 10 мкг/мл бластицидина, 100 мкг/мл зеоцина и 1 мкг/мл пуромицина). В планшеты с клетками добавляли 5 мкл образцов ADC, нацеленных на GCC, и затем инкубировали при 37°С в течение 20 часов. В конце инкубации добавляли 10 мкл/лунку QUANTI-Luc™ (InvivoGen # rep-qlc1) и сразу же измеряли люминесценцию с помощью LeadSeeker.

Для описанного выше метода анализа рассчитывали процент индукции сигнала люминесценции для

- 113 048725 каждого тестируемого ADC при различных концентрациях относительно необработанных и контрольных обработанных образцов. Кривые зависимости концентрации соединения от процента индукции сигнала были подогнаны для получения значений EC50. Специалист в данной области техники поймет, что значения, полученные как значения EC50, могут изменяться в эксперименте. Наблюдаемые EC50 и Emax представлены в табл. 30. Как показано в табл. 30 ниже, ADC-16 был в около 21 раз более активным, чем ADC-15 в векторных клетках ТНР1, вероятно, из-за более быстрого высвобождения внутриклеточной полезной нагрузки из ADC-16 по сравнению с ADC-15.

__________________________________________________________________Таблица 30

ADC	hGCC-экспрессия ТИР 1	Вектор THP 1
EC₅₀ hM	Emax	EC₅₀ hM	Emax
ADC-1	0,068	123	3,9	82,3
ADC-9	0,10	91,6	>280	39,6
ADC-2	0,28	80,7	>370	17,0
ADC-10	0,10	81,3	>180	3,8
ADC-3	>290	0,9	>290	0,4
ADC-4	0,047	96,6	3,92	67,6
ADC-5	0,089	82,5	11,0	49,8
ADC-11	0,12	86,9	>200	12,6
ADC-6	0,11	90,8	>250	28,3
ADC-7	0,57	90,1	>380	15,1
ADC-8	0,17	102,2	>430	40,2
ADC-12	0,10	94,8	>140	22,4
ADC-13	0,060	95	Нет данных	Нет данных
ADC-14	0,074	86,9	>140	15,4
ADC-15	0,067	108	242	54,9
ADC-16	0,040	97,7	11,2	83,0
ADC-17	0,032	105	>500	3,46
ADC-18	<0,025	100	>500	1,18

Пример 50.

Оценка фармакокинетики у мышей.

Для оценки in vivo ADC у мышей Balb/C, несущих GCC-экспрессирующие опухоли мышей карциномы толстой кишки СТ26, использовали самок мышей Balb/C в возрасте 6-8 недель (приобретенных в Jackson Laboratory). Родительские клетки CT26.WT были получены из АТСС, Каталожный № CRL-2638. GCC-экспрессирующие клетки СТ26 были сконструированы в Takeda путем трансдукции CT26.WT лентивирусным вектором pLenti6.3, содержащим ген GCC человека, с получением СТ26 pLenti6.3 GCC клона А5. Клетки СТ26 pLenti6.3 GCC clone A5 выращивали в стерильных условиях в инкубаторе при 37°С с 5% СО2 в течение 12-14 дней. Клетки выращивали в среде RPMI-1640 с 10% фетальной бычьей сывороткой. Клетки пассировали каждые 3-4 дня с использованием 0,05% трипсина/ЭДТА для отделения клеток. В день имплантации клетки поднимали и ресуспендировали в бессывороточной среде RPM-1640 в концентрации 0,5 х 10 6 клеток/100 мкл. Клетки клона А5 СТ26 pLenti6.3 GCC имплантировали подкожной инъекцией в нижний бок мыши с использованием иглы 27 размера (0,5 х 106 клеток /100 мкл инъекционного объема на мышь). После имплантации клеток опухоли измеряли штангенциркулем, и мышей взвешивали два раза в неделю после пальпации опухоли. Опухоли измеряли в двух измерениях. Измерения штангенциркуля рассчитывались как (Д х Ш2)/2. Мышей кормили нормальной диетой и помещали в помещение для животных SPF в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и правилами Институционального комитета по уходу и использованию животных. Животных содержали при температуре 18-26 °С, относительной влажности 50 ± 20% и периодических световых и темных циклах продолжительностью 12 часов с пищей и водой, доступными ad libitum.

Фармакокинетику ADC изучали после инъекции ADC мышам Balb/C, несущим опухоли CT26-GCC ^=3/группа лечения), когда средний объем опухоли (MTV) достигал 500-800 мм³. Образцы сыворотки отбирали в различные моменты времени и хранили в замороженном виде для анализа.

Уровни общих антител и конъюгированных полезных нагрузок в плазме мышей измеряли с помо

- 114 048725 щью анализа ЖХ/МС на основе иммунозахвата 2-в-1 в системе Shimadzu UHPLC, сопряженной с массспектрометром Sciex 6500 QTRAP. Вкратце, образцы плазмы мышей инкубировали с магнитными шариками, покрытыми антителами против человеческого IgG, в течение 45 минут при комнатной температуре, затем неспецифически связанные белки удаляли промыванием магнитных шариков PBST (буфер PBS при рН 7,4, содержащий 0,05% твин 20) и буфером PBS последовательно. После этого как голые антитела (DAR=0), так и ADC (DAR>1) элюировали с магнитных шариков 0,1% трифторуксусной кислотой. После нейтрализации элюентов и добавления внутренних стандартов, меченых стабильным изотопом, пипеткой отбирали одну аликвоту образца и расщепляли папаином в течение 1 часа при 37°С, а затем использовали для анализа конъюгированных полезных нагрузок методом ЖХ/МС. Оставшиеся образцы подвергали расщеплению трипсином/лиз-С в течение 1 часа при 70°С, затем использовали для анализа общего количества антител методом ЖХ/МС.

Свободную полезную нагрузку в кровотоке также измеряли с помощью ЖХ/МС после выполнения преципитации белков плазмы. Короче говоря, плазму мыши смешивали с 8 объемами метанола, содержащего внутренний стандарт, меченый стабильным изотопом, затем супернатанты выпаривали досуха при 40°С в слабом потоке азота. Наконец, остатки восстанавливали в воде для ЖХ/МС перед анализом ЖХ/МС. Профиль PK ADC-1, ADC-8 и ADC-9 представлен в табл. 31. Графическое изображение ФК плазмы показано на фиг. 12, 13 и 14. Как показано в табл. 24, значения DAR для ADC-1, ADC-8 и ADC-9 равны 4,5, 3,9 и 4,3 соответственно, что приводит к более высокой молярной концентрации конъюгированной CDN, полученной в момент времени 0, чем молярная концентрация общей Ab как показано на каждой из фиг. 8-10. Однако, как показано на фиг. 8, молярная концентрация конъюгированной CDN из ADC-1 упала быстрее, чем молярная концентрация общего Ab, и две концентрации объединились на 7 день (что привело к DAR около 1 в этот день), что указывает на то, что DAR ADC-1 со временем снижался из-за более низкой стабильности его линкера. Напротив, как показано на фигурах 9 и 10, молярная концентрация конъюгированной CDN как из ADC-8, так и из ADC-9 продолжала быть выше, чем у их соответствующих общих Ab на протяжении всего эксперимента. Кроме того, более длительный период полураспада конъюгированной полезной нагрузки/CDN от ADC-8 и ADC-9 по сравнению с ADC-1, как показано в табл. 31, вероятно, является результатом повышенной стабильности линкера в ADC-8 и ADC9. Таким образом, этот эксперимент показывает, что линкеры ADC-8 и ADC-9 обладают улучшенной стабильностью в плазме мышей по сравнению с ADC-1.

Таблица 31

ADC (доза полезной нагрузки)	Время полураспада (час)	AUC (последняя) (ч*нМ)
ADC-1 (0,1 мг/кг)	Конъюгированная полезная нагрузка	33	51432
Антитело	45	23280
ADC-9 (0.05 мг/кг)	Конъюгированная полезная нагрузка	50	46262
Антитело	62	13313
ADC-8 (0,055 мг/кг)	Конъюгированная полезная нагрузка	60	37315
Антитело	65	12540

Пример 51.

Оценка противоопухолевой активности у мышей.

Мышей Balb/C, несущие GCC-экспрессирующие СТ26 опухоли мышей карциномы толстой кишки, получали, как описано в примере 50.

Когда средний объем опухоли (MTV) достигал около 75 мм³, животных рандомизировали на несколько групп лечения (п=8/группу) и однократно вводили внутривенным путем различные дозы ADC. Опухоли продолжали измерять два раза в неделю. Эффекты лечения ADC на рост опухоли оценивали путем измерения объемов опухолей и сравнения с опухолями, обработанными носителем.

Конечная точка для исследований эффективности была достигнута, когда размер опухоли достигал 10% от веса тела животного или 2 см в любом направлении. После инъекции за мышами также внимательно наблюдали на предмет признаков клинического ухудшения. Если по какой-либо причине у мышей проявлялись какие-либо признаки заболевания, включая респираторный дистресс, сгорбленную осанку, снижение активности, паралич задних лап, тахипноэ как признак плеврального выпота, потерю веса, приближающуюся к 20% или 15% плюс другие признаки, или если их способность вести нормальную деятельность (кормление, подвижность) была нарушена, мышей умерщвляли.

- 115 048725

Графическое представление наблюдаемой противоопухолевой активности для ADC-1, ADC-5, ADC-8 и ADC-9 показано на фиг. 7, 8, 9 и 10 соответственно.

Коньюгаты липидов.

Сокращения.

АА	Метод ЖХМС с использованием ацетата аммония (ЖХМС АА)
Ас	ацетат
ACN	ацетонитрил
atm	атмосфера
aq	водный
BBN	борабицикло(3.3.1 )нонан
Bn	бензил
Вос	/77/9С/77-буТОКСИКарбоНИЛ
(Bpin)₂	бис(пинаколато)диборон

- 116 048725

tBu	третбутил
Bz	бензоил
C	Цельсия
CAD	Детектор заряженных аэрозолей
cGAMP	Циклический гуанозинмонофосфат-аденозинмонофосфат
DBAD	дитрет-бутил азодикарбоксилат
DBU	1,8-Диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ендихлоруксусная кислота
DCA	дихлоруксусная кислота
DCE	дихлорэтан
DCM	дихлорметан
DEAD	диэтил азодикарбоксилат
DIAD	диизопропил азодикарбоксилат
DIPEA	N, А-диизопропилэтиламин
DMAP	4-диметиламинопиридин
ДМФА	N, N-диметилформамид
ДМСО	диметилсульфоксид
DMTr	4,4 '-диметокситритил
DOTMA	1,2-ди-О-октадеценил-З-триметиламмоний пропан
DPPC	1,2-дипальмитоил-8п-глицеро-3-фосфохолин
DSPC	1,2-дистеароил-8п-глицеро-3-фосфохолин
Et	этил
EtOH	этанол
EtOAc	этилацетатт
MK	ЖХМС с использованием муравьиной кислоты
4	часы
Пром. соед.	промежуточный продукт
вэжх	высокоэффективная жидкостная хроматография
MCBP	масс-спектрометрия высокого разрешения
IC_5O	ингибирующая концентрация 50%
IPA	изопропиловый спирт
IPC	диизопинокамфеил
ЖХМС	жидкостная хроматография, масс-спектрометрия.
жх/мс/мс	жидкостная хроматография/тамдемная масс-спектрометрия.
LDA	диизопропиламид лития
LHMDS	бис(триметилсилил)амид лития

- 117 048725

m/z	масса к заряду
МГц	мега герц
Me	метил
МеОН	метанол
мин	минуты
мл	миллилитры
ММР	метилморфолин
МС	масс-спектр
nBu	н-бутан
NMP	1 -метил-2-пирролидинон
ЯМР	ядерный магнитный резонанс
РЕ	петролейный эфир
Ph	фенил
psi	фунтов на квадратный дюйм
РУГ	пиридин
кт	комнатная температура
SFC	сверхкритическая жидкостная хроматография
ТЗР	2,4,6-трипропил-1,3,5,2,4,6-триоксатрифосфоринан-2,4,6-
TDA-1	триоксид от/?ис[2-(2-метоксиэтокси)этил]амин
TBAF	фторид тетрабутиламмония
TBS	отреотбутилдиметилсилил
TBTU	О-(бензотриазол-1-ил)-ЕГ, N, N\№-тетрамет! тетрафторборат
TEA	триэтиламин
TFA	Трифторуксусная кислота
TIDPSi	1,1,3,3 -тетраизопропилдисилоксан
TIPS	триизопропилсилил
ТГФ	тетрагидрофуран
СЭЖХ	сверхэффективная жидкостная хроматография
Ксантфос	4,5-бис(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантен

Аналитические методы Условия ЯМР.

Спектры ЯМР регистрировали на спектрометре Bruker Avance III 400 с частотой 400 МГц 1Н, если не указано иное. Спектры ³¹Р ЯМР и ¹⁹F ЯМР снимали на одном спектрометре при 162 МГц и 376 МГц соответственно. Все гетероядерные эксперименты проводились с 1Н разделением, если не указано иное.

Условия ЖХМС.

Спектры ЖХМС регистрировали на системе ЖХ Hewlett-Packard НР1100 или Agilent 1100 Series, подключенной к масс-спектрометру Micromass, с использованием колонок С18 с обращенной фазой. Были выбраны различные градиенты и время анализа, чтобы наилучшим образом охарактеризовать соединения. Подвижные фазы были основаны на градиентах ACN/вода или МеОН/вода и содержали либо 0,1% муравьиной кислоты (методы обозначены как МК), либо 10 мМ ацетата аммония (методы обозначены как АА). Одним из примеров градиента растворителя, который был использован, был от 100% подвижной фазы А (подвижная фаза А=99% воды+1% ACN+0,1% муравьиной кислоты) до 100% подвижной фазы В (подвижная фаза В=95% ACN+5% вода+0,1% муравьиной кислоты) при скорости потока 1 мл/мин в течение 16,5 мин.

В некоторых случаях спектры ЖХМС регистрировали на системе Agilent 1290 Infinity UPLC, подключенной к масс-спектрометру Agilent 6130, системе Waters Acquity UPLC, подключенной к массспектрометру Waters Acquity SQ, или системе ВЭЖХ Agilent серии 1100, подключенной к Waters Micro

- 118 048725 mass ZQ. масс-спектрометр с использованием колонок С18 с обращенной фазой. Были выбраны различные градиенты и время анализа, чтобы наилучшим образом охарактеризовать соединения. Подвижные фазы были основаны на градиентах ACN/вода или МеОН/вода и содержали либо 0,1% муравьиной кислоты (методы обозначены как МК), либо 10 мМ ацетата аммония (методы обозначены как АА). Одним из примеров градиента растворителя, который был использован, был от 95% подвижной фазы А (подвижная фаза А=99% воды+1% ACN+0,1% муравьиной кислоты) до 100% подвижной фазы В (подвижная фаза В=95% ACN+5% вода+0,1% муравьиной кислоты) при скорости потока 0,5 мл/мин в течение 5 мин.

Препаративная ВЭЖХ.

Препаративная ВЭЖХ проводится с использованием Phenomenex 5 микрон С5 21,2x250 мм, с градиентным режимом элюирования растворителем А (99% 10 мМ ацетат аммония/1% ацетонитрил)/растворитель В (5% 10 мМ ацетат аммония/95% ацетонитрил) с использованием прибора Gil son с 322 насосами, с детектором УФ/видимой области 155, запускаемым детектором фракции, установленным в диапазоне от 200 до 400 нм. Сбор масс-закрытых фракций проводится на приборе Agilent 1100 LC/MSD.

Препаративная SFC:

Препаративная SFC проводится с использованием колонок ChiralPak 10, 20 или 30 мм x 250 мм (обычно IA, IB, IC, ID, IE и IF), колонок 10 или 20 мм x 250 мм Phenomenex Lux Cellulose-4 или 2этилпиридиновых колонок элюированием с соответствующим процентом сверхкритического диоксида углерода и спирта, содержащие 0,3% диэтиламина или 0,3% ТЭА, или 0,3% муравьиной кислоты или без каких-либо кислотных или основных добавок. Типичными являются изократические условия со скоростями потока в диапазоне 10-100 мл/мин и температурой колонки 40°С. Препаративная SFC проводится в системе предварительной очистки Jasco SFC с набором триггерных фракций УФ/видимого света, установленным в диапазоне от 200 до 400 нм, и регулировкой противодавления, установленной на 10 МПа.

Условия ВЭЖХ для примера В.

Анализ ВЭЖХ проводили с использованием SHIMADZU LC-2010C с SHISELDO 3 микрон С18 4,x75 мм, градиентный режим элюирования растворителем А (80% воды/10% 50 мМ ацетата аммония/10% ацетонитрила)/растворителем В (10% 50 мМ ацетата аммония/90% ацетонитрила), скорость потока 1 мл/мин, температура колонки 40°С и УФ-детектирование при 254 нм.

Условия ЖХ/МС/МС для примера В.

Анализ ЖХ/МС/МС проводили с использованием жидкостной хроматографии Shimadzu UltraFast и автосэмплера, связанного с масс-спектрометрией АВ SCIEX 4500 или АВ SCLEX 5500 Triple Quad или эквивалентной системой.

Для анализа Соединения № 14 и Соединения 1-5с 10 мМ ацетата аммония в 99% воды и 1% ацетонитрила или 0,1% муравьиной кислоты в воде приготовили в качестве растворителя подвижной фазы А и 10 мМ ацетата аммония в 5% воды, и 95% ацетонитрила или 0,1% муравьиной кислоты в 5% воды и 95% ацетонитрила использовали в качестве растворителя подвижной фазы В. Жидкостную хроматографию проводили со скоростью 1,5 мл/мин в течение 3 минут в градиенте. Колонка для ВЭЖХ представляла собой 3,5-микронную колонку Waters Xselect C18 CSH с внутренним диаметром 2,1 мм и длиной 30 мм, и температура колонки была комнатной.

Для анализа Соединения СР-1 10 мМ ацетат аммония в 99% воды и 1% ацетонитриле был приготовлен в качестве растворителя подвижной фазы А, и 10 мМ ацетата аммония в 5% воды и 95% ацетонитриле был приготовлен в качестве растворителя подвижной фазы В. Жидкостную хроматографию проводили со скоростью 1,5 мл/мин в течение 3,5 минут в градиенте. Колонка HPCL представляла собой Osaka Soda Capcell PAK C1 UG120 5 микрон, внутренний диаметр 2,0 мм x длина 35 мм, и температура колонки была комнатной.

Analyst Software 1.7 использовали для анализа площади пика МС/МС и расчета концентрации образцов.

Условия UPLC-CAD.

Анализ UPLC-CAD проводился с использованием Thermo Scientific™ Dionex™ Corona™ Veo™ RS (быстрое разделение) Детектор заряженного аэрозоля и системы Waters ACQUITY UPLC с АСЕ Excel C4 2 микрон 2,1 x 100 мм или аналогичной колонкой, элюирующей градиентным методом с использованием растворителя А (10 мМ ацетат аммония в воде, 2,6 мл гидроксида аммония в 4 л)/растворитель В (10 мМ ацетат аммония в метаноле, 2,6 мл гидроксида аммония 95% в 4 л), используя скорость потока 0,8 мл/мин и температуру колонки 35°С. Анализ UPLC-CAD может привести к отклонению до ± 20%.

Пример А1.

- 119 048725 трет-Бутил[4-({9-[(^^^Ж10^12а^14^15^15а^^)-15-фтор-7-(5-фтор-4-оксо-3,4дигидро-7Н-пирроло [2,3 -d]nupuMuguH-7-ил)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-2,10-дисульфанилоктагидро12Н-5,8-метанофуро[3,2-1] [ 1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-14-ил]-9Н-пурин-6-ил} амино)-4-оксобутил]метилкарбамат соль TEA, промежуточный продукт-1

Соединение № 14 (300 мг, 0,40 ммоль) растворяли в сухом пиридине и упаривали досуха (5 мл х 3 раза). Остаток растворяли в пиридине (6,41 мл) в атмосфере аргона и обрабатывали хлортриметилсиланом (0,30 мл, 2,38 ммоль), охлажденным на бане с ледяной водой. Реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 2 часов с получением соединения № 14, защищенного ТМС. Отдельно (через ~ 30 мин указанной выше реакции при перемешивании при комнатной температуре) в охлаждаемый на бане с ледяной водой раствор 4-((третбутоксикарбонил)(метил)амино)бутановой кислоты (520,0 мг, 2,27 ммоль) в тетрагидрофуране (10,7 мл) добавляли 4-метилморфолин (0,28 мл, 2,50 ммоль), а затем медленно добавляли изобутилхлорформиат (0,29 мл, 2,27 ммоль) в ТГФ. Мутной суспензии давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа, а затем медленно добавляли к вышеуказанному промежуточному продукту, защищенному TMS, через шприц. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. К указанной выше реакционной смеси добавляли МеОН (10 мл) и реакционную смесь упаривали. Остаток повторно растворяли в МеОН (3,8 мл). Тригидрофторид триэтиламина (0,26 мл, 1,59 ммоль) добавляли в реакционную смесь, охлаждаемую водно-ледяной баней, и оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение 30 минут. Реакционную смесь абсорбировали на диатомовой земле (Celite®) (1 г) и очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии с обращенной фазой (0-50% ACN в водном ацетате триэтиламмония (10 мМ)) с получением промежуточного соединения-1 в виде соли TEA (214,0 мг, 48,5%). ЖХМС (АА): m/z=910,2 (М+Н). ¹Н ЯМР (D2O) δ 8,55 (с, 1H), 8,20 (с, 1H), 7,87 (с, 1H), 7,14 (д, J=4,0 Гц, 1H), 6,42 (д, J=16,0 Гц, 1H), 6,29 (д, J=8,0 Гц, 1H), 5,5d (дд, J=4,0, 52,0 Гц, 1H), 5,04-4,93 (м, 1H), 4,91-4,86 (м, 1H), 4,66 (д, J=4,0 Гц, 1H), 4,46 (д, J=8,0 Гц, 1H), 4,334,25 (м, 3Н), 4,14 (дд, J=4,0, 12,0 Гц, 1H), 3,94 (дд, J=4,0, 8,0 Гц, 1H), 3,25 (уш., м, 2Н), 3,05 (к, J=8,0 Гц, 15Н), 2,73 (с, 3Н), 2,59-2,54 (м, 1H), 1,90-1,82 (м, 1H), 1,20 (с, 9Н), 1,13 (т, J=8,0 Гц, 22Н). ³¹Р ЯМР (D2O) δ 55,46 (с, 1P), 52,06 (с, 1P). ¹⁹F ЯМР (D2O) δ -164,19 (с, уш., 1F), -200,75 to -200,99 (м, 1F).

Пример А2.

[(2R)-3-[Гидрокси-[2-[[5-[[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-(гидроксиметил)анилино]-1-метил-2-оксо-этил]карбамоил]-2-метил-пропил]амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]фосфорил]окси-2-октадеканоилоксипропил]октадеканоат, промежуточный продукт-2

(2S)-2-Амино-N-[(1S)-2-[4-(гидроксиметил)анилино]-1-метил-2-оксоэтил]-3-метилбутанамид (112,1 мг, 0,38 ммоль) суспендировали в толуоле во флаконе и упаривали досуха (1 мл х 3). Остаток растворяли в ДМФА (1,5 мл) и обрабатывали DIPEA (88,9 мкл, 0,51 ммоль). Затем раствор ДМФА добавляли к натрий [(2R)-2,3-ди(октадеканоилокси)пропил]-2-[[5-(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси-5-оксопентаноил]амино]этилфосфат (250,0 мг, 0,25 ммоль) в ДХМ (15 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Большую часть растворителя (ДХМ) выпаривали, а остаточный раствор (ДМФА) выливали в ледяной водный раствор HCl (0,1 н, 5 мл)). Твердое вещество собирали

- 120 048725 фильтрованием и промывали водой (3 мл х 3) и ДХМ (3 мл х 3) и сушили в вакууме с получением промежуточного продукта-2 (247,0 мг, 85,2%). ЖХМС (АА): m/z=1137,8 (М+Н). 1Н ЯМР (MeOD/CDCl₃) δ 7,55 (скрыт внутри пика CDCl₃, 2H), 7,29 (д, J= 8,0 Гц, 1H), 5,25-5,22 (м, 1H), 4,53-4,49 (скрыт внутри пика воды остатка MeOD, 3Н), 4,40 (дд, J= 4,0, 12,0 Гц, 1H), 4,19-4,00 (м, 6 Н), 3,49-3,39 (м, 2Н), 2,35-2,30 (м, 6Н), 2,22 (т, J= 8,0 Гц, 2Н), 2,17-2,09 (м, 1H), 1,97-1,89 (м, 2Н), 1,65-1,58 (м, 4Н), 1,45 (д, J= 8,0 Гц, 3Н), 1,35-1,28 (широкий, м, 56Н), 0,99-0,97 (м, 6Н), 0,89-0,86 (6Н). ³¹Р ЯМР (MeOD/CDCl₃) δ 0,77 (с, 1P).

Пример A3.

[(2R)-3-[гидрокси-[2-[[5-[[(1S)-2-метил-1-[[(1S)-1-метил-2-[4-[(4-нитрофенокси)карбонилоксиметил]анилино]-2-оксо-этил]карбамоил]пропил]амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]фосфорил]окси-2октадеканоилокси-пропил]октадеканоат, промежуточный продукт-3

Во флакон добавляли промежуточный продукт-2 (247,0 мг, 0,22 ммоль), ТГФ (4,0 мл) и DIPEA (83,3 мкл, 0,48 ммоль). Раствор охлаждали на бане с ледяной водой в атмосфере N2, а затем добавляли бис(4нитрофенил)карбонат (97%, 74,9 мг, 0,24 ммоль) одной порцией. Бледно-желтый раствор перемешивали при 50°С в течение 1 часа. Дополнительно добавляли бис(4-нитрофенил)карбонат (97%, 145,3 мг, 0,48 ммоль) и перемешивали при 50°С в течение 1 часа, а затем при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь выливали в ледяной водный раствор HCl (0,05 н., 30 мл). Твердое вещество собирали фильтрованием и промывали водой (10 мл х 3) и EtOAc (8 мл хщ 6) с получением твердого промежуточного продукта-3 (282,8 мг, 79,5%). ЖХМС (FA): m/z=1302,8 (М+Н). 1H ЯМР (MeOD/CDCl₃) δ 8,28 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,65 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,42-7,38 (м, 4Н), 5,25-5,22 (м, 3Н), 4,53-4,49 (скрыт внутри пика воды остатка MeOD, 1H), 4,38 (дд, J=4,0, 12,0 Гц, 1H), 4,19-4,02 (м, 6 Н), 3,61-3,387 (м, 2Н), 2,35-2,29 (м, 6Н), 2,22-2,20 (м, 2Н), 2,17-2,08 (м, 1H), 1,98-1,90 (м, 2Н), 1,64-1,56 (м, 4Н), 1,46 (д, J=8,0 Гц, 3Н), 1,351,28 (шир, м, 56Н), 0,99-0,97 (м, 6Н), 0,89-0,85 (6Н). ³¹Р ЯМР (MeOD/CDCl₃) δ 0,74 (с, 1P).

Пример А4.

(2S,5S, 19R)-2-({4-[({[4-({9-[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15R, 15aR,16R)-15-фтор-7-(5-фтор-4-оксо3,4-дигидро-7Н-пирроло[2,3^]пиримидин-7-ил)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-2,10-дисульфанилоктагидро -12Н-5,8-метанофуро [3,2-l] [1,3,6,9,11,2,10] пентаоксадифосфациклотетрадецин-14-ил] -9Н-пурин-6ил}амино)-4-оксобутил] (метил)карбамоил } окси)метил]фенил } карбамоил)-16-гидрокси-5-изопропил-16оксидо-4,7,11 -триоксо-19-(стеароилокси)-15,17-диокса-3,6,12-триаза-16 лямбда~5—фосфаикозан-20-ил октадеканоат, СР-1

Промежуточный продукт-1 (15,0 мг, 0,013 ммоль) растворяли в 1,4-диоксане (0,29 мл) и обрабатывали 4М HCl в 1,4-диоксане (0,15 мл, 0,6 ммоль) при комнатной температуре в течение 1 часа. Летучие вещества удаляли и сушили в вакууме в течение 1 часа с получением 4-А в виде сырого продукта, который непосредственно использовали на следующей стадии. Отдельно во флакон загружали промежуточный продукт-3 (17,6 мг, 0,013 ммоль), DMAP (3,3 мг, 0,027 ммоль), TEA (0,015 мл, 0,11 ммоль) и ДХМ

- 121 048725 (0,35 мл). К этой смеси медленно добавляли раствор 4-А в ДМФА (0,42 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут и упаривали до небольшого объема (~ 0,5 мл). Неочищенное соединение очищали препаративной ВЭЖХ (Phenomenex 5 микрон С5 21,2x250 мм, элюируя растворителем А [99% 10 мМ ацетат аммония/1% ацетонитрил]растворитель В [5% 10 мМ ацетат аммония/95% ацетонитрил]от 60% В до 100% В за 16 мин при скорости потока 20 мл/мин) для получения СР-1 в виде аммониевой соли (11,0 мг, 40,3%). ЖХМС (АА): m/z=1972,8 (M+H). ¹H ЯМР (MeOD) δ 8,55 (широкий, с, 1H), 8,28 (широкий, с, 1H), 7,75 (широкий, с, 1H) 7,52-7,42 (м, 2Н), 7,24-7,17 (м, 3Н), 6,436,36 (м, 2Н), 5,60 (дд, J= 4,0 и 52,0 Гц, 1H), 5,17-5,12 (м, 1H), 5,10-5,00 (м, 1H), 4,99 (с, 2Н), 4,95- 4,89 (м, 1H), 4,78-4,76 (скрыт внутри водного пика остатка MeOD, 1H), 4,48-4,28 (м, 6Н), 4,23 (м, 1H), 4,13-4,09 (м, 2Н), 3,96-3,82 (м, 5Н), 3,42-3,33 (м, 4Н), 2,91 (с, 3Н), 2,73-2,64 (м, 2Н), 2,31-2,16 (м, 8Н), 2,11-2,03 (м, 1H), 1,99-1,92 (м, 2Н), 1,89-1,82 (м, 2Н), 1,57-1,47 (м, 4Н), 1,49 (д, J=8,0 Гц, 3Н), 1,27-1,28 (широкий, 56Н), 0,93-0,91 (м, 6Н), 0,85-0,81 (м, 6Н). ³¹Р ЯМР (MeOD) δ 57,00 (с, 1P), 52,26 (с, 1P), -0,20 (с, 1P). ¹⁹F ЯМР (MeOD) δ от -165,24 до -165,46 (с, широкий, 1F), от -202,98 до -203,24 (м, 1F). МСВР (C88H138F2N13O25P3S2) Ожидается: 1972,8622; Наблюдается: 1972,8674

Пример А5.

2-[(трет-бутоксикарбонил)(метил)амино]этил{9-[( 1 R,3R,6R,8R,9R, 10R, 12R, 15R,17R, 1 8R)-9^mop17-(5-Фтор-4-оксо-3,4-дигидро-7Н-пирроло[2,3^]пиримидин-7-ил)-18-гидрокси-3,12-диоксидо-3,12дисульфанил-2,4,7,11,13,16-гексаокса-3,12-дифосфатрицикло [13.2.1.0~6,10~]октадек-8-ил] -9Н-пурин-6ил}карбамат, промежуточный продукт-4

О \ f Фосген в толуоле 9 \ /

ΗΟ^ΛθΧ -55— ογο^Α₀Χ

Стадия -1 _ .

Стадия 1: 2-[трет-бутоксикарбонил(метил)амино]этил карбонохлоридат (5-А).

трет-Бутил (2-гидроксиэтил)(метил)карбамат (1,40 г, 7,99 ммоль) в ДХМ (100 мл) с пиридином (1,26 мл) медленно добавляли к 15% раствору фосгена в толуоле (16 мл, 22,4 ммоль) при -78°С. Затем реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1,5 часа. Затем растворитель упаривали досуха с получением неочищенного 5-А (1,90 г, 100%).

Стадия 2: 2-[(трет-бутоксикарбонил)(метил)амино]этил{9-[(1R,3R,6R,8R,9R,10R,12R,15R,17R,18R)9-фтор-17-(5-фтор-4-оксо-3,4-дигидро-7Н-пирроло[2,3^]пиримидин-7-ил)-18-гидрокси-3,12-диоксидо3,12-дисульфанил-2,4,7,11,13,16-гексаокса-3,12-дифосфатрицикло[13.2.1.0~6,10~]октадек-8-ил]-9Нпурин-6-ил}карбамат, промежуточный продукт-4.

Соединение № 14 (313 мг, 0,40 ммоль) растворяли в сухом пиридине и упаривали досуха (3x5 мл). Остаток растворяли в пиридине (6,70 мл) в атмосфере аргона и обрабатывали хлортриметилсиланом (0,378 мл, 2,97 ммоль), охлажденным на бане с ледяной водой. Реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 20 минут с получением ТМС-защищенного соединения № 14 в растворе. 5-А (1,90 г, 7,52 ммоль) растворяли в ДХМ (12,5 мл) и затем добавляли к вышеупомянутому раствору с помощью шприца. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере аргона в течение 16 часов. Затем реакционную смесь концентрировали досуха. К остатку добавляли МеОН (10 мл) и гидроксид аммония (28-30% раствор в воде, 10 мл) и давали перемешиваться в течение 30 минут. Реакционную смесь упаривали досуха и остаток растворяли в МеОН (15 мл). Добавляли тригидрофторид триэтиламина (0,12 мл, 0,75 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакционную смесь упаривали досуха, и неочищенный остаток адсорбировали на целите и очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии с обращенной фазой (0-50% ACN в водном ацетате триэтиламмония (10мМ)) с получением промежуточного продукта-4 в виде соли TEA (181 мг, 39,3%). ЖХМС (АА): m/z=912,3 (М+Н). 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-do) δ 12,06(уш., с, 1H), 10,56 (уш., с, 1H), 9,16 (уш., 2Н), 8,62 (с, 1H), 8,52 (с, 1H), 7,89(д, J=4,0 Гц, 1H), 7,63 (с, 1H), 6,35 (дд, J=4,0 и 12,0 Гц, 1H), 6,26 (д, J=8,0 Гц, 1H), 5,80 (д, J=52,0 Гц, 1H), 5,19-5,14 (м, 1H), 4,95-4,93 (м, 1H), 4,79-4,78 (м, 1H), 4,56 (уш., с, 1H), 4,33 (уш., с, 1H), 4,21-4,12 (м, 5Н), 4,00-3,90 (м, 1H), 3,72-3,69 (м, 1H), 3,45-3,43 (м, 2Н), 3,05 (уш., 12Н), 2,86-2,83 (м, 3Н), 1,34 (уш., 9Н), 1.15-1,11(м, 18Н). ³¹Р ЯМР (ДМСО-06) δ 54,04 (с, 1P), 47,46 (с, 1P). ¹⁹F ЯМР (ДМСО-06) δ -165,06 (с, уш., 1F), -207,23 до -207,54 (м, 1F)

- 122 048725

Пример А6.

(2S,5S,19R)-2-{[4-({[{2-[({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-154TOp-7-(54TOp-4-OKCO3,4-дигидро-7Н-пирроло[2,3^]пиримидин-7-ил)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-2,10-дисульфанилоктагидро-12Н-5,8-метанофуро[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-14-ил]-9Н-пурин-6ил}карбамоил)окси]этил}(метил)карбамоил]окси}метил)фенил]карбамоил}-16-гидрокси-5-изопропил16-оксидо-4,7,11 -триоксо-19-(стеароилокси)-15,17-диокса-3,6,12-триаза-16-лямбда~5—фосфаикозан-20илоктадеканоат, СР-2

Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной показанной в примере А4, с использованием промежуточного продукта-4 (77,0 мг, 0,069 ммоль) вместо промежуточного продукта-1 с получением СР-2 в виде соли аммония (42,0 мг, 30,0%). ЖХМС (АА): m/z=1974,6 (М+Н). 1H ЯМР (MeOD) δ 8,52 (широкий, d, J=12,0 Гц, 1H), 8,33 (широкий, d, J=8,0 Гц, 1H), 7,74 (с, 1H), 7,50 (широкий, d, J=8,0 Гц 1H), 7,40 (широкий, д, J=8,0 Гц, 1H), 7,28 (широкий, 1H), 7,24 (широкий, д, J= 8,0 Гц, 1H), 7,14 (широкий, д, J= 8,0 Гц, 1H), 6,43-6,34 (м, 2Н), 5,56 (д, J=52,0 Гц, 1H), 5,17-5,06 (м, 2Н), 5,01-4,93 (м, 3Н), 4,78-4,76 (скрыт внутри остатка MeOD пик воды, 1H), 4,47-4,29 (м, 8Н), 4,21 (м, 1H), 4,13-4,09 (дд, J=8,0 и 12,0 Гц, 2Н), 3,95-3,82 (м, 5Н), 3,63-3,58 (м, 2Н), 3,33 (ш, д, J=8,0 Гц, 2Н), 2,99 (с, 3Н), 2,30-2,22 (м, 6Н), 2,17 (т, д, J=8,0 Гц, 2Н), 2,10-2,04 (м, 1H), 1,88-1,81 (м, 2Н), 1,56-1,48 (м, 4Н), 1,49 (ш, д, J=8,0 Гц, 3Н), 1,27-1,21 (ш, м, 56Н), 0,93-0,90 (м, 6Н), 0,84-0,81 (м, 6Н). ³¹Р ЯМР (ДМСО^б) δ 53,64 (с, 1P), 46,87 (с, 1P), -0,45 (с, 1P). ¹⁹ ЯМР (MeOD) δ от -165,49 до -165,66 (м, 1F), от -203,23 до -203,70 (м, 1F). МСВР (C87H136F2N13O26P3S2) Ожидается: 1974,8415; Наблюдается: 1974,8455

Пример А7.

[4-(Г идроксиметил)фенил]4-(аминометил)бензоат, промежуточный продукт-5

Стадия 1: [4-(гидроксиметил)фенил]4-[(трет-бутоксикарбониламино) метил]бензоат.

В круглодонную колбу на 100 мл загружали 4-(Вос-аминометил) бензойную кислоту (503,0 мг, 1,98 ммоль), 4-гидроксибензиловый спирт (97%, 304,3 мг, 2,38 ммоль). Затем смесь суспендировали в ДХМ (15 мл) и обрабатывали 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидом (97%, 634,3 мг, 3,96 ммоль). Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 2 часов и промывали ледяной HCl (0,1 н., 10 мл), затем водой (10 мл) и насыщ. NaHCO₃ (10 мл), сушили и очищали хроматографией на силикагеле (0-100% EtOAc/гексаны) с получением 7-А (385,0 мг, 54,4%). ЖХМС (АА): m/z=356,00 (МН). ¹Н ЯМР (ДМСО^6) δ 8,09 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,53 (т, J=4,0 Гц, 1H), 7,47-7,39 (м, 4Н), 7,22 (д, J=8,0 Гц, 1H), 5,25 (т, J=8,0 Гц, 1H), 4,53 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 4,24 (уш., д, J=4,0 Гц, 2Н), 1,41 (с, 9Н).

Стадия 2: [4-(гидроксиметил)фенил]4-(аминометил)бензоат, промежуточный продукт-5.

[4-(гидроксиметил)фенил]4-[(трет-бутоксикарбониламино)метил]бензоат 7-А (100,0 мг, 0,28 ммоль) растворяли в ДХМ (2 мл) и обрабатывали ТФУ (0,8 мл, 10 ммоль) при комнатной температуре в течение 30 мин. Летучие вещества удаляли с помощью роторного испарителя, а остаток повторно растворяли в МеОН (2 мл) и выдерживали при 37°С в течение 90 минут. После полного удаления летучих веществ остаток упаривали совместно с МеОН (2 мл х 2) и ДХМ (4 мл х 2) с получением промежуточного продукта 5 в виде соли ТФУ (110,0 мг, количественный выход). ЖХМС (АА): m/z=258,20 (M+H). 1H ЯМР (ДМСО^6) δ 8,37 (уш., 3Н), 8,19 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 7,68 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 7,42 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 7,24 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 4,54 (с, 2Н), 4,20 (уш., с, 2Н).

Пример А8.

(2R)-3-((Гидрокси(2-(5-((4-((4-(гидроксиметил)фенокси)карбонил)бензил)амино)-5оксопентанамидо)этокси)фосфорил)окси)пропан-1,2-диил дистеарат, промежуточный продукт-6

- 123 048725

DIPEA / DCM / DMF

OH

соединение-6

Соль трифторуксусной кислоты [4-(гидроксиметил)фенил]4-(аминометил)бензоата (64,1 мг, 0,17 ммоль) растворяли в ДМФА (0,8 мл). Раствор добавляли к другому раствору натрия [(2R)-2,3ди(октадеканоилокси)пропил]2-[[5-(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси-5оксопентаноил]амино]этилфосфату (113,0 мг, 0,115 ммоль) в ДХМ (3,2 мл). Затем к указанной выше смеси добавляли DIPEA (0,04 мл, 0,23 ммоль) и перемешивали в течение 3,5 часов при комнатной температуре. Большую часть растворителя (ДХМ) выпаривали, а остаточный раствор (ДМФА) выливали в ледяной раствор HCl (0,1 н, 5 мл). Твердое вещество собирали фильтрованием и промывали ледяным рас твором HCl (0,1 н, 4 мл х 6) и водой (3 мл х 6) и сушили в вакууме с получением промежуточного продукта® (106,0 мг, 83,6%). ЖХМС (АА): слабый сигнал. ¹Н ЯМР (MeOD/CDCl3) δ 8,03 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 7,31 (д, J=8,0 Гц, 4Н), 7,06 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 5,13-5,10 (м, 1H), 4,55 (с, 2Н), 4,37 (с, 2Н), 4,07-4,05 (м, 1H), 4,07-3,93 (м, 5Н), 3,37-3,34 (уш., 2Н), 2,24-2,13 (м, 8Н), 1,86-1,82 (м, 2Н), 1,49 (уш., 4Н), 1,14 (уш., 56Н), 0,78 (м, 6Н). ³¹Р ЯМР (MeOD/CDCl3) δ 3,06 (с, 1P).

Пример А9.

(2R)-3-((Гидрокси(2-(5-((4-((4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенокси)карбонил)бензил)амино)-5-оксопентанамидо)этокси)фосфорил)окси)пропан-1,2-диил дистеарат, промежуточный продукт-7

Промежуточный продукт-6 (106 мг, 0,096 ммоль) растворяли в ТГФ (2 мл) и обрабатывали DIPEA (0,037 мл, 0,21 ммоль). К этому раствору добавляли бис(4-нитрофенил)карбонат (64,4 мг, 0,21 ммоль). Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем добавляли дополнительно бис(4-нитрофенил)карбонат (64,4 мг, 0,21 ммоль) и DIPEA (0,037 мл, 0,21 ммоль). Реакционную смесь нагревали при 50°С еще в течение 1 часа. Реакционную смесь добавляли в ледяной раствор HCl (0,05 н., 100 мл). Осадок собирали фильтрованием и промывали водой (2 мл х 4). Твердое вещество суспендировали в EtOAc (3 мл) и обрабатывали ультразвуком в течение 5 секунд и фильтровали. Твердое вещество промывали EtOAc (2 мл х 3) с получением твердого промежуточного продукта-7 (121,9 мг, 57,4%). ЖХМС (АА): слабый сигнал. ¹H ЯМР (MeOD/CDCl₃) δ 8,26 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 8,12 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 7,50 (д, J=8,0 Гц, 4Н), 7,40 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 7,37 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 7,23 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 5,29 (с, 2Н), 5,21-5,18 (м, 1H), 4,48 (с, 2Н), 4,31 (дд, J=4,0 и 12,0 Гц,Ш), 4,14-4,01 (м, 5Н), 3,45 (уш., т, J=4,0 Гц, 2Н), 2,32-2,23 (м, 8Н), 1,96-1,92 (м, 2Н), 1,57 (уш., 4Н), 1,22 (уш., 56Н), 0,84 (м, 6Н).

Пример А10.

4-({[{2-[({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-фтор-7-(5-фтор-4-3-оксо-3,4-дигидро7Н-пирроло[2,3®]пиримидин-7-ил)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-2,10-дисульфанилоктагидро-12Н-5,8метанофуро[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-14-ил]-9Н-пурин-6-ил } карбамоил)окси]этил}(метил)карбамоил]окси}метил)фенил 4-[(15R)-12-гидрокси-12-оксидо-3,7,18-триоксо-15(стеароилокси)-11,13,17 -триокса-2,8-диаза-12ламбда~5—фосфапентатриаконт-1 -ил] бензоат, СР-3

- 124 048725

Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной показанной в примере А4, с использованием промежуточного продукта 7 (8,0 мг, 0,0072 ммоль) вместо промежуточного продукта-3 и промежуточного продукта-4 (9,1 мг, 0,0072 ммоль) вместо промежуточного продукта1 с получением СР-3 в виде аммониевой соли (4,2 мг, 29,0%). ЖХМС (АА): m/z=1939,1 (М+Н). ¹Н ЯМР (MeOD) δ 8,65-8,59 (м, 1H), 8,42 (широкий, д, J= 16,0 Гц, 1H), 8,14 (д, J= 8,0 Гц, 2Н), 7,85 (с, 1H), 7,74 (с, 1H), 7,51 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 7,48-7,39 (м, 3Н), 7,20 (ш, д, J= 8,0 Гц, 1H), 7,11 ш, д, J=8,0 Гц, 1H), 6,50 (дд, J=l,2 и 8,0 Гц, 1H), 6,42 (ш, д, J=8,0 Гц, 1H), 5,80-5,61 (м, 1H), 5,27-5,10 (м, 4Н), 5,08 -5,0 (м, 1H), 4,82 (м, 1н), 4,55-4,32 (м, 9Н), 4,30 (широкий, 1H), 4,04-3,98 (м, 3Н), 3,96-3,91 (м, 2Н), 3,83 -3,65 (м, 2Н), 3,44 (т, J=4,0 Гц, 2Н), 3,10 (ш, д, J=12,0 Гц, 3Н), 2,38-2,28 (м, 8Н), 2,02-1,94 (м, 2Н), 1,65-1,57 (м, 4Н), 1,30 (широкий, 56Н), 0,93-0,90 (м, 6Н). ³¹Р ЯМР (MeOD) δ 57,08 (с, 1P), 52,51 (с, 1P), 0,36 (с, 1P). ¹⁹F ЯМР (MeOD) δ от -165,58 до -165,67 (м, 1F), от -203,66 до -203,99 (м, 1F) MCBP (C87H128F2N11O26P3S2) Ожидаемое: 1938,7727; Наблюдается: 1938,7713

Пример А11.

4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил [2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15фтор-7-(5-фтор-4-оксо-3,4-дигидро-7Н-пирроло [2,3 А]пиримидин-7-ил)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-2,10дисульфанилоктагидро-12Н-5,8-метанофуро[3,2-Щ1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-14ил]-9Н-пурин-6-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат, промежуточный продукт-8

Стадия 1: 2-[[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-3-метилбутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метоксикарбонилметил-амино]метил]бензойная кислота, 11-А.

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в Примере А4, стадия 2, исходя из 2-[(метиламино)метил]бензойной кислоты HCl (150 мг, 0,72 ммоль) вместо deBoc промежуточного продукта-1. После очистки хроматографией на силикагеле (0-25% МеОН/ДХМ) получали 11-А (306 мг, 67%). ЖХМС.

(AA): m/z=583,4 (M-H).

Стадия 2: [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-3-метилбутаноил]амино]пропаноил]амино]фенил]метил У-[(2-хлоркарбонилфенил)метил]-У-метилкарбамат, промежуточный продукт-8

К раствору 11-А (295 мг, 0,50 ммоль) в ТГФ (1,5 мл), охлажденному до 0 °С, добавляли оксалилхлорид (2,0 М раствор в ДХМ, 0,25 мл, 0,50 ммоль), а затем 3 капли ДМФА. Реакционной смеси давали перемешиваться при 0°С в течение 45 минут. Затем смесь упаривали досуха, чтобы получить неочищенный промежуточный продукт-8, который непосредственно использовали на следующей стадии (304 мг, 100%).

Пример А12

4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил [2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15фтор-7-(5-фтор-4-оксо-3,4-дигидро-7Н-пирроло [2,3 А]пиримидин-7-ил)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-2,10дисульфанилоктагидро-12Н-5,8-метанофуро[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин14-ил]-9Н-пурин-6-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат, промежуточный продукт-9

- 125 048725

Соединение № 14 (107 мг, 0,117 ммоль) добавляли в круглодонную колбу (50 мл) и упаривали совместно с сухим пиридином (2 мл х 3 раза). Затем остаток повторно растворяли в сухом пиридине (4,26 мл, 52,7 ммоль), обрабатывали хлортриметилсиланом (0,121 мл, 0,934 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. К вышеуказанному раствору добавляли промежуточный продукт-8 (423 мг, 0,70 ммоль) в пиридине (1,89 мл, 23,4 ммоль) и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь гасили 10 мл МеОН и перемешивали в течение 30 минут, удаляли весь растворитель и добавляли гидроксид аммония (28-30% раствор в воде, 10 мл) и оставляли перемешиваться в течение 30 минут. Реакционную смесь упаривали, получая неочищенное твердое вещество темного цвета. Твердое вещество повторно растворяли в МеОН (1,42 мл) и обрабатывали триэтиламинтригидрофторидом (0,12 мл, 0,75 ммоль) при 0°С и оставляли нагреваться до комнатной температуры в течение 30 минут. Смесь выпаривали и очищали обращенно-фазовой флэш-хроматографией на колонке (0-50% ACN в водном бикарбонате аммония (5 мМ)) и дополнительно очищали препаративной ВЭЖХ (Phenomenex 5 микрон С5 21,2x250 мм, элюируя растворителем А (99% 10 мМ ацетат аммония /1% ацетонитрил) / растворитель В (5% 10 мМ ацетат аммония/95% ацетонитрил) от 60% В до 100% В за 16 мин при скорости потока 20 мл/мин) с получением промежуточного продукта-9 в виде соли аммония. ЖХМС (АА): m/z=1277,8 (М+Н). 1H ЯМР (MeOD) δ 8,68 (с, 1H), 8,44 (с, 1H), 7,82 (уш., д, J=8,0 Гц, 1H), 7,77 (с, 1H), 7,52-7,39 (м, 4Н), 7,39 (с, 1H), 7,23-7,26 (м, 3Н), 6,50-6,43 (м, 2Н), 5,74 (дд, J=4,0 и 52,0 Гц, 1H), 5,255,15 (м, 1H), 5,07-5,04 (м, 3Н), 4,93-4,89 (м, 2Н), 4,56-4,49 (м, 2Н), 4,46-4,39(м, 3Н), 4,30 (уш., 1H), 4,03 (дд, J=4,0 and 12,0 Гц, 1H), 3,95 (д, J=4,0 Гц, 1H), 2,95 (уш., 3Н), 2,13-2,11 (м, 1H), 1,48 (д, J=8,0 Гц, 1H), 1,45 (с, 9Н), 1,00 (д, J=4,0 Гц, 3Н), 0,94 (J=4,0 Гц, 3Н), ³¹Р ЯМР (MeOD) δ 56,91 (с, 1P), 52,36 (с, 1P). ¹⁹F ЯМР (MeOD) δ -165,65 (с, 1F), -203,16 до -203,35 (м, 1F).

Пример А13.

(2S,5S,19S)-2-({4-[({[2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-фтор-7-(5-фтор-4-оксо3,4-дигидро-7Н-пирроло[2,3Д]пиримидин-7-ил)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-2,10-дисульфанилоктагидро -12Н-5,8-метанофуро[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-14-ил] -9Н-пурин-6ил}карбамоил) бензил](метил)карбамоил}окси)метил]фенил}карбамоил)-16-гидрокси-5-изопропил-16оксидо-4,7,11 -триоксо-19-(стеароилокси)-15,17-диокса-3,6,12-триаза-16лямбда~5—фосфаикозан-20-ил октадеканоат, (СР-4)

Стадия 1: 4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-амино-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил [2-({9[(2R,5R,7R,8R, 10R,12aR, 14R, 15R, 15aR, 16R)-15-фтор-7-(5-фтор-4-оксо-3,4-дигидро-7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-7-ил)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-2,10-дисульфанилоктагидро-12Н-5,8-метанофуро[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-14-ил]-9Н-пурин-6-ил}карбамоил)бензил]метил

- 126 048725 карбамат (13-А).

Промежуточный продукт-9 (56 мг, 0,045 ммоль) добавляли в круглодонную колбу и охлаждали до 0°С. Затем через шприц добавляли раствор ТФУ (0,24 мл, 3,2 ммоль) и ДХМ (0,58 мл) и реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 30 минут. Затем реакционную смесь упаривали досуха и помещали под вакуум на 2 часа, чтобы получить 13-А в виде соли ТФУ (56 мг, 100%). ЖХМС (АА): m/z=1177,0 (М+Н).

Стадия 2: (2S,5S,19S)-2-({4-[({[2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-фтор-7-(5фтор-4-оксо-3,4-дигидро-7Н-пирроло [2,3 ^]пиримидин-7-ил)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-2,10-дисульфанилоктагидро-12Н-5,8-метанофуро[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-14-ил]-9Нпурин-6-ил}карбамоил)бензил](метил)карбамоил}окси)метил]фенил}карбамоил)-16-гидрокси-5изопропил-16-оксидо-4,7,11 -триоксо-19-(стеароилокси)-15,17-диокса-3,6,12-триаза-16лямбда~5— фосфаикозан-20-ил октадеканоат, СР-4.

К раствору 13-А (56 мг, 0,037 ммоль) и 13-В (40,0 мг, 0,041 ммоль) в ТГФ (1,4 мл) и ДМФА (0,7 мл) по каплям добавляли N, N-диизопропилэтиламин (65 мкл, 0,37 ммоль). Реакционной смеси давали перемешиваться при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем реакционную смесь упаривали досуха и неочищенный остаток очищали препаративной ВЭЖХ (Phenomenex 5 микрон С5 21,2x250 мм, элюируя растворителем А (99% 10 мМ ацетата аммония/1% ацетонитрила)/растворителем В (5% 10 мМ ацетат аммония/95% ацетонитрила) от 60% В до 100% В за 16 мин при скорости потока 20 мл/мин), чтобы получить СР-4 в виде соли аммония (32,8 мг, 42%). ЖХМС (АА): ¹/₂ m/z=1011,1 (М+Н). ¹H ЯМР (MeOD) δ 8,78 (с, 1H), 8,74 (с, 1H), 7,90-7,88 (м, 1H) 7,78 (с, 1H), 7,64-7,46 (м, 4Н), 7,36 (с, 1H), 7,33-7,13 (м, 3Н), 6,54-6,48 (м, 2Н), 5,79 (дд, J= 4,0 и 52,0 Гц, 1H), 5,26-5,13 (м, 2Н), 5,05-4,99 (м, 3Н), 4,84 (м, 2Н скрыт в пике воды), 4,78-4,77 (м, 1H), 4,59-4,36 (м, 6Н), 4,30-4,29 (м, 1H), 4,22-4,17 (м, 2Н), 4,03-3,92 (м, 5Н), 3,43 (т, J=4,0 Гц, 2Н), 2,96 (с, 3Н), 2,89-2,24 (м, 8Н), 2,20-2,12 (м, 1H), 1,98-1,90 (м, 2Н), 1,67-1,56 (м, шир, 4Н), 1,48 (д, J=8,0 Гц, 3Н), 1,30 (шир, 56Н), 1,02-0,99 (м, 6Н), 0,93-0,90 (м, 6Н), ³¹Р ЯМР (MeOD) δ 57,47 (с, 1P), 52,87 (с, 1P), 0,12 (с, 1P) ¹⁹F ЯМР (MeOD) δ от -165,91 до -166,08 (м, 1F), от -203,70 до -203,94 (м, 1F). MCBP (C92H138F2N13O25P3S2) Ожидается: 2020,8622; наблюдается: 2020,8601.

Пример А14.

4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил [2-({9-[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS, 16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Н-пурин-2-ил}карбамоил)бензил]метилкарбамат, промежуточный продукт-10

1.TMSCI, пиридин

IT NH₂

3. NEt₃-3HF. МеОН

ΝΗ О

Промежуточное соединение-10

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с процедурой, описанной в Примере А12, заменяя 2-амино-9-[(2R,5R,7R,8R, 10R, 12aR, 14R, 15aS,16R)-16-гидрокси-2,10-диоксидо-14(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[ 1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфациклотетрадецин-7-ил]-1,9-дигидро-6Н-пурин-6-он в виде соли TEA (Соединение 1-5с) (синтез см. РСТ/1В2О18/О58846) для Соединения I-5c. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии с обращенной фазой (0-50% ACN в водном бикарбонате аммония (5 мМ)) с получением промежуточного продукта-10 в виде соли аммония. Для превращения солей это вещество затем растворяли в МеОН (2 мл) и добавляли триэтиламин (5 мл). Смесь встряхивали 1 мин. растворители уда

- 127 048725 ляли и лиофилизировали в течение ночи с получением промежуточного продукта-10 в виде соли TEA (147 мг, 48%). ЖХМС (АА): m/z=1216,3 (М+Н). ¹Н ЯМР (400 МГц, MeOD) δ 8,70 (с, 1H), 8,43 (шир. с, 1H), 8,40 (д, J=5,9 Гц, 1H), 7,70 (д, J=7,5 Гц, 1H), 7,56-7,46 (м, 3Н), 7,42-7,38 (м, 1H), 7,32-7,19 (м, 3Н), 6,84 (д, J=5,5 Гц, 1H), 6,15 (д, J=7,3 Гц, 1H), 5,62-5,56 (м, 1H), 5,54-5,48 (м, 1H), 5,08-5,02 (м, 1H), 5,04 (с, 2Н), 4,88-4,83 (м, 1H), 4,81-4,76 (м, 2Н), 4,53-4,47 (м, 1H), 4,37-4,22 (м, 3Н), 4,08-4,03 (м, 1H), 3,92-3,89 (м, 1H), 3,82-3,74 (м, 1H), 2,88 (с, 3Н), 2,58-2,30 (м, 4Н), 2,10-2,03 (м, 1H), 1,54-1,47 (м, 1H), 1,46-1,44 (м, 3Н), 1,44 (с, 9Н), 0,98 (д, J=6,8 Гц, 3Н), 0,93 (д, J=6,8 Гц, 3Н). ³¹Р ЯМР (162 МГц, MeOD) δ 55,01 (с, 1P), 53,03 (с, 1P).

Пример А15.

(2S,5S,19R)-16-гидрокси-2-({4-[({[2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-гидрокси-2,10диоксидо-14-(пиримидин-4-илокси)-2,10-дисульфанилдекагидро-5,8-метаноциклопента[1][1,3,6,9,11,2,10]пентаоксадифосфатетрадецин-7-ил]-6-оксо-6,9-дигидро-1Н-пурин-2-ил}карбамоил)бензил](метил)карбамоил}окси)метил]фенил}карбамоил)-5-изопропил-16-оксидо-4,7,11-триоксо-19(стеароилокси)-15,17-диокса-3,6,12-триаза-16-лямбда~5—фосфаикозан-20-илоктадеканоат, СР-5

Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной показанной для Примера А13, начиная с промежуточного продукта-10 вместо промежуточного продукта-9 с получением СР-5 (96,0 мг, 48,8% для 2 стадий). ЖХМС (АА): m/z=1959,8 (M+H). 1H NMR (MeOD) δ 8,58 (с, 1H), 8,33 (с, 1H), 8,28 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,58 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,45-7,36 (м, 3Н), 7,29 (t, J= 8,0 Гц, 1H), 7,14 (ш, 3Н), 6,72 (д, J= 8,0 Гц, 1H), 6,04 (д, J= 8,0 Гц, 1H), 5,48 (ш, 1H), 5,38-5,33 (м, 1H), 5,13-5,08 (м, 1H), 4,94-4,89 (м, 3Н), 4,71 (углубленный внутри водного пика остатка MeOD, 1H), 4,67 (м, 2Н), 4,42 -4,38 (м, 1H), 4,34-4,30 (м, 1H), 4,25-4,04 (м, 5Н), 3,95-3,91 (м, 1H), 3,87 (т, J=8,0 Гц, 2Н), 3,82-3,78 (м, 2Н), 3,693,62 (м, 1H), 3,29 (т, J= 4,0 Гц, 2Н), 2,77 (с, 3Н), 2,47-2,17 (м, 10Н), 2,13 (т, J=8,0 Гц, 2Н), 2,05-1,97 (м, 1H), 1,82-1,77 (м, 2Н), 1,53-1,43 (ш, м, 4Н), 1,41-1,38 (м, 1H), 1,34 (д, J=8,0 Гц, 3Н), 1,17 (ш, 56Н), 0,89-0,86 (м, 6Н), 0,80-0,76 (м, 6Н). ³¹Р ЯМР (ДМСО-06) δ 55,29 (с, 1P), 53,05 (с, 1P), 0,29 (с, 1P). MCBP (C₉₁H₁₄₁N₁₂O2₅P₃S2) Ожидаемое: 1959,8858, наблюдаемое: 1959,8886.

Следует понимать, что раздел Подробное описание, а не разделы Сущность изобретения и Реферат, предназначен для использования для интерпретации формулы изобретения. Разделы Сущность изобретения и Реферат могут излагать один или более, но не все примерные варианты реализации данного изобретения, как предполагается изобретателем (-ами), и, таким образом, никоим образом не предназначены для ограничения данного изобретения и прилагаемой формулы изобретения.

Данное изобретение было описано выше с помощью функциональных строительных блоков, иллюстрирующих реализацию определенных функций и их взаимосвязи. Границы этих функциональных строительных блоков были определены в данном документе произвольно для удобства описания. Альтернативные границы могут быть определены при условии, что указанные функции и их взаимосвязи выполняются надлежащим образом.

Вышеприведенное описание конкретных вариантов реализации будет настолько полно раскрывать общий характер изобретения, что другие могут, применяя знания в пределах квалификации в данной области, легко модифицировать и/или адаптировать для различных приложений такие конкретные варианты реализации, без излишнего экспериментирования, без отклонения от общей концепции данного изобретения. Следовательно, предполагается, что такие адаптации и модификации находятся в пределах значения и диапазона эквивалентов раскрытых вариантов реализации, основанных на идее и руководстве, представленных в данном документе. Следует понимать, что фразеология или терминология в данном документе предназначена для описания, а не ограничения, так что терминология или фразеология данного описания должна интерпретироваться квалифицированным специалистом в свете идей и руководств к действию.

Охват и объем данного изобретения не должны ограничиваться каким-либо из описанных выше

- 128 -

Claims

примерных вариантов реализации, а должны определяться только в соответствии со следующей формулой изобретения и ее эквивалентами.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение формулы (I):

или его фармацевтически приемлемую соль, где а является целым числом от 1 до 20;

b является целым числом от 1 до 20;

m равно 0, 1, 2, 3, или 4;

n равно 0 или 1;

D-NH- выбран из

а) фрагмента формулы (II):

или его фармацевтически приемлемой соли, где каждый из R¹⁰ и R⁴⁰ независимо представляет собой водород, фтор, -ОН или -OCH2CF₃;

кольцо А¹⁰ представляет собой 6-членное моноциклическое гетероарильное кольцо, содержащее 1, 2 или 3 атома азота; и кольцо В¹⁰ представляет собой

каждый из Z¹⁰, Z²⁰, Z³⁰ и Z⁴⁰ независимо представляет собой N или CR²⁰⁰;

R²¹⁰ представляет собой водород, С1-С₆алкил, галоген(С1-С₆)алкил или С₃-С₆циклоалкил;

R²³⁰ представляет собой водород или -NH₂; и каждый из R²⁰⁰ и R²²⁰ независимо представляет собой водород, галоген, -ОН, -NH2, -CN, С1-С₆алкил, галоген(С1-С₆)алкил или С₃-С₆циклоалкил;

при условии, что либо кольцо А¹⁰ либо кольцо В¹⁰ присоединено к карбонильной группе формулы (I) через группу -NH-; или

b) фрагмента формулы (III):

или его фармацевтически приемлемой соли, где каждый из R¹⁰⁵ и R²⁰⁵ независимо представляет собой гидроксигруппу или атом галогена;

- 129 048725 один из В¹⁰⁰ и В²⁰⁰ представляет собой

где R¹⁸ представляет собой водород или С1-С6-алкил; и R¹⁹ представляет собой атом галогена;

и другой представляет собой:

каждый R¹ независимо выбран из С1-С₄-алкила, О-С₁-С₄-алкила и галогена;

R² выбран из С1-С₄-алкила и -(CH₂CH2O)s-CH_3; где s является целым числом от 1 до 10;

R³ и R³, каждый независимо, выбран из водорода и С1-С₃-алкила;

L представляет собой

где Y представляет собой точку присоединения к атому азота;

представляет собой точку присоединения к Ab;

t является целым числом от 1 до 10;

W отсутствует или выбран из

где г представляет собой точку присоединения к карбонильной группе; и / представляет собой точку присоединения к Z;

Z отсутствует или представляет собой пептид из 2-5 аминокислот;

U выбран из

* представляет собой точку присоединения к Q;

где представляет собой точку присоединения к Z;

- 130 048725 р является целым числом от 1 до 6;

q является целым числом от 1 до 20;

X представляет собой О или -СН2-; и каждый r независимо равно 0 или 1;

U' отсутствует; и

Q выбран из

Ab представляет собой антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающий фрагмент.
2. Соединение по п.1 или его фармацевтически приемлемая соль, где а является целым числом от 1 до 4;

b является целым числом от 1 до 10; и m равно 0.
3. Соединение по п.1 или 2 или его фармацевтически приемлемая соль, где m равно 0;

n равно 0; и

R³ и R³, каждый, представляет собой водород.
4. Соединение по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемая соль, где Z представляет собой пептид, способный к ферментативному расщеплению.
5. Соединение по п.4 или его фармацевтически приемлемая соль, где Z расщепляется катепсином.
6. Соединение по любому из п.4 или 5 или его фармацевтически приемлемая соль, где Z представляет собой пептид из двух аминокислот, выбранный из Val-Cit, Cit-Val, Val-Ala, Ala-Val, Phe-Lys и LysPhe.
7. Соединение по п.1, где t равно 1; и

Z отсутствует или представляет собой пептид из 2 аминокислот.
8. Соединение по любому из пп.1-7, где R² представляет собой -СН₃ или -(CH₂CH₂O)_s-CH₃ и s является целым числом от 1 до 10.
9. Соединение по п.1, где D-NH представляет собой:

или его фармацевтически приемлемую соль, где а представляет собой точку присоединения к карбонильной группе формулы (I).
10. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-9 или его фармацевтически приемлемую соль и один или более фармацевтически приемлемых носителей.
11. Способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту фармацевтически приемлемого количества соединения по любому из пп.1-9.
12. Способ стимуляции иммунного ответа у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту фармацевтически приемлемого количества соединения по любому из пп.1-9 или композиции по п.10.

- 131 -