EA042479B1 - Моноклональное антитело против pd1, его фармацевтическая композиция и их применение - Google Patents
Моноклональное антитело против pd1, его фармацевтическая композиция и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- EA042479B1 EA042479B1 EA201990570 EA042479B1 EA 042479 B1 EA042479 B1 EA 042479B1 EA 201990570 EA201990570 EA 201990570 EA 042479 B1 EA042479 B1 EA 042479B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- antigen
- monoclonal antibody
- antibody
- seq
- binding fragment
- Prior art date
Links
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 102
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims description 95
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 88
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 88
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 88
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 87
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 73
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 51
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 27
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 25
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 24
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 21
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 20
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 12
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims description 11
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 8
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical group C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 7
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 7
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 6
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 6
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims description 6
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 claims description 5
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 claims description 2
- 239000009874 shenqi Substances 0.000 claims description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 claims 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 claims 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 claims 1
- 102000048362 human PDCD1 Human genes 0.000 claims 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 1
- 241000894007 species Species 0.000 claims 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 claims 1
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 23
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 12
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 101001117312 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 2 Proteins 0.000 description 5
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 5
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 2
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010565 Apoptosis Regulatory Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010063104 Apoptosis Regulatory Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108020004513 Bacterial RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101150100936 CD28 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000014447 Complement C1q Human genes 0.000 description 1
- 108010078043 Complement C1q Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 description 1
- 101710138871 Ig gamma-1 chain C region Proteins 0.000 description 1
- 102100039345 Immunoglobulin heavy constant gamma 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 101100519207 Mus musculus Pdcd1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 description 1
- 208000010362 Protozoan Infections Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 1
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004182 chemical digestion Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000014107 chromosome localization Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007896 negative regulation of T cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015347 renal cell adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение принадлежит к области терапии опухолей и молекулярной иммунологии и относится к антителу против PD1, фармацевтической композиции и способам применения. В частности, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу против PD1.
Уровень техники
Трансмембранный рецептор PD1 (белок 1 запрограммированной клеточной смерти, также известный как PD-1) является членом семейства генов CD28, экспрессируемых в активированных Т-клетках, В-клетках и миелоидных клетках. Оба лиганда PD1 (т.е. PDL1 и PDL2) принадлежат к суперсемейству В7; причем PDL1 широко экспрессируется во множестве клеток, включая Т-клетки, В-клетки, эндотелиальные клетки и эпителиальные клетки, тогда как PDL2 экспрессируется только в антигенпрезентирующих клетках, таких как дендритные клетки и макрофаги.
Т-клетки играют очень важную роль в устранении вирусных инфекций, а противовирусный ответ Т-клеток обычно связан с иммунопатогенезом. PD1 играет жизненно важную роль в негативной регуляции активации Т-клеток. Хотя PD1-опосредованная негативная регуляция на Т-клетках может уменьшать повреждение тканей, вызванное инфекцией, блокирование или ингибирование негативного регуляторного эффекта PD1 может приводить к аутоиммунным заболеваниям, например вирусная инфекция поджелудочной железы может быть более эффективно устранена у мышей, с нокаутированным геном PD1, но может приводить к более серьезному повреждению печени (Isai et al., 2003, J. Exp. Med., 198:39-50). Кроме того, опухоли с высокой экспрессией PD1 часто развиваются при раковых заболеваниях, которые трудно обнаруживать (Hamanishi et al., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 104:3360-5). Общепринятый способ регулирования экспрессии PD1 заключается во введении антител в организм.
В связи с широкими противоопухолевыми перспективами и поразительной эффективностью антител к PD1, обычно считается, что антитела против метаболических путей PD1 приведут к прорывам в лечении различных опухолей: немелкоклеточного рака легкого, почечно-клеточного рака, рака яичника, меланомы (Homet M.B., Parisi G. et al., Anti-PDl Therapy in Melanoma. Semin Oncol., 2015 Jun, 42(3):466-473), лейкоза и анемии (Held S.A., Heine A. et al., Advances in immunotherapy of chronic myeloid leukemia CML, Curr. Cancer Drug Targets, 2013 Sep, 13(7):768-74).
С момента раскрытия беспрецедентных данных о клинической эффективности на ежегодных совещаниях Американской ассоциации исследований рака (AACR) и Американского общества клинической онкологии (ASCO) в 2012 и 2013 гг. антитела против PD1 стали самыми востребованными новыми лекарственными средствами в исследованиях и разработках в глобальной фармацевтической индустрии.
В настоящее время все еще существует потребность в разработке новых антител против PD1 с лучшей эффективностью связывания, чтобы эффективно блокировать связывание PD1 с PDL1.
Сущность изобретения
Благодаря углубленным исследованиям и творческой работе путем иммунизации мышей рекомбинантным PD1, экспрессируемым в системе экспрессии клеток млекопитающих в качестве антигена, авторы изобретения получили клетки гибридомы путем слияния спленоцитов мыши и клеток миеломы. Путем скрининга большого количества образцов авторы изобретения получили линию клеток гибридомы LT003 (депозитарный номер доступа ССТСС: С2015105).
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что линия клеток гибридомы LT003 способна секретировать специфическое моноклональное антитело (названное 14С12), связывающееся специфически с PD1, и это моноклональное антитело может эффективно блокировать соединение PD1 с PDL1.
Кроме того, изобретатели новым способом создали гуманизированное антитело против PD1 (названное 14C12H1L1).
Еще более неожиданно, что авторы изобретения обнаружили, что антитела 14С12 и 14C12H1L1 в данном документе могут эффективно связываться с Т-клетками человека, активировать Т-клетки и индуцировать секрецию ИФН-γ и ИЛ-2 из лимфоцитов человека. Антитела 14С12 и 14C12H1L1 в данном документе потенциально могут стать лекарственными средствами для профилактики и лечения злокачественных новообразований, включая рак легкого, меланому, рак почки, рак яичника и лейкоз, а также анемию.
Следующее предусмотрено настоящим изобретением.
Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, в котором вариабельная область тяжелой цепи (VH) указанного моноклонального антитела содержит CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 9-11; и/или вариабельная область легкой цепи (VL) указанного моноклонального антитела содержит CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 12-14.
В некоторых примерах данного изобретения раскрыто указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающие фрагменты, причем аминокислотную последовательность VH моноклонального антитела выбирают из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 6; и/или аминокислотную последовательность VL моноклонального антитела выбирают из SEQ ID NO: 4 и
- 1 042479
SEQ ID NO: 8.
В примере данного изобретения раскрыто указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающие фрагменты, причем моноклональное антитело содержит (1) VH представленную SEQ ID NO: 2 и VL представленную SEQ ID NO: 4;
(2) VH представленную SEQ ID NO: 6 и VL представленную SEQ ID NO: 8.
Вариабельные области в тяжелой и легкой цепях антитела регулируют активность связывания. Каждая цепь содержит три гипервариабельные области, а именно определяющая комплементарность область (CDR) (HCDR1, HCDR2 и HCDR3 в тяжелой (н) цепи и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 в легкой (L) цепи), которые определяют по Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition (1991), volume 1-3, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD).
Посредством методик, хорошо известных техническому специалисту в описанной в данном документе области техники, например анализа аминокислотных последовательностей в CDR моноклональных антител в пунктах (1) и (2) выше через базу данных VBASE2, антитела 14С12 и 14C12H1L1 в данном документе содержат одинаковые CDR, причем аминокислотные последовательности 3 областей CDR VH являются следующими:
HCDRl: GFAFSSYD (SEQ ID NO:9),
HCDR2: ISGGGRYT (SEQ ID NO:10),
HCDR3: ANRYGEAWFAY (SEQ ID NO:11);
при этом аминокислотные последовательности 3 областей CDR VL являются следующими:
LCDRl: QDINTY (SEQ ID NO:12),
LCDR2: RAN (SEQ ID NO :13),
LCDR3: LQYDEFPLT (SEQ ID NO:14).
В определенном примере раскрыто указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, причем указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбирают из Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, CDR, одноцепочечных антител (например, scFv), гуманизированных антител, химерных антител или биспецифических антител.
В определенных вариантах осуществления раскрыто указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, причем указанное моноклональное антитело связывается с белком PD1 с KD, равной менее чем приблизительно 10-5 М, например менее чем приблизительно 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 М или менее; предпочтительно измеренной с помощью оборудования для молекулярного взаимодействия Fortebio.
В определенных вариантах осуществления раскрыто указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, причем указанное моноклональное антитело связывается с белком PD1 с ЕС50, равной менее чем приблизительно 100 нМ, например менее чем приблизительно 10, 1, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 нМ, или менее. В частности, указанную ЕС50 определяют посредством опосредованной ИФА.
В определенных вариантах осуществления раскрыто указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, причем указанное моноклональное антитело связывается с белком PD1 с KD, равной менее чем приблизительно 10-5 М, такой как менее чем приблизительно 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 М или менее.
В некоторых вариантах осуществления раскрыто указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, причем указанное моноклональное антитело содержит области, отличные от CDR, полученные от видов, отличных от мыши, например от человека.
В определенных вариантах осуществления раскрыто указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающие фрагменты, причем указанное моноклональное антитело продуцируется линией клеток гибридомы LT003, а указанная линия клеток гибридомы LT003 задепонирована в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) с депозитарным номером доступа ССТСС: С2015105.
Настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, способную кодировать VH антитела, причем VH указанного антитела содержит CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 9-11.
В частности, тяжелая цепь указанного антитела имеет аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 6.
Более конкретно, указанная молекула нуклеиновой кислоты имеет нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 5.
Настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, способную кодировать VL антитела, причем VL указанного антитела содержит CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 12-14.
В частности, VL указанного антитела имеет аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 8.
Более конкретно, указанная молекула нуклеиновой кислоты имеет нуклеотидные последовательно
- 2 042479 сти SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 7.
Настоящее изобретение относится к вектору, содержащему выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в данном изобретении.
Настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в данном изобретении, или вектор, описанный в данном изобретении.
Настоящее изобретение относится к способу получения моноклонального антитела или его антигенсвязывающих фрагментов, описанному в данном изобретении, путем культивирования клеткихозяина в данном изобретении в соответствующих условиях и выделения указанного моноклонального антитела или его антигенсвязывающих фрагментов из культуры клеток.
Настоящее изобретение относится к линии клеток гибридомы LT003, которая задепонирована в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) с депозитарным номером доступа ССТСС: С2015105.
Настоящее изобретение относится к конъюгату, который состоит из моноклонального антитела или его антигенсвязывающих фрагментов и конъюгируемой части, причем указанное моноклональное антитело представляет собой моноклональное антитело или его антигенсвязывающие фрагменты, описанное в данном изобретении, а указанная конъюгируемая часть представляет собой детектируемый маркер. В частности, указанная конъюгируемая часть представляет собой радиоактивные изотопы, флуоресцеин, люминесцентные вещества, красители или ферменты.
Настоящее изобретение относится к наборам реагентов, состоящим из моноклонального антитела или его антигенсвязывающих фрагментов или их конъюгатов, описанных в изобретении.
В частности, наборы реагентов могут содержать вторичное антитело, которое специфически распознает указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающие фрагменты; необязательно указанное вторичное антитело может содержать детектируемые маркеры, такие как радиоактивные изотопы, флуоресцеин, люминесцентные вещества, красители или ферменты.
Настоящее изобретение относится к применению указанного моноклонального антитела, или его антигенсвязывающих фрагментов, или его конъюгатов, описанных в изобретении, для создания наборов реагентов, причем указанные наборы реагентов используются для обнаружения наличия или уровня PD1 в образцах.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей указанное моноклональное антитело, или его антигенсвязывающие фрагменты, или их конъюгаты, описанные в изобретении. Необязательно она также может содержать фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
Настоящее изобретение относится к применению указанного моноклонального антитела, или его антигенсвязывающих фрагментов, или их конъюгатов, описанных в изобретении, при изготовлении лекарственных средств для профилактики и/или лечения, и/или адъювантного лечения, и/или диагностики опухолей или анемии; в частности, указанные опухоли могут представлять собой меланому, рак почки, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, колоректальный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак печени, немелкоклеточный рак легкого, рак яичника и лейкоз.
Авторы данного изобретения обнаружили в экспериментах на животных, что 14C12H1L1 может эффективно ингибировать рост опухолевых клеток МС38, инокулированных, подкожно в правый бок мышам PD-1 HuGEMM, у которых лекарственное средство на основе антитела 14C12H1L1 может значительно ингибировать рост опухоли у мышей-носителей опухоли PD-1 HuGEMM, имея эффективность, эквивалентную продаваемому лекарственному средству на основе моноклонального антитела ниволумаб, которое является утвержденным лекарственным средством, нацеленным на ту же самую мишень.
Настоящее изобретение относится к применению моноклонального антитела, или его антигенсвязывающих фрагментов, или их конъюгатов, описанных в данном изобретении, для изготовления лекарственных средств для следующих целей:
блокирование связывания PD1 с лигандом PD1, регуляция (например, понижение) активности или уровня PD1, ослабление иммуносупрессии PD1, или повышение экспрессии ИФН-γ и/или ИЛ-2 в Т-лимфоцитах;
конкретно, указанный лиганд PD1 представляет собой PDL1 или PDL2, предпочтительно PDL1.
Настоящее изобретение относится к способу in vivo или in vitro применения к клеткам или субъектам, нуждающимся в этом, эффективной дозы моноклонального антитела, или его антигенсвязывающих фрагментов, или их конъюгатов, описанных в данном изобретении, а указанный способ выбирают из следующего:
способы блокирования связывания PD1 с лигандом PD1, способы регулирования (например, понижения) активности или уровня PD1, способы ослабления иммуносупрессии PD1, или способы повышения экспрессии ИФН-γ и/или ИЛ-2 в Т-лимфоцитах;
конкретно, указанный лиганд PD1 представляет собой PDL1 или PDL2, предпочтительно PDL1.
- 3 042479
В конкретном примере данного изобретения указанный способ in vitro предназначен для нетерапевтических или недиагностических целей.
Интерферон у (ИФНу) в основном вырабатывается естественными клетками-киллерами (NK) и естественными киллерными Т-клетками (NKT) или продуцируется эффекторными Т-клетками, состоящими из CD4 Th1-клеток и CD8 цитотоксических Т-лимфоцитов, после стимуляции специфическими антигенами. Являясь важным цитокином врожденного и приобретенного иммунитета, ИФНу играет важную роль в противодействии или ингибировании вирусных, некоторых бактериальных инфекций и инфекций, вызванных простейшими. Между тем ИФНу может активировать макрофаги и индуцировать экспрессию главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) 2-го типа, чтобы активировать иммунные ответы для контроля прогрессирования опухолей (Schoenborn J.R., Wilson С.В., Regulation of Interferon-γ During Innate and Adaptive Immune Responses, Advances in Immunology, 2007, 96:41-101). В исследовании данного изобретения in vitro антитело против PD1 может индуцировать секрецию ИФНу для активации иммунных ответов.
Интерлейкин 2 (ИЛ-2), продуцируемый Т-клетками, является фактором роста, регулирующим субпопуляции Т-клеток, и решающим фактором, регулирующим иммунные ответы, способствующим пролиферации активированных В-клеток и участвующим в реакциях антител, кроветворении и онкологическом надзоре. Рекомбинантный ИЛ-2 человека был одобрен FDA (Управление по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств) США для лечения злокачественных опухолей (включая меланому, опухоль почки и т.д.) во время прохождения клинических исследований для лечения хронических вирусных инфекций (Chavez, A.R. et al., Pharmacologic administration of interleukin-2, Ann. N. Y. Acad. Sci., 2009, 1182, p.14-27). В исследованиях in vitro антитело против PD1 по данному изобретению может специфически ослаблять иммуносупрессию PD1, активировать Т-клетки и индуцировать выработку ИЛ-2, демонстрируя многообещающие перспективы широкого применения в генной терапии опухолевых и паразитарных заболеваний.
Моноклональное антитело, или его антигенсвязывающие фрагменты, или их конъюгаты, описанные в данном изобретении, применяются для профилактики и/или лечения, и/или адъювантного лечения, и/или диагностики опухолей или анемии; в частности, указанные опухоли могут представлять собой меланому, рак почки, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, колоректальный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак печени, немелкоклеточный рак легкого, рак яичника или лейкоз.
Моноклональное антитело, или его антигенсвязывающие фрагменты, или его конъюгаты, описанные в данном изобретении, применяются для блокирования связывания PD1 с лигандом PD1, регуляции (например, понижение) активности или уровня PD1, ослабления иммуносупрессии PD1, или повышения экспрессии ИФН-γ и/или ИЛ-2 в Т-лимфоцитах;
конкретно, указанный лиганд PD1 представляет собой PDL1 или PDL2, предпочтительно PDL1.
В конкретном примере данного изобретения моноклональное антитело, или его антигенсвязывающие фрагменты, или их конъюгаты, описанные в данном изобретении, блокируют только связывание PD1 с PDL1.
Настоящее изобретение относится к способу профилактики, и/или лечения, и/или адъювантного лечения, и/или диагностики опухолей или анемии, включающему процедуру применения к субъектам эффективной дозы моноклонального антитела, или его антигенсвязывающих фрагментов, или их конъюгатов, описанных в данном изобретении; в частности, указанные опухоли могут представлять собой меланому, рак почки, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, колоректальный рак, рак желудочнокишечного тракта, рак печени, немелкоклеточный рак легкого, рак яичника или лейкоз.
Если в данном документе не указано иное, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, должны иметь значения, которые обычно понимаются специалистами в данной области техники. Кроме того, лабораторные методы культивирования клеток и тканей, молекулярной генетики, химии олиго- или полинуклеотидов и иммунологии, описанные в данном документе, хорошо известны и широко используются в данной области техники. Между тем, чтобы лучше понять настоящее изобретение, следует понимать, что следующие термины, если не указано иное, имеют следующие значения.
Используемый в данном изобретении термин аминокислотная последовательность белка PD1 (белок 1 запрограммированной клеточной смерти, NCBI GenBank: NP_005009.2) охватывает полноразмерный белок PD1 или PD1ECD (внеклеточный сегмент PD1) или PD1ECD-содержащие фрагменты; и также включает слитый белок PD1ECD, например слитый с фрагментами белка Fc IgG мыши или человека (mFc или hFc). Кроме того, специалистам в данной области техники понятно, что аминокислотная последовательность белка PD1 может иметь естественные или искусственные мутации (включая без ограничения замены, делеции и/или вставки), не влияющие на его биологические функции. Следовательно, в данном изобретении термин белок PD1 должен включать все такие последовательности и их природные или искусственные варианты. Кроме того, при описании фрагментов последовательности белка PD1 ука
- 4 042479 занные фрагменты последовательности включают как фрагменты последовательности, так и соответствующие фрагменты последовательности в ее естественных или искусственных вариантах.
Используемый в данном изобретении термин аминокислотная последовательность белка PDL1 (лиганд 1 запрограммированной клеточной смерти, NCBI Genebank ID: NP_054862.1) охватывает полноразмерный белок PDL1 или PDL1ECD (внеклеточный сегмент PDL1) или PDL1ECD-содержащие фрагменты; и также включает слитый белок PDL1ECD, например слитый с фрагментами белка Fc IgG мыши или человека (mFc или hFc). Кроме того, специалистам в данной области техники понятно, что аминокислотная последовательность белка PDL1 может иметь естественные или искусственные мутации (включая без ограничения замены, делеции и/или вставки), не влияющие на его биологические функции. Следовательно, в данном изобретении термин белок PDL1 должен включать все такие последовательности и их природные или искусственные варианты. Кроме того, при описании фрагментов последовательности белка PDL1 указанные фрагменты последовательности включают как фрагменты последовательности, так и соответствующие фрагменты последовательности в ее естественных или искусственных вариантах.
Используемый в данном изобретении термин ЕС50 относится к концентрации для обеспечения 50% максимального эффекта.
Используемый в данном изобретении термин антитело относится к белкам иммуноглобулинов, которые обычно состоят из двух пар полипептидных цепей (каждая пара имеет легкую (L) цепь и тяжелую (Н) цепь). Легкие цепи классифицируются как легкие цепи к и λ. Тяжелые цепи классифицируются как μ, δ, γ, α и ε и, соответственно, определяют изотип антитела как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE. В легких цепях и тяжелых цепях вариабельные области и константные области связаны J-областью, состоящей из около 12 или более аминокислот. Тяжелая цепь также содержит область D-область с около 3 или более аминокислотами. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область (VH) и константную область (СН), которая состоит из 3 доменов (СН1, СН2 и СН3). Каждая легкая цепь содержит вариабельную область (VL) и константную область (CL), которая состоит из одного домена CL. Константная область может опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и компонент 1q (C1q) комплемента классической системы комплемента. VH и VL также могут быть подразделены на области с высокой изменчивостью (называемые областью, определяющей комплементарность (CDR)), которые разделены относительно консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). От аминоконца до карбоксильного конца каждая VH и VL состоит из 3 CDR и 4 FR в порядке FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Вариабельные области (VH и VL) тяжелой цепи и легкой цепи образуют сайт связывания антитела. Распределение аминокислот по областям или доменам соответствует определениям Kabat в Sequences of Proteins of Immunological Interest (Национальный институт здоровья Бетесда, штат Мэриленд (1987 и 1991)) или Chothia & Lesk (1987), Mol. Biol., 196:901-917; или Chothia et al. (1989), Nature, 342:878-883. Термин антитело не ограничен каким-либо конкретным способом их получения. Например, он включает, в частности, рекомбинантные антитела, моноклональные антитела и поликлональные антитела. Антитела могут быть разных изотипов, например антителами IgG (такие как подтипы IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM.
Используемый в данном изобретении термин антигенсвязывающие фрагменты относится к полипептиду, содержащему фрагменты полноразмерного антитела, сохраняющему способность специфически связываться с тем же антигеном и/или конкурировать с полноразмерным антителом за связывание с антигеном, который также называют антигенсвязывающей частью. См. Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed. 2, Raven Press, N. Y. (1989)), включая всю статью и ссылки в данном изобретении для всех целей. Антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены методами рекомбинантной ДНК или расщеплением интактных антител протеолитическими ферментами или химическими веществами. В некоторых случаях антигенсвязывающие фрагменты включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb и CDR, одноцепочечные антитела (например, scFv), химерные антитела, диатела и полипептиды, которые по меньшей мере содержат часть антитела, достаточную для придания специфической антигенсвязывающей способности полипептидам.
В некоторых случаях антигенсвязывающий фрагмент представляет собой диатело, а именно фрагмент димерного антитела, чьи домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, однако из-за использования слишком короткого линкера, чтобы позволить спаривание между двумя доменами той же цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами в другой цепи с образованием двух антигенсвязывающих сайтов (см., например, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:6444-6448 (1993); и Poljak R.J. et al., Structure 2: 1121-1123 (1994)).
Используя обычные методики, известные специалистам в данной области техники (такие как технология рекомбинантных ДНК или ферментативное/химическое расщепление), антигенсвязывающий фрагмент (такой как описанные выше фрагменты антител) может быть получен из данного антитела (например, моноклональные антитела 14С12, 14C12H1L1, предоставленные в данном изобретении) и проведен его скрининг на специфичность таким же образом, как и для полноразмерного антитела.
- 5 042479
В данном изобретении, если не указано иное, термин антитело относится не только к интактному антителу, но также к антигенсвязывающим фрагментам антитела.
Используемые в данном изобретении термины mAb и моноклональные антитела относятся к антителу или фрагменту антитела, полученному из группы высокогомологичных антител, т.е. из группы идентичных молекул антител за исключением мутаций, которые могут возникать самопроизвольно. Моноклональное антитело обладает высокой специфичностью в отношении одного эпитопа на антигене. Поликлональные антитела отличаются от моноклональных антител, содержащих по меньшей мере 2 или более разных антител, которые обычно распознают разные эпитопы на антигене. Моноклональные антитела могут быть получены с помощью гибридомной технологии, о которой первоначально сообщалось Kohler et al. (Nature, 256:495 (1975)), а также технологии рекомбинантных ДНК (см. патент США 4816567).
Используемый в данном изобретении термин гуманизированное антитело относится к антителу или его фрагментам, полученным из иммуноглобулина человека (рецепторное антитело), чьи CDR или часть CDR заменены областями CDR антитела, полученного не от человека (донорное антитело), причем донорское антитело может представлять собой антитело, не относящееся к антителу человека (например, мыши, крысы или кролика) с предсказуемой специфичностью, аффинностью связывания или реакционной способностью. Кроме того, некоторые аминокислотные остатки каркасной области (FR) рецепторного антитела также могут быть заменены соответствующими аминокислотными остатками, не относящимися к человеку, или заменены аминокислотными остатками других антител для дальнейшего улучшения или оптимизации эффективности антитела. Для более подробной информации о гуманизированных антителах, см., например, Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992); и Clark, Immunol. Today, 21:397-402 (2000).
Используемый в данном изобретении термин изолят или выделенный означает полученный искусственным путем в естественном состоянии. Если в природе существует определенный вид выделенного вещества или компонента, он может получаться из-за изменения его естественной среды или изолироваться из естественной среды или и тем, и другим. Например, полинуклеотид или полипептид в естественном существовании у живого животного будет называться выделенным, если он был выделен с высокой степенью чистоты в том же естественном состоянии. Термин выделять или выделенный не исключает наличия искусственного или синтетического вещества или других примесей, которые не влияют на активность.
Используемый в данном изобретении термин вектор относится к носителю для доставки нуклеиновой кислоты, который может быть введен с полинуклеотидом. Вектор, который может содержать белок, который кодируется экспрессируемым введенным полинуклеотидом, называется вектором экспрессии. Векторы могут быть введены в клетку-хозяина путем трансформации, трансдукции или трансфекции, поэтому генетические вещества, переносимые вектором, могут быть экспрессированы в клеткехозяине. Векторы хорошо известны техническому персоналу в данной области техники, включая без ограничения плазмиду; фазмиду; космиду; искусственную хромосому, такую как дрожжевая искусственная хромосома (YAC), бактериальная искусственная хромосома (ВАС) или искусственная хромосома, полученная из Р1 (РАС); фаг, такой как фаг λ или фаг М13, а также вирусы животных и т.д. Вирусы животных могут включать в себя без ограничения вирус с обратной транскриптазой (включая лентивирус), аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирус герпеса (например, вирус простого герпеса), вирус ветряной оспы, бакуловирус, папилломавирус и паповавирус (такой как SV40). Вектор может содержать множество компонентов, которые контролируют экспрессию, включая без ограничения промотор, фактор инициации транскрипции, энхансер, селективный элемент и репортерный ген. Кроме того, вектор также может содержать сайт инициации репликации.
Используемый в данном изобретении термин клетка-хозяин относится к клеткам, которые могут импортировать векторы, включая без ограничения прокариотические клетки, такие как Е. coli и Bacillus subtilis, клетки грибов, такие как дрожжи и Aspergillus, клетки насекомых, такие как клетки дрозофилы S2 и Sf9, или клетки животных, такие как клетки фибробластов, клетки СНО, клетки COS, клетки NSO, клетки HeLa, клетки ВНК, клетки HEK293 или клетки человека.
Используемый в данном изобретении термин специфическое связывание относится к неслучайному связыванию между двумя молекулами, такому как взаимодействие между антителом и его антигеном-мишенью. В некоторых вариантах осуществления специфическое связывание антитела с антигеном означает аффинность (KD), например, менее чем около 10-5 М, в частности менее чем 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 М или менее.
Используемый в данном изобретении термин KD относится к константе равновесия диссоциации специфического взаимодействия между антителом и антигеном для описания аффинности связывания между антителами и антигенами. Чем меньше константа диссоциации равновесия, тем сильнее антитело связывается с антигеном, тем выше аффинность между антителом и антигеном. Как правило, антитела (например, моноклональные антитела 14С12, 14C12H1L1 в данном изобретении) связываются с антигенами (например, белок PD1) с KD менее чем приблизительно 10-5 М, например менее чем 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 или 10-10 М, или даже менее. KD может быть измерена любым методом, хорошо известным техниче- 6 042479 скому персоналу в данной области техники, например, с использованием системы Fortebio Octet. Используемые в данном изобретении термины моноклональное антитело и mAb имеют одинаковое значение и используются взаимозаменяемо; термины поликлональное антитело и PcAb имеют одинаковое значение и используются взаимозаменяемо; термины полипептид и белок имеют одинаковое значение и используются взаимозаменяемо. Также в данном изобретении аминокислоты обычно представлены однобуквенными или трехбуквенными сокращениями, известными в данной области техники. Например, аланин может быть представлен как А или Ala.
Используемые в данном изобретении термины гибридома и линия клеток гибридомы могут использоваться взаимозаменяемо и, когда упоминаются в данном документе, включают субклон и клеткипотомки гибридомы. Например, когда упомянута в данном документе, линия клеток гибридомы LT003 также включает субклон и клетки-потомки LT003.
Используемый в данном изобретении термин фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент относится к носителю и/или эксципиенту, фармацевтически и/или физиологически совместимому с субъектами и активными ингредиентами и широко признанному в данной области техники (Remington's Pharmaceutical Sciences, Edited by Gennaro AR, 19th ed., Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995), включая без ограничения регуляторы рН, поверхностно-активные вещества, адъюванты и усилители ионной силы. Например, регуляторы рН включают без ограничения фосфатный буферный раствор; поверхностно-активные вещества включают без ограничения катионные, анионные или неионные поверхностно-активные вещества, такие как Твин-80; усилители ионной силы включают без ограничения хлорид натрия.
Используемый в данном изобретении термин эффективная доза определяется как количество терапевтического средства, достаточное для достижения или, по меньшей мере, частичного достижения желаемого эффекта. Например, эффективная профилактическая доза (например, для рака) представляет собой количество для предотвращения, остановки или задержки возникновения заболеваний (например, рака); эффективная доза лечения представляет собой количество, которое излечивает или, по меньшей мере, частично, останавливает заболевание и его осложнения у пациентов с заболеванием. Определение такой эффективной дозы полностью находится в пределах возможностей технического персонала в данной области техники. Например, эффективная доза лечения будет зависеть от тяжести заболевания, общего состояния иммунной системы пациента, общего состояния пациентов, такого как возраст, масса и пол, способа введения указанного лекарственного средства и других сопутствующих методов лечения и т.п.
Эффекты изобретения.
Моноклональные антитела по данному изобретению, особенно 14C12H1L1, способны специфически связываться с PD1, эффективно блокируя связывание PD1 с PDL1 и ослабляя иммуносупрессию PD1 для активации Т-лимфоцитов. При этом антитело 14C12H1L1 против PD1 может индуцировать секрецию ИФН-γ и ИЛ-2 намного лучше, чем контрольное антитело 5С4 (5С4: PD1 антитело от Medarex Inc.: Alan J.Korman, et al., Human monoclonal antibodies to programmed death 1 (PD1) and methods for treating cancer using anti-PDl antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics, патент США № US 8008449 В2). Моноклональные антитела по данному изобретению, особенно 14C12H1L1, обладают противоопухолевым эффектом, эквивалентным одобренному препарату ниволумаб для той же мишени. Антитела по данному изобретению обладают потенциалом стать или быть использованными в изготовлении в лекарственных средствах для профилактики и/или лечения немелкоклеточного рака легкого, почечноклеточного рака, рака яичника, меланомы, лейкоза или анемии.
Описание чертежей
На фиг. 1 представлены результаты электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН (SDS-PAGE) гуманизированного моноклонального антитела 14C12H1L1. Слева направо: 1 - 1 мкг антитела в невосстановленном загрузочном буфере; 2 - 1 мкг антитела в восстановленном загрузочном буфере; 5 мкл маркера; 3 - 1 мкг БСА.
На фиг. 2 показана кинетика связывания антитела 14С12.
На фиг. 3 - кинетика связывания антитела 14C12H1L1.
На фиг. 4 - кинетика связывания антитела 5С4.
На фиг. 5 представлены результаты ИФА по связыванию 14C12H1L1 и 5С4 с PD1.
На фиг. 6 - результаты конкурентного ИФА по связыванию 14C12H1L1 и 5С4 с PD1 в сравнении с PDL1.
На фиг. 7 показана ЕС50 связывания 14C12H1L1 с PD1 на поверхности клеток 293T-PD1.
На фиг. 8 - активность связывания 14C12H1L1 с поверхностным антигеном PD1 Т-клеток.
На фиг. 9 показано влияние 14C12H1L1 на секрецию ИФН-γ смешанных лимфоцитов.
На фиг. 10 - влияние 14C12H1L1 на секрецию ИЛ-2 смешанных лимфоцитов.
На фиг. 11 - влияние 14C12H1L1 на секрецию цитокина ИЛ-2, индуцированную смешением клеток РВМС, MDA-MB-2 31 и Raji.
На фиг. 12 - влияние 14C12H1L1 на рост опухоли в модели опухоли МС38 у мышей PD-1 HuGEMM.
- 7 042479
Линия клеток гибридомы LT003 была задепонирована в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) в университете Ухань, г. Ухань, Китай, 430072, 16 июня 2015 г., с депозитарным номером доступа ССТСС: С2015105.
Подробное описание изобретения
Изобретение далее будет описано подробно. Как будет понятно специалисту в данной области техники, следующие примеры используются только для описания изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Случаи без конкретного описания методов или условий были выполнены в соответствии с литературой в данной области техники (например, Guide to Molecular Cloning, под авторством J. Sambrook et al., переведен Peitang Huang et al., third Edition, Science Press) или в соответствии с инструкцией по применению продукта. Все реагенты или инструменты без указания изготовителя представляли собой обычные продукты, имеющиеся в продаже.
В приведенных ниже примерах используемые Т-клетки были получены от Akeso Biopharma, Inc.; мыши BALB/C были приобретены в Медицинском центре животных провинции Гуандун. Используемые мыши PD-1 HuGEMM были получены от Nanjing Galaxy Biopharma Co., Ltd.; клетки МС3 8 были получены из шанхайского клеточного центра Fudan IBS; коммерческий препарат против той же мишени используемый ниволумаб (Opdivo®), был получен от Bristol-Myers Squibb Company.
Пример 1. Получение линии клеток гибридомы LT003 и получение моноклонального антитела 14С12.
1. Создание линии клеток гибридомы LT003.
Используется PD1-mFc (PD1: белок 1 запрограммированной клеточной смерти, NCBI GenBank ID: NP_005009.2) слитый белок в качестве антигена и слитые спленоциты иммунизированных мышей BALB/C (приобретенных в Медицинском центре животных провинции Гуандун) и клетки миеломы мыши в клетки гибридомы с помощью общепринятого в настоящее время метода (например, Stewart, S.J., Monoclonal Antibody Production, в Basic Methods in antibody Production and Characterization, Eds.G.C. Howard and D.R. Bethell, Boca Raton: CRC Press, 2000).
Покрывали микропланшет PD1-mFc в качестве антигена и подвергали скринингу клетки гибридомы с помощью опосредованного ИФА для получения клеток гибридомы, которые секретируют новые антитела, специфически связывающиеся с PD1.
При скрининге получали линии клеток гибридомы, способные секретировать моноклональные антитела, связывающиеся с PD1, посредством конкурентного ИФА против слитого белка лиганд PDL1-hFc (PDL1: лиганд 1 белка запрограммированной клеточной смерти, NCBI Genebank ID: NP 054862.1), и получали стабильные клеточные линии гибридомы методом ограниченного разведения, а затем получали стабильные линии клеток LT003 методом ограниченного разведения (моноклональное антитело, секретируемое из LT003, называется 14С12).
Линия клеток гибридомы LT003 (PD1-14C12) была задепонирована в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) в университете Ухань, г. Ухань, Китай, 430072, 16 июня 2015 г., с депозитарным номером доступа ССТСС: С2015105.
2. Получение моноклонального антитела 14С12.
Линию клеток LT003 в данном изобретении культивировали с использованием среды IMDM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки с низким содержанием IgG, в течение 7 суток, а затем собирали и очищали супернатант культуры клеток для получения антитела 14С12.
Пр имер 2. Получение последовательностей легкой цепи и тяжелой цепи моноклонального антитела 14С12.
Экстрагировали мРНК из линии клеток гибридомы LT003, полученной в примере 1 выше, в соответствии с руководством для набора реагентов для выделения общей клеточной/бактериальной РНК (Tiangen, продукт № DP430).
Синтезировали кДНК в соответствии с руководством для системы синтеза первой цепи Invitrogen Superscript® III для набора ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскриптазой) и проводили амплификацию ПЦР.
Непосредственно проводили ТА-клонирование с использованием продуктов амплификации ПЦР в соответствии с инструкциями набора для клонирования pEASY-T1 (Transgen CT101).
Секвенировали продукты ТА-клонирования и получили следующие результаты.
Результаты секвенирования ДНК VH: (354 п. о.).
GAGGTCAAACTGGTGGAGAGCGGCGGCGGGCTGGTGAAGCCCGGCGGGTCACTGAAACT
GAGCTGCGCCGCTTCCGGCTTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCATGGGTGAGGCAGACCCCT
GAGAAGCGCCTGGAATGGGTCGCTACTATCAGCGGAGGCGGGCGATACACCTACTATCCTGACT
С Т G Т СAAAG G GAGАТ Т САСААТ ТAG Т С G G GATAAC G С СAGАААТAC TCTGTATCTGCAGATGTC
TAGTCTGCGGTCCGAGGATACAGCTCTGTACTATTGTGCAAACCGGTACGGCGAAGCATGGTTT
GCCTATTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACAGTCTCTGCC(SEQ ID NO: 1)
- 8 042479
Закодированная последовательность белка: (118 а. к.).
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVATISGGGRYTY
YPDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 2)
Результаты секвенирования ДНК VL: (318 п. о.).
GACATTAAGATGACACAGTCCCCTTCCTCAATGTACGCTAGCCTGGGCGAGCGAGTGAC
CTTCACATGCAAAGCATCCCAGGACATCAACACATACCTGTCTTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGC
AAAAGCCCCAAGACCCTGATCTACCGGGCCAATAGACTGGTGGACGGGGTCCCCAGCAGATTCT
CCGGATCTGGCAGTGGGCAGGATTACTCCCTGACCATCAGCTCCCTGGAGTATGAAGACATGGG
CATCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCTCTGACCTTTGGAGCAGGCACAAAACTGGAA
CTG (SEQ ID NO: 3)
Закодированная последовательность белка: (106 а. к.).
DIKMTQSPSSMYASLGERVTFTCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVP
SRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLTFGAGTKLEL (SEQ ID NO: 4)
2. Получение рекомбинантного моноклонального антитела 14С12 (Re).
Отдельно клонировали последовательность кДНК тяжелой цепи (последовательность вариабельной области SEQ ID NO: 1) и последовательность кДНК легкой цепи (последовательность вариабельной области SEQ ID NO: 3) из 14С12 (Re) в вектор pUC57simple (предоставлен GenScript Biotech Corp.) (сайты ферментативного расщепления: XbaI и BamHI) и получили плазмиды pUC57simple-14C12H и pUC57 simple- 14C12L соответственно.
Ферментативно расщепляли (HindIII и EcoRI) плазмиды pUC57simple-14C12H и pUC57simple14C12L соответственно, а затем субклонировали тяжелые и легкие цепи, извлеченные после электрофореза, в вектор pcDNA3.1, экстрагировали обе рекомбинантные плазмиды и котрансфицировали клетки 293F.
Через 7 суток культивирования клеток супернатант культуры клеток центрифугировали посредством высокоскоростного центрифугирования и фильтровали путем вакуумной фильтрации через микропористую мембрану и загружали в колонку HiTrap MabSelectSuRe, а затем антитело элюировали с помощью буфера для элюции за один этап, а затем пропускали через колонку для обессоливания HiTrap и вымыли в фосфатно-солевой буфер (PBS), a затем было получено рекомбинантное антитело 14С12 (Re) после дополнительной очистки.
Как подтверждено анализом ИФА на связывающую активность, рекомбинантное антитело 14С12 (Re) имело связывающую активность, эквивалентную антителу 14С12, и, следовательно, может быть далее использовано в последующем конструировании гуманизации антител.
Пример 3. Конструирование последовательностей легкой цепи и тяжелой цепи гуманизированного антитела 14C12H1L1.
1. Конструирование последовательностей легкой цепи и тяжелой цепи гуманизированного антитела 14C12H1L1.
По данным трехмерной кристаллической структуры белка PD1 (Shinohara, T. et al., Structure and chromosomal localization of the human PD1 gene (PDCD1), Genomics, 1995, 23 (3):704-6)) и последовательностей антитела 14С12, полученного в примере 2, с помощью компьютерного моделирования антител, конструировали аминокислотные мутации в соответствии с моделью и получали последовательности вариабельной области антитела 14C12H1L1 (константная область тяжелой цепи представляет собой С-область цепи Ig гамма-1, ACCESSION:P01857; константная область легкой цепи представляет собой С-область Ig каппа-цепи, ACCESSION:P01834), представленную далее.
Последовательность ДНК вариабельной области тяжелой цепи: (354 п. о.).
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGCGACT
GAGCTGCGCAGCTTCCGGATTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCCTGGGTGCGACAGGCACCA
GGAAAGGGACTGGATTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGATACACCTACTATCCTGACA
G С G Т СAAG GGCCGGTT САСААТ СТС TAGAGATAACAG ТAAGAACААТ CTGTATCTGCAGAT GAA
CAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCACTGTACTATTGTGCCAACCGCTACGGGGAAGCATGGTTT
GCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACAGTCTCTAGT (SEQ ID NO: 5)
Закодированная последовательность белка: (118 а. к.).
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTY
YPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 6)
- 9 042479
Последовательность ДНК вариабельной области легкой цепи: (321 п. о.).
GACATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCATGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCAC
CTTCACATGCCGCGCTAGTCAGGATATCAACACCTACCTGAGCTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGG
AAAAGCCCCAAGACACTGATCTACCGGGCTAATAGACTGGTGTCTGGAGTCCCAAGTCGGTTCA GTGGCTCAGGGAGCGGACAGGACTACACTCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGGACATGGC AACCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCACTGACCTTTGGCGCCGGGACAAAACTGGAG CTGAAG (SEQ ID NO: 7)
Закодированная последовательность белка: (107 а. к.).
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVP
SRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 8)
Пример 4. Получение и электрофорез SDS-PAGE гуманизированного моноклонального антитела 14C12H1L1.
Отдельно клонировали кДНК тяжелой цепи (последовательность вариабельной области представляет собой SEQ ID NO: 5, константная область тяжелой цепи представляет собой С-область цепи Ig гамма-1, ACCESSION: P01857) и кДНК легкой цепи (последовательность вариабельной области представляет собой SEQ ID NO 7: константная область легкой цепи представляет собой С-область Ig каппа-цепи, ACCESSION: P01834) 14C12H1L1 в вектор pUC57simple (предоставленный GenScript Biotech Corp.) (сайты ферментативного расщепления: XbaI и BamHI) для получения плазмиды pUC57simple-14С12Н1 и pUC57simple-14C12Ll соответственно. Эти плазмиды субклонировали в вектор pcDNA3.1 соответственно (сайты ферментативного расщепления: XbaI и BamHI), экстрагировали обе рекомбинантные плазмиды и котрансфицировали клетки 293F.
Через 7 суток культивирования клеток культуру клеток центрифугировали посредством высокоскоростного центрифугирования и фильтровали путем вакуумной фильтрации через микропористую мембрану и загружали в колонку HiTrap MabSelectSuRe, а затем антитело элюировали с помощью буфера для элюции за один этап, а затем пропускали через колонку для обессоливания HiTrap и вымыли в буфер PBS, а далее очистили для получения рекомбинантного антитела 14C12H1L1, которое анализировали электрофорезом SDS-PAGE.
Результаты показаны на фиг. 1, восстановленный целевой белок появился приблизительно при 24,5 и 49 кДа, а невосстановленный целевой белок появился приблизительно при 147 кДа.
Пример 5. Измерения кинетических параметров антител.
Кинетику связывания антитела 14С12 и гуманизированного антитела 14C12H1L1 с антигеном PD1 измеряли с помощью системы Fortebio Octet.
1. Расщепляли белок PD1-mFc протеазой TEV и получали антиген PD1 путем очистки на колонке.
2. Антиген PD1 (концентрация 1 мкг/мл), меченный биотином, иммобилизовали на поверхности сенсора SA и уравновешивали в буфере PBST, а затем связывали антитела 14С12, 14C12H1L1 и 5С4, и антитела были разбавлены в каждом разведении в три раза относительно предыдущей концентрации начиная с 200 нМ. Диссоциацию антигена и антитела также проводили в PBST.
Кинетика связывания антител 14С12, 14C12H1L1 и 5С4 показана в табл. 1 и на фиг. 2, 3 и 4 соответственно. Результаты показали, что как 14С12, так и 14C12H1L1 имеют хорошую аффинность с PD1 с более высокой аффинностью, чем у 5С4.
Таблица 1
Динамические параметры антитела 14С12.
| Название антитела | KD (М) | Коп (1/мс) | Ошибка Коп | Kdis (1/с) | Ошибка Kdis |
| 14С12 | 1,81Е-11 | 3,38Е+05 | 8,23Е+03 | 6,12Е-06 | 1,04Е-05 |
| 14C12H1L1 | 2,42Е-11 | 3,17Е+05 | 5,90Е+03 | 7,66Е-06 | 8,70Е-06 |
| 5С4 | 6,46Е-10 | 5,63Е+05 | 1,38Е+04 | 3,63Е-04 | 9,77Е-06 |
KD: константа диссоциации;
Kon: скорость связывания антигена и антитела;
Kdis: скорость диссоциации антигена и антитела;
KD=Kdis/Kon.
Пример 6. Активность связывания антитела и антигена PD1, измеренная с помощью опосредованного ИФА.
Активности связывания антител 14C12H1L1 и 5С4 с PD1 измеряли отдельно с помощью опосредованного ИФА следующим образом.
После инкубации с PD1-mFc при 4°С в течение ночи микропланшет блокировали 1% БСА при 37°С в течение 2 ч, а затем антитела добавляли по отдельности и инкубировали при 37°С в течение 30 мин,
- 10 042479 затем добавляли меченное HRP (пероксидаза хрена) вторичное антитело (козий анти-человеческий IgG (H+L)) (Jackson, 109-035-088) и затем добавляли ТМВ (Neogen, 308177) для прохождения реакции в течение 5 мин и измеряли оптическую плотность при длине волны, равной 450 нм, в считывающем устройстве для микропланшетов.
Результаты связывания антител 14C12H1L1 и 5С4 с антигеном PD1 показаны на фиг. 5. Как показано на фиг. 5, оба антитела 14C12H1L1 и 5С4 могут эффективно связываться с белком PD1 с зависимостью от дозы. Интенсивности поглощения при разных дозах показаны в табл. 2. С помощью моделирования кривой с использованием результатов количественного анализа в виде значений оптической плотности было определено, что ЕС50 связывания 14C12H1L1 и 5С4 с PD1 определены равными 0,032 и 0,043 нМ соответственно.
Таблица 2
Интенсивности поглощения для связывания 14C12H1L1 и 5С4 с PD1
| Антигенное покрытие: PDl-mFc (0,5 мкг/мл) | ||||
| Концентрация антитела (мкг/мл) | 14C12H1L1 | 5С4 | ||
| 1 | 2, 970 | 2, 954 | 2,959 | 2, 991 |
| 0,3 | 2,886 | 2, 961 | 2,978 | 3,079 |
| 0,1 | 2,864 | 2,868 | 2,838 | 2, 926 |
| 0,03 | 2, 674 | 2, 669 | 2,617 | 2, 659 |
| 0,01 | 2,222 | 2,201 | 1,981 | 2,221 |
| 0,003 | 1,383 | 1,464 | 1,169 | 1,222 |
| 0,001 | 0, 676 | 0,736 | 0,527 | 0,548 |
| 0 | 0,062 | 0,062 | 0,065 | 0,073 |
| Вторичное антитело | Меченное HRP вторичное антитело (козий античеловеческий IgG) |
Пример 7. Активности связывания антител с антигеном PD1 против PDL1, определенные с помощью конкурентного ИФА.
Активности связывания гуманизированных антител 14C12H1L1 и 5С4 с антигеном PD1 против PDL1 измеряли с помощью конкурентного ИФА следующим образом.
После инкубации с PD1-hFc при 4°С в течение ночи микропланшет блокировали 1% БСА в течение 2 ч, антитела 14C12H1L1 и 5С4 с различными концентрациями (см. табл. 3 для разведенных концентраций) смешивали с PDLl-mFc в течение 10 мин, и смеси инкубировали при 37°С в течение 30 мин, а затем добавляли соответствующие анти-человеческие и анти-мышиные меченые ферментом вторичные антитела соответственно и инкубировали при 37 °С в течение 30 мин. Поглощение на длине волны 450 нм считывали в считывающем устройстве для микропланшетов.
Результаты связывания антител 14C12H1L1 и 5С4 с антигеном PD1 показаны на фиг. 6. Как показано на фиг. 6, антитело 14C12H1L1 может конкурировать с PDL1 и эффективно связываться с белком PD1 с зависимостью от дозы. Интенсивности поглощения при разных дозах показаны в табл. 3. С помощью моделирования кривой с использованием результатов количественного анализа в виде значений поглощения было определено, что ЕС50 активности связывания 14C12H1L1 и 5С4 составляет 1,322 и 1,199 нМ соответственно.
Таблица 3
Конкурентное связывание 14C12H1L1 и 5С4 с PD1 против PDL1
| Антигенное покрытие | PDl-mFc 0,5 мкг/мл | |||
| Концентрация антитела/градиент разведения | 14C12H1L1 | 5С4 | ||
| 1,5 мкг/мл | 0, 062 | 0, 064 | 0, 070 | 0,075 |
| 1: 3 | 0, 069 | 0, 064 | 0, 081 | 0,086 |
| 1: 9 | 0, 363 | 0, 305 | 0, 372 | 0,269 |
| 1: 27 | 1,727 | 1,543 | 1,429 | 1, 604 |
| 1: 81 | 1, 892 | 1,752 | 1,766 | 1,881 |
- 11 042479
| 1: 243 | 1, 984 | 2, 029 | 2, 045 | 2,005 |
| 1: 729 | 1, 937 | 1, 978 | 1, 934 | 1,954 |
| 0 | 1, 870 | 1, 977 | 1, 933 | 1,977 |
| Лиганд | PDLl-mFc 0,3 мкг/мл | |||
| Вторичное антитело | Меченное HRP козье анти-мышиное вторичное антитело |
Пример 8. Активность связывания антител с антигеном PD1 поверхности клеток методом проточной цитометрии.
Были сконструированы клетки-хозяева 293Т, экспрессирующие антиген PD1, и помечены гуманизированным антителом 14C12H1L1, полученным согласно данному изобретению (см. пример 4). Способность антитела 14C12H1L1 специфически связываться с антигеном клеточной поверхности в его нативной конформации анализировали и проверяли с помощью проточной цитометрии.
1. Конструирование клетки-хозяина 293Т, экспрессирующей антиген PD1.
Конкретные шаги были следующими.
Конструирование клетки-хозяина 293Т, экспрессирующей антиген PD1.
Клетки 293Т трансфицировали PD1-содержащим вектором pLenti6.3-PD1 (вектор pLenti6.3 был приобретен у Invitrogen Corporation) в соответствии с руководством набора LipofectaminTransfection Kit (приобретенным у Invitrogen Corporation) для получения стабильного пула 293T-PD1, экспрессирующих PD1, путем скрининга.
2. Связывание антител с антигеном клеточной поверхности 293T-PD1.
Мечение антител и проточная цитометрия.
Полученный вышеописанным этапом 293T-PD1 расщепляли трипсином и распределяли по пробиркам, каждая из которых содержала 2х105 клеток. Антитела PD1 разбавляли с использованием буфера PBS (1% БСА) в концентрациях 50, 10, 5, 1, 0,1 и 0,01 нМ и добавляли в пробирки и инкубировали на льду с экспрессирующими PD1 клетками 293Т в течение 2 ч. В каждую пробирку добавляли 100 мкл FITC-меченого вторичного козьего анти-человеческого антитела (1:500) и инкубировали на льду в течение 1 ч. После 3-кратной промывки с помощью PBS клетки ресуспендировали в 300 мкл PBS и измеряли сигналы флуоресценции на проточном цитометре с использованием канала FITC.
Результаты связывания гуманизированного антитела 14C12H1L1 с клетками 293T-PD1 показаны на фиг. 7. Как показано на фиг. 7, антитело 14C12H1L1 может эффективно связывать целевой белок PD1, экспрессирующийся на поверхности клеток-хозяев 293T-PD1, с зависимостью от дозы. Интенсивности флуоресценции при разных дозах показаны в табл. 4. Через моделирование кривой с использованием результатов количественного анализа в виде значений интенсивности флуоресценции, ЕС50 связывания 14C12H1L1 с PD1 было определено как 1,89 нМ.
Таблица 4
Интенсивности флуоресценции связывания 14C12H1L1 с поверхностным антигеном 293T-PD1, обнаруженные методом проточной цитометрии
| Концентрация (нМ) | 0,01 | 0,1 | 1 | 5 | 10 | 50 |
| Интенсивность флуоресценции | 8,32 | 20,31 | 174,62 | 579,41 | 686,49 | 669,54 |
Пример 9. Активность связывания антитела с поверхностным антигеном PD1 Т-клеток методом проточной цитометрии.
РВМС были выделены при помощи Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, партия № 171440-02), затем выделяли клетки CD4+ и клетки стимулировали РНА (фитогемагглютинином) (Shanghai Shenqi Biotech Co., Ltd, 50 мкл/мл) в течение трех суток, а затем один раз промывали PBS и антитела в различных концентрациях добавляли и инкубировали на льду в течение 1,5 ч. Затем клетки промывали PBS один раз после инкубации, добавляли меченное FITC козье анти-человеческое вторичное антитело (Jackson immunoresearch lot. 102155), инкубировали на льду в темноте в течение 1 ч и после однократного промывания PBS сигналы флуоресценции измеряли на проточном цитометре.
Результаты связывания гуманизированного антитела 14C12H1L1 с Т-клетками показаны на фиг. 8. Очевидно, что антитело 14C12H1L1 может эффективно связывать белок PD1 на поверхности Т-клеток с зависимостью от дозы.
Пример 10. Реакция смешанных лимфоцитов.
Секреция цитокинов ИФН-γ, ИЛ-2 РВМС были выделены при помощи Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, партия № 171440-02), дополнительно выделенные РВМС индуцировали ИЛ-4 (Peprotech K2513, 1000 ед/мл) и GM-CSF (Peprotech H1513, 1000 ед/мл) в течение 6 суток, а затем ФНО-α (Peprotech G1513, 200 ед/мл) был добавлен для индукции в течение 3 суток для получения клеток DC (дендритных клеток).
-
Claims (25)
- Т-клетки выделяли из РВМС и смешивали с клетками DC, полученными выше, в соотношении 10:1 для совместного культивирования с антителами 14C12H1L1, 5С4 и hIgG (hIgG в качестве изотипического контроля) в различных соотношениях в течение 5-6 суток. Значения секреции ИФН-γ и ИЛ-2 измеряли с помощью соответствующих наборов реагентов для ИФА (оба были приобретены у Dakewe) соответственно.Секреции ИФН-γ и ИЛ-2 после смешивания культуры клеток DC и Т-клеток были показаны на фиг. 9 и 10. Антитело 14C12H1L1 может эффективно индуцировать секрецию ИФН-γ и ИЛ-2 с зависимостью от дозы. Антитело 14C12H1L1 может индуцировать более высокую секрецию как ИФН-γ, так и ИЛ-2, чем контрольное антитело 5С4.Пример 11. Индуцированная секреция ИЛ-2.Выделенные РВМС (такой же метод, как в примере 10) стимулировали с помощью PHA (Shanghai Shenqi Biotech Co., Ltd, 50 мкл/мл) в течение 3 суток, а затем зрелые РВМС (5х104 клеток/лунка) смешивали с клетками Raji (Китайская академия наук Шанхайский филиал) (5х104 клеток/лунка) и клетками MDA-MB-231 (АТСС) (1х104 клеток/лунка) в 96-луночном планшете. Добавляли 100 нМ 14C12H1L1 или контрольного антитела 5С4 или hIgG (hIgG в качестве изотипического контроля), смешивали и культивировали вместе в течение 3 суток. Секрецию ИЛ-2 определяли с помощью набора реагентов для ИФА (приобретенного у Dakewe) в соответствии с инструкциями для набора.Результаты секреции ИЛ-2 после инкубации смешанной клеточной культуры показаны на фиг. 11. Как показано на фиг. 11, антитело может эффективно индуцировать РВМС к секреции ИЛ-2, а секреция ИЛ-2, индуцированная 14C12H1L1, значительно выше, чем секреция для контрольного антитела 5С4.Пример 12. Влияние антитела 14C12H1L1 на рост опухоли в модели опухоли МС38 у мышей PD-1 HuGEMM.Опухолевые клетки МС38 (1х106 клеток/мышь) инокулировали подкожно в правый бок мышей PD-1 HuGEMM (трансгенных мышей с PD-1 человека). Когда средний объем опухоли достиг приблизительно 118 мм3, мышей случайным образом разделили на 4 экспериментальные группы по 8 мышей в каждой группе. Антитела давали введением через брюшную полость. Конкретные группы и дозировки были следующими:группа изотипического контроля (доза: 8 мг/кг),14C12H1L1 группа с высокой дозой (доза: 8 мг/кг),14C12H1L1 группа с низкой дозой (доза: 0,8 мг/кг), группа ниволумаба (доза: 8 мг/кг).Вышеуказанным 4 группам вводили антитела два раза в неделю, всего 5 доз. После инъекции размеры опухолей измеряли два раза в неделю.Результаты предоставлены на фиг. 12.Результаты указывают на то, что статистически размеры опухолей в группе ниволумаба, группе с высокой дозой 14C12H1L1 и группе с низкой дозой 14C12H1L1 были значимо меньше, чем в группе изотипического контроля (Р<0,01, Р<0,01, Р<0,05 соответственно). Группа с высокой дозой 14C12H1L1 (8 мг/кг) продемонстрировала статистически значимый противоопухолевый эффект на модели опухоли МС38 у мышей PD-1 HuGEMM и имела эффективность, эквивалентную одобренному препарату для той же мишени - ниволумабу (8 мг/кг).Хотя конкретные варианты осуществления данного изобретения были описаны подробно, как будет понятно специалисту в данной области техники, эти детали могут повлечь за собой различные модификации и замены в соответствии со всеми раскрытыми нами принципами. Все эти изменения охватываются объемом данного изобретения. Полный объем данного изобретения охватывается прилагаемой формулой изобретения и любыми эквивалентами.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Анти-PD-I моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где вариабельная область тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела содержит CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 9-11; и вариабельная область легкой цепи (VL) моноклонального антитела содержит CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 12-14.
- 2. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где аминокислотная последовательность VH моноклонального антитела выбрана из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 6; и аминокислотная последовательность VL моноклонального антитела выбрана из SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 8.
- 3. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, где моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 и VL с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4.
- 4. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, где моноклональное- 13 042479 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6 и VL с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8.
- 5. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, где антигенсвязывающий фрагмент представляет собой Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, CDR-фрагмент или одноцепочечное антитело (scFv).
- 6. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-5, где аффинность связывания (KD) с PD1 моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет менее чем 10-5 М.
- 7. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где аффинность связывания (KD) с PD1 моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 или 10-10 М или менее.
- 8. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.6 или 7, где KD измеряют анализатором молекулярных взаимодействий Fortebio.
- 9. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пп.1-4, где моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит области, отличные от CDR, полученные от вида, отличного от мыши.
- 10. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.9, где моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит области, отличные от CDR, полученные от человека.
- 11. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, где моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент продуцируется линией клеток гибридомы LT003 и линия клеток гибридомы LT003 задепонирована в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) с депозитарным номером доступа ССТСС: С2015105.
- 12. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п.1, где VH содержит CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 9-11.
- 13. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.12, где VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 6.
- 14. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.13, где молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 5.
- 15. Экспрессионный конструкт, содержащий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.12-14.
- 16. Экспрессионный конструкт по п.15, где экспрессионный конструкт дополнительно содержит выделенную молекулу нуклеиновой кислоты или экспрессионный конструкт, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи (VL) моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п.1, где VL содержит CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 12-14.
- 17. Экспрессионный конструкт по п.16, где VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 8.
- 18. Экспрессионный конструкт по п.17, где нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи (VL) моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п.1 содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 7.
- 19. Экспрессионная линия клеток, содержащая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.12-14 или экспрессионный конструкт по любому из пп.15-18.
- 20. Линия клеток гибридомы LT003, задепонированная в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) с депозитарным номером доступа ССТСС: С2015105, для получения анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-11.
- 21. Конъюгат, содержащий моноклональное антитело или его антигенсвязывающие фрагмент по любому из пп.1-11 и партнер для конъюгирования в качестве детектируемого маркера.
- 22. Конъюгат по п.21, где партнер для конъюгирования представляет собой радиоактивные изотопы, флуоресцеин, люминесцентное вещество, красители или ферменты.
- 23. Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-11 либо конъюгат по п.21 или 22 и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество.
- 24. Применение моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по пп.1-11, или конъюгата по п.21 или 22, или фармацевтической композиции по п.23 для лечения опухолей.
- 25. Применение по п.24, где опухоли представляют собой меланому, рак почки, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, колоректальный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак печени, немелкоклеточный рак легкого, рак яичника и лейкоз.-
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610705763.5 | 2016-08-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA042479B1 true EA042479B1 (ru) | 2023-02-17 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20250041409A1 (en) | Anti-pd1 monoclonal antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof | |
| JP7589314B2 (ja) | 抗ｐｄ－１／抗ｖｅｇｆａ二官能性抗体、その医薬組成物およびその使用 | |
| JP7425604B2 (ja) | 抗ｃｔｌａ４－抗ｐｄ－１二機能性抗体、その医薬組成物および使用 | |
| RU2739610C1 (ru) | Антитело против PD-1 и его применение | |
| US10273307B2 (en) | Humanized anti-CD134 (OX40) antibodies and uses thereof | |
| EA042479B1 (ru) | Моноклональное антитело против pd1, его фармацевтическая композиция и их применение | |
| KR20250035543A (ko) | 항-cldn18.2 항체를 포함하는 이중특이적 항체 및 이의 약제학적 조성물 및 이의 용도 | |
| JP2025037880A (ja) | 抗ｐｄ－１／抗ｖｅｇｆａ二官能性抗体、その医薬組成物およびその使用 | |
| EA049135B1 (ru) | Бифункциональное антитело против pd-1 и против vegfa, его фармацевтическая композиция и его применение | |
| EA042365B1 (ru) | Бифункциональное антитело против ctla4 и против pd-1, его фармацевтическая композиция и их применение | |
| NZ791621A (en) | Anti-CTLA4 and anti-PD-1 bifunctional antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof | |
| NZ791623A (en) | Anti-CTLA4 and anti-PD-1 bifunctional antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof |