EA042479B1 - MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST PD1, ITS PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND THEIR USE - Google Patents
MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST PD1, ITS PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND THEIR USE Download PDFInfo
- Publication number
- EA042479B1 EA042479B1 EA201990570 EA042479B1 EA 042479 B1 EA042479 B1 EA 042479B1 EA 201990570 EA201990570 EA 201990570 EA 042479 B1 EA042479 B1 EA 042479B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- antigen
- monoclonal antibody
- antibody
- seq
- binding fragment
- Prior art date
Links
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 102
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims description 95
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 88
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 88
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 88
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 87
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 73
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 51
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 27
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 25
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 24
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 21
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 20
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 12
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims description 11
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 8
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical group C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 7
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 7
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 6
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 6
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims description 6
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 claims description 5
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 claims description 2
- 239000009874 shenqi Substances 0.000 claims description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 claims 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 claims 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 claims 1
- 102000048362 human PDCD1 Human genes 0.000 claims 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 1
- 241000894007 species Species 0.000 claims 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 claims 1
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 23
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 12
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 101001117312 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 2 Proteins 0.000 description 5
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 5
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 2
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010565 Apoptosis Regulatory Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010063104 Apoptosis Regulatory Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108020004513 Bacterial RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101150100936 CD28 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000014447 Complement C1q Human genes 0.000 description 1
- 108010078043 Complement C1q Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 description 1
- 101710138871 Ig gamma-1 chain C region Proteins 0.000 description 1
- 102100039345 Immunoglobulin heavy constant gamma 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 101100519207 Mus musculus Pdcd1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 description 1
- 208000010362 Protozoan Infections Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 1
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004182 chemical digestion Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000014107 chromosome localization Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007896 negative regulation of T cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015347 renal cell adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится изобретениеThe field of technology to which the invention belongs
Настоящее изобретение принадлежит к области терапии опухолей и молекулярной иммунологии и относится к антителу против PD1, фармацевтической композиции и способам применения. В частности, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу против PD1.The present invention belongs to the field of tumor therapy and molecular immunology and relates to an anti-PD1 antibody, a pharmaceutical composition and methods of use. In particular, the present invention relates to a monoclonal antibody against PD1.
Уровень техникиState of the art
Трансмембранный рецептор PD1 (белок 1 запрограммированной клеточной смерти, также известный как PD-1) является членом семейства генов CD28, экспрессируемых в активированных Т-клетках, В-клетках и миелоидных клетках. Оба лиганда PD1 (т.е. PDL1 и PDL2) принадлежат к суперсемейству В7; причем PDL1 широко экспрессируется во множестве клеток, включая Т-клетки, В-клетки, эндотелиальные клетки и эпителиальные клетки, тогда как PDL2 экспрессируется только в антигенпрезентирующих клетках, таких как дендритные клетки и макрофаги.The PD1 transmembrane receptor (programmed cell death protein 1, also known as PD-1) is a member of the CD28 gene family expressed in activated T cells, B cells, and myeloid cells. Both PD1 ligands (ie PDL1 and PDL2) belong to the B7 superfamily; moreover, PDL1 is widely expressed in a variety of cells, including T cells, B cells, endothelial cells and epithelial cells, while PDL2 is expressed only in antigen presenting cells, such as dendritic cells and macrophages.
Т-клетки играют очень важную роль в устранении вирусных инфекций, а противовирусный ответ Т-клеток обычно связан с иммунопатогенезом. PD1 играет жизненно важную роль в негативной регуляции активации Т-клеток. Хотя PD1-опосредованная негативная регуляция на Т-клетках может уменьшать повреждение тканей, вызванное инфекцией, блокирование или ингибирование негативного регуляторного эффекта PD1 может приводить к аутоиммунным заболеваниям, например вирусная инфекция поджелудочной железы может быть более эффективно устранена у мышей, с нокаутированным геном PD1, но может приводить к более серьезному повреждению печени (Isai et al., 2003, J. Exp. Med., 198:39-50). Кроме того, опухоли с высокой экспрессией PD1 часто развиваются при раковых заболеваниях, которые трудно обнаруживать (Hamanishi et al., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 104:3360-5). Общепринятый способ регулирования экспрессии PD1 заключается во введении антител в организм.T cells play a very important role in the elimination of viral infections, and the antiviral response of T cells is usually associated with immunopathogenesis. PD1 plays a vital role in the down regulation of T cell activation. Although PD1-mediated downregulation on T cells can reduce tissue damage caused by infection, blocking or inhibiting the negative regulatory effect of PD1 can lead to autoimmune diseases, for example, viral infection of the pancreas can be more effectively eliminated in PD1 knockout mice, but may lead to more severe liver damage (Isai et al., 2003, J. Exp. Med., 198:39-50). In addition, tumors with high expression of PD1 often develop in cancers that are difficult to detect (Hamanishi et al., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 104:3360-5). A common way to regulate PD1 expression is to introduce antibodies into the body.
В связи с широкими противоопухолевыми перспективами и поразительной эффективностью антител к PD1, обычно считается, что антитела против метаболических путей PD1 приведут к прорывам в лечении различных опухолей: немелкоклеточного рака легкого, почечно-клеточного рака, рака яичника, меланомы (Homet M.B., Parisi G. et al., Anti-PDl Therapy in Melanoma. Semin Oncol., 2015 Jun, 42(3):466-473), лейкоза и анемии (Held S.A., Heine A. et al., Advances in immunotherapy of chronic myeloid leukemia CML, Curr. Cancer Drug Targets, 2013 Sep, 13(7):768-74).Due to the broad antitumor prospects and the amazing efficacy of antibodies to PD1, it is generally believed that antibodies against PD1 metabolic pathways will lead to breakthroughs in the treatment of various tumors: non-small cell lung cancer, renal cell carcinoma, ovarian cancer, melanoma (Homet M.B., Parisi G. et al., Anti-PDl Therapy in Melanoma Semin Oncol., 2015 Jun, 42(3):466-473), Held S.A., Heine A. et al., Advances in immunotherapy of chronic myeloid leukemia CML , Curr. Cancer Drug Targets, 2013 Sep, 13(7):768-74).
С момента раскрытия беспрецедентных данных о клинической эффективности на ежегодных совещаниях Американской ассоциации исследований рака (AACR) и Американского общества клинической онкологии (ASCO) в 2012 и 2013 гг. антитела против PD1 стали самыми востребованными новыми лекарственными средствами в исследованиях и разработках в глобальной фармацевтической индустрии.Since the disclosure of unprecedented clinical performance data at the annual meetings of the American Association for Cancer Research (AACR) and the American Society of Clinical Oncology (ASCO) in 2012 and 2013. Anti-PD1 antibodies have become the most sought-after new drugs in research and development in the global pharmaceutical industry.
В настоящее время все еще существует потребность в разработке новых антител против PD1 с лучшей эффективностью связывания, чтобы эффективно блокировать связывание PD1 с PDL1.At present, there is still a need to develop new anti-PD1 antibodies with better binding efficiency in order to effectively block the binding of PD1 to PDL1.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Благодаря углубленным исследованиям и творческой работе путем иммунизации мышей рекомбинантным PD1, экспрессируемым в системе экспрессии клеток млекопитающих в качестве антигена, авторы изобретения получили клетки гибридомы путем слияния спленоцитов мыши и клеток миеломы. Путем скрининга большого количества образцов авторы изобретения получили линию клеток гибридомы LT003 (депозитарный номер доступа ССТСС: С2015105).Through in-depth research and creative work by immunizing mice with recombinant PD1 expressed in the mammalian cell expression system as an antigen, the inventors obtained hybridoma cells by fusing mouse splenocytes and myeloma cells. By screening a large number of samples, the inventors obtained the LT003 hybridoma cell line (deposit accession number CCTCC: C2015105).
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что линия клеток гибридомы LT003 способна секретировать специфическое моноклональное антитело (названное 14С12), связывающееся специфически с PD1, и это моноклональное антитело может эффективно блокировать соединение PD1 с PDL1.The inventors surprisingly found that the LT003 hybridoma cell line is able to secrete a specific monoclonal antibody (named 14C12) that binds specifically to PD1, and this monoclonal antibody can effectively block the fusion of PD1 to PDL1.
Кроме того, изобретатели новым способом создали гуманизированное антитело против PD1 (названное 14C12H1L1).In addition, the inventors created a humanized anti-PD1 antibody (named 14C12H1L1) in a novel way.
Еще более неожиданно, что авторы изобретения обнаружили, что антитела 14С12 и 14C12H1L1 в данном документе могут эффективно связываться с Т-клетками человека, активировать Т-клетки и индуцировать секрецию ИФН-γ и ИЛ-2 из лимфоцитов человека. Антитела 14С12 и 14C12H1L1 в данном документе потенциально могут стать лекарственными средствами для профилактики и лечения злокачественных новообразований, включая рак легкого, меланому, рак почки, рак яичника и лейкоз, а также анемию.Even more surprisingly, the inventors found that the 14C12 and 14C12H1L1 antibodies herein can effectively bind to human T cells, activate T cells, and induce secretion of IFN-γ and IL-2 from human lymphocytes. Antibodies 14C12 and 14C12H1L1 herein have the potential to be drugs for the prevention and treatment of malignant neoplasms, including lung cancer, melanoma, kidney cancer, ovarian cancer and leukemia, as well as anemia.
Следующее предусмотрено настоящим изобретением.The following is provided by the present invention.
Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, в котором вариабельная область тяжелой цепи (VH) указанного моноклонального антитела содержит CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 9-11; и/или вариабельная область легкой цепи (VL) указанного моноклонального антитела содержит CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 12-14.The present invention relates to a monoclonal antibody or antigennegative fragment, in which the variable region of the heavy chain (VH) of the specified monoclonal antibody contains a CDR with the amino acid sequences of SEQ ID NO: 9-11; and/or the light chain variable region (VL) of said monoclonal antibody contains CDRs with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 12-14.
В некоторых примерах данного изобретения раскрыто указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающие фрагменты, причем аминокислотную последовательность VH моноклонального антитела выбирают из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 6; и/или аминокислотную последовательность VL моноклонального антитела выбирают из SEQ ID NO: 4 иIn some examples of the invention, said monoclonal antibody or antigen-binding fragments thereof are disclosed, wherein the VH amino acid sequence of the monoclonal antibody is selected from SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 6; and/or the V L amino acid sequence of the monoclonal antibody is selected from SEQ ID NO: 4 and
- 1 042479- 1 042479
SEQ ID NO: 8.SEQ ID NO: 8.
В примере данного изобретения раскрыто указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающие фрагменты, причем моноклональное антитело содержит (1) VH представленную SEQ ID NO: 2 и VL представленную SEQ ID NO: 4;In an example of the present invention, said monoclonal antibody or antigen-binding fragments thereof is disclosed, wherein the monoclonal antibody comprises (1) VH represented by SEQ ID NO: 2 and VL represented by SEQ ID NO: 4;
(2) VH представленную SEQ ID NO: 6 и VL представленную SEQ ID NO: 8.(2) VH represented by SEQ ID NO: 6 and VL represented by SEQ ID NO: 8.
Вариабельные области в тяжелой и легкой цепях антитела регулируют активность связывания. Каждая цепь содержит три гипервариабельные области, а именно определяющая комплементарность область (CDR) (HCDR1, HCDR2 и HCDR3 в тяжелой (н) цепи и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 в легкой (L) цепи), которые определяют по Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition (1991), volume 1-3, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD).The variable regions in the heavy and light chains of an antibody regulate binding activity. Each chain contains three hypervariable regions, namely the complementarity determining region (CDR) (HCDR1, HCDR2 and HCDR3 in the heavy (h) chain and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 in the light (L) chain) as defined by Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition (1991), volume 1-3, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD).
Посредством методик, хорошо известных техническому специалисту в описанной в данном документе области техники, например анализа аминокислотных последовательностей в CDR моноклональных антител в пунктах (1) и (2) выше через базу данных VBASE2, антитела 14С12 и 14C12H1L1 в данном документе содержат одинаковые CDR, причем аминокислотные последовательности 3 областей CDR VH являются следующими:Through techniques well known to one of skill in the art described herein, such as analyzing the amino acid sequences in the CDRs of monoclonal antibodies in (1) and (2) above through the VBASE2 database, the 14C12 and 14C12H1L1 antibodies herein contain the same CDRs, with the amino acid sequences of the 3 V H CDR regions are as follows:
HCDRl: GFAFSSYD (SEQ ID NO:9),HCDRl: GFAFSSYD (SEQ ID NO:9)
HCDR2: ISGGGRYT (SEQ ID NO:10),HCDR2: ISGGGRYT (SEQ ID NO:10)
HCDR3: ANRYGEAWFAY (SEQ ID NO:11);HCDR3: ANRYGEAWFAY (SEQ ID NO:11);
при этом аминокислотные последовательности 3 областей CDR VL являются следующими:wherein the amino acid sequences of the 3 CDR V L regions are as follows:
LCDRl: QDINTY (SEQ ID NO:12),LCDRl: QDINTY (SEQ ID NO:12),
LCDR2: RAN (SEQ ID NO :13),LCDR2: RAN (SEQ ID NO :13)
LCDR3: LQYDEFPLT (SEQ ID NO:14).LCDR3: LQYDEFPLT (SEQ ID NO:14).
В определенном примере раскрыто указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, причем указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбирают из Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, CDR, одноцепочечных антител (например, scFv), гуманизированных антител, химерных антител или биспецифических антител.In a specific example, said monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof is disclosed, wherein said monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof is selected from Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, CDR, single chain antibodies (e.g., scFv), humanized antibodies, chimeric antibodies or bispecific antibodies.
В определенных вариантах осуществления раскрыто указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, причем указанное моноклональное антитело связывается с белком PD1 с KD, равной менее чем приблизительно 10-5 М, например менее чем приблизительно 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 М или менее; предпочтительно измеренной с помощью оборудования для молекулярного взаимодействия Fortebio.In certain embodiments, said monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof is disclosed, wherein said monoclonal antibody binds to a PD1 protein with a K D of less than about 10 -5 M, such as less than about 10 -6 , 10 -7 , 10 -8 , 10 -9 , 10 -10 M or less; preferably measured with Fortebio molecular interaction equipment.
В определенных вариантах осуществления раскрыто указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, причем указанное моноклональное антитело связывается с белком PD1 с ЕС50, равной менее чем приблизительно 100 нМ, например менее чем приблизительно 10, 1, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 нМ, или менее. В частности, указанную ЕС50 определяют посредством опосредованной ИФА.In certain embodiments, said monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof is disclosed, wherein said monoclonal antibody binds to a PD1 protein with an EC 50 of less than about 100 nM, such as less than about 10, 1, 0.9, 0.8, 0, 7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 nM, or less. In particular, said EC 50 is determined by indirect ELISA.
В определенных вариантах осуществления раскрыто указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, причем указанное моноклональное антитело связывается с белком PD1 с KD, равной менее чем приблизительно 10-5 М, такой как менее чем приблизительно 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 М или менее.In certain embodiments, said monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof is disclosed, wherein said monoclonal antibody binds to a PD1 protein with a KD of less than about 10 -5 M, such as less than about 10 -6 , 10 -7 , 10 -8 , 10 -9 , 10 -10 M or less.
В некоторых вариантах осуществления раскрыто указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, причем указанное моноклональное антитело содержит области, отличные от CDR, полученные от видов, отличных от мыши, например от человека.In some embodiments, said monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof is disclosed, wherein said monoclonal antibody contains regions other than CDRs derived from a non-mouse species, such as a human.
В определенных вариантах осуществления раскрыто указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающие фрагменты, причем указанное моноклональное антитело продуцируется линией клеток гибридомы LT003, а указанная линия клеток гибридомы LT003 задепонирована в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) с депозитарным номером доступа ССТСС: С2015105.In certain embodiments, said monoclonal antibody or antigen-binding fragments thereof are disclosed, wherein said monoclonal antibody is produced by the LT003 hybridoma cell line and said LT003 hybridoma cell line is deposited with the China Type Culture Collection Center (CCTCC) with CCCCC Deposit Accession Number: C2015105.
Настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, способную кодировать VH антитела, причем VH указанного антитела содержит CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 9-11.The present invention relates to an isolated nucleic acid molecule containing a nucleotide sequence capable of encoding the VH of an antibody, the VH of said antibody having a CDR with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 9-11.
В частности, тяжелая цепь указанного антитела имеет аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 6.In particular, the heavy chain of said antibody has the amino acid sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 6.
Более конкретно, указанная молекула нуклеиновой кислоты имеет нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 5.More specifically, said nucleic acid molecule has the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 5.
Настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, способную кодировать VL антитела, причем VL указанного антитела содержит CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 12-14.The present invention relates to an isolated nucleic acid molecule containing a nucleotide sequence capable of encoding the VL of an antibody, the VL of said antibody having a CDR with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 12-14.
В частности, VL указанного антитела имеет аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 8.In particular, the V L of said antibody has the amino acid sequences of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 8.
Более конкретно, указанная молекула нуклеиновой кислоты имеет нуклеотидные последовательноMore specifically, said nucleic acid molecule has nucleotide sequences
- 2 042479 сти SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 7.- 2 042479 SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 7.
Настоящее изобретение относится к вектору, содержащему выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в данном изобретении.The present invention relates to a vector containing the isolated nucleic acid molecule described in this invention.
Настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в данном изобретении, или вектор, описанный в данном изобретении.The present invention relates to a host cell containing an isolated nucleic acid molecule described in this invention, or a vector described in this invention.
Настоящее изобретение относится к способу получения моноклонального антитела или его антигенсвязывающих фрагментов, описанному в данном изобретении, путем культивирования клеткихозяина в данном изобретении в соответствующих условиях и выделения указанного моноклонального антитела или его антигенсвязывающих фрагментов из культуры клеток.The present invention relates to a method for producing a monoclonal antibody or antigen-binding fragments thereof described in this invention by culturing a host cell in this invention under appropriate conditions and isolating said monoclonal antibody or antigen-binding fragments thereof from cell culture.
Настоящее изобретение относится к линии клеток гибридомы LT003, которая задепонирована в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) с депозитарным номером доступа ССТСС: С2015105.The present invention relates to the LT003 hybridoma cell line, which is deposited with the China Type Culture Collection Center (CTCCC) with CCCCC Deposit Accession Number: C2015105.
Настоящее изобретение относится к конъюгату, который состоит из моноклонального антитела или его антигенсвязывающих фрагментов и конъюгируемой части, причем указанное моноклональное антитело представляет собой моноклональное антитело или его антигенсвязывающие фрагменты, описанное в данном изобретении, а указанная конъюгируемая часть представляет собой детектируемый маркер. В частности, указанная конъюгируемая часть представляет собой радиоактивные изотопы, флуоресцеин, люминесцентные вещества, красители или ферменты.The present invention relates to a conjugate that consists of a monoclonal antibody or antigen-binding fragments thereof and a conjugate portion, wherein said monoclonal antibody is a monoclonal antibody or antigen-binding fragments thereof described in this invention, and said conjugated portion is a detectable marker. In particular, said conjugated part is radioactive isotopes, fluorescein, luminescent substances, dyes or enzymes.
Настоящее изобретение относится к наборам реагентов, состоящим из моноклонального антитела или его антигенсвязывающих фрагментов или их конъюгатов, описанных в изобретении.The present invention relates to kits of reagents, consisting of a monoclonal antibody or its antigen-binding fragments or their conjugates described in the invention.
В частности, наборы реагентов могут содержать вторичное антитело, которое специфически распознает указанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающие фрагменты; необязательно указанное вторичное антитело может содержать детектируемые маркеры, такие как радиоактивные изотопы, флуоресцеин, люминесцентные вещества, красители или ферменты.In particular, reagent kits may contain a secondary antibody that specifically recognizes said monoclonal antibody or antigen-binding fragments thereof; optionally said secondary antibody may contain detectable markers such as radioactive isotopes, fluorescein, luminescent substances, dyes or enzymes.
Настоящее изобретение относится к применению указанного моноклонального антитела, или его антигенсвязывающих фрагментов, или его конъюгатов, описанных в изобретении, для создания наборов реагентов, причем указанные наборы реагентов используются для обнаружения наличия или уровня PD1 в образцах.The present invention relates to the use of said monoclonal antibody, or antigen-binding fragments thereof, or conjugates thereof, as described herein, to create kits of reagents, said kits of reagents being used to detect the presence or level of PD1 in samples.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей указанное моноклональное антитело, или его антигенсвязывающие фрагменты, или их конъюгаты, описанные в изобретении. Необязательно она также может содержать фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.The present invention relates to a pharmaceutical composition containing the specified monoclonal antibody, or its antigen-binding fragments, or their conjugates described in the invention. Optionally, it may also contain a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
Настоящее изобретение относится к применению указанного моноклонального антитела, или его антигенсвязывающих фрагментов, или их конъюгатов, описанных в изобретении, при изготовлении лекарственных средств для профилактики и/или лечения, и/или адъювантного лечения, и/или диагностики опухолей или анемии; в частности, указанные опухоли могут представлять собой меланому, рак почки, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, колоректальный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак печени, немелкоклеточный рак легкого, рак яичника и лейкоз.The present invention relates to the use of said monoclonal antibody, or its antigen-binding fragments, or their conjugates described in the invention, in the manufacture of drugs for the prevention and/or treatment and/or adjuvant treatment and/or diagnosis of tumors or anemia; in particular, said tumors may be melanoma, kidney cancer, prostate cancer, bladder cancer, colorectal cancer, gastrointestinal cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer and leukemia.
Авторы данного изобретения обнаружили в экспериментах на животных, что 14C12H1L1 может эффективно ингибировать рост опухолевых клеток МС38, инокулированных, подкожно в правый бок мышам PD-1 HuGEMM, у которых лекарственное средство на основе антитела 14C12H1L1 может значительно ингибировать рост опухоли у мышей-носителей опухоли PD-1 HuGEMM, имея эффективность, эквивалентную продаваемому лекарственному средству на основе моноклонального антитела ниволумаб, которое является утвержденным лекарственным средством, нацеленным на ту же самую мишень.The present inventors have found in animal experiments that 14C12H1L1 can effectively inhibit the growth of MC38 tumor cells inoculated subcutaneously in the right flank of PD-1 HuGEMM mice, in which 14C12H1L1 antibody drug can significantly inhibit tumor growth in PD tumor-bearing mice -1 HuGEMM, with equivalent potency to the marketed monoclonal antibody nivolumab, which is an approved drug that targets the same target.
Настоящее изобретение относится к применению моноклонального антитела, или его антигенсвязывающих фрагментов, или их конъюгатов, описанных в данном изобретении, для изготовления лекарственных средств для следующих целей:The present invention relates to the use of a monoclonal antibody, or its antigen-binding fragments, or their conjugates described in this invention, for the manufacture of drugs for the following purposes:
блокирование связывания PD1 с лигандом PD1, регуляция (например, понижение) активности или уровня PD1, ослабление иммуносупрессии PD1, или повышение экспрессии ИФН-γ и/или ИЛ-2 в Т-лимфоцитах;blocking PD1 binding to a PD1 ligand, regulation (eg, decrease) of PD1 activity or level, attenuation of PD1 immunosuppression, or increased expression of IFN-γ and/or IL-2 in T lymphocytes;
конкретно, указанный лиганд PD1 представляет собой PDL1 или PDL2, предпочтительно PDL1.specifically, said PD1 ligand is PDL1 or PDL2, preferably PDL1.
Настоящее изобретение относится к способу in vivo или in vitro применения к клеткам или субъектам, нуждающимся в этом, эффективной дозы моноклонального антитела, или его антигенсвязывающих фрагментов, или их конъюгатов, описанных в данном изобретении, а указанный способ выбирают из следующего:The present invention relates to an in vivo or in vitro method of administering to cells or subjects in need thereof an effective dose of a monoclonal antibody, or antigen-binding fragments thereof, or conjugates thereof, described herein, said method being selected from the following:
способы блокирования связывания PD1 с лигандом PD1, способы регулирования (например, понижения) активности или уровня PD1, способы ослабления иммуносупрессии PD1, или способы повышения экспрессии ИФН-γ и/или ИЛ-2 в Т-лимфоцитах;methods for blocking PD1 binding to a PD1 ligand, methods for regulating (eg, lowering) PD1 activity or levels, methods for attenuating PD1 immunosuppression, or methods for increasing expression of IFN-γ and/or IL-2 in T lymphocytes;
конкретно, указанный лиганд PD1 представляет собой PDL1 или PDL2, предпочтительно PDL1.specifically, said PD1 ligand is PDL1 or PDL2, preferably PDL1.
- 3 042479- 3 042479
В конкретном примере данного изобретения указанный способ in vitro предназначен для нетерапевтических или недиагностических целей.In a specific example of the invention, said in vitro method is for non-therapeutic or non-diagnostic purposes.
Интерферон у (ИФНу) в основном вырабатывается естественными клетками-киллерами (NK) и естественными киллерными Т-клетками (NKT) или продуцируется эффекторными Т-клетками, состоящими из CD4 Th1-клеток и CD8 цитотоксических Т-лимфоцитов, после стимуляции специфическими антигенами. Являясь важным цитокином врожденного и приобретенного иммунитета, ИФНу играет важную роль в противодействии или ингибировании вирусных, некоторых бактериальных инфекций и инфекций, вызванных простейшими. Между тем ИФНу может активировать макрофаги и индуцировать экспрессию главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) 2-го типа, чтобы активировать иммунные ответы для контроля прогрессирования опухолей (Schoenborn J.R., Wilson С.В., Regulation of Interferon-γ During Innate and Adaptive Immune Responses, Advances in Immunology, 2007, 96:41-101). В исследовании данного изобретения in vitro антитело против PD1 может индуцировать секрецию ИФНу для активации иммунных ответов.Interferon y (IFNy) is mainly produced by natural killer (NK) cells and natural killer T cells (NKT) or produced by effector T cells consisting of CD4 Th1 cells and CD8 cytotoxic T lymphocytes after stimulation with specific antigens. As an important cytokine of innate and adaptive immunity, IFN-y plays an important role in counteracting or inhibiting viral, some bacterial and protozoan infections. Meanwhile, IFN-y can activate macrophages and induce major histocompatibility complex (MCHC) type 2 expression to activate immune responses to control tumor progression (Schoenborn J.R., Wilson S.V., Regulation of Interferon-γ During Innate and Adaptive Immune Responses, Advances in Immunology, 2007, 96:41-101). In an in vitro study of the present invention, an anti-PD1 antibody can induce the secretion of IFN-a to activate immune responses.
Интерлейкин 2 (ИЛ-2), продуцируемый Т-клетками, является фактором роста, регулирующим субпопуляции Т-клеток, и решающим фактором, регулирующим иммунные ответы, способствующим пролиферации активированных В-клеток и участвующим в реакциях антител, кроветворении и онкологическом надзоре. Рекомбинантный ИЛ-2 человека был одобрен FDA (Управление по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств) США для лечения злокачественных опухолей (включая меланому, опухоль почки и т.д.) во время прохождения клинических исследований для лечения хронических вирусных инфекций (Chavez, A.R. et al., Pharmacologic administration of interleukin-2, Ann. N. Y. Acad. Sci., 2009, 1182, p.14-27). В исследованиях in vitro антитело против PD1 по данному изобретению может специфически ослаблять иммуносупрессию PD1, активировать Т-клетки и индуцировать выработку ИЛ-2, демонстрируя многообещающие перспективы широкого применения в генной терапии опухолевых и паразитарных заболеваний.Interleukin 2 (IL-2), produced by T cells, is a growth factor that regulates T cell subpopulations and is a critical factor that regulates immune responses, promotes the proliferation of activated B cells, and is involved in antibody responses, hematopoiesis, and cancer surveillance. Recombinant human IL-2 has been approved by the US FDA (Food and Drug Administration) for the treatment of malignant tumors (including melanoma, kidney tumor, etc.) during clinical trials for the treatment of chronic viral infections (Chavez, A.R. et al., Pharmacologic administration of interleukin-2, Ann. N. Y. Acad. Sci., 2009, 1182, p.14-27). In in vitro studies, the anti-PD1 antibody of the present invention can specifically attenuate PD1 immunosuppression, activate T cells, and induce IL-2 production, showing promise for widespread use in gene therapy for tumor and parasitic diseases.
Моноклональное антитело, или его антигенсвязывающие фрагменты, или их конъюгаты, описанные в данном изобретении, применяются для профилактики и/или лечения, и/или адъювантного лечения, и/или диагностики опухолей или анемии; в частности, указанные опухоли могут представлять собой меланому, рак почки, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, колоректальный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак печени, немелкоклеточный рак легкого, рак яичника или лейкоз.The monoclonal antibody, or antigen-binding fragments thereof, or conjugates thereof described in this invention are used for the prevention and/or treatment and/or adjuvant treatment and/or diagnosis of tumors or anemia; in particular, said tumors may be melanoma, kidney cancer, prostate cancer, bladder cancer, colorectal cancer, gastrointestinal cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer or leukemia.
Моноклональное антитело, или его антигенсвязывающие фрагменты, или его конъюгаты, описанные в данном изобретении, применяются для блокирования связывания PD1 с лигандом PD1, регуляции (например, понижение) активности или уровня PD1, ослабления иммуносупрессии PD1, или повышения экспрессии ИФН-γ и/или ИЛ-2 в Т-лимфоцитах;The monoclonal antibody, or antigen-binding fragments thereof, or conjugates thereof, described in this invention are used to block the binding of PD1 to a PD1 ligand, regulate (e.g., decrease) the activity or level of PD1, attenuate PD1 immunosuppression, or increase the expression of IFN-γ and/or IL-2 in T-lymphocytes;
конкретно, указанный лиганд PD1 представляет собой PDL1 или PDL2, предпочтительно PDL1.specifically, said PD1 ligand is PDL1 or PDL2, preferably PDL1.
В конкретном примере данного изобретения моноклональное антитело, или его антигенсвязывающие фрагменты, или их конъюгаты, описанные в данном изобретении, блокируют только связывание PD1 с PDL1.In a specific example of this invention, the monoclonal antibody, or its antigen-binding fragments, or their conjugates, described in this invention, block only the binding of PD1 to PDL1.
Настоящее изобретение относится к способу профилактики, и/или лечения, и/или адъювантного лечения, и/или диагностики опухолей или анемии, включающему процедуру применения к субъектам эффективной дозы моноклонального антитела, или его антигенсвязывающих фрагментов, или их конъюгатов, описанных в данном изобретении; в частности, указанные опухоли могут представлять собой меланому, рак почки, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, колоректальный рак, рак желудочнокишечного тракта, рак печени, немелкоклеточный рак легкого, рак яичника или лейкоз.The present invention relates to a method for the prevention and/or treatment and/or adjuvant treatment and/or diagnosis of tumors or anemia, comprising the procedure of applying to subjects an effective dose of a monoclonal antibody, or its antigen-binding fragments, or their conjugates described in this invention; in particular, said tumors may be melanoma, kidney cancer, prostate cancer, bladder cancer, colorectal cancer, gastrointestinal cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer or leukemia.
Если в данном документе не указано иное, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, должны иметь значения, которые обычно понимаются специалистами в данной области техники. Кроме того, лабораторные методы культивирования клеток и тканей, молекулярной генетики, химии олиго- или полинуклеотидов и иммунологии, описанные в данном документе, хорошо известны и широко используются в данной области техники. Между тем, чтобы лучше понять настоящее изобретение, следует понимать, что следующие термины, если не указано иное, имеют следующие значения.Unless otherwise indicated herein, scientific and technical terms used in connection with the present invention shall have the meanings commonly understood by those skilled in the art. In addition, the laboratory methods of cell and tissue culture, molecular genetics, oligo- or polynucleotide chemistry, and immunology described herein are well known and widely used in the art. Meanwhile, in order to better understand the present invention, it should be understood that the following terms, unless otherwise indicated, have the following meanings.
Используемый в данном изобретении термин аминокислотная последовательность белка PD1 (белок 1 запрограммированной клеточной смерти, NCBI GenBank: NP_005009.2) охватывает полноразмерный белок PD1 или PD1ECD (внеклеточный сегмент PD1) или PD1ECD-содержащие фрагменты; и также включает слитый белок PD1ECD, например слитый с фрагментами белка Fc IgG мыши или человека (mFc или hFc). Кроме того, специалистам в данной области техники понятно, что аминокислотная последовательность белка PD1 может иметь естественные или искусственные мутации (включая без ограничения замены, делеции и/или вставки), не влияющие на его биологические функции. Следовательно, в данном изобретении термин белок PD1 должен включать все такие последовательности и их природные или искусственные варианты. Кроме того, при описании фрагментов последовательности белка PD1 укаAs used herein, the term PD1 protein amino acid sequence (Programmed Cell Death Protein 1, NCBI GenBank: NP_005009.2) encompasses full-length PD1 protein or PD1ECD (PD1 extracellular segment) or PD1ECD-containing fragments; and also includes a PD1ECD fusion protein, eg fused to mouse or human IgG Fc protein fragments (mFc or hFc). In addition, those skilled in the art will recognize that the amino acid sequence of the PD1 protein may be naturally or artificially mutated (including, without limitation, substitutions, deletions, and/or insertions) without affecting its biological functions. Therefore, in this invention, the term PD1 protein should include all such sequences and their natural or artificial variants. In addition, when describing fragments of the PD1 protein sequence,
- 4 042479 занные фрагменты последовательности включают как фрагменты последовательности, так и соответствующие фрагменты последовательности в ее естественных или искусственных вариантах.- 4 042479 specified sequence fragments include both sequence fragments and corresponding sequence fragments in its natural or artificial variants.
Используемый в данном изобретении термин аминокислотная последовательность белка PDL1 (лиганд 1 запрограммированной клеточной смерти, NCBI Genebank ID: NP_054862.1) охватывает полноразмерный белок PDL1 или PDL1ECD (внеклеточный сегмент PDL1) или PDL1ECD-содержащие фрагменты; и также включает слитый белок PDL1ECD, например слитый с фрагментами белка Fc IgG мыши или человека (mFc или hFc). Кроме того, специалистам в данной области техники понятно, что аминокислотная последовательность белка PDL1 может иметь естественные или искусственные мутации (включая без ограничения замены, делеции и/или вставки), не влияющие на его биологические функции. Следовательно, в данном изобретении термин белок PDL1 должен включать все такие последовательности и их природные или искусственные варианты. Кроме того, при описании фрагментов последовательности белка PDL1 указанные фрагменты последовательности включают как фрагменты последовательности, так и соответствующие фрагменты последовательности в ее естественных или искусственных вариантах.As used herein, the term PDL1 protein amino acid sequence (programmed cell death ligand 1, NCBI Genebank ID: NP_054862.1) encompasses the full-length PDL1 protein or PDL1ECD (extracellular segment of PDL1) or PDL1ECD-containing fragments; and also includes a PDL1ECD fusion protein, eg fused to mouse or human IgG Fc protein fragments (mFc or hFc). In addition, those skilled in the art will appreciate that the amino acid sequence of the PDL1 protein may be naturally or artificially mutated (including, without limitation, substitutions, deletions, and/or insertions) without affecting its biological functions. Therefore, in this invention, the term PDL1 protein should include all such sequences and their natural or artificial variants. In addition, when describing sequence fragments of the PDL1 protein, said sequence fragments include both sequence fragments and corresponding sequence fragments in natural or artificial variants.
Используемый в данном изобретении термин ЕС50 относится к концентрации для обеспечения 50% максимального эффекта.Used in this invention, the term EC 50 refers to the concentration to provide 50% of the maximum effect.
Используемый в данном изобретении термин антитело относится к белкам иммуноглобулинов, которые обычно состоят из двух пар полипептидных цепей (каждая пара имеет легкую (L) цепь и тяжелую (Н) цепь). Легкие цепи классифицируются как легкие цепи к и λ. Тяжелые цепи классифицируются как μ, δ, γ, α и ε и, соответственно, определяют изотип антитела как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE. В легких цепях и тяжелых цепях вариабельные области и константные области связаны J-областью, состоящей из около 12 или более аминокислот. Тяжелая цепь также содержит область D-область с около 3 или более аминокислотами. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область (VH) и константную область (СН), которая состоит из 3 доменов (СН1, СН2 и СН3). Каждая легкая цепь содержит вариабельную область (VL) и константную область (CL), которая состоит из одного домена CL. Константная область может опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и компонент 1q (C1q) комплемента классической системы комплемента. VH и VL также могут быть подразделены на области с высокой изменчивостью (называемые областью, определяющей комплементарность (CDR)), которые разделены относительно консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). От аминоконца до карбоксильного конца каждая VH и VL состоит из 3 CDR и 4 FR в порядке FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Вариабельные области (VH и VL) тяжелой цепи и легкой цепи образуют сайт связывания антитела. Распределение аминокислот по областям или доменам соответствует определениям Kabat в Sequences of Proteins of Immunological Interest (Национальный институт здоровья Бетесда, штат Мэриленд (1987 и 1991)) или Chothia & Lesk (1987), Mol. Biol., 196:901-917; или Chothia et al. (1989), Nature, 342:878-883. Термин антитело не ограничен каким-либо конкретным способом их получения. Например, он включает, в частности, рекомбинантные антитела, моноклональные антитела и поликлональные антитела. Антитела могут быть разных изотипов, например антителами IgG (такие как подтипы IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM.As used herein, the term antibody refers to immunoglobulin proteins, which typically consist of two pairs of polypeptide chains (each pair having a light (L) chain and a heavy (H) chain). Light chains are classified as k and λ light chains. Heavy chains are classified as μ, δ, γ, α and ε and define the antibody isotype as IgM, IgD, IgG, IgA and IgE respectively. In light chains and heavy chains, the variable regions and constant regions are linked by a J region of about 12 or more amino acids. The heavy chain also contains a D-region with about 3 or more amino acids. Each heavy chain contains a variable region (VH) and a constant region ( CH ), which consists of 3 domains ( CH 1, CH2 and CH 3). Each light chain contains a variable region (VL) and a constant region (CL), which consists of a single CL domain. The constant region can mediate the binding of an immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (eg, effector cells) and the complement component 1q (C1q) of the classical complement system. VH and VL can also be subdivided into regions of high variability (called the complementarity determining region (CDR)), which are separated by relatively conserved regions, called framework regions (FR). From the amino end to the carboxyl end, each V H and V L consists of 3 CDRs and 4 FRs in the order FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4. The variable regions (VH and VL) of the heavy chain and light chain form the binding site of the antibody. The distribution of amino acids by region or domain follows Kabat's definitions in Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health Bethesda, MD (1987 and 1991)) or Chothia & Lesk (1987), Mol. Biol., 196:901-917; or Chothia et al. (1989), Nature, 342:878-883. The term antibody is not limited to any particular method for their preparation. For example, it includes, in particular, recombinant antibodies, monoclonal antibodies and polyclonal antibodies. Antibodies can be of different isotypes, for example IgG antibodies (such as IgGl, IgG2, IgG3 or IgG4 subtypes), IgA1, IgA2, IgD, IgE or IgM.
Используемый в данном изобретении термин антигенсвязывающие фрагменты относится к полипептиду, содержащему фрагменты полноразмерного антитела, сохраняющему способность специфически связываться с тем же антигеном и/или конкурировать с полноразмерным антителом за связывание с антигеном, который также называют антигенсвязывающей частью. См. Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed. 2, Raven Press, N. Y. (1989)), включая всю статью и ссылки в данном изобретении для всех целей. Антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены методами рекомбинантной ДНК или расщеплением интактных антител протеолитическими ферментами или химическими веществами. В некоторых случаях антигенсвязывающие фрагменты включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb и CDR, одноцепочечные антитела (например, scFv), химерные антитела, диатела и полипептиды, которые по меньшей мере содержат часть антитела, достаточную для придания специфической антигенсвязывающей способности полипептидам.As used herein, the term antigen-binding fragments refers to a polypeptide containing fragments of a full-length antibody that retains the ability to specifically bind to the same antigen and/or compete with the full-length antibody for binding to the antigen, also referred to as the antigen-binding portion. See Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed. 2, Raven Press, NY (1989)), including the entire article and references in this invention for all purposes. Antigen-binding fragments can be generated by recombinant DNA techniques or by digestion of intact antibodies with proteolytic enzymes or chemicals. In some instances, antigen-binding fragments include Fab, Fab', F(ab') 2 , Fd, Fv, dAb, and CDR fragments, single chain antibodies (eg, scFv), chimeric antibodies, diabodies, and polypeptides that contain at least a portion of an antibody, sufficient to confer specific antigen-binding ability to the polypeptides.
В некоторых случаях антигенсвязывающий фрагмент представляет собой диатело, а именно фрагмент димерного антитела, чьи домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, однако из-за использования слишком короткого линкера, чтобы позволить спаривание между двумя доменами той же цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами в другой цепи с образованием двух антигенсвязывающих сайтов (см., например, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:6444-6448 (1993); и Poljak R.J. et al., Structure 2: 1121-1123 (1994)).In some cases, the antigen-binding fragment is a diabody, namely a dimeric antibody fragment whose V H and V L domains are expressed on the same polypeptide chain, however, due to the use of a linker too short to allow pairing between two domains on the same chain, the domains are forced to pair. with complementary domains in the other strand to form two antigen binding sites (see, for example, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:6444-6448 (1993); and Poljak RJ et al. , Structure 2: 1121-1123 (1994)).
Используя обычные методики, известные специалистам в данной области техники (такие как технология рекомбинантных ДНК или ферментативное/химическое расщепление), антигенсвязывающий фрагмент (такой как описанные выше фрагменты антител) может быть получен из данного антитела (например, моноклональные антитела 14С12, 14C12H1L1, предоставленные в данном изобретении) и проведен его скрининг на специфичность таким же образом, как и для полноразмерного антитела.Using conventional techniques known to those skilled in the art (such as recombinant DNA technology or enzymatic/chemical digestion), an antigen-binding fragment (such as the antibody fragments described above) can be obtained from a given antibody (e.g., monoclonal antibodies 14C12, 14C12H1L1 provided in of this invention) and screened for specificity in the same manner as for a full-length antibody.
- 5 042479- 5 042479
В данном изобретении, если не указано иное, термин антитело относится не только к интактному антителу, но также к антигенсвязывающим фрагментам антитела.In this invention, unless otherwise indicated, the term antibody refers not only to an intact antibody, but also to antigen-binding fragments of an antibody.
Используемые в данном изобретении термины mAb и моноклональные антитела относятся к антителу или фрагменту антитела, полученному из группы высокогомологичных антител, т.е. из группы идентичных молекул антител за исключением мутаций, которые могут возникать самопроизвольно. Моноклональное антитело обладает высокой специфичностью в отношении одного эпитопа на антигене. Поликлональные антитела отличаются от моноклональных антител, содержащих по меньшей мере 2 или более разных антител, которые обычно распознают разные эпитопы на антигене. Моноклональные антитела могут быть получены с помощью гибридомной технологии, о которой первоначально сообщалось Kohler et al. (Nature, 256:495 (1975)), а также технологии рекомбинантных ДНК (см. патент США 4816567).As used herein, the terms mAb and monoclonal antibody refer to an antibody or antibody fragment derived from a group of highly homologous antibodies, i. from a group of identical antibody molecules, with the exception of mutations that may occur spontaneously. A monoclonal antibody is highly specific for one epitope on an antigen. Polyclonal antibodies are distinct from monoclonal antibodies containing at least 2 or more different antibodies, which typically recognize different epitopes on an antigen. Monoclonal antibodies can be obtained using hybridoma technology, which was originally reported by Kohler et al. (Nature, 256:495 (1975)), as well as recombinant DNA technology (see US patent 4816567).
Используемый в данном изобретении термин гуманизированное антитело относится к антителу или его фрагментам, полученным из иммуноглобулина человека (рецепторное антитело), чьи CDR или часть CDR заменены областями CDR антитела, полученного не от человека (донорное антитело), причем донорское антитело может представлять собой антитело, не относящееся к антителу человека (например, мыши, крысы или кролика) с предсказуемой специфичностью, аффинностью связывания или реакционной способностью. Кроме того, некоторые аминокислотные остатки каркасной области (FR) рецепторного антитела также могут быть заменены соответствующими аминокислотными остатками, не относящимися к человеку, или заменены аминокислотными остатками других антител для дальнейшего улучшения или оптимизации эффективности антитела. Для более подробной информации о гуманизированных антителах, см., например, Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992); и Clark, Immunol. Today, 21:397-402 (2000).As used herein, the term humanized antibody refers to an antibody or fragments thereof derived from a human immunoglobulin (receptor antibody) whose CDRs or part of the CDRs have been replaced by CDR regions of a non-human derived antibody (donor antibody), wherein the donor antibody may be an antibody non-human (eg, mouse, rat, or rabbit) antibody with predictable specificity, binding affinity, or reactivity. In addition, some framework region (FR) amino acid residues of a receptor antibody can also be replaced with corresponding non-human amino acid residues or amino acid residues of other antibodies to further improve or optimize antibody performance. For more information on humanized antibodies, see, for example, Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992); and Clark, Immunol. Today, 21:397-402 (2000).
Используемый в данном изобретении термин изолят или выделенный означает полученный искусственным путем в естественном состоянии. Если в природе существует определенный вид выделенного вещества или компонента, он может получаться из-за изменения его естественной среды или изолироваться из естественной среды или и тем, и другим. Например, полинуклеотид или полипептид в естественном существовании у живого животного будет называться выделенным, если он был выделен с высокой степенью чистоты в том же естественном состоянии. Термин выделять или выделенный не исключает наличия искусственного или синтетического вещества или других примесей, которые не влияют на активность.As used in this invention, the term isolate or isolated means artificially obtained in a natural state. If a certain kind of isolated substance or component exists in nature, it may be produced due to a change in its natural environment, or isolated from the natural environment, or both. For example, a polynucleotide or polypeptide in its natural state in a living animal will be said to be isolated if it has been isolated with a high degree of purity in the same natural state. The term isolated or isolated does not exclude the presence of an artificial or synthetic substance or other impurities that do not interfere with activity.
Используемый в данном изобретении термин вектор относится к носителю для доставки нуклеиновой кислоты, который может быть введен с полинуклеотидом. Вектор, который может содержать белок, который кодируется экспрессируемым введенным полинуклеотидом, называется вектором экспрессии. Векторы могут быть введены в клетку-хозяина путем трансформации, трансдукции или трансфекции, поэтому генетические вещества, переносимые вектором, могут быть экспрессированы в клеткехозяине. Векторы хорошо известны техническому персоналу в данной области техники, включая без ограничения плазмиду; фазмиду; космиду; искусственную хромосому, такую как дрожжевая искусственная хромосома (YAC), бактериальная искусственная хромосома (ВАС) или искусственная хромосома, полученная из Р1 (РАС); фаг, такой как фаг λ или фаг М13, а также вирусы животных и т.д. Вирусы животных могут включать в себя без ограничения вирус с обратной транскриптазой (включая лентивирус), аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирус герпеса (например, вирус простого герпеса), вирус ветряной оспы, бакуловирус, папилломавирус и паповавирус (такой как SV40). Вектор может содержать множество компонентов, которые контролируют экспрессию, включая без ограничения промотор, фактор инициации транскрипции, энхансер, селективный элемент и репортерный ген. Кроме того, вектор также может содержать сайт инициации репликации.As used herein, the term vector refers to a nucleic acid delivery vehicle that can be introduced with a polynucleotide. A vector that can contain a protein that is encoded by the introduced polynucleotide to be expressed is called an expression vector. Vectors can be introduced into a host cell by transformation, transduction, or transfection so that the genetic substances carried by the vector can be expressed in the host cell. Vectors are well known to those of skill in the art, including, without limitation, the plasmid; phasmid; cosmid; an artificial chromosome such as a yeast artificial chromosome (YAC), a bacterial artificial chromosome (BAC), or a P1-derived artificial chromosome (PAC); phage such as λ phage or M13 phage, as well as animal viruses, etc. Animal viruses can include, without limitation, reverse transcriptase virus (including lentivirus), adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus (eg, herpes simplex virus), varicella-zoster virus, baculovirus, papillomavirus, and papovavirus (such as SV40). The vector may contain a variety of components that control expression, including, but not limited to, a promoter, a transcription initiation factor, an enhancer, a selection element, and a reporter gene. In addition, the vector may also contain an origin of replication.
Используемый в данном изобретении термин клетка-хозяин относится к клеткам, которые могут импортировать векторы, включая без ограничения прокариотические клетки, такие как Е. coli и Bacillus subtilis, клетки грибов, такие как дрожжи и Aspergillus, клетки насекомых, такие как клетки дрозофилы S2 и Sf9, или клетки животных, такие как клетки фибробластов, клетки СНО, клетки COS, клетки NSO, клетки HeLa, клетки ВНК, клетки HEK293 или клетки человека.As used herein, the term host cell refers to cells that can import vectors, including, but not limited to, prokaryotic cells such as E. coli and Bacillus subtilis, fungal cells such as yeast and Aspergillus, insect cells such as Drosophila S2 cells, and Sf9, or animal cells such as fibroblast cells, CHO cells, COS cells, NSO cells, HeLa cells, BHK cells, HEK293 cells, or human cells.
Используемый в данном изобретении термин специфическое связывание относится к неслучайному связыванию между двумя молекулами, такому как взаимодействие между антителом и его антигеном-мишенью. В некоторых вариантах осуществления специфическое связывание антитела с антигеном означает аффинность (KD), например, менее чем около 10-5 М, в частности менее чем 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 М или менее.As used herein, the term specific binding refers to non-random binding between two molecules, such as an interaction between an antibody and its target antigen. In some embodiments, specific binding of an antibody to an antigen means an affinity (KD), e.g., less than about 10 -5 M, such as less than 10 -6 , 10 -7 , 10 -8 , 10 -9 , 10 -10 M, or less.
Используемый в данном изобретении термин KD относится к константе равновесия диссоциации специфического взаимодействия между антителом и антигеном для описания аффинности связывания между антителами и антигенами. Чем меньше константа диссоциации равновесия, тем сильнее антитело связывается с антигеном, тем выше аффинность между антителом и антигеном. Как правило, антитела (например, моноклональные антитела 14С12, 14C12H1L1 в данном изобретении) связываются с антигенами (например, белок PD1) с KD менее чем приблизительно 10-5 М, например менее чем 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 или 10-10 М, или даже менее. KD может быть измерена любым методом, хорошо известным техниче- 6 042479 скому персоналу в данной области техники, например, с использованием системы Fortebio Octet. Используемые в данном изобретении термины моноклональное антитело и mAb имеют одинаковое значение и используются взаимозаменяемо; термины поликлональное антитело и PcAb имеют одинаковое значение и используются взаимозаменяемо; термины полипептид и белок имеют одинаковое значение и используются взаимозаменяемо. Также в данном изобретении аминокислоты обычно представлены однобуквенными или трехбуквенными сокращениями, известными в данной области техники. Например, аланин может быть представлен как А или Ala.As used herein, the term KD refers to the dissociation equilibrium constant of a specific interaction between an antibody and an antigen to describe the binding affinity between antibodies and antigens. The smaller the equilibrium dissociation constant, the stronger the antibody binds to the antigen, the higher the affinity between the antibody and antigen. Typically, antibodies (eg, monoclonal antibodies 14C12, 14C12H1L1 in this invention) bind to antigens (eg, PD1 protein) with a KD of less than about 10 -5 M, for example, less than 10 -6 , 10 -7 , 10 -8 . 10 -9 or 10 -10 M, or even less. KD can be measured by any method well known to those of skill in the art, such as using the Fortebio Octet system. Used in this invention, the terms monoclonal antibody and mAb have the same meaning and are used interchangeably; the terms polyclonal antibody and PcAb have the same meaning and are used interchangeably; the terms polypeptide and protein have the same meaning and are used interchangeably. Also in this invention, amino acids are usually represented by one-letter or three-letter abbreviations known in the art. For example, alanine can be represented as A or Ala.
Используемые в данном изобретении термины гибридома и линия клеток гибридомы могут использоваться взаимозаменяемо и, когда упоминаются в данном документе, включают субклон и клеткипотомки гибридомы. Например, когда упомянута в данном документе, линия клеток гибридомы LT003 также включает субклон и клетки-потомки LT003.As used herein, the terms hybridoma and hybridoma cell line may be used interchangeably and, when referred to herein, include subclone and hybridoma progeny cells. For example, when referred to herein, the LT003 hybridoma cell line also includes the LT003 subclone and progeny cells.
Используемый в данном изобретении термин фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент относится к носителю и/или эксципиенту, фармацевтически и/или физиологически совместимому с субъектами и активными ингредиентами и широко признанному в данной области техники (Remington's Pharmaceutical Sciences, Edited by Gennaro AR, 19th ed., Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995), включая без ограничения регуляторы рН, поверхностно-активные вещества, адъюванты и усилители ионной силы. Например, регуляторы рН включают без ограничения фосфатный буферный раствор; поверхностно-активные вещества включают без ограничения катионные, анионные или неионные поверхностно-активные вещества, такие как Твин-80; усилители ионной силы включают без ограничения хлорид натрия.As used herein, the term pharmaceutically acceptable carrier or excipient refers to a carrier and/or excipient that is pharmaceutically and/or physiologically compatible with the subjects and active ingredients and is widely recognized in the art (Remington's Pharmaceutical Sciences, Edited by Gennaro AR, 19th ed., Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995), including, without limitation, pH adjusters, surfactants, adjuvants, and ionic strength enhancers. For example, pH adjusters include, without limitation, phosphate buffer; surfactants include, without limitation, cationic, anionic, or nonionic surfactants such as Tween-80; ionic strength enhancers include, without limitation, sodium chloride.
Используемый в данном изобретении термин эффективная доза определяется как количество терапевтического средства, достаточное для достижения или, по меньшей мере, частичного достижения желаемого эффекта. Например, эффективная профилактическая доза (например, для рака) представляет собой количество для предотвращения, остановки или задержки возникновения заболеваний (например, рака); эффективная доза лечения представляет собой количество, которое излечивает или, по меньшей мере, частично, останавливает заболевание и его осложнения у пациентов с заболеванием. Определение такой эффективной дозы полностью находится в пределах возможностей технического персонала в данной области техники. Например, эффективная доза лечения будет зависеть от тяжести заболевания, общего состояния иммунной системы пациента, общего состояния пациентов, такого как возраст, масса и пол, способа введения указанного лекарственного средства и других сопутствующих методов лечения и т.п.Used in this invention, the term effective dose is defined as the amount of therapeutic agent sufficient to achieve or at least partially achieve the desired effect. For example, an effective prophylactic dose (eg, for cancer) is an amount to prevent, stop, or delay the onset of diseases (eg, cancer); an effective dose of treatment is an amount that cures or at least partially stops the disease and its complications in patients with the disease. Determination of such an effective dose is entirely within the ability of technical personnel in the art. For example, the effective dose of treatment will depend on the severity of the disease, the general immune system of the patient, the general condition of the patients such as age, weight and sex, the route of administration of said drug and other concomitant treatments, and the like.
Эффекты изобретения.effects of the invention.
Моноклональные антитела по данному изобретению, особенно 14C12H1L1, способны специфически связываться с PD1, эффективно блокируя связывание PD1 с PDL1 и ослабляя иммуносупрессию PD1 для активации Т-лимфоцитов. При этом антитело 14C12H1L1 против PD1 может индуцировать секрецию ИФН-γ и ИЛ-2 намного лучше, чем контрольное антитело 5С4 (5С4: PD1 антитело от Medarex Inc.: Alan J.Korman, et al., Human monoclonal antibodies to programmed death 1 (PD1) and methods for treating cancer using anti-PDl antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics, патент США № US 8008449 В2). Моноклональные антитела по данному изобретению, особенно 14C12H1L1, обладают противоопухолевым эффектом, эквивалентным одобренному препарату ниволумаб для той же мишени. Антитела по данному изобретению обладают потенциалом стать или быть использованными в изготовлении в лекарственных средствах для профилактики и/или лечения немелкоклеточного рака легкого, почечноклеточного рака, рака яичника, меланомы, лейкоза или анемии.The monoclonal antibodies of this invention, especially 14C12H1L1, are able to specifically bind to PD1, effectively blocking the binding of PD1 to PDL1 and attenuating PD1 immunosuppression to activate T-lymphocytes. At the same time, the anti-PD1 antibody 14C12H1L1 can induce the secretion of IFN-γ and IL-2 much better than the control antibody 5C4 (5C4: PD1 antibody from Medarex Inc.: Alan J. Korman, et al., Human monoclonal antibodies to programmed death 1 ( PD1) and methods for treating cancer using anti-PDl antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics, US Patent No. US 8008449 B2). The monoclonal antibodies of this invention, especially 14C12H1L1, have an antitumor effect equivalent to the approved nivolumab for the same target. The antibodies of this invention have the potential to be or be used in medicaments for the prevention and/or treatment of non-small cell lung cancer, renal cell cancer, ovarian cancer, melanoma, leukemia, or anemia.
Описание чертежейDescription of drawings
На фиг. 1 представлены результаты электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН (SDS-PAGE) гуманизированного моноклонального антитела 14C12H1L1. Слева направо: 1 - 1 мкг антитела в невосстановленном загрузочном буфере; 2 - 1 мкг антитела в восстановленном загрузочном буфере; 5 мкл маркера; 3 - 1 мкг БСА.In FIG. 1 shows the results of SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) of the humanized monoclonal antibody 14C12H1L1. Left to right: 1 - 1 μg antibody in unreconstituted loading buffer; 2 - 1 μg of antibody in reconstituted loading buffer; 5 µl marker; 3 - 1 mcg of BSA.
На фиг. 2 показана кинетика связывания антитела 14С12.In FIG. 2 shows the binding kinetics of the 14C12 antibody.
На фиг. 3 - кинетика связывания антитела 14C12H1L1.In FIG. 3 - kinetics of binding of antibody 14C12H1L1.
На фиг. 4 - кинетика связывания антитела 5С4.In FIG. 4 - 5C4 antibody binding kinetics.
На фиг. 5 представлены результаты ИФА по связыванию 14C12H1L1 и 5С4 с PD1.In FIG. 5 shows the results of ELISA for the binding of 14C12H1L1 and 5C4 to PD1.
На фиг. 6 - результаты конкурентного ИФА по связыванию 14C12H1L1 и 5С4 с PD1 в сравнении с PDL1.In FIG. 6 - results of competitive ELISA for binding of 14C12H1L1 and 5C4 to PD1 in comparison with PDL1.
На фиг. 7 показана ЕС50 связывания 14C12H1L1 с PD1 на поверхности клеток 293T-PD1.In FIG. 7 shows EC 50 of 14C12H1L1 binding to PD1 on the surface of 293T-PD1 cells.
На фиг. 8 - активность связывания 14C12H1L1 с поверхностным антигеном PD1 Т-клеток.In FIG. 8 - 14C12H1L1 binding activity to PD1 surface antigen of T cells.
На фиг. 9 показано влияние 14C12H1L1 на секрецию ИФН-γ смешанных лимфоцитов.In FIG. 9 shows the effect of 14C12H1L1 on the secretion of IFN-γ mixed lymphocytes.
На фиг. 10 - влияние 14C12H1L1 на секрецию ИЛ-2 смешанных лимфоцитов.In FIG. 10 - the effect of 14C12H1L1 on the secretion of IL-2 mixed lymphocytes.
На фиг. 11 - влияние 14C12H1L1 на секрецию цитокина ИЛ-2, индуцированную смешением клеток РВМС, MDA-MB-2 31 и Raji.In FIG. 11 - Effect of 14C12H1L1 on IL-2 cytokine secretion induced by admixture of PBMC, MDA-MB-2 31 and Raji cells.
На фиг. 12 - влияние 14C12H1L1 на рост опухоли в модели опухоли МС38 у мышей PD-1 HuGEMM.In FIG. 12 - Effect of 14C12H1L1 on tumor growth in the MC38 tumor model in PD-1 HuGEMM mice.
- 7 042479- 7 042479
Линия клеток гибридомы LT003 была задепонирована в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) в университете Ухань, г. Ухань, Китай, 430072, 16 июня 2015 г., с депозитарным номером доступа ССТСС: С2015105.The LT003 hybridoma cell line was deposited with the China Type Culture Collection Center (CCTCC) at Wuhan University, Wuhan, China, 430072 on June 16, 2015, with CCCCC Deposit Accession Number: C2015105.
Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention
Изобретение далее будет описано подробно. Как будет понятно специалисту в данной области техники, следующие примеры используются только для описания изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Случаи без конкретного описания методов или условий были выполнены в соответствии с литературой в данной области техники (например, Guide to Molecular Cloning, под авторством J. Sambrook et al., переведен Peitang Huang et al., third Edition, Science Press) или в соответствии с инструкцией по применению продукта. Все реагенты или инструменты без указания изготовителя представляли собой обычные продукты, имеющиеся в продаже.The invention will now be described in detail. As will be understood by a person skilled in the art, the following examples are used only to describe the invention and should not be construed as limiting the scope of the invention. Cases without specific description of methods or conditions were performed according to the literature in the art (e.g., Guide to Molecular Cloning, by J. Sambrook et al., translated by Peitang Huang et al., third Edition, Science Press) or according to with instructions for using the product. All reagents or instruments without a manufacturer's name were common commercially available products.
В приведенных ниже примерах используемые Т-клетки были получены от Akeso Biopharma, Inc.; мыши BALB/C были приобретены в Медицинском центре животных провинции Гуандун. Используемые мыши PD-1 HuGEMM были получены от Nanjing Galaxy Biopharma Co., Ltd.; клетки МС3 8 были получены из шанхайского клеточного центра Fudan IBS; коммерческий препарат против той же мишени используемый ниволумаб (Opdivo®), был получен от Bristol-Myers Squibb Company.In the examples below, the T cells used were obtained from Akeso Biopharma, Inc.; BALB/C mice were purchased from Guangdong Animal Medical Center. The PD-1 HuGEMM mice used were obtained from Nanjing Galaxy Biopharma Co., Ltd.; MC38 cells were obtained from Shanghai Fudan IBS Cell Center; a commercial drug against the same target, used nivolumab (Opdivo®), was obtained from the Bristol-Myers Squibb Company.
Пример 1. Получение линии клеток гибридомы LT003 и получение моноклонального антитела 14С12.Example 1 Preparation of LT003 hybridoma cell line and production of monoclonal antibody 14C12.
1. Создание линии клеток гибридомы LT003.1. Creation of the LT003 hybridoma cell line.
Используется PD1-mFc (PD1: белок 1 запрограммированной клеточной смерти, NCBI GenBank ID: NP_005009.2) слитый белок в качестве антигена и слитые спленоциты иммунизированных мышей BALB/C (приобретенных в Медицинском центре животных провинции Гуандун) и клетки миеломы мыши в клетки гибридомы с помощью общепринятого в настоящее время метода (например, Stewart, S.J., Monoclonal Antibody Production, в Basic Methods in antibody Production and Characterization, Eds.G.C. Howard and D.R. Bethell, Boca Raton: CRC Press, 2000).Used PD1-mFc (PD1: programmed cell death protein 1, NCBI GenBank ID: NP_005009.2) fusion protein as antigen and fused splenocytes from immunized BALB/C mice (purchased from Guangdong Animal Medical Center) and mouse myeloma cells into hybridoma cells using a currently accepted method (e.g., Stewart, S.J., Monoclonal Antibody Production, in Basic Methods in antibody Production and Characterization, Eds.G.C. Howard and D.R. Bethell, Boca Raton: CRC Press, 2000).
Покрывали микропланшет PD1-mFc в качестве антигена и подвергали скринингу клетки гибридомы с помощью опосредованного ИФА для получения клеток гибридомы, которые секретируют новые антитела, специфически связывающиеся с PD1.The microplate was coated with PD1-mFc as antigen and hybridoma cells were screened with mediated ELISA to obtain hybridoma cells that secrete new antibodies that specifically bind to PD1.
При скрининге получали линии клеток гибридомы, способные секретировать моноклональные антитела, связывающиеся с PD1, посредством конкурентного ИФА против слитого белка лиганд PDL1-hFc (PDL1: лиганд 1 белка запрограммированной клеточной смерти, NCBI Genebank ID: NP 054862.1), и получали стабильные клеточные линии гибридомы методом ограниченного разведения, а затем получали стабильные линии клеток LT003 методом ограниченного разведения (моноклональное антитело, секретируемое из LT003, называется 14С12).In screening, hybridoma cell lines capable of secreting PD1-binding monoclonal antibodies were obtained by competitive ELISA against PDL1-hFc ligand fusion protein (PDL1: programmed cell death protein ligand 1, NCBI Genebank ID: NP 054862.1), and stable hybridoma cell lines were obtained by the limited dilution method, and then stable LT003 cell lines were obtained by the limited dilution method (the monoclonal antibody secreted from LT003 is called 14C12).
Линия клеток гибридомы LT003 (PD1-14C12) была задепонирована в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) в университете Ухань, г. Ухань, Китай, 430072, 16 июня 2015 г., с депозитарным номером доступа ССТСС: С2015105.The LT003 hybridoma cell line (PD1-14C12) was deposited with the China Type Culture Collection Center (CCTCC) at Wuhan University, Wuhan, China, 430072 on June 16, 2015, with CCCCC Deposit Accession Number: C2015105.
2. Получение моноклонального антитела 14С12.2. Obtaining a monoclonal antibody 14C12.
Линию клеток LT003 в данном изобретении культивировали с использованием среды IMDM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки с низким содержанием IgG, в течение 7 суток, а затем собирали и очищали супернатант культуры клеток для получения антитела 14С12.The LT003 cell line of the present invention was cultured using IMDM medium containing 10% low IgG fetal bovine serum for 7 days, and then the cell culture supernatant was harvested and purified to obtain 14C12 antibody.
Пр имер 2. Получение последовательностей легкой цепи и тяжелой цепи моноклонального антитела 14С12.Example 2 Preparation of light chain and heavy chain sequences for monoclonal antibody 14C12.
Экстрагировали мРНК из линии клеток гибридомы LT003, полученной в примере 1 выше, в соответствии с руководством для набора реагентов для выделения общей клеточной/бактериальной РНК (Tiangen, продукт № DP430).Extracted mRNA from the hybridoma cell line LT003, obtained in example 1 above, in accordance with the manual for the kit of reagents for isolation of total cellular/bacterial RNA (Tiangen, product no. DP430).
Синтезировали кДНК в соответствии с руководством для системы синтеза первой цепи Invitrogen Superscript® III для набора ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскриптазой) и проводили амплификацию ПЦР.cDNA was synthesized according to the manual for the Invitrogen Superscript® III First Strand Synthesis System for RT-PCR Kit (Reverse Transcriptase PCR) and PCR amplification was performed.
Непосредственно проводили ТА-клонирование с использованием продуктов амплификации ПЦР в соответствии с инструкциями набора для клонирования pEASY-T1 (Transgen CT101).TA cloning was performed directly using PCR amplification products according to the instructions of the pEASY-T1 cloning kit (Transgen CT101).
Секвенировали продукты ТА-клонирования и получили следующие результаты.The TA cloning products were sequenced and the following results were obtained.
Результаты секвенирования ДНК VH: (354 п. о.).VH DNA sequencing results: (354 bp).
GAGGTCAAACTGGTGGAGAGCGGCGGCGGGCTGGTGAAGCCCGGCGGGTCACTGAAACTGAGGTCAAACTGGTGGAGAGCGGCGGCGGGCTGGTGAAGCCCGGCGGGTCACTGAAACT
GAGCTGCGCCGCTTCCGGCTTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCATGGGTGAGGCAGACCCCTGAGCTGCGCCGCTTCCGGCTTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCATGGGTGAGGCAGACCCCT
GAGAAGCGCCTGGAATGGGTCGCTACTATCAGCGGAGGCGGGCGATACACCTACTATCCTGACTGAGAAGCGCCTGGAATGGGTCGCTACTATCAGCGGAGGCGGGCGATACACCTACTATCCTGACT
С Т G Т СAAAG G GAGАТ Т САСААТ ТAG Т С G G GATAAC G С СAGАААТAC TCTGTATCTGCAGATGTCC T G T CAAAG G GAGAT T CACAAT TAG T C G G GATAAC G C CAGAAAATAC TCTGTATCTGCAGATGTC
TAGTCTGCGGTCCGAGGATACAGCTCTGTACTATTGTGCAAACCGGTACGGCGAAGCATGGTTTTAGTCTGCGGTCCGAGGATACAGCTCTGTACTATTGTGCAAACCGGTACGGCGAAGCATGGTTT
GCCTATTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACAGTCTCTGCC(SEQ ID NO: 1)GCCTATTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACAGTCTCTGCC(SEQ ID NO: 1)
- 8 042479- 8 042479
Закодированная последовательность белка: (118 а. к.).Encoded protein sequence: (118 a.k.).
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVATISGGGRYTYEVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVATISGGGRYTY
YPDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 2)YPDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 2)
Результаты секвенирования ДНК VL: (318 п. о.).VL DNA sequencing results: (318 bp).
GACATTAAGATGACACAGTCCCCTTCCTCAATGTACGCTAGCCTGGGCGAGCGAGTGACGACATTAAGATGACACAGTCCCCTTCCTCAATGTACGCTAGCCTGGGCGAGCGAGTGAC
CTTCACATGCAAAGCATCCCAGGACATCAACACATACCTGTCTTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGCCTTCACATGCAAAGCATCCCAGGACATCAACACATACCTGTCTTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGC
AAAAGCCCCAAGACCCTGATCTACCGGGCCAATAGACTGGTGGACGGGGTCCCCAGCAGATTCTAAAAGCCCCAAGACCCTGATCTACCGGGCCAATAGACTGGTGGACGGGGTCCCCAGCAGATTCT
CCGGATCTGGCAGTGGGCAGGATTACTCCCTGACCATCAGCTCCCTGGAGTATGAAGACATGGGCCGGATCTGGCAGTGGGCAGGATTACTCCCTGACCATCAGCTCCCTGGAGTATGAAGACATGGG
CATCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCTCTGACCTTTGGAGCAGGCACAAAACTGGAACATCTACTATTGCCCTGCAGTATGATGAGTTCCCTCTGACCTTTGGAGCAGGCACAAAACTGGAA
CTG (SEQ ID NO: 3)CTG (SEQ ID NO: 3)
Закодированная последовательность белка: (106 а. к.).Encoded protein sequence: (106 a.k.).
DIKMTQSPSSMYASLGERVTFTCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPDIKMTQSPSSMYASLGERVTFTCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVP
SRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLTFGAGTKLEL (SEQ ID NO: 4)SRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLTFGAGTKLEL (SEQ ID NO: 4)
2. Получение рекомбинантного моноклонального антитела 14С12 (Re).2. Obtaining a recombinant monoclonal antibody 14C12 (Re).
Отдельно клонировали последовательность кДНК тяжелой цепи (последовательность вариабельной области SEQ ID NO: 1) и последовательность кДНК легкой цепи (последовательность вариабельной области SEQ ID NO: 3) из 14С12 (Re) в вектор pUC57simple (предоставлен GenScript Biotech Corp.) (сайты ферментативного расщепления: XbaI и BamHI) и получили плазмиды pUC57simple-14C12H и pUC57 simple- 14C12L соответственно.The heavy chain cDNA sequence (variable region sequence SEQ ID NO: 1) and the light chain cDNA sequence (variable region sequence SEQ ID NO: 3) were cloned separately from 14C12 (Re) into the pUC57simple vector (provided by GenScript Biotech Corp.) (enzymatic cleavage sites : XbaI and BamHI) and obtained plasmids pUC57simple-14C12H and pUC57 simple-14C12L, respectively.
Ферментативно расщепляли (HindIII и EcoRI) плазмиды pUC57simple-14C12H и pUC57simple14C12L соответственно, а затем субклонировали тяжелые и легкие цепи, извлеченные после электрофореза, в вектор pcDNA3.1, экстрагировали обе рекомбинантные плазмиды и котрансфицировали клетки 293F.Plasmids pUC57simple-14C12H and pUC57simple14C12L, respectively, were enzymatically digested (HindIII and EcoRI), and then the heavy and light chains extracted after electrophoresis were subcloned into the pcDNA3.1 vector, both recombinant plasmids were extracted, and 293F cells were co-transfected.
Через 7 суток культивирования клеток супернатант культуры клеток центрифугировали посредством высокоскоростного центрифугирования и фильтровали путем вакуумной фильтрации через микропористую мембрану и загружали в колонку HiTrap MabSelectSuRe, а затем антитело элюировали с помощью буфера для элюции за один этап, а затем пропускали через колонку для обессоливания HiTrap и вымыли в фосфатно-солевой буфер (PBS), a затем было получено рекомбинантное антитело 14С12 (Re) после дополнительной очистки.After 7 days of cell culture, the cell culture supernatant was centrifuged by high-speed centrifugation and filtered by vacuum filtration through a microporous membrane and loaded into a HiTrap MabSelectSuRe column, and then the antibody was eluted with elution buffer in one step, and then passed through a HiTrap desalting column and washed in phosphate-buffered saline (PBS), and then a recombinant 14C12 (Re) antibody was obtained after further purification.
Как подтверждено анализом ИФА на связывающую активность, рекомбинантное антитело 14С12 (Re) имело связывающую активность, эквивалентную антителу 14С12, и, следовательно, может быть далее использовано в последующем конструировании гуманизации антител.As confirmed by ELISA for binding activity, the recombinant 14C12 (Re) antibody had a binding activity equivalent to the 14C12 antibody, and therefore can be further used in the subsequent construction of antibody humanization.
Пример 3. Конструирование последовательностей легкой цепи и тяжелой цепи гуманизированного антитела 14C12H1L1.Example 3 Construction of the Light Chain and Heavy Chain Sequences of the Humanized 14C12H1L1 Antibody.
1. Конструирование последовательностей легкой цепи и тяжелой цепи гуманизированного антитела 14C12H1L1.1. Construction of the light chain and heavy chain sequences of the humanized 14C12H1L1 antibody.
По данным трехмерной кристаллической структуры белка PD1 (Shinohara, T. et al., Structure and chromosomal localization of the human PD1 gene (PDCD1), Genomics, 1995, 23 (3):704-6)) и последовательностей антитела 14С12, полученного в примере 2, с помощью компьютерного моделирования антител, конструировали аминокислотные мутации в соответствии с моделью и получали последовательности вариабельной области антитела 14C12H1L1 (константная область тяжелой цепи представляет собой С-область цепи Ig гамма-1, ACCESSION:P01857; константная область легкой цепи представляет собой С-область Ig каппа-цепи, ACCESSION:P01834), представленную далее.According to the three-dimensional crystal structure of the PD1 protein (Shinohara, T. et al., Structure and chromosomal localization of the human PD1 gene (PDCD1), Genomics, 1995, 23(3):704-6)) and the sequences of the 14C12 antibody obtained in example 2, using computer simulation of antibodies, amino acid mutations were designed according to the model and the sequences of the variable region of the antibody 14C12H1L1 were obtained (heavy chain constant region is the C region of the Ig gamma-1 chain, ACCESSION: P01857; light chain constant region is C kappa chain Ig region, ACCESSION:P01834) below.
Последовательность ДНК вариабельной области тяжелой цепи: (354 п. о.).Heavy chain variable region DNA sequence: (354 bp).
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGCGACTGAAGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGCGACT
GAGCTGCGCAGCTTCCGGATTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCCTGGGTGCGACAGGCACCAGAGCTGCGCAGCTTCCGGATTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCCTGGGTGCGACAGGCACCA
GGAAAGGGACTGGATTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGATACACCTACTATCCTGACAGGAAAGGGACTGGATTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGATACACCTACTATCCTGACA
G С G Т СAAG GGCCGGTT САСААТ СТС TAGAGATAACAG ТAAGAACААТ CTGTATCTGCAGAT GAAG C G T CAAG GGCCGGTT CACAAT CTC TAGAGATAACAG TAAGAACAAT CTGTATCTGCAGAT GAA
CAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCACTGTACTATTGTGCCAACCGCTACGGGGAAGCATGGTTTCAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCACTGTACTATTGTGCCAACCGCTACGGGGAAGCATGGTTT
GCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACAGTCTCTAGT (SEQ ID NO: 5)GCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACAGTCTCTAGT (SEQ ID NO: 5)
Закодированная последовательность белка: (118 а. к.).Encoded protein sequence: (118 a.k.).
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTYEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTY
YPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 6)YPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 6)
- 9 042479- 9 042479
Последовательность ДНК вариабельной области легкой цепи: (321 п. о.).Light chain variable region DNA sequence: (321 bp).
GACATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCATGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACGACATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCATGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCAC
CTTCACATGCCGCGCTAGTCAGGATATCAACACCTACCTGAGCTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGGCTTCACATGCCGCGCTAGTCAGGATATCAACACCTACCTGAGCTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGG
AAAAGCCCCAAGACACTGATCTACCGGGCTAATAGACTGGTGTCTGGAGTCCCAAGTCGGTTCA GTGGCTCAGGGAGCGGACAGGACTACACTCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGGACATGGC AACCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCACTGACCTTTGGCGCCGGGACAAAACTGGAG CTGAAG (SEQ ID NO: 7)(SEQ ID NO: 7)
Закодированная последовательность белка: (107 а. к.).Encoded protein sequence: (107 a.k.).
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVPDIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVP
SRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 8)SRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 8)
Пример 4. Получение и электрофорез SDS-PAGE гуманизированного моноклонального антитела 14C12H1L1.Example 4 Preparation and SDS-PAGE electrophoresis of the humanized monoclonal antibody 14C12H1L1.
Отдельно клонировали кДНК тяжелой цепи (последовательность вариабельной области представляет собой SEQ ID NO: 5, константная область тяжелой цепи представляет собой С-область цепи Ig гамма-1, ACCESSION: P01857) и кДНК легкой цепи (последовательность вариабельной области представляет собой SEQ ID NO 7: константная область легкой цепи представляет собой С-область Ig каппа-цепи, ACCESSION: P01834) 14C12H1L1 в вектор pUC57simple (предоставленный GenScript Biotech Corp.) (сайты ферментативного расщепления: XbaI и BamHI) для получения плазмиды pUC57simple-14С12Н1 и pUC57simple-14C12Ll соответственно. Эти плазмиды субклонировали в вектор pcDNA3.1 соответственно (сайты ферментативного расщепления: XbaI и BamHI), экстрагировали обе рекомбинантные плазмиды и котрансфицировали клетки 293F.Heavy chain cDNA (variable region sequence is SEQ ID NO: 5, heavy chain constant region is Ig gamma-1 chain C region, ACCESSION: P01857) and light chain cDNA (variable region sequence is SEQ ID NO 7) were cloned separately. : light chain constant region is the C region of kappa chain Ig, ACCESSION: P01834) 14C12H1L1 into the pUC57simple vector (provided by GenScript Biotech Corp.) (enzymatic cleavage sites: XbaI and BamHI) to generate plasmid pUC57simple-14C12H1 and pUC57simple-14C12Ll, respectively . These plasmids were subcloned into the pcDNA3.1 vector respectively (enzymatic cleavage sites: XbaI and BamHI), both recombinant plasmids were extracted and co-transfected with 293F cells.
Через 7 суток культивирования клеток культуру клеток центрифугировали посредством высокоскоростного центрифугирования и фильтровали путем вакуумной фильтрации через микропористую мембрану и загружали в колонку HiTrap MabSelectSuRe, а затем антитело элюировали с помощью буфера для элюции за один этап, а затем пропускали через колонку для обессоливания HiTrap и вымыли в буфер PBS, а далее очистили для получения рекомбинантного антитела 14C12H1L1, которое анализировали электрофорезом SDS-PAGE.After 7 days of cell culture, the cell culture was centrifuged by high-speed centrifugation and filtered by vacuum filtration through a microporous membrane and loaded into a HiTrap MabSelectSuRe column, and then the antibody was eluted with elution buffer in one step, and then passed through a HiTrap desalting column and washed in buffer PBS, and further purified to obtain recombinant antibody 14C12H1L1, which was analyzed by SDS-PAGE electrophoresis.
Результаты показаны на фиг. 1, восстановленный целевой белок появился приблизительно при 24,5 и 49 кДа, а невосстановленный целевой белок появился приблизительно при 147 кДа.The results are shown in FIG. 1, the reduced target protein appeared at approximately 24.5 and 49 kDa, and the unreduced target protein appeared at approximately 147 kDa.
Пример 5. Измерения кинетических параметров антител.Example 5 Kinetic Measurements of Antibodies.
Кинетику связывания антитела 14С12 и гуманизированного антитела 14C12H1L1 с антигеном PD1 измеряли с помощью системы Fortebio Octet.The binding kinetics of the 14C12 antibody and the humanized 14C12H1L1 antibody to the PD1 antigen was measured using the Fortebio Octet system.
1. Расщепляли белок PD1-mFc протеазой TEV и получали антиген PD1 путем очистки на колонке.1. Digest PD1-mFc protein with TEV protease and obtain PD1 antigen by column purification.
2. Антиген PD1 (концентрация 1 мкг/мл), меченный биотином, иммобилизовали на поверхности сенсора SA и уравновешивали в буфере PBST, а затем связывали антитела 14С12, 14C12H1L1 и 5С4, и антитела были разбавлены в каждом разведении в три раза относительно предыдущей концентрации начиная с 200 нМ. Диссоциацию антигена и антитела также проводили в PBST.2. PD1 antigen (concentration 1 μg/ml) labeled with biotin was immobilized on the surface of the SA sensor and equilibrated in PBST buffer, and then antibodies 14C12, 14C12H1L1 and 5C4 were bound, and the antibodies were diluted in each dilution three times the previous concentration starting with 200 nM. Dissociation of antigen and antibody was also performed in PBST.
Кинетика связывания антител 14С12, 14C12H1L1 и 5С4 показана в табл. 1 и на фиг. 2, 3 и 4 соответственно. Результаты показали, что как 14С12, так и 14C12H1L1 имеют хорошую аффинность с PD1 с более высокой аффинностью, чем у 5С4.The kinetics of binding of antibodies 14C12, 14C12H1L1 and 5C4 is shown in Table. 1 and in FIG. 2, 3 and 4, respectively. The results showed that both 14C12 and 14C12H1L1 have good affinity for PD1 with higher affinity than 5C4.
Таблица 1Table 1
Динамические параметры антитела 14С12.Dynamic parameters of the 14C12 antibody.
KD: константа диссоциации;K D : dissociation constant;
Kon: скорость связывания антигена и антитела;Ko n : antigen-antibody binding rate;
Kdis: скорость диссоциации антигена и антитела;Kd is : dissociation rate of antigen and antibody;
KD=Kdis/Kon.KD=Kdis/Con.
Пример 6. Активность связывания антитела и антигена PD1, измеренная с помощью опосредованного ИФА.Example 6 Antibody-PD1 antigen binding activity measured by mediated ELISA.
Активности связывания антител 14C12H1L1 и 5С4 с PD1 измеряли отдельно с помощью опосредованного ИФА следующим образом.The binding activities of antibodies 14C12H1L1 and 5C4 with PD1 were measured separately using mediated ELISA as follows.
После инкубации с PD1-mFc при 4°С в течение ночи микропланшет блокировали 1% БСА при 37°С в течение 2 ч, а затем антитела добавляли по отдельности и инкубировали при 37°С в течение 30 мин,After incubation with PD1-mFc at 4°C overnight, the microplate was blocked with 1% BSA at 37°C for 2 h, and then antibodies were added separately and incubated at 37°C for 30 min,
- 10 042479 затем добавляли меченное HRP (пероксидаза хрена) вторичное антитело (козий анти-человеческий IgG (H+L)) (Jackson, 109-035-088) и затем добавляли ТМВ (Neogen, 308177) для прохождения реакции в течение 5 мин и измеряли оптическую плотность при длине волны, равной 450 нм, в считывающем устройстве для микропланшетов.- 10 042479 HRP (horseradish peroxidase) labeled secondary antibody (goat anti-human IgG (H+L)) (Jackson, 109-035-088) was then added and then TMB (Neogen, 308177) was added to run the reaction for 5 min and measured the absorbance at a wavelength of 450 nm in a microplate reader.
Результаты связывания антител 14C12H1L1 и 5С4 с антигеном PD1 показаны на фиг. 5. Как показано на фиг. 5, оба антитела 14C12H1L1 и 5С4 могут эффективно связываться с белком PD1 с зависимостью от дозы. Интенсивности поглощения при разных дозах показаны в табл. 2. С помощью моделирования кривой с использованием результатов количественного анализа в виде значений оптической плотности было определено, что ЕС50 связывания 14C12H1L1 и 5С4 с PD1 определены равными 0,032 и 0,043 нМ соответственно.The results of binding of antibodies 14C12H1L1 and 5C4 to the PD1 antigen are shown in FIG. 5. As shown in FIG. 5, both 14C12H1L1 and 5C4 antibodies can efficiently bind to the PD1 protein in a dose dependent manner. Absorption rates at different doses are shown in Table. 2. By modeling the curve using the results of quantitative analysis in the form of optical density values, it was determined that the EC50 binding of 14C12H1L1 and 5C4 to PD1 was determined to be 0.032 and 0.043 nM, respectively.
Таблица 2table 2
Интенсивности поглощения для связывания 14C12H1L1 и 5С4 с PD1Uptake rates for 14C12H1L1 and 5C4 binding to PD1
Пример 7. Активности связывания антител с антигеном PD1 против PDL1, определенные с помощью конкурентного ИФА.Example 7 Antibody binding activities against PD1 antigen against PDL1 determined by competitive ELISA.
Активности связывания гуманизированных антител 14C12H1L1 и 5С4 с антигеном PD1 против PDL1 измеряли с помощью конкурентного ИФА следующим образом.The binding activities of the humanized 14C12H1L1 and 5C4 antibodies to the anti-PDL1 PD1 antigen were measured by competitive ELISA as follows.
После инкубации с PD1-hFc при 4°С в течение ночи микропланшет блокировали 1% БСА в течение 2 ч, антитела 14C12H1L1 и 5С4 с различными концентрациями (см. табл. 3 для разведенных концентраций) смешивали с PDLl-mFc в течение 10 мин, и смеси инкубировали при 37°С в течение 30 мин, а затем добавляли соответствующие анти-человеческие и анти-мышиные меченые ферментом вторичные антитела соответственно и инкубировали при 37 °С в течение 30 мин. Поглощение на длине волны 450 нм считывали в считывающем устройстве для микропланшетов.After overnight incubation with PD1-hFc at 4°C overnight, the microplate was blocked with 1% BSA for 2 h, 14C12H1L1 and 5C4 antibodies at various concentrations (see Table 3 for diluted concentrations) were mixed with PDL1-mFc for 10 min, and the mixtures were incubated at 37°C for 30 min, and then the respective anti-human and anti-mouse enzyme-labeled secondary antibodies, respectively, were added and incubated at 37°C for 30 min. Absorbance at 450 nm was read in a microplate reader.
Результаты связывания антител 14C12H1L1 и 5С4 с антигеном PD1 показаны на фиг. 6. Как показано на фиг. 6, антитело 14C12H1L1 может конкурировать с PDL1 и эффективно связываться с белком PD1 с зависимостью от дозы. Интенсивности поглощения при разных дозах показаны в табл. 3. С помощью моделирования кривой с использованием результатов количественного анализа в виде значений поглощения было определено, что ЕС50 активности связывания 14C12H1L1 и 5С4 составляет 1,322 и 1,199 нМ соответственно.The results of binding of antibodies 14C12H1L1 and 5C4 to the PD1 antigen are shown in FIG. 6. As shown in FIG. 6, the 14C12H1L1 antibody can compete with PDL1 and bind efficiently to the PD1 protein in a dose dependent manner. The intensity of absorption at different doses are shown in table. 3. By curve modeling using absorbance quantification results, the EC50s of 14C12H1L1 and 5C4 binding activities were determined to be 1.322 and 1.199 nM, respectively.
Таблица 3Table 3
Конкурентное связывание 14C12H1L1 и 5С4 с PD1 против PDL1Competitive binding of 14C12H1L1 and 5C4 to PD1 against PDL1
- 11 042479- 11 042479
Пример 8. Активность связывания антител с антигеном PD1 поверхности клеток методом проточной цитометрии.Example 8 Antibody binding activity to cell surface antigen PD1 by flow cytometry.
Были сконструированы клетки-хозяева 293Т, экспрессирующие антиген PD1, и помечены гуманизированным антителом 14C12H1L1, полученным согласно данному изобретению (см. пример 4). Способность антитела 14C12H1L1 специфически связываться с антигеном клеточной поверхности в его нативной конформации анализировали и проверяли с помощью проточной цитометрии.293T host cells expressing the PD1 antigen were constructed and labeled with the humanized 14C12H1L1 antibody prepared according to the invention (see Example 4). The ability of the 14C12H1L1 antibody to specifically bind to the cell surface antigen in its native conformation was analyzed and verified by flow cytometry.
1. Конструирование клетки-хозяина 293Т, экспрессирующей антиген PD1.1. Construction of a 293T host cell expressing the PD1 antigen.
Конкретные шаги были следующими.The specific steps were as follows.
Конструирование клетки-хозяина 293Т, экспрессирующей антиген PD1.Construction of a 293T host cell expressing the PD1 antigen.
Клетки 293Т трансфицировали PD1-содержащим вектором pLenti6.3-PD1 (вектор pLenti6.3 был приобретен у Invitrogen Corporation) в соответствии с руководством набора LipofectaminTransfection Kit (приобретенным у Invitrogen Corporation) для получения стабильного пула 293T-PD1, экспрессирующих PD1, путем скрининга.293T cells were transfected with the PD1-containing pLenti6.3-PD1 vector (pLenti6.3 vector purchased from Invitrogen Corporation) according to the LipofectaminTransfection Kit manual (purchased from Invitrogen Corporation) to obtain a stable pool of PD1-expressing 293T-PD1 by screening.
2. Связывание антител с антигеном клеточной поверхности 293T-PD1.2. Binding of antibodies to the cell surface antigen 293T-PD1.
Мечение антител и проточная цитометрия.Antibody labeling and flow cytometry.
Полученный вышеописанным этапом 293T-PD1 расщепляли трипсином и распределяли по пробиркам, каждая из которых содержала 2х105 клеток. Антитела PD1 разбавляли с использованием буфера PBS (1% БСА) в концентрациях 50, 10, 5, 1, 0,1 и 0,01 нМ и добавляли в пробирки и инкубировали на льду с экспрессирующими PD1 клетками 293Т в течение 2 ч. В каждую пробирку добавляли 100 мкл FITC-меченого вторичного козьего анти-человеческого антитела (1:500) и инкубировали на льду в течение 1 ч. После 3-кратной промывки с помощью PBS клетки ресуспендировали в 300 мкл PBS и измеряли сигналы флуоресценции на проточном цитометре с использованием канала FITC.The 293T-PD1 obtained in the above step was digested with trypsin and distributed into tubes, each containing 2x10 5 cells. PD1 antibodies were diluted using PBS buffer (1% BSA) at concentrations of 50, 10, 5, 1, 0.1, and 0.01 nM and added to tubes and incubated on ice with PD1-expressing 293T cells for 2 h. the tube was added with 100 µl of FITC-labeled secondary goat anti-human antibody (1:500) and incubated on ice for 1 h. FITC channel.
Результаты связывания гуманизированного антитела 14C12H1L1 с клетками 293T-PD1 показаны на фиг. 7. Как показано на фиг. 7, антитело 14C12H1L1 может эффективно связывать целевой белок PD1, экспрессирующийся на поверхности клеток-хозяев 293T-PD1, с зависимостью от дозы. Интенсивности флуоресценции при разных дозах показаны в табл. 4. Через моделирование кривой с использованием результатов количественного анализа в виде значений интенсивности флуоресценции, ЕС50 связывания 14C12H1L1 с PD1 было определено как 1,89 нМ.The results of binding of the humanized 14C12H1L1 antibody to 293T-PD1 cells are shown in FIG. 7. As shown in FIG. 7, the 14C12H1L1 antibody can efficiently bind the target PD1 protein expressed on the surface of 293T-PD1 host cells in a dose dependent manner. Fluorescence intensities at different doses are shown in Table 1. 4. Through curve modeling using quantification results as fluorescence intensity values, the EC50 of 14C12H1L1 binding to PD1 was determined to be 1.89 nM.
Таблица 4Table 4
Интенсивности флуоресценции связывания 14C12H1L1 с поверхностным антигеном 293T-PD1, обнаруженные методом проточной цитометрииFluorescence intensities of 14C12H1L1 binding to 293T-PD1 surface antigen detected by flow cytometry
Пример 9. Активность связывания антитела с поверхностным антигеном PD1 Т-клеток методом проточной цитометрии.Example 9 Antibody Binding Activity to T Cell Surface Antigen PD1 by Flow Cytometry.
РВМС были выделены при помощи Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, партия № 171440-02), затем выделяли клетки CD4+ и клетки стимулировали РНА (фитогемагглютинином) (Shanghai Shenqi Biotech Co., Ltd, 50 мкл/мл) в течение трех суток, а затем один раз промывали PBS и антитела в различных концентрациях добавляли и инкубировали на льду в течение 1,5 ч. Затем клетки промывали PBS один раз после инкубации, добавляли меченное FITC козье анти-человеческое вторичное антитело (Jackson immunoresearch lot. 102155), инкубировали на льду в темноте в течение 1 ч и после однократного промывания PBS сигналы флуоресценции измеряли на проточном цитометре.PBMCs were isolated using Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare lot #171440-02), then CD4+ cells were isolated and the cells were stimulated with PHA (phytohemagglutinin) (Shanghai Shenqi Biotech Co., Ltd, 50 μl/ml) for three days, and then washed once with PBS and antibodies at various concentrations were added and incubated on ice for 1.5 h. Cells were then washed with PBS once after incubation, FITC labeled goat anti-human secondary antibody (Jackson immunoresearch lot. 102155) was added, incubated on ice in the dark for 1 h and after a single wash with PBS, fluorescence signals were measured on a flow cytometer.
Результаты связывания гуманизированного антитела 14C12H1L1 с Т-клетками показаны на фиг. 8. Очевидно, что антитело 14C12H1L1 может эффективно связывать белок PD1 на поверхности Т-клеток с зависимостью от дозы.The results of binding of the humanized 14C12H1L1 antibody to T cells are shown in FIG. 8. It appears that the 14C12H1L1 antibody can effectively bind the PD1 protein on the surface of T cells in a dose dependent manner.
Пример 10. Реакция смешанных лимфоцитов.Example 10. The reaction of mixed lymphocytes.
Секреция цитокинов ИФН-γ, ИЛ-2 РВМС были выделены при помощи Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, партия № 171440-02), дополнительно выделенные РВМС индуцировали ИЛ-4 (Peprotech K2513, 1000 ед/мл) и GM-CSF (Peprotech H1513, 1000 ед/мл) в течение 6 суток, а затем ФНО-α (Peprotech G1513, 200 ед/мл) был добавлен для индукции в течение 3 суток для получения клеток DC (дендритных клеток).Cytokine secretion IFN-γ, IL-2 PBMCs were isolated using Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare lot #171440-02), additional isolated PBMCs induced IL-4 (Peprotech K2513, 1000 U/mL) and GM-CSF ( Peprotech H1513, 1000 U/ml) for 6 days, and then TNF-α (Peprotech G1513, 200 U/ml) was added for induction for 3 days to obtain DC cells (dendritic cells).
--
Claims (25)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610705763.5 | 2016-08-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA042479B1 true EA042479B1 (en) | 2023-02-17 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20250041409A1 (en) | Anti-pd1 monoclonal antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof | |
| JP7589314B2 (en) | Anti-PD-1/anti-VEGFA bifunctional antibodies, pharmaceutical compositions thereof and uses thereof | |
| JP7425604B2 (en) | Anti-CTLA4-anti-PD-1 bifunctional antibodies, pharmaceutical compositions and uses thereof | |
| RU2739610C1 (en) | Anti-pd-1 antibody and use thereof | |
| US10273307B2 (en) | Humanized anti-CD134 (OX40) antibodies and uses thereof | |
| EA042479B1 (en) | MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST PD1, ITS PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND THEIR USE | |
| KR20250035543A (en) | Bispecific antibodies comprising anti-CLDN18.2 antibodies and pharmaceutical compositions thereof and uses thereof | |
| JP2025037880A (en) | Anti-PD-1/anti-VEGFA bifunctional antibodies, pharmaceutical compositions thereof and uses thereof | |
| EA049135B1 (en) | BIFUNCTIONAL ANTI-PD-1 AND ANTI-VEGFA ANTIBODY, ITS PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND ITS APPLICATION | |
| EA042365B1 (en) | BIFUNCTIONAL ANTIBODY AGAINST CTLA4 AND AGAINST PD-1, ITS PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND THEIR APPLICATION | |
| NZ791621A (en) | Anti-CTLA4 and anti-PD-1 bifunctional antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof | |
| NZ791623A (en) | Anti-CTLA4 and anti-PD-1 bifunctional antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof |