[go: up one dir, main page]

EA046120B1 - GENE THERAPY - Google Patents

GENE THERAPY Download PDF

Info

Publication number
EA046120B1
EA046120B1 EA201992514 EA046120B1 EA 046120 B1 EA046120 B1 EA 046120B1 EA 201992514 EA201992514 EA 201992514 EA 046120 B1 EA046120 B1 EA 046120B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cell
cells
mir
monocyte
ifn
Prior art date
Application number
EA201992514
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Луиджи Нальдини
Джулия Эскобар
Бернхард Рудольф Гентнер
Адель Муччи
Original Assignee
Оспедале Сан Раффаэле С.Р.Л.
Фондацьоне Телетон
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Оспедале Сан Раффаэле С.Р.Л., Фондацьоне Телетон filed Critical Оспедале Сан Раффаэле С.Р.Л.
Publication of EA046120B1 publication Critical patent/EA046120B1/en

Links

Description

Область техникиField of technology

Изобретение относится к применению генной терапии на основе цитокинов, в частности, генной терапии на основе интерферона (например, интерферон-альфа или интерферон-гамма), необязательно, в сочетании с ингибитором контрольных точек иммунитета, Т-клетками, специфическими для опухолеассоциированного антигена (TAA), и/или 1-метилтриптофаном (1-МТ) для лечения или профилактики злокачественного новообразования.The invention relates to the use of cytokine-based gene therapy, in particular interferon-based gene therapy (for example, interferon-alpha or interferon-gamma), optionally in combination with an immune checkpoint inhibitor, tumor-associated antigen (TAA)-specific T cells ), and/or 1-methyltryptophan (1-MT) for the treatment or prevention of malignancy.

Предпосылки изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

Недавно был усилен интерес к иммунотерапии как противоопухолевому лечению ввиду ее способности вызывать длительную ремиссию. Более глубокое понимание механизмов, с помощью которых злокачественные клетки ускользают от иммунного ответа, привело к разработке новых терапевтических средств, нацеленных на иммунные контрольные точки, тем самым раскрывая возможности иммунной системы1. Клинические испытания этих препаратов привели к беспрецедентным показателям по длительности ответов в опухолях, ранее считавшихся неизменно летальными, таких как метастатическая меланома2,3. Однако, несмотря на эти достижения, большая часть пациентов не отвечает на эти способы лечения либо из-за неспособности продуцировать опухолеспецифические Т-клетки, либо из-за наличия иммуносупрессивного микроокружения опухоли, что делает их устойчивыми к блокаде классических негативных контрольных точек, CTLA4 или PD1/PDL14.Recently, there has been increased interest in immunotherapy as an anticancer treatment due to its ability to induce long-term remission. Greater understanding of the mechanisms by which malignant cells evade the immune response has led to the development of new therapeutics that target immune checkpoints, thereby unlocking the capabilities of the immune system 1 . Clinical trials of these drugs have resulted in unprecedented long-lasting responses in tumors previously considered invariably lethal, such as metastatic melanoma 2,3 . However, despite these advances, a large proportion of patients do not respond to these treatments, either due to an inability to produce tumor-specific T cells or the presence of an immunosuppressive tumor microenvironment, making them resistant to classical negative checkpoint blockade, CTLA4 or PD1 /PDL14.

Таким образом, предпринимаемые в настоящее время попытки направлены на выявление новых мишеневых контрольных точек иммунитета и комбинированной терапии, что может расширить возможности иммунотерапии для большего числа пациентов с опухолями. В связи с этим усилился интерес к использованию цитокинов, таких как интерфероны (IFN), в качестве противоопухолевых агентов5. Помимо цитостатического и антиангиогенного действия на опухолевые клетки и кровеносные сосуды, интерфероны, в частности, интерфероны 1-го типа, увеличивают созревание и способность к перекрестному праймированию дендритных клеток (DC), пролиферацию и цитотоксичность Т-клеток, уничтожающий потенциал естественных клеток-киллеров (NK), а также переключение классов иммуноглобулинов В-клеток6,7. Ранее авторы сообщали о доказательствах, полученных в ходе экспериментальных проверок, того, что стратегия клеточной и генной терапии, основанной на селективной экспрессии трансгена альфа-интерферона (IFNa) в потомстве моноцитов/макрофагов, проникающих в опухоль трансплантированных, полученных методами генной инженерии гемопоэтических стволовых клеток (HSC), может усиливать противоопухолевые реакции. Эта нацеленная на опухоль стратегия доставки IFNa не показала системной токсичности у мышей и ингибировала рост спонтанных опухолей молочной железы, а также метастазов в легких и печени в клетках злокачественного новообразования молочной железы и колоректального злокачественного новообразования, соответственно8-10.Thus, current efforts are aimed at identifying new immune checkpoint targets and combination therapies that may expand immunotherapy options to a larger number of tumor patients. Consequently, there has been increased interest in the use of cytokines such as interferons (IFNs) as antitumor agents 5 . In addition to their cytostatic and antiangiogenic effects on tumor cells and blood vessels, interferons, particularly type 1 interferons, increase the maturation and cross-priming capacity of dendritic cells (DCs), T cell proliferation, and cytotoxicity, depleting the potential of natural killer cells ( NK), as well as immunoglobulin class switching of B cells 6,7 . The authors previously reported evidence from experimental trials that cell and gene therapy strategies based on selective expression of interferon alpha (IFNa) transgene in tumor-infiltrating monocyte/macrophage progeny of transplanted, genetically engineered hematopoietic stem cells (HSC), may enhance antitumor responses. This tumor-targeted IFNa delivery strategy showed no systemic toxicity in mice and inhibited the growth of spontaneous mammary tumors as well as lung and liver metastases in breast and colorectal malignancy cells, respectively 8 - 10 .

Другим иммунотерапевтическим подходом является адоптивный перенос генно-инженерных Т-клеток, экспрессирующих рецептор трансгенных Т-клеток (TCR) или химерный антигенный рецептор (CAR), направленных против связанного с опухолью антигена (TAA)11,12. Этот подход особенно приемлем для злокачественных новообразований с низкой мутационной нагрузкой, которые не способны индуцировать эндогенные Т-клеточные ответы против TAA. Т-клетки CAR, распознающие антиген CD19, продемонстрировали замечательную эффективность при рецидивирующих и рефрактерных В-клеточных злокачественных опухолях. Тем не менее, эти исследования также показали, что терапевтический эффект был менее выражен при нодальном варианте болезни костного мозга (ВМ) или лейкозе, предполагая, что иммуносупрессивное микроокружение представляет собой серьезное препятствие для успешной иммунотерапии, особенно при солидных опухолевых образованиях. Более того, в быстрорастущих опухолях, таких как В-клеточный острый лимфобластный лейкоз (В-ALL), потеря антигена происходит у 20% пациентов, получавших CD19 CAR Т-клетки, что свидетельствует об ограниченной возможности иммунотерапии, направленной против одного антигена11,13. Тем не менее, имеется мало данных о том, вызывает ли лейкоз TAA-специфические Т-клеточные ответы за пределами аллогенного трансплантата, и может ли такой ответ усиливаться в терапевтических целях.Another immunotherapeutic approach is the adoptive transfer of genetically engineered T cells expressing transgenic T cell receptor (TCR) or chimeric antigen receptor (CAR) directed against tumor associated antigen (TAA) 11,12 . This approach is particularly suitable for malignancies with low mutational load that are unable to induce endogenous T cell responses against TAA. CAR T cells recognizing the CD19 antigen have demonstrated remarkable efficacy in relapsed and refractory B-cell malignancies. However, these studies also showed that the therapeutic effect was less pronounced in nodal bone marrow disease (BM) or leukemia, suggesting that the immunosuppressive microenvironment represents a major barrier to successful immunotherapy, especially in solid tumors. Moreover, in fast-growing tumors such as B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL), antigen loss occurs in 20% of patients treated with CD19 CAR T cells, suggesting the limited utility of immunotherapy directed against a single antigen 11,13 . However, there is little data on whether leukemia induces TAA-specific T cell responses outside the allogeneic graft and whether such responses can be enhanced for therapeutic purposes.

Сохраняется необходимость в улучшении способа лечения злокачественных новообразований. Настоящее изобретение удовлетворяет эту потребность, благодаря обнаружению того факта, что улучшенная эффективность может быть достигнута, при использовании цитокина, такого как IFNa, доставляемого генной терапией, в сочетании с другими иммунотерапевтическими стратегиями.There remains a need to improve the way cancer is treated. The present invention addresses this need by discovering that improved efficacy can be achieved when using a cytokine, such as IFNa, delivered by gene therapy in combination with other immunotherapeutic strategies.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что цитокин, такой как интерферон, доставляемый генной терапией, может стимулировать индукцию, консолидацию и поддержание противоопухолевых ответов и обеспечивать синергизм вместе с другими иммунотерапевтическими стратегиями, в частности, с лечением ингибиторами контрольных точек иммунитета и лечением с помощью Т-клеток, специфических для опухолеассоцированного антигена (TAA).We have unexpectedly discovered that a cytokine, such as interferon, delivered by gene therapy can stimulate the induction, consolidation and maintenance of antitumor responses and provide synergism with other immunotherapeutic strategies, particularly immune checkpoint inhibitor treatments and T cell therapies. , specific for tumor-associated antigen (TAA).

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предложены гемопоэтическая стволовая клетка (HSC), гематопоэтическая клетка-предшественник (НРС), миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, где вектор содержит по меньшейIn accordance with one aspect of the present invention, there is provided a hematopoietic stem cell (HSC), hematopoietic progenitor cell (HPC), myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a vector, where the vector contains at least

- 1 046120 мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клеткапредшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета.- 1 046120 at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine, for use in the treatment or prevention of a malignancy in a patient, wherein HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte are used in combination with an immune checkpoint inhibitor.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации со специфической к связанному с опухолью антигену (TAA) Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a vector, wherein the vector contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked with a nucleotide sequence encoding a cytokine for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte is used in combination with a tumor-associated antigen (TAA)-specific T- cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета и TAA-специфической Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a vector, wherein the vector contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked with a nucleotide sequence encoding a cytokine for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte is used in combination with an immune checkpoint inhibitor and a TAA-specific T cell .

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации с 1-метилтриптофаном (1-МТ).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a vector, wherein the vector contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked with a nucleotide sequence encoding a cytokine for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte are used in combination with 1-methyltryptophan (1-MT).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен вектор, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где вектор используется в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a vector comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, where the vector is used in combination with an immune checkpoint inhibitor.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен вектор, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где вектор используется в комбинации с TAAспецифической Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a vector comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, where the vector is used in combination with a TAA-specific T cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен вектор, содержащий по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где вектор используется в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета и TAA-специфической Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a vector comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein the vector used in combination with an immune checkpoint inhibitor and a TAA-specific T cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен вектор, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где вектор используется в комбинации в комбинации с 1-метилтриптофаном (1-МТ).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a vector comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein the vector is used in combination with 1-methyltryptophan (1-MT).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены TAA-специфичные Тклетки, экспрессирующие CAR и/или трансгенный TCR, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин.In accordance with another aspect of the present invention, TAA-specific T Cells expressing a CAR and/or a transgenic TCR are provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been treated with HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or a monocyte containing a vector, where the vector contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена TAA-специфическая Т-клетка для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили вектор, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mirn-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин.In accordance with another aspect of the present invention, a TAA-specific T cell is provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered a vector containing at least one mir-130a and/or mirn-126 target sequence , functionally related to the nucleotide sequence encoding the cytokine.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен ингибитор контрольных точек иммунитета для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клеткупредшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided an immune checkpoint inhibitor for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, or monocyte containing a vector, wherein the vector contains at least at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine.

- 2 046120- 2 046120

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен ингибитор контрольных точек иммунитета для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили вектор, содержащий по меньшей мере одну последовательностьмишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанная с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided an immune checkpoint inhibitor for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered a vector comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence , encoding a cytokine.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен 1-метилтриптофан (1-МТ) для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательностьмишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин.In accordance with another aspect of the present invention, 1-methyltryptophan (1-MT) is provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, or monocyte containing vector where the vector contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен 1-метилтриптофан (1-МТ) для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили вектор, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин.In accordance with another aspect of the present invention, 1-methyltryptophan (1-MT) is provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered a vector containing at least one mir-130a and/or mir target sequence -126, operably linked to the nucleotide sequence encoding the cytokine.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена комбинация ингибитора контрольных точек иммунитета и TAA-специфической Т-клетки для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин.In accordance with another aspect of the present invention, a combination of an immune checkpoint inhibitor and a TAA-specific T cell is provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been treated with HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, or monocyte containing a vector, where the vector contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена комбинация ингибитора контрольных точек иммунитета и TAA-специфической Т-клетки для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили вектор, содержащий по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанная с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин.In accordance with another aspect of the present invention, a combination of an immune checkpoint inhibitor and a TAA-specific T cell is provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered a vector containing at least one mir-130a target sequence and/ or mir-126, operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования, который включает введение HSC, НРС, миелоид/моноциткоммитированной клетки-предшественника, макрофага или моноцита, содержащих вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, нуждающемуся в этом пациенту, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета и/или TAA-специфической Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or preventing cancer, which includes administering an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a vector, where the vector contains at least one mir-130a target sequence and /or mir-126 operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine in a patient in need thereof, wherein an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte is used in combination with an immune checkpoint inhibitor and/or a TAA- specific T cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования, который включает введение вектора, содержащего, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130а и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, нуждающемуся в этом пациенту, где вектор используют в комбинации с ингибитором иммунной контрольной точки и/или TAA-специфической Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or preventing a malignant neoplasm, which includes administering a vector containing at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine to a patient in need in this patient, where the vector is used in combination with an immune checkpoint inhibitor and/or a TAA-specific T cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования у пациента, которому ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, где вектор содержит, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, где этот способ включает введение пациенту TAA-специфической Т-клетки и/или введение пациенту ингибитора контрольных точек иммунитета.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or preventing cancer in a patient who has previously been administered an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a vector, where the vector contains at least one sequence -a mir-130a and/or mir-126 target operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine, wherein the method comprises administering a TAA-specific T cell to the patient and/or administering an immune checkpoint inhibitor to the patient.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения и/или профилактики злокачественного новообразования у пациента, которому ранее вводили вектор, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующий цитокин, который включает стадию введения пациенту TAA-специфической Т-клетки и/или стадию введения пациенту ингибитора контрольных точек иммунитета.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method for treating and/or preventing cancer in a patient who has previously been administered a vector containing at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence, encoding a cytokine, which includes the step of administering a TAA-specific T cell to the patient and/or the step of administering an immune checkpoint inhibitor to the patient.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования, который включает введение HSC, НРС, миелоид/моноциткоммитированной клетки-предшественника, макрофага или моноцита, содержащих вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, нуждающемуся в этом пациенту, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации с 1-метилтриптофаном (1-МТ).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or preventing cancer, which includes administering an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a vector, where the vector contains at least one mir-130a target sequence and /or mir-126 operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine in a patient in need thereof, wherein an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte is used in combination with 1-methyltryptophan (1-MT).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования, который включает введение вектора, содержащего, поIn accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or preventing malignancy, which includes administering a vector containing,

- 3 046120 меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, нуждающемуся в этом пациенту, где вектор используют в комбинации с 1-метилтриптофаном (1-МТ).- 3 046120 at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine in a patient in need thereof, wherein the vector is used in combination with 1-methyltryptophan (1-MT).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования у пациента, которому ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, где вектор содержит, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, где этот способ включает введение пациенту 1-метилтриптофана (1-МТ).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or preventing cancer in a patient who has previously been administered an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a vector, where the vector contains at least one sequence -a mir-130a and/or mir-126 target operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine, wherein the method comprises administering 1-methyltryptophan (1-MT) to the patient.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения и/или профилактики злокачественного новообразования у пациента, которому ранее вводили вектор, содержащий по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, который включает стадию введения пациенту 1-метилтриптофана (1-МТ).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating and/or preventing cancer in a patient who has previously been administered a vector containing at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine , which includes the step of administering 1-methyltryptophan (1-MT) to the patient.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены гемопоэтическая стволовая клетка (HSC), гематопоэтическая клетка-предшественник (НРС), миелоид/моноцит-коммитированная клеткапредшественник, макрофаг или моноцит, содержащие полинуклеотид, где полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a hematopoietic stem cell (HSC), hematopoietic progenitor cell (HPC), myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a polynucleotide, where the polynucleotide contains at least one mir-130a target sequence and/or mir-126 operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte is used in combination with a control inhibitor points of immunity.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие полинуклеотид, где полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации со специфической к связанному с опухолью антигену (TAA) Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a polynucleotide, wherein the polynucleotide contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked with a nucleotide sequence encoding a cytokine for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte is used in combination with a tumor-associated antigen (TAA)-specific T- cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие полинуклеотид, где полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета и TAA-специфической Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a polynucleotide, wherein the polynucleotide contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked with a nucleotide sequence encoding a cytokine for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte is used in combination with an immune checkpoint inhibitor and a TAA-specific T cell .

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие полинуклеотид, где полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации с 1-метилтриптофаном (1-MT).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a polynucleotide, wherein the polynucleotide contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked with a nucleotide sequence encoding a cytokine for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte are used in combination with 1-methyltryptophan (1-MT).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен полинуклеотид, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130а и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где полинуклеотид используется в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a polynucleotide comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine, for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein the polynucleotide is used in combination with an immune checkpoint inhibitor.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен полинуклеотид, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130а и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где полинуклеотид используется в комбинации с TAA-специфической Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a polynucleotide comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine, for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein the polynucleotide is used in combination with a TAA-specific T cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен полинуклеотид, содержащий по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130а и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где полинуклеотид используется в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета и TAA-специфической Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a polynucleotide comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein the polynucleotide used in combination with an immune checkpoint inhibitor and a TAA-specific T cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен полинуклеотид, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130а и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где полинуклеотид используется в комбинации в комбинации с 1-метилтриптофаном (1-MT).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a polynucleotide comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine, for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein the polynucleotide is used in combination with 1-methyltryptophan (1-MT).

- 4 046120- 4 046120

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены TAA-специфичные Тклетки, экспрессирующие CAR и/или трансгенный TCR, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие полинуклеотид, где полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин.In accordance with another aspect of the present invention, TAA-specific T Cells expressing a CAR and/or a transgenic TCR are provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been treated with HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or a monocyte, containing a polynucleotide, where the polynucleotide contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена TAA-специфическая Тклетка для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили полинуклеотид, содержащий, по меньшей мере, одну последовательностьмишень mir-130а и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин.In accordance with another aspect of the present invention, a TAA-specific T Cell is provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered a polynucleotide containing at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to nucleotide sequence encoding a cytokine.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен ингибитор контрольных точек иммунитета для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клеткупредшественник, макрофаг или моноцит, содержащие полинуклеотид, где полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided an immune checkpoint inhibitor for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, or monocyte containing polynucleotide, wherein the polynucleotide contains at least at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен ингибитор контрольных точек иммунитета для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили полинуклеотид, содержащий по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130а и/или mir-126, функционально связанная с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided an immune checkpoint inhibitor for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered a polynucleotide comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to nucleotide sequence encoding a cytokine.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен 1-метилтриптофан (1-MT) для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие полинуклеотид, где полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин.In accordance with another aspect of the present invention, 1-methyltryptophan (1-MT) is provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, or monocyte containing a polynucleotide wherein the polynucleotide contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен 1-метилтриптофан (1-MT) для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили полинуклеотид, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин.In accordance with another aspect of the present invention, 1-methyltryptophan (1-MT) is provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered a polynucleotide comprising at least one mir-130a and/or mir target sequence -126, operably linked to the nucleotide sequence encoding the cytokine.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена комбинация ингибитора контрольных точек иммунитета и TAA-специфической Т-клетки для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие полинуклеотид, где полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин.In accordance with another aspect of the present invention, a combination of an immune checkpoint inhibitor and a TAA-specific T cell is provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been treated with HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, or monocyte containing a polynucleotide, where the polynucleotide contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to the nucleotide sequence encoding the cytokine.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена комбинация ингибитора контрольных точек иммунитета и TAA-специфической Т-клетки для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили полинуклеотид, содержащий по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанная с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин.In accordance with another aspect of the present invention, a combination of an immune checkpoint inhibitor and a TAA-specific T cell is provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered a polynucleotide comprising at least one mir-130a target sequence and/or or mir-126, operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования, который включает введение HSC, НРС, миелоид/моноциткоммитированной клетки-предшественника, макрофага или моноцита, содержащих полинуклеотид, где полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, нуждающемуся в этом пациенту, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета и/или TAAспецифической Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or preventing cancer, which includes administering an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a polynucleotide, where the polynucleotide contains at least one mir-130a target sequence and /or mir-126 operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine to a patient in need thereof, wherein an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte is used in combination with an immune checkpoint inhibitor and/or a TAA-specific T -cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования, который включает введение полинуклеотида, содержащего, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, нуждающемуся в этом пациенту, где полинуклеотид используют в комбинации с ингибитором иммунной контрольной точки и/или TAAспецифической Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or preventing a malignant neoplasm, which includes administering a polynucleotide containing at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine to a patient in need in this patient, where the polynucleotide is used in combination with an immune checkpoint inhibitor and/or a TAA-specific T cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования у пациента, которому ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие полинуклеотид, где полинуклеотид содержит, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/илиIn accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or preventing cancer in a patient who has previously been administered an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a polynucleotide, where the polynucleotide contains at least one sequence -target mir-130a and/or

- 5 046120 mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, где этот способ включает введение пациенту TAA-специфической Т-клетки и/или введение пациенту ингибитора контрольных точек иммунитета.- 5 046120 mir-126, operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine, where the method includes administering a TAA-specific T cell to a patient and/or administering an immune checkpoint inhibitor to the patient.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения и/или профилактики злокачественного новообразования у пациента, которому ранее вводили полинуклеотид, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующий цитокин, который включает стадию введения пациенту TAA-специфической Т-клетки и/или стадию введения пациенту ингибитора контрольных точек иммунитета.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method for treating and/or preventing cancer in a patient who has previously been administered a polynucleotide comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to the nucleotide sequence, encoding a cytokine, which includes the step of administering a TAA-specific T cell to the patient and/or the step of administering an immune checkpoint inhibitor to the patient.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования, который включает введение HSC, НРС, миелоид/моноциткоммитированной клетки-предшественника, макрофага или моноцита, содержащих полинуклеотид, где полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, нуждающемуся в этом пациенту, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации с 1-метилтриптофаном (1-MT).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or preventing cancer, which includes administering an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a polynucleotide, where the polynucleotide contains at least one mir-130a target sequence and /or mir-126 operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine in a patient in need thereof, wherein an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte is used in combination with 1-methyltryptophan (1-MT).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования, который включает введение полинуклеотида, содержащего, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, нуждающемуся в этом пациенту, где полинуклеотид используют в комбинации с 1-метилтриптофаном (1-MT).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or preventing a malignant neoplasm, which includes administering a polynucleotide containing at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine to a patient in need in this patient, where the polynucleotide is used in combination with 1-methyltryptophan (1-MT).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования у пациента, которому ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие полинуклеотид, где полинуклеотид содержит, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, где этот способ включает введение пациенту 1-метилтриптофана (1-MT).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or preventing cancer in a patient who has previously been administered an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a polynucleotide, where the polynucleotide contains at least one sequence -a mir-130a and/or mir-126 target operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine, wherein the method comprises administering 1-methyltryptophan (1-MT) to the patient.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения и/или профилактики злокачественного новообразования у пациента, которому ранее вводили полинуклеотид, содержащий по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, который включает стадию введения пациенту 1-метилтриптофана (1-MT).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method for treating and/or preventing cancer in a patient who has previously been administered a polynucleotide comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine , which includes the step of administering 1-methyltryptophan (1-MT) to the patient.

В соответствии с другим аспектом аспектом настоящего изобретения предложены гемопоэтическая стволовая клетка (HSC), гематопоэтическая клетка-предшественник (НРС), миелоид/моноциткоммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон (IFN) 1 типа, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a hematopoietic stem cell (HSC), hematopoietic progenitor cell (HPC), myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a vector, where the vector contains at least one target sequence mir- 130a and/or mir-126, operably linked to a nucleotide sequence encoding interferon (IFN) type 1, for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte used in combination with an immune checkpoint inhibitor.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации со специфической к связанному с опухолью антигену (TAA) Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a vector, wherein the vector contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked with a nucleotide sequence encoding type 1 interferon, for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte is used in combination with a specific tumor associated antigen (TAA) T cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета и TAA-специфической Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a vector, wherein the vector contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked with a nucleotide sequence encoding type 1 interferon, for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte is used in combination with an immune checkpoint inhibitor and TAA-specific T -cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации с 1-метилтриптофаном (1-MT).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a vector, wherein the vector contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked with a nucleotide sequence encoding type 1 interferon, for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte is used in combination with 1-methyltryptophan (1-MT).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен вектор, содержащий, поIn accordance with another aspect of the present invention, there is provided a vector containing,

- 6 046120 меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где вектор используется в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета.- 6 046120 at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon, for use in the treatment or prevention of malignancy in a patient, where the vector is used in combination with a control inhibitor points of immunity.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен вектор, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где вектор используется в комбинации с TAAспецифической Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a vector comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, where the vector is used in combination with a TAA-specific T cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен вектор, содержащий по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где вектор используется в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета и TAA-специфической Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a vector comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon, for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, where the vector is used in combination with an immune checkpoint inhibitor and a TAA-specific T cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен вектор, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где вектор используется в комбинации в комбинации с 1-метилтриптофаном (1-MT).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a vector comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon, for use in the treatment or prevention of cancer in patient, where the vector is used in combination with 1-methyltryptophan (1-MT).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены TAA-специфичные Тклетки, экспрессирующие CAR и/или трансгенный TCR, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа.In accordance with another aspect of the present invention, TAA-specific T Cells expressing a CAR and/or a transgenic TCR are provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been treated with HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or a monocyte containing a vector, where the vector contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена TAA-специфическая Тклетка для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили вектор, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа.In accordance with another aspect of the present invention, a TAA-specific T Cell is provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered a vector comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence functionally associated with the nucleotide sequence encoding type 1 interferon.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен ингибитор контрольных точек иммунитета для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клеткупредшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided an immune checkpoint inhibitor for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, or monocyte containing a vector, wherein the vector contains at least at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен ингибитор контрольных точек иммунитета для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили вектор, содержащий по меньшей мере одну последовательностьмишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанная с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided an immune checkpoint inhibitor for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered a vector comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence , encoding type 1 interferon.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен 1-метилтриптофан (1-MT) для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательностьмишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа.In accordance with another aspect of the present invention, 1-methyltryptophan (1-MT) is provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, or monocyte containing vector where the vector contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен 1-метилтриптофан (1-MT) для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили вектор, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа.In accordance with another aspect of the present invention, 1-methyltryptophan (1-MT) is provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered a vector containing at least one mir-130a and/or mir target sequence -126, functionally related to the nucleotide sequence encoding type 1 interferon.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена комбинация ингибитора контрольных точек иммунитета и TAA-специфической Т-клетки для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа.In accordance with another aspect of the present invention, a combination of an immune checkpoint inhibitor and a TAA-specific T cell is provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been treated with HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, or monocyte containing a vector, where the vector contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена комбинация ингибитора контрольных точек иммунитета и TAA-специфической Т-клетки для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили вектор, содержащий по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанIn accordance with another aspect of the present invention, a combination of an immune checkpoint inhibitor and a TAA-specific T cell is provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered a vector containing at least one mir-130a target sequence and/ or mir-126, functionally related

- 7 046120 ная с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа.- 7 046120 with a nucleotide sequence encoding type 1 interferon.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования, который включает введение HSC, НРС, миелоид/моноциткоммитированной клетки-предшественника, макрофага или моноцита, содержащих вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, нуждающемуся в этом пациенту, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета и/или TAAспецифической Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or preventing cancer, which includes administering an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a vector, where the vector contains at least one mir-130a target sequence and /or mir-126 operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon to a patient in need thereof, wherein an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte is used in combination with an immune checkpoint inhibitor and/or TAA-specific T cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования, который включает введение вектора, содержащего, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130а и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, нуждающемуся в этом пациенту, где вектор используют в комбинации с ингибитором иммунной контрольной точки и/или TAAспецифической Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method for treating or preventing a malignant neoplasm, which includes administering a vector containing at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon patient in need, where the vector is used in combination with an immune checkpoint inhibitor and/or a TAA-specific T cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования у пациента, которому ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, где вектор содержит, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, где этот способ включает введение пациенту TAA-специфической Т-клетки и/или введение пациенту ингибитора контрольных точек иммунитета.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or preventing cancer in a patient who has previously been administered an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a vector, where the vector contains at least one sequence -a mir-130a and/or mir-126 target operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon, wherein the method comprises administering a TAA-specific T cell to the patient and/or administering an immune checkpoint inhibitor to the patient.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения и/или профилактики злокачественного новообразования у пациента, которому ранее вводили вектор, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующий интерферон 1 типа, который включает стадию введения пациенту TAA-специфической Т-клетки и/или стадию введения пациенту ингибитора контрольных точек иммунитета.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method for treating and/or preventing cancer in a patient who has previously been administered a vector containing at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence, encoding type 1 interferon, which includes the step of administering a TAA-specific T cell to the patient and/or the step of administering an immune checkpoint inhibitor to the patient.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования, который включает введение HSC, НРС, миелоид/моноциткоммитированной клетки-предшественника, макрофага или моноцита, содержащих вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, нуждающемуся в этом пациенту, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации с 1-метилтриптофаном (1-MT).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or preventing cancer, which includes administering an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a vector, where the vector contains at least one mir-130a target sequence and /or mir-126 operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon in a patient in need thereof, wherein an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte is used in combination with 1-methyltryptophan (1-MT ).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования, который включает введение вектора, содержащего, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130а и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, нуждающемуся в этом пациенту, где вектор используют в комбинации с 1-метилтриптофаном (1-MT).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method for treating or preventing a malignant neoplasm, which includes administering a vector containing at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon patient in need, where the vector is used in combination with 1-methyltryptophan (1-MT).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования у пациента, которому ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, где вектор содержит, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, где этот способ включает введение пациенту 1-метилтриптофана (1-MT).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or preventing cancer in a patient who has previously been administered an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a vector, where the vector contains at least one sequence -a mir-130a and/or mir-126 target operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon, wherein the method comprises administering 1-methyltryptophan (1-MT) to the patient.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения и/или профилактики злокачественного новообразования у пациента, которому ранее вводили вектор, содержащий по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, который включает стадию введения пациенту 1-метилтриптофана (1-MT).In accordance with another aspect of the present invention, a method is provided for the treatment and/or prevention of malignancy in a patient who has previously been administered a vector containing at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding an interferon Type 1, which includes the step of administering 1-methyltryptophan (1-MT) to the patient.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены гемопоэтическая стволовая клетка (HSC), гематопоэтическая клетка-предшественник (НРС), миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие полинуклеотид, где полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где HSC, НРС, миелоид/моноциткоммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a hematopoietic stem cell (HSC), hematopoietic progenitor cell (HPC), myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a polynucleotide, where the polynucleotide contains at least one mir target sequence -130a and/or mir-126, operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon, for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, or monocyte is used in combination with immune checkpoint inhibitor.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие полинуклеотид, где полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/илиIn accordance with another aspect of the present invention, there is provided an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a polynucleotide, wherein the polynucleotide contains at least one mir-130a target sequence and/or

- 8 046120 mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации со специфической к связанному с опухолью антигену (TAA) Т-клеткой.- 8 046120 mir-126, operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon, for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein an HSC, HSC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte is used in combination with tumor-associated antigen (TAA)-specific T cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие полинуклеотид, где полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета и TAA-специфической Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a polynucleotide, wherein the polynucleotide contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked with a nucleotide sequence encoding type 1 interferon for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte is used in combination with an immune checkpoint inhibitor and TAA-specific T -cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие полинуклеотид, где полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации с 1-метилтриптофаном (1-MT).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a polynucleotide, wherein the polynucleotide contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked with a nucleotide sequence encoding type 1 interferon, for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte is used in combination with 1-methyltryptophan (1-MT).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен полинуклеотид, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130а и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где полинуклеотид используется в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a polynucleotide comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon, for use in the treatment or prevention of cancer in patient, where the polynucleotide is used in combination with an immune checkpoint inhibitor.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен полинуклеотид, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень шй-130а и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где полинуклеотид используется в комбинации с TAA-специфической Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a polynucleotide comprising at least one mi-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon, for use in the treatment or prevention of cancer in patient, where the polynucleotide is used in combination with a TAA-specific T cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен полинуклеотид, содержащий по меньшей мере одну последовательность-мишень шй-130а и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где полинуклеотид используется в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета и TAA-специфической Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a polynucleotide comprising at least one mi-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon, for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein the polynucleotide is used in combination with an immune checkpoint inhibitor and a TAA-specific T cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен полинуклеотид, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень шй-130а и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где полинуклеотид используется в комбинации в комбинации с 1-метилтриптофаном (1-MT).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a polynucleotide comprising at least one mi-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon, for use in the treatment or prevention of cancer in patient, where the polynucleotide is used in combination in combination with 1-methyltryptophan (1-MT).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены TAA-специфичные Тклетки, экспрессирующие CAR и/или трансгенный TCR, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие полинуклеотид, где полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа.In accordance with another aspect of the present invention, TAA-specific T Cells expressing a CAR and/or a transgenic TCR are provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been treated with HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or a monocyte, containing a polynucleotide, where the polynucleotide contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена TAA-специфическая Тклетка для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили полинуклеотид, содержащий, по меньшей мере, одну последовательностьмишень mir-130а и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа.In accordance with another aspect of the present invention, a TAA-specific T Cell is provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered a polynucleotide containing at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to nucleotide sequence encoding type 1 interferon.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен ингибитор контрольных точек иммунитета для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клеткупредшественник, макрофаг или моноцит, содержащие полинуклеотид, где полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided an immune checkpoint inhibitor for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, or monocyte containing polynucleotide, wherein the polynucleotide contains at least at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен ингибитор контрольных точек иммунитета для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили полинуклеотид, содержащий по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130а и/или mir-126, функционально связанная с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided an immune checkpoint inhibitor for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered a polynucleotide comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to nucleotide sequence encoding type 1 interferon.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен 1-метилтриптофан (1-MT)In accordance with another aspect of the present invention there is provided 1-methyltryptophan (1-MT)

- 9 046120 для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие полинуклеотид, где полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон.- 9 046120 for use in the treatment or prevention of malignancy in a patient where the patient has previously been administered an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a polynucleotide, where the polynucleotide contains at least one mir-target sequence 130a and/or mir-126, operably linked to the nucleotide sequence encoding interferon.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен 1-метилтриптофан (1-MT) для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили полинуклеотид, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон.In accordance with another aspect of the present invention, 1-methyltryptophan (1-MT) is provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered a polynucleotide comprising at least one mir-130a and/or mir target sequence -126, functionally related to the nucleotide sequence encoding interferon.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена комбинация ингибитора контрольных точек иммунитета и TAA-специфической Т-клетки для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие полинуклеотид, где полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа.In accordance with another aspect of the present invention, a combination of an immune checkpoint inhibitor and a TAA-specific T cell is provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been treated with HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, or monocyte containing a polynucleotide, where the polynucleotide contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена комбинация ингибитора контрольных точек иммунитета и TAA-специфической Т-клетки для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где пациенту ранее вводили полинуклеотид, содержащий по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанная с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа.In accordance with another aspect of the present invention, a combination of an immune checkpoint inhibitor and a TAA-specific T cell is provided for use in the treatment or prevention of cancer in a patient where the patient has previously been administered a polynucleotide comprising at least one mir-130a target sequence and/or or mir-126, operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования, который включает введение HSC, НРС, миелоид/моноциткоммитированной клетки-предшественника, макрофага или моноцита, содержащих полинуклеотид, где полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, нуждающемуся в этом пациенту, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клеткапредшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета и/или TAA-специфической Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or preventing cancer, which includes administering an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a polynucleotide, where the polynucleotide contains at least one mir-130a target sequence and /or mir-126 operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon to a patient in need thereof, wherein an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte is used in combination with an immune checkpoint inhibitor and/or a TAA- specific T cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования, который включает введение полинуклеотида, содержащего, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, нуждающемуся в этом пациенту, где полинуклеотид используют в комбинации с ингибитором иммунной контрольной точки и/или TAAспецифической Т-клеткой.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or preventing a malignant neoplasm, which includes administering a polynucleotide containing at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon to a patient in need thereof, wherein the polynucleotide is used in combination with an immune checkpoint inhibitor and/or a TAA-specific T cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования у пациента, которому ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие полинуклеотид, где полинуклеотид содержит, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, где этот способ включает введение пациенту TAA-специфической Т-клетки и/или введение пациенту ингибитора контрольных точек иммунитета.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or preventing cancer in a patient who has previously been administered an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a polynucleotide, where the polynucleotide contains at least one sequence -a mir-130a and/or mir-126 target operably linked to a nucleotide sequence encoding type 1 interferon, wherein the method comprises administering a TAA-specific T cell to the patient and/or administering an immune checkpoint inhibitor to the patient.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения и/или профилактики злокачественного новообразования у пациента, которому ранее вводили полинуклеотид, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующий интерферон 1 типа, который включает стадию введения пациенту TAA-специфической Т-клетки и/или стадию введения пациенту ингибитора контрольных точек иммунитета.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method for treating and/or preventing cancer in a patient who has previously been administered a polynucleotide comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to the nucleotide sequence, encoding type 1 interferon, which includes the step of administering a TAA-specific T cell to the patient and/or the step of administering an immune checkpoint inhibitor to the patient.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования, который включает введение HSC, НРС, миелоид/моноциткоммитированной клетки-предшественника, макрофага или моноцита, содержащих полинуклеотид, где полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон, нуждающемуся в этом пациенту, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используются в комбинации с 1-метилтриптофаном (1-MT).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or preventing cancer, which includes administering an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a polynucleotide, where the polynucleotide contains at least one mir-130a target sequence and /or mir-126 operably linked to a nucleotide sequence encoding an interferon in a patient in need thereof, wherein an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte is used in combination with 1-methyltryptophan (1-MT).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики злокачественного новообразования, который включает введение полинуклеотида, содержащего, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон, нуждающемуся в этом пациенту, где полинуклеотид используют в комбинации с 1-метилтриптофаном (1-MT).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or preventing a malignant neoplasm, which includes administering a polynucleotide containing at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding an interferon to a patient in need in this patient, where the polynucleotide is used in combination with 1-methyltryptophan (1-MT).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профиIn accordance with another aspect of the present invention, there is provided a method of treating or pro

- 10 046120 лактики злокачественного новообразования у пациента, которому ранее вводили HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие полинуклеотид, где полинуклеотид содержит, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон, где этот способ включает введение пациенту 1-метилтриптофана (1-MT).- 10 046120 lactic malignancy in a patient who has previously been administered an HSC, NPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a polynucleotide, where the polynucleotide contains at least one mir-130a target sequence and/or mir-126, operably linked to a nucleotide sequence encoding interferon, wherein the method comprises administering 1-methyltryptophan (1-MT) to the patient.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения и/или профилактики злокачественного новообразования у пациента, которому ранее вводили полинуклеотид, содержащий по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интерферон 1 типа, который включает стадию введения пациенту 1-метилтриптофана (1-MT).In accordance with another aspect of the present invention, a method is provided for the treatment and/or prevention of malignancy in a patient who has previously been administered a polynucleotide comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to an interferon-encoding nucleotide sequence Type 1, which includes the step of administering 1-methyltryptophan (1-MT) to the patient.

В одном варианте осуществления TAA-специфическая Т-клетка экспрессирует химерный антигенный рецептор (CAR) и/или трансгенный Т-клеточный рецептор (TCR). В одном варианте осуществления TAA-специфическая Т-клетка экспрессирует CAR. В одном варианте осуществления TAAспецифическая Т-клетка экспрессирует трансгенный TCR.In one embodiment, the TAA-specific T cell expresses a chimeric antigen receptor (CAR) and/or a transgenic T cell receptor (TCR). In one embodiment, the TAA-specific T cell expresses a CAR. In one embodiment, the TAA-specific T cell expresses a transgenic TCR.

Таким образом, настоящее изобретение может использовать Т-клетку, сконструированную для экспрессии TAA-специфического CAR или TCR.Thus, the present invention can use a T cell engineered to express a TAA-specific CAR or TCR.

В одном варианте осуществления цитокин представляет собой интерферон (IFN), IL-12 или гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF).In one embodiment, the cytokine is interferon (IFN), IL-12, or granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF).

В одном варианте осуществления цитокин представляет собой интерферон (IFN). Предпочтительно, цитокин представляет собой интерферон типа I или интерферон типа II.In one embodiment, the cytokine is interferon (IFN). Preferably, the cytokine is a type I interferon or a type II interferon.

В предпочтительном варианте осуществления цитокин представляет собой IFNa.In a preferred embodiment, the cytokine is IFNa.

В другом предпочтительном варианте осуществления цитокин представляет собой интерферонгамма (IFNy).In another preferred embodiment, the cytokine is interferon gamma (IFNy).

В одном варианте осуществления интерферон типа I представляет собой интерферон-альфа (IFNa) или интерферон-бета (IFNe).In one embodiment, the type I interferon is interferon alpha (IFNa) or interferon beta (IFNe).

В одном варианте осуществления интерферон типа I представляет собой IFNa.In one embodiment, the type I interferon is IFNa.

В одном варианте осуществления интерферон типа I представляет собой IFNe.In one embodiment, the type I interferon is IFNe.

В одном варианте осуществления интерферон типа II представляет собой интерферон-гамма (IFNy).In one embodiment, the type II interferon is interferon gamma (IFNy).

В одном варианте осуществления HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клеткапредшественник, макрофаг, моноцит или вектор по настоящему изобретению предназначены для применения для предотвращения рецидива злокачественного новообразования у пациента.In one embodiment, the HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, monocyte, or vector of the present invention is for use in preventing the recurrence of a cancer in a patient.

В одном варианте осуществления HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клеткапредшественник, макрофаг, моноцит или вектор по настоящему изобретению предназначены для применения в профилактике прогрессирования злокачественного новообразования у пациента.In one embodiment, the HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, monocyte, or vector of the present invention is for use in preventing the progression of a cancer in a patient.

В одном варианте осуществления TAA выбран из одного из следующих: карциноэмбриональный антиген (СЕА), рецептор эстрогена, рецептор прогестерона, ephrinB2, ROR1, мезотелин, c-Met, GD-2 и MAGE A3 TCR, 4-1BB, антиген аденокарциномы, альфа-фетопротеин BAFF, клетка В-лимфомы, антиген С242, карбоангидраза 9 (CA-IX), CCR4, CD152, CD200, CD22, CD19, CD22, CD123, CD221, CD23 (рецептор IgE), CD28, CD4, CD40, CD44, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CS-1, CNT0888, CTLA-4, DR5, EpCAM, CD3, дополнительный домен фибронектина-В, рецептор фолата 1, гликопротеин 75, GPNMB, HGF, рецептор-киназы фактор роста гепатоцитов человека, рецептор IGF-1, IGF-1, IgG1, L1-CAM, IL-13, IL-6, рецептор инсулиноподобного фактора роста I, интегрин α5β1, интегрин ανβ3, MORAb-009, MS4A1, муцин CanAg, N-гликолилнейраминовая кислота, NPC-1C, PDGF-Ra, PDL192, фосфатидилсерин, клетки карциномы предстательной железы, RANKL, RON, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, тенасцин С, TGF бета 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, опухолевый антиген CTAA16.88, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, виментин, 5Т4, CD5, CD19, CD20, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD45, САМРАТН-1 (CDw52), HLA-DR, антиидиотип, TAG-72, EpCAM, MUC1, фолат-связывающий белок, А33, G250, простатический специфический мембранный антиген, (PSMA), простатический специфический антиген (PSA), ферритин, ганглиозиды (например, GD2, GD3, GM2), Ley, CA-125, СА19-9, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), p185HER2, рецептор IL-2, de2-7 EGFR, белок активации фибробластов (FAP), тенасцин, металлопротеиназы, эндосиалин, карбоангидраза, галектин 9, альдолаза A, eIFy4, тирозиназа, галектин 4, HERKV-K10, р53, NY-LU-12, рестин, NY-CO-38, MaGE-1, MAGE4a, SSX2, NY-ESO-1, SCP-1, 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, Ь-катенин/m, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27m, CDK4/m, CT, Cyp-B, DAM-6 (MAGE-B2) и DAM-10 (MAGE-B1), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT (hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A, MC1R, миозин/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NY-ESO-1, P15, p190 минорный bcr-abl, Pml/RARa, PRAME, RAGE, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, белок 1, gp75, TRP-2, TRP-2/INT2 или WT1.In one embodiment, the TAA is selected from one of the following: carcinoembryonic antigen (CEA), estrogen receptor, progesterone receptor, ephrinB2, ROR1, mesothelin, c-Met, GD-2 and MAGE A3 TCR, 4-1BB, adenocarcinoma antigen, alpha BAFF fetoprotein, B lymphoma cell, C242 antigen, carbonic anhydrase 9 (CA-IX), CCR4, CD152, CD200, CD22, CD19, CD22, CD123, CD221, CD23 (IgE receptor), CD28, CD4, CD40, CD44, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CS-1, CNT0888, CTLA-4, DR5, EpCAM, CD3, fibronectin-B accessory domain, folate receptor 1, glycoprotein 75, GPNMB, HGF, growth factor receptor kinase human hepatocytes, IGF-1 receptor, IGF-1, IgG1, L1-CAM, IL-13, IL-6, insulin-like growth factor I receptor, α5β1 integrin, ανβ3 integrin, MORAb-009, MS4A1, CanAg mucin, N-glycolylneuramine acid, NPC-1C, PDGF-Ra, PDL192, phosphatidylserine, prostate carcinoma cells, RANKL, RON, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, tenascin C, TGF beta 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, tumor antigen CTAA16.88, vascular endothelial growth factor (VEGF), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, vimentin, 5T4, CD5, CD19, CD20, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD45, CAMPATH-1 (CDw52 ), HLA-DR, antiidiotype, TAG-72, EpCAM, MUC1, folate binding protein, A33, G250, prostate specific membrane antigen (PSMA), prostate specific antigen (PSA), ferritin, gangliosides (e.g. GD2, GD3 , GM2), Ley, CA-125, CA19-9, epidermal growth factor receptor (EGFR), p185HER2, IL-2 receptor, de2-7 EGFR, fibroblast activation protein (FAP), tenascin, metalloproteinases, endosialin, carbonic anhydrase, galectin 9, aldolase A, eIFy4, tyrosinase, galectin 4, HERKV-K10, p53, NY-LU-12, restin, NY-CO-38, MaGE-1, MAGE4a, SSX2, NY-ESO-1, SCP-1, 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, b-catenin/m, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27m, CDK4/m, CT, Cyp-B, DAM-6 (MAGE- B2) and DAM-10 (MAGE-B1), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70- 2M, HST-2, hTERT (hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A, MC1R, myosin/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3 , NA88-A, NY-ESO-1, P15, p190 minor bcr-abl, Pml/RARa, PRAME, RAGE, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1 , protein 1, gp75, TRP-2, TRP-2/INT2, or WT1.

В одном варианте осуществления TAA представляет собой CD19.In one embodiment, the TAA is CD19.

В предпочтительном варианте осуществления TAA-специфическая Т-клетка экспрессирует CD19специфический CAR.In a preferred embodiment, the TAA-specific T cell expresses a CD19-specific CAR.

В одном варианте осуществления TAA-специфическая Т-клетка получена из клетки, взятой от пациента.In one embodiment, the TAA-specific T cell is derived from a cell taken from a patient.

- 11 046120- 11 046120

В одном варианте осуществления TAA-специфическая Т-клетка была разработана для разрушения по меньшей мере одного эндогенного гена, предпочтительно, где по меньшей мере один эндогенный ген выбран из эндогенного гена, кодирующего α-цепь TCR, β-цепь TCR и главный комплекс гистосовместимости (МНС).In one embodiment, the TAA-specific T cell has been designed to disrupt at least one endogenous gene, preferably wherein the at least one endogenous gene is selected from an endogenous gene encoding a TCR α chain, a TCR β chain, and a major histocompatibility complex ( MNS).

В одном варианте осуществления ингибитор контрольных точек иммунитета представляет собой антитело, предпочтительно, где антитело ингибитор контрольных точек иммунитета выбрано из группы, состоящей из антитела против CTLA4, антитела против PD1, антитела против PDL1, антитела против PDL2 и антитела против LAG-3.In one embodiment, the immune checkpoint inhibitor is an antibody, preferably wherein the immune checkpoint inhibitor antibody is selected from the group consisting of an anti-CTLA4 antibody, an anti-PD1 antibody, an anti-PDL1 antibody, an anti-PDL2 antibody, and an anti-LAG-3 antibody.

В одном варианте осуществления вектор содержит по меньшей мере одну последовательностьмишень mir-130a и по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-126, предпочтительно, вектор содержит две последовательности-мишени mir-130a и две последовательности-мишени mir-126.In one embodiment, the vector contains at least one mir-130a target sequence and at least one mir-126 target sequence, preferably the vector contains two mir-130a target sequences and two mir-126 target sequences.

В одном варианте осуществления HSC, HPC, миелоид/моноцит-коммитированная клеткапредшественник, макрофаг или моноцит, используемые в настоящем изобретении, содержат по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-126, предпочтительно, HSC, HPC, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит, используемые в настоящем изобретении, содержат две последовательности-мишени mir-130а и две последовательности-мишени mir-126.In one embodiment, the HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, or monocyte used in the present invention comprises at least one mir-130a target sequence and at least one mir-126 target sequence, preferably HSC The HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte used in the present invention contain two mir-130a target sequences and two mir-126 target sequences.

Вектор или полинуклеотид могут дополнительно содержать тканеспецифичный промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, например, интерферон типа 1. Предпочтительным тканеспецифичным промотором является промотор ТЕК (Tie2).The vector or polynucleotide may further comprise a tissue-specific promoter operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine, such as type 1 interferon. A preferred tissue-specific promoter is the TEK promoter (Tie2).

В одном варианте осуществления изобретения злокачественное новообразование представляет собой гематологическое злокачественное образование или солидную опухоль, предпочтительно, где гематологическое злокачественное новообразование выбрано из группы, состоящей из острого миелоидного лейкоза (AML), лимф областного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза (ALL), миелодиспластических синдромов (MDS), миелопролиферативных новообразований (MPN), первичного миелофиброза, эссенциальной тромбоцитемии, истинной полицитемии, атипичного хронического миелоидного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза (CML), лимфомы, множественной миеломы, неходжкинской лимфомы и лимфомы Ходжкина; или, предпочтительно, где солидная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака легких, рака молочной железы, рака пищевода, рака желудка, рака толстой кишки, холангиокарциномы, рака поджелудочной железы, рака яичника, рака головы и шеи, синовиальной саркомы, ангиосаркомы, остеосаркомы, рака щитовидной железы, рака эндометрия, нейробластомы, рабдомиосаркомы, рака печени, меланомы, рака предстательной железы, рака почки, саркомы мягких тканей, рака уротелия, рака желчных путей, глиобластомы, рака шейки матки и колоректального рака.In one embodiment of the invention, the malignancy is a hematologic malignancy or solid tumor, preferably wherein the hematologic malignancy is selected from the group consisting of acute myeloid leukemia (AML), lymphoblastic leukemia, acute lymphoblastic leukemia (ALL), myelodysplastic syndromes (MDS) ), myeloproliferative neoplasms (MPN), primary myelofibrosis, essential thrombocythemia, polycythemia vera, atypical chronic myeloid leukemia, chronic myeloid leukemia (CML), lymphoma, multiple myeloma, non-Hodgkin's lymphoma and Hodgkin's lymphoma; or, preferably, wherein the solid tumor is selected from the group consisting of lung cancer, breast cancer, esophageal cancer, gastric cancer, colon cancer, cholangiocarcinoma, pancreatic cancer, ovarian cancer, head and neck cancer, synovial sarcoma, angiosarcoma, osteosarcoma , thyroid cancer, endometrial cancer, neuroblastoma, rhabdomyosarcoma, liver cancer, melanoma, prostate cancer, kidney cancer, soft tissue sarcoma, urothelial cancer, biliary tract cancer, glioblastoma, cervical cancer and colorectal cancer.

В одном варианте осуществления злокачественное новообразование представляет собой метастазирование из первичной опухоли.In one embodiment, the malignancy is metastasis from a primary tumor.

В одном варианте осуществления клетка, используемая в настоящем изобретении, представляет собой HSC, содержащую вектор или полинуклеотид, где вектор или полинуклеотид содержит, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, например, интерферон типа 1.In one embodiment, the cell used in the present invention is an HSC containing a vector or polynucleotide, wherein the vector or polynucleotide contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to the nucleotide sequence, encoding a cytokine, such as type 1 interferon.

В одном варианте осуществления клетка, используемая в настоящем изобретении, представляет собой НРС, содержащую вектор или полинуклеотид, где вектор или полинуклеотид содержит, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, например, интерферон типа 1.In one embodiment, the cell used in the present invention is an HPC containing a vector or polynucleotide, where the vector or polynucleotide contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to the nucleotide sequence, encoding a cytokine, such as type 1 interferon.

В одном варианте осуществления клетка, используемая в настоящем изобретении, представляет собой миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, содержащую вектор или полинуклеотид, где вектор или полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir130a и/или mir-126, функционально связанную нуклеотидной последовательности, кодирующей цитокин, например, интерферон типа 1.In one embodiment, the cell used in the present invention is a myeloid/monocyte-committed progenitor cell containing a vector or polynucleotide, wherein the vector or polynucleotide contains at least one mir130a and/or mir-126 target sequence operably linked by a nucleotide sequence encoding a cytokine, such as type 1 interferon.

В одном варианте осуществления клетка, используемая в настоящем изобретении, представляет собой макрофаг, содержащий вектор или полинуклеотид, где вектор или полинуклеотид содержит, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, например, интерферон типа 1.In one embodiment, the cell used in the present invention is a macrophage containing a vector or polynucleotide, where the vector or polynucleotide contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to the nucleotide sequence, encoding a cytokine, such as type 1 interferon.

В одном варианте осуществления клетка, используемая в настоящем изобретении, представляет собой моноцит, содержащий вектор или полинуклеотид, где вектор или полинуклеотид содержит, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, например, интерферон типа 1.In one embodiment, the cell used in the present invention is a monocyte containing a vector or polynucleotide, where the vector or polynucleotide contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to the nucleotide sequence, encoding a cytokine, such as type 1 interferon.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены гемопоэтическая стволовая клетка (HSC), гематопоэтическая клетка-предшественник (НРС), миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, содержащий по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый цитокин, и вектор, содержащий по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательно- 12 046120 стью, кодирующей второй цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где первый и второй цитокины являются различными.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a hematopoietic stem cell (HSC), hematopoietic progenitor cell (HPC), myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a vector containing at least one mir-130a target sequence and/or mir-126, operably linked to the nucleotide sequence encoding the first cytokine, and a vector containing at least one target sequence mir-130a and/or mir-126, operably linked to the nucleotide sequence encoding the second a cytokine for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein the first and second cytokines are different.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена популяция гемопоэтических стволовых клеток (HSC), гемопоэтических клеток-предшественников (НРС), миелоид/моноциткоммитированных клеток-предшественников, макрофагов или моноцитов, популяция, трансдуцированная вектором, содержащим по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый цитокин, и вектором, содержащим по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй цитокин для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где первый и второй цитокины являются различными.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a population of hematopoietic stem cells (HSC), hematopoietic progenitor cells (HPC), myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages or monocytes, a population transduced with a vector containing at least one target sequence mir- 130a and/or mir-126 operably linked to a nucleotide sequence encoding a first cytokine, and a vector containing at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a second cytokine for use in the treatment or prevention of malignancy in a patient, where the first and second cytokines are different.

В одном варианте осуществления первый цитокин кодируется на первом векторе, а второй цитокин кодируется на втором векторе. В одном варианте осуществления первый и второй цитокины кодируются на одном и том же векторе.In one embodiment, the first cytokine is encoded on the first vector, and the second cytokine is encoded on the second vector. In one embodiment, the first and second cytokines are encoded on the same vector.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена комбинация полинуклеотида, содержащего, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый цитокин, и полинуклеотида, содержащего, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где первый и второй цитокины являются различными.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a combination of a polynucleotide containing at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a first cytokine, and a polynucleotide containing at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a second cytokine, for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein the first and second cytokines are different.

В одном варианте осуществления первый цитокин кодируется на первом полинуклеотиде, а второй цитокин кодируется на втором полинуклеотиде. В одном варианте осуществления первый и второй цитокины кодируются на одном и том же полинуклеотиде. Полинуклеотиды могут быть, например, в форме вектора.In one embodiment, the first cytokine is encoded on the first polynucleotide and the second cytokine is encoded on the second polynucleotide. In one embodiment, the first and second cytokines are encoded on the same polynucleotide. The polynucleotides may, for example, be in vector form.

В одном варианте осуществления первый и второй цитокины, каждый, независимо, выбраны из интерферона (IFN) или фактора некроза опухоли альфа (TNFa),In one embodiment, the first and second cytokines are each independently selected from interferon (IFN) or tumor necrosis factor alpha (TNFa),

В одном варианте осуществления первый и второй цитокины, каждый, независимо, выбраны из группы, состоящей из IFN типа I (предпочтительно IFNa или IFNe), IFN типа II (предпочтительно IFNy) и TNFa.In one embodiment, the first and second cytokines are each independently selected from the group consisting of type I IFN (preferably IFNa or IFNe), type II IFN (preferably IFNy) and TNFa.

В одном варианте осуществления первый и второй цитокины, каждый, независимо, выбраны из группы, состоящей из IFNa, IFNe, IFNy и TNFa.In one embodiment, the first and second cytokines are each independently selected from the group consisting of IFNa, IFNe, IFNy, and TNFa.

В одном варианте осуществления первый цитокин представляет собой IFNa, а второй цитокин представляет собой IFNy.In one embodiment, the first cytokine is IFNa and the second cytokine is IFNy.

В одном варианте осуществления первый цитокин представляет собой IFNa, а второй цитокин представляет собой TNFa.In one embodiment, the first cytokine is IFNa and the second cytokine is TNFa.

В предпочтительном варианте осуществления первый цитокин представляет собой IFNy, а второй цитокин представляет собой TNFa.In a preferred embodiment, the first cytokine is IFNy and the second cytokine is TNFa.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены гемопоэтическая стволовая клетка (HSC), гемопоэтическая клетка-предшественник (HPC), миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащие вектор, где вектор содержит в по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где цитокин представляет собой интерферон (IFN) или фактор альфа некроза опухоли (TNFa).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a hematopoietic stem cell (HSC), hematopoietic progenitor cell (HPC), myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a vector, where the vector contains at least one sequence - a mir-130a and/or mir-126 target operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein the cytokine is interferon (IFN) or tumor necrosis factor alpha (TNFa).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен вектор, содержащий по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где цитокин представляет собой интерферон (IFN) или фактор некроза опухоли альфа (TNFa).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a vector comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein the cytokine is interferon (IFN) or tumor necrosis factor alpha (TNFa).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен полинуклеотид, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность-мишень mir-130а и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, для применения при лечении или профилактике злокачественного новообразования у пациента, где цитокин представляет собой интерферон (IFN) или фактор некроза опухоли альфа (TNFa).In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a polynucleotide comprising at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine, for use in the treatment or prevention of cancer in a patient, wherein the cytokine is interferon (IFN) or tumor necrosis factor alpha (TNFa).

В одном варианте осуществления IFN представляет собой IFN типа II (предпочтительно, IFNy) или IFN типа I (предпочтительно, IFNa или IFNe)In one embodiment, the IFN is a type II IFN (preferably IFNy) or a type I IFN (preferably IFNa or IFNe)

В одном варианте осуществления цитокин представляет собой IFNy. В одном варианте осуществления цитокин представляет собой IFNa. В одном варианте осуществления цитокин представляет собой IFNe.In one embodiment, the cytokine is IFNy. In one embodiment, the cytokine is IFNa. In one embodiment, the cytokine is IFNe.

- 13 046120- 13 046120

Описание чертежейDescription of drawings

Фиг. 1. Ингибирование роста OVA-ALL у IFN мышей путем индукции OVA-специфических CD8+ Т-клеток.Fig. 1. Inhibition of OVA-ALL growth in IFN mice by induction of OVA-specific CD8+ T cells.

а - Схематическое представление лентивирусных векторов (LV), используемых для конструирования HSC, и генерирования спонтанного B-ALL. b - Экспериментальная разработка. с - Конкретные количества (среднее±SEM) исходного ALL в периферической крови (РВ) за время CTRL (n=10, обработка антителом изотипического контроля), IFN ((n=10, обработка антителом изотипического контроля), CTRL+aCTLA4 (n=14) и IFN+aCTLA4 (n=13) мыши. Каждая точка представляет одну мышь. *р<0,05, **р<0,01, ****р<0,0001, непараметрический ранговый метод для лонгитудинальных данных в факторных экспериментах. d, e, f - Конкретные количества (среднее±SEM) OVA-ALL (спроектировано с помощью двунаправленного LV NGFR/OVA, показанного вверху) в РВ за время (d), а также в ВМ и селезенке (е, f; 14 дней после инъекции опухоли) IFN мышей (n=15) и CTRL (n=15) (показан один из 9 экспериментов). Каждая точка представляет одну мышь. ****р<0,0001, непараметрический ранговый метод для лонгитудинальных данных в факторных экспериментах (d); *р<0,05, **р<0,01, тест Манн-Уитни (е, f). g - CD8+ Т-клетки селезенки IFN мышей, через 13 дней после инъекции опухоли или от не несущих опухоли CTRL (наивные C57Bl/6, n=1) мышей, протестированных IFNg-ELISPOT против линии клеток-мишеней EL4, трансдуцированной NGFR-OVA или NGFR-CD20 BdLV. Каждая точка представляет одну мышь, среднее±SEM. Низкая опухолевая нагрузка (n=5): 5,2±4,9 (среднее±SEM)% OVA-ALL; средняя опухолевая нагрузка (n=1): 33% OVA-ALL; высокая опухолевая нагрузка (n=6): 51±4,9% OVA-ALL. h - Процентное содержание (среднее±SEM) OVA-специфических Т-клеток у PB IFN мышей (n=14-6) и CTRL (n=158). **р<0,01, тест Манн-Уитни выполнялся через 9 дней после инъекции OVA-ALL. Каждая точка представляет одну мышь. Т-клетки от трансгенных мышей OT-I используют в качестве положительного контроля (не показано). i, j - Конкретное число (среднее±SEM) OVA-специфических Т-клеток в ВМ (i) и селезенке (j), через 9 дней после инъекции опухоли, у IFN (n=23) и CTRL (n=26) мышей из 3 независимых экспериментов. **р<0,01, ***р<0,001, тест Манн-Уитни. Каждая точка представляет одну мышь. k CD8+Т-клеткu селезенки от IFN (n=7) и CTRL (n=8) мышей через 9 дней после инъекции опухоли или от мышей, не имеющих опухоли, испытанных, как в (g). Стимуляция конканавалином А (ConA) и Тклетками OT-I мышей (не показаны) используются в качестве положительных контролей. Каждая точка представляет одну мышь. l, m - Процентное содержание (1) и конкретное количество (m) (среднее±SEM) OVA-ALL в PB IFN (n=9), ОЭ8-истощенных IFN (n=7) и CTRL (n=9) мышей. **р<0,01, ****р<0,0001, непараметрический ранговый метод для лонгитудинальных данных в факторных экспериментах (1); *р<0,05, ****р<0,0001, критерий Крускала-Уоллиса с откорректированным значением p по критерию Данна (m).a - Schematic representation of lentiviral vectors (LVs) used to construct HSCs and generate spontaneous B-ALL. b - Experimental development. c - Specific amounts (mean±SEM) of initial ALL in peripheral blood (PB) during CTRL (n=10, isotype control antibody treatment), IFN ((n=10, isotype control antibody treatment), CTRL+aCTLA4 (n= 14) and IFN+aCTLA4 (n=13) mice. Each point represents one mouse. *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001, non-parametric rank method for longitudinal data in factorial experiments d, e, f - Specific amounts (mean ± SEM) of OVA-ALL (projected with the bidirectional LV NGFR/OVA shown at top) in the PB over time (d), and in the VM and spleen (e, f; 14 days after tumor injection) IFN mice (n=15) and CTRL (n=15) (one of 9 experiments shown). Each point represents one mouse. ****p<0.0001, non-parametric rank method for longitudinal data in factorial experiments (d); *p<0.05, **p<0.01, Mann-Whitney test (e, f). g - CD8 + T cells of the spleen of IFN mice, 13 days after injection tumors or from tumor-free CTRL (naïve C57Bl/6, n=1) mice tested with IFNg-ELISPOT against the target cell line EL4 transduced with NGFR-OVA or NGFR-CD20 BdLV. Each point represents one mouse, mean±SEM. Low tumor burden (n=5): 5.2±4.9 (mean±SEM)% OVA-ALL; average tumor burden (n=1): 33% OVA-ALL; high tumor burden (n=6): 51±4.9% OVA-ALL. h - Percentage (mean±SEM) of OVA-specific T cells in PB IFN mice (n=14-6) and CTRL (n=158). **p<0.01, Mann-Whitney test performed 9 days after OVA-ALL injection. Each dot represents one mouse. T cells from OT-I transgenic mice were used as positive controls (not shown). i, j - Specific number (mean±SEM) of OVA-specific T cells in VM (i) and spleen (j), 9 days after tumor injection, in IFN (n=23) and CTRL (n=26) mice from 3 independent experiments. **p<0.01, ***p<0.001, Mann-Whitney test. Each dot represents one mouse. k Splenic CD8 + T cells from IFN (n=7) and CTRL (n=8) mice 9 days after tumor injection or from tumor-free mice tested as in (g). Stimulation with concanavalin A (ConA) and mouse OT-I T cells (not shown) are used as positive controls. Each dot represents one mouse. l, m - Percentage (1) and specific amount (m) (mean±SEM) of OVA-ALL in PB IFN (n=9), OE8-IFN-depleted (n=7) and CTRL (n=9) mice. **p<0.01, ****p<0.0001, non-parametric rank method for longitudinal data in factorial experiments (1); *p<0.05, ****p<0.0001, Kruskal-Wallis test with adjusted p value by Dunn's test (m).

Фиг. 2. Адоптивно перенесенные OT-I Т-клетки распространяются и содержат OVA-ALL у IFN мышей.Fig. 2. Adoptively transferred OT-I T cells expand and contain OVA-ALL in IFN mice.

а, b - Схема эксперимента (а) и рост OVA-ALL за время (b, процентное содержание в РВ; среднее±SEM) у IFN (n=7) или CTRL (n=7) мышей. с - Конкретное число (среднее±SEM) OTI Т-клеток в ВМ и селезенке IFN (n=7), CTRL (n=7) мышей и мышей без опухолей (C57Bl/6 без опухолей, n=3) 3 дня после OT-I адоптивного переноса. *р<0,05, **р<0,01, тест Манн-Уитни. Каждая точка представляет одну мышь. d - Процентное содержание (среднее±SEM) наивных (CD44-CD62L+), центральной памяти (CD44+CD62L+) и эффекторной памяти (CD44+CD62L-) клеток в OT-I Т-клетках в ВМ и селезенке мышей за (с) 3 дня после адоптивного переноса. **р<0,01, непараметрический комбинированный тест. е, f Схема эксперимента (е) и кривая выживания (f) мышей CTRL (n=12), инъецированных OVA-ALL, IFN+OT-I (n=9) и мышей CTRL+OT-I (n=10), *р<0,05, ****р<0,0001 критерий Мантеля-Хензеля, скорректированное значение p по критерию Бонферрони. g - Конкретное число (среднее±SEM) адоптивно перенесенных ОТ-I Т-клеток в РВ в течение времени у CTRL+Ot-I и IFN+OT-I мышей из (f) и C57Bl/6 мышей, не имеющих опухоли (n=3). Длительно выжившие мыши показаны зеленым цветом. Каждая линия представляет одну мышь. h - Процентное содержание (среднее±SEM) экспрессии Lag3 на OT-I Тклетках в РВ мышей из (f, g). Каждая точка представляет одну мышь.a, b - Experimental scheme (a) and growth of OVA-ALL over time (b, percentage in PB; mean±SEM) in IFN (n=7) or CTRL (n=7) mice. c - Specific number (mean±SEM) of OTI T cells in the BM and spleen of IFN (n=7), CTRL (n=7) mice and mice without tumors (C57Bl/6 without tumors, n=3) 3 days after OT -I adoptive transfer. *p<0.05, **p<0.01, Mann-Whitney test. Each dot represents one mouse. d - Percentage (mean±SEM) of naive (CD44-CD62L+), central memory (CD44+CD62L+) and effector memory (CD44+CD62L-) cells in OT-I T cells in the VM and spleen of mice for (s) 3 days after the adoptive transfer. **p<0.01, nonparametric combined test. e, f Experimental design (e) and survival curve (f) of CTRL mice (n=12) injected with OVA-ALL, IFN+OT-I (n=9) and CTRL+OT-I mice (n=10), *p<0.05, ****p<0.0001 Mantel-Haenszel test, adjusted p value by Bonferroni test. g - Specific number (mean±SEM) of adoptively transferred OT-I T cells into the PB over time in CTRL+Ot-I and IFN+OT-I mice from (f) and C57Bl/6 tumor-free mice (n =3). Long-term surviving mice are shown in green. Each line represents one mouse. h - Percentage (mean ± SEM) of Lag3 expression on OT-I T cells in mouse PB from (f, g). Each dot represents one mouse.

Фиг. 3. ISG/Th1-примированная генная сигнатура и увеличенные классические моноциты и М1смещение у IFN мышей.Fig. 3. ISG/Th1-primed gene signature and increased classical monocytes and M1 shift in IFN mice.

a - График рассеяния для большого массива данных показывает изменения в экспрессии панели иммунных генов злокачественного новообразования в ВМ и селезенке IFN и CTRL мышей до и после заражения OVA-ALL. Горизонтальные пунктирные линии показывают порог значимости (FDR<0,05). Вертикальные пунктирные линии указывают на гены с 2-кратной повышенной/пониженной экспрессией по отношению к CTRL мышам. ISG показаны оранжевым цветом, гены активации Th1 и Т-клеток светлосиним цветом, гены, общие для ответов IFN и Th1 зеленым цветом, гены активации макрофагов и DC красным цветом, гены активации NK-клеток фиолетовым цветом, гены процессинга антигенов синим цветом, гены, связанные с лейкемией, серым. Управляемые вставки показаны увеличенными справа. n=3 мышам для каждого образца, за исключением CTRL BM+ALL, n=2. b - Анализ экспрессии с помощью RT-qPCR указанных генов Th1 (среднее изменение кратности по сравнению с OVA-ALLa - Scatter plot for a large data set shows changes in the expression of a panel of malignancy immune genes in the BM and spleen of IFN and CTRL mice before and after infection with OVA-ALL. Horizontal dotted lines indicate the significance threshold (FDR<0.05). Vertical dotted lines indicate genes with 2-fold increased/decreased expression relative to CTRL mice. ISGs are shown in orange, Th1 and T cell activation genes in light blue, genes common to IFN and Th1 responses in green, macrophage and DC activation genes in red, NK cell activation genes in purple, antigen processing genes in blue, genes associated with leukemia, grey. Controlled inserts are shown enlarged on the right. n=3 mice for each sample, except CTRL BM+ALL, n=2. b - RT-qPCR expression analysis of the indicated Th1 genes (average fold change compared to OVA-ALL

- 14 046120 инъецированными мышами CTRL±SEM) в CD4+ Т-клетках селезенки от OVA-ALL-инъецированных IFN (n=6) и CTRL (n=5) мышей через 9 дней после инъекции опухоли и от не содержащей опухоли C57Bl/6 мыши. Каждая точка представляет одну мышь. *р<0,05, Манн-Уитни. с - Процентное содержание (среднее±SEM) указанных миелоидных популяций в PB IFN (n=11) и CTRL (n=13) мышей до и после (12 дней) инъекции OVA-ALL. *р<0,05, **р<0,01, ***р<0,001, ****р<0,0001, Kruskall-Wallis, с откорректированным значением p по критерию Данна. Статистический анализ проводится в каждой отдельной популяции миелоидных клеток.- 14 046120 injected CTRL±SEM mice) in splenic CD4+ T cells from OVA-ALL IFN-injected (n=6) and CTRL (n=5) mice 9 days after tumor injection and from tumor-free C57Bl/6 mice . Each dot represents one mouse. *p<0.05, Mann-Whitney. c - Percentage (mean±SEM) of the indicated myeloid populations in PB IFN (n=11) and CTRL (n=13) mice before and after (12 days) OVA-ALL injection. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001, Kruskall-Wallis, with adjusted p value by Dunn's test. Statistical analysis is performed on each individual myeloid cell population.

Фиг. 4. Клеточная и генная терапия IFN вызывает длительные противоопухолевые реакции, а в сочетании с иммунной контрольной точкой дополнительно улучшает выживаемость.Fig. 4. IFN cell and gene therapy induces durable antitumor responses and, when combined with immune checkpoint therapy, further improves survival.

а, b, с, d - Кривые выживаемости IFN и CTRL мышей, которым инъецировали OVA-ALL, после первых (а; n=11,13; *р<0,05, критерий Мантеля-Хенселя) и последующих опухолевых проблем с указанными клетками ALL (b: n=3 длительно выживающие IFN мыши из (а) в сравнении с 4 наивными мышами. с - Те же 3 выжившие мыши из (а, b) в сравнении с 4 наивными мышами. d - 2 из 3 выживших мышей из (а, b, с) в сравнении с 4 наивными мышами. е - Экспериментальный дизайн. f, g - Кривые выживаемости OVA-ALL-инъецированных (f) IFN (n=14), CTRL (n=14), IFN+aCTLA4 (n=14) и CTRL+aCTLA4 (n=15) мышей, *р<0,05, ***р<0,001, критерий Мантеля-Хензеля, скорректированное значение p по методу Бонферрони; и (g) IFN+aCTLA4 (n=10) и CTRL+aCTLA4 (n=12) мышей, *р<0,05, тест MantelHaenszel. h - PBMC от выживших мышей из (f) (IFN n=3, CTRL n=1, IFN+aCTLA4 n=4, CTRL+aCTLA4 n=3) через 51 день после инъекции опухоли и от мышей без опухоли (OT-I, n=1 и трансплантированные CTRL мыши, n=2), испытанные с помощью IFNg-ELISPOT против линии клеток-мишеней EL4, трансдуцированной NGFR-OVA, или NGFR-CD20 BdLV, или PGK-OFP, или PGK-tTA LV. Пунктирная линия указывает на более высокий средний фоновый уровень, наблюдаемый в отношении клеток-мишеней EL4 NGFR. Каждая точка представляет собой одну мышь, протестированную по всем четырем TAA. i - Клональность и сходство репертуара CDR TCR-бета выживших мышей (каждая стрелка представляет собой мышь) от (f) до инъекции OVA-ALL (начало стрелки, ТО) и через 4 дня после второго повторного заражения опухолью (кончик стрелки, Т2). j - PBMC от мышей из (g) (выжившие IFN+aCTLA-4, закрашенные синие символы, n=3; выжившие CTRL+aCTLA-4, закрашенные красные символы, n=1; IFN+aCTLA4 не отвечающие, незакрашенные синие символы, n=7; CTRL+aCTLA-4, незакрашенный красный символ, n=8 из 12 контролей, не отвечающих на лечение), протестированные IFNg-ELISPOT, как в (h), через 19 дней после инъекции опухоли. Каждая точка представляет собой одну мышь, протестированную по всем четырем TAA. k - Кривая выживаемости мышей из (g), стратифицированных на основе их иммунной реактивности, как оценено анализом IFNg-ELISPOT, показанным в (j). Мыши, показанные красным, реагируют против 2 или более антигенов; мыши, показанные черным, реагируют против 1 или без антигенов. Следует отметить, что реактивность в отношении OVA и NGFR принимается за 1, поскольку их экспрессия совместно регулируется двунаправленным промотором, присутствующим в BdLV.a, b, c, d - IFN and CTRL survival curves of mice injected with OVA-ALL, after the first (a; n=11.13; *p<0.05, Mantel-Haenszel test) and subsequent tumor problems with the indicated ALL cells (b: n=3 long-term surviving IFN mice from (a) in comparison with 4 naive mice. c - The same 3 surviving mice from (a, b) in comparison with 4 naive mice. d - 2 out of 3 surviving mice from (a, b, c) compared with 4 naive mice e - Experimental design f, g - Survival curves of OVA-ALL-injected (f) IFN (n=14), CTRL (n=14), IFN+ aCTLA4 (n=14) and CTRL+aCTLA4 (n=15) mice, *p<0.05, ***p<0.001, Mantel-Haenszel test, Bonferroni adjusted p value; and (g) IFN+aCTLA4 (n=10) and CTRL+aCTLA4 (n=12) mice, *p<0.05, MantelHaenszel test h - PBMC from surviving mice from (f) (IFN n=3, CTRL n=1, IFN+aCTLA4 n=4, CTRL+aCTLA4 n=3) 51 days after tumor injection and from tumor-free mice (OT-I, n=1 and CTRL transplanted mice, n=2) tested with IFNg-ELISPOT against the cell line - EL4 targets transduced with NGFR-OVA, or NGFR-CD20 BdLV, or PGK-OFP, or PGK-tTA LV. The dashed line indicates the higher average background level observed for EL4 NGFR target cells. Each point represents one mouse tested on all four TAAs. i - Clonality and similarity of the TCR-beta CDR repertoire of surviving mice (each arrow represents a mouse) from (f) before OVA-ALL injection (arrowhead, TO) and 4 days after the second tumor reinfection (arrowhead, T2). j - PBMC from mice from (g) (IFN+aCTLA-4 survivors, filled blue symbols, n=3; CTRL+aCTLA-4 survivors, filled red symbols, n=1; IFN+aCTLA4 non-responders, open blue symbols, n=7; CTRL+aCTLA-4, open red symbol, n=8 of 12 non-responder controls) tested with IFNg-ELISPOT as in (h), 19 days after tumor injection. Each point represents one mouse tested on all four TAAs. k - Survival curve of mice from (g) stratified based on their immune reactivity as assessed by the IFNg-ELISPOT assay shown in (j). Mice shown in red react against 2 or more antigens; mice shown in black react against 1 or no antigens. It should be noted that reactivity toward OVA and NGFR is set to 1 because their expression is coregulated by a bidirectional promoter present in BdLV.

Фиг. 5. Сконструированный OVA-ALL показал повышенную иммуногенность по сравнению с исходным ALL.Fig. 5. The engineered OVA-ALL showed increased immunogenicity compared to the parent ALL.

а - Схематическое представление двунаправленного LV (BdLV), используемого для генерации OVA-ALL, с показательным графиком, показывающим экспрессию NGFR на очищенном OVA-ALL. b - Стратегия гейтирования, используемая для идентификации экспрессии B-ALL (CD19+OFP+) и NGFR на ALL в РВ мышей, которым инъецировали опухоль. с - Вверху: процентное содержание (среднее±SEM) OVA-ALL в РВ иммунокомпетентных C57Bl/6 (n=5) и иммунодефицитных NSG (n=6) мышей и исходного ALL в РВ иммуно-компетентных C57Bl/6 (n=5) мышей. Внизу: экспрессия маркера NGFR на ALL, присутствующем в РВ иммунокомпетентных C57Bl/6 (n=5) и иммунодефицитных NSG (n=6) мышей. Следует отметить, что экспрессия антигенов NGFR и OVA совместно регулируется двунаправленным промотором, присутствующим в BdLV. d, e - Процентное содержание (среднее±SEM) OVA-ALL и экспрессия маркера NGFR на лейкозных клетках, присутствующих в ВМ иммунокомпетентного C57Bl/6 (n=6) (d) и иммунодефицитного NSG (n=6) мыши (е) в процессе умерщвление подопытного животного.a Schematic representation of the bidirectional LV (BdLV) used to generate OVA-ALL, with a representative plot showing NGFR expression on purified OVA-ALL. b - Gating strategy used to identify B-ALL (CD19+OFP+) and NGFR expression on ALL in the PB of tumor-injected mice. c - Top: percentage (mean±SEM) of OVA-ALL in the PB of immunocompetent C57Bl/6 (n=5) and immunodeficient NSG (n=6) mice and parental ALL in the PB of immunocompetent C57Bl/6 (n=5) mice. Bottom: NGFR marker expression on ALL present in the PB of immunocompetent C57Bl/6 (n=5) and immunodeficient NSG (n=6) mice. It should be noted that the expression of NGFR and OVA antigens is jointly regulated by a bidirectional promoter present in BdLV. d, e - Percentage (mean±SEM) of OVA-ALL and expression of the NGFR marker on leukemic cells present in the VM of immunocompetent C57Bl/6 (n=6) (d) and immunodeficient NSG (n=6) mice (e) in the process of killing an experimental animal.

Фиг. 6. Ингибирование роста OVA-ALL у IFN мышей и индукция OVA-специфических Т-клеток.Fig. 6. Inhibition of OVA-ALL growth in IFN mice and induction of OVA-specific T cells.

а - Стратегия гейтирования, используемая для идентификации OVA-специфических CD8+ Т-клеток. b, с, d - Процентное содержание (b) и конкретное число (с, d) (среднее±SEM) OVA-ALL в РВ (b) и в ВМ и селезенке (с, d) IFN (n=14-6) и CTRL (n=15-8) мышей через 9 дней после введения опухоли. ***р<0,001, Манн-Уитни. Каждая точка представляет одну мышь. е - Процентное содержание OVA-ALL у PB IFN (n=9), CD8-истощенных IFN (n=7) и CTRL (n=9) мышей через 9 дней после заражения опухолью. Каждая точка представляет одну мышь. *р<0,05, ***р<0,001, Крускал-Уоллис с откорректированным значением p по критерию Данна.a - Gating strategy used to identify OVA-specific CD8 + T cells. b, c, d - Percentage (b) and specific number (c, d) (mean±SEM) OVA-ALL in the PB (b) and in the VM and spleen (c, d) IFN (n=14-6) and CTRL (n=15-8) mice 9 days after tumor injection. ***p<0.001, Mann-Whitney. Each dot represents one mouse. f - Percentage of OVA-ALL in PB IFN (n=9), CD8 IFN-depleted (n=7) and CTRL (n=9) mice 9 days after tumor challenge. Each dot represents one mouse. *p<0.05, ***p<0.001, Kruskal-Wallis with adjusted p value by Dunn's test.

Фиг. 7. Стратегия гейтирования использовалась для оценки апоптоза OVA-ALL, клеточного цикла и скорости пролиферации.Fig. 7. A gating strategy was used to evaluate OVA-ALL apoptosis, cell cycle, and proliferation rate.

а, b - Стратегия гейтирования (а) и анализ (b) (процент, среднее±SEM) раннего апоптоза (аннексин+7-AAD-), позднего апоптоза (аннексин+7-ADD+), мертвых/некротических (аннексин-7AAD+) и живых (аннексин-7-AAD-) клеток OVA-ALL, присутствующих в ВМ и селезенке IFN (n=11) и CTRL (n=15)a, b - Gating strategy (a) and analysis (b) (percentage, mean±SEM) of early apoptosis (annexin+7-AAD - ), late apoptosis (annexin+7-ADD + ), dead/necrotic (annexin-7AAD + ) and live (annexin-7-AAD - ) OVA-ALL cells present in the VM and spleen IFN (n=11) and CTRL (n=15)

- 15 046120 мышей через 9 дней после инъекции опухоли. *р<0,05, Манн-Уитни. с, d - стратегия гейтирования (с) и анализ (d: процентное содержание, среднее±SEM) распределения OVA-ALL в фазах GO (Ki67Hoechstlow), G1 (Ki67+Hoechstlow) и S-G2-M (Ki67+Hoechsthigh) клеточного цикла в ВМ и селезенке IFN (n=11) и CTRL (n=15) мышей через 9 дней после введения опухоли. е, f - Стратегия гейтирования (е) и анализ (f: процентное содержание, среднее±SEM) пролиферирующих клеток EdU+ALL, присутствующих в ВМ и селезенке IFN (n=11) и CTRL (n=15) мышей через 9 дней после инъекции опухоли. **р<0,01, Манн-Уитни.- 15 046120 mice 9 days after tumor injection. *p<0.05, Mann-Whitney. c, d - gating strategy (c) and analysis (d: percentage, mean ± SEM) of the distribution of OVA-ALL in the GO (Ki67Hoechst low ), G1 (Ki67+Hoechst low ) and S-G2-M (Ki67+Hoechst low) phases igh ) cell cycle in the BM and spleen of IFN (n=11) and CTRL (n=15) mice 9 days after tumor injection. e, f - Gating strategy (e) and analysis (f: percentage, mean±SEM) of proliferating EdU+ALL cells present in the VM and spleen of IFN (n=11) and CTRL (n=15) mice 9 days after tumor injections. **p<0.01, Mann-Whitney.

Фиг. 8. Адоптивный перенос Т-клеток OT-I у CTRL мышей, инъецированных OVA-ALL, IFN мышей и C57Bl/6 мышей, не имеющих опухолей.Fig. 8. Adoptive transfer of OT-I T cells into CTRL mice injected with OVA-ALL, IFN mice and tumor-free C57Bl/6 mice.

а - Конкретное число (среднее±SEM) OVA-ALL в РВ CTRL (n=7) и IFN (n=7) мышей в указанное время после адоптивного переноса OT-I. Каждая точка представляет одну мышь. b - Экспрессия Lag3 на OT-I Т-клетках в ВМ и селезенке IFN (n=7), CTRL (n=7) мышей и мышей без опухолей (C57Bl/6 без опухолей, n=3) через 3 дня после адоптивного переноса OT-I Т-клеток. Каждая точка представляет одну мышь. с - Стратегия гейтирования, используемая для идентификации адоптивно перенесенных OT-I Тклеток (CD45.2+) и экспрессии Lag3 на OT-I Т-клетках, присутствующих в ВМ и селезенке мышей из (а, b). Клетки OVA-ALL сначала исключаются путем гейтирования на OFP-CD8+ Т-клетках. Маркеры CD45.1 и CD45.2 используются для различения радиоустойчивых CD8+ Т-клеток реципиента (CD45.1+), донорных CD8+ Т-клеток (CD45.1.2+) и адоптивно переносимых OT-I Т-клеток (CD45.2+). У неопухолевых мышей адоптивно перенесенные OT-I Т-клетки определяются как CD8+ Т-клетки и отличаются от CD8+ реципиентных Т-клеток (CD45.1+) путем гейтирования CD45.2+CD8+ Т-клеток. d - Стратегия гейтирования, используемая для идентификации наивных (CD62L+CD44-), центральной памяти (CD62L+CD44+) и эффекторной памяти (CD62L-CD44+) клеток, адоптивно переносимых OT-I Т-клеток. OT-I Т-клетки идентифицируются как описано в (с, OVA-ALL сначала исключаются путем гейтирования на CD19-CD8+ Т-клетках). е, f - Конкретное число экспрессии маркера OVA-ALL (е) (среднее±SEM) и маркера NGFR (f) на ALL в ВМ и селезенке мышей, показанных на (а, b), через 3 дня после адоптивного переноса OT-I Т-клеток. Каждая точка представляет одну мышь. **р<0,01, ***р<0,001, Манн-Уитни (е).a - Specific number (mean±SEM) of OVA-ALL in the PB of CTRL (n=7) and IFN (n=7) mice at the indicated time after adoptive transfer of OT-I. Each dot represents one mouse. b - Lag3 expression on OT-I T cells in the BM and spleen of IFN (n=7), CTRL (n=7) mice and mice without tumors (C57Bl/6 without tumors, n=3) 3 days after adoptive transfer OT-I T cells. Each dot represents one mouse. c - Gating strategy used to identify adoptively transferred OT-I T cells (CD45.2+) and Lag3 expression on OT-I T cells present in the VM and spleen of mice from (a, b). OVA-ALL cells are first excluded by gating on OFP-CD8+ T cells. CD45.1 and CD45.2 markers are used to distinguish recipient radioresistant CD8+ T cells (CD45.1+), donor CD8+ T cells (CD45.1.2+) and adoptively transferred OT-I T cells (CD45.2+) . In non-tumor mice, adoptively transferred OT-I T cells are defined as CD8+ T cells and are distinguished from CD8+ recipient T cells (CD45.1+) by gating CD45.2+CD8+ T cells. d - Gating strategy used to identify naive (CD62L+CD44 - ), central memory (CD62L+CD44+) and effector memory (CD62L-CD44+) cells adoptively transferred OT-I T cells. OT-I T cells are identified as described in (c, OVA-ALL is first excluded by gating on CD19-CD8+ T cells). e, f - Specific expression number of OVA-ALL marker (e) (mean ± SEM) and NGFR marker (f) on ALL in the VM and spleen of mice shown in (a, b), 3 days after adoptive transfer of OT-I T cells. Each dot represents one mouse. **p<0.01, ***p<0.001, Mann-Whitney (f).

Фиг. 9. Адоптивно перенесенные ОТ-I T-клетки распространяются и содержат OVA-ALL у IFN мышей.Fig. 9. Adoptively transferred OT-I T cells expand and harbor OVA-ALL in IFN mice.

а, b, с, d - Процентное содержание (среднее±SEM) клеток ALL и экспрессия маркера NGFR на клетках ALL в РВ (а, b) и ВМ (с, d) IFN+OT-I (n=9, а, с) и CTRL+OT-I (n=10, b, d) мышей. Длительно выжившие мыши показаны зеленым цветом. Следует обратить внимание, что экспрессия NGFR не показана для выживших мышей, у которых лейкоз уничтожен. Каждая отдельная мышь представлена одной точкой (b, d) или линией (a, b). e, f - Процентное содержание (среднее±SEM) наивных (CD62L+CD44-), центральной памяти (CD62L+CD44+) и эффекторной памяти (CD62LCD44+) OT-I T-клеток в ВМ, селезенке и лимфатических узлах усыпленных мышей, несущих опухоль, из (а, b, с, d, CTRL+OT-I, n=8; IFN+OT-I, n=3). f - Процентное содержание (среднее±SEM) экспрессии PD1 на OT-I Т-клетках, присутствующих в ВМ, селезенке и лимфатических узлах мышей, показан в (е). Каждая точка представляет одну мышь.a, b, c, d - Percentage (mean±SEM) of ALL cells and expression of the NGFR marker on ALL cells in the PB (a, b) and VM (c, d) IFN+OT-I (n=9, a, c) and CTRL+OT-I (n=10, b, d) mice. Long-term surviving mice are shown in green. It should be noted that NGFR expression is not indicated for surviving mice in which leukemia has been eradicated. Each individual mouse is represented by a single dot (b, d) or line (a, b). e, f - Percentage (mean±SEM) of naive (CD62L+CD44 - ), central memory (CD62L+CD44+) and effector memory (CD62LCD44+) OT-I T cells in the VM, spleen and lymph nodes of euthanized tumor-bearing mice , from (a, b, c, d, CTRL+OT-I, n=8; IFN+OT-I, n=3). f - The percentage (mean ± SEM) of PD1 expression on OT-I T cells present in the VM, spleen and lymph nodes of mice is shown in (e). Each dot represents one mouse.

Фиг. 10. Анализ экспрессии генов прототипических генов Th2 и Treg в очищенных CD4+ Т-клетках селезенки.Fig. 10. Gene expression analysis of prototypical Th2 and Treg genes in purified splenic CD4+ T cells.

а - Анализ экспрессии с помощью RT-qPCR указанных генов Th2 и Treg (среднее кратное изменение по сравнению с CTRL мышами, инъецированными OVA-ALL,±SEM) в CD4+ Т-клетках селезенки, очищенных от IFN, инъецированной OVA-ALL (n=6), и с CTRL мышами (n=5) через 9 дней после инъекции опухоли и с C57Bl/6 мышами, не несущими опухоль. Каждая точка представляет одну мышь.a - RT-qPCR expression analysis of the indicated Th2 and Treg genes (mean fold change compared to CTRL mice injected with OVA-ALL, ±SEM) in spleen CD4+ T cells purified from IFN injected with OVA-ALL (n= 6), and with CTRL mice (n=5) 9 days after tumor injection and with C57Bl/6 tumor-free mice. Each dot represents one mouse.

Фиг. 11. Проточно-цитометрический анализ миелоидных клеток в РВ и селезенке у IFN и CTRL мышей с опухолями и без инъекций опухолей.Fig. 11. Flow cytometric analysis of myeloid cells in the PB and spleen of IFN and CTRL mice with and without tumor injections.

а, b, с - Стратегия гейтирования (а) и анализ (b, конкретное число, среднее±SEM) популяций миелоидных клеток в селезенке у IFN и CTRL мышей без опухолей и инъектированных OVA-ALL (CTRL: n=3), IFN n=2, CTRL+ALL: n=9, IFN+ALL: n=7), через 10 дней после инъекции опухоли. Макрофаги (MF) идентифицируются как клетки CD19-CD11c-Ly6G-F4/80+ и далее различаются на MHC-II+MF и MHC-II-Mf с использованием маркера IAb (MHC-II). Различали CD19-F4/80-CD11c+MHCII-миелоидные клетки и CD19-Р4/80-CD11с+MHCII+дендриmные клетки. Определяли гранулоциты как CD19-F4/80 CD11c-CD11b+Ly6C+Ly6G+, классические моноциты как CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6ClowLy6G- и не классические моноциты как CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6C-Ly6G-. **p<0,01, Крускал-Уоллис с откорректированным значением p по критерию Данна. Статистика выполняется в каждой отдельной миелоидной популяции. d - Процентное содержание макрофагов МНС-II, присутствующих у IFN и CTRL мышей без опухолей или имеющих опухоль, из (с). **р<0,01, Крускал-Уоллис с откорректированным значением p по критерию Данна.a, b, c - Gating strategy (a) and analysis (b, specific number, mean±SEM) of myeloid cell populations in the spleen of IFN and CTRL mice without tumors and injected with OVA-ALL (CTRL: n=3), IFN n =2, CTRL+ALL: n=9, IFN+ALL: n=7), 10 days after tumor injection. Macrophages (MF) are identified as CD19 cells-CD11c-Ly6G-F4/80+ and are further differentiated into MHC-II+MF and MHC-II-Mf using the IAb marker (MHC-II). Distinguished CD19-F4/80-CD11c+MHCII myeloid cells and CD19-Р4/80-CD11c+MHCII+dendritic cells. Granulocytes were identified as CD19-F4/80 CD11c-CD11b+Ly6C+Ly6G+, classical monocytes as CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6ClowLy6G- and not classical monocytes like CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6C-Ly6G-. **p<0.01, Kruskal-Wallis with Dunn's adjusted p value. Statistics are performed on each individual myeloid population. d - Percentage of MHC-II macrophages present in IFN and CTRL tumor-free or tumor-bearing mice from (c). **p < 0.01, Kruskal-Wallis adjusted p value by Dunn's test.

Фиг. 12. Проточно-цитометрический анализ миелоидных клеток в РВ и селезенке у IFN и CTRL мышей с опухолями и без инъекций опухолей.Fig. 12. Flow cytometric analysis of myeloid cells in the PB and spleen of IFN and CTRL mice with and without tumor injections.

а, b - Стратегия гейтирования и анализ (конкретное число, среднее±SEM) популяций миелоидных клеток в ВМ у IFN и CTRL мышей без опухолей и инъектированных OVA-ALL (CTRL: n=3), IFN n=2,a, b - Gating strategy and analysis (specific number, mean±SEM) of myeloid cell populations in the VM of IFN and CTRL mice without tumors and injected with OVA-ALL (CTRL: n=3), IFN n=2,

- 16 046120- 16 046120

CTRL+ALL: n=9, IFN+ALL: n=7), через 10 дней после инъекции опухоли. Каждая точка представляет одну мышь. Макрофаги (MF) идентифицированы как CD19-CD11c-Ly6G-F4/80+ клетки, дендритные клетки (DC) как CD19-F4/80-CD11c+MHCII+, гранулоциты как CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6C+Ly6G+, классические моноциты как CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6ClowLy6G- и неклассические моноциты как CD19 F4/80-CD11c-CD11b+Ly6CLy6G-. *p<0,05, **p<0,01, Крускал-Уоллис с откорректированным значением p по критерию Данна. Статистика выполняется в каждой отдельной миелоидной популяции. с, d - Стратегия гейтирования (с) и анализ (d, конкретное число, среднее±SEM) Т-регуляторных клеток в ВМ и селезенке IFN и CTRL мышей без опухолей и с инъекцией OVA-ALL из (b). Каждая точка представляет одну мышь. Т-регуляторные клетки определяются как CD3+CD4+CD25+FoxP3+. **p<0,01, Крускал-Уоллис с откорректированным значением p по критерию Данна. Статистика выполняется внутри каждой отдельной ткани.CTRL+ALL: n=9, IFN+ALL: n=7), 10 days after tumor injection. Each dot represents one mouse. Macrophages (MF) identified as CD19-CD11c-Ly6G-F4/80+ cells, dendritic cells (DC) like CD19-F4/80-CD11c+MHCII+, granulocytes as CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6C+Ly6G+, classical monocytes as CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6ClowLy6G- and non-classical monocytes as CD19 F4/80-CD11c-CD11b+Ly6CLy6G-. *p<0.05, **p<0.01, Kruskal-Wallis with Dunn's adjusted p value. Statistics are performed on each individual myeloid population. c, d - Gating strategy (c) and analysis (d, specific number, mean ± SEM) of T-regulatory cells in the BM and spleen of IFN and CTRL mice without tumors and injected with OVA-ALL from (b). Each dot represents one mouse. T regulatory cells are defined as CD3+CD4+CD25+FoxP3+. **p<0.01, Kruskal-Wallis with Dunn's adjusted p value. Statistics are performed within each individual tissue.

Фиг. 13. Проточно-цитометрический анализ NK и NKT клеток в селезенке IFN и CTRL мышей с опухолями и без инъекций опухолей.Fig. 13. Flow cytometric analysis of NK and NKT cells in the spleen of IFN and CTRL mice with and without tumor injections.

а, b, с - Стратегия гейтирования (а) и анализ (b, конкретное число, среднее±SEM) NK и NKT клеток в селезенке IFN и CTRL мышей без опухолей и с инъекцией OVA-ALL (CTRL: n=3), IFN n=2, CTRL+ALL: n=9, IFN+ALL: n=7), через 10 дней после инъекции опухоли. Каждая точка представляет одну мышь. NK-клетки были идентифицированы как CD19-CD3-NK1.1+, а NKT-клетки как CD19 CD3+NK1.1+. Используя маркеры CD11b и CD27, дополнительно различались наиболее незрелые (CD11b CD27+), зрелые и наиболее продуцирующие цитотоксические и цитокиновые (CD11b+CD27+) и зрелые и менее продуцирующие цитотоксические и цитокиновые (CD11b+CD27-) NK-клетки. **р<0,01, ***р<0,001, Крускал-Уоллис с откорректированным значением p по критерию Данна. Статистика выполняется в каждой отдельной популяции, с, Процентное содержание (среднее±SEM) указанных субпопуляций NK-клеток в селезенке (вверху) и ВМ (внизу) у IFN и CTRL мышей, не имеющих опухолей, из (b). Каждая точка представляет одну мышь. d, e - Процентное содержание (среднее±SEM) экспрессии NKG2D и NKp46 на CD11b+CD27+(d) и CD11b+CD27- (d, e) NK-клетках, присутствующих в селезенке (d) и ВМ (е) мышей от (b). Каждая точка представляет одну мышь. *р<0,05, **р>0,01, Крускал-Уоллис с откорректированным значением p по критерию Данна. Статистика выполняется в каждой отдельной популяции.a, b, c - Gating strategy (a) and analysis (b, specific number, mean±SEM) of NK and NKT cells in the spleen of IFN and CTRL mice without tumors and injected with OVA-ALL (CTRL: n=3), IFN n=2, CTRL+ALL: n=9, IFN+ALL: n=7), 10 days after tumor injection. Each dot represents one mouse. NK cells were identified as CD19-CD3-NK1.1+ and NKT cells as CD19 CD3+NK1.1+. Using markers CD11b and CD27, the most immature ones (CD11b CD27+), mature and most producing cytotoxic and cytokines (CD11b+CD27+) and mature and less producing cytotoxic and cytokines (CD11b+CD27-) NK cells. **p<0.01, ***p<0.001, Kruskal-Wallis with adjusted p value by Dunn's test. Statistics are performed on each individual population, with, Percentages (mean±SEM) of the indicated NK cell subsets in the spleen (top) and BM (bottom) of tumor-free IFN and CTRL mice from (b). Each dot represents one mouse. d, e - Percentage (mean±SEM) expression of NKG2D and NKp46 on CD11b+CD27+(d) and CD11b+CD27- (d, e) NK cells present in the spleen (d) and VM (e) of mice from (b). Each dot represents one mouse. *p<0.05, **p>0.01, Kruskal-Wallis with adjusted p value by Dunn's test. Statistics are performed on each individual population.

Фиг. 14. Иммунное давление, оказываемое OVA-специфическими Т-клетками, приводит к иммунному отбору OVA-негативных ALL-клеток у мышей.Fig. 14. Immune pressure exerted by OVA-specific T cells leads to immune selection of OVA-negative ALL cells in mice.

а - Процентное содержание (среднее±SEM) OVA-ALL в РВ каждой отдельной IFN (n=11) и CTRL (n=13) мыши. Каждая строка представляет одну мышь. b - Экспрессия NGFR на ВМ-инфильтрирующем ALL (или РВ, циркулирующем ALL для тех мышей, для которых недоступен анализ ВМ) и конкретное число (среднее±SEM) OVA-специфических Т-клеток (каждая линия представляет одну мышь) в PB IFN (n=8) и CTRL (n=13) мышей с быстрым или отсроченным течением заболевания (быстрое течение заболевания: CTRL: 13-29 дней (диапазон), 20,4±1,3 (среднее±SEM), n=11; IFN): 16-27 дней, 20,8±1,8, n=5, отсроченное течение заболевания: CTRL: 34-44 дня, 39±5, n=2; IFN: 34-100 дней, 56±22, n=3). с - Конкретное число (среднее±SEM) OVA-специфических Т-клеток у PB IFN мышей (n=3) с длительным выживанием. Каждая строка представляет одну мышь. d - Процентное содержание (среднее±SEM) OVAспецифических Т-клеток у выживших IFN мышей (n=3) по сравнению с 4 наивными мышами на фиг. 4b через 14 дней после второго заражения опухолью с помощью OVA-ALL. Каждая точка представляет одну мышь. е - Показательный график, показывающий клетки OVA-ALL и родительские ALL, смешанные в соотношении 1:1 перед инъекцией мышам.a - Percentage (mean±SEM) of OVA-ALL in the PB of each individual IFN (n=11) and CTRL (n=13) mouse. Each line represents one mouse. b - NGFR expression on BM-infiltrating ALL (or PB circulating ALL for those mice for which BM analysis is not available) and the specific number (mean ± SEM) of OVA-specific T cells (each line represents one mouse) in PB IFN ( n=8) and CTRL (n=13) mice with rapid or delayed disease (fast disease: CTRL: 13-29 days (range), 20.4±1.3 (mean±SEM), n=11; IFN): 16-27 days, 20.8±1.8, n=5, delayed course of the disease: CTRL: 34-44 days, 39±5, n=2; IFN: 34-100 days, 56±22, n=3). c - Specific number (mean±SEM) of OVA-specific T cells in PB IFN mice (n=3) with long-term survival. Each line represents one mouse. d - Percentage (mean ± SEM) of OVA-specific T cells in surviving IFN mice (n=3) compared to 4 naive mice in Fig. 4b 14 days after the second tumor challenge with OVA-ALL. Each dot represents one mouse. f - Representative graph showing OVA-ALL cells and parental ALL mixed in a 1:1 ratio before injection into mice.

Фиг. 15. Кинетика лейкемического роста у отдельных мышей.Fig. 15. Kinetics of leukemic growth in individual mice.

а, b - Процентное содержание (среднее±SEM) OVA-ALL в РВ каждого индивидуума (a) IFN (n=14), CTRL (n=14), IFN+aCTLA4 (n=14) и CTRL+aCTLA4 (n=15) мыши и (b) мыши IFN+aCTLA4 (n=10) и CTRL+aCTLA4 (n=12). Каждая точка представляет одну мышь.a, b - Percentage (mean±SEM) of OVA-ALL in the PB of each individual (a) IFN (n=14), CTRL (n=14), IFN+aCTLA4 (n=14) and CTRL+aCTLA4 (n= 15) mice and (b) IFN+aCTLA4 (n=10) and CTRL+aCTLA4 (n=12) mice. Each dot represents one mouse.

Фиг. 16. Иммунный отбор OVA-негативных ALL-клеток усиливается как у IFN, так и у CTRL мышей, обработанных CTLA4.Fig. 16. Immune selection of OVA-negative ALL cells is enhanced in both IFN and CTRL mice treated with CTLA4.

а - Экспрессия NGFR на ВМ-инфильтрирующем ALL (или РВ, циркулирующем ALL для тех мышей, для которых недоступен анализ ВМ) и конкретное число (среднее±SEM) OVA-специфических Тклеток (каждая линия представляет одну мышь) в PB IFN (n=14), CTRL (n=14), IFN+aCTLA4 (n=14) и CTRL+aCTLA4 (n=15) мышей, демонстрирующих быстрое, отсроченное течение заболевания или длительную выживаемость. Быстрое течение заболевания: CTRL: 14-21 день (диапазон), 15,66±0,8 (среднее±SEM), n=12; IFN: 17-25 дней, 21±1,3, n=8; CTRL+CTLA4: 14-21 день, 19±1,2, n=6; IFN+CTLA4: 25 дней, 25±0, n=2; отсроченное течение заболевания: CTRL: 36 дней, n=1; IFN: 30-36 дней, 34±2, n=3; CTRL+CTLA4, 30-64 дня, 42±7,4, n=5; IFN+CTLA4: 25-64 дня, 44±4,9, n=7). b - Процентное содержание OVA-специфических Т-клеток в CD8+ Т-клетках в РВ мышей из (а). *р<0,05, **р<0,01, ****р<0,0001, непараметрический ранговый метод для продольных данных в факторных экспериментах. с - Клональность и сходство репертуара TCR-бета CDR у длительно выживших мышей без опухолей (каждая стрелa - NGFR expression on BM-infiltrating ALL (or PB circulating ALL for those mice for which BM analysis is not available) and the specific number (mean±SEM) of OVA-specific T cells (each line represents one mouse) in PB IFN (n= 14), CTRL (n=14), IFN+aCTLA4 (n=14) and CTRL+aCTLA4 (n=15) mice demonstrating rapid, delayed disease progression or long-term survival. Rapid course of the disease: CTRL: 14-21 days (range), 15.66±0.8 (mean±SEM), n=12; IFN: 17-25 days, 21±1.3, n=8; CTRL+CTLA4: 14-21 days, 19±1.2, n=6; IFN+CTLA4: 25 days, 25±0, n=2; delayed course of the disease: CTRL: 36 days, n=1; IFN: 30-36 days, 34±2, n=3; CTRL+CTLA4, 30-64 days, 42±7.4, n=5; IFN+CTLA4: 25-64 days, 44±4.9, n=7). b - Percentage of OVA-specific T cells in CD8+ T cells in the PB of mice from (a). *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001, non-parametric rank method for longitudinal data in factorial experiments. c - Clonality and similarity of the TCR-beta CDR repertoire in long-term surviving tumor-free mice (each arrow

- 17 046120 ка представляет собой мышь) на фиг. 4f перед инъекцией OVA-ALL (начало стрелки, Т0) и через 30 дней после заражения OVA-ALL (конец стрелки, Т1).- 17 046120 ka represents a mouse) in FIG. 4f before OVA-ALL injection (start of arrow, T0) and 30 days after OVA-ALL infection (end of arrow, T1).

Фиг. 17. Генная терапия IFN ингибирует рост ALL путем активации адаптивного иммунитета.Fig. 17. IFN gene therapy inhibits the growth of ALL by activating adaptive immunity.

Конкретное число (среднее±SEM) исходного ALL в периферической крови (РВ) с течением времени у CTRL (n=10, обработанного антителом изотипического контроля), IFN (n=10, обработанного антителом изотипического контроля), CTRL+aCTLA4 (n=14) и IFN+aCTLA4 (n=13) мышей. Каждая точка представляет одну мышь. *р<0,05, **р<0,01, ****р<0,0001, непараметрический ранговый метод для продольных данных в факторных экспериментах.Specific number (mean±SEM) of baseline ALL in peripheral blood (PB) over time in CTRL (n=10, isotype control antibody-treated), IFN (n=10, isotype control antibody-treated), CTRL+aCTLA4 (n=14 ) and IFN+aCTLA4 (n=13) mice. Each dot represents one mouse. *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001, non-parametric rank method for longitudinal data in factorial experiments.

Фиг. 18. Генная терапия IFN накладывает иммуностимулирующую программу в ТМЕ.Fig. 18. IFN gene therapy imposes an immunostimulatory program in the TME.

Процент DC, представляющих иммунодоминантный пептид OVA (SINFEKL) на молекулах MHC-I в ВМ мышей от CTRL+ALL (n=7) и IFN+ALL (n=8). *р<0,05 критерий Манна-Уитни.Percentage of DCs presenting immunodominant OVA peptide (SINFEKL) on MHC-I molecules in the VM of mice from CTRL+ALL (n=7) and IFN+ALL (n=8). *p<0.05 Mann-Whitney test.

Фиг. 19. Транскрипционное перепрограммирование лейкемии ТМЕ с помощью генной терапии IFN.Fig. 19. Transcriptional reprogramming of TME leukemia using IFN gene therapy.

а, b - Вулканные диаграммы (левые панели), на которых показаны дифференциально экспрессированные гены (абс. log2FC>1,5, FDR<0,05) с повышенными (зеленым) или с пониженными (оранжевым) макрофагами селезенки мышей с опухолью (ALL) по сравнению с контрольными (CTRL) мышами (а) или ALL мышами, получавшими (IFN+ALL) или не получавшими (ALL) генную терапию IFN (b). Столбиковые диаграммы (правая панель) показывают GO-термины, обогащенные повышенными (зелеными) или пониженными (оранжевыми) генами из указанных сравнений. с, d - Избранные моментальные снимки PHK-Seq дерегулированных генов в макрофагах мышей ALL (с) или ISG, индуцированные у IFN+ALL мышей (d). e, f - tSNE графики, включающие данные scPHK-Seq от 10821 CD11b+ клеток, отсортированных из селезенки CTRL или ALL мышей, обработанных или не обработанных генной терапией IFN. Кластеры, определенные транскрипцией, и связанные с ними типы (е) клеток обозначены цифрами и цветами в условных обозначениях. Данные одноклеточной РНК-Seq в клетках кластера 1 (неклассические моноциты), окрашенные в зависимости от условий эксперимента (f). g - Термины GO, обогащенные в топ-100 генов (ранжированных по log2FC), повышенных (зеленый) или пониженных (оранжевый) в данных scPHK-Seq из кластера 1 (неклассические моноциты) в указанных сравнениях. h - Средняя экспрессия (log трансформированные значения ТРМ, нормализованные по количеству клеток) в неклассических моноцитах выбранных генов для указанных условий. i - Анализ минимального остовного дерева (MST) данных scPHK-Seq из кластера 1 (неклассические моноциты) после субкластеризации. Каждый круг представляет подкластер и показывает его размер (количество клеток) и состав (условия эксперимента). Круги, отмеченные звездочками, представляют собой мелкие подгруппы с рассеянным составом.a, b - Volcano diagrams (left panels) showing differentially expressed genes (abs. log 2 FC>1.5, FDR<0.05) with increased (green) or decreased (orange) macrophages in the spleen of tumor-bearing mice (ALL) versus control (CTRL) mice (a) or ALL mice treated (IFN+ALL) or not (ALL) with IFN gene therapy (b). Bar graphs (right panel) show GO terms enriched in upregulated (green) or downregulated (orange) genes from the indicated comparisons. c, d - Selected RNA-Seq snapshots of deregulated genes in macrophages from ALL mice (c) or ISGs induced in IFN+ALL mice (d). e, f - tSNE plots including scRNA-Seq data from 10,821 CD11b + cells sorted from the spleen of CTRL or ALL mice treated or not treated with IFN gene therapy. Transcriptionally defined clusters and their associated cell type(s) are indicated by numbers and colors in the legend. Single-cell RNA-Seq data from cluster 1 cells (non-classical monocytes), colored according to experimental conditions (f). g - GO terms enriched in the top 100 genes (ranked by log2FC) upregulated (green) or downregulated (orange) in scRNA-Seq data from cluster 1 (non-classical monocytes) in the indicated comparisons. h - Average expression (log transformed TPM values normalized by cell number) in non-classical monocytes of selected genes for the indicated conditions. i - Minimum spanning tree (MST) analysis of scRNA-Seq data from cluster 1 (non-classical monocytes) after subclustering. Each circle represents a subcluster and shows its size (number of cells) and composition (experimental conditions). Circles marked with asterisks represent small subgroups with dispersed composition.

Фиг. 20. Генная терапия IFN усиливает активацию адоптивно перенесенных CDR19трансдуцированных Т-клеток и повышает выживаемость.Fig. 20. IFN gene therapy enhances activation of adoptively transferred CDR19-transduced T cells and improves survival.

а, b - План эксперимента (а) и рост ALL во времени (b, конкретное число в РВ; среднее±SEM) в CTRL+CTRLT (n=5), IFN+CTRLT (n=5), CTRL+CART19 (n=7), IFN+CART19 (n=7). ****р<0,0001, непараметрический ранговый метод для продольных данных в факторных экспериментах. с - Процентное содержание (среднее±SEM) экспрессии Lag3 на клетках CD8+NGFR+CART19 в РВ мышей из (b). Длительно выжившие мыши показаны зеленым цветом. Каждая строка представляет одну мышь. d, e - План эксперимента (d) и рост ALL во времени (е, конкретное число в РВ; среднее±SEM) в CTRL+CTRLT (n=7), IFN+CTRLT (n=6), CTRL+CART19 (n=7), IFN+CART19 (n=6), CTRL+iCART19 (n=7), IFN+iCART19 (n=6), IFN+CTRLT позднее (n=6, исследование с поздним вмешательством), IFN+iCART19 позднее (n=6, исследование с поздним вмешательством). ****р<0,0001, непараметрический ранговый метод для продольных данных в факторных экспериментах. Статистический анализ проводят для выбранных групп (см. дополнительные онлайн табл. 9 и 10). f - Процент сверхурочной (среднее±SEM) экспрессии Lag3 на клетках CD8+NGFR+CART19 в РВ мышей из (b). Мыши CTRL+CART19 и CTRL+iCART19 нанесены на график вместе. Длительно выжившие мыши показаны зеленым цветом. Каждая строка представляет одну мышь. g - Кривая выживаемости мышей, обработанных клетками CART19 или iCART19 из (b и е). CTRL мыши, обработанные CART19 и iCART19 на фиг. 20 b, e нанесены на график вместе (CTRL+i/CART19, n=21), IFN+CART19 (n=13), IFN+iCART19 (n=6), IFN+iCART19 позднее (n=6). ****р<0,0001, критерий Мантеля-Хензеля, скорректированное значение p по методу Бонферрони.a, b - Experimental plan (a) and growth of ALL over time (b, specific number in RT; mean±SEM) in CTRL+CTRLT (n=5), IFN+CTRLT (n=5), CTRL+CART19 (n =7), IFN+CART19 (n=7). ****p<0.0001, nonparametric rank method for longitudinal data in factorial experiments. c - Percentage (mean±SEM) of Lag3 expression on CD8+NGFR+CART19 cells in the PB of mice from (b). Long-term surviving mice are shown in green. Each line represents one mouse. d, e - Experimental design (d) and growth of ALL over time (e, specific number in RT; mean±SEM) in CTRL+CTRLT (n=7), IFN+CTRLT (n=6), CTRL+CART19 (n =7), IFN+CART19 (n=6), CTRL+iCART19 (n=7), IFN+iCART19 (n=6), IFN+CTRLT later (n=6, late intervention study), IFN+iCART19 later (n=6, late intervention study). ****p<0.0001, nonparametric rank method for longitudinal data in factorial experiments. Statistical analyzes are performed for the selected groups (see online supplementary tables 9 and 10). f - Percentage of overtime (mean±SEM) expression of Lag3 on CD8+NGFR+CART19 cells in the PB of mice from (b). CTRL+CART19 and CTRL+iCART19 mice are plotted together. Long-term surviving mice are shown in green. Each line represents one mouse. g - Survival curve of mice treated with CART19 or iCART19 cells from (b and e). CTRL mice treated with CART19 and iCART19 in Fig. 20 b, e plotted together (CTRL+i/CART19, n=21), IFN+CART19 (n=13), IFN+iCART19 (n=6), IFN+iCART19 later (n=6). ****p<0.0001, Mantel-Haenszel test, Bonferroni adjusted p value.

Фиг. 21. Сконструированный OVA-ALL показал повышенную иммуногенность по сравнению с исходным ALL.Fig. 21. Engineered OVA-ALL showed increased immunogenicity compared to parental ALL.

Кривая выживания ALL-инъецированных CTRL (n=10, обработанных изотопным контрольным антителом), IFN (n=10, обработанных антителом изотипического контроля), CTRL+aCTLA4 (n=14) и IFN+aCTLA4 (n=13) мышей, **р<0,01, тест Мантеля-Хензеля.Survival curve of ALL-injected CTRL (n=10, isotype control antibody-treated), IFN (n=10, isotype control antibody-treated), CTRL+aCTLA4 (n=14) and IFN+aCTLA4 (n=13) mice, ** p<0.01, Mantel-Haenszel test.

Фиг. 22. Объемный анализ PHK-Seq в макрофагах селезенки.Fig. 22. Bulk RNA-Seq analysis in splenic macrophages.

а - Ящичковые диаграммы, показывающие уровни экспрессии в указанных состояниях генов с повышенными (n=213) или пониженными (n=258) макрофагами от мышей ALL, получавших генную терапию IFN (IFN+ALL), по сравнению с контролями ALL. Числа представляют результаты знакового рангового теста Уилкоксона в указанных сравнениях. b - Тепловая карта корреляции между наборами данныхa - Boxplots showing expression levels in the indicated conditions of genes with increased (n=213) or decreased (n=258) macrophages from ALL mice treated with IFN gene therapy (IFN+ALL) compared to ALL controls. Numbers represent the results of the Wilcoxon signed rank test in the comparisons indicated. b - Heat map of correlation between data sets

- 18 046120- 18 046120

PHK-Seq в макрофагах из указанных условий. Числа указывают рассчитанные коэффициенты определения (R2). Образцы упорядочены на основе неконтролируемой иерархической кластеризации.RNA-Seq in macrophages from these conditions. The numbers indicate the calculated coefficients of determination (R 2 ). The samples are ordered based on unsupervised hierarchical clustering.

Фиг. 23. Идентификация типа клеток в данных scPHK-Seq из селезеночных CD11b+ клеток.Fig. 23. Cell type identification in scRNA-Seq data from splenic CD11b + cells.

а - Графики tSNE, показывающие уровни экспрессии в отдельных клетках указанных сигнатур генов (GS). Неклассические моноциты: Cd300e, 1700011I03Rik, Tspan9, Dmpk, Fxyd2; классические моноциты: Ly6c2, Tarm, Tfec, Psrc1, Mmp8; нейтрофилы: Il1f9, Pglyrp4, Nlrp12, Mrgpra2b, Mmp8, Ltf, Amer2, Stfa211, Gm5483; дендритные клетки: Adam23, Procr, Mab2113, Sucnrl, Fndc5, Rnf186, Flt3, Cd207, Adam11, Apol7c, Htr7; макрофаги: Vcam1, Mertk, Actn1, Fcna, Crip2, Spic, Kcna2, Gfra2, Stab2, Jup; NKклетки: Khdc1c, Khdc1b, Phactr3, Col8a2, Klra4, Adamts14, Gzma, Cma1, Gzmb, Clip4; Т-клетки: Cd3g, Cd3e, Bcl11b, Actn2, Camk4; В-клетки: Рах5, Cd79a, Cd19, Chst3, Scn4a, Cacnali, Ly6d, Klhl14, Mzb1. Цветовая шкала отражает среднюю экспрессию (log-трансформированный ТРМ) по генам в каждой сигнатуре. b - Тепловая карта, показывающая экспрессию (масштабированные log-трансформированные значения ТРМ) 20 лучших дискриминационных генов для каждого кластера. Выбранные характерные гены для каждого кластера показаны справа. Для каждого кластера показано до 200 отдельных клеток.a - tSNE plots showing single cell expression levels of the indicated gene signatures (GS). Non-classical monocytes: Cd300e, 1700011I03Rik, Tspan9, Dmpk, Fxyd2; classical monocytes: Ly6c2, Tarm, Tfec, Psrc1, Mmp8; neutrophils: Il1f9, Pglyrp4, Nlrp12, Mrgpra2b, Mmp8, Ltf, Amer2, Stfa211, Gm5483; dendritic cells: Adam23, Procr, Mab2113, Sucnrl, Fndc5, Rnf186, Flt3, Cd207, Adam11, Apol7c, Htr7; macrophages: Vcam1, Mertk, Actn1, Fcna, Crip2, Spic, Kcna2, Gfra2, Stab2, Jup; NK cells: Khdc1c, Khdc1b, Phactr3, Col8a2, Klra4, Adamts14, Gzma, Cma1, Gzmb, Clip4; T cells: Cd3g, Cd3e, Bcl11b, Actn2, Camk4; B cells: Pax5, Cd79a, Cd19, Chst3, Scn4a, Cacnali, Ly6d, Klhl14, Mzb1. The color scale reflects the average expression (log-transformed TPM) across genes in each signature. b - Heat map showing the expression (scaled log-transformed TPM values) of the top 20 discriminatory genes for each cluster. Selected representative genes for each cluster are shown on the right. Up to 200 individual cells are shown for each cluster.

Фиг. 24. Изменения, вызванные лейкемией и IFN в данных scPHK-Seq на клетках селезенки CD11b+.Fig. 24. Leukemia- and IFN-induced changes in scRNA-Seq data on CD11b + spleen cells.

Графики tSNE, показывающие данные scPHK-Seq из кластеров 2-11, окрашенные в зависимости от условий эксперимента.tSNE plots showing scRNA-Seq data from clusters 2–11, colored by experimental condition.

Фиг. 25. Субкластерный анализ данных scPHK-Seq из неклассических моноцитов и анализ экспрессии генов на CD4 Т-клетках.Fig. 25. Subcluster analysis of scRNA-Seq data from non-classical monocytes and gene expression analysis on CD4 T cells.

а - Графики проточной цитометрии, показывающие клетки OVA-ALL (вверху) и OVAспецифические CD8 Т-клетки (внизу) в селезенке от 3 типичных ALL-инъецированных CTRL (CTRL+ALL), IFN без ответа (IFN+ALL NR) и IFN с ответом (IFN+ALL R) мышей. Клетки CD11b+ от этих мышей анализировали с помощью scPHK-seq. b - Графики tsne, показывающие субкластер клеток в неклассической популяции моноцитов, окрашенных на основе кластеризации (верхний график) или экспериментальных условий (нижний график). Подкластеры, обведенные кружком, представляют собой второстепенные подкластеры с рассеянным составом и соответствуют тем, которые отмечены звездочками на фиг. 19i.a - Flow cytometry plots showing OVA-ALL cells (top) and OVA-specific CD8 T cells (bottom) in the spleen from 3 typical ALL-injected CTRL (CTRL+ALL), IFN no response (IFN+ALL NR), and IFN with response (IFN+ALL R) of mice. CD11b + cells from these mice were analyzed by scRNA-seq. b - tsne plots showing a subcluster of cells in a non-classical monocyte population colored based on clustering (top plot) or experimental condition (bottom plot). The circled subclusters represent minor subclusters with dispersed composition and correspond to those marked with asterisks in Fig. 19i.

Фиг. 26. Генная терапия IFN повышает активацию клеток CART19.Fig. 26. IFN gene therapy increases CART19 cell activation.

а - Схематическое представление двунаправленного LV (BdLV), используемого для трансдуцированных Т-клеток мыши, и процент экспрессии NGFR в нетрансдуцированных (UT) и трансдуцированных (CART 19) CD4 и CD8 Т-клетках до инфузии мышам на фиг. 20b. b - Процент наивных (CD62L+CD44+), центральной памяти (CD62L CD44') и эффекторной памяти (CD62L CD44') UT или CART19 Т-клеток до инфузии мышам на фиг. 20b. с - Типичная проточная цитофлуориметрическая диаграмма выжившей IFN+CART19 мыши на фиг. 20b, показывающая аплазию В-клеток в РВ. d - Процент сверхурочной (среднее±SEM) экспрессии PD1 на клетках CD8+NGFR+CART19 у мышей CTRL+CART19 (n=7) и IFN+CART19 (n=7). Длительно выжившие мыши показаны зеленым цветом. Каждая строка представляет одну мышь. е, f - Уровень (средняя интенсивность флуоресценции, MFI) экспрессии NGFR в течение времени на клетках CD4+ (е) и CD8+ (f) CART19 мышей из (d). Длительно выжившие мыши показаны зеленым цветом. Каждая точка представляет одну мышь.a Schematic representation of the bidirectional LV (BdLV) used for transduced mouse T cells and the percentage of NGFR expression in untransduced (UT) and transduced (CART 19) CD4 and CD8 T cells before infusion into mice in FIG. 20b. b - Percentage of naive (CD62L + CD44 + ), central memory (CD62L CD44') and effector memory (CD62L CD44') UT or CART19 T cells before infusion into mice in Fig. 20b. c - Typical flow cytometric diagram of a surviving IFN+CART19 mouse in Fig. 20b showing B cell aplasia in the PB. d - Percentage of overtime (mean±SEM) expression of PD1 on CD8+NGFR+CART19 cells in CTRL+CART19 (n=7) and IFN+CART19 (n=7) mice. Long-term surviving mice are shown in green. Each line represents one mouse. e, f - Level (mean fluorescence intensity, MFI) of NGFR expression over time on mouse CD4 + (e) and CD8 + (f) CART19 cells from (d). Long-term surviving mice are shown in green. Each dot represents one mouse.

Фиг. 27. Генная терапия IFN повышает активацию клеток CART19.Fig. 27. IFN gene therapy increases CART19 cell activation.

а - Процент экспрессии NGFR в нетрансдуцированных (UT) и трансдуцированных (CART 19) CD4 и CD8 Т-клетках до инфузии мышам на фиг. 20е. b - Процент наивных (CD62L+CD44+), центральной памяти (CD62L CD44') и эффекторной памяти (CD62L-CD44+) UT или CART19 Т-клеток до инфузии мышам из фигуры 20е. с - Конкретное число (среднее±SEM) CD4 (вверху) и CD8 (внизу) клеток NGFR+CART19 из CTRL+CART19 (n=7), IFN+CART19 (n=6), CTRL+iCART19 (n=7), IFN+iCART19 (n=6) и IFN+iCART19 позднее (n=6, исследование с поздним вмешательством) мышей. Длительно выжившие мыши показаны зеленым цветом. Каждая строка представляет одну мышь. d - Уровень (средняя интенсивность флуоресценции, MFI) экспрессии NGFR в течение времени на клетках CD4+ (вверху) и CD8+ (внизу) CART19 мышей из (с). Длительно выжившие мыши показаны зеленым цветом. Каждая точка представляет одну мышь.a - Percentage of NGFR expression in untransduced (UT) and transduced (CART 19) CD4 and CD8 T cells before infusion into mice in Fig. 20th b - Percentage of naive (CD62L + CD44 + ), central memory (CD62L CD44') and effector memory (CD62L - CD44 + ) UT or CART19 T cells before infusion into mice from Figure 20e. c - Specific number (mean±SEM) of CD4 (top) and CD8 (bottom) NGFR+CART19 cells from CTRL+CART19 (n=7), IFN+CART19 (n=6), CTRL+iCART19 (n=7), IFN+iCART19 (n=6) and IFN+iCART19 late (n=6, late intervention study) mice. Long-term surviving mice are shown in green. Each line represents one mouse. d - Level (mean fluorescence intensity, MFI) of NGFR expression over time on mouse CD4 + (top) and CD8 + (bottom) CART19 cells from (c). Long-term surviving mice are shown in green. Each dot represents one mouse.

Фиг. 28. Структура конструкций NGFR контроля (вверху), Tig126/130a (в центре) и Tta126/130а (внизу).Fig. 28. Structure of NGFR control (top), Tig126/130a (center), and Tta126/130a (bottom) constructs.

Фиг. 29. Оценка доставки IFNy при лейкемическом росте и вызванной лейкемией микроокружении опухоли.Fig. 29. Evaluation of IFNy delivery during leukemic growth and leukemia-induced tumor microenvironment.

Фиг. 30. Оценка одновременной доставки нескольких иммуностимулирующих цитокинов в микросреду лейкемии с использованием векторной цепи Tie2.Fig. 30. Evaluation of simultaneous delivery of multiple immunostimulatory cytokines into the leukemia microenvironment using a Tie2 vector chain.

Фиг. 31. Оценка синергизма между доставкой IFNy на основе генной терапии с другими иммунотерапевтическими стратегиями, включая ингибиторы контрольных точек анти-CTLA-4 и анти-LAG-3, и ингибитор индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), 1-метилтриптофан (1-MT).Fig. 31. Assess the synergy between gene therapy-based delivery of IFNy with other immunotherapeutic strategies, including the anti-CTLA-4 and anti-LAG-3 checkpoint inhibitors, and the indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) inhibitor, 1-methyltryptophan (1 -MT).

- 19 046120- 19 046120

Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention

Клетки.Cells.

Стволовая клетка способна дифференцироваться во многие типы клеток. Клетка, которая способна дифференцироваться во все типы клеток, известна как тотипотент. У млекопитающих только зигота и ранние эмбриональные клетки являются тотипотентными. Стволовые клетки встречаются в большинстве, если не во всех многоклеточных организмах. Они характеризуются способностью обновляться посредством митотического деления клеток и дифференцироваться в широкий спектр специализированных типов клеток. Два широких типа стволовых клеток млекопитающих представляют собой эмбриональные стволовые клетки, которые выделены из внутренней клеточной массы бластоцист, и взрослые стволовые клетки, которые находятся во взрослых тканях. У развивающегося эмбриона стволовые клетки могут дифференцироваться во все специализированные эмбриональные ткани. У взрослых организмов стволовые клетки и клетки-предшественники действуют как система восстановления организма, пополняя специализированные клетки, а также поддерживая нормальный обмен регенеративных органов, таких как кровь, кожа или кишечные ткани.A stem cell is capable of differentiating into many types of cells. A cell that is capable of differentiating into all cell types is known as totipotent. In mammals, only the zygote and early embryonic cells are totipotent. Stem cells are found in most, if not all multicellular organisms. They are characterized by the ability to renew themselves through mitotic cell division and differentiate into a wide range of specialized cell types. The two broad types of mammalian stem cells are embryonic stem cells, which are isolated from the inner cell mass of blastocysts, and adult stem cells, which are found in adult tissues. In the developing embryo, stem cells can differentiate into all the specialized embryonic tissues. In adult organisms, stem and progenitor cells act as the body's repair system, replenishing specialized cells as well as maintaining the normal turnover of regenerative organs such as blood, skin or intestinal tissues.

Гематопоэтические стволовые клетки (HSC) являются мультипотентными стволовыми клетками, которые могут быть обнаружены, например, в периферической крови, костном мозге и пуповинной крови. HSC способны к самообновлению и дифференцировке в любую линию клеток крови. Они способны реколонизировать всю иммунную систему, а также эритроидные и миелоидные линии во всех кроветворных тканях (таких как костный мозг, селезенка и тимус). Они обеспечивают пожизненное производство всех линий кроветворных клеток.Hematopoietic stem cells (HSC) are multipotent stem cells that can be found, for example, in peripheral blood, bone marrow and umbilical cord blood. HSCs are capable of self-renewal and differentiation into any blood cell lineage. They are capable of recolonizing the entire immune system, as well as the erythroid and myeloid lineages in all hematopoietic tissues (such as bone marrow, spleen and thymus). They ensure lifelong production of all hematopoietic cell lines.

Гематопоэтические клетки-предшественники (ГПС) способны дифференцироваться в клетки определенного типа. Однако в отличие от стволовых клеток они уже более специфичны: они вынуждены дифференцироваться в свои клетки-мишени. Разница между HSC и НРС заключается в том, что HSC могут реплицироваться бесконечно, тогда как НРС могут делиться только ограниченное количество раз.Hematopoietic progenitor cells (HPCs) are capable of differentiating into a specific cell type. However, unlike stem cells, they are already more specific: they are forced to differentiate into their target cells. The difference between HSCs and NPCs is that HSCs can replicate indefinitely, whereas NPCs can only divide a limited number of times.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение может использоваться смешанная популяция клеток, содержащая HSC и НРС (например, популяцию HSPC).In one embodiment, the present invention may use a mixed population of cells containing HSCs and HPCs (eg, a population of HSPCs).

Дифференцированная клетка представляет собой клетку, которая стала более специализированной по сравнению со стволовыми клетками или клетками-предшественниками. Дифференциация происходит во время развития многоклеточного организма, когда организм переходит от одной зиготы к сложной системе тканей и типов клеток. Дифференциация также является распространенным процессом у взрослых: взрослые стволовые клетки делятся и создают полностью дифференцированные дочерние клетки во время восстановления тканей и нормального обмена клеток. Дифференциация резко меняет размер клетки, ее форму, мембранный потенциал, метаболическую активность и чувствительность к сигналам. Эти изменения в значительной степени обусловлены строго контролируемыми изменениями в экспрессии генов. Другими словами, дифференцированная клетка представляет собой клетку, которая имеет специфические структуры и выполняет определенные функции благодаря процессу развития, который включает активацию и дезактивацию определенных генов. При этом дифференцированная клетка включает дифференцированные клетки кроветворной линии, такие как моноциты, макрофаги, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, эритроциты, мегакариоциты/тромбоциты, дендритные клетки, Т-клетки, В-клетки и NK-клетки. Например, дифференцированные клетки кроветворной линии можно отличить от HSC и НРС путем обнаружения молекул клеточной поверхности, которые не экспрессируются или экспрессируются в меньшей степени на недифференцированных клетках (HSC и НРС). Примеры подходящих маркеров человеческой линии включают CD33, CD13, CD14, CD15 (миелоид), CD19, CD20, CD22, CD79a (В), CD36, CD71, CD235a (эритроид), CD2, CD3, CD4, CD8 (Т), CD56 (НК).A differentiated cell is a cell that has become more specialized compared to stem or progenitor cells. Differentiation occurs during the development of a multicellular organism, when the organism moves from a single zygote to a complex system of tissues and cell types. Differentiation is also a common process in adults: adult stem cells divide and create fully differentiated daughter cells during tissue repair and normal cell turnover. Differentiation dramatically changes cell size, shape, membrane potential, metabolic activity, and sensitivity to signals. These changes are largely driven by tightly controlled changes in gene expression. In other words, a differentiated cell is a cell that has specific structures and performs specific functions through a developmental process that involves the activation and deactivation of certain genes. The differentiated cell includes differentiated cells of the hematopoietic lineage, such as monocytes, macrophages, neutrophils, basophils, eosinophils, erythrocytes, megakaryocytes/platelets, dendritic cells, T cells, B cells and NK cells. For example, differentiated cells of the hematopoietic lineage can be distinguished from HSC and HPC by detecting cell surface molecules that are not expressed or expressed to a lesser extent on undifferentiated cells (HSC and HPC). Examples of suitable human lineage markers include CD33, CD13, CD14, CD15 (myeloid), CD19, CD20, CD22, CD79a (B), CD36, CD71, CD235a (erythroid), CD2, CD3, CD4, CD8 (T), CD56 ( NK).

Источник клеток.Source of cells.

В одном варианте осуществления HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клеткупредшественник, макрофаг или моноцит, используемые в настоящем изобретении, получают из образца ткани.In one embodiment, the HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, or monocyte used in the present invention is obtained from a tissue sample.

Например, HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит могут быть получены из периферической крови взрослого и плода, пуповинной крови, костного мозга, печени или селезенки. Предпочтительно, эти клетки получают из периферической крови или костного мозга. Они могут быть получены после мобилизации клеток in vivo посредством обработки фактором роста.For example, HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte can be obtained from adult and fetal peripheral blood, umbilical cord blood, bone marrow, liver or spleen. Preferably, these cells are obtained from peripheral blood or bone marrow. They can be obtained after mobilization of cells in vivo by treatment with a growth factor.

Мобилизация HSC или НРС может быть осуществлена с использованием, например, G-CSF, плериксафора или их комбинаций. Другие агенты, такие как NSAID, лиганды CXCR2 (Grobeta) и ингибиторы дипептидилпептидазы, также могут быть использованы в качестве мобилизующих агентов.Mobilization of HSCs or HPCs can be accomplished using, for example, G-CSF, plerixafor, or combinations thereof. Other agents such as NSAIDs, CXCR2 ligands (Grobeta) and dipeptidyl peptidase inhibitors can also be used as mobilizing agents.

Учитывая наличие факторов роста стволовых клеток GM-CSF и G-CSF, большинство процедур трансплантации гемопоэтических стволовых клеток в настоящее время выполняется с использованием стволовых клеток, собранных из периферической крови, а не из костного мозга. Сбор стволовых клеток периферической крови обеспечивает больший трансплантат, не требует, чтобы донор подвергался общей анестезии для сбора трансплантата, приводит к более короткому времени приживления и может обеспечить более низкую частоту рецидивов в долгосрочной перспективе.Given the presence of stem cell growth factors GM-CSF and G-CSF, most hematopoietic stem cell transplant procedures are currently performed using stem cells collected from peripheral blood rather than bone marrow. Harvesting peripheral blood stem cells provides a larger graft, does not require the donor to undergo general anesthesia for graft collection, results in shorter engraftment times, and may provide lower relapse rates in the long term.

- 20 046120- 20 046120

Костный мозг можно собирать стандартными методами аспирации (либо в стационарном режиме, либо после мобилизации), либо с использованием инструментов для сбора следующего поколения.Bone marrow can be collected using standard aspiration techniques (either inpatient or after mobilization) or using next-generation collection instruments.

Кроме того, HSC также могут быть получены из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.In addition, HSCs can also be derived from induced pluripotent stem cells.

Характеристики HSC.Characteristics of HSC.

HSC обычно имеют низкий профиль прямого рассеяния и профиль бокового рассеяния с помощью проточной цитометрии. Некоторые из них метаболически неактивны, о чем свидетельствует мечение родамином, что позволяет определить активность митохондрий. HSC могут содержать определенные маркеры клеточной поверхности, такие как CD34, CD45, CD133, CD90 и CD49f. Их также можно определить как клетки, в которых отсутствует экспрессия маркеров клеточной поверхности CD38 и CD45RA. Однако экспрессия некоторых из этих маркеров зависит от стадии развития и тканеспецифического контекста HSC. Некоторые HSC, называемые клетками боковой популяции, исключают краситель Hoechst 33342, обнаруживаемый методом проточной цитометрии. Таким образом, HSC имеют описательные характеристики, которые позволяют их идентифицировать и выделять.HSCs generally have a low forward scatter profile and a low side scatter profile by flow cytometry. Some of them are metabolically inactive, as evidenced by rhodamine labeling, which allows determination of mitochondrial activity. HSCs may contain certain cell surface markers such as CD34, CD45, CD133, CD90 and CD49f. They can also be defined as cells that lack expression of the cell surface markers CD38 and CD45RA. However, the expression of some of these markers depends on the developmental stage and tissue-specific context of the HSC. Some HSCs, called lateral population cells, exclude the Hoechst 33342 dye detected by flow cytometry. Thus, HSCs have descriptive characteristics that allow them to be identified and distinguished.

Отрицательные маркеры.Negative markers.

CD38 является наиболее общепринятым и используемым единственным отрицательным маркером для HSC человека.CD38 is the most widely accepted and used single negative marker for human HSC.

Человеческие HSC также могут быть отрицательными в отношении маркеров линии, таких как CD2, CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD24, CD36, CD56, CD66b, CD271 и CD45RA. Однако эти маркеры, возможно, придется использовать в комбинации для обогащения HSC.Human HSCs can also be negative for lineage markers such as CD2, CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD24, CD36, CD56, CD66b, CD271, and CD45RA. However, these markers may have to be used in combination for HSC enrichment.

Под отрицательным маркером следует понимать, что человеческие HSC не имеют экспрессии этих маркеров.By negative marker is meant that human HSCs do not express these markers.

Положительные маркеры.Positive markers.

CD34 и CD133 являются наиболее используемыми положительными маркерами для HSC.CD34 and CD133 are the most used positive markers for HSC.

Некоторые HSC также являются положительными для маркеров линии, таких как CD90, CD49f и CD93. Однако эти маркеры, возможно, придется использовать в комбинации для обогащения HSC.Some HSCs are also positive for lineage markers such as CD90, CD49f and CD93. However, these markers may have to be used in combination for HSC enrichment.

Под положительным маркером следует понимать, что человеческие HSC экспрессируют эти маркеры.By positive marker is meant that human HSCs express these markers.

Соответственно, терапевтическая популяция клеток может представлять собой CD34+CD38-. Дальнейшее разделение может быть проведено для получения, например, C.'D34'C.'D38-C.'D45RA-C.'D90'C.'D49r клеток.Accordingly, the therapeutic cell population may be CD34+CD38 - . Further separation can be carried out to obtain, for example, C.'D34'C.'D38 - C.'D45RA - C.'D90'C.'D49r cells.

Экспрессия микроРНК.MicroRNA expression.

Экспрессия микроРНК mir-126 и mir-130a в клетке указывает на то, что клетка представляет собой HSC или НРС. Более конкретно, экспрессия mir-126 указывает, что клетка представляет собой примитивную НРС. Экспрессия Mir-130а указывает на то, что клетка является более примитивной НРС.Expression of microRNAs mir-126 and mir-130a in a cell indicates that the cell is an HSC or an HPC. More specifically, the expression of mir-126 indicates that the cell is a primitive NPC. Expression of Mir-130a indicates that the cell is a more primitive LPC.

Цитокины.Cytokines.

Цитокины представляют собой категорию небольших белков, обычно размером примерно 5-20 кДа, которые играют важную роль в системе клеточных сигналов. Цитокины могут включать интерфероны, хемокины, интерлейкины, лимфокины и факторы некроза опухолей, и они продуцируются широким спектром клеток, включая макрофаги, В-лимфоциты, Т-лимфоциты, тучные клетки, эндотелиальные клетки и фибробласты.Cytokines are a category of small proteins, typically approximately 5-20 kDa in size, that play important roles in cell signaling. Cytokines may include interferons, chemokines, interleukins, lymphokines, and tumor necrosis factors, and they are produced by a wide range of cells, including macrophages, B lymphocytes, T lymphocytes, mast cells, endothelial cells, and fibroblasts.

Цитокины действуют через рецепторы и играют особенно важную роль в иммунной системе, модулируя баланс между гуморальными и клеточными иммунными реакциями.Cytokines act through receptors and play a particularly important role in the immune system, modulating the balance between humoral and cellular immune responses.

Цитокины включают интерфероны (IFN), IL-12 и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF).Cytokines include interferons (IFNs), IL-12, and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF).

Интерфероны (IFN) представляют собой группу сигнальных белков, которые вырабатываются клетками-хозяевами в ответ на присутствие патогенов (например, вирусов, бактерий и паразитов) и опухолевых клеток.Interferons (IFNs) are a group of signaling proteins that are produced by host cells in response to the presence of pathogens (eg, viruses, bacteria, and parasites) and tumor cells.

IFN обычно делятся на три класса: тип I, тип II и тип III.IFNs are generally divided into three classes: type I, type II, and type III.

Интерфероны типа I (IFN).Type I interferons (IFNs).

Интерфероны типа I (IFN) представляют собой класс цитокинов, продуцируемых иммунными клетками (лейкоцитами, например, NK-клетками, В-клетками, Т-клетками, макрофагами и т.д.). IFN типа I называют плейотропными цитокинами, поскольку они могут оказывать специфическое действие IFN на несколько типов клеток.Type I interferons (IFNs) are a class of cytokines produced by immune cells (white blood cells, e.g. NK cells, B cells, T cells, macrophages, etc.). Type I IFNs are called pleiotropic cytokines because they can exert specific IFN effects on multiple cell types.

В одном варианте осуществления IFN типа I представляет собой интерферон-альфа (IFNa). IFNa также известен как IFN-альфа, IFNa, INFa-1/13.In one embodiment, the type I IFN is interferon alpha (IFNa). IFNa is also known as IFN-alpha, IFNa, INFa-1/13.

- 21 046120- 21 046120

Примером аминокислотной последовательности IFNa является:An example of an IFNa amino acid sequence is:

MALTFALLVALLVLSCKSSCSVGCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKD RHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQL NDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSF SLSTNLQESLRSKE (SEQ ID NO:6)MALTFALLVALLVLSCKSSCSVGCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKD RHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQL NDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSF SLSTNLQESLRSKE (SE QID NO:6)

В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая IFN типа I, кодирует белок IFNa, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая IFN типа I, кодирует белок IFNa, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,5% идентичности с SEQ ID NO: 6, и где функциональность белка IFNa, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, в основном сохраняется.In one embodiment, the nucleotide sequence encoding type I IFN encodes an IFNa protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In one embodiment, the nucleotide sequence encoding type I IFN encodes an IFNa protein comprising an amino acid sequence having at least 70 %, at least 75%, at least 80%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5% identity with SEQ ID NO: 6, and wherein the functionality of an IFNa protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, mostly maintained.

Примером нуклеотидной последовательности, кодирующей IFNa, является:An example of a nucleotide sequence encoding IFNa is:

ATGGCCTTGACCTTTGCTTTACTGGTGGCCCTCCTGGTGCTCAGCTGCAAGTCATGGCCTTGACCTTTGCTTTACTGGTGGCCCTCCTGGTGCTCAGCTGCAAGTC

AAGCTGCTCTGTGGGCTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGA CCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACA GACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAA ACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAG GACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTAC CAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGAC TCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCAC TCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAG AAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGG AATGA (SEQ ID NO:7)AAGCTGCTCTGTGGGCTGTGATCTGCCTCAAACCCAGCCTGGGTAGCAGGAGGA CCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACA GACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAA ACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAG GACTCATCTGCTGCTTG GGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTAC CAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGAC TCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCAC TCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAG AAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCA AGAAAGTTTAAGAAGTAAGG AATGA (SEQ ID NO:7)

В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая IFNa, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая IFNa, содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,5% идентичности с SEQ ID NO: 7, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует белок, имеющий по существу ту же функцию, что и белок SEQ ID NO: 6.In one embodiment, the nucleotide sequence encoding IFNa comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7. In one embodiment, the nucleotide sequence encoding IFNa comprises a nucleotide sequence having at least 40%, at least 50%, at least 60 %, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5% identity with SEQ ID NO: 7, wherein said nucleotide sequence encodes a protein having substantially the same function as the protein of SEQ ID NO: 6.

В одном варианте осуществления IFN типа 1 представляет собой интерферон-бета (IFNe; IFNb).In one embodiment, the type 1 IFN is interferon-beta (IFNe; IFNb).

Примером аминокислотной последовательности IFNe является:An example of an IFNe amino acid sequence is:

MTNKCLLQIALLLCFSTTALSMSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLK DRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYH QINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILR NFYFINRLTGYLRN (SEQ ID NO:8)(SEQ ID NO:8)

В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая IFN типа I, кодирует белок IFNe, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая IFN типа I, кодирует белок IFNe, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,5% идентичности с SEQ ID NO: 8, и где функциональность белка IFNe, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, в основном сохраняется.In one embodiment, the nucleotide sequence encoding type I IFN encodes an IFNe protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In one embodiment, the nucleotide sequence encoding type I IFN encodes an IFNe protein comprising an amino acid sequence having at least 70 %, at least 75%, at least 80%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5% identity with SEQ ID NO: 8, and wherein the functionality of an IFNe protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, mostly retained.

- 22 046120- 22 046120

Примером нуклеотидной последовательности, кодирующей IFNe, является:An example of a nucleotide sequence encoding IFNe is:

gaattctcaggtcgtttgctttcctttgctttctcccaagtcttgttttacaatttgctttagtcattcactgaaactttaaaaaacattagaa aacctcacagtttgtaaatctttttccctattatatatatcataagataggagcttaaataaagagttttagaaactactaaaatgtaaatgacatag gaaaactgaaagggagaagtgaaagtgggaaattcctctgaatagagagaggaccatctcatataaataggccatacccacggagaaag gacattctaactgcaacctttcgaagcctttgctctggcacaacaggtagtaggcgacactgttcgtgttgtcaacatgaccaacaagtgtctc ctccaaattgctctcctgttgtgcttctccactacagctctttccatgagctacaacttgcttggattcctacaaagaagcagcaattttcagtgtc agaagctcctgtggcaattgaatgggaggcttgaatactgcctcaaggacaggatgaactttgacatccctgaggagattaagcagctgca gcagttccagaaggaggacgccgcattgaccatctatgagatgctccagaacatctttgctattttcagacaagattcatctagcactggctgg aatgagactattgttgagaacctcctggctaatgtctatcatcagataaaccatctgaagacagtcctggaagaaaaactggagaaagaagat ttcaccaggggaaaactcatgagcagtctgcacctgaaaagatattatgggaggattctgcattacctgaaggccaaggagtacagtcactg tgcctggaccatagtcagagtggaaatcctaaggaacttttacttcattaacagacttacaggttacctccgaaactgaagatctcctagcctgt gcctctgggactggacaattgcttcaagcattcttcaaccagcagatgctgtttaagtgactgatggctaatgtactgcatatgaaaggacact agaagattttgaaatttttattaaattatgagttatttttatttatttaaattttattttggaaaataaattatttttggtgcaaaagtcaacatggcagtttt aatttcgatttgatttatataaccatccatattataaaattgccaagtacctattagttgttctttttaaaatatacctgcaaagtagtatactttctggc ccctgcctttaaggaatttaaaattcaagaaagccatgatggaatatataaggtaagagacaataaggggacctgaaccttatgggggaata aatatggcatgaactgctgtgggattaaaagagaaaaggaaagctggagggtctggaactaaacctggggttcccattcctcctactgtgtgt tccagattctctcatcataaagttagaattgagctggccatcaggaatagccagaggaatatgtcagcttttgtgttctccctaaccttccccagt tatttgggggatcactttgctcctcgaaagatttttaaataattatgtgccccccaccatccctgcaagcttaagggtgagaagtcccatttacttc catgacactattaagcagcaatctctttattctgctcatcatgggacagccaagatgtgtgggtatcttaggggagctgtgggtccctgtctgct ggcatggcacaggcatcagaggaagaagaacctttttataccctagccatctggttagttttctccctagtttttcaaaaaactaagcctgcttcc agtccccactgccttgttcatacagaattc (SEQ ID N0:9)gaattctcaggtcgtttgctttcctttgctttctcccaagtcttgttttacaatttgctttagtcattcactgaaactttaaaaaacattagaa aacctcacagtttgtaaatctttttccctattatatatatcataagataggagcttaaataaagagttttagaaactactaaaatgtaaatgacatag gaaaactga aagggagaagtgaaagtgggaaattcctctgaatagagagaggaccatctcatataaataggccatacccacggagaaag gacattctaactgcaacctttcgaagcctttgctctggcacaacaggtagtaggcgacactgttcgtgttgtcaacatgaccaacaagtgtctc ctccaaattgctctcctgttgtgcttctccactacagctctt tccatgagctacaacttgcttggattcctacaaagaagcagcaattttcagtgtc agaagctcctgtggcaattgaatgggaggcttgaatactgcctcaaggacaggatgaactttgacatccctgaggagattaagcagctgca gcagttccagaaggaggacgccgcattgaccatctatgagatgctccagaacatctttgctattttcagacaagatt catctagcactggctgg aatgagactattgttgagaacctcctggctaatgtctatcatcagataaaccatctgaagacagtcctggaagaaaaactggagaaagaagat ttcaccaggggaaaactcatgagcagtctgcacctgaaaagatattatgggaggattctgcattacctgaaggccaaggagtacagtcactg tgcctggaccatagtcagagtgg aaatcctaaggaacttttacttcattaacagacttacaggttacctccgaaactgaagatctcctagcctgt gcctctgggactggacaattgcttcaagcattcttcaaccagcagatgctgtttaagtgactgatggctaatgtactgcatatgaaaggacact agaagattttgaaatttttattaaattatgagttatttttatttatttaaattt tattttggaaaataaattatttttggtgcaaaagtcaacatggcagtttt aatttcgatttgatttatataaccatccatattataaaattgccaagtacctattagttgttctttttaaaatatacctgcaaagtagtatactttctggc ccctgcctttaaggaatttaaaattcaagaaagccatgatggaatatataaggtaagagaca aataaggggacctgaaccttatgggggaata aatatggcatgaactgctgtgggattaaaagagaaaaggaaagctggagggtctggaactaaacctggggttcccattcctcctactgtgtgt tccagattctctcatcataaagttagaattgagctggccatcaggaatagccagaggaatatgtcagcttttgtgttctccctaaccttcccca gt tatttgggggatcactttgctcctcgaaagatttttaaataattatgtgccccccaccatccctgcaagcttaagggtgagaagtcccatttacttc catgacactattaagcagcaatctctttattctgctcatcatgggacagccaagatgtgtgggtatcttaggggagctgtgggtccctgtctgct ggcatggcacaggcatcagaggaaga agaacctttttataccctagccatctggttagttttctccctagtttttcaaaaaactaagcctgcttcc agtccccactgccttgttcatacagaattc (SEQ ID N0:9)

В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая IFNe, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая IFNe, содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,5% идентичности с SEQ ID NO: 9, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует белок, имеющий по существу ту же функцию, что и белок IFNe SEQ ID NO: 8.In one embodiment, the nucleotide sequence encoding IFNe comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9. In one embodiment, the nucleotide sequence encoding IFNe comprises a nucleotide sequence having at least 40%, at least 50%, at least 60 %, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5% identity with SEQ ID NO: 9, wherein said nucleotide sequence encodes a protein having substantially the same function as the IFNe protein of SEQ ID NO: 8.

В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая IFN типа I, оптимизирована по кодонам.In one embodiment, the nucleotide sequence encoding type I IFN is codon optimized.

Интерферон типа II- интерферон-γ (IFNy).Type II interferon is interferon-γ (IFNy).

Интерферон-γ (IFNy), также известный как иммунный интерферон, активируется интерлейкином-12 и играет важную роль в регуляции и активации иммунного ответа.Interferon-γ (IFNy), also known as immune interferon, is activated by interleukin-12 and plays an important role in the regulation and activation of the immune response.

Примером аминокислотной последовательности IFNy является:An example of an IFNy amino acid sequence is:

MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCYCQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLG ILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRD DFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ (SEQIDNO:12)MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCYCQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLG ILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRD DFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ (SEQIDNO:12)

Аминокислоты 1-23 SEQ ID NO: 12 могут действовать как сигнальный пептид и расщепляться с образованием зрелого белка, который представлен аминокислотами 24-161 SEQ ID NO: 12. Примером зрелой аминокислотной последовательности IFNy является:Amino acids 1-23 SEQ ID NO: 12 can act as a signal peptide and are cleaved to form a mature protein, which is represented by amino acids 24-161 SEQ ID NO: 12. An example of a mature IFNy amino acid sequence is:

QDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYF KLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHEL IQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ (SEQIDNO:13)QDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYF KLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHEL IQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ (SEQIDNO:13)

В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая IFNy, кодирует белок IFNy, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или 13. В одном вариантеIn one embodiment, the nucleotide sequence encoding IFNy encodes an IFNy protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or 13. In one embodiment

- 23 046120 осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая IFNy, кодирует белок IFNy, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,5% идентичности с SEQ ID NO: 12 или 13, и где функциональность белка IFNy, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или 13, в основном сохраняется.- 23 046120 implementation of the nucleotide sequence encoding IFNy encodes an IFNy protein comprising an amino acid sequence having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 90%, at least 91%, according to at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5% identity with SEQ ID NO: 12 or 13, and wherein the functionality of the IFNy protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or 13 is substantially retained.

Еще одним примером аминокислотной последовательности IFNy является:Another example of an IFNy amino acid sequence is:

MNATHCILALQLFLMAVSGCYCHGTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRMNATHCILALQLFLMAVSGCYCHGTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWR

NWQKDGDMKILQSQIISFYLRLFEVLKDNQAISNNISVIESHLITTFFSNSKAKKDAFMSINWQKDGDMKILQSQIISFYLRLFEVLKDNQAISNNISVIESHLITTFFSNSKAKKDAFMSI

AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC (SEQIDNO:17)AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC (SEQIDNO:17)

В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая IFNy, кодирует белок IFNy, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая IFNy, кодирует белок IFNy, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,5% идентичности с SEQ ID NO: 17, и где функциональность белка IFNy, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, в основном сохраняется.In one embodiment, the nucleotide sequence encoding IFNy encodes an IFNy protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17. In one embodiment, the nucleotide sequence encoding IFNy encodes an IFNy protein comprising an amino acid sequence having at least 70% at least 75%, at least 80%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96 %, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5% identity with SEQ ID NO: 17, and where the functionality of the IFNy protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, mostly preserved.

Примером нуклеотидной последовательности, кодирующей IFNy, является:An example of a nucleotide sequence encoding IFNy is:

ATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTTTCAGCTCTGCATCGTTTTGGGTTCTATGAAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTTTCAGCTCTGCATCGTTTTGGGTTCT

CTTGGCTGTTACTGCCAGGACCCATATGTAAAAGAAGCAGAAAACCTTAAGAAATA TTTTAATGCAGGTCATTCAGATGTAGCGGATAATGGAACTCTTTTCTTAGGCATTTTG AAGAATTGGAAAGAGGAGAGTGACAGAAAAATAATGCAGAGCCAAATTGTCTCCTT TTACTTCAAACTTTTTAAAAACTTTAAAGATGACCAGAGCATCCAAAAGAGTGTGGA GACCATCAAGGAAGACATGAATGTCAAGTTTTTCAATAGCAACAAAAAGAAACGAGCTTGGCTGTTACTGCCAGGACCCATATGTAAAAGAAGCAGAAAACCTTAAGAAATA TTTTAATGCAGGTCATTCAGATGTAGCGGATAATGGAACTCTTTTCTTAGGCATTTTG AAGAATTGGAAAGAGGAGAGTGACAGAAAAATAATGCAGAGCCAAATTGTCTCCTT TTACTTCAAACTTTTTAAAAACTTTAAAGATGACCAGAGCATCCAAAAGAGTGTGGA GACCATCAAGGAAGACATGAATG TCAAGTTTTTCAATAGCAACAAAAAGAAACGAG

ATGACTTCGAAAAGCTGACTAATTATTCGGTAACTGACTTGAATGTCCAACGCAAAG CAATACATGAACTCATCCAAGTGATGGCTGAACTGTCGCCAGCAGCTAAAACAGGG AAGCGAAAAAGGAGTCAGATGCTGTTTCGAGGTCGAAGAGCATCCCAGTAA (SEQIDNO:14)ATGACTTCGAAAAGCTGACTAATTATTCGGTAACTGACTTGAATGTCCAACGCAAAG CAATACATGAACTCATCCAAGTGATGGCTGAACTGTCGCCAGCAGCTAAAACAGGG AAGCGAAAAAGGAGTCAGATGCTGTTTCGAGGTCGAAGAGCATCCCAGTAA (SEQIDNO:14)

Примером нуклеотидной последовательности, кодирующей зрелую форму IFNy, является:An example of a nucleotide sequence encoding the mature form of IFNy is:

CAGGACCCATATGTAAAAGAAGCAGAAAACCTTAAGAAATATTTTAATGCAGCAGGACCCATATGTAAAAGAAGCAGAAAACCTTAAGAAAATTTTTAATGCAG

GTCATTCAGATGTAGCGGATAATGGAACTCTTTTCTTAGGCATTTTGAAGAATTGGAGTCATTCAGATGTAGCGGATAATGGAACTCTTTTCTTAGGCATTTTGAAGAATTGGA

AAGAGGAGAGTGACAGAAAAATAATGCAGAGCCAAATTGTCTCCTTTTACTTCAAA CTTTTTAAAAACTTTAAAGATGACCAGAGCATCCAAAAGAGTGTGGAGACCATCAA GGAAGACATGAATGTCAAGTTTTTCAATAGCAACAAAAAGAAACGAGATGACTTCG AAAAGCTGACTAATTATTCGGTAACTGACTTGAATGTCCAACGCAAAGCAATACAT GAACTCATCCAAGTGATGGCTGAACTGTCGCCAGCAGCTAAAACAGGGAAGCGAAA AAGGAGTCAGATGCTGTTTCGAGGT (SEQ ID NO: 15)AAGAGGAGAGTGACAGAAAAATAATGCAGAGCCAAATTGTCTCCTTTTACTTCAAA CTTTTTAAAAACTTTAAAGATGACCAGAGCATCCAAAAGAGTGTGGAGACCATCAA GGAAGACATGAATGTCAAGTTTTTCAATAGCAACAAAAAGAAACGAGATGACTTCG AAAAGCTGACTAATTATTCGGTAACTGACTTGAATGTCCAACGCAAAGCAATACAT GAACTCATCCAAGTGATGGCTGAACTG TCGCCAGCAGCTAAAACAGGGAAGCGAAA AAGGAGTCAGATGCTGTTTCGAGGT (SEQ ID NO: 15)

- 24 046120- 24 046120

Дополнительным примером нуклеотидной последовательности, кодирующей IFNy, является:An additional example of a nucleotide sequence encoding IFNy is:

ATGAACGCTACACACTGCATCTTGGCTTTGCAGCTCTTCCTCATGGCTGTTTCATGAACGCTACACACTGCATCTTGGCTTTGCAGCTCTTCCTCATGGCTGTTTC

TGGCTGTTACTGCCACGGCACAGTCATTGAAAGCCTAGAAAGTCTGAATAACTATTT TAACTCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAAAAGAGTCTCTTCTTGGATATCTGGAGGATGGCTGTTACTGCCACGGCACAGTCATTGAAAGCCTAGAAAGTCTGAATAACTATTT TAACTCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAAAAGAGTCTCTTCTTGGATATCTGGAGGA

ACTGGCAAAAGGATGGTGACATGAAAATCCTGCAGAGCCAGATTATCTCTTTCTACC TCAGACTCTTTGAAGTCTTGAAAGACAATCAGGCCATCAGCAACAACATAAGCGTC ATTGAATCACACCTGATTACTACCTTCTTCAGCAACAGCAAGGCGAAAAAGGATGCACTGGCAAAAGGATGGTGACATGAAAATCCTGCAGAGCCAGATTATCTCTTTCTACC TCAGACTCTTTGAAGTCTTGAAAGACAATCAGGCCATCAGCAACAACATAAGCGTC ATTGAATCACACCTGATTACTACCTTCTTCAGCAACAGCAAGGCGAAAAAGGATGC

ATTCATGAGTATTGCCAAGTTTGAGGTCAACAACCCACAGGTCCAGCGCCAAGCATT CAATGAGCTCATCCGAGTGGTCCACCAGCTGTTGCCGGAATCCAGCCTCAGGAAGC GGAAAAGGAGTCGCTGCTGA (SEQIDNO:16)ATTCATGAGTATTGCCAAGTTTTGAGGTCAACAACCCACAGGTCCAGCGCCAAGCATT CAATGAGCTCATCCGAGTGGTCCACCAGCTGTTGCCGGAATCCAGCCTCAGGAAGC GGAAAAGGAGTCGCTGCTGA (SEQIDNO:16)

В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая IFNy, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14, 15 или 16. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая IFNy, содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,5% идентичности с SEQ ID NO: 14, 15 или 16, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует белок, имеющий по существу ту же функцию, что и белок SEQ ID NO: 12 или 13.In one embodiment, the nucleotide sequence encoding IFNy comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14, 15, or 16. In one embodiment, the nucleotide sequence encoding IFNy comprises a nucleotide sequence having at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99 .5% identity to SEQ ID NO: 14, 15 or 16, wherein said nucleotide sequence encodes a protein having substantially the same function as the protein of SEQ ID NO: 12 or 13.

Дополнительным примером нуклеотидной последовательности, кодирующей IFNy, является:An additional example of a nucleotide sequence encoding IFNy is:

ATGAACGCTACACACTGCATCTTGGCTTTGCAGCTCTTCCTCATGGCTGTTTCATGAACGCTACACACTGCATCTTGGCTTTGCAGCTCTTCCTCATGGCTGTTTC

TGGCTGTTACTGCCACGGCACAGTCATTGAAAGCCTAGAAAGTCTGAATAACTATTT TAACTCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAAAAGAGTCTCTTCTTGGATATCTGGAGGATGGCTGTTACTGCCACGGCACAGTCATTGAAAGCCTAGAAAGTCTGAATAACTATTT TAACTCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAAAAGAGTCTCTTCTTGGATATCTGGAGGA

ACTGGCAAAAGGATGGTGACATGAAAATCCTGCAGAGCCAGATTATCTCTTTCTACC TCAGACTCTTTGAAGTCTTGAAAGACAATCAGGCCATCAGCAACAACATAAGCGTC ATTGAATCACACCTGATTACTACCTTCTTCAGCAACAGCAAGGCGAAAAAGGATGCACTGGCAAAAGGATGGTGACATGAAAATCCTGCAGAGCCAGATTATCTCTTTCTACC TCAGACTCTTTGAAGTCTTGAAAGACAATCAGGCCATCAGCAACAACATAAGCGTC ATTGAATCACACCTGATTACTACCTTCTTCAGCAACAGCAAGGCGAAAAAGGATGC

ATTCATGAGTATTGCCAAGTTTGAGGTCAACAACCCACAGGTCCAGCGCCAAGCATT CAATGAGCTCATCCGAGTGGTCCACCAGCTGTTGCCGGAATCCAGCCTCAGGAAGC GGAAAAGGAGTCGCTGCTGA (SEQ ID NO: 18)ATTCATGAGTATTGCCAAGTTTTGAGGTCAACAACCCACAGGTCCAGCGCCAAGCATT CAATGAGCTCATCCGAGTGGTCCACCAGCTGTTGCCGGAATCCAGCCTCAGGAAGC GGAAAAGGAGTCGCTGCTGA (SEQ ID NO: 18)

В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая IFNy, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 18. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая IFNy, содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,5% идентичности с SEQ ID NO: 18, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует белок, имеющий по существу ту же функцию, что и белок SEQ ID NO: 17.In one embodiment, the nucleotide sequence encoding IFNy comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18. In one embodiment, the nucleotide sequence encoding IFNy comprises a nucleotide sequence having at least 40%, at least 50%, at least 60 %, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5% identity with SEQ ID NO: 18, wherein said nucleotide sequence encodes a protein having substantially the same function as the protein of SEQ ID NO: 17.

В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая IFNy, оптимизирована по кодонам.In one embodiment, the nucleotide sequence encoding IFNy is codon optimized.

Фактор некроза опухоли a (TNFa).Tumor necrosis factor a (TNFa).

Фактор некроза опухоли a (TNFa) представляет собой цитокин, который участвует в системном воспалении. Его основная роль заключается в регуляции иммунных клеток.Tumor necrosis factor a (TNFa) is a cytokine that is involved in systemic inflammation. Its main role is to regulate immune cells.

TNFa в основном продуцируется активированными макрофагами, но также продуцируется другими типами клеток, такими как CD4+ лимфоциты, NK-клетки, нейтрофилы, тучные клетки, эозинофилы и нейроны.TNFa is primarily produced by activated macrophages, but is also produced by other cell types such as CD4+ lymphocytes, NK cells, neutrophils, mast cells, eosinophils, and neurons.

- 25 046120- 25 046120

Примером аминокислотной последовательности TNFa является:An example of the amino acid sequence of TNFa is:

MSTESMIRDVELAEEALPQKMGGFQNSRRCLCLSLFSFLLVAGATTLFCLLNFGV IGPQRDEKFPNGLPLISSMAQTLTLRSSSQNSSDKPVAHVVANHQVEEQLEWLSQRANA LLANGMDLKDNQLVVPADGLYLVYSQVLFKGQGCPDYVLLTHTVSRFAISYQEKVNLL SAVKSPCPKDTPEGAELKPWYEPIYLGGVFQLEKGDQLSAEVNLPKYLDFAESGQVYFG VIAL (SEQ ID NO: 19)MSTESMIRDVELAEEALPQKMGGFQNSRRCLCLSLFSFLLVAGATTLFCLLNFGV IGPQRDEKFPNGLPLISSMAQTLTLRSSSQNSSDKPVAHVVANHQVEEQLEWLSQRANA LLANGMDLKDNQLVVPADGLYLVYSQVLFKGQGCPDYVLLTHTVSRFAISYQEKVNLL SAVKSPCPKDTPEGAELKPWYEPIYL GGVFQLEKGDQLSAEVNLPKYLDFAESGQVYFG VIAL (SEQ ID NO: 19)

В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая TNFa, кодирует белок TNFa, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая TNFa, кодирует белок TNFa, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,5% идентичности с SEQ ID NO: 19, и где функциональность белка TNFa, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, в основном сохраняется.In one embodiment, the nucleotide sequence encoding TNFa encodes a TNFa protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. In one embodiment, the nucleotide sequence encoding TNFa encodes a TNFa protein comprising an amino acid sequence having at least 70% at least 75%, at least 80%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96 %, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5% identity with SEQ ID NO: 19, and where the functionality of the TNFa protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, mostly preserved.

Примером нуклеотидной последовательности, кодирующей TNFa, является:An example of a nucleotide sequence encoding TNFa is:

ATGAGCACAGAAAGCATGATCCGCGACGTGGAACTGGCAGAAGAGGCACTC CCCCAAAAGATGGGGGGCTTCCAGAACTCCAGGCGGTGCCTATGTCTCAGCCTCTTC TCATTCCTGCTTGTGGCAGGGGCCACCACGCTCTTCTGTCTACTGAACTTCGGGGTG ATCGGTCCCCAAAGGGATGAGAAGTTCCCAAATGGCCTCCCTCTCATCAGTTCTATG GCCCAGACCCTCACACTCAGATCATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCC CACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGAGGAGCAGCTGGAGTGGCTGAGCCAGCGCGC CAACGCCCTCCTGGCCAACGGCATGGATCTCAAAGACAACCAACTAGTGGTGCCAG CCGATGGGTTGTACCTTGTCTACTCCCAGGTTCTCTTCAAGGGACAAGGCTGCCCCG ACTACGTGCTCCTCACCCACACCGTCAGCCGATTTGCTATCTCATACCAGGAGAAAG TCAACCTCCTCTCTGCCGTCAAGAGCCCCTGCCCCAAGGACACCCCTGAGGGGGCTG AGCTCAAACCCTGGTATGAGCCCATATACCTGGGAGGAGTCTTCCAGCTGGAGAAG GGGGACCAACTCAGCGCTGAGGTCAATCTGCCCAAGTACTTAGACTTTGCGGAGTCC GGGCAGGTCTACTTTGGAGTCATTGCTCTG (SEQ ID NO:20)ATGAGCACAGAAAGCATGATCCGCGACGTGGAACTGGCAGAAGAGGCACTC CCCCAAAAGATGGGGGGCTTCCAGAACTCCAGGCGGTGCCTATGTCTCAGCCCTTC TCATTCCTGCTTGTGGCAGGGGCCACCACGCTCTTCTGTCTACTGAACTTCGGGGTG ATCGGTCCCCAAAGGGATGAGAAGTTCCCAAATGGCCTCCCTCTCATCAGTTCTATG GCCCAGACCTCACACTCAGAT CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCC CACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGAGGAGCAGCTGGAGTGGCTGAGCCAGCGCGC CAACGCCCTCCTGGCCAACGGCATGGATCTCAAAGACAACCAACTAGTGGTGCCAG CCGATGGGTTGTACCTTGTCTACTCCCAGGTTCTCTTCAAGGGACAAGGCTGCCCCG ACTACGTGCTCCTCACCCACACCGTCAGCCGATTTGCTAT CTCATACCAGGAGAAAG TCAACCTCCTCTCTGCCGTCAAGAGCCCCTGCCCCAAGGACACCCCTGAGGGGGCTG AGCTCAAACCCTGGTATGAGCCCATATACCTGGGGAGGAGTCTTCCAGCTGGAGAAG GGGGACCAACTCAGCGCTGAGGTCAATCTGCCCAAGTACTTAGACTTTGCGGAGTCC GGGCAGGTCTACTTTGGAGTCATTGCTCTG (SEQ ID NO:20)

В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая TNFa, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 20. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая TNFa, содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,5% идентичности с SEQ ID NO: 20, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует белок, имеющий по существу ту же функцию, что и белок SEQ ID NO: 19.In one embodiment, the nucleotide sequence encoding TNFa comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20. In one embodiment, the nucleotide sequence encoding TNFa comprises a nucleotide sequence having at least 40%, at least 50%, at least 60 %, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5% identity with SEQ ID NO: 20, wherein said nucleotide sequence encodes a protein having substantially the same function as the protein of SEQ ID NO: 19.

1-Метил-триптофан (1-MT).1-Methyl-tryptophan (1-MT).

1-Метилтриптофан (1-MT) является ингибитором триптофан катаболического фермента индоламина 2,3-диоксигеназы (IDO) и имеет структуру:1-Methyltryptophan (1-MT) is an inhibitor of the tryptophan catabolic enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) and has the structure:

1-MT по настоящему изобретению может присутствовать в виде соли или сложного эфира, в частности, фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира.The 1-MT of the present invention may be present in the form of a salt or ester, in particular a pharmaceutically acceptable salt or ester.

- 26 046120- 26 046120

В одном варианте осуществления 1-ML представляет собой D-1-MT. В одном варианте осуществления 1-ML представляет собой L-1-MT. В одном варианте осуществления 1-ML представляет собой рацемическую смесь.In one embodiment, 1-ML is D-1-MT. In one embodiment, 1-ML is L-1-MT. In one embodiment, 1-ML is a racemic mixture.

Фармацевтически приемлемые соли агентов по изобретению включают подходящие соли присоединения кислоты или основания. Обзор подходящих фармацевтических солей можно найти в Berge et al. (1977) J Pharm Sci 66: 1-19.Pharmaceutically acceptable salts of the agents of the invention include suitable acid or base addition salts. A review of suitable pharmaceutical salts can be found in Berge et al. (1977) J Pharm Sci 66: 1-19.

Изобретение также включает, где необходимо, все энантиомеры и таутомеры агентов. Специалист в данной области определит соединения, которые обладают оптическими свойствами (например, одним или несколькими хиральными атомами углерода) или таутомерными характеристиками. Соответствующие энантиомеры и/или таутомеры могут быть выделены/получены способами, известными в данной области.The invention also includes, where appropriate, all enantiomers and tautomers of the agents. One skilled in the art will identify compounds that have optical properties (eg, one or more chiral carbon atoms) or tautomeric characteristics. The corresponding enantiomers and/or tautomers can be isolated/obtained by methods known in the art.

Целевая последовательность-мишень микро РНК.MicroRNA target sequence.

Гены микроРНК размещены по всем хромосомам человека, кроме Y-хромосомы. Они могут находиться либо в некодирующих областях генома, либо в интронах генов, кодирующих белки. Около 50% микроРНК появляются в кластерах, которые транскрибируются как полицистронные первичные транскрипты. Подобно генам, кодирующим белок, микроРНК обычно транскрибируются с промоторов полимеразы-II, генерируя так называемый первичный транскрипт микроРНК (pri-микроРНК). Затем этот pri-микроРНК обрабатывается серией стадий эндонуклеолитического расщепления, выполняемых двумя ферментами, принадлежащими к семейству РНКаз типа III, Drosha и Dicer. Из pri-микроРНК стволовая петля длиной около 60 нуклеотидов, называемая предшественником микроРНК (pre-микроРНК), иссекается специфическим ядерным комплексом, состоящим из гена критической области синдрома Дроша и ДиДжорджа (DGCR8), который обрезает обе цепи около основания первичной стволовой петли и оставляет 5'фосфат и 2 bp в длину, 3' липкий конец ДНК. pre-микроРНК затем активно транспортируется из ядра в цитоплазму с помощью RAN-GTP и Exportin. Затем Dicer выполняет двунитевой разрез на конце стеблевой петли, не определяемой разрезом Дроша, генерируя дуплекс 19-24 bp, который состоит из зрелой микроРНК и противоположной нити дуплекса, называемой микроРНК*. В соответствии с правилом термодинамической асимметрии, только одна цепь дуплекса селективно загружается в индуцированный РНК комплекс сайленсинга (RISC) и накапливается в виде зрелой микроРНК. Эта цепь обычно является той, у которой 5'-конец менее плотно спарен с его комплементом, что было продемонстрировано однонуклеотидными несоответствиями, введенными в 5'-конец каждой цепи дуплексов миРНК. Однако есть некоторые микроРНК, которые поддерживают накопление обеих дуплексных нитей в одинаковой степени.MicroRNA genes are located on all human chromosomes except the Y chromosome. They can be located either in non-coding regions of the genome or in introns of protein-coding genes. About 50% of miRNAs appear in clusters that are transcribed as polycistronic primary transcripts. Like protein-coding genes, miRNAs are typically transcribed from polymerase-II promoters, generating the so-called primary miRNA transcript (pri-miRNA). This pri-miRNA is then processed through a series of endonucleolytic cleavage steps performed by two enzymes belonging to the type III RNase family, Drosha and Dicer. From the pri-miRNA, a stem loop of about 60 nucleotides in length, called the precursor miRNA (pre-miRNA), is excised by a specific nuclear complex consisting of the Drosh and DiGeorge syndrome critical region gene (DGCR8), which trims both strands near the base of the primary stem loop and leaves 5 'phosphate and 2 bp long, 3' DNA sticky end. The pre-miRNA is then actively transported from the nucleus to the cytoplasm by RAN-GTP and Exportin. Dicer then makes a double-strand cut at the end of the stem loop not defined by the Drosha cut, generating a 19-24 bp duplex that consists of the mature miRNA and the opposite strand of the duplex, called miRNA*. According to the rule of thermodynamic asymmetry, only one strand of the duplex is selectively loaded into the RNA-induced silencing complex (RISC) and accumulates as mature miRNA. This strand is typically the one whose 5' end is less tightly paired with its complement, as demonstrated by single nucleotide mismatches introduced into the 5' end of each strand of siRNA duplexes. However, there are some microRNAs that support the accumulation of both duplex strands to the same extent.

МикроРНК запускают PHKi, очень похожие на малые интерферирующие РНК (миРНК), которые широко используются для экспериментального нокдауна генов.MicroRNAs trigger RNAi, very similar to small interfering RNAs (siRNAs), which are widely used for experimental gene knockdown.

Основное различие между микроРНК и миРНК заключается в их биогенезе. После загрузки в RISC направляющая цепь малой молекулы РНК взаимодействует с последовательностями-мишенями мРНК, которые преимущественно находятся в З'-нетранслируемой области (3'UTR) генов, кодирующих белок. Было показано, что нуклеотиды 2-8, подсчитанные от 5'-конца микроРНК, так называемая порождающая последовательность, необходимы для запуска PHKi. Если вся последовательность направляющей цепи идеально комплементарна мРНК-мишени, как это обычно имеет место в случае миРНК и микроРНК растений, мРНК эндонуклеолитически расщепляется с участием белка Argonaute (Ago), также называемого слайсер малого дуплекса РНК в индуцированном РНК комплексе сайленсинга (RISC). DGRC (ген критической области синдрома DiGeorge 8) и TRBP (TAR (HIV) РНК-связывающий белок 2) представляют собой двухцепочечные РНК-связывающие белки, которые способствуют биогенезу зрелой микроРНК ферментами Drosha и Dicer RNase III, соответственно. Направляющая цепь дуплекса микроРНК включается в эффекторный комплекс RISC, который распознает специфические мишени посредством несовершенного спаривания оснований и индуцирует посттранскрипционный сайленсинг гена. Для этого способа регуляции было предложено несколько механизмов: микроРНК могут индуцировать репрессию инициации трансляции, маркировать мРНК-мишени для деградации путем деаденилирования или изолировать мишени в Р-теле цитоплазмы.The main difference between miRNAs and miRNAs is their biogenesis. Once loaded into RISC, the guide strand of the small RNA molecule interacts with target mRNA sequences that are predominantly located in the 3' untranslated region (3'UTR) of protein-coding genes. It has been shown that nucleotides 2-8 counted from the 5' end of the miRNA, the so-called seed sequence, are required to trigger RNAi. If the entire guide strand sequence is perfectly complementary to the target mRNA, as is typically the case with plant miRNAs and microRNAs, the mRNA is endonucleolytically cleaved by the Argonaute (Ago) protein, also called the small duplex RNA slicer in the RNA-induced silencing complex (RISC). DGRC (DiGeorge syndrome critical region gene 8) and TRBP (TAR (HIV) RNA-binding protein 2) are double-stranded RNA-binding proteins that promote the biogenesis of mature microRNA by the Drosha and Dicer RNase III enzymes, respectively. The guide strand of the miRNA duplex is incorporated into the RISC effector complex, which recognizes specific targets through imperfect base pairing and induces posttranscriptional gene silencing. Several mechanisms have been proposed for this mode of regulation: microRNAs can induce repression of translation initiation, mark target mRNAs for degradation by deadenylation, or sequester targets in the cytoplasmic P body.

С другой стороны, если только порождающая последовательность идеально дополняет мРНКмишень, но оставшиеся основания демонстрируют неполное спаривание, PHKi действует через множество механизмов, ведущих к трансляционной репрессии. Эукариотическая деградация мРНК в основном происходит за счет укорочения концца polyA на З'-конце мРНК и расщепления на 5'-конце с последующим расщеплением 5'-3'-экзонуклеазой и накоплением микроРНК в отдельных цитоплазматических областях, так называемые Р-тела, обогащенные компонентами механизма распада мРНК.On the other hand, if only the originator sequence perfectly complements the target mRNA, but the remaining bases exhibit incomplete pairing, RNAi acts through multiple mechanisms leading to translational repression. Eukaryotic degradation of mRNA mainly occurs due to shortening of the polyA end at the 3' end of the mRNA and cleavage at the 5' end, followed by cleavage by 5'-3' exonuclease and accumulation of microRNAs in separate cytoplasmic regions, the so-called P-bodies enriched with components mechanism of mRNA decay.

Согласно настоящему изобретению экспрессия цитокина, такого как IFN типа I, регулируется эндогенными микроРНК с использованием соответствующих последовательностей-мишеней микроРНК. Используя этот метод, микроРНК, эндогенно экспрессируемая в клетке, предотвращает или уменьшает экспрессию трансгена в этой клетке путем связывания с соответствующей последовательностью-мишенью микроРНК, расположенной в векторе или полинуклеотиде. Это имеет ряд преимуществ по сравнению с использованием тканеспецифичных промоторов, не в последнюю очередь тот факт, что тканеспецифичные промоторы часто связаны с негерметичной экспрессией во фракции клеток, не являющихся мишенью.According to the present invention, the expression of a cytokine, such as type I IFN, is regulated by endogenous microRNAs using corresponding miRNA target sequences. Using this method, a miRNA endogenously expressed in a cell prevents or reduces the expression of a transgene in that cell by binding to the corresponding miRNA target sequence located in the vector or polynucleotide. This has a number of advantages over the use of tissue-specific promoters, not least the fact that tissue-specific promoters are often associated with leaky expression in a fraction of non-target cells.

- 27 046120- 27 046120

Последовательности-мишени микроРНК, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, представляют собой последовательности-мишени микроРНК, которые экспрессируются в HSC, но которые не экспрессируются широко в дифференцированных клетках, например, миелоидных клетках (включая макрофаги, инфильтрирующие опухоль). Это особенно важно, поскольку известно, что экспрессия IFNa токсична для HSC.MicroRNA target sequences that can be used in the present invention are miRNA target sequences that are expressed in HSCs, but which are not widely expressed in differentiated cells, such as myeloid cells (including tumor-infiltrating macrophages). This is especially important since IFNa expression is known to be toxic to HSCs.

Предпочтительными примерами последовательностей-мишеней микроРНК для применения в изобретении являются mir-130a и mir-126.Preferred examples of microRNA target sequences for use in the invention are mir-130a and mir-126.

Связывание микроРНК mir-126 с последовательностью-мишенью mir-126 наиболее эффективно блокирует экспрессию в HSC и в клетках эритроидной линии. Таким образом, последовательностьмишень mir-126 особенно подходит для применений в генной терапии, основанной на надежной экспрессии трансгена в миелоидной и лимфоидной линии.Binding of microRNA mir-126 to the target sequence mir-126 most effectively blocks expression in HSCs and erythroid lineage cells. Thus, the mir-126 target sequence is particularly suitable for gene therapy applications based on robust transgene expression in myeloid and lymphoid lineages.

МикроРНК mir-126 может иметь нуклеотидную последовательность: UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG (SEQ ID NO:1).MicroRNA mir-126 may have the nucleotide sequence: UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG (SEQ ID NO:1).

В одном варианте осуществления последовательность-мишень mir-126 содержит нуклеотидную последовательность GCATTATTACTCACGGTACGA (SEQ ID NO:2).In one embodiment, the mir-126 target sequence comprises the nucleotide sequence GCATTATTACTCACGGTACGA (SEQ ID NO:2).

В одном варианте осуществления вектор или полинуклеотид, используемый в настоящем изобретении, содержит, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или, по меньшей мере, три копии нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2. В предпочтительном варианте осуществления последовательность-мишень mir-126 содержит две копии нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2.In one embodiment, the vector or polynucleotide used in the present invention contains at least one, at least two, or at least three copies of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2. In a preferred embodiment, the target sequence mir -126 contains two copies of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2.

В одном варианте осуществления HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клеткапредшественник, макрофаг или моноцит, используемые в настоящем изобретении, содержат по меньшей мере одну, по меньшей мере две или по меньшей мере три копии нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2. В предпочтительном варианте осуществления последовательность-мишень mir-126 содержит две копии нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2.In one embodiment, the HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, or monocyte used in the present invention contain at least one, at least two, or at least three copies of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2. In a preferred embodiment In an embodiment, the mir-126 target sequence contains two copies of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2.

Копии последовательностей-мишеней 126 могут быть разделены спейсерной последовательностью. Спейсерная последовательность может содержать по меньшей мере одно, по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре или по меньшей мере пять нуклеотидных оснований.Copies of target sequences 126 may be separated by a spacer sequence. The spacer sequence may contain at least one, at least two, at least three, or at least four or at least five nucleotide bases.

Связывание микроРНК mir-130a с последовательностью-мишенью mir-130a наиболее эффективно блокирует экспрессию в HSC и в клетках эритроидной линии (аналогично miR-126). Таким образом, последовательность-мишень mir-130a особенно подходит для применений в генной терапии, основанной на надежной экспрессии трансгена в миелоидной и лимфоидной линии.Binding of miRNA mir-130a to the target sequence mir-130a most effectively blocks expression in HSCs and erythroid lineage cells (similar to miR-126). Thus, the mir-130a target sequence is particularly suitable for gene therapy applications based on robust transgene expression in myeloid and lymphoid lineages.

МикроРНК mir-130a может иметь нуклеотидную последовательность: CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU (SEQ ID NO:3).MicroRNA mir-130a may have the nucleotide sequence: CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU (SEQ ID NO:3).

В одном варианте осуществления последовательность-мишень mir-130a содержит нуклеотидную последовательность ATGCCCTTTTAACATTGCACTG (SEQ ID NO:4).In one embodiment, the mir-130a target sequence comprises the nucleotide sequence ATGCCCTTTTAACATTGCACTG (SEQ ID NO:4).

В одном варианте осуществления последовательность-мишень mir-130a содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две или по меньшей мере три копии нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4. В предпочтительном варианте осуществления последовательность-мишень mir-130a содержит две копии нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4.In one embodiment, the mir-130a target sequence contains at least one, at least two, or at least three copies of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4. In a preferred embodiment, the mir-130a target sequence contains two copies of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.

Копии целевых последовательностей mir-130a могут быть разделены спейсерной последовательностью. Спейсерная последовательность может содержать по меньшей мере одно, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре или по меньшей мере пять нуклеотидных оснований.Copies of mir-130a target sequences can be separated by a spacer sequence. The spacer sequence may contain at least one, at least two, at least three, at least four, or at least five nucleotide bases.

В одном варианте осуществления вектор содержит две копии целевой последовательности mir-126 и две копии целевой последовательности mir-130a.In one embodiment, the vector contains two copies of the mir-126 target sequence and two copies of the mir-130a target sequence.

В одном варианте осуществления две копии последовательности-мишени mir-126 и две копии последовательности-мишени mir-130a содержатся в нуклеотидной последовательности:In one embodiment, two copies of the mir-126 target sequence and two copies of the mir-130a target sequence are contained in the nucleotide sequence:

GCATTATTACTCACGGTACGACGATGCATTATTACTCACGGTACGAACGCGCATTATTACTCACGGTACGACGATGCATTATTACTCACGGTACGAACGC

GTATGCCCTTTTAACATTGCACTGATGCATATGCCCTTTTAACATTGCACTG (SEQ ID NO:5).GTATGCCCTTTTAACATTGCACTGATGCATATGCCCTTTTAACATTGCACTG (SEQ ID NO:5).

Комбинированная целевая последовательность, например, целевая последовательность, содержащая две копии целевой последовательности mir-126 и две копии целевой последовательности mir-130a, является особенно предпочтительной для использования в настоящем изобретении, поскольку использование этой комбинации максимизирует репрессию вектора в HSC и экспрессию в миелоидном потомстве.A combination target sequence, for example a target sequence containing two copies of the mir-126 target sequence and two copies of the mir-130a target sequence, is particularly preferred for use in the present invention because the use of this combination maximizes vector repression in HSCs and expression in myeloid progeny.

Кроме того, при использовании комбинации-мишени подавление трансгена в HSC обеспечивается двумя независимыми микроРНК, и риск вмешательства в эндогенную регуляцию микроРНК снижается, что повышает безопасность и эффективность последовательности-мишени.In addition, when using a target combination, transgene silencing in HSC is mediated by two independent miRNAs, and the risk of interfering with endogenous miRNA regulation is reduced, thereby increasing the safety and efficacy of the target sequence.

Вектор.Vector.

Вектор представляет собой инструмент, который позволяет или облегчает перенос объекта из одной среды в другую. В соответствии с настоящим изобретением и в качестве примера, некоторые векторы,A vector is a tool that allows or facilitates the transfer of an object from one environment to another. In accordance with the present invention and by way of example, some vectors

- 28 046120 используемые в технологиях рекомбинантных нуклеиновых кислот, позволяют переносить объекты, такие как сегмент нуклеиновой кислоты (например, гетерологичный сегмент ДНК, такой как гетерологичный сегмент Cdna), в клетку-мишень. Вектор может служить для поддержания гетерологичной нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) внутри клетки, облегчения репликации вектора, содержащего сегмент нуклеиновой кислоты, или облегчения экспрессии белка, кодируемого сегментом нуклеиновой кислоты. Векторы могут быть не вирусными или вирусными. Примеры векторов, используемых в технологиях рекомбинантных нуклеиновых кислот, включают, но не ограничиваются ими, плазмиды, хромосомы, искусственные хромосомы и вирусы. Вектором также может быть, например, простая нуклеиновая кислота (например, ДНК). В своей простейшей форме вектор может представлять собой интересующий нуклеотид.- 28 046120 used in recombinant nucleic acid technologies allow the transfer of objects, such as a nucleic acid segment (for example, a heterologous DNA segment, such as a heterologous Cdna segment), into a target cell. The vector may serve to maintain heterologous nucleic acid (DNA or RNA) within a cell, facilitate replication of the vector containing the nucleic acid segment, or facilitate expression of the protein encoded by the nucleic acid segment. Vectors may be non-viral or viral. Examples of vectors used in recombinant nucleic acid technologies include, but are not limited to, plasmids, chromosomes, artificial chromosomes, and viruses. The vector can also be, for example, a simple nucleic acid (eg DNA). In its simplest form, a vector may represent a nucleotide of interest.

Векторы, используемые в изобретении, могут быть, например, плазмидными или вирусными векторами и могут включать в себя промотор для экспрессии полинуклеотида и, необязательно, регулятор промотора. В предпочтительном варианте осуществления вектор представляет собой вирусный вектор.Vectors used in the invention may be, for example, plasmid or viral vectors and may include a promoter for expression of the polynucleotide and, optionally, a promoter regulator. In a preferred embodiment, the vector is a viral vector.

Векторы, содержащие полинуклеотиды, используемые в изобретении, могут быть введены в клетки с использованием различных методик, известных в данной области, таких как трансформация, трансфекция и трансдукция. В данной области известно несколько методик, например, трансдукция рекомбинантными вирусными векторами, такими как ретровирусные, лентивирусные, аденовирусные, аденоассоциированные вирусные, бакуловирусные и вирус простого герпеса, векторы Sleeping Beauty; прямая инъекция нуклеиновых кислот и биолистическая трансформация.Vectors containing the polynucleotides used in the invention can be introduced into cells using various techniques known in the art, such as transformation, transfection and transduction. Several techniques are known in the art, for example, transduction with recombinant viral vectors such as retroviral, lentiviral, adenoviral, adeno-associated viral, baculovirus and herpes simplex virus, Sleeping Beauty vectors; direct injection of nucleic acids and biolistic transformation.

Невирусные системы доставки включают, но не ограничиваются ими, способы трансфекции ДНК. В данной работе трансфекция включает процесс с использованием невирусного вектора для доставки гена в клетку-мишень. Типичные способы трансфекции включают электропорацию, биолистику ДНК, липид-опосредованную трансфекцию, компактную ДНК-опосредованную трансфекцию, липосомы, иммунолипосомы, липофектин, опосредованную катионными агентами трансфекцию, катионные амфифилы лица (CFA) (Nature Biotechnology 1996 14; 556) и их комбинации.Non-viral delivery systems include, but are not limited to, DNA transfection methods. In this work, transfection involves the process of using a non-viral vector to deliver a gene to a target cell. Typical transfection methods include electroporation, DNA biolistics, lipid-mediated transfection, compact DNA-mediated transfection, liposomes, immunoliposomes, lipofectin, cationic agent-mediated transfection, cationic facial amphiphiles (CFAs) (Nature Biotechnology 1996 14; 556) and combinations thereof.

Термин трансфекция следует понимать как охватывающий доставку полинуклеотидов в клетки посредством как вирусной, так и невирусной доставки.The term transfection should be understood to cover the delivery of polynucleotides into cells via both viral and non-viral delivery.

Кроме того, изобретение может использовать протоколы направленного воздействия на гены, например, доставку ДНК-модифицирующих агентов.In addition, the invention may utilize gene targeting protocols, such as the delivery of DNA-modifying agents.

Вирусные системы доставки включают, но не ограничиваются ими, аденовирусный вектор, аденоассоциированный вирусный (AAV) вектор, ввектор вируса герпеса, ретровирусный вектор, лентивирусный вектор и бакуловирусный вектор.Viral delivery systems include, but are not limited to, adenoviral vector, adeno-associated viral (AAV) vector, herpes virus vector, retroviral vector, lentiviral vector, and baculoviral vector.

Ретровирусы представляют собой РНК-вирусы с жизненным циклом, отличным от жизненного цикла литических вирусов. В этом отношении ретровирус представляет собой инфекционную сущность, которая реплицируется через промежуточную ДНК. Когда ретровирус заражает клетку, ее геном превращается в форму ДНК с помощью фермента обратной транскриптазы. Копия ДНК служит шаблоном для производства новых геномов РНК и кодируемых вирусом белков, необходимых для сборки инфекционных вирусных частиц.Retroviruses are RNA viruses with a life cycle different from that of lytic viruses. In this regard, a retrovirus is an infectious entity that replicates through a DNA intermediate. When a retrovirus infects a cell, its genome is converted into DNA form by the enzyme reverse transcriptase. The DNA copy serves as a template for the production of new RNA genomes and virus-encoded proteins needed to assemble infectious virus particles.

Существует множество ретровирусов, например, вирус мышиной лейкемии (MLV), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус инфекционной анемии лошади (EIAV), вирус опухоли молочной железы мыши (MMTV), вирус саркомы Рауса (RSV), вирус саркомы Фуджинами (FuSV), вирус мышиного лейкоза Молони (Mo-MLV), вирус мышиной остеосаркомы FBR (FBR MSV), вирус мышиной саркомы Молони (Mo-MSV), вирус мышиного лейкоза Абельсона (A-MLV), вирус птичьего миелоцитоматоза-29 (МС29) и вирус птичьего эритробластоза (AEV) и все другие ретровиридии, включая лентивирусы.There are many retroviruses, such as murine leukemia virus (MLV), human immunodeficiency virus (HIV), equine infectious anemia virus (EIAV), mouse mammary tumor virus (MMTV), Rous sarcoma virus (RSV), Fujinami sarcoma virus (FuSV) , Moloney murine leukemia virus (Mo-MLV), FBR murine osteosarcoma virus (FBR MSV), Moloney murine sarcoma virus (Mo-MSV), Abelson murine leukemia virus (A-MLV), avian myelocytomatosis virus-29 (MC29) and avian erythroblastosis (AEV) and all other retroviridia, including lentiviruses.

Подробный перечень ретровирусов можно найти у Coffin et al., Coffin et al. (Retroviruses 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763).A detailed list of retroviruses can be found in Coffin et al., Coffin et al. (Retroviruses 1997 Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763).

Лентивирусы также принадлежат к семейству ретровирусов, но они могут инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки (Lewis et al. (1992) EMBO J. 3053-3058).Lentiviruses also belong to the retrovirus family, but they can infect both dividing and non-dividing cells (Lewis et al. (1992) EMBO J. 3053-3058).

В одном варианте осуществления вектор представляет собой лентивирусный вектор. Промотор.In one embodiment, the vector is a lentiviral vector. Promoter.

В одном варианте осуществления вектор содержит тканеспецифичный промотор. Предпочтительно, тканеспецифичный промотор вызывает специфическую экспрессию в подмножестве инфильтрующих опухоль миелоидных клеток, таких как моноциты, экспрессирующие Tie2, (ТЕМ) или М2поляризованные макрофаги.In one embodiment, the vector contains a tissue-specific promoter. Preferably, the tissue-specific promoter drives specific expression in a subset of tumor-infiltrating myeloid cells, such as Tie2-expressing monocytes (TEMs) or M2-polarized macrophages.

В предпочтительном варианте осуществления тканеспецифичным промотором является промотор ТЕК (Tie2).In a preferred embodiment, the tissue-specific promoter is the TEK promoter (Tie2).

- 29 046120- 29 046120

Примером нуклеотидной последовательности промотора ТЕК является:An example of a TEK promoter nucleotide sequence is:

gatcacgagactagcctcgagtcacacctgcaaactggaaacattaattggttcttaagatcatcatcgacgtgataaaacctggg acagaaattagtcaagactagctgcatctgccttttcctctggtgggtaggaaaaggaggagtataatgatttcctcaggcatgaaggtcgat gatgagcaaagtgtatactctctaatctaatgtcataattcatattgtggagtaattatctggataagtgtagggtctctgacctcattctagatatt gtacattccatggctattttcattttggtccatgaactctctttgctctcatgagcaccatttttatcccaatctaatcctgtatgtttgtgtttttacaca gattagtttttaaatgttatatataatttgcttctgaaacaccattgctcaatgactaccaaatctttctcattaccaaaatccttctatgccaacttctt caagaaatttgatcacctttagatgaattgttaatgaaaattaaagctatagccggcaacatgggtatctttgggctaatggccaaccaacagg ccatctgtgtgaaagaaaacaggctaacaattttggactctggtctcttggggctacattgagcattgacctcaccggtgctcactgaaattaat tgcttttcaggttgtattttctcatcacggaaaccttcttctcccaattcaaaccatgtgggttaaaatgagaaaacaaaagccaaaacggcttcc cacacccaaaagctccttctgtcagagatcccagtagccccgggagagctgttagaagtctgagaaggattggtcatcatcgcataccatac ataggtggagggcttgttattctcagtttcccgcctatgagaggatacccctattgtttctgaaaatgctgaccgggacccacacttccaacaa aaattcctctgcccctacagcagcagcaaaagcagcagcagaagcaacagcaacagataagtgttttgatgaattgcgagatggataggg cttgagtgcccccagccctgctgataccaaatgcctttaagatacagcctttcccatcctaatctacaaaggaaacaggaaaaaggaacttaa aactccctgtgctcagacagaaatgagactgttacagcctgcttctgtgctgttccttcttgcctctaacttgtaaacaagacgtagtaggacga tgctaatggaaagtcacaaaccgctgggtttttgaaaggatcctagactcgagcggccgcca (SEQ ID NO: 10)gatcacgagactagcctcgagtcacacctgcaaactggaaacattaattggttcttaagatcatcatcgacgtgataaaacctggg acagaaattagtcaagactagctgcatctgccttttcctctggtgggtaggaaaaggaggagtataatgatttcctcaggcatgaaggtcgat gatgagcaaagtgtatactctctaatctaatg tcataattcatattgtggagtaattatctggataagtgtagggtctctgacctcattctagatatt gtacattccatggctattttcattttggtccatgaactctctttgctctcatgagcaccatttttatcccaatctaatcctgtatgtttgtgtttttacaca gattagtttttaaatgttatatataatttgcttctgaaacaccattgct caatgactaccaaatctttctcattaccaaaatccttctatgccaacttctt caagaaatttgatcacctttagatgaattgttaatgaaaattaaagctatagccggcaacatgggtatctttgggctaatggccaaccaacagg ccatctgtgtgaaagaaaacaggctaacaattttggactctggtctcttggggctacattgagcattgacctc a taggtggagggcttgttattctcagtttcccgcctatgagaggatacccctattgtttctgaaaatgctgaccgggacccacacttccaacaa aaattcctctgcccctacagcagcagcaaaagcagcagcagaagcaacagcaacagataagtgttttgatgaattgcgagatggataggg cttgagtgcccccagccctgct gataccaaatgcctttaagatacagcctttcccatcctaatctacaaaggaaacaggaaaaaggaacttaa aactccctgtgctcagacagaaatgagactgttacagcctgcttctgtgctgttccttcttgcctctaacttgtaaacaagacgtagtaggacga tgctaatggaaagtcacaaaccgctgggtttttga aaggatcctagactcgagcggccgcca (SEQ ID NO: 10)

В одном варианте осуществления промотор ТЕК содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления промотор ТЕК содержит нуклеотидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 65%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 91%, по меньшей мере, 92%, по меньшей мере, 93%, по меньшей мере, 94%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99%, по меньшей мере, 99,5% идентичности с SEQ ID NO: 10.In one embodiment, the TEK promoter contains the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10. In one embodiment, the TEK promoter contains a nucleotide sequence having at least 50%, at least 60%, at least 65%, at least at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least , 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5% identical to SEQ ID NO: 10.

Промотор ТЕК (Tie2) можно комбинировать с последовательностью-мишенью mir-126 и/или последовательностью-мишенью mir-130a. Это обеспечивает специфическую экспрессию трансгена в подмножестве инфильтрирующих опухоль миелоидных клеток, например, инфильтрирующих опухоль макрофагов.The TEK promoter (Tie2) can be combined with a mir-126 target sequence and/or a mir-130a target sequence. This ensures specific expression of the transgene in a subset of tumor-infiltrating myeloid cells, such as tumor-infiltrating macrophages.

В одном варианте осуществления вектор может дополнительно содержать последовательность энхансера ТЕК (Tie2).In one embodiment, the vector may further comprise a TEK enhancer (Tie2) sequence.

Пример последовательности энхансера ТЕК (Tie2):Example TEK enhancer sequence (Tie2):

cttcagacctggaggaggagatatgagggaccaattgtggccagacgattccttaactcgtgttacacctgcagaatgagttttag atctagctgtgacctcttcccccagccccacccccattgtccccttgtgtgccttcaggaatctgatcattcttctctcctgctccttcccaaagg ctgcaggagcaggtgtgaagacgtggatgtgccagatgcagagtcctgacacttttcaacacatctgcatattagaggaagtacatacccatt gcttggtggtttcatgtctaatgtggtatgagtgtgacaaagagagggagaaaatttggactagccaaagaagccagtcaggcgtggggttt gaagggcatcgtgggcggctgtcatttgctctctgcttgtcacagccccttgcccagggcttgaccagtgaggtgtatgtgctggtcacaccc atctcagcagatctgtcagctttcccgcttttgttaaagggtgatatcatgcttcctggggggagcactggaagacaatgctcggccactttcct ccagatacaataggcggagtcaggaaggcagtattgacattgctggggctggggaggcactcactgctctgcggccgtcagatggtgaac cagcttaaccttggcacacagggcctgggttgtgcaaggcgtctggctgcagagccaaaggggactccaccctggggacaggagtgcttt agacatctgggaatctgggatgggcttcaaattctgatccctgtgtcagaaacaaccacaaaacaataagagtaccagtaataacaaaaatg actaccctaggttgaatgcctttatgtgccaagtgtcaattg (SEQ ID NO: 11)cttcagacctggaggaggagatatgagggaccaattgtggccagacgattccttaactcgtgttacacctgcagaatgagttttag atctagctgtgacctcttcccccagccccacccccattgtccccttgtgtgccttcaggaatctgatcattctcttctctcctgctccttcccaaagg ctgcaggagcaggtgtgaagac gtggatgtgccagatgcagagtcctgacacttttcaacacatctgcatattagaggaagtacatacccatt gcttggtggtttcatgtctaatgtggtatgagtgtgacaaagagaggagaaaatttggactagccaaagaagccagtcaggcgtggggttt gaagggcatcgtgggcggctgtcatttgctctctgcttgtca cagccccttgcccagggcttgaccagtgaggtgtatgtgctggtcacaccc atctcagcagatctgtcagctttcccgcttttgttaaagggtgatatcatgcttcctggggggagcactggaagacaatgctcggccactttcct cgatacaataggcggagtcaggaaggcagtattgacattgctggggctggggaggc actcactgctctgcggccgtcagatggtgaac cagcttaaccttggcacacagggcctgggttgtgcaaggcgtctggctgcagagccaaaggggactccaccctggggacaggagtgcttt agacatctgggaatctgggatgggcttcaaattctgatccctgtgtcagaaacaaccacaaaacaataagagtaccagtaataacaaa aatg actaccctaggttgaatgcctttatgtgccaagtgtcaattg (SEQ ID NO: 11)

В одном варианте осуществления последовательность энхансера ТЕК содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 11. В одном варианте осуществления энхансер ТЕК содержит нуклеотидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 65%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 91%, по меньшей мере, 92%, по меньшей мере, 93%, по меньшей мере, 94%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99%, по меньшей мере, 99,5% идентичности с SEQ ID NO: 11.In one embodiment, the TEK enhancer sequence comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11. In one embodiment, the TEK enhancer comprises a nucleotide sequence having at least 50%, at least 60%, at least 65%, of at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least , 99.5% identity with SEQ ID NO: 11.

Оптимизация кодонов.Codon optimization.

Полинуклеотиды, используемые в настоящем изобретении, могут быть оптимизированы по кодонам. Оптимизация кодонов ранее была описана в WO 1999/41397 и WO 2001/79518. Разные клетки различаются использованием определенных кодонов. Это предпочтение кодонов соответствует предпочтеThe polynucleotides used in the present invention may be codon optimized. Codon optimization has previously been described in WO 1999/41397 and WO 2001/79518. Different cells differ in their use of specific codons. This codon preference corresponds to the preference

- 30 046120 нию в относительном изобилии определенных tPHK в типе клеток. Изменяя кодоны в последовательности так, чтобы они были адаптированы к относительному количеству соответствующих tPHK, можно увеличить экспрессию. Аналогичным образом, можно уменьшить экспрессию путем преднамеренного выбора кодонов, для которых известно, что соответствующие tPHK редки в конкретном типе клеток. Таким образом, доступна дополнительная степень контроля на уровне трансляции.- 30 046120 nuyu in the relative abundance of certain tRNAs in a cell type. By changing the codons in the sequence so that they are tailored to the relative abundance of the corresponding tRNAs, expression can be increased. Likewise, expression can be reduced by deliberately selecting codons for which the corresponding tRNAs are known to be rare in a particular cell type. Thus, an additional degree of control is available at the translation level.

Многие вирусы, включая ВИЧ и другие лентивирусы, используют большое количество редких кодонов, и, изменяя их в соответствии с обычно используемыми кодонами млекопитающих, можно добиться повышенной экспрессии компонентов упаковки в клетках-продуцентах млекопитающих. Таблицы использования кодонов известны в данной области для клеток млекопитающих, а также для ряда других организмов.Many viruses, including HIV and other lentiviruses, use a large number of rare codons, and by changing them to match commonly used mammalian codons, it is possible to achieve increased expression of packaging components in mammalian producing cells. Codon usage tables are known in the art for mammalian cells as well as a number of other organisms.

Оптимизация кодонов может также включать удаление мотивов нестабильности мРНК и скрытых участков скрытого сплайсинга.Codon optimization may also include the removal of mRNA instability motifs and cryptic cryptic splicing sites.

Опухолеассоциированный антиген (TAA).Tumor associated antigen (TAA).

Как используется в настоящем документе, термин опухолеассоциированный антиген (TAA; также известный как опухолевый антиген) относится к антигенной молекуле, экспрессируемой злокачественной клеткой, например опухолевой клеткой. TAA может распознаваться иммунной клеткой, которая экспрессирует иммунный рецептор (например, TCR, трансгенный TCR или CAR), который способен специфически связываться с частью (например, эпитопом) молекулы TAA.As used herein, the term tumor-associated antigen (TAA; also known as tumor antigen) refers to an antigenic molecule expressed by a malignant cell, such as a tumor cell. TAA can be recognized by an immune cell that expresses an immune receptor (eg, TCR, transgenic TCR, or CAR) that is capable of specifically binding to a portion (eg, epitope) of the TAA molecule.

Как используется в настоящем документе, термин TAA-специфическая Т-клетка относится к Т-клетке, которая экспрессирует TCR или CAR, специфичную для TAA.As used herein, the term TAA-specific T cell refers to a T cell that expresses a TCR or CAR specific for TAA.

Т-клетка, экспрессирующая TAA-специфический TCR или TAA-специфический CAR, может быть способна специфически нацеливаться и убивать опухолевые клетки, экспрессирующие TAA. TAAспецифический TCR может представлять собой трансгенный TCR.A T cell expressing a TAA-specific TCR or a TAA-specific CAR may be able to specifically target and kill tumor cells expressing TAA. The TAA-specific TCR may be a transgenic TCR.

В одном варианте осуществления TAA-специфическая Т-клетка не может быть генетически модифицирована. Т-клетки могут быть природно индуцированными опухолеспецифическими Т-клетками. Например, Т-клетки, используемые в настоящем изобретении, могут распространяться от опухоли или лимфатического узла.In one embodiment, the TAA-specific T cell cannot be genetically modified. T cells may be naturally induced tumor-specific T cells. For example, the T cells used in the present invention may spread from a tumor or lymph node.

Конкретный TAA может экспрессироваться при высокой относительной распространенности в опухолевых клетках определенного типа по сравнению с неопухолевыми клетками (например, здоровыми клетками).A particular TAA may be expressed at a high relative abundance in a certain type of tumor cell compared to non-tumor cells (eg, healthy cells).

Примеры TAA включают карциноэмбриональный антиген (СЕА), рецептор эстрогена, рецептор прогестерона, ephrinB2, ROR1, мезотелин, c-Met, GD-2 и MAGE A3 TCR, 4-1BB, антиген аденокарциномы, альфа-фетопротеин, BAFF, клетку В-лимфомы, антиген С242, карбоангидразу 9 (CA-IX), CCR4, CD152, CD200, CD22, CD19, CD22, CD123, CD221, CD23 (IgE receptor), CD28, CD4, CD40, CD44, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CS-1, CNTO888, CTLA-4, DR5, EpCAM, CD3, дополнительный домен фибронектина-В, рецептор фолата 1, гликопротеин 75, GPNMB, HGF, рецептор-киназы фактор роста гепатоцитов человека, рецептор IGF-1, IGF-I, IgG1, L1-CAM, IL-13, IL-6, рецептор инсулиноподобного фактора роста I, интегрин α5β1, интегрин ave3, MORAb-009, MS4A1, муцин CanAg, N-гликолилнейраминовую кислоту, NPC-1C, PDGF-Ra, PDL192, фосфатидилсерин, клетки карциномы предстательной железы, RANKL, RON, SCH1105 S5 9005, тенасцин С, TGF бета 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, опухолевый антиген CTAA16.88, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, виментин, 5Т4, CD5, CD19, CD20, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD45, CAMPATH-1 (CDw52), HLADR, антиидиотип, TAG-72, Ep-CAM, MUC1, фолат-связывающий белок, А33, G250, простатический специфический мембранный антиген, (PSMA), простатический специфический антиген (PSA), ферритин, ганглиозиды (например, GD2, GD3, GM2), Ley, CA-125, СА19-9, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), p185HER2, рецептор IL-2, de2-7 EGFR, белок активации фибробластов (FAP), тенасцин, металлопротеиназы, эндосиалин, карбоноангидразу, галектин 9, альдолазу A, eIFY4, тирозиназу, галектин 4, HERKV-K10, р53, NY-LU-12, рестин, NY-CO-38, MAGE-1, MAGE-4a, SSX2, NY-ESO-1, SCP-1, 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, b-катенин/m, Bcr-abl, CAMEL, САР-1, CASP-8, CDC27m, CDK4/m, CT, Cyp-B, DAM-6 (MAGE-B2) и DAM-10 (MAGE-B1), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT (hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/мелан-А, MC1R, миозин/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NYESO-1, P15, p190 минорный bcr-abl, Pml/RARa, PRAME, RAGE, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, белокп 1, gp75, TRP-2, TRP-2/INT2 или WT1.Examples of TAAs include carcinoembryonic antigen (CEA), estrogen receptor, progesterone receptor, ephrinB2, ROR1, mesothelin, c-Met, GD-2 and MAGE A3 TCR, 4-1BB, adenocarcinoma antigen, alpha-fetoprotein, BAFF, B lymphoma cell , C242 antigen, carbonic anhydrase 9 (CA-IX), CCR4, CD152, CD200, CD22, CD19, CD22, CD123, CD221, CD23 (IgE receptor), CD28, CD4, CD40, CD44, CD44 v6, CD51, CD52, CD56 , CD74, CD80, CS-1, CNTO888, CTLA-4, DR5, EpCAM, CD3, fibronectin-B accessory domain, folate receptor 1, glycoprotein 75, GPNMB, HGF, human hepatocyte growth factor receptor kinase, IGF-1 receptor , IGF-I, IgG1, L1-CAM, IL-13, IL-6, insulin-like growth factor I receptor, α5β1 integrin, ave3 integrin, MORAb-009, MS4A1, CanAg mucin, N-glycolylneuraminic acid, NPC-1C, PDGF -Ra, PDL192, phosphatidylserine, prostate carcinoma cells, RANKL, RON, SCH1105 S5 9005, tenascin C, TGF beta 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, tumor antigen CTAA16.88, vascular endothelial growth factor ( VEGF), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, vimentin, 5T4, CD5, CD19, CD20, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD45, CAMPATH-1 (CDw52), HLADR, anti-idiotype, TAG-72, Ep-CAM, MUC1, folate binding protein, A33, G250, prostate specific membrane antigen (PSMA), prostate specific antigen (PSA), ferritin, gangliosides (e.g. GD2, GD3, GM2), Ley, CA-125, CA19-9, epidermal growth factor receptor (EGFR), p185HER2, IL-2 receptor, de2-7 EGFR, fibroblast activation protein (FAP), tenascin, metalloproteinases, endosialin, carbonic anhydrase, galectin 9, aldolase A, eIFY4, tyrosinase, galectin 4, HERKV-K10, p53, NY-LU-12, restin, NY-CO-38, MAGE-1, MAGE-4a, SSX2, NY-ESO-1, SCP-1, 707-AP, AFP, ART- 4, BAGE, b-catenin/m, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27m, CDK4/m, CT, Cyp-B, DAM-6 (MAGE-B2) and DAM-10 (MAGE -B1), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT ( hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melan-A, MC1R, myosin/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NYESO-1 , P15, p190 minor bcr-abl, Pml/RARa, PRAME, RAGE, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, proteinp 1, gp75, TRP- 2, TRP-2/INT2 or WT1.

Дополнительные TAA могут быть идентифицированы с использованием методов, известных в данной области техники - см., например, обзорную статью Zilberberg et al., 2015 (Biology of Blood and Marrow Transplantation, Volume 21, Issue 6, June 2015, Pages 1000-1007), содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки.Additional TAAs can be identified using methods known in the art - see, for example, review article Zilberberg et al., 2015 (Biology of Blood and Marrow Transplantation, Volume 21, Issue 6, June 2015, Pages 1000-1007) , the contents of which are incorporated herein by reference.

Т-клетки.T cells.

Как используется в настоящем документе, термин Т-клетки может относиться к CD8+ Т-клеткам, CD4+ Т-клеткам, наивным Т-клеткам, стволовым Т-клеткам памяти, центральным Т-клеткам памяти,As used herein, the term T cells can refer to CD8+ T cells, CD4+ T cells, naïve T cells, memory stem T cells, central memory T cells,

- 31 046120 дважды негативным Т-клеткам, эффекторным Т-клеткам памяти, эффекторным Т-клеткам, Th0 клеткам, Тс0 клеткам, Th1 клеткам, Tc1 клеткам, Th2 клеткам, Тс2 клеткам, Th17 клеткам, Th22 клеткам, гамма/дельта Т-клеткам.- 31 046120 double negative T cells, effector memory T cells, effector T cells, Th0 cells, Tc0 cells, Th1 cells, Tc1 cells, Th2 cells, Tc2 cells, Th17 cells, Th22 cells, gamma/delta T cells .

Т-клетка, используемая в настоящем изобретении, может использоваться для адоптивного переноса Т-клетки. Настоящее изобретение также охватывает адоптивный перенос противоопухолевых эффекторных лимфоцитов (TIL) и/или инфильтрирующих костный мозг лимфоцитов (MIL).The T cell used in the present invention can be used for T cell adoptive transfer. The present invention also covers adoptive transfer of antitumor effector lymphocytes (TILs) and/or bone marrow infiltrating lymphocytes (MILs).

Как используется в настоящем документе, термин адоптивный перенос Т-клеток относится к введению популяции Т-клеток пациенту. Т-клетка может быть выделена из индивида, а затем генетически модифицирована и культивирована in vitro (ex vivo) для экспрессии TAA-специфического TCR или CAR перед введением пациенту.As used herein, the term adoptive T cell transfer refers to the administration of a population of T cells to a patient. The T cell can be isolated from an individual and then genetically modified and cultured in vitro (ex vivo) to express a TAA-specific TCR or CAR before being administered to a patient.

Адоптивный перенос клеток может быть аллогенным или аутологичным.Adoptive cell transfer can be allogeneic or autologous.

Под переносом аутологичных клеток следует понимать, что исходную популяцию клеток получают от того же индивида, которому вводится трансдуцированная популяция Т-клеток. Аутологичный перенос является предпочтительным, поскольку он позволяет избежать проблем, связанных с иммунологической несовместимостью, и доступен индивидам независимо от наличия генетически подобранного донора.Autologous cell transfer means that the original cell population is obtained from the same individual to whom the transduced T cell population is administered. Autologous transfer is preferred because it avoids problems associated with immunological incompatibility and is available to individuals regardless of the availability of a genetically matched donor.

Под переносом аллогенных клеток следует понимать, что исходная популяция клеток получена от другого индивида, чем тот, которому вводится популяция трансдуцированных клеток. Предпочтительно, чтобы донор был генетически подобран субъекту, которому вводят клетки, чтобы минимизировать риск иммунологической несовместимости. Альтернативно, донор может не соответствовать и не иметь отношения к пациенту.By allogeneic cell transfer it should be understood that the original population of cells is obtained from a different individual than the one to whom the population of transduced cells is introduced. It is preferable that the donor be genetically matched to the subject receiving the cells to minimize the risk of immunological incompatibility. Alternatively, the donor may not be a match or relationship to the patient.

Подходящие дозы популяций трансдуцированных клеток таковы, что они являются терапевтически и/или профилактически эффективными. Вводимая доза может зависеть от индивида и состояния, подлежащего лечению, и может быть легко определена специалистом в данной области.Suitable doses of the transduced cell populations are such that they are therapeutically and/or prophylactically effective. The dose administered may depend on the individual and the condition being treated and can be readily determined by one skilled in the art.

Т-клетка может быть получена из Т-клетки, выделенной от пациента. Т-клетка может быть частью популяции смешанных клеток, выделенной у индивида, такой как популяция лимфоцитов периферической крови (PBL). Т-клетки в популяции PBL могут быть активированы способами, известными в данной области, такими как использование антител против CD3 и/или против CD28 или гранул клеточного размера, конъюгированных с антителами против CD3 и/или против CD28.The T cell may be derived from a T cell isolated from a patient. The T cell may be part of a mixed cell population isolated from an individual, such as a peripheral blood lymphocyte (PBL) population. T cells in the PBL population can be activated by methods known in the art, such as using anti-CD3 and/or anti-CD28 antibodies or cell-sized beads conjugated to anti-CD3 and/or anti-CD28 antibodies.

Т-клетка может быть CD4' хелперной Т-клеткой или CD8' цитотоксической Т-клеткой. Т-клетка может находиться в смешанной популяции CD4+ хелперных Т-клеток/СВ8+ цитотоксических Т-клеток. Поликлональная активация, например, с использованием антител против CD3, необязательно в комбинации с антителами против CD28, будет запускать пролиферацию CD4+ и CD8+ Т-клеток.The T cell may be a CD4' helper T cell or a CD8' cytotoxic T cell. The T cell may reside in a mixed population of CD4+ helper T cells/CB8 + cytotoxic T cells. Polyclonal activation, for example using anti-CD3 antibodies, optionally in combination with anti-CD28 antibodies, will trigger the proliferation of CD4 + and CD8 + T cells.

Т-клетка может быть выделена у индивида, которому должна быть осуществлена адоптивная передача генетически модифицированной клетки. В этом отношении клетка может быть получена путем выделения Т-клетки у индивида, необязательно, активации Т-клетки, переноса гена TCR в клетку ex vivo. Последующая иммунотерапия индивида может затем осуществляться путем адоптивного переноса TCRтрансдуцированных клеток. В настоящем описании этот процесс относится к аутологичному переносу Тклеток - то есть TCR-трансдуцированные клетки вводятся тому же самому субъекту, от которого Тклетки были первоначально получены.The T cell can be isolated from an individual to whom the genetically modified cell is to be adopted. In this regard, the cell can be obtained by isolating a T cell from an individual, optionally activating the T cell, transferring the TCR gene into the cell ex vivo. Subsequent immunotherapy of the individual can then be achieved by adoptive transfer of TCR-transduced cells. As used herein, this process refers to autologous T cell transfer—that is, the TCR-transduced cells are administered to the same subject from which the T cells were originally obtained.

Альтернативно, Т-клетка может быть выделена у другого индивида, так что она является аллогенной. Т-клетка может быть выделена у донорского индивида. Например, если субъект подвергается аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (Allo-HSCT) или трансплантации солидных органов, или трансплантации клеток, или терапии стволовыми клетками, клетка может быть получена от донора, у которого получены органы, ткани или клетки. Донором и субъектом, подвергающимся лечению, могут быть братья и сестры.Alternatively, the T cell may be isolated from another individual so that it is allogeneic. The T cell can be isolated from a donor individual. For example, if a subject undergoes allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (Allo-HSCT) or solid organ transplantation or cell transplantation or stem cell therapy, the cell may be obtained from a donor from whom the organs, tissues, or cells are obtained. The donor and the subject being treated may be siblings.

Альтернативно, Т-клетка может быть получена из стволовой клетки, такой как гемопоэтическая стволовая клетка (HSC). Перенос гена в HSC не приводит к экспрессии TCR на клеточной поверхности, поскольку стволовые клетки не экспрессируют молекулы CD3. Однако, когда стволовые клетки дифференцируются в лимфоидные предшественники, которые мигрируют в тимус, инициация экспрессии CD3 приводит к поверхностной экспрессии введенного TCR в тимоцитах.Alternatively, the T cell may be derived from a stem cell such as a hematopoietic stem cell (HSC). Gene transfer into HSCs does not result in TCR expression on the cell surface because stem cells do not express CD3 molecules. However, when stem cells differentiate into lymphoid progenitors that migrate to the thymus, initiation of CD3 expression results in surface expression of the introduced TCR in thymocytes.

Преимущество этого подхода состоит в том, что зрелые Т-клетки, как только они получены, экспрессируют только введенный TCR и мало имеют или вообще не имеют эндогенных цепей TCR, потому что экспрессия введенных цепей TCR подавляет перестройку эндогенных сегментов гена TCR с образованием функциональных альфа TCR и бета-генов. Дополнительным преимуществом является то, что генно-модифицированные стволовые клетки являются постоянным источником зрелых Т-клеток с желаемой специфичностью к антигену. Соответственно, HSC, НРС или вектор, как определено в настоящем документе, можно использовать в комбинации с генно-модифицированной стволовой клеткой, предпочтительно, с генно-модифицированной гемопоэтической стволовой клеткой, которая при дифференцировке продуцирует Т-клетку, экспрессирующую TAA-специфический TCR.The advantage of this approach is that mature T cells, once generated, express only the introduced TCR and have little or no endogenous TCR chains, because expression of the introduced TCR chains suppresses the rearrangement of endogenous TCR gene segments to produce functional alpha TCRs and beta genes. An additional advantage is that genetically modified stem cells provide a constant source of mature T cells with the desired antigen specificity. Accordingly, an HSC, HPC, or vector as defined herein can be used in combination with a genetically modified stem cell, preferably a genetically modified hematopoietic stem cell, that upon differentiation produces a T cell expressing a TAA-specific TCR.

Другие подходы, известные в данной области, могут использоваться для уменьшения, ограничения, предотвращения, сайленсинга или отмены экспрессии эндогенных генов в клетках по настоящему изоOther approaches known in the art can be used to reduce, limit, prevent, silence or abolish the expression of endogenous genes in cells of the present invention.

- 32 046120 бретению или клетках, полученных способами по настоящему изобретению.- 32 046120 shaving or cells obtained by the methods of the present invention.

Как используется в настоящем документе, термин нарушение относится к уменьшению, ограничению, предотвращению, сайленсингу или отмене экспрессии гена. Специалист в данной области может использовать любой метод, известный в данной области, для нарушения эндогенного гена, например, любой подходящий метод для редактирования генома, сайленсинга гена, нокдауна гена или нокаута гена.As used herein, the term disorder refers to the reduction, limitation, prevention, silencing or abolition of gene expression. One skilled in the art may use any method known in the art to disrupt an endogenous gene, for example, any suitable method for genome editing, gene silencing, gene knockdown, or gene knockout.

Например, эндогенный ген может быть нарушен с помощью искусственной нуклеазы. Искусственная нуклеаза представляет собой, например, искусственный рестрикционный фермент, сконструированный для селективного нацеливания на специфическую полинуклеотидную последовательность (например, кодирующий интересующий ген) и индуцирования двухцепочечного разрыва в указанной полинуклеотидной последовательности. Как правило, разрыв двухцепочечной цепи (DSB) будет устранен с помощью подверженного ошибкам негомологичного присоединения конца (NHEJ), что приведет к образованию нефункциональной полинуклеотидной последовательности, которая может быть неспособна экспрессировать эндогенный ген.For example, an endogenous gene can be disrupted using an artificial nuclease. An artificial nuclease is, for example, an artificial restriction enzyme designed to selectively target a specific polynucleotide sequence (eg, encoding a gene of interest) and induce a double-strand break in said polynucleotide sequence. Typically, a double-strand break (DSB) will be repaired by error-prone non-homologous end joining (NHEJ), resulting in a non-functional polynucleotide sequence that may be unable to express the endogenous gene.

В некоторых вариантах осуществления искусственная нуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеаз цинкового пальца (ZFN), эффекторных нуклеаз, подобных активатору транскрипции (TALEN) и CRISPR/Cas (например, CRISPR/Cas9).In some embodiments, the artificial nuclease is selected from the group consisting of zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas (eg, CRISPR/Cas9).

Т-клеточный рецептор (TCR).T cell receptor (TCR).

Во время процессинга антигена антигены разлагаются внутри клеток, а затем переносятся на поверхность клетки молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС). Т-клетки способны распознавать этот пептид: комплекс МНС на поверхности антигенпрезентирующей клетки. Существует два разных класса молекул МНС: МНС I иDuring antigen processing, antigens are degraded within cells and then transferred to the cell surface by major histocompatibility complex (MHC) molecules. T cells are able to recognize this peptide: MHC complex on the surface of the antigen presenting cell. There are two different classes of MHC molecules: MHC I and

МНС II, каждый класс доставляет пептиды из разных клеточных компартментов на клеточную поверхность.MHC II, each class, delivers peptides from different cellular compartments to the cell surface.

АТ-клеточный рецептор (TCR) представляет собой молекулу, обнаруженную на поверхности Тклеток, которая отвечает за распознавание антигенов, связанных с молекулами МНС. Гетеродимер TCR состоит из альфа (α) и бета (β) цепи примерно в 95% Т-клеток, в то время как около 5% Т-клеток имеют TCR, состоящие из гамма (γ) и дельта (δ) цепей.The AT cell receptor (TCR) is a molecule found on the surface of T cells that is responsible for recognizing antigens bound to MHC molecules. The TCR heterodimer consists of an alpha (α) and beta (β) chain in about 95% of T cells, while about 5% of T cells have TCRs composed of gamma (γ) and delta (δ) chains.

Взаимодействие TCR с антигеном и МНС приводит к активации Т-лимфоцита, на котором TCR экспрессируется через серию биохимических событий, опосредованных ассоциированными ферментами, корецепторами и специализированными вспомогательными молекулами.The interaction of the TCR with antigen and MHC results in the activation of the T lymphocyte, on which the TCR is expressed through a series of biochemical events mediated by associated enzymes, coreceptors, and specialized accessory molecules.

Каждая цепь TCR является членом суперсемейства иммуноглобулинов и имеет один N-концевой иммуноглобулин (^-вариабельный (V) домен, один Ig-константный (С) домен, область, охватывающая трансмембранную/клеточную мембрану, и короткий цитоплазматический хвост на С-терминальном конце.Each TCR chain is a member of the immunoglobulin superfamily and has one N-terminal immunoglobulin (Ig) variable (V) domain, one Ig constant (C) domain, a transmembrane/cell membrane spanning region, and a short cytoplasmic tail at the C-terminal end.

Вариабельный домен как α-цепи TCR, так и β-цепи имеет три гипервариабельных или определяющих комплементарность области (CDR). CDR3 представляет собой основную CDR, ответственную за распознавание процессированного антигена, хотя было также показано, что CDR1 альфа-цепи взаимодействует с N-концевой частью антигенного пептида, тогда как CDR1 бета-цепи взаимодействует с Сконцевой частью пептида. Полагают, что CDR2 распознает молекулу МНС.The variable domain of both the TCR α chain and the β chain has three hypervariable or complementarity determining regions (CDRs). CDR3 is the main CDR responsible for recognition of processed antigen, although the alpha chain CDR1 has also been shown to interact with the N-terminal portion of the antigenic peptide, whereas the beta chain CDR1 interacts with the C-terminal portion of the peptide. It is believed that CDR2 recognizes the MHC molecule.

Константный домен домена TCR состоит из коротких соединительных последовательностей, в которых остаток цистеина образует дисульфидную связь, создавая связь между двумя цепями.The constant domain of the TCR domain consists of short connecting sequences in which a cysteine residue forms a disulfide bond, creating a link between the two chains.

TCR, используемый в настоящем изобретении, может иметь один или несколько дополнительных остатков цистеина в каждой из α и β цепей, так что TCR может содержать две или более дисульфидных связей в константных доменах.The TCR used in the present invention may have one or more additional cysteine residues in each of the α and β chains, such that the TCR may contain two or more disulfide bonds in constant domains.

Структура позволяет TCR связываться с другими молекулами, такими как CD3, которые обладают тремя различными цепями (γ, δ и ε) у млекопитающих и ζ-цепью. Эти вспомогательные молекулы имеют отрицательно заряженные трансмембранные области и играют роль в распространении сигнала от TCR в клетку. CD3- и ζ-цепи вместе с TCR образуют так называемый Т-клеточный рецепторный комплекс.The structure allows the TCR to bind to other molecules such as CD3, which possess three distinct chains (γ, δ and ε) in mammals and a ζ chain. These accessory molecules have negatively charged transmembrane regions and play a role in propagating the signal from the TCR into the cell. The CD3 and ζ chains together with the TCR form the so-called T-cell receptor complex.

Сигнал от комплекса Т-клеток усиливается одновременным связыванием молекул МНС специфическим корецептором. Для хелперных Т-клеток этот корецептор представляет собой CD4 (специфичный для МНС класса II); тогда как для цитотоксических Т-клеток этот корецептор представляет собой CD8 (специфичный для МНС класса I). Ко-рецептор обеспечивает длительное взаимодействие между антигенпрезентирующей клеткой и Т-клеткой и рекрутирует важные молекулы (например, LCK) внутри клетки, участвующие в передаче сигналов активированного Т-лимфоцита.The signal from the T-cell complex is enhanced by the simultaneous binding of MHC molecules by a specific coreceptor. For helper T cells, this coreceptor is CD4 (MHC class II specific); whereas for cytotoxic T cells this coreceptor is CD8 (MHC class I specific). The co-receptor mediates long-term interaction between the antigen-presenting cell and the T cell and recruits important molecules (eg, LCK) within the cell involved in activated T cell signaling.

Соответственно, как используется в настоящем документе, термин рецептор Т-клеток (TCR) относится к молекуле, способной распознавать пептид, когда он представлен молекулой МНС. Молекула может представлять собой гетеродимер с двумя цепями α и β (или, необязательно, γ и δ), или он может представлять собой одноцепочечную конструкцию TCR.Accordingly, as used herein, the term T cell receptor (TCR) refers to a molecule capable of recognizing a peptide when it is presented by an MHC molecule. The molecule may be a heterodimer with two chains α and β (or optionally γ and δ), or it may be a single chain TCR construct.

TCR, используемый в настоящем изобретении, может представлять собой гибридный TCR, содержащий последовательности, полученные из более чем одного вида. Например, неожиданно было обнаружено, что мышиные TCR более эффективно экспрессируются в Т-клетках человека, чем TCR человека.The TCR used in the present invention may be a hybrid TCR containing sequences derived from more than one species. For example, it was unexpectedly found that mouse TCRs are more efficiently expressed in human T cells than human TCRs.

- 33 046120- 33 046120

Следовательно, TCR может содержать вариабельные области человека и константные области мыши.Therefore, the TCR may contain human variable regions and mouse constant regions.

Недостатком этого подхода является то, что мышиные константные последовательности могут вызывать иммунный ответ, что приводит к отторжению перенесенных Т-клеток. Однако схемы кондиционирования, используемые для подготовки пациентов к адоптивной Т-клеточной терапии, могут привести к достаточной иммуносупрессии, чтобы позволить приживление Т-клеток, экспрессирующих мышиные последовательности.A disadvantage of this approach is that the murine constant sequences may trigger an immune response that results in rejection of the transferred T cells. However, conditioning regimens used to prepare patients for adoptive T-cell therapy may result in sufficient immunosuppression to allow engraftment of T cells expressing murine sequences.

Часть TCR, которая устанавливает большую часть контактов с антигенным пептидом, связанным с основным комплексом гистосовместимости (МНС), представляет собой определяющую комплементарность область 3 (CDR3), которая является уникальной для каждого клона Т-клеток. Область CDR3 генерируется при событиях соматической перестройки, происходящих в тимусе и вовлекающих несмежные гены, принадлежащие к вариабельным (V), разнообразным (D, для β- и δ-цепям) и присоединяющимся (J) генам. Кроме того, случайные нуклеотиды, встроенные/удаленные в перестраивающихся локусах каждого гена цепи TCR, значительно увеличивают разнообразие высоко вариабельной последовательности CDR3. Таким образом, частота конкретной последовательности CDR3 в биологическом образце указывает на численность конкретной популяции Т-клеток. Большое разнообразие репертуара TCR у здоровых людей обеспечивает широкий спектр защиты от различных чужеродных антигенов, представленных молекулами МНС на поверхности антигенпрезентирующих клеток. В связи с этим следует отметить, что теоретически в тимусе может генерироваться до 1015 различных TCR.The part of the TCR that makes the majority of contacts with the major histocompatibility complex (MHC)-bound antigenic peptide is complementarity determining region 3 (CDR3), which is unique to each T cell clone. The CDR3 region is generated by somatic remodeling events that occur in the thymus and involve noncontiguous genes belonging to the variable (V), diversity (D, for β- and δ-chains), and junction (J) genes. In addition, random nucleotides inserted/deleted at the rearrangement loci of each TCR chain gene significantly increase the diversity of the highly variable CDR3 sequence. Thus, the frequency of a particular CDR3 sequence in a biological sample indicates the abundance of a particular T cell population. The wide diversity of the TCR repertoire in healthy individuals provides a broad spectrum of protection against various foreign antigens presented by MHC molecules on the surface of antigen-presenting cells. In this regard, it should be noted that theoretically, up to 10 15 different TCRs can be generated in the thymus.

Разнообразие рецепторов Т-клеток сфокусировано на CDR3, и эта область в первую очередь ответственна за распознавание антигена.T cell receptor diversity is focused on CDR3, and this region is primarily responsible for antigen recognition.

CDR могут, например, содержать одну, две или три замены, добавления или делеции из данной последовательности, при условии, что TCR сохраняет способность связывать производный от TAA пептид, когда он представлен молекулой МНС.CDRs may, for example, contain one, two or three substitutions, additions or deletions from a given sequence, provided that the TCR retains the ability to bind the TAA-derived peptide when presented by an MHC molecule.

Специалисты в данной области могут легко генерировать TCR, специфичные для TAA, используя любой способ, известный в данной области.Those skilled in the art can easily generate TAA-specific TCRs using any method known in the art.

Например, TAA-специфичные TCR могут быть идентифицированы методом захвата гена TCR, описанного Linnemann et al. (Nature Medicine 19, 1534-1541 (2013)). Вкратце, в этом методе используется высокопроизводительная стратегия на основе ДНК для идентификации последовательностей TCR путем захвата и секвенирования фрагментов геномной ДНК, кодирующих гены TCR, и может использоваться для идентификации TAA-специфических TCR.For example, TAA-specific TCRs can be identified by the TCR gene capture method described by Linnemann et al. (Nature Medicine 19, 1534-1541 (2013)). Briefly, this method uses a high-throughput DNA-based strategy to identify TCR sequences by capturing and sequencing genomic DNA fragments encoding TCR genes and can be used to identify TAA-specific TCRs.

Улучшенная экспрессия TCR и уменьшенное ошибочное спаривание TCR.Improved TCR expression and reduced TCR mismatching.

Увеличение количества молекул CD3 может увеличить экспрессию TCR, например, в клетке, которая была модифицирована для экспрессии TCR по настоящему изобретению. Соответственно, Т-клетка может быть модифицирована (например, с использованием вектора) для включения одного или нескольких генов, кодирующих CD3-гαмма, CD3-дельта, CD3-эпсилон и/или CD3-дзета. В одном варианте осуществления Т-клетка содержит ген, кодирующий CD3-дзета. Т-клетка может содержать ген, кодирующий CD8. Вектор, кодирующий такие гены, может кодировать селектируемый маркер или ген самоубийства, чтобы увеличить профиль безопасности генетически сконструированной клетки. Гены могут быть связаны с помощью саморасщепляющихся последовательностей, таких как саморасщепляющихся последовательность 2А.Increasing the number of CD3 molecules can increase TCR expression, for example, in a cell that has been modified to express the TCR of the present invention. Accordingly, the T cell can be modified (eg, using a vector) to include one or more genes encoding CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon and/or CD3 zeta. In one embodiment, the T cell contains a gene encoding CD3-zeta. The T cell may contain a gene encoding CD8. The vector encoding such genes may encode a selectable marker or suicide gene to increase the safety profile of the genetically engineered cell. Genes can be linked by self-cleaving sequences, such as the 2A self-cleaving sequence.

Альтернативно, один или несколько отдельных векторов, кодирующих ген CD3, могут быть предоставлены для совместного переноса в Т-клетку одновременно, последовательно или раздельно с одним или несколькими векторами, кодирующими TCR.Alternatively, one or more separate vectors encoding the CD3 gene may be provided for co-transfer into a T cell simultaneously, sequentially or separately with one or more vectors encoding the TCR.

Трансгенный TCR может быть экспрессирован в Т-клетке, используемой в настоящем изобретении, для изменения антигенной специфичности Т-клетки. TCR-трансдуцированные TCR-клетки экспрессируют по меньшей мере две альфа-цепи TCR и две бета-цепи TCR. В то время как эндогенные альфа/бетацепи TCR образуют рецептор, который является самодостаточным, введенные альфа/бета-цепи TCR образуют рецептор с определенной специфичностью для данного антигена-мишени.A transgenic TCR can be expressed in a T cell used in the present invention to change the antigen specificity of the T cell. TCR-transduced TCR cells express at least two TCR alpha chains and two TCR beta chains. While endogenous TCR alpha/beta chains form a receptor that is self-sufficient, introduced TCR alpha/beta chains form a receptor with a certain specificity for a given target antigen.

Однако генная терапия TCR требует достаточной экспрессии перенесенных (то есть трансгенных) TCR, поскольку перенесенный TCR может быть разбавлен присутствием эндогенного TCR, что приводит к субоптимальной экспрессии специфичного для опухоли TCR. Кроме того, может происходить неправильное связывание между эндогенными и введенными цепями с образованием новых рецепторов, которые могут проявлять неожиданную специфичность для аутоантигенов и вызывать аутоиммунное повреждение при передаче пациентам.However, TCR gene therapy requires sufficient expression of the transferred (i.e., transgenic) TCR, since the transferred TCR may be diluted by the presence of endogenous TCR, resulting in suboptimal expression of the tumor-specific TCR. In addition, misbinding may occur between endogenous and introduced chains to form new receptors that may exhibit unexpected specificity for autoantigens and cause autoimmune damage when transmitted to patients.

Следовательно, было разработано несколько стратегий для снижения риска ошибочного связывания между эндогенными и введенными цепями TCR. Мутации в альфа/бета-интерфейсе TCR - одна из стратегий, используемых в настоящее время для уменьшения нежелательного ошибочного спаривания. Например, введение цистеина в константные домены альфа- и бета-цепи позволяет образовывать дисульфидную связь и улучшает спаривание введенных цепей, уменьшая при этом ошибочное связывание с цепями дикого типа.Consequently, several strategies have been developed to reduce the risk of misbinding between endogenous and introduced TCR chains. Mutations in the TCR alpha/beta interface are one of the strategies currently used to reduce unwanted mismatching. For example, introducing cysteine into the alpha and beta chain constant domains allows disulfide bond formation and improves pairing of the introduced chains while reducing erroneous binding to wild-type chains.

Соответственно, TCR, используемые в настоящем изобретении, могут содержать одну или несколько мутаций на границе α-цепи/в-цепи, так что, когда α-цепь и β-цепь экспрессируются в Т-клетке, частоAccordingly, the TCRs used in the present invention may contain one or more mutations at the α-chain/b-chain boundary such that when the α-chain and β-chain are expressed in a T cell, often

- 34 046120 та ошибочного спаривания между указанными цепями и эндогенные TCR α и β цепи снижена. В одном варианте осуществления одна или несколько мутаций вводят остаток цистеина в домен константной области каждой из α-цепи и β-цепи, где остатки цистеина способны образовывать дисульфидную связь между α-цепью и β-цепью.- 34 046120 mismatch between these chains and the endogenous TCR α and β chains is reduced. In one embodiment, one or more mutations introduce a cysteine residue into the constant region domain of each of the α chain and the β chain, where the cysteine residues are capable of forming a disulfide bond between the α chain and the β chain.

Другая стратегия уменьшения количества ошибочных связываний основана на введении полинуклеотидных последовательностей, кодирующих миРНК, добавленных к генам, кодирующим специфичные для опухоли α- или β-цепи TCR, и предназначенных для ограничения экспрессии эндогенных генов TCR (Okamoto S. Cancer research 69, 9003-9011, 2009).Another strategy for reducing misbindings is based on the introduction of polynucleotide sequences encoding siRNAs added to genes encoding tumor-specific TCR α- or β-chains and designed to limit the expression of endogenous TCR genes (Okamoto S. Cancer research 69, 9003-9011 , 2009).

Соответственно, вектор или полинуклеотид, кодирующий TCR, используемые в настоящем изобретении, могут включать одну или несколько миРНК или других агентов, направленных на ограничение или отмену экспрессии эндогенных генов TCR.Accordingly, a vector or polynucleotide encoding a TCR used in the present invention may include one or more siRNAs or other agents aimed at limiting or abolishing the expression of endogenous TCR genes.

Также можно комбинировать искусственные нуклеазы, такие как цинковопальцевые нуклеазы (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (TALEN) или системы CRISPR/Cas, предназначенные для нацеливания на константные области эндогенных генов TCR (TRAC и/или TRBC), чтобы получить постоянное разрушение эндогенных генов альфа- и/или бета-цепей TCR, что обеспечивает полную экспрессию специфичного для опухоли TCR и, таким образом, снижает или устраняет риск ошибочного связывания TCR. Этот процесс, известный как редактирование гена TCR, оказался лучше передачи гена TCR in vitro and in vivo (Provasi E., Genovese P., Nature Medicine May; 18(5):807-15; 2012).It is also possible to combine artificial nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), or CRISPR/Cas systems designed to target the constant regions of endogenous TCR genes (TRAC and/or TRBC) to obtain permanent disruption endogenous TCR alpha and/or beta chain genes, which ensures full expression of the tumor-specific TCR and thus reduces or eliminates the risk of TCR misbinding. This process, known as TCR gene editing, has been shown to be superior to TCR gene transfer in vitro and in vivo (Provasi E, Genovese P, Nature Medicine May; 18(5):807-15; 2012).

Кроме того, технология редактирования генома позволяет целенаправленно интегрировать кассету экспрессии, содержащую полинуклеотид, кодирующий TCR, используемый в настоящем изобретении, и, необязательно, одну или несколько областей промотора и/или других последовательностей контроля экспрессии, в эндогенный ген, нарушенный искусственными нуклеазами (Lombardo A., Nature biotechnology 25, 1298-1306; 2007).In addition, genome editing technology allows for the targeted integration of an expression cassette containing a polynucleotide encoding the TCR used in the present invention, and optionally one or more promoter regions and/or other expression control sequences, into an endogenous gene disrupted by artificial nucleases (Lombardo A ., Nature biotechnology 25, 1298-1306; 2007).

Другая стратегия, разработанная для увеличения экспрессии трансгенных TCR и уменьшения ошибочного связывания TCR, заключается в муринизировании, при котором константные области TCR а и TCR человека (например, области TRAC, TRBC1 и TRBC2) заменяются их мышиными аналогами. Муринизированние константных областей TCR описана, например, в Sommermeyer и Uckert J. Immunol; 2010 (184: 6223-6231). Соответственно, TCR, используемый в настоящем изобретении, может быть муринизирован.Another strategy developed to increase the expression of transgenic TCRs and reduce TCR misbinding is murinization, in which human TCR α and TCR constant regions (eg, the TRAC, TRBC1, and TRBC2 regions) are replaced with their murine counterparts. Murinization of TCR constant regions is described, for example, in Sommermeyer and Uckert J. Immunol; 2010 (184: 6223-6231). Accordingly, the TCR used in the present invention may be murinized.

Химерный антигенный рецептор (CAR).Chimeric antigen receptor (CAR).

CAR содержат внеклеточный связывающий лиганд домен, чаще всего одноцепочечный вариабельный фрагмент моноклонального антитела (scFv), связанный с внутриклеточными сигнальными компонентами, чаще всего CD3C, отдельно или в сочетании с одним или несколькими костимуляторными доменами. Спейсер часто добавляют между внеклеточным антигенсвязывающим доменом и трансмембранным фрагментом для оптимизации взаимодействия с мишенью.CARs contain an extracellular ligand binding domain, most often a single chain monoclonal antibody fragment variable (scFv), linked to intracellular signaling components, most often CD3C, alone or in combination with one or more costimulatory domains. A spacer is often added between the extracellular antigen-binding domain and the transmembrane moiety to optimize interaction with the target.

CAR для использования в настоящем изобретении может содержать антиген-специфический нацеливающий домен;A CAR for use in the present invention may comprise an antigen-specific targeting domain;

трансмембранный домен;transmembrane domain;

необязательно, по меньшей мере, один костимуляторный домен; а также внутриклеточный сигнальный домен.optionally at least one costimulatory domain; as well as an intracellular signaling domain.

Предпочтительно антиген-специфический нацеливающий домен содержит антитело или его фрагмент, более предпочтительно, вариабельный фрагмент с одной цепью.Preferably, the antigen-specific targeting domain comprises an antibody or fragment thereof, more preferably a single chain variable fragment.

Предпочтительно антиген-специфический нацеливающий домен нацеливается на TAA.Preferably, the antigen-specific targeting domain targets the TAA.

В одном варианте осуществления антиген-специфический нацеливающий домен нацеливается на CD19.In one embodiment, the antigen-specific targeting domain targets CD19.

Примеры трансмембранных доменов включают трансмембранный домен дзета-цепи Т-клеточного рецепторного комплекса, CD28 и CD8a.Examples of transmembrane domains include the T cell receptor complex zeta chain transmembrane domain, CD28, and CD8a.

Примеры костимулирующих доменов включают в себя костимулирующий домен из CD28, CD137 (4-1ВВ), CD134 (ОХ40), Dap1O, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30 и CD40.Examples of costimulatory domains include the costimulatory domain of CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), Dap1O, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas , CD30 and CD40.

В одном варианте осуществления костимуляторный домен представляет собой костимулирующий домен из CD28.In one embodiment, the costimulatory domain is a costimulatory domain from CD28.

Примеры внутриклеточных сигнальных доменов включают дзета-цепь CD3 человека, FcyRIII, FcsRI, цитоплазматический хвост Fc-рецептора и иммунорецепторный мотив активации на основе тирозина (ITAM), несущий цитоплазматические рецепторы.Examples of intracellular signaling domains include human CD3 zeta chain, FcyRIII, FcsRI, Fc receptor cytoplasmic tail, and immunoreceptor tyrosine activation motif (ITAM) bearing cytoplasmic receptors.

Химерные антигенные рецепторы.Chimeric antigen receptors.

Термин химерный антигенный рецептор или CAR или CAR в контексте настоящего описания относится к сконструированным рецепторам, которые могут придавать антигенную специфичность клеткам (например, Т-клеткам, таким как наивные Т-клетки, Т-клетки центральной памяти, эффекторные Тклетки памяти или их комбинации). CAR также известны как искусственные Т-клеточные рецепторы, химерные Т-клеточные рецепторы или химерные иммунорецепторы. Предпочтительно, CAR по изобреThe term chimeric antigen receptor or CAR or CAR as used herein refers to engineered receptors that can impart antigen specificity to cells (e.g., T cells such as naïve T cells, central memory T cells, effector memory T cells, or combinations thereof) . CARs are also known as artificial T cell receptors, chimeric T cell receptors, or chimeric immunoreceptors. Preferably, CAR according to the invention

- 35 046120 тению содержат антиген-специфическую нацеливающую область, внеклеточный домен, трансмембранный домен, необязательно, один или несколько костимуляторных доменов и внутриклеточный сигнальный домен.- 35 046120 tenia contain an antigen-specific targeting region, an extracellular domain, a transmembrane domain, optionally one or more costimulatory domains and an intracellular signaling domain.

Антиген-специфический нацеливающий домен.Antigen-specific targeting domain.

Антиген-специфический нацеливающий домен обеспечивает CAR способностью связываться с целевым антигеном, представляющим интерес. Антиген-специфический нацеливающий домен, предпочтительно, направлен на антиген, представляющий клинический интерес, против которого было бы желательно инициировать эффекторный иммунный ответ, который приводит к уничтожению опухоли.The antigen-specific targeting domain provides the CAR with the ability to bind to the target antigen of interest. The antigen-specific targeting domain is preferably directed to an antigen of clinical interest against which it would be desirable to initiate an effector immune response that results in tumor killing.

Антиген-специфический направляющий домен может представлять собой любой белок или пептид, который обладает способностью специфически распознавать и связываться с биологической молекулой (например, рецептором клеточной поверхности или опухолевым белком или его компонентом). Антигенспецифический направляющий домен включает природного, синтетического, полусинтетического или рекомбинантно полученного связывающего партнера для представляющей интерес биологической молекулы.An antigen-specific targeting domain can be any protein or peptide that has the ability to specifically recognize and bind to a biological molecule (eg, a cell surface receptor or a tumor protein or a component thereof). An antigen-specific targeting domain includes a natural, synthetic, semi-synthetic, or recombinantly produced binding partner for a biological molecule of interest.

Иллюстративные антиген-специфичные нацеливающие домены включают антитела или фрагменты или производные антител, внеклеточные домены рецепторов, лиганды для молекул/рецепторов клеточной поверхности или их связывающие рецептор домены и связывающие опухоль белки.Exemplary antigen-specific targeting domains include antibodies or antibody fragments or derivatives, extracellular domains of receptors, ligands for cell surface molecules/receptors or receptor binding domains thereof, and tumor binding proteins.

В предпочтительном варианте осуществления антиген-специфический нацеливающий домен представляет собой антитело или происходит от него. Нацеливающий домен антитела может представлять собой фрагмент антитела или генно-инженерный продукт одного или нескольких фрагментов антитела, причем этот фрагмент участвует в связывании с антигеном. Примеры включают вариабельную область (Fv), определяющую комплементарность область (CDR), Fab, одноцепочечное антитело (scFv), вариабельную область тяжелой цепи (VH), вариабельную область легкой цепи (VL) и антитело верблюда (VHH).In a preferred embodiment, the antigen-specific targeting domain is or is derived from an antibody. The targeting domain of an antibody may be an antibody fragment or a genetically engineered product of one or more antibody fragments, which fragment is involved in binding to an antigen. Examples include variable region (Fv), complementarity determining region (CDR), Fab, single chain antibody (scFv), heavy chain variable region (VH), light chain variable region (VL) and camel antibody (VHH).

В предпочтительном варианте осуществления связывающий домен представляет собой одноцепочечное антитело (scFv). ScFv может быть мышиным, человеческим или гуманизированным scFv.In a preferred embodiment, the binding domain is a single chain antibody (scFv). The ScFv may be murine, human, or humanized scFv.

Область, определяющая комплементарность или CDR в отношении антитела или его антигенсвязывающего фрагмента относится к высоко вариабельной петле в вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи антитела. CDR могут взаимодействовать с конформацией антигена и в значительной степени определять связывание с антигеном (хотя известно, что некоторые каркасные области участвуют в связывании). Вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи содержат по 3 CDR.The complementarity determining region or CDR for an antibody or antigen binding fragment thereof refers to a highly variable loop in the variable region of the heavy chain or light chain of an antibody. CDRs can interact with the conformation of the antigen and largely determine antigen binding (although some framework regions are known to be involved in binding). The heavy chain variable region and the light chain variable region each contain 3 CDRs.

Вариабельная область тяжелой цепи или VH относится к фрагменту тяжелой цепи антитела, который содержит три CDR, расположенные между фланкирующими участками, известными как каркасные области, которые являются более консервативными, чем CDR, и образуют каркас для поддержки CDR.A heavy chain variable region, or VH, refers to a fragment of an antibody heavy chain that contains three CDRs located between flanking regions known as framework regions, which are more conserved than the CDRs and form a framework to support the CDRs.

Вариабельная область легкой цепи или VL относится к фрагменту легкой цепи антитела, который содержит три CDR, вставленных между каркасными областями.A light chain variable region, or VL, refers to a fragment of an antibody light chain that contains three CDRs inserted between framework regions.

Fv относится к наименьшему фрагменту антитела, который несет полный сайт связывания антигена. Fv-фрагмент состоит из вариабельной области одной легкой цепи, связанной с вариабельной областью одной тяжелой цепи.Fv refers to the smallest antibody fragment that carries the complete antigen binding site. The Fv fragment consists of a single light chain variable region linked to a single heavy chain variable region.

Одноцепочечное Fv-антитело или scFv относится к сконструированному антителу, состоящему из вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи, соединенных друг с другом напрямую или через последовательность пептидного линкера.A single chain Fv antibody or scFv refers to an engineered antibody consisting of a light chain variable region and a heavy chain variable region linked to each other directly or through a peptide linker sequence.

Антитела, которые специфически связывают молекулу поверхности опухолевой клетки, могут быть получены с использованием способов, хорошо известных в данной области. Такие способы включают фаговый дисплей, способы получения человеческих или гуманизированных антител или способы с использованием трансгенного животного или растения, сконструированного для получения человеческих антител. Доступны библиотеки фагового дисплея частично или полностью синтетических антител, которые можно подвергать скринингу на наличие антитела или его фрагмента, которые могут связываться с молекулой-мишенью. Также доступны библиотеки фагового дисплея человеческих антител. После идентификации аминокислотную последовательность или полинуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, можно выделить и/или определить.Antibodies that specifically bind a tumor cell surface molecule can be prepared using methods well known in the art. Such methods include phage display, methods for producing human or humanized antibodies, or methods using a transgenic animal or plant engineered to produce human antibodies. Phage display libraries of partially or fully synthetic antibodies are available and can be screened for the presence of an antibody or fragment thereof that can bind to the target molecule. Human antibody phage display libraries are also available. Once identified, the amino acid sequence or polynucleotide sequence encoding the antibody can be isolated and/or determined.

Что касается нацеливающих доменов, которые нацелены на раковые антигены, выбор нацеливающего домена будет зависеть от типа злокачественного новообразования, подлежащего лечению, и может нацеливаться на опухолевые антигены. Образец опухоли от индивида может быть охарактеризован на наличие определенных биомаркеров или маркеров клеточной поверхности. Например, клетки злокачественного новообразования молочной железы от индивида могут быть положительными или отрицательными для каждого из Her2Neu, рецептора эстрогена и/или рецептора прогестерона. Выбирают опухолевый антиген или молекулу клеточной поверхности, которая обнаруживается в опухолевых клетках индивидуума. Предпочтительно, антиген-специфический нацеливающий домен направлен на молекулу клеточной поверхности, которая обнаружена в опухолевых клетках и по существу не обнаружена в нормальных тканях или ограничена по своей экспрессии в неживых нормальных тканях.With respect to targeting domains that target cancer antigens, the choice of targeting domain will depend on the type of cancer being treated and may target tumor antigens. A tumor sample from an individual can be characterized for the presence of certain biomarkers or cell surface markers. For example, breast cancer cells from an individual may be positive or negative for each of Her2Neu, estrogen receptor and/or progesterone receptor. A tumor antigen or cell surface molecule that is found on the individual's tumor cells is selected. Preferably, the antigen-specific targeting domain is directed to a cell surface molecule that is found in tumor cells and is substantially not found in normal tissues or is limited in its expression in non-living normal tissues.

- 36 046120- 36 046120

TAA, на который может быть нацелен CAR, используемый в настоящем изобретении, включает, но не ограничивается этим, один или несколько из следующих: гематопоэтическую стволовую клетку (HSC), гематопоэтическую клетку-предшественник (НРС), миелоид/моноцит-коммитированную клеткупредшественник, макрофаг или моноцит, содержащий вектор, в котором вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, предпочтительно, где TAA выбран из группы, включающей карциноэмбриональный антиген (СЕА), рецептор эстрогена, рецептор прогестерона, ephrinB2, ROR1, мезотелин, c-Met, GD-2 и MAGE A3 TCR, 4-1BB, антиген аденокарциномы, альфа-фетопротеин BAFF, клетку В-лимфомы, антиген С242, карбоангидразу 9 (CA-IX), CCR4, CD152, CD200, Cd22, CD19, CD22, CD123, CD221, CD23 (рецептор IgE), CD28, CD4, CD40, CD44, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CS-1, CNTO888, CTLA-4, DR5, EpCAM, CD3, дополнительный домен фибронектина-В, рецептор фолата 1, гликопротеин 75, GPNMB, HGF, рецептор-киназы фактор роста гепатоцитов человека, рецептор IGF-1, IGF-I, IgG1, L1-CAM, IL-13, IL-6, рецептор инсулиноподобного фактора роста I, интегрин α5β1, интегрин ave3, MORAb-009, MS4A1, муцин CanAg, N-гликолилнейраминовую кислоту, NPC-1C, PDGF-Ra, PDL192, фосфатидилсерин, клетки карциномы предстательной железы, RANKL, RON, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, тенасцин С, TGF бета 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, опухолевый антиген CTAA16.88, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, виментин, 5Т4, CD5, CD19, CD20, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD45, САМРАТН-1 (CDw52), HLA-DR, антиидиотип, TAG-72, Ep-CAM, MUC1, фолат-связывающий белок, А33, G250, простатический специфический мембранный антиген, (PSMA), простатический специфический антиген (PSA), ферритин, ганглиозиды (например, GD2, GD3, GM2), Ley, CA-125, СА19-9, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), p185HER2, рецептор IL-2, de2-7 EGFR, белок активации фибробластов (FAP), тенасцин, металлопротеиназы, эндосиалин, карбоноангидразу, галектин 9, альдолазу A, eIFy4, тирозиназа, галектин 4, HERKV-K10, р53, NY-LU-12, рестин, NY-CO-38, MAGE-1, MAGE-4a, SSX2, NY-ESO-1, SCP-1, 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, b-катенин/ш, Bcr-abl, CAMEL, САР-1, CASP-8, CDC27m, CDK4/m, CT, Cyp-B, DAM-6 (MAGE-B2) and DAM-10 (MAGE-B1), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT (hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/мелан-А, MC1R, миозин/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NYESO-1, P15, p190 минорный bcr-abl, Pm1/RARa, PRAME, RAGE, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, белок 1, gp75, TRP-2, TRP-2/INT2 и WT1.TAAs that can be targeted by a CAR used in the present invention include, but are not limited to, one or more of the following: hematopoietic stem cell (HSC), hematopoietic progenitor cell (HPC), myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or a monocyte containing a vector, wherein the vector contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine, preferably wherein the TAA is selected from the group consisting of carcinoembryonic antigen (CEA) , estrogen receptor, progesterone receptor, ephrinB2, ROR1, mesothelin, c-Met, GD-2 and MAGE A3 TCR, 4-1BB, adenocarcinoma antigen, BAFF alpha-fetoprotein, B lymphoma cell, C242 antigen, carbonic anhydrase 9 (CA- IX), CCR4, CD152, CD200, Cd22, CD19, CD22, CD123, CD221, CD23 (IgE receptor), CD28, CD4, CD40, CD44, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CS-1, CNTO888, CTLA-4, DR5, EpCAM, CD3, fibronectin-B additional domain, folate receptor 1, glycoprotein 75, GPNMB, HGF, human hepatocyte growth factor receptor kinase, IGF-1 receptor, IGF-I, IgG1, L1- CAM, IL-13, IL-6, insulin-like growth factor I receptor, α5β1 integrin, ave3 integrin, MORAb-009, MS4A1, CanAg mucin, N-glycolylneuraminic acid, NPC-1C, PDGF-Ra, PDL192, phosphatidylserine, carcinoma cells prostate gland, RANKL, RON, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, tenascin C, TGF beta 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, tumor antigen CTAA16.88, vascular endothelial growth factor (VEGF), VEGF-A , VEGFR-1, VEGFR2, vimentin, 5T4, CD5, CD19, CD20, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD45, CAMPATH-1 (CDw52), HLA-DR, antiidiotype, TAG-72, Ep-CAM, MUC1, folate binding protein, A33, G250, prostate specific membrane antigen (PSMA), prostate specific antigen (PSA), ferritin, gangliosides (e.g. GD2, GD3, GM2), Ley, CA-125, CA19-9, epidermal growth factor receptor (EGFR), p185HER2, IL-2 receptor, de2-7 EGFR, fibroblast activation protein (FAP), tenascin, metalloproteinases, endosialin, carbonic anhydrase, galectin 9, aldolase A, eIFy4, tyrosinase, galectin 4, HERKV- K10, p53, NY-LU-12, restin, NY-CO-38, MAGE-1, MAGE-4a, SSX2, NY-ESO-1, SCP-1, 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, b-catenin/w, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27m, CDK4/m, CT, Cyp-B, DAM-6 (MAGE-B2) and DAM-10 (MAGE-B1), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT (hTRT), iCE , KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melan-A, MC1R, myosin/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NYESO-1, P15, p190 minor bcr-abl, Pm1/RARa, PRAME, RAGE, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, protein 1, gp75, TRP-2, TRP- 2/INT2 and WT1.

Костимуляторный домен.Costimulatory domain.

CAR, используемый в настоящем изобретении, также может содержать один или несколько костимуляторных доменов. Этот домен может усиливать пролиферацию клеток, выживание клеток и развитие клеток памяти.The CAR used in the present invention may also contain one or more costimulatory domains. This domain can enhance cell proliferation, cell survival, and memory cell development.

Каждый костимуляторный домен содержит костимуляторный домен любого одного или нескольких, например, членов суперсемейства TNFR, CD28, CD137 (4-1ВВ), CD134 (ОХ40), Dap1O, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-1, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 или их комбинации. Костимулирующие домены из других белков также могут быть использованы с CAR, используемым в настоящем изобретении. Дополнительные костимулирующие домены будут очевидны для специалистов в данной области.Each costimulatory domain contains a costimulatory domain of any one or more, for example, members of the TNFR superfamily, CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), Dap1O, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR -1, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 or combinations thereof. Costimulatory domains from other proteins can also be used with the CAR used in the present invention. Additional co-stimulatory domains will be apparent to those skilled in the art.

Внутриклеточный сигнальный домен.Intracellular signaling domain.

CAR, используемый в настоящем изобретении, также может содержать внутриклеточный сигнальный домен. Этот домен может быть цитоплазматическим и может преобразовывать сигнал эффекторной функции и направлять клетку на выполнение своей специализированной функции. Примеры внутриклеточных сигнальных доменов включают, но не ограничиваются ими, ζ цепь рецептора Т-клетки или любой из его гомологов (например, η-цепь, FcεR1γ и β-цепи, цепь МВ1 (Iga), цепь В29 (Ige) и т.д.), полипептиды CD3 (Δ, δ и ε), тирозинкиназы семейства syk (Syk, ZAP 70 и т.д.), тирозинкиназы семейства src (Lck, Fyn, Lyn и др.) и другие молекулы, участвующие в трансдукции Т-клеток, такие как CD2, CD5 и CD28. Внутриклеточный сигнальный домен может представлять собой дзета-цепь CD3 человека, FcyRIII, FcsRI, цитоплазматические хвосты Fc-рецепторов, иммунорецепторный мотив активации на основе тирозина (ITAM), несущий цитоплазматические рецепторы, или их комбинации.The CAR used in the present invention may also contain an intracellular signaling domain. This domain may be cytoplasmic and can transduce the effector function signal and direct the cell to perform its specialized function. Examples of intracellular signaling domains include, but are not limited to, the T cell receptor ζ chain or any of its homologues (e.g., η chain, FcεR1γ and β chains, MB1 chain (Iga), B29 chain (Ige), etc. .), CD3 polypeptides (Δ, δ and ε), tyrosine kinases of the syk family (Syk, ZAP 70, etc.), tyrosine kinases of the src family (Lck, Fyn, Lyn, etc.) and other molecules involved in the transduction of T- cells such as CD2, CD5 and CD28. The intracellular signaling domain may be human CD3 zeta chain, FcyRIII, FcsRI, Fc receptor cytoplasmic tails, immunoreceptor tyrosine activation motif (ITAM) bearing cytoplasmic receptors, or combinations thereof.

Трансмембранный домен.Transmembrane domain.

CAR, используемый в настоящем изобретении, также может содержать трансмембранный домен. Трансмембранный домен может содержать трансмембранную последовательность из любого белка, который имеет трансмембранный домен, включая любой из трансмембранных белков типа I, типа II или типа III. Трансмембранный домен CAR, используемый в настоящем изобретении, также может содержать искусственную гидрофобную последовательность. Трансмембранные домены CAR, используемых в настоящем изобретении, могут быть выбраны так, чтобы не димеризоваться. Дополнительные трансмембранные домены будут очевидны для специалистов в данной области. Примерами трансмембранных (ТМ) областей, используемых в конструкциях CAR, являются: 1) область CD28 ТМ (Pule et al., Mol Ther, 2005, Nov;12(5):933-41; Brentjens et al., CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35; Casucci et al., Blood, 2013, Nov 14; 122(20):3461-72.); 2) область ТМ ОХ40 (Pule et al., Mol Ther, 2005, ноябрь; 12 (5): 933-41); 3) обThe CAR used in the present invention may also contain a transmembrane domain. The transmembrane domain may comprise a transmembrane sequence from any protein that has a transmembrane domain, including any of the type I, type II, or type III transmembrane proteins. The CAR transmembrane domain used in the present invention may also contain an artificial hydrophobic sequence. The transmembrane domains of the CARs used in the present invention may be selected so as not to dimerize. Additional transmembrane domains will be apparent to those skilled in the art. Examples of transmembrane (TM) regions used in CAR constructs are: 1) the CD28 TM region (Pule et al., Mol Ther, 2005, Nov;12(5):933-41; Brentjens et al., CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35; Casucci et al., Blood, 2013, Nov 14; 122(20):3461-72.); 2) the OX40 TM region (Pule et al., Mol Ther, 2005, Nov; 12 (5): 933-41); 3) about

- 37 046120 ласть ТМ 41ВВ (Brentjens et al., CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35); 4) область CD3 zeta TM (Pule et al., Mol Ther, 2005, Nov; 12(5):933-41; Savoldo B, Blood, 2009, Jun 18; 113(25):6392-402); 5) область ТМ CD8a (Maher et al., Nat Biotechnol, 2002, Jan; 20 (1): 70-5.; Imai C, Leukemia, 2004, Apr; 18(4):676-84; Brentjens et al., CCR, 2007, Sep 15; 13(18 Pt 1):5426-35; Milone et al., Mol Ther, 2009, Aug; 17(8): 1453-64.).- 37 046120 last TM 41ВВ (Brentjens et al., CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35); 4) CD3 zeta TM region (Pule et al., Mol Ther, 2005, Nov; 12(5):933-41; Savoldo B, Blood, 2009, Jun 18; 113(25):6392-402); 5) CD8a TM region (Maher et al., Nat Biotechnol, 2002, Jan; 20 (1): 70-5.; Imai C, Leukemia, 2004, Apr; 18 (4): 676-84; Brentjens et al. , CCR, 2007, Sep 15; 13(18 Pt 1):5426-35; Milone et al., Mol Ther, 2009, Aug; 17(8): 1453-64.).

Ингибитор контрольных точек иммунитета.Immune checkpoint inhibitor.

Как используется в настоящем документе, термин ингибитор контрольных точек иммунитета относится к молекуле, соединению, антителу или лекарственному средству, которые ингибируют, блокируют, предотвращают, уменьшают или подавляют экспрессию или иным образом антагонистичны молекуле ингибитора контрольных точек иммунитета. При экспрессии на клеточной поверхности ингибирующая контрольные точки молекула ингибирует или ослабляет опосредованный Т-клетками иммунный ответ на указанную клетку. Например, экспрессия ингибирующих контрольные точки молекул может препятствовать гибели клетки от ответа Т -клеток. Этот механизм особенно вреден, когда раковая клетка экспрессирует ингибирующие контрольные точки молекулы, поскольку это может позволить злокачественной клетке избежать ответа Т-клеток хозяина. Соответственно, когда ингибирующие контрольные точки молекулы на опухолевых клетках ингибируются ингибитором контрольных точек иммунитета, должен происходить усиленный ответ Т-клеток хозяина против опухолевой клетки.As used herein, the term immune checkpoint inhibitor refers to a molecule, compound, antibody or drug that inhibits, blocks, prevents, reduces or suppresses the expression of or otherwise antagonizes an immune checkpoint inhibitor molecule. When expressed on the cell surface, the checkpoint inhibitory molecule inhibits or weakens the T cell-mediated immune response to the specified cell. For example, the expression of checkpoint inhibitory molecules can prevent cell death from the T cell response. This mechanism is particularly harmful when the cancer cell expresses checkpoint inhibitory molecules, as this may allow the malignant cell to evade the host T cell response. Accordingly, when checkpoint inhibitory molecules on tumor cells are inhibited by an immune checkpoint inhibitor, an enhanced host T cell response against the tumor cell should occur.

В одном варианте осуществления ингибитор контрольных точек иммунитета ингибирует ингибирующую контрольныей точки молекулу, выбранную из группы, состоящей из A2AR (рецептор аденозина А2А), В7-Н3 (CD276), В7-Н4 (VTCN1), BTLA (аттенюатор В- и Т-лимфоцитов; CD272), HVEM (медиатор проникновения вируса герпеса), CTLA-4 (цитотоксический белок, ассоциированный с Тлимфоцитами 4; CD152), IDO (инлоламин-2,3-диоксигеназа), TDO (триптофан-2,3-диоксигеназа), KIR (киллерный иммуноглобулиноподобный рецептор), LAG3 (ген активации лимфоцитов 3), PD-1 (рецептор запрограммированной смерти 1), PD-L1 (лиганд 1 PD-1), PD-L2 (лиганд 2 PD-1), TIM-3 (Т-клеточный домен иммуноглобулина и домен муцина-3), VISTA (Ig-супрессор V-домена активации Т-клеток), В7-1 (CD80), В7-2 (CD86). Комбинации ингибиторов контрольных точек иммунитета также могут быть использованы.In one embodiment, the immune checkpoint inhibitor inhibits a checkpoint inhibitory molecule selected from the group consisting of A2AR (adenosine A2A receptor), B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), BTLA (B and T lymphocyte attenuator ; CD272), HVEM (herpes virus entry mediator), CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte associated protein 4; CD152), IDO (inlolamine 2,3-dioxygenase), TDO (tryptophan 2,3-dioxygenase), KIR (killer immunoglobulin-like receptor), LAG3 (lymphocyte activation gene 3), PD-1 (programmed death receptor 1), PD-L1 (PD-1 ligand 1), PD-L2 (PD-1 ligand 2), TIM-3 ( T-cell immunoglobulin domain and mucin-3 domain), VISTA (Ig suppressor of the V-domain of T-cell activation), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86). Combinations of immune checkpoint inhibitors may also be used.

В одном варианте осуществления ингибитор контрольных точек иммунитета представляет собой ингибитор PD-1; предпочтительно, ингибитор PD-1 представляет собой анти-PD-1 антитело.In one embodiment, the immune checkpoint inhibitor is a PD-1 inhibitor; preferably, the PD-1 inhibitor is an anti-PD-1 antibody.

В другом варианте осуществления ингибитор контрольных точек иммунитета представляет собой ингибитор PD-L1; предпочтительно, ингибитор PD-L1 представляет собой αнтu-PD-L1 антитело.In another embodiment, the immune checkpoint inhibitor is a PD-L1 inhibitor; preferably, the PD-L1 inhibitor is an αntu-PD-L1 antibody.

В другом варианте осуществления ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой ингибитор PD-L2, предпочтительно, ингибитор PD-L2 представляет собой анти-PD-L2 антитело.In another embodiment, the immune checkpoint inhibitor is a PD-L2 inhibitor, preferably the PD-L2 inhibitor is an anti-PD-L2 antibody.

В другом варианте осуществления ингибитор контрольных точек иммунитета представляет собой ингибитор CTLA4, предпочтительно, ингибитор CTLA4 представляет собой анти-CTLA4 антитело.In another embodiment, the immune checkpoint inhibitor is a CTLA4 inhibitor, preferably the CTLA4 inhibitor is an anti-CTLA4 antibody.

В другом варианте осуществления ингибитор контрольных точек иммунитета представляет собой ингибитор LAG-3; предпочтительно, ингибитор LAG-3 представляет собой анти-LAG-3 антитело.In another embodiment, the immune checkpoint inhibitor is a LAG-3 inhibitor; preferably, the LAG-3 inhibitor is an anti-LAG-3 antibody.

Как используется в настоящем документе, термин антитело понимается как полипептид, в значительной степени кодируемый геном иммуноглобулина или генами иммуноглобулина или их фрагментами, которые специфически связывают и распознают антиген (например, маркер клеточной поверхности). Как используется в настоящем документе, термин антитело относится к цельной или интактной молекуле антитела (например, IgM, IgG (включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4), IgA, IgD или IgE) или любому их антигенсвязывающему фрагменту.As used herein, the term antibody is understood to mean a polypeptide substantially encoded by an immunoglobulin gene or immunoglobulin genes or fragments thereof that specifically binds and recognizes an antigen (eg, a cell surface marker). As used herein, the term antibody refers to a whole or intact antibody molecule (eg, IgM, IgG (including IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4), IgA, IgD or IgE) or any antigen-binding fragment thereof.

Антитело может представлять собой поликлональное антитело или моноклональное антитело. Моноклональные антитела продуцируются идентичными иммунными клетками (например, гибридомами, которые могут быть получены в результате слияния линии В-клеток, продуцирующих антитела, и линии раковых В-клеток). Моноклональное антитело, направленное на конкретный антиген, распознает один специфический эпитоп на указанном антигене. Напротив, поликлональные антитела продуцируются из множества неидентичных клеточных линий и поэтому распознают несколько разных эпитопов на конкретном антигене.The antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Monoclonal antibodies are produced by identical immune cells (eg, hybridomas, which can be produced by fusing an antibody-producing B cell line with a cancer B cell line). A monoclonal antibody directed to a specific antigen recognizes one specific epitope on that antigen. In contrast, polyclonal antibodies are produced from multiple non-identical cell lines and therefore recognize several different epitopes on a particular antigen.

Антиген-связывающие фрагменты антитела включают, например, одноцепочечное антитело, одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv), Fd-фрагмент, Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент или F(ab')2 -фрагмент. scFvфрагмент представляет собой одну полипептидную цепь, которая включает вариабельные области тяжелой и легкой цепи антитела, из которого получен scFv. Кроме того, интратела, миниантитела, триатела и диатела (см., например, Todorovska et al. (2001) J Immunol Methods 248(1):47-66; Hudson and Kortt (1999) J Immunol Methods 231(1): 177-189; Poljak 25 (1994) Structure 2(12): 1121-1123; Rondon and Marasco (1997) Annual Review of Microbiology 21:257-283, также включены в определение антител и совместимы для использования в описанных здесь способах. Термин антитело, как используется в настоящем документе, также включает фрагменты антител, полученные либо путем модификации целых антител, либо фрагментов, синтезированных de novo с использованием рекомбинантных методов.Antigen-binding antibody fragments include, for example, a single chain antibody, a single chain Fv fragment (scFv), an Fd fragment, a Fab fragment, a Fab' fragment, or an F(ab') 2 fragment. The scFv fragment is a single polypeptide chain that includes the heavy and light chain variable regions of the antibody from which the scFv is derived. In addition, intrabodies, minibodies, tribodies and diabodies (see, for example, Todorovska et al. (2001) J Immunol Methods 248(1):47-66; Hudson and Kortt (1999) J Immunol Methods 231(1): 177 -189; Poljak 25 (1994) Structure 2(12): 1121-1123; Rondon and Marasco (1997) Annual Review of Microbiology 21:257-283 are also included in the definition of antibodies and are compatible for use in the methods described herein. The term antibody , as used herein, also includes antibody fragments produced either by modification of whole antibodies or fragments synthesized de novo using recombinant methods.

Подходящие способы получения антитела или его антигенсвязывающих фрагментов, направленных на конкретный антиген, известны в данной области (см., например, Greenfield (2014) Antibodies: A Laboratory Manual, Second Edition 201-221).Suitable methods for producing an antibody or antigen-binding fragments thereof directed to a specific antigen are known in the art (see, for example, Greenfield (2014) Antibodies: A Laboratory Manual, Second Edition 201-221).

- 38 046120- 38 046120

Варианты, производные, аналоги, гомологи и фрагменты.Variants, derivatives, analogs, homologues and fragments.

В дополнение к конкретным белкам и полинуклеотидам, упомянутым в настоящем документе, настоящее изобретение также охватывает использование вариантов, производных, аналогов, гомологов и их фрагментов.In addition to the specific proteins and polynucleotides mentioned herein, the present invention also covers the use of variants, derivatives, analogs, homologues and fragments thereof.

В контексте настоящего изобретения вариант любой данной последовательности представляет собой последовательность, в которой конкретная последовательность остатков (остатков аминокислот или нуклеиновых кислот) была модифицирована таким образом, что рассматриваемый полипептид или полинуклеотид по существу сохраняет хотя бы одну из его эндогенных функций. Вариантная последовательность может быть получена путем добавления, делеции, замены, модификации, замены и/или изменения по меньшей мере одного остатка, присутствующего в природном белке.In the context of the present invention, a variant of any given sequence is a sequence in which a particular sequence of residues (amino acid or nucleic acid residues) has been modified such that the polypeptide or polynucleotide in question substantially retains at least one of its endogenous functions. The variant sequence can be obtained by adding, deleting, substituting, modifying, substituting and/or changing at least one residue present in the naturally occurring protein.

Термин производное, как используется в настоящем документе, в отношении белков или полипептидов по настоящему изобретению включает любое замещение, изменение, модификацию, замену, делецию и/или добавление одного (или нескольких) аминокислотных остатков из или к последовательности, при условии, что полученный белок или полипептид по существу сохраняет по меньшей мере одну из своих эндогенных функций.The term derivative, as used herein, with respect to proteins or polypeptides of the present invention includes any substitution, alteration, modification, substitution, deletion and/or addition of one (or more) amino acid residues from or to the sequence, provided that the resulting protein or the polypeptide substantially retains at least one of its endogenous functions.

Термин аналог, как используется в настоящем документе в отношении полипептидов или полинуклеотидов включает любой миметик, то есть химическое соединение, которое обладает по меньшей мере одной из эндогенных функций полипептидов или полинуклеотидов, которые он имитирует.The term analogue, as used herein in relation to polypeptides or polynucleotides, includes any mimetic, that is, a chemical compound that has at least one of the endogenous functions of the polypeptides or polynucleotides that it mimics.

Белки, используемые по настоящему изобретению, также могут иметь делеции, вставки или замены аминокислотных остатков, которые вызывают молчащие изменения и приводят к функционально эквивалентному белку. Преднамеренные аминокислотные замены могут быть сделаны на основе сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природе остатков до той степени, пока сохраняется эндогенная функция. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин; и аминокислоты с незаряженными полярными головными группами, имеющие сходные значения гидрофильности, включают аспарагин, глутамин, серин, треонин и тирозин.Proteins used in the present invention may also have deletions, insertions or substitutions of amino acid residues that cause silent changes and result in a functionally equivalent protein. Deliberate amino acid substitutions can be made based on similarity in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues to the extent that endogenous function is maintained. For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid; positively charged amino acids include lysine and arginine; and amino acids with uncharged polar head groups that have similar hydrophilicity values include asparagine, glutamine, serine, threonine and tyrosine.

Замена может включать замену аминокислоты на аналогичную аминокислоту (консервативная замена). Сходная аминокислота представляет собой аминокислоту, которая имеет фрагмент боковой цепи с соответствующими свойствами, сгруппированными вместе, например, как показано ниже:The substitution may involve replacing an amino acid with a similar amino acid (conservative substitution). A similar amino acid is an amino acid that has a side chain fragment with the corresponding properties grouped together, for example as shown below:

(i) основные боковые цепи: лизин (К), аргинин (R), гистидин (Н);(i) main side chains: lysine (K), arginine (R), histidine (H);

(ii) кислотные боковые цепи: аспарагиновая кислота (D) и глутаминовая кислота (Е);(ii) acidic side chains: aspartic acid (D) and glutamic acid (E);

(iii) незаряженные полярные боковые цепи: аспарагин (N), глутамин (Q), серин (S), треонин (Т) и тирозин (Y); или (iv) неполярные боковые цепи: глицин (G), аланин (А), валин (V), лейцин (L), изолейцин (I), пролин (Р), фенилаланин (F), метионин (М), триптофан (W) и цистеин (С).(iii) uncharged polar side chains: asparagine (N), glutamine (Q), serine (S), threonine (T) and tyrosine (Y); or (iv) non-polar side chains: glycine (G), alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), proline (P), phenylalanine (F), methionine (M), tryptophan ( W) and cysteine (C).

Вариантные последовательности могут содержать аминокислотные замены, добавления, делеции и/или вставки.Variant sequences may contain amino acid substitutions, additions, deletions and/or insertions.

Консервативные замены, добавления или делеции могут быть сделаны, например, согласно таблице ниже. Аминокислоты в одном и том же блоке во втором столбце и предпочтительно в одной и той же строке в третьем столбце могут заменять друг друга:Conservative substitutions, additions or deletions can be made, for example, according to the table below. Amino acids in the same block in the second column and preferably in the same row in the third column can replace each other:

АЛИФАТИЧЕСКИЕ ALIPHATIC Неполярные Non-polar GAP GAP IL V IL V Полярный - незаряженный Polar - uncharged CSTM CSTM NQ NQ Полярный - заряженный Polar - charged DE DE KR KR АРОМАТИЧЕСКИЙ AROMATIC HFW Y HFW Y

Настоящее изобретение также охватывает гомологичное замещение (замещение и замена, оба используются в настоящем документе для обозначения взаимной замены существующего аминокислотного остатка с альтернативным остатком), например аналогичное замещение, такое как основное для основного, кислотное для кислонтого, полярное для полярного и т.д. Негомологичное замещение также может происходить, например, от одного класса остатка к другому или, альтернативно, включать включение неприродных аминокислот, таких как орнитин.The present invention also covers homologous substitution (substitution and substitution, both used herein to refer to the mutual substitution of an existing amino acid residue with an alternative residue), such as analogous substitution such as basic for basic, acidic for acidic, polar for polar, etc. Non-homologous substitution may also occur, for example, from one residue class to another or, alternatively, involve the inclusion of unnatural amino acids such as ornithine.

Термин вариант, как используется в настоящем документе, может означать объект, имеющий определенную гомологию с аминокислотной последовательностью дикого типа или нуклеотидной последовательностью дикого типа. Термин гомология можно отождествить с идентичностью.The term variant, as used herein, can mean an entity that has certain homology to a wild-type amino acid sequence or a wild-type nucleotide sequence. The term homology can be identified with identity.

- 39 046120- 39 046120

Вариантная последовательность может включать аминокислотную последовательность, которая может быть по меньшей мере на 50%, 55%, 65%, 75%, 85% или 90% идентичной, предпочтительно, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% или по меньшей мере на 99% идентичной интересующей последовательности. Обычно варианты будут содержать те же активные участки и т.д., что и рассматриваемая аминокислотная последовательность. Хотя гомологию также можно рассматривать с точки зрения сходства (т.е. аминокислотные остатки, обладающие сходными химическими свойствами/функциями), в контексте настоящего изобретения предпочтительно выражать гомологию с точки зрения идентичности последовательности.The variant sequence may include an amino acid sequence that may be at least 50%, 55%, 65%, 75%, 85%, or 90% identical, preferably at least 95%, at least 97%, or at least 99% identical to the sequence of interest. Typically, variants will contain the same active sites, etc., as the amino acid sequence in question. Although homology can also be considered in terms of similarity (ie, amino acid residues having similar chemical properties/functions), in the context of the present invention it is preferable to express homology in terms of sequence identity.

Вариантная последовательность может включать аминокислотную последовательность, которая может быть по меньшей мере на 50%, 55%, 65%, 75%, 85% или 90% идентичной, предпочтительно, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% или по меньшей мере на 99% идентичной интересующей последовательности. Хотя гомологию также можно рассматривать с точки зрения сходства, в контексте настоящего изобретения предпочтительно выражать гомологию с точки зрения идентичности последовательности.The variant sequence may include an amino acid sequence that may be at least 50%, 55%, 65%, 75%, 85%, or 90% identical, preferably at least 95%, at least 97%, or at least 99% identical to the sequence of interest. Although homology can also be considered in terms of similarity, in the context of the present invention it is preferable to express homology in terms of sequence identity.

Предпочтительно, ссылка на последовательность, которая имеет процентную идентичность к любой из SEQ ID №№, подробно описанных в данном документе, относится к последовательности, которая имеет указанную процентную идентичность по всей длине указанной SEQ ID N.Preferably, reference to a sequence that has percent identity to any of the SEQ ID Nos. detailed herein refers to a sequence that has said percent identity over the entire length of said SEQ ID No.

Сравнение идентичности может проводиться визуально или, чаще, с помощью легко доступных программ для сравнения последовательностей. Эти коммерчески доступные компьютерные программы могут вычислять процент гомологии или идентичности между двумя или более последовательностями.Identity comparisons can be made visually or, more commonly, using readily available sequence comparison programs. These commercially available computer programs can calculate the percentage of homology or identity between two or more sequences.

Процент гомологии можно вычислять для смежных последовательностей, то есть где одну последовательность выравнивают с другой последовательностью, и каждую аминокислоту в одной последовательности непосредственно сравнивается с соответствующей аминокислотой в другой последовательности, по одному остатку за раз. Это называется выравниванием без пропусков. Обычно такие выравнивания без пропусков проводят только для относительно небольшого числа остатков.Percentage homology can be calculated for contiguous sequences, that is, where one sequence is aligned with another sequence, and each amino acid in one sequence is directly compared with the corresponding amino acid in another sequence, one residue at a time. This is called gapless alignment. Typically, such gapless alignments are performed only for a relatively small number of residues.

Хотя это представляет собой очень простой и последовательный способ, он не может учитывать того, что, например, в паре последовательностей в остальном идентичной, одна вставка или делеция будет вызывать выпадение из выравнивания следующих аминокислотных остатков, таким образом потенциально приводя к большому уменьшению процента гомологии при проведении общего выравнивания. Поэтому большинство способов сравнения последовательностей разрабатывают для получения оптимальных выравниваний, которые учитывают возможные вставки и делеции без чрезмерных штрафов для общего показателя гомологии. Это достигается путем вставки пропусков в выравнивание последовательности, чтобы попытаться максимизировать локальную гомологию.Although this represents a very simple and consistent method, it cannot take into account that, for example, in a pair of otherwise identical sequences, a single insertion or deletion will cause subsequent amino acid residues to fall out of alignment, thus potentially leading to a large decrease in the percentage of homology at carrying out general leveling. Therefore, most sequence comparison methods are designed to produce optimal alignments that account for possible insertions and deletions without unduly penalizing the overall homology score. This is achieved by inserting gaps into the sequence alignment to try to maximize local homology.

Однако в этих более сложных способах назначают штрафы за пропуски для каждого пропуска, встретившегося в выравнивании, так что для одинакового числа идентичных аминокислот, выравнивание последовательности с наименее возможным числом пропусков - отражающее более сильное родство между двумя сравниваемыми последовательностями - будет достигать более высокого показателя гомологии, чем выравнивание со многими пропусками. Обычно используют аффинную стоимость пропусков, где начисляют относительно высокую стоимость за наличие пропуска и меньший штраф за каждый последующий остаток в пропуске. Это представляет собой наиболее широко применяемую систему оценки пропусков. С высокими штрафами за пропуски получают оптимизированные выравнивания с меньшими пропусками. Большинство программ выравнивания позволяют модифицировать штрафы за пропуски. Однако при использовании такого программного обеспечения для сравнений последовательностей предпочтительно применять значения по умолчанию. Например, при использовании пакета GCG Wisconsin Bestfit штраф за пропуск для аминокислотных последовательностей по умолчанию составляет -12 для пропуска и -4 для каждого продолжения.However, these more complex methods assign gap penalties to each gap encountered in the alignment, so that for the same number of identical amino acids, the sequence alignment with the fewest possible number of gaps—reflecting the stronger relationship between the two sequences being compared—will achieve a higher homology score. than alignment with many gaps. Typically, an affine cost of passes is used, where a relatively high cost is charged for the presence of a pass and a smaller penalty for each subsequent remainder in the pass. This represents the most widely used omission scoring system. With high skip penalties, optimized alignments with smaller skips are obtained. Most leveling programs allow you to modify the omission penalties. However, when using such software for sequence comparisons, it is preferable to use the default values. For example, when using the GCG Wisconsin Bestfit package, the default skip penalty for amino acid sequences is -12 for skipping and -4 for each continuation.

Поэтому вычисление максимальной процентной гомологии сначала требует получения оптимального выравнивания с учетом штрафов за пропуски. Подходящей компьютерной программой для проведения такого выравнивания является пакет GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387). Примеры другого программного обеспечения, которое может проводить сравнение последовательностей, включают, но не ограничиваются этим, пакет BLAST (см. Ausubel et al. (1999), там же - Ch. 18), FASTA (Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) и набор инструментов для сравнения GENEWORKS. Как BLAST, так и FASTA доступны для автономного и онлайнпоиска (см. Ausubel et al. (1999), там же, страницы с 7-58 по 7-60). Однако для некоторых применений предпочтительно использовать программу GCG Bestfit. Другой инструмент, называемый BLAST 2 Sequence, также доступен для сравнения белковых и нуклеотидных последовательностей (см. FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8).Therefore, calculating the maximum percent homology first requires obtaining an optimal alignment, taking into account gap penalties. A suitable computer program for performing this alignment is the GCG Wisconsin Bestfit package (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387). Examples of other software that can perform sequence comparisons include, but are not limited to, the BLAST package (see Ausubel et al. (1999), ibid. - Ch. 18), FASTA (Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) and the GENEWORKS comparison toolkit. Both BLAST and FASTA are available for offline and online searches (see Ausubel et al. (1999), ibid., pages 7-58 to 7-60). However, for some applications it is preferable to use the GCG Bestfit program. Another tool called BLAST 2 Sequence is also available for comparing protein and nucleotide sequences (see FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8).

Хотя конечный процентна гомологии может быть измерен с точки зрения идентичности, сам процесс выравнивания обычно не основан на сравнении пар все или ничего. Вместо этого обычно используют масштабированную матрицу оценки сходства, назначающую баллы для каждого парного сравнения на основе химического сходства или эволюционного расстояния. Примером такой широко используемой матрицы является матрица BLOSUM62 - матрица по умолчанию для набора программ BLAST. ПрограмAlthough the final percent homology can be measured in terms of identity, the alignment process itself is not usually based on an all-or-none comparison of pairs. Instead, a scaled similarity scoring matrix is typically used, assigning scores to each pairwise comparison based on chemical similarity or evolutionary distance. An example of such a widely used matrix is the BLOSUM62 matrix, the default matrix for the BLAST program suite. Program

- 40 046120 мы GCG Wisconsin обычно используют либо общедоступные значения по умолчанию, либо пользовательскую таблицу сравнения символов, если она имеется (см. Руководство пользователя для получения дополнительной информации). Для некоторых применений предпочтительно использовать общедоступные значения по умолчанию для пакета GCG или, в случае другого программного обеспечения, матрицу по умолчанию, такую как BLOSUM62.- 40 046120 we GCG Wisconsin typically use either public defaults or a custom character comparison table if available (see User Guide for more information). For some applications it is preferable to use the public defaults for the GCG package or, in the case of other software, a default matrix such as BLOSUM62.

Как только программное обеспечение произведет оптимальное выравнивание, можно вычислить процент гомологии, предпочтительно, процент идентичности последовательности. Программное обеспечение обычно производит это как часть сравнения последовательности и выводит числовой результат.Once the software has generated the optimal alignment, the percentage of homology, preferably the percentage of sequence identity, can be calculated. The software usually does this as part of a sequence comparison and outputs a numerical result.

Фрагменты также являются вариантами, и этот термин обычно относится к выбранной области полипептида или полинуклеотида, которая представляет интерес либо функционально, либо, например, в анализе. Фрагмент, таким образом, относится к последовательности аминокислоты или нуклеиновой кислоты, которая является частью полноразмерного полипептида или полинуклеотида.Fragments are also variants, and the term generally refers to a selected region of a polypeptide or polynucleotide that is of interest either functionally or, for example, in an assay. A fragment thus refers to an amino acid or nucleic acid sequence that is part of a full-length polypeptide or polynucleotide.

Такие варианты могут быть получены с использованием стандартных методов рекомбинантной ДНК, таких как сайт-направленный мутагенез. Там, где должны быть сделаны вставки, может быть получена синтетическая ДНК, кодирующая вставку вместе с 5' и 3' фланкирующими областями, соответствующими природной последовательности по обе стороны от участка вставки. Фланкирующие области будут содержать удобные сайты рестрикции, соответствующие сайтам природной последовательности, так что последовательность может быть разрезана с помощью подходящего фермента(ов) и синтетическая ДНК лигирована в разрезанную часть. Затем ДНК экспрессируется в соответствии с изобретением для получения кодируемого белка. Эти способы являются только иллюстрацией многочисленных стандартных методов, известных в данной области для манипулирования последовательностями ДНК, и также могут быть использованы другие известные методы.Such variants can be generated using standard recombinant DNA techniques such as site-directed mutagenesis. Where insertions are to be made, synthetic DNA can be produced encoding the insertion along with 5' and 3' flanking regions corresponding to the natural sequence on either side of the insertion site. The flanking regions will contain convenient restriction sites corresponding to those of the natural sequence so that the sequence can be cut using the appropriate enzyme(s) and synthetic DNA ligated into the cut portion. The DNA is then expressed in accordance with the invention to produce the encoded protein. These methods are only illustrative of numerous standard methods known in the art for manipulating DNA sequences, and other known methods may also be used.

Комбинация.Combination.

HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированные клетки-предшественники, макрофаги, моноциты или векторы по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с ингибитором контрольных точеки иммунитета.HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes or vectors of the present invention can be used in combination with an immune checkpoint inhibitor.

Альтернативно, HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированные клетки-предшественники, макрофаги, моноциты или векторы по настоящему изобретению могут использоваться в комбинации со TAAспецифической Т-клеткой.Alternatively, HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes or vectors of the present invention can be used in combination with a TAA-specific T cell.

Альтернативно, HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированные клетки-предшественники, макрофаги, моноциты или векторы по настоящему изобретению могут быть использованы в комбинации со TAA-специфической Т-клеткой, экспрессирующей CAR.Alternatively, HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes or vectors of the present invention can be used in combination with a TAA-specific T cell expressing a CAR.

Альтернативно, HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированные клетки-предшественники, макрофаги, моноциты или векторы по настоящему изобретению можно использовать в комбинации со TAAспецифической Т-клеткой, экспрессирующей трансгенный TCR.Alternatively, HSCs, HPCs, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes, or vectors of the present invention can be used in combination with a TAA-specific T cell expressing a transgenic TCR.

Альтернативно, HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированные клетки-предшественники, макрофаги, моноциты или векторы по настоящему изобретению могут использоваться в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета и TAA-специфической Т-клеткой, экспрессирующей трансгенный TCR.Alternatively, HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes or vectors of the present invention can be used in combination with an immune checkpoint inhibitor and a TAA-specific T cell expressing a transgenic TCR.

Альтернативно, HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированные клетки-предшественники, макрофаги, моноциты или векторы по настоящему изобретению могут быть использованы в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунитета и TAA-специфической Т-клеткой, экспрессирующей CAR.Alternatively, HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes or vectors of the present invention can be used in combination with an immune checkpoint inhibitor and a TAA-specific T cell expressing a CAR.

Альтернативно, HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированные клетки-предшественники, макрофаги, моноциты или векторы по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с 1метилтриптофаном (1-MT).Alternatively, HSCs, HPCs, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes or vectors of the present invention can be used in combination with 1-methyltryptophan (1-MT).

Как используется в настоящем документе, фраза используется в комбинации с охватывает введение HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированныхе клеток-предшественников, макрофагов, моноцитов или векторов по настоящему изобретению, последовательно, отдельно или одновременно с ингибитором контрольных точек иммунитета и/или TAA-специфическойо Т-клеткой.As used herein, the phrase when used in combination includes administration of HSCs, HPCs, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes, or vectors of the present invention, sequentially, alone, or concomitantly with an immune checkpoint inhibitor and/or TAA. specific T cell.

HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированные клетки-предшественники, макрофаги, моноциты или вектор по настоящему изобретению можно вводить, по меньшей мере за 5 мин, по меньшей мере за 10 мин, по меньшей мере за 15 мин, по меньшей мере за 30 мин, по меньшей мере за 45 мин, по меньшей мере за 60 мин до TAA-специфической Т-клетки и/или ингибитора контрольных точек иммунитета.The HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes, or vector of the present invention can be administered over at least 5 minutes, at least 10 minutes, at least 15 minutes, at least 30 min, at least 45 min, at least 60 min before TAA-specific T cell and/or immune checkpoint inhibitor.

HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированные клетки-предшественники, макрофаги, моноциты или вектор по настоящему изобретению можно вводить, по меньшей мере за 1 ч, по меньшей мере за 2 ч, по меньшей мере за 3 ч, по меньшей мере за 4 ч, по меньшей мере за 5 ч по меньшей мере, 6 ч, по меньшей мере, 12 часов, по меньшей мере за 24 ч, по меньшей мере за 48 ч, по меньшей мере за 72 ч до TAAспецифической Т-клетки и/или ингибитора контрольных точек иммунитета.HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes or a vector of the present invention can be administered at least 1 hour before, at least 2 hours before, at least 3 hours before, at least 4 hours before h, at least 5 h, at least 6 h, at least 12 h, at least 24 h, at least 48 h, at least 72 h before TAA-specific T cell and/or immune checkpoint inhibitor.

HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированные клетки-предшественники, макрофаги, моноциты или вектор по настоящему изобретению можно вводить, по меньшей мере за один день, по меньшей мере за два дня, по меньшей мере за три дня, по меньшей мере за четыре дня, по меньшей мере за пять дней, по меньшей мере за шесть дней, по меньшей мере за семь дней или по меньшей мере за 14 дней до TAAспецифической Т-клетки и/или ингибитора контрольных точек иммунитета.The HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes, or vector of the present invention can be administered at least one day before, at least two days before, at least three days before, at least four days before days, at least five days, at least six days, at least seven days, or at least 14 days before the TAA-specific T cell and/or immune checkpoint inhibitor.

- 41 046120- 41 046120

HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированные клетки-предшественники, макрофаги, моноциты или вектор по настоящему изобретению можно вводить, по меньшей мере за одну неделю, по меньшей мере за две недели, по меньшей мере за три недели, по меньшей мере за четыре недели, по меньшей мере за пять недели, по меньшей мере за шесть недель, по меньшей мере за семь недель, по меньшей мере за восемь недель, по меньшей мере за девять недель, по меньшей мере за 10 недель, по меньшей мере за 11 недель или по меньшей мере за 12 недель до TAA-специфической Т-клетки и/или ингибитора контрольных точек иммунитета.HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes, or a vector of the present invention can be administered at least one week, at least two weeks, at least three weeks, at least four weeks, at least five weeks, at least six weeks, at least seven weeks, at least eight weeks, at least nine weeks, at least 10 weeks, at least 11 weeks or at least 12 weeks before TAA-specific T cell and/or immune checkpoint inhibitor.

HSC, HPC, миелоид/моноцит-коммитированные клетки-предшественники, макрофаги, моноциты или вектор по настоящему изобретению можно вводить, по меньшей мере за один месяц, по меньшей мере за два месяца, по меньшей мере за три месяца, по меньшей мере за четыре месяца, по меньшей мере за пять месяцев, по меньшей мере за шесть месяцев, по меньшей мере за семь месяцев, по меньшей мере за восемь месяцев, по меньшей мере за девять месяцев, по меньшей мере за 10 месяцев, по меньшей мере за 11 месяцев или по меньшей мере за 12 месяцев до TAA-специфической Т-клетки и/или ингибитора контрольных точек иммунитета.HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes or a vector of the present invention can be administered at least one month in advance, at least two months in advance, at least three months in advance, at least four months in advance months, at least five months, at least six months, at least seven months, at least eight months, at least nine months, at least 10 months, at least 11 months or at least 12 months prior to TAA-specific T cell and/or immune checkpoint inhibitor.

HSC, HPC, миелоид/моноцит-коммитированные клетки-предшественники, макрофаги, моноциты или вектор по настоящему изобретению можно вводить, по меньшей мере за один месяц, по меньшей мере за два месяца, по меньшей мере за три месяца, по меньшей мере за четыре месяца, по меньшей мере за пять месяцев, по меньшей мере за шесть месяцев, по меньшей мере за семь месяцев, по меньшей мере за восемь месяцев, по меньшей мере за девять месяцев, по меньшей мере за 10 месяцев, по меньшей мере за 11 месяцев или по меньшей мере за 12 месяцев до TAA-специфической Т-клетки и/или ингибитора контрольных точек иммунитета.HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes or a vector of the present invention can be administered at least one month in advance, at least two months in advance, at least three months in advance, at least four months in advance months, at least five months, at least six months, at least seven months, at least eight months, at least nine months, at least 10 months, at least 11 months or at least 12 months prior to TAA-specific T cell and/or immune checkpoint inhibitor.

Как используется в настоящем документе, выражение используется в комбинации с охватывает введение HSC, HPC, клеток-предшественников, миелоид/моноцит-коммитированных клетокпредшественников, макрофагов, моноцитов или векторов по настоящему изобретению, последовательно, отдельно или одновременно с 1-метилтриптофаном (1-MT).As used herein, the expression when used in combination includes the administration of HSCs, HPCs, progenitor cells, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes, or vectors of the present invention, sequentially, alone, or simultaneously with 1-methyltryptophan (1-MT ).

HSC, HPC, миелоид/моноцит-коммитированные клетки-предшественникии, макрофаги, моноциты или вектор по настоящему изобретению можно вводить, по меньшей мере за 5 мин, по меньшей мере за 10 мин, по меньшей мере за 15 мин, по меньшей мере за 30 мин, по меньшей мере за 45 мин, по меньшей мере за 60 мин до 1-метилтриптофана (1-MT).The HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes, or vector of the present invention can be administered over at least 5 minutes, at least 10 minutes, at least 15 minutes, at least 30 min, at least 45 min, at least 60 min before 1-methyltryptophan (1-MT).

HSC, HPC, миелоид/моноцит-коммитированные клетки-предшественники, макрофаги, моноциты или вектор по настоящему изобретению можно вводить, по меньшей мере за 1 час, по меньшей мере за 2 ч, по меньшей мере за 3 ч, по меньшей мере за 4 ч, по меньшей мере за 5 ч по меньшей мере, 6 ч, по меньшей мере, 12 часов, по меньшей мере за 24 ч, по меньшей мере за 48 ч, по меньшей мере за 72 ч до 1-метилтриптофана (1-MT).The HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes, or vector of the present invention can be administered at least 1 hour before, at least 2 hours before, at least 3 hours before, at least 4 hours before h, at least 5 h, at least 6 h, at least 12 h, at least 24 h, at least 48 h, at least 72 h before 1-methyltryptophan (1-MT ).

HSC, HPC, миелоид/моноцит-коммитированные клетки-предшественники, макрофаги, моноциты или вектор по настоящему изобретению можно вводить, по меньшей мере за один день, по меньшей мере за два дня, по меньшей мере за три дня, по меньшей мере за четыре дня, по меньшей мере за пять дней, по меньшей мере за шесть дней, по меньшей мере за семь дней или по меньшей мере за 14 дней до 1метилтриптофана (1-MT).The HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes, or vector of the present invention can be administered at least one day before, at least two days before, at least three days before, at least four days before days, at least five days, at least six days, at least seven days, or at least 14 days before 1-methyltryptophan (1-MT).

HSC, HPC, миелоид/моноцит-коммитированные клетки-предшественники, макрофаги, моноциты или вектор по настоящему изобретению можно вводить, по меньшей мере за одну неделю, по меньшей мере за две недели, по меньшей мере за три недели, по меньшей мере за четыре недели, по меньшей мере за пять недели, по меньшей мере за шесть недель, по меньшей мере за семь недель, по меньшей мере за восемь недель, по меньшей мере за девять недель, по меньшей мере за 10 недель, по меньшей мере за 11 недель или по меньшей мере за 12 недель до 1-метилтриптофана (1-MT).The HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes, or vector of the present invention can be administered at least one week, at least two weeks, at least three weeks, at least four weeks, at least five weeks, at least six weeks, at least seven weeks, at least eight weeks, at least nine weeks, at least 10 weeks, at least 11 weeks or at least 12 weeks before 1-methyltryptophan (1-MT).

HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированные клетки-предшественники, макрофаги, моноциты или вектор по настоящему изобретению можно вводить, по меньшей мере за один месяц, по меньшей мере за два месяца, по меньшей мере за три месяца, по меньшей мере за четыре месяца, по меньшей мере за пять месяцев, по меньшей мере за шесть месяцев, по меньшей мере за семь месяцев, по меньшей мере за восемь месяцев, по меньшей мере за девять месяцев, по меньшей мере за 10 месяцев, по меньшей мере за 11 месяцев или по меньшей мере за 12 месяцев до 1-метилтриптофана (1-MT).HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes or a vector of the present invention can be administered at least one month in advance, at least two months in advance, at least three months in advance, at least four months in advance months, at least five months, at least six months, at least seven months, at least eight months, at least nine months, at least 10 months, at least 11 months or at least 12 months before 1-methyltryptophan (1-MT).

HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированные клетки-предшественники, макрофаги, моноциты или вектор по настоящему изобретению можно вводить, по меньшей мере за один месяц, по меньшей мере за два месяца, по меньшей мере за три месяца, по меньшей мере за четыре месяца, по меньшей мере за пять месяцев, по меньшей мере за шесть месяцев, по меньшей мере за семь месяцев, по меньшей мере за восемь месяцев, по меньшей мере за девять месяцев, по меньшей мере за 10 месяцев, по меньшей мере за 11 месяцев или по меньшей мере за 12 месяцев до 1-метилтриптофана (1-MT).HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes or a vector of the present invention can be administered at least one month in advance, at least two months in advance, at least three months in advance, at least four months in advance months, at least five months, at least six months, at least seven months, at least eight months, at least nine months, at least 10 months, at least 11 months or at least 12 months before 1-methyltryptophan (1-MT).

Фармацевтическая композиция.Pharmaceutical composition.

HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированные клетки-предшественники, макрофаги, моноциты, ингибиторы иммунной контрольной точки, TAA-специфические Т-клетки, векторы, 1-метилтриптофан (1-MT) и их комбинации для применения в соответствии с настоящим изобретением быть составленным с фармацевтически приемлемыми носителем, разбавителем или вспомогательным веществом.HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cells, macrophages, monocytes, immune checkpoint inhibitors, TAA-specific T cells, vectors, 1-methyltryptophan (1-MT), and combinations thereof for use in accordance with the present invention be formulated with a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient.

- 42 046120- 42 046120

Пациент.Patient.

Пациентом может быть человек. Пациентом может быть животное, не человек.The patient can be a person. The patient may be an animal, not a person.

Пациент может быть поражен раком. Альтернативно, пациент может подвергаться риску развития злокачественного новообразования.The patient may be affected by cancer. Alternatively, the patient may be at risk of developing malignancy.

Пациент, возможно, ранее был определен как обладающий риском развития злокачественного новообразования. Повышенный риск может быть определен путем генетического скрининга и/или анализа семейного анамнеза пациента. У пациента, возможно, была определена экспрессия одного или нескольких генетических маркеров, указывающих на повышенный риск развития злокачественного новообразования.The patient may have previously been identified as being at risk for developing malignancy. Increased risk can be determined by genetic screening and/or analysis of the patient's family history. The patient may have had the expression of one or more genetic markers indicating an increased risk of developing a malignancy.

Соответственно, специалист в данной области должен знать о генетических факторах риска (например, генетических маркерах), связанных с повышенным риском развития злокачественного новообразования. Специалист в данной области может использовать любой подходящий способ или метод, известные в данной области, чтобы определить, имеет ли субъект повышенный риск развития злокачественного новообразования.Accordingly, one skilled in the art should be aware of genetic risk factors (eg, genetic markers) associated with an increased risk of developing cancer. One skilled in the art may use any suitable method or technique known in the art to determine whether a subject is at increased risk of developing cancer.

Субъект, возможно, ранее получал лечение от злокачественного новообразования. У индивида может быть ремиссия от злокачественного новообразования. Субъект может быть устойчивым к химиотерапии.Subject may have previously received treatment for malignancy. An individual may be in remission from a malignancy. The subject may be resistant to chemotherapy.

В некоторых аспектах настоящего изобретения пациенту ранее вводили гематопоэтическую стволовую клетку (HSC), гемопоэтическую прогениторную клетку (НРС), миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит по изобретению, до введения TAA-специфической Тклетки и/или ингибитора контрольных точек иммунитета.In some aspects of the present invention, the patient has previously been administered a hematopoietic stem cell (HSC), hematopoietic progenitor cell (HPC), myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, or monocyte of the invention, prior to administration of the TAA-specific T Cell and/or immune checkpoint inhibitor .

В одном варианте осуществления HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клеткупредшественник, макрофаги или моноциты по настоящему изобретению вводят пациенту по меньшей мере за 6 ч, по меньшей мере за 12 ч, по меньшей мере за 24 ч, по меньшей мере за 48 ч, по крайней мере, за 72 ч до TAA-специфической Т-клетки и/или ингибитора контрольных точек иммунитета.In one embodiment, the HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophages or monocytes of the present invention are administered to the patient at least 6 hours before, at least 12 hours before, at least 24 hours before, at least 48 hours before , at least 72 hours before TAA-specific T cell and/or immune checkpoint inhibitor.

В одном варианте осуществления HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клеткупредшественник, макрофаг или моноцит по настоящему изобретению можно вводить пациенту по меньшей мере за один день, по меньшей мере за два дня, по меньшей мере за три дня, по меньшей мере за четыре дня, по меньшей мере за пять дней, по меньшей мере за шесть дней, по меньшей мере за семь дней или по меньшей мере за 14 дней до TAA-специфической Т-клетки и/или ингибитора контрольных точек иммунитета.In one embodiment, the HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, or monocyte of the present invention can be administered to a patient at least one day, at least two days, at least three days, at least four days, at least five days, at least six days, at least seven days, or at least 14 days before the TAA-specific T cell and/or immune checkpoint inhibitor.

HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит по настоящему изобретению можно вводить пациенту, по меньшей мере за одну неделю, по меньшей мере за две недели, по меньшей мере за три недели, по меньшей мере за четыре недели, по меньшей мере за пять недели, по меньшей мере за шесть недель, по меньшей мере за семь недель, по меньшей мере за восемь недель, по меньшей мере за девять недель, по меньшей мере за 10 недель, по меньшей мере за 11 недель или по меньшей мере за 12 недель до TAA-специфической Т-клетки и/или ингибитора контрольных точек иммунитета.The HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte of the present invention can be administered to a patient at least one week before, at least two weeks before, at least three weeks before, at least four weeks before , at least five weeks, at least six weeks, at least seven weeks, at least eight weeks, at least nine weeks, at least 10 weeks, at least 11 weeks, or at least 12 weeks before TAA-specific T cell and/or immune checkpoint inhibitor.

HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит по настоящему изобретению можно вводить пациенту по меньшей мере за один месяц, по меньшей мере за два месяца, по меньшей мере за три месяца, по меньшей мере за четыре месяца, по меньшей мере за пять месяцев, по меньшей мере за шесть месяцев, по меньшей мере за семь месяцев, по меньшей мере за восемь месяцев, по меньшей мере за девять месяцев, по меньшей мере за 10 месяцев, по меньшей мере за 11 месяцев или по меньшей мере за 12 месяцев до TAA-специфической Т-клетки и/или ингибитора контрольных точек иммунитета.The HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte of the present invention can be administered to a patient at least one month in advance, at least two months in advance, at least three months in advance, at least four months in advance, at least five months, at least six months, at least seven months, at least eight months, at least nine months, at least 10 months, at least 11 months, or at least 12 months prior to TAA-specific T cell and/or immune checkpoint inhibitor.

В некоторых аспектах настоящего изобретения пациенту перед введением ранее вводили гематопоэтическую стволовую клетку (HSC), гемопоэтическую клетку-предшественник (НРС), миелоид/моноциткоммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит по изобретению, до введения 1-метилтриптофана (1-MT).In some aspects of the present invention, the patient has previously been administered a hematopoietic stem cell (HSC), hematopoietic progenitor cell (HPC), myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, or monocyte of the invention prior to administration, prior to administration of 1-methyltryptophan (1-MT).

В одном варианте осуществления HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клеткапредшественникик, макрофаг или моноцит по настоящему изобретению вводят пациенту по меньшей мере за 6 ч, по меньшей мере за 12 ч, по меньшей мере за 24 ч, по меньшей мере за 48 ч, по крайней мере за 72 ч до введения 1-метилтриптофана (1-MT).In one embodiment, the HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, or monocyte of the present invention is administered to the patient at least 6 hours before, at least 12 hours before, at least 24 hours before, at least 48 hours before , at least 72 hours before administration of 1-methyltryptophan (1-MT).

В одном варианте осуществления HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клеткапредшественник, макрофаг или моноцит по настоящему изобретению вводят пациенту по меньшей мере за один день, по меньшей мере за два дня, по меньшей мере за три дня, по меньшей мере за четыре дня, по крайней мере за пять дней, по крайней мере за шесть дней, по крайней мере за семь дней или, по крайней мере за 14 дней до введения 1-метилтриптофана (1-MT).In one embodiment, the HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, or monocyte of the present invention is administered to a patient at least one day before, at least two days before, at least three days before, at least four days before at least five days, at least six days, at least seven days, or at least 14 days before 1-methyltryptophan (1-MT) administration.

В одном варианте осуществления HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клеткупредшественник, макрофаг или моноцит по настоящему изобретению можно вводить пациенту, по меньшей мере за одну неделю, по меньшей мере за две недели, по меньшей мере за три недели, по меньшей мере за четыре недели, по меньшей мере за пять недели, по меньшей мере за шесть недель, поIn one embodiment, the HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage, or monocyte of the present invention can be administered to a patient at least one week in advance, at least two weeks in advance, at least three weeks in advance, at least four weeks, at least five weeks, at least six weeks, by

- 43 046120 меньшей мере за семь недель, по меньшей мере за восемь недель, по меньшей мере за девять недель, по меньшей мере за 10 недель, по меньшей мере за 11 недель или по меньшей мере за 12 недель до введения 1-метилтриптофана (1-MT).- 43 046120 at least seven weeks, at least eight weeks, at least nine weeks, at least 10 weeks, at least 11 weeks or at least 12 weeks before the administration of 1-methyltryptophan (1 -MT).

В одном HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит по настоящему изобретению можно вводить пациенту по меньшей мере за один месяц, по меньшей мере за два месяца, по меньшей мере за три месяца, по меньшей мере за четыре месяца, по меньшей мере за пять месяцев, по меньшей мере за шесть месяцев, по меньшей мере за семь месяцев, по меньшей мере за восемь месяцев, по меньшей мере за девять месяцев, по меньшей мере за 10 месяцев, по меньшей мере за 11 месяцев или по меньшей мере за 12 месяцев до введения 1-метилтриптофана (1-MT).In one HSC, HSC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte of the present invention can be administered to a patient at least one month, at least two months, at least three months, at least four months, at least five months, at least six months, at least seven months, at least eight months, at least nine months, at least 10 months, at least 11 months or at least 12 months before administration of 1-methyltryptophan (1-MT).

Как человеческое, так и ветеринарное лечение входят в объем настоящего изобретения.Both human and veterinary treatment are included within the scope of the present invention.

Термины содержащий, содержит и состоящий из, используемые в настоящем документе, являются синонимами включающий или включает; или содержащий или содержит, и являются включающими или открытыми и не исключают дополнительных, не перечисленных элементов, элементов или стадий. Термины содержащий, содержит и состоящий из также включают в себя термин состоящий из.The terms containing, containing and consisting of, as used herein, are synonymous with including or includes; or containing or contains, and are inclusive or open-ended and do not exclude additional, not listed elements, elements or steps. The terms containing, containing and consisting of also include the term consisting of.

Практика настоящего изобретения будет использовать, если не указано иное, общепринятые методы клеточной биологии, молекулярной биологии, гистологии, иммунологии, онкологии, которые находятся в пределах возможностей специалиста в данной области. Эти методы в полной мере описаны в литературе.The practice of the present invention will utilize, unless otherwise indicated, conventional methods of cell biology, molecular biology, histology, immunology, oncology, which are within the capabilities of one skilled in the art. These methods are fully described in the literature.

См., например, Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, Т. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13 and 16, John Wiley & Sons; Roe, В., Crabtree, J. and Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; Polak, J.M. and McGee, J.O'D. (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; Gait, M.J. (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; and Lilley, D.M. and Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Press. Каждый из этих общих текстов включен в настоящий документ посредством ссылки.See, for example, Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13 and 16, John Wiley &Sons; Roe, W., Crabtree, J. and Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley &Sons; Polak, J.M. and McGee, J.O'D. (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; Gait, M. J. (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; and Lilley, D. M. and Dahlberg, J. E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Press. Each of these general texts is incorporated herein by reference.

Различные предпочтительные признаки и варианты осуществления настоящего изобретения теперь будут описаны с помощью неограничивающих примеров.Various preferred features and embodiments of the present invention will now be described by way of non-limiting examples.

ПримерыExamples

Пример 1. IFNa, нацеленный на опухоль, усиливает Т-клеточные противоопухолевые ответы в модели ALL.Example 1 Tumor-targeted IFNa enhances T-cell antitumor responses in an ALL model.

Мышам C57Bl/6 трансплантировали HSC, трансдуцированные либо mTie2-IFN-mirT LV (IFN mice), либо mTie2-GFP-mirT LV, или Mock-трансдуцированные (обе использовали в качестве контрольных мышей), чтобы нацелить экспрессию IFN/GFP на дифференцированное TIE2+ потомство моноцитов, которое сильно обогащено в опухолях15’16. Как было показано ранее, реконструкция с помощью клеток, трансдуцированных mTie2-IFN-mirT LV, приводит к функциональному многолинейному трансплантату без явных побочных эффектов8-10. Затем реконструированных мышей с ранее описанной авторами изобретения моделью B-ALL (фиг. 1а) стимулировали антигеном и обнаружили ингибирование роста лейкемии у IFN по сравнению с контрольными мышами (фиг. 1b, с). Введение анти-CTLA4-блокирующего антитела (aCTLA4) не оказывало влияния на контрольных мышей, но дополнительно и значительно улучшало ингибирование ALL у IFN мышей, что указывает на иммунный вклад в наблюдаемый ответ у IFN мышей. Комбинация генной терапии IFN и aCTLA4 значительно улучшила выживаемость мышей (фиг. 21). Чтобы исследовать индукцию противоопухолевого иммунитета, были разработали клетки ALL с лентивирусным вектором (LV), позволяющим координировать экспрессию модельного антигена овальбумина (OVA) и усеченной формы рецептора фактора роста нервов (NGFR) на поверхности клеток, маркера из двунаправленного промотора (OVA-ALL, фиг. 5а, b).C57Bl/6 mice were transplanted with HSCs transduced with either mTie2-IFN-mirT LV (IFN mice), mTie2-GFP-mirT LV, or Mock-transduced (both used as control mice) to target IFN/GFP expression to differentiated TIE2+ monocyte progeny, which is highly enriched in tumors 15 ' 16 . Reconstruction with mTie2-IFN-mirT LV transduced cells has been shown previously to result in a functional multilineage graft without apparent side effects 8 - 10 . Reconstituted mice with our previously described B-ALL model (Fig. 1a) were then challenged with antigen and found to inhibit leukemia growth by IFN compared to control mice (Fig. 1b,c). Administration of anti-CTLA4 blocking antibody (aCTLA4) had no effect in control mice but additionally and significantly improved ALL inhibition in IFN mice, indicating an immune contribution to the observed response in IFN mice. The combination of IFN and aCTLA4 gene therapy significantly improved the survival of mice (Fig. 21). To investigate the induction of antitumor immunity, ALL cells were engineered with a lentiviral vector (LV) allowing coordinated expression of the model antigen ovalbumin (OVA) and a truncated form of the nerve growth factor receptor (NGFR) on the cell surface, a marker from a bidirectional promoter (OVA-ALL, Fig. 5a, b).

При введении иммунокомпетентным мышам C57Bl/6 OVA-ALL демонстрирует у части мышей более медленную кинетику роста и отсроченное начало по сравнению с исходным ALL. При вскрытии у всех мышей наблюдалась массивная инфильтрация ВМ клетками ALL с ростом NGFR негативных властных клеток у мышей с отсроченным заболеванием (фиг. 5 с, d). Когда клетки OVA ALL инъецировали мышам с иммунодефицитом NOD-SCID-IL2Rg-/- (NSG), наблюдался сравнимый рост опухоли в качестве родительских клеток и отсутствие потери экспрессии NGFR (фиг. 5 с, е). В целом эти результаты указывают на повышенную иммуногенность варианта OVA-ALL, что приводит к иммунному редактированию и отбору редких не трансдуцированных или сайленсированных (OVA/NGFR-негативных) клонов ALL, вероятно присутствующих в продукте для инфузии. Однако ни одна из мышей не выжила ни в одном из испытаний. Таким образом была исследована способность переноса IFN клеток и генов в опухоль для усиления противоопухолевого иммунного ответа против OVA-ALL. Поскольку ALL быстро разрастались у контрольных мышей (фиг. 1d-f), отмечалось замедленное появление и накопление властных клеток в крови и снижение инфильтрации в ВМ и селезенке IFN мышей. Следует отметить, что фракция IFN мышей показала отсутствие лейкемии во всех анализируемых органах.When administered to immunocompetent C57Bl/6 mice, OVA-ALL exhibits slower growth kinetics and delayed onset in a subset of mice compared with parental ALL. At necropsy, all mice showed massive infiltration of the VM by ALL cells, with an increase in NGFR negative control cells in mice with delayed disease (Fig. 5 c,d). When OVA ALL cells were injected into immunodeficient NOD-SCID-IL2Rg −/− (NSG) mice, comparable tumor growth as parent cells and no loss of NGFR expression were observed (Fig. 5 c,e). Overall, these results indicate increased immunogenicity of the OVA-ALL variant, leading to immune editing and selection of rare non-transduced or silenced (OVA/NGFR-negative) ALL clones likely present in the infusion product. However, none of the mice survived any of the tests. Thus, the ability of IFN to transfer cells and genes into the tumor to enhance the antitumor immune response against OVA-ALL was investigated. As ALLs proliferated rapidly in control mice (Fig. 1d-f), there was a delayed appearance and accumulation of control cells in the blood and decreased infiltration into the VM and spleen of IFN mice. It should be noted that the IFN fraction of mice showed the absence of leukemia in all analyzed organs.

- 44 046120- 44 046120

Стимулированные in vitro очищенные CD8+ Т-клетки селезенки от IFN мышей показали индукцию специфического ответа против OVA с помощью g-IFN-ELISPOT, при этом у мышей наблюдается увеличение числа клеток-с ответомов, демонстрирующих наименьшую опухолевую нагрузку (фиг. 1g). OVA-специфичные CD8+ Т-клетки были обнаружены окрашиванием OVA257-264-H-2Kb-пенmамером как у IFN, так и у контрольных мышей с более высоким процентом и количеством в крови и ВМ в первой группе (фиг. 1h-j и 6а). Более того, CD8+ Т-клетки контрольных мышей не высвобождали IFN-g при повторной стимуляции ex-vivo OVA, как и Тклетки IFN мышей (фиг. 1k), что указывает на дисфункцию, что согласуется с отсутствием ингибирования опухоли в контроле против IFN мышей (фиг. 6b-d). Поразительно, что истощение CD8+ Т-клеток у IFN мышей отменяет противоопухолевый ответ (фиг. 1l, m). В целом эти результаты указывают на индукцию CTL, способных вызывать эффективный ответ против опухолевого неоантигена у IFN мышей.In vitro-stimulated purified splenic CD8 + T cells from IFN mice showed induction of a specific anti-OVA response by g-IFN-ELISPOT, with mice showing an increase in response-c cells exhibiting the lowest tumor burden (Fig. 1g). OVA-specific CD8+ T cells were detected by OVA257-264-H-2Kb-penamer staining in both IFN and control mice with a higher percentage and number in the blood and BM in the first group (Figs. 1h-j and 6a). . Moreover, CD8 + T cells from control mice did not release IFN-g when restimulated ex-vivo with OVA, as did murine IFN T cells (Fig. 1k), indicating dysfunction, consistent with the lack of tumor inhibition in control anti-IFN mice. (Fig. 6b-d). Strikingly, depletion of CD8 + T cells in IFN mice abolished the antitumor response (Fig. 1l,m). Overall, these results indicate the induction of CTLs capable of eliciting an effective response against tumor neoantigen in IFN mice.

Отмечалось также начальная более низкая опухолевая нагрузка у IFN мышей, истощенных по CD8, по сравнению с контролем, предполагая, что дополнительные механизмы помимо СЭ8-опосредованного контроля могут способствовать, по крайней мере, первоначально и временно, ингибированию опухоли (фиг. 6е). Принимая во внимание, что не было различий во фракции апоптотических клеток и распределении клеточного цикла ВМ и клеток ALL селезенки между IFN и контрольными мышами (фиг. 7a-d), скорость пролиферации, измеренная путем включения EdU, была ниже в ВМ, но не в селезенке IFN мышей (фиг. 7е, f). Задержка пролиферации, которая может быть вызвана непосредственно IFN, может способствовать накоплению специфичных для опухоли CTL при эффективном соотношении эффектор и мишень для подавления роста опухолевых клеток.There was also an initial lower tumor burden in CD8-depleted IFN mice compared with controls, suggesting that additional mechanisms beyond CD8-mediated control may contribute, at least initially and transiently, to tumor inhibition (Fig. 6e). Whereas there were no differences in the fraction of apoptotic cells and cell cycle distribution of BM and splenic ALL cells between IFN and control mice (Fig. 7a-d), the proliferation rate measured by EdU incorporation was lower in BM but not in spleen of IFN mice (Fig. 7e, f). The proliferation delay that can be caused directly by IFN may promote the accumulation of tumor-specific CTLs with an effective effector-target ratio to suppress tumor cell growth.

Пример 2. Адоптивно перенесенные трансгенные Т-клетки OT-I только размножаются и катализируют лейкоз у IFN мышей.Example 2 Adoptively transferred transgenic OT-I T cells only proliferate and catalyze leukemia in IFN mice.

Чтобы исследовать влияние IFN типа I на рекрутирование и активацию Т-клеток, были адоптивно перенесены наивные трансгенные OVA-специфические Т-клетки (OT-I) у IFN и контрольных мышей (фиг. 2а). Было скорректировано время инфузии между двумя группами для инфузии клеток OT-I с сопоставимым бременем лейкемии (фиг. 2b и 8а) и мышей анализировали через 3 дня. Наблюдалось значительно большее количество клеток OT-I в селезенке и ВМ у IFN мышей, которым инъецировали лейкемию, чем у контрольных мышей, у которых клетки OT-I были получены в небольшом количестве, аналогично контрольным клеткам, не имеющим опухоли (фиг. 2с). Цитофлуориметрический анализ показал, что большинство клеток OT-I активировали рецептор активирования LAG3 и приобретали фенотип центральной памяти или эффекторной памяти у лейкемических IFN и контрольных мышей с увеличением активации в первой группе.To examine the effect of type I IFN on T cell recruitment and activation, naive transgenic OVA-specific T cells (OT-I) were adoptively transferred into IFN and control mice (Fig. 2a). The infusion time between the two groups was adjusted to infuse OT-I cells with comparable leukemia burden (Figures 2b and 8a) and mice were analyzed after 3 days. There were significantly greater numbers of OT-I cells in the spleen and BM of IFN-injected leukemia mice than in control mice, from which OT-I cells were obtained in low numbers, similar to non-tumor control cells (Fig. 2c). Cytofluorimetric analysis showed that the majority of OT-I cells activated the activating receptor LAG3 and acquired a central memory or effector memory phenotype in leukemic IFN and control mice, with increased activation in the former group.

Эти результаты резко контрастировали с контрольными мышами без опухолей, у которых клетки OT-I сохраняли наивный фенотип собранного продукта (фиг. 2d и 8b-d). Лейкемический груз был значительно снижен у IFN по сравнению с контрольными мышами уже вна начальном этапе после адоптивного переноса Т-клеток (фиг. 8е). В то время как почти все лейкозные клетки контрольных мышей экспрессировали маркер NGFR, наблюдалось увеличение доли NGFR-негативных клеток у IFN мышей, что предполагает селективное давление против OVA-ALL (фиг. 8f).These results were in sharp contrast to tumor-free control mice, in which OT-I cells maintained a naïve harvested phenotype (Figures 2d and 8b-d). The leukemic burden was significantly reduced in IFN compared to control mice already early after T cell adoptive transfer (Fig. 8e). While almost all leukemia cells from control mice expressed the NGFR marker, there was an increase in the proportion of NGFR-negative cells in IFN mice, suggesting selective pressure against OVA-ALL (Fig. 8f).

Затем был исследован синергизм клеточной терапии IFN и адоптивный перенос Т-клеток OT-I в содействии выживанию (фиг. 2е). Принимая во внимание, что инфузия Т-клеток OT-I приводила к выживанию мышей на 20% по сравнению с отсутствием в контрольной группе, комбинированное лечение значительно улучшало выживаемость, до 67% (фиг. 2f). Продольный анализ IFN мышей+ОТ-I выявил расширение OT-I, достигающее пика через 6 дней после инфузии, сопровождаемое преходящей активацией LAG3 и клиренсом OVA-ALL (фиг. 2g, h и 9а). Следует отметить, что у тех IFN мышей+ОТ-I, которые скончались от заболевания (показано черным на фиг. 2g, h и 9а), наблюдался рост отрицательных по NGFR клеток ALL в крови и ВМ, что подтверждает, что OVA-экспрессирующие лейкозные клетки были уничтожены инфузированными клетками OT-I (фиг. 9а, с). Наоборот, клетки OT-I у большинства контрольных мышей не смогли размножиться и показали конститутивно высокие уровни экспрессии LAG3, признак истощения Т-клеток (фиг. 2g, h). Соответственно, инфузированные клетки OT-I не смогли уничтожить OVA-экспрессирующие клетки В-ALL у этих мышей, о чем свидетельствует первоначальное, но временное снижение циркулирующих NGFR-экспрессирующих лейкозных клеток с последующим их ростом в крови и ВМ (фиг. 9b, d).The synergy of IFN cell therapy and adoptive transfer of OT-I T cells in promoting survival was then examined (Fig. 2e). Whereas OT-I T cell infusion resulted in 20% survival of mice compared to no control, combination treatment significantly improved survival, up to 67% (Figure 2f). Longitudinal analysis of IFN+OT-I mice revealed expansion of OT-I peaking at 6 days postinfusion, accompanied by transient activation of LAG3 and clearance of OVA-ALL (Figs. 2g, h and 9a). Of note, those IFN+OT-I mice that succumbed to the disease (shown in black in Figs. 2g, h and 9a) exhibited an increase in NGFR-negative ALL cells in the blood and BM, confirming that OVA-expressing leukemia cells were killed by infused OT-I cells (Fig. 9a, c). In contrast, OT-I cells in most control mice failed to proliferate and showed constitutively high levels of LAG3 expression, a sign of T cell exhaustion (Fig. 2g,h). Accordingly, infused OT-I cells failed to eliminate OVA-expressing B-ALL cells in these mice, as evidenced by an initial but transient decrease in circulating NGFR-expressing leukemia cells followed by their increase in the blood and BM (Fig. 9b, d) .

При вскрытии, в то время как хорошая фракция Т-клеток OT-I в ВМ, селезенке и лимфатических узлах IFN мышей+ОТ-I оставалась в качестве пула памяти и имела пониженную регуляцию ингибиторного PD1, большинство Т-клеток OT-I у мышей CTRL OT-I были обнаружены признаки истощения эффекторов, так как все они экспрессировали маркер PD1 (фиг. 9е, f). Как и ожидалось, Т-клетки OT-I, введенные контрольным мышам, которым не вводили опухоли, не расширялись и не повышали экспрессию Lag3 (фиг. 2g, h). В целом эти данные показывают, что, хотя клетки OT-I подвергались сильной активации и размножению у IFN мышей, что приводило к клиренсу опухоли, эти клетки были гипофункциональны у контрольных мышей, не могли размножаться и демонстрировали фенотипические признаки истощения.At autopsy, while a good fraction of OT-I T cells in the BM, spleen, and lymph nodes of IFN+OT-I mice remained as a memory pool and had downregulation of inhibitory PD1, the majority of OT-I T cells in CTRL mice OT-I showed evidence of effector depletion as they all expressed the PD1 marker (Fig. 9e, f). As expected, OT-I T cells injected into tumor-free control mice did not expand or increase Lag3 expression (Fig. 2g,h). Overall, these data indicate that although OT-I cells were highly activated and proliferated in IFN mice, leading to tumor clearance, these cells were hypofunctional in control mice, failed to proliferate, and showed phenotypic signs of exhaustion.

- 45 046120- 45 046120

Пример 3. Сигнатура праймированного иммунного гена в отношении ответов M1 и Th1 у IFN мышей; и генная терапия IFN компенсирует вызванные лейкемией изменения в микроокружении опухоли (ТМЕ) и налагает иммуностимулирующую программу.Example 3: Primed Immune Gene Signature for M1 and Th1 Responses in IFN Mice; and IFN gene therapy compensates for leukemia-induced changes in the tumor microenvironment (TME) and imposes an immunostimulatory program.

Чтобы выяснить, изменяет ли предложенная стратегия доставки генов IFN лейкемическую микросреду, способствующую индукции эффективных иммунных ответов, было проведено мультиплексное измерение экспрессии генов на панели генов 750, используемой для профилирования иммунитета при раке на селезенке и ВМ у контрольных и IFN мышей, до и после заражения лейкемией. Почти все активированные гены в обеих тканях IFN по сравнению с контрольными мышами были генами, стимулированными IFN (ISG), и в селезенке активация Т-клеток, процессинг антигена, активация макрофагов/DC, активация NK и врожденный иммунитет подтверждают, что предложенное лечение заставляет производить ответную реакцию IFN/Th1 в этих тканях. Эти изменения оставались очевидными после стимуляции антигеном опухоли и сопровождались отрицательной негативной модуляций лейкозноассоциированных генов (фиг. 3а). Затем были очищены CD4+ Т-клетки селезенки, чтобы детально исследовать выбранные гены, и была показана значительная положительная регуляция Tb21, кодирующего фактор транскрипции Th1 TBET, и никаких изменений в прототипических генах Th2 и Treg у IFN по сравнению с контрольными мышами-опухоленосителями. Также наблюдалась активацию гена Il17 у IFN мышей, но это изменение не сопровождалось активацией других прототипных генов Il22 и Rorc Th17 (фиг. 3b и 10а).To investigate whether the proposed IFN gene delivery strategy alters the leukemic microenvironment to facilitate the induction of effective immune responses, multiplex gene expression measurements were performed on a 750 gene panel used to profile immunity in splenic and BM cancers in control and IFN mice, pre- and post-challenge. leukemia. Almost all of the upregulated genes in both IFN tissues compared to control mice were IFN-stimulated genes (ISGs), and in the spleen, T cell activation, antigen processing, macrophage/DC activation, NK activation, and innate immunity confirm that the proposed treatment induces production IFN/Th1 response in these tissues. These changes remained evident after tumor antigen stimulation and were accompanied by down-modulation of leukemia-associated genes (Fig. 3a). Splenic CD4+ T cells were then purified to examine the selected genes in detail and showed significant up-regulation of Tb21 encoding the Th1 transcription factor TBET and no changes in the prototypical Th2 and Treg genes in IFN compared to control tumor-bearing mice. Activation of the Il17 gene in IFN mice was also observed, but this change was not accompanied by activation of the other prototypic genes Il22 and Rorc Th17 (Figs. 3b and 10a).

Затем был охарактеризован фенотип миелоидных клеток в крови, селезенке и ВМ. Был обнаружен повышенный процент классических (Ly6C'Ly6Glow) и сниженный процент неклассических (Ly6C-Ly6G ) моноцитов в крови IFN по сравнению с контрольными мышами, и такие различия еще более усиливались при заражении лейкемией (фиг. 3 с и 11а). Было также обнаружено увеличение циркулирующих гранулоцитов (Ly6Cint Ly6G+) у IFN мышей. Рост лейкемии в селезенке контрольных мышей сопровождался экспансией незрелых миелоидных клеток (CD11cint MHCII-F4/ 80-) и повышенным процентом МНС-II негативных макрофагов М2, тогда как ни одно из этих изменений не наблюдалось у IFN мышей (фиг. 11b-d). Связанные с лейкемией изменения также отсутствовали в миелоидных клетках ВМ IFN мышей, которые вместо этого показали увеличение DC и фракции DC, представляющей иммунодоминантный пептид OVA257-264 на MHC-I (фиг. 12а, b и 18). Аналогично, изменения в клетках NK и NKT, наблюдаемые в селезенке и ВМ лейкозных мышей, включая снижение экспрессии активирующего рецептора NKG2D, у IFN мышей отсутствовали (фиг. 13а-е).The phenotype of myeloid cells in the blood, spleen, and VM was then characterized. An increased percentage of classical (Ly6C'Ly6Glow) and a reduced percentage of non-classical (Ly6C) were found-Ly6G ) monocytes in the blood of IFN compared with control mice, and such differences were further enhanced by leukemia challenge (Figs. 3 c and 11a). An increase in circulating granulocytes was also found (Ly6Cint Ly6G+) in IFN mice. The growth of leukemia in the spleen of control mice was accompanied by the expansion of immature myeloid cells (CD11cint MHCII-F4/80-) and an increased percentage of MHC-II negative M2 macrophages, whereas none of these changes were observed in IFN mice (Fig. 11b-d). Leukemia-associated changes were also absent in IFN mouse BM myeloid cells, which instead showed an increase in DCs and a fraction of DCs presenting the immunodominant peptide OVA257-264 on MHC-I (Figs. 12a, b and 18). Similarly, changes in NK and NKT cells observed in the spleen and BM of leukemic mice, including decreased expression of the activating receptor NKG2D, were absent in IFN mice (Fig. 13a-e).

Анализ РНК-секвенирования (PHK-Seq) выявил лейкемические индуцированные транскрипционные изменения в макрофагах, которые были существенно нейтрализованы генной терапией IFN (фиг. 22а, b). Макрофаги селезенки от ALL против контрольных мышей активировали гены, кодирующие иммуносупрессивный цитокин IL-10, ингибиторную контрольную точку иммунитета PD-1, а также гены, связанные с делением клеток и ответом на термины генной онтологии (GO) иммунных стимулов. Гены с пониженной регуляцией были обогащены в терминах GO, связанных с метаболизмом жирных кислот, активацией лейкоцитов и презентацией антигена (фиг. 19а, с). IFN генная терапия у ALL мышей вызвала иммуностимулирующую программу, характеризующуюся повышенной активацией IFNстимулированных генов (ISG), обогащенных защитным ответом, миграцией лейкоцитов и ответом на условия интерферона GO, и отмененной вызванной лейкемией повышенной регуляцией Il10 и снижением регуляция генов МНС II (фиг. 19b-d). Генная терапия IFN у ALL мышей индуцировала ISG на уровнях выше, чем у контрольной группы (фиг. 19d и фигура 22а), и транскриптомы макрофагов от контрольных мышей и без IFN опухолевых мышей показали высокую корреляцию, хотя они были четко отличны от ALL и IFN+ALL группы (фиг. 22b). Эти данные подтверждают и расширяют предыдущие сообщения о том, что предложенная моноцитарно-опосредованная генная терапия преимущественно направляет IFN на ТМЕ (De Palma, M. et al. (2008) Cancer Cell 14: 299-311; Escobar, G. et al. (2014) Sci. Transl. Med. 6: 217ra3; Catarinella, M. et al. (2016) EMBO Mol. Med. 8: 155-170).RNA sequencing (RNA-Seq) analysis revealed leukemia-induced transcriptional changes in macrophages that were significantly reversed by IFN gene therapy (Fig. 22a, b). Splenic macrophages from ALL versus control mice upregulated genes encoding the immunosuppressive cytokine IL-10, the inhibitory immune checkpoint PD-1, as well as genes associated with cell division and response to gene ontology (GO) terms of immune stimuli. Down-regulated genes were enriched in GO terms related to fatty acid metabolism, leukocyte activation and antigen presentation (Fig. 19a, c). IFN gene therapy in ALL mice induced an immunostimulatory program characterized by increased activation of IFN-stimulated genes (ISGs) enriched in defense response, leukocyte migration, and response to interferon GO conditions, and abolished leukemia-induced upregulation of Il10 and downregulation of MHC II genes (Fig. 19b- d). IFN gene therapy in ALL mice induced ISGs at levels higher than those of controls (Figure 19d and Figure 22a), and macrophage transcriptomes from control and IFN-free tumor mice showed high correlation, although they were clearly distinct from ALL and IFN+ ALL groups (Fig. 22b). These data confirm and extend previous reports that the proposed monocyte-mediated gene therapy preferentially targets IFN to the TME (De Palma, M. et al. (2008) Cancer Cell 14: 299-311; Escobar, G. et al. ( 2014) Sci. Transl. Med. 6: 217ra3; Catarinella, M. et al. (2016) EMBO Mol. Med. 8: 155-170).

Чтобы проанализировать влияние лейкемии и генной терапии IFN на ТМЕ более непредвзято, была проведена одноклеточная (sc)PHK-Seq на клетках CD11b+, выделенных из селезенки контрольных и мышей с опухолями, которых лечили или не лечили IFN генной терапией. Используя капельный метод (Zheng, G.X. et al. (2017) Nat. Commun. 8: 14049), были получены данные scPHK-Seq из 10 821 клеток, определив среднее значение 1338 генов/клетку. Кластеризацией на основе графиков и анализом сигнатур генов с использованием опубликованных наборов данных (Lavin, Y. et al. (2014) Cell 159: 1312-1326; Varol, D. et al. (2017) Immunity 46: 1030-1044; ImmGen) идентифицировали 11 кластеров, соответствующих моноцитам (кл. 1-3), нейтрофилы (кл. 4-6), дендритные клетки (кл. 7), макрофаги (кл. 8), природные киллеры и Т-клетки (кл. 9) тучные клетки (кл. 10) и В-клетки (кл. 11). Гетерогенность наблюдалась в популяциях моноцитов и нейтрофилов, охватывающих неклассические (кл. 1) и классические (кл. 2) моноциты, кластер, совместно экспрессирующий гены моноцитов и нейтрофилов (кл. 3) (Yanez, A. et al. (2017) Immunity 47: 890-902) и промежуточные звенья созревания нейтрофилов (фиг. 19е и фигура 23а, b). Лейкемия оказала значительное влияние на транскрипционный ландшафт неклассических моноцитов (фиг. 19f), которые были расширены в селезенке мышей с опухолями (см. фигю 11с). Другие популяции миелоидных клеток, в том числе макрофаги и DC, показали сравнительно меньше изменений, вызванныхTo analyze the impact of leukemia and IFN gene therapy on the TME in a more unbiased manner, single-cell (sc)RNA-Seq was performed on CD11b + cells isolated from the spleens of control and tumor-bearing mice that were or were not treated with IFN gene therapy. Using the droplet method (Zheng, G. X. et al. (2017) Nat. Commun. 8: 14049), scRNA-Seq data were obtained from 10,821 cells, yielding an average of 1,338 genes/cell. Graph-based clustering and gene signature analysis using published datasets (Lavin, Y. et al. (2014) Cell 159: 1312-1326; Varol, D. et al. (2017) Immunity 46: 1030-1044; ImmGen) identified 11 clusters corresponding to monocytes (cl. 1-3), neutrophils (cl. 4-6), dendritic cells (cl. 7), macrophages (cl. 8), natural killer cells and T cells (cl. 9) mast cells (cl. 10) and B cells (cl. 11). Heterogeneity was observed in monocyte and neutrophil populations, spanning non-classical (cl. 1) and classical (cl. 2) monocytes, a cluster co-expressing monocyte and neutrophil genes (cl. 3) (Yanez, A. et al. (2017) Immunity 47 : 890-902) and neutrophil maturation intermediates (Figure 19e and Figure 23a,b). Leukemia had a significant impact on the transcriptional landscape of non-classical monocytes (Figure 19f), which were expanded in the spleen of tumor-bearing mice (see Figure 11c). Other myeloid cell populations, including macrophages and DCs, showed comparatively fewer changes caused by

- 46 046120 лейкемией (фиг. 24). Связанные с опухолью неклассические моноциты, активировали гены, обогащенные терминами GO, такими как активация комплемента и отрицательная регуляция воспаления, в то время как они подавлялит гены, связанные с процессингом и презентацией антигена (фиг. 19g). Генная терапия IFN наложила управляемую ISG иммуностимулирующую программу на неклассические моноциты от ALL мышей, о чем свидетельствует активация генов, обогащенных терминами GO, связанных с защитой и врожденным иммунным ответом, а также генов МНС II (фиг. 19g, h). Транскрипционное перепрограммирование ТМЕ с помощью генной терапии IFN было менее эффективным у неклассических моноцитов от мышей, которые не реагировали на генную терапию IFN (фиг. 25а), что было выявлено с помощью кластеризации на основе графиков и дифференциальной экспрессии генов (фиг. 19f, h). Субкластеризация данных scPHK-Seq по неклассическим моноцитам позволила идентифицировать четыре основных субкластера (от 1А до 1D; фиг. 25b). Подкластер 1А состоял из клеток мышей, не страдающих заболеваниями, как у контрольных, так и у IFN мышей, тогда как остальные три субкластера в значительной степени перекрывались клетками от с ответомов IFN+ALL (1В), не реагирующих IFN+ALL (1С) и ALL (1D). Анализ минимального остовного дерева (MST) выявил траекторию от 1А до 1D, подтверждая частичное и эффективное перепрограммирование в клетках не реагирующих в сравнении и с ответомов IFN мышей (фиг. 191).- 46 046120 leukemia (Fig. 24). Tumor-associated non-classical monocytes upregulated genes enriched in GO terms such as complement activation and negative regulation of inflammation, while they downregulated genes associated with antigen processing and presentation (Figure 19g). IFN gene therapy imposed an ISG-driven immunostimulatory program on non-classical monocytes from ALL mice, as evidenced by the upregulation of genes enriched in GO terms associated with defense and innate immune response, as well as MHC II genes (Fig. 19g,h). Transcriptional reprogramming of the TME by IFN gene therapy was less effective in non-classical monocytes from mice that did not respond to IFN gene therapy (Figure 25a), as revealed by graph-based clustering and differential gene expression (Figure 19f,h) . Subclustering of scRNA-Seq data on non-classical monocytes identified four major subclusters (1A to 1D; Figure 25b). Subcluster 1A consisted of cells from disease-free mice in both control and IFN mice, while the other three subclusters largely overlapped with cells from IFN+ALL responders (1B), IFN+ALL non-responders (1C), and ALL (1D). Minimum spanning tree (MST) analysis revealed a trajectory from 1A to 1D, confirming partial and efficient reprogramming in cells of non-responders versus IFN responders in mice (FIG. 191).

Неожиданно также было обнаружено увеличение количества FOXP3+CD25+CD4+ Т-клеток в ВМ у IFN мышей с инъекцией опухоли (фиг. 12с, d). В целом эти изменения согласуются с примированием к активации ответов M1 и Th1 у IFN мышей, что может способствовать, при заражении лейкемией, индукции защитного иммунного ответа.Surprisingly, an increase in the number of FOXP3+CD25+CD4+ T cells in the VM of IFN tumor-injected mice was also found (Fig. 12c,d). Overall, these changes are consistent with the priming of activation of M1 and Th1 responses in mice by IFN, which may contribute, during leukemia infection, to the induction of a protective immune response.

Пример 4. Обработка IFN индуцирует длительные противоопухолевые ответы, нацеленные на множественные опухолевые антигены.Example 4 IFN treatment induces durable antitumor responses targeting multiple tumor antigens.

Далее было исследовано, может ли лечение IFNa, нацеленное на опухоль, также способствовать долгосрочным длительным ответам у мышей. Поразительно, но в среднем 24% (в среднем в 5 различных экспериментах, n=11, 14, 8, 16, 12) IFN мышей выжили в течение длительного времени и были эффективно излечены от заболевания, тогда как только 2% контрольных мышей (n=13, 14, 8, 16, 13) до него дожили (один показательный эксперимент показан на фиг. 4а и 14а). Следует отметить, что при распределении мышей по времени выживания мы обнаружили, что у мышей, подвергнутых эвтаназии в ранние сроки после инъекции опухоли, наблюдался низкий процент циркулирующих OVA-специфических Тклеток и отсутствие появления NGFR негативных ALL (фиг. 14b). Напротив, мыши, подвергнутые эвтаназии в более поздние моменты времени, продемонстрировали индукцию переменного процента циркулирующих OVA-специфических Т-клеток и появление NGFR-негативных клонов ALL (фиг. 14b). Эти результаты позволяют предположить, что мыши, ставшие жертвой этой болезни, либо не смогли вызвать иммунный ответ и умерли очень рано, либо выработали анти-OVA-ответы, но в конечном итоге умерли из-за неспособности этих клеток защитить мышей, либо из-за истощения, либо из-за появления иммунно-отобранных OVA-негативных ALL клонов. Выжившие длительное время показали стабильные циркулирующие OVA-специфические Т-клетки и, после повторного заражения OVA-ALL, оставались без заболевания (фиг. 4b и 14с). Клиренс опухоли был связан с экспансией циркулирующих OVAспецифических Т-клеток, что позволяет предположить, что развитие ответов Т-клеток памяти играет ключевую роль в защите мышей от последующего заражения опухолью (фиг. 14d). Удивительно, но выжившие в течение длительного времени мыши IFN эффективно очищались как от OVAэкспрессирующих, так и родительских OVA-негативных ALL-клеток при повторном заражении этими клетками при соотношении 1: 1 или только родительскими клетками, что предполагает, что имело место распространение ответа на дополнительные опухолеспецифические антигены (TAA), и могло быть необходимым для достижения долгосрочной долговременной защиты (фиг. 4с, d и 14е).It was further investigated whether tumor-targeting IFNa treatment could also promote long-term durable responses in mice. Strikingly, an average of 24% (average across 5 different experiments, n=11, 14, 8, 16, 12) of IFN mice survived long-term and were effectively cured of disease, whereas only 2% of control mice (n =13, 14, 8, 16, 13) lived to see it (one representative experiment is shown in Fig. 4a and 14a). Of note, when stratifying mice by survival time, we found that mice euthanized early after tumor injection had a low percentage of circulating OVA-specific T cells and no development of NGFR negative ALL (Figure 14b). In contrast, mice euthanized at later time points showed the induction of a variable percentage of circulating OVA-specific T cells and the emergence of NGFR-negative ALL clones (Fig. 14b). These results suggest that mice that succumbed to this disease either failed to mount an immune response and died very early, or developed anti-OVA responses but ultimately died due to the failure of these cells to protect the mice, or because depletion, or due to the emergence of immune-selected OVA-negative ALL clones. Long-term survivors showed stable circulating OVA-specific T cells and, after re-infection with OVA-ALL, remained disease-free (Figs. 4b and 14c). Tumor clearance was associated with expansion of circulating OVA-specific T cells, suggesting that the development of memory T cell responses plays a key role in protecting mice from subsequent tumor challenge (Fig. 14d). Surprisingly, long-term surviving IFN mice were effectively cleared from both OVA-expressing and parental OVA-negative ALL cells when reinfected with these cells at a 1:1 ratio or with parental cells alone, suggesting that there was a spread of the response to additional tumor-specific antigens (TAA), and could be necessary to achieve long-term long-term protection (Fig. 4c, d and 14e).

Пример 5. Комбинация IFN лечения и блокады CTLA-4 повышает выживаемость при лейкозе.Example 5: Combination of IFN treatment and CTLA-4 blockade improves survival in leukemia.

Затем была исследована комбинация терапии блокадой CTLA-4 с направленным на опухоль IFNa лечением в предложенной экспериментальной модели OVA-ALL (фиг. 4е). Принимая во внимание, что все группы лечения - генная терапия IFN или лечение одним aCTLA4 или их комбинацией - значительно увеличивали выживаемость мышей по сравнению с контролем, комбинированная терапия была более эффективной (IFN 21%; aCTLA4 20%; CTRL+антитело изотопического контроля 7%; IFN+aCTLA4 36%; фиг. 4f и 15а), что было подтверждено во втором эксперименте (IFN+aCTLA4 30% против aCTLA4 8%; фиг. 4g и 15b). Обработка IFN или aCTLA-4 увеличивала процент специфических для OVA207 Т-клеток в РВ, который дополнительно увеличивался в комбинированной группе (фиг. 16b). Соответственно, иммунный отбор NGFR-негативных ALL был более явным в группах IFN+aCTLA4 и aCTLA4, хотя он не всегда сопровождался отсроченным течением заболевания (фиг. 16а), что позволяет предположить, что иммунный ответ на один нео-антиген может не дает защиту от опухолей. Помимо доминантного антигена OVA, предложенная модель ALL также экспрессирует OFP (который коэкспрессируется с miR-126) и прокариотический транс-активатор tTA (который активирует экспрессию miR-126) в качестве потенциальных нео-антигенов, которые помогают управлять трансформированным фенотип (см. фиг. 1а). Были стимулированы мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) долгоживущих выживших мыThe combination of CTLA-4 blockade therapy with tumor-targeted IFNa treatment was then examined in the proposed experimental model of OVA-ALL (Fig. 4e). Whereas all treatment groups - IFN gene therapy or treatment with aCTLA4 alone or a combination of both - significantly increased mouse survival compared to control, combination therapy was more effective (IFN 21%; aCTLA4 20%; CTRL + isotopic control antibody 7% ; IFN+aCTLA4 36%; Figs. 4f and 15a), which was confirmed in the second experiment (IFN+aCTLA4 30% vs. aCTLA4 8%; Figs. 4g and 15b). Treatment with IFN or aCTLA-4 increased the percentage of OVA207-specific T cells in the PB, which was further increased in the combination group (Fig. 16b). Accordingly, immune selection of NGFR-negative ALL was more pronounced in the IFN+aCTLA4 and aCTLA4 groups, although it was not always accompanied by delayed disease progression (Fig. 16a), suggesting that the immune response to a single neo-antigen may not confer protection against tumors. In addition to the dominant OVA antigen, the proposed ALL model also expresses OFP (which is coexpressed with miR-126) and the prokaryotic trans-activator tTA (which activates miR-126 expression) as potential neo-antigens that help drive the transformed phenotype (see FIG. 1a). Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from long-lived survivors were stimulated.

- 47 046120 шей (из эксперимента, показанного на фиг. 4f) клетками-мишенями, трансдуцированными LV, экспрессирующими tTA, OFP, NGFR или OVA, и измерена продукция γ-IFN с помощью ELISPOT. Большинство из этих мышей показали способность к ответу против одного или нескольких нео-антигенов в дополнение к OVA, причем самый сильный ответ наблюдался против tTA и самый слабый против NGFR (фиг. 4h).- 47 046 120 necks (from the experiment shown in Fig. 4f) with target cells transduced with LV expressing tTA, OFP, NGFR or OVA, and γ-IFN production measured using ELISPOT. Most of these mice showed the ability to respond against one or more neo-antigens in addition to OVA, with the strongest response observed against tTA and the weakest against NGFR (Fig. 4h).

Эти данные показывают, что распространение иммунного ответа на дополнительные нео-антигены происходило у большинства выживших мышей. Затем эти мыши были повторно заражены при соотношении 1:1 OVA-позитивной и негативной ALL и было обнаружено, что большинство из них пережили повторное заражение.These data indicate that expansion of the immune response to additional neo-antigens occurred in the majority of surviving mice. These mice were then reinfected at a 1:1 ratio of OVA-positive to ALL-negative and the majority were found to survive the reinfection.

Интересно отметить, что анализ отдельных мышей показал, что у тех, которые не выжили, не удалось вызвать широкий ответ против опухолевых антигенов и/или погибли от набора клонов ALL, в которых отсутствует более одного неоантигена (дополнительная таблица 1). В качестве еще одного признака адаптивного иммунного ответа, лежащего в основе выживания мышей, было проведено сравнение репертуара TCR-P комплементарной определяющей области (CDR) РВМС до и после заражения лейкемией. Как продуктивная клональность (мера разнообразия в диапазоне от 0=поликлональная до 1=моноклональная у каждой мыши), так и сходство репертуара среди разных мышей увеличивались при повторном заражении лейкемией, что указывает на расширение клонов Т-клеток, реагирующих на опухоль в сравнении с общим набором TAA среди выживших мышей (фиг. 4i и 16с).Interestingly, analysis of individual mice revealed that those that did not survive failed to mount a broad response against tumor antigens and/or died from a set of ALL clones lacking more than one neoantigen (Supplementary Table 1). As a further indication of the adaptive immune response underlying mouse survival, the TCR-P complementary determining region (CDR) repertoire of PBMCs before and after leukemia infection was compared. Both productive clonality (a measure of diversity ranging from 0=polyclonal to 1=monoclonal within each mouse) and repertoire similarity among different mice increased with leukemia reinfection, indicating an expansion of tumor-responsive T cell clones relative to the total recruitment of TAA among surviving mice (Figs. 4i and 16c).

Чтобы дополнительно оценить, является ли генерация ответов на множественные нео-антигены прогностическим фактором длительного выживания, был проведен новый эксперимент и были собраны РВМС сразу после заражения OVA-ALL, чтобы исследовать реактивность Т-клеток против всех известных TAA с помощью анализа IFNg-ELISPOT. У мышей с противоопухолевым репертуаром, включающим в себя несколько TAA, вероятность длительной выживаемости была гораздо выше, чем у мышей, реагирующих на единственный TAA или без него, которые все умерли от болезни (фиг. 4j, k).To further evaluate whether the generation of responses to multiple neo-antigens is predictive of long-term survival, a new experiment was performed and PBMCs were collected immediately after OVA-ALL infection to examine T cell reactivity against all known TAAs using an IFNg-ELISPOT assay. Mice with an antitumor repertoire that included multiple TAAs were much more likely to survive long-term than mice responding to a single or no TAA, which all succumbed to disease (Figure 4j,k).

В целом эти данные показывают, что как генная терапия IFN, так и блокада CTLA4 увеличивают примирование Т-клеток и расширяют репертуар ответа против неоантигенов опухоли, и что эти ответы могут быть аддитивными и длительно защищать от опухоли.Overall, these data indicate that both IFN gene therapy and CTLA4 blockade increase T cell priming and expand the repertoire of responses against tumor neoantigens, and that these responses may be additive and long-lastingly protective against tumor.

Пример 6. Генная терапия IFN ускоряет активацию и расширение адоптивно перенесенных CAR19трансдуцированных Т-клеток и повышает выживаемость.Example 6: IFN gene therapy accelerates the activation and expansion of adoptively transferred CAR19-transduced T cells and improves survival.

Для дальнейшего изучения синергизма между генной терапией IFN и адоптивным переносом Тклеток в клинически релевантной модели были созданы Т-клетки, экспрессирующие ранее описанный CAR второго поколения (2G), нацеленный на CD19 мыши (клетки CART19) и включающийе эндокостимулирующий домен CD28 (Kochenderfer, J.N. et al. (2010) Blood 116: 3875-3886), и обработанным мышам вводили родительский (OVA-негативный) ALL. Для переноса гена CAR был использован LV, который координируют экспрессию CAR и маркера NGFR от двунаправленного промотора (Casucci, M. et al. (2013) Blood 122: 3461-3472) (фиг. 26а, b). Чтобы осуществить приживление клеток CART19 (Davila, ML et al. (2013) PLoS One 8: 1-14), перед инфузией мышей кондиционировали циклофосфамидом (фиг. 20а). Принимая во внимание, что одни клетки CART19 практически не влияли на быстро растущий ALL у контрольных мышей в представленных экспериментальных условиях, они значительно ингибировали бремя лейкемии и истощали нормальные В-клетки у IFN мышей (фиг. 20b и фигура 26с). Напоминающий обнаружение Т-клеток OT-I, клетки CART19 выявили раннюю и преходящую активацию LAG3 и PD1 у IFN, но не у контрольных мышей, достигнув самого высокого пика в долгосрочной выжившей IFN (фиг. 20с и фигура 26d, длительное выживание IFN показано зеленым цветом). Интересно отметить, что экспрессия NGFR также была положительно активирована на клетках CART19 IFN мышей, вероятно, отражая повышенную активность промотора фосфоглицераткиназы (PGK) в ответ на более высокую метаболическую активацию клеток CART у IFN мышей (фиг. 26е, f). Поскольку в рассматриваемом LV экспрессия NGFR и CAR19 совместно регулируется промотором PGK, более высокая экспрессия последнего, возможно, также способствовала более эффективному уничтожению CD19' ALL у IFN мышей. Мы также протестировали улучшенную версию CD19 CAR (iCAR19), которая содержит инактивирующие мутации в первом и третьем доменах ITAM CD3zeta и, как сообщалось, улучшает эффективность уничтожения и повышает жизнеспособность Т-клеток по сравнению со стандартным CAR19 (Kochenderfer, J.N. et al. (2010) Blood 116: 3875-3886). Обрабатывали контрольных или IFN-мышей Т-клетками, экспрессирующими либо CAR19, либо контрольными Т-клетками с низким или высоким бременем лейкемии (фиг. 20d и 27а, b). В то время как клетки CART19 и iCART19 оказывали заметное, но не значимое влияние на опухолевую нагрузку у контрольных мышей, они значительно ингибировали ALL у IFN мышей как в ранних, так и в поздних вмешательствах (фиг. 20е). Также была подтверждена раннюю активацию LAG3 в обеих клетках CART19 IFN мышей (фиг. 20f). Продольные анализы выявили пики экспансии iCART19 у IFN мышей, сопутствующие ингибированию роста или клиренсу ALL, и раннюю активацию экспрессии NGFR/CAR19 у IFN мышей (фиг. 27с, d). В целом значительная часть IFN мышей, обработанных клетками CART19, была еще жива при последнем наблюдении (фиг. 20g).To further explore the synergy between IFN gene therapy and T cell adoptive transfer, T cells expressing a previously described second generation (2G) CAR targeting murine CD19 (CART19 cells) and incorporating the CD28 endocostimulatory domain were generated in a clinically relevant model (Kochenderfer, J.N. et al. (2010) Blood 116: 3875-3886), and treated mice were injected with parental (OVA-negative) ALL. An LV was used to transfer the CAR gene, which coordinates the expression of CAR and the NGFR marker from a bidirectional promoter (Casucci, M. et al. (2013) Blood 122: 3461-3472) (Fig. 26a, b). To achieve engraftment of CART19 cells (Davila, ML et al. (2013) PLoS One 8:1-14), mice were conditioned with cyclophosphamide prior to infusion (Fig. 20a). Whereas CART19 cells alone had little effect on rapidly growing ALL in control mice under the experimental conditions presented, they significantly inhibited leukemia burden and depleted normal B cells in IFN mice (Figure 20b and Figure 26c). Reminiscent of OT-I T cell detection, CART19 cells revealed early and transient activation of LAG3 and PD1 in IFN but not control mice, reaching the highest peak in long-term IFN survival (Figure 20c and Figure 26d, long-term IFN survival shown in green ). Interestingly, NGFR expression was also positively upregulated on mouse IFN CART19 cells, likely reflecting increased phosphoglycerate kinase (PGK) promoter activity in response to higher metabolic activation of mouse IFN CART cells (Fig. 26e,f). Since NGFR and CAR19 expression is co-regulated by the PGK promoter in the LV in question, higher expression of the latter may also have contributed to more efficient clearance of CD19' ALL in IFN mice. We also tested an improved version of the CD19 CAR (iCAR19), which contains inactivating mutations in the first and third domains of ITAM CD3zeta and has been reported to improve killing efficiency and enhance T cell viability compared to standard CAR19 (Kochenderfer, J.N. et al. (2010) ) Blood 116: 3875-3886). Control or IFN mice were treated with T cells expressing either CAR19 or control T cells with low or high leukemia burden (Figs. 20d and 27a,b). While CART19 and iCART19 cells had a noticeable but not significant effect on tumor burden in control mice, they significantly inhibited ALL in IFN mice in both early and late interventions (Figure 20e). Early activation of LAG3 was also confirmed in both murine IFN CART19 cells (Fig. 20f). Longitudinal analyzes revealed peaks of iCART19 expansion in IFN mice concomitant with growth inhibition or clearance of ALL, and early upregulation of NGFR/CAR19 expression in IFN mice (Fig. 27c,d). Overall, a significant proportion of IFN mice treated with CART19 cells were still alive at last observation (Fig. 20g).

- 48 046120- 48 046120

Материалы и способы.Materials and methods.

План эксперимента.Experimental design.

Размер выборки был выбран в соответствии с предыдущим опытом экспериментальных моделей и анализов. Ни один образец или животное не были исключены из анализа. Мыши были случайным образом распределены в каждую экспериментальную группу. Исследователи были в неслепом исследовании.The sample size was chosen according to previous experience with experimental designs and analyses. No samples or animals were excluded from analysis. Mice were randomly assigned to each experimental group. The researchers were in a non-blinded study.

Плазмидная конструкция и продуцирование LV.Plasmid construction and LV production.

Ранее были описаны mTie2-IFN-mirT, mTie2-GFP-mirT, PGK-OFP, PGK-tTA LV9,10,14. Передача NGFR-OVA BdLV была получена путем клонирования кДНК OVA (AgeI-SalI), амплифицированной из PGK-OVA LV37 с помощью PCR вместо cDNA GFP (AgeI-SalI) в NGFR-GFP BdLV38. Были использованы следующие праймеры:mTie2-IFN-mirT, mTie2-GFP-mirT, PGK-OFP, PGK-tTA LV were previously described 9,10,14 . Transfer of NGFR-OVA to BdLV was achieved by cloning the OVA cDNA (AgeI-SalI) amplified from PGK-OVA LV37 by PCR in place of the GFP cDNA (AgeI-SalI) into NGFR-GFP BdLV38. The following primers were used:

праймер Fw: 5-CGACCGGTCCACAAAGACAGCACCATGACA;primer Fw: 5-CGACCGGTCCACAAAGACAGCACCATGACA;

праймер Rv: 5'- ATTGTCGACTTAAGGGGAAACACATCTGCCAAAGA.primer Rv: 5'- ATTGTCGACTTAAGGGGAAACACATCTGCCAAAGA.

NGFR-CD20 перенос BdLV был получен путем клонирования оптимизированной в отношении кодонов CD20 cDNA человека из синтезированной плазмиды (KpnI blunt-Sail) вместо GFP cDNA (AgeI blunt-SalI) в NGFR-GFP BdLV. NGFR-CAR19 и NGFR-iCAR19 перенос BdLV были получены путем клонирования последовательностей CAR19 и неактивных CAR19, описанных ранее (Kochenderfer, J.N. et al. (2010) Blood 116: 3875-3886) методом PCR вместо кДНК GFP (AgeI-SalI) в BDLV NGFR-GFP, используя следующие праймеры:The NGFR-CD20 transfer of BdLV was generated by cloning codon-optimized human CD20 cDNA from a synthesized plasmid (KpnI blunt-Sail) in place of the GFP cDNA (AgeI blunt-SalI) into NGFR-GFP BdLV. NGFR-CAR19 and NGFR-iCAR19 transfer BdLV were obtained by cloning the CAR19 and inactive CAR19 sequences described previously (Kochenderfer, J.N. et al. (2010) Blood 116: 3875-3886) by PCR instead of the GFP cDNA (AgeI-SalI) in BDLV NGFR-GFP using the following primers:

праймер Rv (неактивный CAR19): 5-AAACAGCTCCTCGAGTTATCTAGGGGCCA;Rv primer (inactive CAR19): 5-AAACAGCTCCTCGAGTTATCTAGGGGCCA;

праймер Rv (CAR19): 5-AAACAGCTCCCTCGAGTCATCTAGGGGCCAGT;Rv primer (CAR19): 5-AAACAGCTCCCTCGAGTCATCTAGGGGCCAGT;

праймер Fw (CAR19 и неактивный CAR19): 5'-AACACCGGTGTACCGAATTCATGGGCGTG.Fw primer (CAR19 and inactive CAR19): 5'-AACACCGGTGTACCGAATTCATGGGCGTG.

Концентрированные VSV-G-псевдотипированные LV получали и титровали, как описано ранее (Follenzi, A. et al. (2000) Nat. Genet. 25: 217-222).Concentrated VSV-G-pseudotyped LVs were prepared and titrated as previously described (Follenzi, A. et al. (2000) Nat. Genet. 25: 217-222).

Мыши.Mice.

Мыши C57Bl/6 Ly45.2 и Ly45.1 были приобретены в лаборатории Charles River. C57Bl/6 Ly45.1/Ly45.2 были получены скрещиванием мышей C57Bl/6 Ly45.2 и C57Bl/6 Ly45.1 в исследовательском центре на животных в Научном институте Сан-Раффаэле и использовались в качестве доноров для трансплантации НРС. Трансгенных мышей OT-I C57Bl/6 Ly45.2 содержали в виде колонии в исследовательском центре животных Научного института Сан-Раффаэле. Все процедуры на животных выполнялись в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и их использованию Научного института Сан Раффаэле (IACUC 600), и представлялись Министерству здравоохранения и местным органам власти в соответствии с итальянским законодательством.C57Bl/6 Ly45.2 and Ly45.1 mice were purchased from Charles River Laboratory. C57Bl/6 Ly45.1/Ly45.2 were obtained by crossing C57Bl/6 Ly45.2 and C57Bl/6 Ly45.1 mice at the animal research center of the San Raffaele Scientific Institute and were used as donors for LDC transplantation. OT-I C57Bl/6 Ly45.2 transgenic mice were maintained as a colony at the Animal Research Center of the San Raffaele Scientific Institute. All animal procedures were performed in accordance with protocols approved by the Animal Care and Use Committee of the San Raffaele Scientific Institute (IACUC 600) and were submitted to the Ministry of Health and local authorities in accordance with Italian legislation.

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (HSPC).Hematopoietic stem cell (HSPC) transplantation.

Трансплантация HSPC у мышей C57Bl/6.HSPC transplantation in C57Bl/6 mice.

Шестинедельных мышей C57Bl/6 Ly45.2/Ly45.1 подвергали эвтаназии с помощью СО2, а ВМ собирали путем промывки бедренных костей и голеней. Клетки негативной линии дифференцировки, обогащенные HS/PC, выделяли из общего ВМ с использованием системы очистки клеток на основе иммуномагнитной колонки (набор для истощения клеточной линии мышей, Miltenyi, № 130-090-858). 10 клеток негативной линии/мл затем предварительно стимулировали в течение 3-4 ч в бессывороточной среде StemSpan (StemCell Technologies), содержащей смесь цитокинов (20 нг/мл IL-3, 100 нг/мл SCF, 100 нг/мл FLT-3L, 50 нг/мл ТРО (все от компании Peprotech) и затем трансдуцировали указанными лентивирусными векторами в дозе 108 трансдуцирующих единиц/мл в течение 12 ч в той же среде, содержащей цитокин. После трансдукции клетки промывали и 10 клеток вводили в хвостовую вену смертельно облученных 6-недельных самок C57Bl/Ly45.1. Дозы облучения были разделены по 935 сГр в двух дозах. Трансдуцированные клетки также культивировали in vitro в течение 15 дней в EVIDM с добавлением 10% FBS, SCF (100 нг/мл), FLT3L (100 нг/мл), пенициллина (100 МЕ/мл), стрептомицина (100 мкг/мл) и 2% глютамина и затем тестировали вместе с клетками РВМС, выделенными от пересаженных мышей при стабильном гемопоэтическом восстановлении (6 недель), для количественного определения VCN с помощью qPCR, как описано ранее (De Palma et al., Blood 2005).Six-week-old C57Bl/6 Ly45.2/Ly45.1 mice were euthanized with CO2, and VMs were collected by washing the femurs and tibias. Negative lineage cells enriched in HS/PC were isolated from total BM using an immunomagnetic column-based cell purification system (Mouse Cell Line Depletion Kit, Miltenyi, no. 130-090-858). 10 negative lineage cells/ml were then prestimulated for 3–4 h in StemSpan serum-free medium (StemCell Technologies) containing a cytokine cocktail (20 ng/ml IL-3, 100 ng/ml SCF, 100 ng/ml FLT-3L, 50 ng/ml TPO (all from Peprotech) and then transduced with the indicated lentiviral vectors at a dose of 108 transducing units/ml for 12 h in the same cytokine-containing medium. After transduction, the cells were washed and 10 cells were injected into the tail vein of lethally irradiated 6 -week-old C57Bl/Ly45.1 females.Radiation doses were divided into 935 cGy in two doses.Transduced cells were also cultured in vitro for 15 days in EVIDM supplemented with 10% FBS, SCF (100 ng/ml), FLT3L (100 ng /ml), penicillin (100 IU/ml), streptomycin (100 μg/ml) and 2% glutamine and then tested together with PBMC cells isolated from transplanted mice in stable hematopoietic recovery (6 weeks), to quantify VCN using qPCR as described previously (De Palma et al., Blood 2005).

Исследования опухолей.Tumor research.

Мышь OVA-ALL.OVA-ALL mouse.

Субклон OVA-ALL был создан путем трансформации исходного клона ALL #1114 с NGFR-OVA BdLV. Вкратце, ALL содержали в культуре при концентрации 2x106 клеток/мл в Stem Span с добавлением 10% FBS, пенициллина (100 МЕ/мл), стрептомицина (100 мкг/мл), 2% глютамина, IL3 (20 нг/мл), SCF (100 нг/мл), FLT3L (100 нг/мл), ТРО (50 нг/мл) и трансдуцировали при 2x107 TU/мл с NGFR-OVA BdLV. После 6 ч воздействия LV, трансдуцированный ALL был отмыт и внутривенно введен мышам C57Bl/6 Ly45.2, получавшим сублетальное облучение (450 сГр). Мышей с лейкемией умерщвляли через 14 дней, когда ALL достигал 90% от общего количества клеток РВ, и ВМ собирали путем промывки бедренных костей и голеней.The OVA-ALL subclone was created by transforming the original ALL clone #1114 with the NGFR-OVA BdLV. Briefly, ALL were maintained in culture at a concentration of 2x106 cells/ml in Stem Span supplemented with 10% FBS, penicillin (100 IU/ml), streptomycin (100 μg/ml), 2% glutamine, IL3 (20 ng/ml), SCF (100 ng/ml), FLT3L (100 ng/ml), TPO (50 ng/ml) and transduced at 2x107 TU/ml with NGFR-OVA BdLV. After 6 h of LV exposure, transduced ALL was washed and intravenously injected into C57Bl/6 Ly45.2 mice receiving sublethal irradiation (450 cGy). Leukemic mice were sacrificed after 14 days when ALL reached 90% of total PB cells, and BM were collected by washing the femurs and tibias.

Клетки, трансдуцированные NGFR+, выделяли путем иммуно-магнитной маркировки клеток (CD271 MicroBead Kit, Miltenyi, #130-099-023). Чистоту выделенного ALL определяли анализом с помоNGFR+ transduced cells were isolated by immunomagnetic cell labeling (CD271 MicroBead Kit, Miltenyi, #130-099-023). The purity of the isolated ALL was determined by analysis using

- 49 046120 щью проточного цитометра путем мечения клеток антителом против NGFR и оценивали как 98% (NGFR+ ALL; см. фиг. 5а). Затем партию OVA-ALL замораживали в нескольких аликвотах, хранили в жидком азоте и использовали для всех экспериментов. Для заражения опухолями мышам внутривенно вводили дозу 105 OVA-ALL или 3х104 родительских ALL, ресуспендированных в 200 мкл фосфатносолевого буфера (PBS). Для экспериментов повторного заражения смешивали OVA-ALL и родительский (OVA-негативный) ALL в соотношении 1:1 (всего 105 ALL). Состав продукта для инфузии проверяли анализом с помощью проточного цитометра перед инъекцией in vivo путем мечения смешанных клеток антителом против NGFR. Кинетику роста опухоли определяли цитофлуориметрическим анализом при периодическом отборе образцов из РВ. Для исследований выживаемости мышей ежедневно осматривали, а при обнаружении признаков страдания оценивали состояние заболевания и затем подвергали эвтаназии, а ВМ и селезенку собирали в стерильных условиях для дальнейшего анализа. В экспериментах по блокированию CTLA-4 мышиное анти-мышиное моноклональное антитело к CTLA4 (mAb-клон 9D9 BioXCell, #BE0164) или контрольное антитело изотипа мыши (mAb-клон МСР-11 BioXCell, #BE0086) вводили внутрибрюшинно со дня 3 после инъекции исходного ALL или OVA-ALL в начальной дозе 200 мкг/мышь и последующие дозы 100 мкг/мышь каждые 3-4 дня для всего пяти инфузий антител.- 49 046120 flow cytometer by labeling cells with anti-NGFR antibody and estimated as 98% (NGFR+ ALL; see Fig. 5a). The batch of OVA-ALL was then frozen in multiple aliquots, stored in liquid nitrogen, and used for all experiments. To challenge tumors, mice were intravenously dosed with 10 5 OVA-ALL or 3 x 10 4 parental ALL resuspended in 200 μl phosphate-buffered saline (PBS). For reinfection experiments, OVA-ALL and parental (OVA-negative) ALL were mixed in a 1:1 ratio (105 ALL in total). The composition of the infusion product was verified by flow cytometric analysis prior to in vivo injection by labeling mixed cells with anti-NGFR antibody. The kinetics of tumor growth was determined by cytofluorometric analysis during periodic sampling from the RV. For survival studies, mice were examined daily and if signs of distress were detected, disease status was assessed and then euthanized, and VMs and spleens were collected under sterile conditions for further analysis. In CTLA-4 blocking experiments, a mouse anti-mouse monoclonal antibody to CTLA4 (mAb clone 9D9 BioXCell, #BE0164) or a mouse isotype control antibody (mAb clone MCP-11 BioXCell, #BE0086) was administered intraperitoneally from day 3 after injection of the original ALL or OVA-ALL at an initial dose of 200 μg/mouse and subsequent doses of 100 μg/mouse every 3-4 days for a total of five antibody infusions.

In vivo истощение CD8 Т-клеток.In vivo depletion of CD8 T cells.

Для истощения Т-клеток in vivo анти CD8 истощающее моноклональное антитело (mAb 53-6.72 BioXCell, #BE0004-1) вводили мышам внутрибрюшинно в дозе 200 мкг/мышь за день до инъекции OVAALL и затем каждые 3 дня в течение всей продолжительности эксперимента.For in vivo T cell depletion, an anti-CD8 depleting monoclonal antibody (mAb 53-6.72 BioXCell, #BE0004-1) was administered intraperitoneally to mice at a dose of 200 μg/mouse the day before OVAALL injection and then every 3 days for the duration of the experiment.

Адоптивный перенос Т-клеток OT-I.Adoptive transfer of OT-I T cells.

Для экспериментов по адоптивным Т-клеткам Т-клетки OT-I очищали от селезенки 8-недельных трансгенных самок мышей OT-I C57B1/6 Ly45.2 с помощью иммуно-магнитного отбора (набор для выделения CD8+ Т-клеток, Miltenyi, #130-104-075). Чистоту отобранных OT-I Т-клеток оценивали цитофлуориметрическим анализом с использованием панели hhtu-CD8, CD4 и CD3-антител. 1х106 наивных Т-клеток OT-I инъецировали внутривенно трансплантированным мышам IFN или CTRL в указанное время после инъекции OVA-ALL.For adoptive T cell experiments, OT-I T cells were purified from the spleens of 8-week-old female OT-I C57B1/6 Ly45.2 transgenic mice using immunomagnetic selection (CD8+ T Cell Isolation Kit, Miltenyi, #130 -104-075). The purity of selected OT-I T cells was assessed by cytofluorometric analysis using a panel of hhtu-CD8, CD4 and CD3 antibodies. 1 x 10 6 naïve OT-I T cells were injected intravenously into IFN or CTRL transplanted mice at the indicated times after OVA-ALL injection.

Генерация клеток CART19.Generation of CART19 cells.

Сначала Т-клетки очищали от селезенки самок мышей C57Bl/6 CD45.2+ в возрасте 8 недель иммунным магнитным отбором (набор для выделения Т-клеток Pan, Miltenyi, #130-095-130) и затем активировали анти-CD3/CD28 бусинами Dyna (ThermoFisher #11452D) в соответствии с инструкциями производителя. Т-клетки культивировали в RPMI с добавлением 10% FBS, пенициллина (100 Ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл), 1% глютамина, IL2 (30 ед/мл), IL7 (5 нг/мл), IL15 (5 нг/мл), Na пирувата (1 мМ), Hepes (20 мМ), NEAA (1 мМ) и бета-меркаптоэтанола (0,05 мМ). Через один день после активации Т-клетки трансдуцировали в концентрации 1х106 клеток/мл с 10 TU/мл BdLV NGFR-CAR19 или NGFR-iCAR19. Через 12 ч после воздействия LV Т-клетки промывали и размножали в культуре в течение 8 дней перед инфузией мышам в дозе 7х106 (эксперимент на фиг. 20b) и 107 (эксперимент на фиг. 20е) NGFR+ Т-клеток.First, T cells were purified from the spleen of 8-week-old female C57Bl/6 CD45.2+ mice by immune magnetic selection (T cell isolation kit Pan, Miltenyi, #130-095-130) and then activated with anti-CD3/CD28 beads Dyna (ThermoFisher #11452D) according to manufacturer's instructions. T cells were cultured in RPMI supplemented with 10% FBS, penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 μg/ml), 1% glutamine, IL2 (30 U/ml), IL7 (5 ng/ml), IL15 ( 5 ng/ml), Na pyruvate (1 mM), Hepes (20 mM), NEAA (1 mM) and beta-mercaptoethanol (0.05 mM). One day after activation, T cells were transduced at a concentration of 1x10 6 cells/ml with 10 TU/ml BdLV NGFR-CAR19 or NGFR-iCAR19. 12 hours after LV exposure, T cells were washed and expanded in culture for 8 days before infusion into mice at a dose of 7x10 6 (experiment in Fig. 20b) and 10 7 (experiment in Fig. 20e) NGFR+ T cells.

In vivo анализ пролиферации Edu.In vivo Edu proliferation assay.

Анализы пролиферации in vivo проводили с использованием 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU, Invitrogen), аналога тимидина, используемого в качестве альтернативы BrdU. EdU растворяли в стерильном 1х PBS в концентрации 10 мг/мл. Мышам вводили внутрибрюшинно 100 мкг EdU за 24 ч до анализа. ВМ и селезенку собирали и обрабатывали в соответствии с инструкциями производителя (набор для анализа проточной цитометрии Click-iT® EdU, Invitrogen, #C10636), и процент включения EdU в лейкозную клетку измеряли анализом проточной цитометрией.In vivo proliferation assays were performed using 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU, Invitrogen), a thymidine analogue used as an alternative to BrdU. EdU was dissolved in sterile 1x PBS at a concentration of 10 mg/ml. Mice were injected intraperitoneally with 100 μg of EdU 24 h before analysis. VM and spleen were collected and processed according to the manufacturer's instructions (Click-iT® EdU Flow Cytometry Assay Kit, Invitrogen, #C10636), and the percentage of EdU incorporation into the leukemia cell was measured by flow cytometry analysis.

Клеточная культура и трансдукция.Cell culture and transduction.

Линия клеток лимфомы, полученная от мыши EL4 C57Bl/6, содержалась в EV1DM с добавлением 10% FBS, пенициллина (100 МЕ/мл), стрептомицина (100 мкг/мл) и 2% глютамина. Трансдукцию проводили при концентрации 106 клеток/мл при дозе 108 TU/мл указанного векторного ресурса. Клетки инкубировали в течение 12 ч и затем промывали для удаления вектора. OFP на трансдуцированных клетках оценивали через 7 дней культивирования методом проточной цитометрии. Экспрессию NGFR и CD20 оценивали путем окрашивания клеток анти-NGFR или анти-CD20 антителом через 7 дней после трансдукции (см. раздел проточной цитометрии). VCN трансдуцированных клеток определяли с помощью qPCR в реальном времени через 15 дней культивирования, как описано ранее (De Palma et al., Blood 2005).A lymphoma cell line derived from an EL4 C57Bl/6 mouse was maintained in EV1DM supplemented with 10% FBS, penicillin (100 IU/ml), streptomycin (100 μg/ml), and 2% glutamine. Transduction was carried out at a concentration of 106 cells/ml at a dose of 108 TU/ml of the indicated vector resource. Cells were incubated for 12 h and then washed to remove the vector. OFP on transduced cells was assessed after 7 days of culture by flow cytometry. NGFR and CD20 expression was assessed by staining cells with anti-NGFR or anti-CD20 antibody 7 days after transduction (see flow cytometry section). The VCN of transduced cells was determined by real-time qPCR after 15 days of culture as described previously (De Palma et al., Blood 2005).

Проточная цитометрия.Flow cytometry.

Все цитометрические анализы были выполнены с использованием инструментов FACSCanto II и LSRFortessa (BD Bioscience) и проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo (v. 9.3, Tree Star Inc.).All cytometric analyzes were performed using FACSCanto II and LSRFortessa instruments (BD Bioscience) and analyzed using FlowJo software (v. 9.3, Tree Star Inc.).

Культивируемые клетки.Cultured cells.

Клетки EL4 промывали и ресуспендировали в PBS, содержащем 2% FBS. Для иммуноокрашивания клетки инкубировали с антителами, блокирующими Fc-рецептор мыши, в течение 15 мин при 4°С, а заEL4 cells were washed and resuspended in PBS containing 2% FBS. For immunostaining, cells were incubated with antibodies that block the mouse Fc receptor for 15 min at 4°C, and then

- 50 046120 тем окрашивали в течение 20 мин при 4°С антителами против NGFR или против CD20 (антитела см. в дополнительной табл. 1). Чтобы исключить мертвые клетки из анализа, клетки промывали и ресуспендировали в PBS, содержащем 10 нг/мл 7-аминоактиномицина D (7-AAD).- 50 046120 topics were stained for 20 min at 4°C with anti-NGFR or anti-CD20 antibodies (see Supplementary Table 1 for antibodies). To exclude dead cells from the analysis, cells were washed and resuspended in PBS containing 10 ng/ml 7-aminoactinomycin D (7-AAD).

Периферическая кровь.Peripheral blood.

Для каждой мыши 250 мкл периферической крови добавляли к 10 мкл PBS, содержащего 45 мг/мл EDTA. Для иммуноокрашивания известный объем цельной крови (100 мкл) сначала инкубировали с антителами против мышиного рецептора FcyIII/II (Cd16/Cd32) в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем инкубировали в присутствии моноклональных антител (антитела см. в дополнительной табл. 1) в течение 15 мин при комнатной температуре. Эритроциты удаляли лизированием на рабочей станции TQ-Prep (Beckman-Coulter) в присутствии равного объема FBS (100 мкл) для защиты лейкоцитов. Для количественной проточной цитометрии сначала окрашивали и лизировали известный объем крови (100 мкл), как описано выше, а затем добавляли фиксированный объем (50 мкл) Flow-count Fluorospheres с известной концентрацией Beckman Coulter, #7547053). Чтобы определить абсолютное количество клеток, была использована формула:For each mouse, 250 μl of peripheral blood was added to 10 μl of PBS containing 45 mg/ml EDTA. For immunostaining, a known volume of whole blood (100 μl) was first incubated with anti-mouse FcyIII/II receptor antibodies (Cd16/Cd32) for 10 min at room temperature and then incubated in the presence of monoclonal antibodies (see Supplementary Table 1 for antibodies) for 15 minutes at room temperature. Red blood cells were removed by lysing on a TQ-Prep workstation (Beckman-Coulter) in the presence of an equal volume of FBS (100 μl) to protect leukocytes. For quantitative flow cytometry, a known volume of blood (100 µl) was first stained and lysed as described above, and then a fixed volume (50 µl) of Flow-count Fluorospheres with a known concentration of Beckman Coulter, #7547053) was added. To determine the absolute number of cells, the formula was used:

Абсолютный подсчет клеток (клетка/мкл)=[общее количество подсчитанных клеток/(общее количество подсчитанных флуоросферх2)]хконцентрация Flow-count Fluorospheres.Absolute cell count (cell/μl) = [total number of cells counted/(total number of fluorospheres counted2)] x concentration of Flow-count Fluorospheres.

Для окрашивания OVA-специфическим пентамером цельную кровь сначала лизировали с помощью H2O. Затем 1 х 106 РВМС ресуспендировали в 50 мкл PBS, содержащего 2 мМ ЭДТА и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA), и инкубировали с антителами, блокирующими анти-мышиный FcyIII/II рецептор (Cd16/Cd32), в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем с OVA-специфичным пентамерным реагентом (0,5 мкг/1х106 клеток) и моноклональными антителами (антитела см. в дополнительной табл. 1) в течение еще 10 мин при комнатной температуре. Чтобы исключить мертвые клетки из анализа, клетки промывали и ресуспендировали в PBS, содержащем 2% FBS и 10 нг/мл 7аминоактиномицина D (7-AAD). Для окрашивания клеток Treg в РВ сначала проводили поверхностное окрашивание на 50 мкл цельной крови (антитела см. в дополнительной таблице 1), как описано выше. Затем окрашенную цельную кровь промывали и ресуспендировали в 100 мкл раствора для фиксации/проницаемости (eBioscience, #00-5523-00) и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре, промывали и ресуспендировали в 50 мкл раствора для проницаемости, содержащего антимышиный FoxP3 или изотип контрольных антител, и выдерживали в течение 20 мин при комнатной температуре.For OVA-specific pentamer staining, whole blood was first lysed with H 2 O. 1 x 10 6 PBMCs were then resuspended in 50 μl PBS containing 2 mM EDTA and 0.5% bovine serum albumin (BSA) and incubated with blocking antibodies. anti-mouse FcyIII/II receptor (Cd16/Cd32), for 10 min at room temperature, and then with OVA-specific pentameric reagent (0.5 μg/1x10 6 cells) and monoclonal antibodies (see Supplementary Table for antibodies). 1) for another 10 minutes at room temperature. To exclude dead cells from the analysis, cells were washed and resuspended in PBS containing 2% FBS and 10 ng/ml 7-aminoactinomycin D (7-AAD). To stain Treg cells in PB, surface staining was first performed on 50 μl of whole blood (see Supplementary Table 1 for antibodies) as described above. Stained whole blood was then washed and resuspended in 100 μl of fixation/permeabilization solution (eBioscience, #00-5523-00) and incubated for 20 min at room temperature, washed and resuspended in 50 μl of permeabilization solution containing anti-mouse FoxP3 or isotype control antibodies and incubated for 20 min at room temperature.

Костный мозг.Bone marrow.

Клетки ВМ получали путем промывки бедренной кости в 2%-ном растворе FBS PBS и пропускания суспензии клеток через нейлоновый фильтр 40 мкм. Клетки (1х106-3х106 клеток) промывали, ресуспендировали в 100 мкл PBS, содержащего 2 мМ EDTA и 0,5% бычьего BSA, и инкубировали с антителами, блокирующими анти-мышиный FcyIII/II рецептор (Cd16/Cd32), в течение 15 мин при 4°С. Затем проводили окрашивание моноклональными антителами (антитела см. в дополнительной табл. 1) в течение 20 мин при 4°С. Для окрашивания OVA-специфическим пентамером 1х106 ВМ -клеток окрашивали, как описано выше для РВ. Для всех внутриклеточных окрашиваний и для некоторых поверхностных окрашиваний использовалось фиксируемое окрашивание мертвых клеток LIVE/DEAD (ThermoFisher, #L34959) для различения живых и мертвых клеток в соответствии с инструкциями производителя. Для окрашивания Treg в ВМ сначала выполняли поверхностное окрашивание на 1 х 106 ВМ -клетках, как описано выше для РВ.BM cells were obtained by washing the femur in 2% FBS PBS and passing the cell suspension through a 40 μm nylon filter. Cells (1x10 6 -3x10 6 cells) were washed, resuspended in 100 μl of PBS containing 2 mM EDTA and 0.5% bovine BSA, and incubated with anti-mouse FcyIII/II receptor blocking antibodies (Cd16/Cd32) for 15 min at 4°C. Staining was then performed with monoclonal antibodies (see Supplementary Table 1 for antibodies) for 20 min at 4°C. For staining with OVA-specific pentamer, 1x10 6 BM cells were stained as described above for PB. For all intracellular stains and for some surface stains, LIVE/DEAD Fixed Dead Cell Stain (ThermoFisher, #L34959) was used to distinguish between live and dead cells according to the manufacturer's instructions. To stain Tregs in BM, surface staining was first performed on 1 x 106 BM cells as described above for PB.

Селезенка.Spleen.

Селезенку сначала разрезали на кусочки и полученную клеточную суспензию пропускали через нейлоновый фильтр 40 мкм. Эритроциты лизировали с помощью Н2О, и полученную суспензию клеток затем пропускали через нейлоновый фильтр 40 мкм и промывали в холодном PBS, содержащем 2 мМ EDTA и 0,5% BSA. Клетки обрабатывали и иммуноокрашивали, как описано выше для ВМ.The spleen was first cut into pieces and the resulting cell suspension was passed through a 40 μm nylon filter. Red blood cells were lysed with H 2 O, and the resulting cell suspension was then passed through a 40 μm nylon filter and washed in cold PBS containing 2 mM EDTA and 0.5% BSA. Cells were processed and immunostained as described above for VM.

Окрашивание клеточного циклаCell cycle staining

Клетки ВМ и спленоциты от мышей, которым инъецировали OVA-ALL, собирали, как описано выше. Затем клетки окрашивали на поверхностные маркеры, промывали и фиксировали с использованием буфера BD Cytofix (BD #554655), промывали и пермеализировали в BD Perm 2 (BD #347692), промывали и окрашивали PerCP-Су5.5-или АРС-конъюгированным антителом Ki67 и, наконец, ресуспендировали в буфере BD Cytofix с Hoechst при концентрации 1 мкг/мл. Затем клетки анализировали на приборе BD LSRFortessa с УФ-лазером.BM cells and splenocytes from OVA-ALL-injected mice were collected as described above. Cells were then stained for surface markers, washed and fixed using BD Cytofix buffer (BD #554655), washed and permealized in BD Perm 2 (BD #347692), washed and stained with PerCP-Cy5.5-or APC-conjugated Ki67 antibody and , were finally resuspended in BD Cytofix buffer with Hoechst at a concentration of 1 μg/ml. The cells were then analyzed on a BD LSRFortessa instrument with a UV laser.

Окрашивание апоптоза клетокCell apoptosis staining

Клетки ВМ и спленоциты от мышей, которым инъецировали OVA-ALL, собирали, как описано выше. Затем клетки окрашивали поверхностными маркерами, как описано выше. Затем окрашенные клетки дважды промывали буфером для окрашивания клеток (BioLegend, #420201) и ресуспендировали в буфере для связывания аннексина V (Biolegend #422201) и инкубировали с 5 мкл аннексина V, конъюгированного с флуоресцирующей меткой Pacific Blue Thermo Fisher Scientific, и 10 мкл 7-AAD (Biolegend, #420403/420404) в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем к каждому образцу добавляютBM cells and splenocytes from OVA-ALL-injected mice were collected as described above. Cells were then stained with surface markers as described above. Stained cells were then washed twice with Cell Staining Buffer (BioLegend, #420201) and resuspended in Annexin V Binding Buffer (Biolegend #422201) and incubated with 5 μl of Annexin V conjugated to a Pacific Blue Thermo Fisher Scientific fluorescent tag and 10 μl of 7 -AAD (Biolegend, #420403/420404) for 15 min at room temperature. Then add to each sample

- 51 046120- 51 046120

400 мкл буфера для связывания аннексина V и процентный состав апоптотических/мертвых клеток в OVA-ALL измеряют с помощью проточной цитометрии в течение 30 мин после окрашивания.400 μl Annexin V binding buffer and the percentage composition of apoptotic/dead cells in OVA-ALL were measured by flow cytometry within 30 min of staining.

ELISPOT анализ.ELISPOT analysis.

ELISPOT для g-IFN проводили в 96-луночном плоскодонном планшете (Millipore), покрытом 5 мкг/мл анти мышиного IFN-g первичного антитела (BD, #554430). CD8 эффекторные Т-клетки селезенки сначала очищали путем иммуно-магнитной маркировки клеток (CD8 MicroBead Kit, Miltenyi, #130049-401), а чистоту оценивали с помощью цитофлуориметрического анализа с использованием панели анти CD8, CD4 и CD3 антител. Эффекторные Т-клетки затем высевали в конечной концентрации 105 или 2х105 клеток/лунку в присутствии облученных (6000 сГр) 10 клеток-мишеней EL4. В некоторых экспериментах также стимулировали эффекторные Т-клетки с помощью 2,5 мкг/мл конканавалина А в качестве контроля. После 46 ч инкубации при 37°С/5% СО2 клетки промывали и инкубировали с биотинилированным анти мышиного IFN-g антителом (клон XMG 1.2, BD #554410, 1 мкг/мл) в течение двух часов. Затем планшеты четыре раза промывали PBS-Tween, затем 3 раза PBS, а затем добавляли авидин-POD (Roche #11089153001) (1:5000, разведенный в PBS) в течение 1 ч. Затем планшеты четыре раза промывали PBS-Tween, а затем 3 раза PBS, а затем в каждую лунку в течение 15-20 мин добавляли 50 мкл субстрата 3-амино-9-этилкарбазола (АЕС, SIGMA #A6926/50tab). Реакцию останавливали добавлением водопроводной воды, и пятна количественно определяли с помощью ELI-Expert.Elispot-Reader и анализировали с помощью Eli.Analyze Version 5.1 (A.EL.VIS). При использовании общего РВМС в качестве эффекторных клеток, общую кровь сначала лизировали с помощью Н2О для эритроцитов, извлеченные РВМС подсчитывали и высевали в конечной концентрации 105 клеток/лунку.ELISPOT for g-IFN was performed in a 96-well flat-bottom plate (Millipore) coated with 5 μg/ml anti-mouse IFN-g primary antibody (BD, #554430). Splenic CD8 effector T cells were first purified by immunomagnetic cell labeling (CD8 MicroBead Kit, Miltenyi, #130049-401), and purity was assessed by cytofluorometric analysis using a panel of anti-CD8, CD4 and CD3 antibodies. Effector T cells were then plated at a final concentration of 105 or 2x105 cells/well in the presence of irradiated (6000 cGy) 10 target EL4 cells. In some experiments, effector T cells were also stimulated with 2.5 μg/ml concanavalin A as a control. After 46 hours of incubation at 37°C/5% CO 2 , cells were washed and incubated with biotinylated anti-mouse IFN-γ antibody (clone XMG 1.2, BD #554410, 1 μg/ml) for two hours. The plates were then washed four times with PBS-Tween, then 3 times with PBS, and then avidin-POD (Roche #11089153001) (1:5000 diluted in PBS) was added for 1 hour. The plates were then washed four times with PBS-Tween, and then 3 times PBS, and then 50 μl of 3-amino-9-ethylcarbazole substrate (AEC, SIGMA #A6926/50tab) was added to each well over 15-20 min. The reaction was stopped by adding tap water, and the spots were quantified using ELI-Expert.Elispot-Reader and analyzed using Eli.Analyze Version 5.1 (A.EL.VIS). When using total PBMC as effector cells, total blood was first lysed with H 2 O for red blood cells, and the recovered PBMC were counted and plated at a final concentration of 10 5 cells/well.

Экстракция РНК, qPCR и анализ экспрессии генов.RNA extraction, qPCR and gene expression analysis.

Экстракцию РНК из клеток ВМ, спленоцитов и очищенных Т-клеток селезенки CD4+ проводили с использованием набора RNeasy Plus mini Kit (Qiagen). Клетки лизировали в буфере RLT plus, дополненном бета-меркаптоэтанолом. Затем лизат пропускали через иглу 20-го калибра. РНК затем экстрагировали в соответствии с инструкциями производителя. Извлеченные мРНК транскрибировали с использованием набора Superscript Vilo (11754250; Invitrogen). Все анализы Q-PCR на отдельных генах были выполнены с использованием зондов TaqMan от Applied Biosystems (см. ниже). QPCR выполняли в течение 40 циклов с использованием инструмента Viia 7, тогда как программное обеспечение Viia 7 затем использовали для извлечения необработанных данных (Ct). Чтобы определить экспрессию гена, была рассчитана разница (ACt) между пороговым циклом (Ct) каждого гена и пороговым циклом сравнения. Чем ниже ,\Ct, тем выше уровень экспрессии гена. Чтобы получить относительные количественные значения, затем были рассчитаны экспрессия представляющего интерес гена с кратным изменением по сравнению с его экспрессией в контрольном образце по формуле 2-AACt. Значения p рассчитывают на основе средних значений 2-AACt. Манна-Уитни для каждого гена между двумя группами.RNA extraction from BM cells, splenocytes, and purified splenic CD4+ T cells was performed using the RNeasy Plus mini Kit (Qiagen). Cells were lysed in RLT plus buffer supplemented with beta-mercaptoethanol. The lysate was then passed through a 20-gauge needle. RNA was then extracted according to the manufacturer's instructions. Extracted mRNAs were transcribed using the Superscript Vilo kit (11754250; Invitrogen). All single gene Q-PCR analyzes were performed using TaqMan probes from Applied Biosystems (see below). QPCR was performed for 40 cycles using the Viia 7 instrument, while Viia 7 software was then used to extract the raw data (Ct). To determine gene expression, the difference (ACt) between the threshold cycle (Ct) of each gene and the comparison threshold cycle was calculated. The lower ,\Ct, the higher the level of gene expression. To obtain relative quantitative values, fold change expression of the gene of interest relative to its expression in the control sample was then calculated using the formula 2 -AACt . P values are calculated based on the mean 2 -AACt values. Mann-Whitney for each gene between the two groups.

Следующие Taqman-зонды использовали на очищенных CD4+ Т-клетках селезеночной мыши:The following Taqman probes were used on purified mouse splenic CD4+ T cells:

1110 Mm00439616_ml), 1117 (Mm00439618_ml), Ifii-g (Mm01168134_ml), П21110 Mm00439616_ml), 1117 (Mm00439618_ml), Ifii-g (Mm01168134_ml), P2

Mm00434256_ml), Tbx21 (TBET) (Mm00450960_ml), Rorc (Mm01261022_ml),Mm00434256_ml), Tbx21 (TBET) (Mm00450960_ml), Rorc (Mm01261022_ml),

Foxp3 Mm00475156_ml), Gata3 (Mm00484683_ml), 1122 (Mm00444241_ml), 114Foxp3 Mm00475156_ml), Gata3 (Mm00484683_ml), 1122 (Mm00444241_ml), 114

Mm00445259_ml).Mm00445259_ml).

TCR секвенирование.TCR sequencing.

Входящая ДНК была получена из РВМС IFN и CTRL мышей перед инъекцией опухоли (ТО), через 30 дней после инъекции OVA-ALL у мышей с длительным выживанием без опухолей (Т1) и через 4 дня после повторного заражения OVA-ALL и родительской инъекцией ALL смешано в соотношении 1:1 (Т2). Секвенирование цепи TCRe проводили в адаптивных биотехнологиях с использованием платформы ImmunoSEQ с праймерами, специфичными для всех 54 известных экспрессированных Ve и всех 13 областей Je. Каждая уникальная CDR-матрица на уровне аминокислот была определена количественно на миллион (cpm). Клональность оценивалась как 1 - равномерность распределения по Пиелоу:Input DNA was obtained from PBMCs of IFN and CTRL mice before tumor injection (TO), 30 days after OVA-ALL injection in long-term tumor-free survival mice (T1), and 4 days after reinfection with OVA-ALL and parental ALL injection mixed in a ratio of 1:1 (T2). TCRe chain sequencing was performed in adaptive biotechnology using the ImmunoSEQ platform with primers specific for all 54 known expressed Ve and all 13 Je regions. Each unique CDR matrix at the amino acid level was quantified per million (cpm). Clonality was assessed as 1 - uniformity of distribution according to Pielou:

где Н' обозначает энтропию образца, рассчитанную по количеству шаблонов, превышающему 0 (то есть набор всех наблюдаемых матриц у мыши), а Н обозначает максимальную теоретическую энтропию для мыши, определяемую как где S - количество различных матриц в мышке.where H' denotes the entropy of the sample, calculated from the number of patterns greater than 0 (i.e., the set of all observed matrices in the mouse), and H denotes the maximum theoretical entropy for the mouse, defined as where S is the number of distinct matrices in the mouse.

Сходство оценивали как 1 - расстояние Брея-Кертиса между образцом s и средним числом шаблонов в момент времени t.Similarity was scored as 1, the Bray-Curtis distance between pattern s and the average number of patterns at time t.

= 1ΣίΙ^ - Jul Σ; 1¼ + Jul= 1ΣίΙ^ - Jul Σ; 1¼ + June

- 52 046120- 52 046120

Эта мера эквивалентна индексу подобия Соренсена-Дайса и была оценена с учетом всех i наблюдаемых матриц в момент времени t.This measure is equivalent to the Sorensen-Dice similarity index and was estimated taking into account all i observed matrices at time t.

Объединенное РНК-секвенирование.Pooled RNA-seq.

РНК выделяли из 10000-50000 отсортированных клеток с использованием системы ReliaPrep РНК MiniPrep (Promega), а библиотеки PHK-Seq готовили по протоколу SMART-Seq2 (Picelli, S. et al. (2014) Nat. Protoc. 9: 171-181), с незначительными изменениями. Вкратце, РНК (1-5 нг) подвергали обратной транскрипции с использованием пользовательских олиго-dT и олиго LNA с переключением матриц (последовательностей) с последующей PCR амплификацией и очисткой (бусины Ampure ХР, Beckman Coulter). Полученную кДНК (0,5-1 нг) метили при 55°С в течение 30 мин, и конечные библиотеки PHK-Seq генерировали с использованием реагентов из набора для подготовки библиотеки Nextera XT DNA (Ulumina). Секвенирование проводили на приборе NextSeq 500 (Ulumina, San Diego, CA) с использованием набора NextSeq 500/550 High Output v2 (75 циклов).RNA was isolated from 10,000-50,000 sorted cells using the ReliaPrep RNA MiniPrep system (Promega), and RNA-Seq libraries were prepared using the SMART-Seq2 protocol (Picelli, S. et al. (2014) Nat. Protoc. 9: 171-181) , with minor changes. Briefly, RNA (1-5 ng) was reverse transcribed using custom template-switching oligo-dT and oligo-LNA, followed by PCR amplification and purification (Ampure XP beads, Beckman Coulter). The resulting cDNA (0.5–1 ng) was labeled at 55°C for 30 min, and final RNA-Seq libraries were generated using reagents from the Nextera XT DNA Library Prep Kit (Ulumina). Sequencing was performed on a NextSeq 500 instrument (Ulumina, San Diego, CA) using the NextSeq 500/550 High Output v2 kit (75 cycles).

Одноклеточное РНК-секвенирование.Single-cell RNA sequencing.

Цифровой 3'-концевой scPHK-Seq на основе капел выполняли на Chromium Single-Cell Controller (10х Genomics, Pleasanton, СА) с использованием набора реагентов Chromium Single Cell 3' Reagent Kit v2 в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, суспендированные отдельные клетки распределяли в Gel Beads-in-Emulsion (GEM) и лизировали с последующим штрих-кодированием РНК, обратной транскрипцией и амплификацией PCR (12-14 циклов). Готовые к секвенированию scPHK-Seq были приготовлены в соответствии с инструкциями производителя, проверены и количественно определены на приборах 2100 Bioanalyzer (Agilent Genomics, Santa Clara, СА) и Qubit 3.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Секвенирование проводили на приборе NextSeq 500 (Шшшпа, San Diego, CA) с использованием набора NextSeq 500/550 High Output v2 (75 циклов).Droplet-based digital 3' end scRNA-Seq was performed on a Chromium Single-Cell Controller (10x Genomics, Pleasanton, CA) using the Chromium Single Cell 3' Reagent Kit v2 according to the manufacturer's instructions. Briefly, suspended single cells were dispensed into Gel Beads-in-Emulsion (GEM) and lysed, followed by RNA barcoding, reverse transcription, and PCR amplification (12–14 cycles). Sequencing-ready scRNA-Seqs were prepared according to the manufacturer's instructions and validated and quantified on 2100 Bioanalyzer (Agilent Genomics, Santa Clara, CA) and Qubit 3.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA) instruments. Sequencing was performed on a NextSeq 500 instrument (San Diego, CA) using the NextSeq 500/550 High Output v2 kit (75 cycles).

Вычислительные методы.Computational methods.

Необработанные чтения были обработаны и приведены в соответствие с транскриптомом ENSEMBL mm10 с использованием CellRanger версии 1.3 (поддержка https://.10xgenomics.com/single-cellgene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger) с параметрами по умолчанию. Были сохранены только достоверно сопоставленные операции считывания, дубликаты без PCR с действительными штрих-кодами и UMI (Unique Molecular Identifiers). Клетки низкого качества отфильтровали. Требовалось минимум 300 уникальных генов, обнаруженных для клеток, кроме того, отбрасывали клетки с соотношением митохондриальной и эндогенной экспрессии генов, превышающим 0,1. Полученные 10821 клеток были сохранены для дальнейшего анализа. Значения экспрессии генов определяли количественно в транскрипте, преобразованном в log на миллион [log (TPM+1)]. Последующие анализы выполнялись с использованием программного пакета R Seurat версии 2.1 (https://github.com/satijalab/seurat/). Кластеризацию клеток и анализ tSNE проводили на 1031 большинстве вариабельных генов, отобранных со средней экспрессией выше 0,01 и логарифмически измененной дисперсией к среднему соотношению выше 0,5.Raw reads were processed and aligned to the ENSEMBL mm10 transcriptome using CellRanger version 1.3 (supported by https://.10xgenomics.com/single-cellgene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger) with parameters default. Only validly mapped reads, non-PCR duplicates with valid barcodes, and UMIs (Unique Molecular Identifiers) were retained. Low quality cells were filtered out. A minimum of 300 unique genes detected per cell was required, and cells with a ratio of mitochondrial to endogenous gene expression greater than 0.1 were discarded. The resulting 10,821 cells were stored for further analysis. Gene expression values were quantified in log per million converted transcript [log(TPM+1)]. Subsequent analyzes were performed using the R software package Seurat version 2.1 (https://github.com/satijalab/seurat/). Cell clustering and tSNE analysis were performed on the 1031 majority variable genes selected with mean expression greater than 0.01 and log variance to mean ratio greater than 0.5.

Анализ данных Nanostring.Nanostring data analysis.

Экспрессию РНК оценивали на приборе nCounter SPRINT с использованием nCounter PanCancer Immune Profiler для панели мыши (Nanostring Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Количество транскриптов, полученных с помощью NanoString®, обрабатывали следующим образом. Необработанные значения в файлах RCC были нормализованы с использованием библиотеки R/Bioconductor NanoStringNorm (v 1.1.21)40; вариация технического анализа была нормализована с использованием среднего геометрического внутреннего контроля, оценка фона была рассчитана с использованием среднего значения отрицательных контролей, количества РНК были нормализованы с использованием среднего геометрического значения экспрессии конститутивных генов, была применена дополнительная стабилизация дисперсии. Дифференциальную экспрессию нормализованных данных оценивали с помощью линейных моделей, реализованных в библиотеке R/Bioconductor limma library41. Транскрипты считали дифференциально выраженными с порогом скорректированного значения р<0,05 (коррекция Бенджамини-Хохберга).RNA expression was assessed on the nCounter SPRINT instrument using the nCounter PanCancer Immune Profiler for Mouse Panel (Nanostring Technologies) according to the manufacturer's instructions. Transcript quantities obtained using NanoString® were processed as follows. The raw values in the RCC files were normalized using the R/Bioconductor NanoStringNorm library (v 1.1.21) 40 ; Technical assay variance was normalized using the geometric mean of internal controls, background scores were calculated using the mean of negative controls, RNA quantities were normalized using the geometric mean of constitutive gene expression, and additional variance stabilization was applied. Differential expression of normalized data was assessed using linear models implemented in the R/Bioconductor limma library 41 . Transcripts were considered differentially expressed with a threshold of adjusted p < 0.05 (Benjamini-Hochberg correction).

Статистический анализ.Statistical analysis.

Значения выражены в виде среднее значение±стандартная ошибка среднего (SEM), как указано. Статистический анализ выполняли с помощью теста Манна-Уитни или теста Крускалла-Уоллиса с последующей после экспериментальной коррекцией по тесту Данна, если не указано иное. Различия считались статистически значимыми при р<0,05. Анализы были выполнены с использованием R 3.2.242, NPC Test R1043 и Prism (GraphPad Prism версия 7.0). Анализ клеточных популяций на фиг. 2 был выполнен непараметрическим комбинированным тестом43, который представляет собой критерий перестановок, альтернативный параметрическому критерию Т-квадрата Хотеллинга для двух выборок. Эта методология позволяет проводить многомерное сравнение средних значений в группах с небольшим количеством наблюдений, которые не удовлетворяют предположению о многомерной нормальности. Фиг. 1а, l, 16b, 17 и 20b, e были смоделированы в непараметрических рамках, которые позволяют учесть небольшой размер выборки, наличие выбросов, негауссово и сильно искаженное распределение данных, для которых параметрические процедуры не подходят. Был применен надежный и гибкий ранговый метод, подValues are expressed as mean ± standard error of the mean (SEM) as indicated. Statistical analysis was performed using the Mann-Whitney test or the Kruskall-Wallis test, followed by post-experimental correction using Dunn's test unless otherwise stated. Differences were considered statistically significant at p<0.05. Analyzes were performed using R 3.2.2 42 , NPC Test R10 43 and Prism (GraphPad Prism version 7.0). Analysis of cell populations in Fig. 2 was performed by the nonparametric combination test, 43 which is a permutation test alternative to the parametric two-sample Hotelling T-square test. This methodology allows multivariate comparisons of means across groups with a small number of observations that do not satisfy the assumption of multivariate normality. Fig. 1a, l, 16b, 17 and 20b, e were modeled in a nonparametric framework that allows for small sample sizes, outliers, and non-Gaussian and highly skewed data distributions for which parametric procedures are not suitable. A reliable and flexible ranking method was applied, under

- 53 046120 ходящий для продольного анализа в факториальном проектировании44,45. В этом контексте проверка гипотез направлена на выявление различий в распределении собранных переменных, а не на различие между средствами46,47. Этот анализ был реализован с использованием пакета nparLD, разработанного в R46. Кривые выживания оценивали с помощью процедуры Каплана-Мейера (КМ). Рассматриваемая в настоящем документе событийная переменная представляла собой время до гибели, информативное цензурирование не осуществляется. Непараметрическая логарифмическая шкала (Mantel-Haenszel) использовалась для сравнения к кривых выживаемости, связанных с k-образцами48. При наличии более 2 групп проблема множественного сравнения была решена путем корректировки значения p методом Бонферрони.- 53 046120 walking for longitudinal analysis in factorial design 44.45 . In this context, hypothesis testing aims to identify differences in the distribution of collected variables rather than differences between means 46,47 . This analysis was implemented using the nparLD package developed in R46. Survival curves were estimated using the Kaplan-Meier (KM) procedure. The event variable considered here was time to death and no informative censoring was performed. A non-parametric logarithmic scale (Mantel-Haenszel) was used to compare k-sample-related survival curves 48 . When there were more than 2 groups, the problem of multiple comparison was resolved by adjusting the p value using the Bonferroni method.

Пример 7.Example 7.

Была разработана новая лентивирусная векторная конструкция для опухолеспецифической экспрессии интерферона-гамма (IFNy), интерферона II типа. Специфичность к опухоли обеспечивается за счет контроля транскрипции через последовательности энхансера/промотора из локуса Tie2 (Tek), которые избирательно управляют экспрессией трансгена в подмножестве инфильтрирующих опухоль миелоидных клеток, в то же время предотвращая экспрессию в гематопоэтических стволовых и прогениторных клетках с помощью последовательностей-мишеней микроРНК, распознаваемых miR-126-3р и miR-130a, как описано ранее (Escobar, G. et al. (2014) Sci Transl Med 6: 217ra3). Эта конструкция была названа Tig126/130a.A novel lentiviral vector construct for tumor-specific expression of interferon gamma (IFNy), a type II interferon, was developed. Tumor specificity is achieved through transcriptional control via enhancer/promoter sequences from the Tie2 (Tek) locus that selectively drive transgene expression in a subset of tumor-infiltrating myeloid cells while preventing expression in hematopoietic stem and progenitor cells via microRNA targeting sequences , recognized by miR-126-3p and miR-130a, as described previously (Escobar, G. et al. (2014) Sci Transl Med 6: 217ra3). This design was named Tig126/130a.

Аналогичная конструкция для экспрессии интерферона-альфа под контролем Tie2 и последовательности-мишени miR-126 (то есть Tie2.Ifha.126T) была названа Tia126.A similar construct for interferon-alpha expression under the control of Tie2 and the miR-126 target sequence (i.e., Tie2.Ifha.126T) was named Tia126.

В дополнение к векторам Tig126/130a и Tia126 авторами был разработан лентивирусный вектор, несущий cDNA гена фактора некроза опухоли альфа (Tnfa), который был назван Tta126/130а. Структура конструкций (например, Tig126/130а и Tta126/130a) показана на фиг. 28.In addition to the Tig126/130a and Tia126 vectors, we developed a lentiviral vector carrying cDNA of the tumor necrosis factor alpha (Tnfa) gene, which was named Tta126/130a. The structure of the constructs (eg, Tig126/130a and Tta126/130a) is shown in FIG. 28.

Терапия проводится путем трансформации ex vivo гематопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPC) с Tig126/130а с последующей трансплантацией сконструированных клеток условному реципиенту. После приживления потомство HSPC будет расширяться и дифференцироваться, и некоторые из них будут рекрутированы в микроокружение опухоли. Активность промотора специфически активируется в подмножестве инфильтрирующих опухоль моноцитов/макрофагов, в частности, в моноцитах/макрофагах, экспрессирующих Tie2 (ТЕМ), которые локализуются в периваскулярных областях и имеют проангиогенные и иммуносупрессивные функции (De Palma, M. et al. (2005) Cancer Cell 8: 211226; De Palma, M. et al. (2008) Cancer Cell 14: 299-311), доставляя груз (например, IFNy) в это стратегическое положение.The therapy is carried out by ex vivo transformation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) with Tig126/130a, followed by transplantation of the engineered cells into a conditional recipient. After engraftment, HSPC progeny will expand and differentiate, and some will be recruited to the tumor microenvironment. The promoter is specifically activated in a subset of tumor-infiltrating monocytes/macrophages, particularly Tie2-expressing monocytes/macrophages (TEMs), which localize to perivascular regions and have proangiogenic and immunosuppressive functions (De Palma, M. et al. (2005) Cancer Cell 8: 211226; De Palma, M. et al (2008) Cancer Cell 14: 299-311), delivering cargo (eg, IFNy) to this strategic location.

Авторы использовали трансплантируемую модель острого лимфобластного В-лейкоза (B-ALL), близко имитирующую человеческий филадельфийский B-ALL (Nucera, S. et al. (2016) Cancer Cell 29: 905-921), которая легко индуцирует противоопухолевую, иммуносупрессивную микросреду, характеризующуюся, например, появлением миелоидных клеток-супрессоров, понижающей регуляцией генов МНС класса II и повышающей регуляцией IL10 и PD1.The authors used a transplantable model of acute lymphoblastic B-cell leukemia (B-ALL), closely mimicking human Philadelphia B-ALL (Nucera, S. et al. (2016) Cancer Cell 29: 905-921), which readily induces an antitumor, immunosuppressive microenvironment, characterized, for example, by the emergence of myeloid suppressor cells, down-regulation of MHC class II genes, and up-regulation of IL10 and PD1.

Сначала оценивались последствия доставки IFNy на основе Tig126/130a для роста лейкемии и микроокружения в опухоли, вызванного лейкемией (фиг. 29).First, the consequences of Tig126/130a-based IFNy delivery on leukemia growth and the leukemia-induced tumor microenvironment were assessed (FIG. 29).

Мышей C57/BL6 в возрасте от 6 до 8 недель преобразовывали с помощью HSPC негативной линии, трансдуцированных либо Tig126/130a, Tta126/130a, либо контрольным лентивирусным вектором, экспрессирующим биологически неактивный, укороченный ген рецептора фактора роста нервов (NGFR). Дозировка Tig126/130а и Tta126/130а была количественно определена как число копий вектора 1,39 и 2,01, соответственно, in vitro, и 0,44 и 0,83, соответственно, in vivo. Через восемь недель после пересадки при восстановления периферической крови животные получали B-ALL, после чего следовал частый сбор крови. По сравнению с контрольными животными мыши, сконструированные для экспрессии IFNy, показали значительно более медленное прогрессирование заболевания (фиг. 29А). Более того, при умерщвлении наблюдалась повышенная регуляция экспрессии МНС класса II на макрофагах селезенки (фиг. 29В), а также уменьшение количества миелоидных клеток-супрессоров в костном мозге (фиг. 29С), указывающих на превращение микроокружения опухоли в более противоопухолевое, М1-подобное состояние поляризации. Степень ингибирования лейкоза генной терапией Tig126/130а была сравнима с тем, что ранее наблюдалось с грузом интерферона I типа (а именно, с интерфероном-альфа), используя аналогичный векторный скелет (Tia126), ту же платформу доставки и ту же модель лейкемии. Напротив, вектор Tta126/130a не оказывал заметного влияния на рост лейкемии, если он использовался в качестве монотерапии.C57/BL6 mice, 6 to 8 weeks old, were transformed with negative line HSPCs transduced with either Tig126/130a, Tta126/130a, or a control lentiviral vector expressing a biologically inactive, truncated nerve growth factor receptor (NGFR) gene. The dosage of Tig126/130a and Tta126/130a was quantified as vector copy numbers of 1.39 and 2.01, respectively, in vitro, and 0.44 and 0.83, respectively, in vivo. Eight weeks after transplantation, while peripheral blood was restored, animals received B-ALL, followed by frequent blood collection. Compared to control animals, mice engineered to express IFNy showed significantly slower disease progression (FIG. 29A). Moreover, upon sacrifice, there was an upregulation of MHC class II expression on splenic macrophages (Fig. 29B), as well as a decrease in the number of myeloid suppressor cells in the bone marrow (Fig. 29C), indicating a transformation of the tumor microenvironment to a more antitumor, M1-like state of polarization. The extent of leukemia inhibition by the Tig126/130a gene therapy was comparable to that previously observed with type I interferon cargo (namely interferon-alpha), using a similar vector backbone (Tia126), the same delivery platform, and the same leukemia model. In contrast, the Tta126/130a vector had no significant effect on leukemia growth when used as monotherapy.

Затем авторы объединили одновременную доставку нескольких иммуностимулирующих цитокинов в микросреду лейкемии, используя векторную цепь Tie2, снабженную различными трансгенными грузами. Были совместно трансдуцированы HSPC негативной линии с дублетными комбинациями векторов Tia126, Tig126/130a и Tta126/130a по сравнению с монотерапией Tia126 или контрольной группой, трансдуцированной биологически неактивным Tie2. Вектор NGFR, и трансплантировали клетки летально облученным реципиентным мышам. Мыши восстанавливаются, как ожидалось, без аддитивной токсичWe then combined the simultaneous delivery of multiple immunostimulatory cytokines into the leukemia microenvironment using a Tie2 vector chain equipped with various transgenic cargos. Negative lineage HSPCs were co-transduced with doublet combinations of Tia126, Tig126/130a and Tta126/130a vectors compared to Tia126 alone or a control group transduced with biologically inactive Tie2. NGFR vector, and cells were transplanted into lethally irradiated recipient mice. Mice recover as expected without additive toxicity

- 54 046120 ности из-за комбинированной экспрессии цитокинов. Количество копий векторов отдельных векторов, измеренное определенными количественными анализами PCR, было довольно низким, в диапазоне от 0,1 до 0,3 у преобразованных мышей. Мышей заражали B-ALL, как описано выше. Отдельно Tia126 показал снижение роста лейкемии по сравнению с контролем, аналогично комбинациям с Tig126/130a или Tta126/130a (фиг. 30А).- 54 046120 ity due to the combined expression of cytokines. Individual vector copy numbers, as measured by certain quantitative PCR assays, were quite low, ranging from 0.1 to 0.3 in the converted mice. Mice were infected with B-ALL as described above. Alone, Tia126 showed a reduction in leukemia growth compared to control, similar to combinations with Tig126/130a or Tta126/130a (Figure 30A).

Неожиданно комбинация Tig126/130а и Tta126/130а привела к резкому снижению прогрессирования лейкемии, связанному со значительным увеличением экспрессии МНС класса II на макрофагах селезенки (фиг. 30В), снижением MDSC (фиг. 30С) и увеличением цитотоксических CD8+ Т-клеток в селезенке (фиг. 30D). Эти данные предполагают синергизм между IFNy и TNFa, локально экспрессируемым в микроокружении опухоли через лейкемию, проникающую в миелоидные клетки под контролем энхансера/промотора Tie2.Surprisingly, the combination of Tig126/130a and Tta126/130a resulted in a dramatic reduction in leukemia progression associated with a significant increase in MHC class II expression on splenic macrophages (Figure 30B), a decrease in MDSC (Figure 30C), and an increase in cytotoxic CD8+ T cells in the spleen (Figure 30B). Fig. 30D). These data suggest a synergy between IFNy and TNFa locally expressed in the tumor microenvironment through leukemia infiltrating myeloid cells under the control of the Tie2 enhancer/promoter.

Кроме того, оценивалась потенциальная синергия предлагаемой доставки IFNy на основе генной терапии с другими иммунотерапевтическими стратегиями, включая ингибиторы контрольных точек анtu-CTLA-4 и анти-LAG-3 и ингибитор фермента IDO, 1-метилтриптофан (1-MT). Были трансдуцированы HSPC негативной линии с Tig126/130a или контрольным биологически неактивным Tie2. Вектор NGFR, и трансплантировали клетки летально облученным реципиентным мышам. Мыши восстанавливаются, как ожидалось, без аддитивной токсичности из-за комбинированной экспрессии цитокинов. Число копий векторов отдельных векторов, измеренное определенными количественными анализами PCR, составляло 0,72 для Tig126/130a и 0,84 для контролей у преобразованных мышей. Мышей заражали B-ALL, как описано выше.In addition, the potential synergy of the proposed gene therapy-based delivery of IFNy with other immunotherapeutic strategies, including the anti-CTLA-4 and anti-LAG-3 checkpoint inhibitors and the IDO enzyme inhibitor, 1-methyltryptophan (1-MT), was assessed. Negative line HSPCs were transduced with Tig126/130a or a control biologically inactive Tie2. NGFR vector, and cells were transplanted into lethally irradiated recipient mice. The mice recovered as expected without additive toxicity due to combined cytokine expression. Individual vector copy numbers, as measured by specific quantitative PCR assays, were 0.72 for Tig126/130a and 0.84 for controls in the transformed mice. Mice were infected with B-ALL as described above.

Наблюдалось, что в то время как анmи-CTLA-4 (aCTLA4) и анти-LAG-3 (aLAG3) уже продемонстрировали некоторую эффективность в монотерапии в снижении прогрессирования B-ALL, лечение 1-MT не оказывало положительного эффекта (фиг. 31А). Более того, комбинация доставки IFNy на основе генной терапии с 1-MT и ингибиторами контрольных точек повысила эффективность лечения, что привело к снижению прогрессирования заболевания (фиг. 31А), связанного со значительным увеличением экспрессии МНС класса II на селезенке и макрофаги костного мозга (фигуры 31А и 31В) и увеличением цитотоксических CD8+ Т-клеток в селезенке (фиг. 31D).It was observed that while anti-CTLA-4 (aCTLA4) and anti-LAG-3 (aLAG3) had already demonstrated some effectiveness as monotherapy in reducing the progression of B-ALL, treatment with 1-MT had no beneficial effect (Fig. 31A) . Moreover, the combination of gene therapy-based IFNy delivery with 1-MT and checkpoint inhibitors increased treatment efficacy, resulting in reduced disease progression (Figure 31A) associated with a significant increase in MHC class II expression on spleen and bone marrow macrophages (Figure 31A). 31A and 31B) and an increase in cytotoxic CD8+ T cells in the spleen (Fig. 31D).

СсылкиLinks

1. Khalil, D. N., Smith, Е. L., Brentjens, R. J. & Wolchok, J. D. The future of cancer treatment: immunomodulation, CARs and combination immunotherapy. Nat. Rev. Clin. Oncol. 13, 273-290 (2016).1. Khalil, D. N., Smith, E. L., Brentjens, R. J. & Wolchok, J. D. The future of cancer treatment: immunomodulation, CARs and combination immunotherapy. Nat. Rev. Clin. Oncol. 13, 273-290 (2016).

2. Topalian, S. L., Drake, C. G. & Pardoll, D. M. Immune Checkpoint Blockade : A Common Denominator Approach to Cancer Therapy. Cancer Cell 27, 450-461 (2015).2. Topalian, S. L., Drake, C. G. & Pardoll, D. M. Immune Checkpoint Blockade: A Common Denominator Approach to Cancer Therapy. Cancer Cell 27, 450-461 (2015).

- 55 046120- 55 046120

3. Schadendorf, D. et al. Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma. J. Clin. Oncol. 33, 1889-94 (2015).3. Schadendorf, D. et al. Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma. J. Clin. Oncol. 33, 1889-94 (2015).

4. Pitt, J. M. et al. Resistance Mechanisms to Immune-Checkpoint Blockade in Cancer: Tumor-Intrinsic and -Extrinsic Factors. Immunity 44, 1255-1269 (2016).4. Pitt, J. M. et al. Resistance Mechanisms to Immune-Checkpoint Blockade in Cancer: Tumor-Intrinsic and -Extrinsic Factors. Immunity 44, 1255-1269 (2016).

5. Parker, B. S., Rautela, J. & Hertzog, P. J. Antitumour actions of interferons: implications for cancer therapy. Nat. Rev. Cancer 16, 131-44 (2016).5. Parker, B. S., Rautela, J. & Hertzog, P. J. Antitumour actions of interferons: implications for cancer therapy. Nat. Rev. Cancer 16, 131-44 (2016).

6. Hervas-Stubbs, S. et al. Direct effects of type I interferons on cells of the immune system. Clin. Cancer Res. 17, 2619-27 (2011).6. Hervas-Stubbs, S. et al. Direct effects of type I interferons on cells of the immune system. Clin. Cancer Res. 17, 2619-27 (2011).

7. Fuertes, Μ. B., Woo, S. R., Burnett, B., Fu, Y. X. & Gajewski, T. F. Type I interferon response and innate immune sensing of cancer. Trends Immunol. 34, 67-73 (2013).7. Fuertes, M. B., Woo, S. R., Burnett, B., Fu, Y. X. & Gajewski, T. F. Type I interferon response and innate immune sensing of cancer. Trends Immunol. 34, 67-73 (2013).

8. De Palma, M. et al. Tumor-Targeted Interferon-Alpha Delivery by Tie2-Expressing Monocytes Inhibits Tumor Growth and Metastasis. Cancer Cell 14, 299-311 (2008).8. De Palma, M. et al. Tumor-Targeted Interferon-Alpha Delivery by Tie2-Expressing Monocytes Inhibits Tumor Growth and Metastasis. Cancer Cell 14, 299-311 (2008).

9. Escobar, G. et al. Genetic engineering of hematopoiesis for targeted IFN-α delivery inhibits breast cancer progression. Sci. Transl. Med. 6, 217ra3 (2014).9. Escobar, G. et al. Genetic engineering of hematopoiesis for targeted IFN-α delivery inhibits breast cancer progression. Sci. Transl. Med. 6, 217ra3 (2014).

10. Catarinella, M. et al. IFNa gene/cell therapy curbs colorectal cancer colonization of the liver by acting on the hepatic microenvironment. EMBO Mol. Med. 8, 155-70 (2016).10. Catarinella, M. et al. IFNa gene/cell therapy curbs colorectal cancer colonization of the liver by acting on the hepatic microenvironment. EMBO Mol. Med. 8, 155-70 (2016).

11. Fesnak, A. D., June, С. H. & Levine, B. L. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer 16, 566-81 (2016).11. Fesnak, A. D., June, S. H. & Levine, B. L. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer 16, 566-81 (2016).

12. Rosenberg, S. A. & Restifo, N. P. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. Science (80-.). 348, 62-68 (2015).12. Rosenberg, S. A. & Restifo, N. P. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. Science (80-.). 348, 62-68 (2015).

13. Sotillo, E. et al. Convergence of acquired mutations and alternative splicing of CD 19 enables resistance to CART-19 immunotherapy. Cancer Discov. 5, 1282-1295 (2015).13. Sotillo, E. et al. Convergence of acquired mutations and alternative splicing of CD 19 enables resistance to CART-19 immunotherapy. Cancer Discov. 5, 1282-1295 (2015).

14. Nucera, S. et al. микроРНК-126 Orchestrates an Oncogenic Program in В Cell Precursor Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell 29, 905-921 (2016).14. Nucera, S. et al. microRNA-126 Orchestrates an Oncogenic Program in B Cell Precursor Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell 29, 905-921 (2016).

15. De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C. & Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nat. Med. 9, 789-95 (2003).15. De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C. & Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nat. Med. 9, 789-95 (2003).

16. De Palma, M. et al. Tie2 identifies a hematopoietic lineage of proangiogenic monocytes required for tumor vessel formation and a mesenchymal population of pericyte progenitors. Cancer Cell 8, 211-26 (2005).16. De Palma, M. et al. Tie2 identifies a hematopoietic lineage of proangiogenic monocytes required for tumor vessel formation and a mesenchymal population of pericyte progenitors. Cancer Cell 8, 211-26 (2005).

17. Mellman, I., Coukos, G. & Dranoff, G. Cancer immunotherapy comes of age. Nature 480, 480-9 (2011).17. Mellman, I., Coukos, G. & Dranoff, G. Cancer immunotherapy comes of age. Nature 480, 480-9 (2011).

18. Kumar, V., Patel, S., Tcyganov, E. & Gabrilovich, D. I. The Nature of MyeloidDerived Suppressor Cells in the Tumor Microenvironment. Trends Immunol. 37, 208-220 (2016).18. Kumar, V., Patel, S., Tcyganov, E. & Gabrilovich, D. I. The Nature of Myeloid-Derived Suppressor Cells in the Tumor Microenvironment. Trends Immunol. 37, 208-220 (2016).

19. Ruffell, B. & Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell 27, 462-472 (2015).19. Ruffell, B. & Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell 27, 462-472 (2015).

20. Joyce Johanna A. and Fearon Douglas T. T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment. Science (80-.). 348, (2015).20. Joyce Johanna A. and Fearon Douglas T. T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment. Science (80-.). 348, (2015).

- 56 046120- 56 046120

21. Verdegaal, E. Μ. E. et al. Neoantigen landscape dynamics during human melanomaT cell interactions. Nature 536, 91-5 (2016).21. Verdegaal, E. M. E. et al. Neoantigen landscape dynamics during human melanomaT cell interactions. Nature 536, 91-5 (2016).

22. Matsushita, H. et al. Cancer exome analysis reveals a T-cell-dependent mechanism of cancer immunoediting. Nature 482, 400-4 (2012).22. Matsushita, H. et al. Cancer exome analysis reveals a T-cell-dependent mechanism of cancer immunoediting. Nature 482, 400-4 (2012).

23. Linnemann, C. et al. High-throughput epitope discovery reveals frequent recognition of neo-antigens by CD4+ T cells in human melanoma. Nat Med 21, 81-85 (2015).23. Linnemann, C. et al. High-throughput epitope discovery reveals frequent recognition of neo-antigens by CD4+ T cells in human melanoma. Nat Med 21, 81-85 (2015).

24. Lu, Y. C. et al. Efficient identification of mutated cancer antigens recognized by T cells associated with durable tumor regressions. Clin. Cancer Res. 20, 3401-3410 (2014).24. Lu, Y. C. et al. Efficient identification of mutated cancer tumor antigens recognized by T cells associated with durable regressions. Clin. Cancer Res. 20, 3401-3410 (2014).

25. McGranahan, N. et al. Clonal neoantigens elicit T cell immunoreactivity and sensitivity to immune checkpoint blockade. Science (80-.). 351, 1463-1469 (2016).25. McGranahan, N. et al. Clonal neoantigens elicit T cell immunoreactivity and sensitivity to immune checkpoint blockade. Science (80-.). 351, 1463-1469 (2016).

26. Schumacher, T. N. & Schreiber, R. D. Neoantigens in cancer immunotherapy. Science (80-.). 348, 69-74 (2015).26. Schumacher, T. N. & Schreiber, R. D. Neoantigens in cancer immunotherapy. Science (80-.). 348, 69-74 (2015).

27. Sharma, P. & Allison, J. P. Immune Checkpoint Targeting in Cancer Therapy: Toward Combination Strategies with Curative Potential. Cell 161, 205-214 (2015).27. Sharma, P. & Allison, J. P. Immune Checkpoint Targeting in Cancer Therapy: Toward Combination Strategies with Curative Potential. Cell 161, 205-214 (2015).

28. Schildberg, F. A., Klein, S. R., Freeman, G. J. & Sharpe, A. H. Coinhibitory Pathways in the B7-CD28 Ligand-Receptor Family. Immunity 44, 955-972 (2016).28. Schildberg, F. A., Klein, S. R., Freeman, G. J. & Sharpe, A. H. Coinhibitory Pathways in the B7-CD28 Ligand-Receptor Family. Immunity 44, 955-972 (2016).

29. Yang, X. et al. Targeting the Tumor Microenvironment with Interferon-β Bridges Innate and Adaptive Immune Responses. Cancer Cell 25, 37-48 (2014).29. Yang, X. et al. Targeting the Tumor Microenvironment with Interferon-β Bridges Innate and Adaptive Immune Responses. Cancer Cell 25, 37-48 (2014).

30. Huang, Т.-H., Chintalacharuvu, K. R. & Morrison, S. L. Targeting IFN-alpha to В Cell Lymphoma by a Tumor-Specific Antibody Elicits Potent Antitumor Activities. J. Immunol. 179, 6881-6888 (2007).30. Huang, T.-H., Chintalacharuvu, K. R. & Morrison, S. L. Targeting IFN-alpha to Cell Lymphoma by a Tumor-Specific Antibody Elicits Potent Antitumor Activities. J. Immunol. 179, 6881-6888 (2007).

31. Wilson, E. B. et al. Blockade of chronic type I interferon signaling to control persistent LCMV infection. Science 340, 202-7 (2013).31. Wilson, E. B. et al. Blockade of chronic type I interferon signaling to control persistent LCMV infection. Science 340, 202-7 (2013).

32. Sandler, N. G. et al. Type I interferon responses in rhesus macaques prevent SIV infection and slow disease progression. Nature 511, 601-605 (2014).32. Sandler, N. G. et al. Type I interferon responses in rhesus macaques prevent SIV infection and slow disease progression. Nature 511, 601-605 (2014).

33. Joseph Benci, A. L. et al. Tumor Interferon Signaling Regulates a Multigenic Resistance Program to Immune Checkpoint Blockade. Cell 167, 1540-1554 (2016).33. Joseph Benci, A. L. et al. Tumor Interferon Signaling Regulates a Multigenic Resistance Program to Immune Checkpoint Blockade. Cell 167, 1540-1554 (2016).

34. Gentles, A. J. et al. The prognostic landscape of genes and infiltrating immune cells across human cancers. Nat. Med. 21, 938-945 (2015).34. Gentles, A. J. et al. The prognostic landscape of genes and infiltrating immune cells across human cancers. Nat. Med. 21, 938-945 (2015).

35. Mlecnik, B. et al. Integrative Analyses of Colorectal Cancer Show Immunoscore Is a Stronger Predictor of Patient Survival Than Micro satellite Instability. Immunity 44, 698-711 (2016).35. Mlecnik, B. et al. Integrative Analyzes of Colorectal Cancer Show Immunoscore Is a Stronger Predictor of Patient Survival Than Microsatellite Instability. Immunity 44, 698-711 (2016).

36. Bachireddy, P., Burkhardt, U. E., Rajasagi, M. & Wu, C. J. Haematological malignancies: at the forefront of immunotherapeutic innovation. Nat. Rev. Cancer 15, 201-215 (2015).36. Bachireddy, P., Burkhardt, U. E., Rajasagi, M. & Wu, C. J. Haematological malignancies: at the forefront of immunotherapeutic innovation. Nat. Rev. Cancer 15, 201-215 (2015).

37. Matrai, J. et al. Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk. Hepatology 53, 1696-1707 (2011).37. Matrai, J. et al. Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk. Hepatology 53, 1696-1707 (2011).

--

Claims (34)

38. Amendola, M., Venneri, M. A., Biffi, A., Vigna, E. & Naldini, L. Coordinate dualgene transgenesis by lentiviral vectors carrying synthetic bidirectional promoters. Nat. Biotechnol. 23, 108-116 (2005).38. Amendola, M., Venneri, M. A., Biffi, A., Vigna, E. & Naldini, L. Coordinate dual gene transgenesis by lentiviral vectors carrying synthetic bidirectional promoters. Nat. Biotechnol. 23, 108-116 (2005). 39. Tumeh, P., Harview, C., Yearley, J. & Al, E. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature 515, 568-571 (2014).39. Tumeh, P., Harview, C., Yearley, J. & Al, E. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature 515, 568-571 (2014). 40. Waggott, D. et al. NanoStringNorm: An extensible R package for the pre-processing of nanostring mPHK and микроРНК data. Bioinformatics 28, 1546-1548 (2012).40. Waggott, D. et al. NanoStringNorm: An extensible R package for the pre-processing of nanostring mRNA and microRNA data. Bioinformatics 28, 1546-1548 (2012). 41. Ritchie, Μ. E. et al. limma powers differential expression analyses for PHK742 sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 43, e47 (2015).41. Ritchie, M. E. et al. limma powers differential expression analyzes for PHK742 sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 43, e47 (2015). 42. R Development Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing Vienna Austria 0, {ISBN} 3-900051-07-0 (2016).42. R Development Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing Vienna Austria 0, {ISBN} 3-900051-07-0 (2016). 43. Pesarin, F. & Salmaso, L. Permutation Tests for Complex Data. Permutation Tests for Complex Data: Theory, Applications and Software (2010). doi: 10.1002/978047068951643. Pesarin, F. & Salmaso, L. Permutation Tests for Complex Data. Permutation Tests for Complex Data: Theory, Applications and Software (2010). doi: 10.1002/9780470689516 44. Brunner, E. & Puri, M. L. Nonparametric methods in factorial designs. Stat. Pap. 42, 1-52 (2001).44. Brunner, E. & Puri, M. L. Nonparametric methods in factorial designs. Stat. Pap. 42, 1-52 (2001). 45. Brunner, E., Dornhof, S. & Langer, F. Nonparametric analysis of longitudinal data in factorial experiments. Wiley Ser. Probab. Stat, xvii, 261 (2002).45. Brunner, E., Dornhof, S. & Langer, F. Nonparametric analysis of longitudinal data in factorial experiments. Wiley Ser. Probab. Stat xvii, 261 (2002). 46. Noguchi, K., Gel, Y. R., Brunner, E. & Konietschke, F. nparLD: An R software package for the nonparametric analysis of longitudinal data in factorial experiments. L Stat. Softw. 50, 1-23 (2012).46. Noguchi, K., Gel, Y. R., Brunner, E. & Konietschke, F. nparLD: An R software package for the nonparametric analysis of longitudinal data in factorial experiments. L Stat. Softw. 50, 1-23 (2012). 47. Feys, J. New Nonparametric Rank Tests for Interactions in Factorial Designs with Repeated Measures New Nonparametric Rank Tests for. 15, (2016).47. Feys, J. New Nonparametric Rank Tests for Interactions in Factorial Designs with Repeated Measures. 15, (2016). 48. Themeau, T. M. A Package for Survival Analysis in S. Survival (2015).48. Themeau, T. M. A Package for Survival Analysis in S. Survival (2015). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Применение гематопоэтической стволовой клетки (HSC), гемопоэтической клеткипредшественницы (НРС), миелоид/моноцит-коммитированной клетки-предшественницы, макрофага или моноцита, содержащих вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, для лечения или профилактики злокачественного новообразования у пациента,1. The use of a hematopoietic stem cell (HSC), hematopoietic progenitor cell (HPC), myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a vector, where the vector contains at least one target sequence mir-130a and/or mir- 126, operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine for the treatment or prevention of cancer in a patient, HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественница, макрофаг или моноцит используются в комбинации с ассоциированный с опухолью антиген (TAA)-специфичной Т-клеткой.HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte are used in combination with a tumor associated antigen (TAA)-specific T cell. 2. Применение по п.1, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клетка-предшественник, макрофаг или моноцит используется в сочетании с ингибитором контрольных точек иммунитета и TAAспецифической Т-клеткой.2. The use of claim 1, wherein the HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte is used in combination with an immune checkpoint inhibitor and a TAA-specific T cell. 3. Применение по п.1 или 2, где TAA-специфическая Т-клетка экспрессирует химерный рецептор антигена (CAR) и/или рецептор трансгенных Т-клеток (TCR).3. Use according to claim 1 or 2, wherein the TAA-specific T cell expresses a chimeric antigen receptor (CAR) and/or a transgenic T cell receptor (TCR). 4. Применение по любому из предшествующих пунктов, где TAA выбран из группы, состоящей из карциноэмбрионального антигена (СЕА), рецептора эстрогена, рецептора прогестерона, ephrinB2, ROR1, мезотелина, c-Met, GD-2 и MAGE A3 TCR, 4-1BB, антигена аденокарциномы, альфа-фетопротеина BAFF, клетки В-лимфомы, антигена С242, карбоангидразы 9 (CA-IX), CCR4, CD152, CD200, CD22, CD19, CD22, CD123, CD221, CD23 (рецептор IgE), CD28, CD4, CD40, CD44, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CS-1, CNT0888, CTLA-4, DR5, EpCAM, CD3, дополнительного домена фибронектина-В, рецептора фолата 1, гликопротеина 75, GPNMB, HGF, киназного рецептора фактора роста гепатоцитов человека, рецептора IGF-1, IGF-I, IgG1, L1-CAM, IL-13, IL-6, рецептора инсулиноподобного фактора роста I, интегрина α5β1, интегрина ave3, MORAb-009, MS4A1, муцина CanAg, Nгликолилнейраминовой кислоты, NPC-1C, PDGF-Ra, PDL192, фосфатидилсерина, клеток карциномы 4. Use as claimed in any of the preceding claims, wherein the TAA is selected from the group consisting of carcinoembryonic antigen (CEA), estrogen receptor, progesterone receptor, ephrinB2, ROR1, mesothelin, c-Met, GD-2 and MAGE A3 TCR, 4-1BB , adenocarcinoma antigen, alpha-fetoprotein BAFF, B-lymphoma cell, C242 antigen, carbonic anhydrase 9 (CA-IX), CCR4, CD152, CD200, CD22, CD19, CD22, CD123, CD221, CD23 (IgE receptor), CD28, CD4 , CD40, CD44, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CS-1, CNT0888, CTLA-4, DR5, EpCAM, CD3, fibronectin-B accessory domain, folate receptor 1, glycoprotein 75, GPNMB, HGF , human hepatocyte growth factor kinase receptor, IGF-1 receptor, IGF-I, IgG1, L1-CAM, IL-13, IL-6, insulin-like growth factor I receptor, α5β1 integrin, ave3 integrin, MORAb-009, MS4A1, mucin CanAg, Nglycolylneuraminic acid, NPC-1C, PDGF-Ra, PDL192, phosphatidylserine, carcinoma cells - 58 046120 предстательной железы, RANKL, RON, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, тенасцина С, TGF бета 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, опухолевого антигена CTAA16.88, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, виментина, 5Т4, CD5, CD19, CD20, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD45, САМРАТН-1 (CDw52), HLA-DR, антиидиотипа, TAG-72, Ep-CAM, MUC1, фолат-связывающего белка, А33, G250, простатического специфического мембранного антигена (PSMA), простатического специфического антигена (PSA), ферритина, ганглиозидов (например, GD2, GD3, GM2), Ley, CA-125, СА19-9, рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), p185HER2, рецептора IL-2, de2-7 EGFR, белка активации фибробластов (FAP), тенасцина, металлопротеиназы, эндосиалина, карбоноангидразы, галектина 9, альдолазы A, eIFY4, тирозиназы, галектина 4, HERKV-K10, р53, NY-LU-12, рестина, NY-CO-38, MAGE-1, MAGE-4a, SSX2, NY-ESO-1, SCP-1, 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, b-катенина/m, Bcr-abl, CAMEL, САР-1, CASP-8, CDC27m, CDK4/m, CT, Cyp-B, DAM-6 (MAGE-B2) и DAM-10 (MAGE-B1), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT (hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/мелана-А, MC1R, миозина/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NY-ESO-1, P15, p190 минорного bcr-abl, Pml/RARa, PRAME, RAGE, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, белка 1, gp75, TRP-2, TRP-2/INT2 и WT1.- 58 046120 prostate gland, RANKL, RON, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, tenascin C, TGF beta 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, tumor antigen CTAA16.88, vascular endothelial growth factor (VEGF), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, vimentin, 5T4, CD5, CD19, CD20, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD45, CAMPATH-1 (CDw52), HLA-DR, anti-idiotype, TAG-72, Ep -CAM, MUC1, folate binding protein, A33, G250, prostate specific membrane antigen (PSMA), prostate specific antigen (PSA), ferritin, gangliosides (e.g. GD2, GD3, GM2), Ley, CA-125, CA19- 9, epidermal growth factor receptor (EGFR), p185HER2, IL-2 receptor, de2-7 EGFR, fibroblast activation protein (FAP), tenascin, metalloproteinase, endosialin, carbonic anhydrase, galectin 9, aldolase A, eIFY4, tyrosinase, galectin 4, HERKV-K10, p53, NY-LU-12, restina, NY-CO-38, MAGE-1, MAGE-4a, SSX2, NY-ESO-1, SCP-1, 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, b-catenin/m, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27m, CDK4/m, CT, Cyp-B, DAM-6 (MAGE-B2) and DAM-10 (MAGE-B1 ), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT (hTRT) , iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melana-A, MC1R, myosin/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NY-ESO-1 , P15, p190 minor bcr-abl, Pml/RARa, PRAME, RAGE, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, protein 1, gp75, TRP- 2, TRP-2/INT2 and WT1. 5. Применение по любому из предыдущих пунктов, где TAA-специфическая Т-клетка получена из клетки, выделенной у пациента.5. Use as claimed in any of the preceding claims, wherein the TAA-specific T cell is derived from a cell isolated from a patient. 6. Применение по любому из предшествующих пунктов, где TAA-специфическая Т-клетка сконструирована так, чтобы разрушать по меньшей мере один эндогенный ген.6. Use as claimed in any one of the preceding claims, wherein the TAA-specific T cell is engineered to disrupt at least one endogenous gene. 7. Применение по любому из пп.2-6, где ингибитор контрольных точек иммунитета:7. Use according to any one of claims 2 to 6, wherein the immune checkpoint inhibitor: (i) представляет собой антитело и/или (ii) ингибирует молекулу ингибитора контрольной точки, выбранную из группы, состоящей из A2AR (рецептор аденозина А2А), В7-Н3 (CD276), В7-Н4 (VTCN1), BTLA (аттенюатор В- и Тлимфоцитов; CD272), HVEM (медиатор проникновения вируса герпеса), CTLA-4 (ассоциированный с Тлимфоцитами цитотоксический белок 4; CD152), IDO (индоламин-2,3-диоксигеназа), TDO (триптофан2,3-диоксигеназа), KIR (иммуноглобулин-подобный рецептор клеток-киллеров), LAG3 (ген-3 активации лимфоцитов), PD-1 (рецептор запрограммированной смерти 1), PD-L1 (лиганд 1 PD-1), PD-L2 (лиганд 2 PD-1), TIM-3 (домен иммуноглобулина Т-клеток и муциновый домен 3), VISTA (V-доменный Ig супрессор активации Т-клеток), В7-1 (CD80) и В7-2 (CD86).(i) is an antibody and/or (ii) inhibits a checkpoint inhibitor molecule selected from the group consisting of A2AR (adenosine A2A receptor), B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), BTLA (B-attenuator and T lymphocytes; CD272), HVEM (herpes virus entry mediator), CTLA-4 (T lymphocyte associated cytotoxic protein 4; CD152), IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase), TDO (tryptophan 2,3-dioxygenase), KIR ( immunoglobulin-like killer cell receptor), LAG3 (lymphocyte activation gene-3), PD-1 (programmed death receptor 1), PD-L1 (PD-1 ligand 1), PD-L2 (PD-1 ligand 2), TIM-3 (T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3), VISTA (V-domain Ig suppressor of T-cell activation), B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86). 8. Применение по любому из предыдущих пунктов, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-126.8. Use according to any of the preceding claims, wherein the vector contains at least one mir-130a target sequence and at least one mir-126 target sequence. 9. Применение по любому из предыдущих пунктов, где вектор дополнительно содержит тканеспецифичный промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин.9. Use according to any of the previous paragraphs, where the vector additionally contains a tissue-specific promoter operably linked to the nucleotide sequence encoding the cytokine. 10. Применение по любому из предыдущих пунктов, где рак представляет собой гематологическое злокачественное новообразование или солидную опухоль.10. Use as claimed in any of the preceding claims, wherein the cancer is a hematologic malignancy or a solid tumor. 11. Применение TAA-специфичной Т-клетки для лечения или профилактики злокачественного новообразования у пациента, где пациенту также вводят гематопоэтическую стволовую клетку (HSC), гематопоэтическую клетку-предшественницу (НРС), миелоид/моноцит-коммитированную клетку-предшественницу, макрофаг или моноцит, содержащий вектор, вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин.11. Use of a TAA-specific T cell for the treatment or prevention of a malignancy in a patient, wherein the patient is also administered a hematopoietic stem cell (HSC), hematopoietic progenitor cell (HPC), myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte, containing the vector, the vector contains at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine. 12. Применение по п.11, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-126.12. Use according to claim 11, wherein the vector contains at least one mir-130a target sequence and at least one mir-126 target sequence. 13. Применение по п.11 или 12, где вектор дополнительно содержит тканеспецифический промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин.13. Use according to claim 11 or 12, where the vector additionally contains a tissue-specific promoter operably linked to the nucleotide sequence encoding the cytokine. 14. Применение по любому из пп.11-13, где злокачественное новообразование представляет собой гематологическое злокачественное новообразование или солидную опухоль.14. Use according to any one of claims 11 to 13, wherein the malignancy is a hematological malignancy or a solid tumor. 15. Применение по любому из предшествующих пунктов, где цитокин представляет собой интерферон (IFN), IL-12 или гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF).15. Use as claimed in any one of the preceding claims, wherein the cytokine is interferon (IFN), IL-12, or granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). 16. Применение по любому из предшествующих пунктов, где цитокин представляет собой IFNa или IFNy.16. Use according to any of the preceding claims, wherein the cytokine is IFNa or IFNy. 17. Применение по любому из пп.6-10, 15 или 16, где по меньшей мере один эндогенный ген выбран из эндогенного гена, кодирующего a-цепь TCR, β-цепь TCR и главный комплекс гистосовместимости (МНС).17. Use according to any one of claims 6 to 10, 15 or 16, wherein at least one endogenous gene is selected from an endogenous gene encoding a TCR a-chain, a TCR beta chain and a major histocompatibility complex (MHC). 18. Применение по любому из пп.9, 10 или 13-17, где тканеспецифический промотор представляет собой промотор ТЕК (Tie2).18. Use according to any one of claims 9, 10 or 13-17, wherein the tissue-specific promoter is a TEK promoter (Tie2). 19. Применение по любому из предыдущих пунктов, где злокачественное новообразование представляет собой рак печени или глиобластому.19. Use according to any of the previous claims, wherein the malignancy is liver cancer or glioblastoma. - 59 046120- 59 046120 20. Применение по любому из предыдущих пунктов, где цитокин представляет собой интерферон (IFN), где TAA-специфическая Т-клетка экспрессирует CAR и TAA представляет собой В7-Н3.20. Use as claimed in any of the preceding claims, wherein the cytokine is interferon (IFN), wherein the TAA-specific T cell expresses a CAR, and the TAA is B7-H3. 21. Способ лечения или профилактики злокачественного новообразования, который включает стадию введения пациенту гемопоэтической стволовой клетки (HSC), гемопоэтической клеткипредшественника (НРС), клетки-предшественника, миелоид/моноцит-коммитированной клеткипредшественника, макрофага или моноцита, содержащих вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин, где HSC, НРС, миелоид/моноцит-коммитированная клеткапредшественник, макрофаг или моноцит вводят пациенту в комбинации с ассоциированной с опухолью антиген (TAA) специфической Т-клеткой.21. A method of treating or preventing a malignancy, which includes the step of administering to a patient a hematopoietic stem cell (HSC), hematopoietic progenitor cell (HPC), progenitor cell, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a vector, where the vector contains at least at least one mir-130a and/or mir-126 target sequence operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine where an HSC, HPC, myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte is administered to a patient in combination with a tumor associated antigen (TAA ) specific T cell. 22. Способ по п.21, где цитокин представляет собой интерферон (IFN), IL-12 или гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF).22. The method of claim 21, wherein the cytokine is interferon (IFN), IL-12 or granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). 23. Способ по п.21 или 22, где цитокин представляет собой IFNa или IFNy.23. The method according to claim 21 or 22, where the cytokine is IFNa or IFNy. 24. Способ по любому из пп.21-23, где вектор дополнительно содержит тканеспецифический промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин.24. The method according to any one of claims 21-23, where the vector additionally contains a tissue-specific promoter operably linked to the nucleotide sequence encoding the cytokine. 25. Способ по п.24, где тканеспецифический промотор представляет собой промотор ТЕК (Tie2).25. The method of claim 24, wherein the tissue-specific promoter is a TEK promoter (Tie2). 26. Способ по любому из пп.21-25, где злокачественное новообразование представляет собой гематологическое злокачественное новообразование или солидную опухоль.26. The method according to any one of claims 21 to 25, wherein the malignancy is a hematological malignancy or a solid tumor. 27. Способ по любому из пп.21-26, где злокачественное новообразование представляет собой рак печени или глиобластому.27. The method according to any one of claims 21-26, where the malignant neoplasm is liver cancer or glioblastoma. 28. Способ по любому из пп.21-27, где цитокин представляет собой интерферон (IFN), где TAAспецифическая Т-клетка экспрессирует CAR и TAA это В7-Н3.28. The method according to any one of claims 21 to 27, wherein the cytokine is interferon (IFN), wherein the TAA-specific T cell expresses a CAR and the TAA is B7-H3. 29. Продукт, содержащий:29. Product containing: (a) гемопоэтическую стволовую клетку (HSC), гемопоэтическую клетку-предшественник (НРС), миелоидную/моноцитарно-коммитированную клетку-предшественник, макрофаг или моноцит, содержащий вектор, где вектор содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень mir-130a и/или mir-126, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин; и (b) TAA-специфичную Т-клетку.(a) a hematopoietic stem cell (HSC), hematopoietic progenitor cell (HPC), myeloid/monocyte-committed progenitor cell, macrophage or monocyte containing a vector, where the vector contains at least one mir-130a target sequence and/or mir-126, operably linked to a nucleotide sequence encoding a cytokine; and (b) a TAA-specific T cell. 30. Продукт по п.29, где цитокин представляет собой интерферон (IFN), IL-12 или гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF).30. The product of claim 29, wherein the cytokine is interferon (IFN), IL-12 or granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). 31. Продукт по п.29 или 30, где цитокин представляет собой IFNa или IFNy.31. The product according to claim 29 or 30, where the cytokine is IFNa or IFNy. 32. Продукт по любому из пп.29-31, где вектор дополнительно содержит тканеспецифический промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин.32. The product according to any one of claims 29-31, where the vector additionally contains a tissue-specific promoter operably linked to the nucleotide sequence encoding the cytokine. 33. Продукт по п.32, где тканеспецифический промотор представляет собой промотор ТЕК (Tie2).33. The product of claim 32, wherein the tissue-specific promoter is a TEK promoter (Tie2). 34. Продукт по любому из пп.29-33, где цитокин представляет собой интерферон (IFN), где TAAспецифическая Т-клетка экспрессирует CAR и TAA представляет собой В7-Н3.34. The product according to any one of claims 29 to 33, wherein the cytokine is interferon (IFN), wherein the TAA-specific T cell expresses a CAR and the TAA is B7-H3. --
EA201992514 2017-04-21 2018-04-20 GENE THERAPY EA046120B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1706410.6 2017-04-21
GB1801511.5 2018-01-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA046120B1 true EA046120B1 (en) 2024-02-07

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3612624B1 (en) Gene therapy
CN107849112B (en) Chimeric Antigen Receptors (CAR), compositions and methods of use thereof
AU2014225788B2 (en) Engager cells for immunotherapy
US20240325450A1 (en) Nkt-cell subset for in vivo persistence and therapeutic activity and propagation of same
JP2020108398A (en) CAR expression vector and CAR expression T cell
JP2022531911A (en) Manipulated immune cells targeting BCMA and their use
CN117802051A (en) Modified cells and compositions
US20170051037A1 (en) Cs1 specific multi-chain chimeric antigen receptor
WO2017159736A1 (en) Immunocompetent cell and expression vector expressing regulatory factors of immune function
CN115885038A (en) Immunocompetent cells expressing chimeric antigen receptors
CA3179800A1 (en) Methods and uses related to cell therapy engineered with a chimeric antigen receptor targeting b-cell maturation antigen
AU2023276467A1 (en) Binding proteins and engineered cells specific for neoantigens and uses thereof
US20220325241A1 (en) Immune effector cell for co-expressing chemokine receptor
Lo Presti et al. Use of cord blood derived T-cells in cancer immunotherapy: milestones achieved and future perspectives
WO2023235440A2 (en) Compositions and methods comprising chimeric adaptor polypeptides
JP2024541976A (en) Chimeric adaptor polypeptides
US20230226181A1 (en) GENETIC ENGINEERING OF gamma delta T CELLS FOR IMMUNOTHERAPY
CN118055944A (en) Modulating Bcl-2 enhances efficacy of chimeric antigen receptor cancer immunotherapy
WO2021202581A1 (en) Engineered immune cells for adoptive cell therapy
EA046120B1 (en) GENE THERAPY
Wang et al. Immunotherapy of cancer
US20240091260A1 (en) Chimeric antigen receptors that bind preferentially expressed antigen in melanoma (prame)/hla-a2 to treat cancer
US20230340068A1 (en) Chimeric antigen receptor (car) with cd28 transmembrane domain
WO2024238938A1 (en) Modulation of the btla-hvem axis to enhance adoptive cell transfer immunotherapy
JP2024502170A (en) Improved adoptive cell transfer therapy for cancer