EA039124B1 - Стабилизированные f-белки rsv до слияния - Google Patents
Стабилизированные f-белки rsv до слияния Download PDFInfo
- Publication number
- EA039124B1 EA039124B1 EA201892702A EA201892702A EA039124B1 EA 039124 B1 EA039124 B1 EA 039124B1 EA 201892702 A EA201892702 A EA 201892702A EA 201892702 A EA201892702 A EA 201892702A EA 039124 B1 EA039124 B1 EA 039124B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- rsv
- protein
- fusion
- seq
- amino acid
- Prior art date
Links
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims abstract description 113
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 69
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 68
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 claims abstract description 161
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 26
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 claims description 185
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 58
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 49
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 47
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 47
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 41
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 32
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 27
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 18
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 18
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 claims description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 abstract description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 63
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 30
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 19
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 16
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 6
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 6
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 4
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 4
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 3
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 2
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 2
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000005558 fluorometry Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010024971 Lower respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000711904 Pneumoviridae Species 0.000 description 1
- 229940124679 RSV vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000144290 Sigmodon hispidus Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010046306 Upper respiratory tract infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NTGGOTYRTOXKMQ-UHFFFAOYSA-K aluminum;potassium;phosphate Chemical compound [Al+3].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O NTGGOTYRTOXKMQ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 229940121357 antivirals Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 101150036080 at gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- -1 enhancer(s) Chemical class 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000012395 formulation development Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007499 fusion processing Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023832 live vector-vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000020029 respiratory tract infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
- C07K14/135—Respiratory syncytial virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение предусматривает стабильные F-белки респираторно-синцитиального вируса (RSV) до слияния, иммуногенные композиции, содержащие указанные белки, и пути их применения для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной RSV.
Description
Настоящее изобретение относится к области медицины. Настоящее изобретение относится, в частности, к рекомбинантным F-белкам RSV до слияния, к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим Fбелки RSV, и путям их применения, например в вакцинах.
Предпосылки изобретения
После открытия респираторно-синцитиального вируса (RSV) в 1950-х этот вирус быстро стал признанным патогеном, ассоциированным с инфекциями верхних и нижних дыхательных путей у людей. По оценкам в мире ежегодно наблюдается 64 млн случаев инфекции RSV, которые приводят к 160000 смертельным исходам (WHO Acute Respiratory Infections Update September 2009). Наиболее тяжело заболевание протекает, в частности, у недоношенных детей, пожилых индивидуумов и индивидуумов с ослабленным иммунитетом. У детей возрастом менее 2 лет RSV является наиболее распространенным патогеном дыхательных путей, на долю которого приходится приблизительно 50% случаев госпитализации вследствие респираторных инфекций, и пик госпитализации наблюдается в возрасте 2-4 месяцев. Сообщалось, что практически все дети к двухлетнему возрасту были инфицированы RSV. Повторные инфекции в течение жизни связаны с малоэффективным врожденным иммунитетом. У пожилых людей бремя заболевания, вызванного RSV, является сходным с таковыми, которые вызваны инфекциями, возбудителем которых является непандемический вирус гриппа А.
RSV представляет собой парамиксовирус, принадлежащий к подсемейству Pneumovirinae. Его геном кодирует различные белки, в том числе мембранные белки, известные как гликопротеин (G) RSV и белок слияния (F) RSV, которые являются главными антигенными мишенями для нейтрализующих антител. Антитела к опосредующей слияние части белка F1 могут предотвращать поглощение вируса клеткой и, таким образом, обладают нейтрализующим эффектом.
F-белок RSV обеспечивает слияние мембран вируса и клетки-хозяина путем необратимого рефолдинга белка из лабильной конформации до слияния в стабильную конформацию после слияния. Структуры обеих конформаций были определены для F-белка RSV (McLellan JS, et al. Science 342, 592-598 (2013); McLellan JS, et al. Nat Struct Mol Biol 17, 248-250 (2010); McLellan JS, et al. Science 340, 1113-1117 (2013); Swanson KA, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 9619-9624 (2011)), а также для белков слияния из родственных парамиксовирусов, что обеспечивает возможность более глубокого изучения механизма этого сложного процесса слияния. Подобно другим белкам слияния типа I, для неактивного предшественника, F0 RSV, требуется расщепление с помощью фуриноподобной протеазы в ходе внутриклеточного созревания. F-белок RSV содержит два сайта для фурина, расщепление по которым приводит к образованию трех белков: F2, р27 и F1, причем последний на своем N-конце содержит гидрофобный пептид слияния (FP). Для рефолдинга из конформации до слияния в конформацию после слияния участок рефолдинга 1 (RR1), находящийся между остатками 137 и 216, который включает FP и гептадный повтор A (HRA), подлежит трансформации из сборки в виде спиралей, петель и нитей в длинную непрерывную спираль. FP, расположенный на N-концевом сегменте RR1, в дальнейшем способен вытягиваться от вирусной мембраны и встраиваться в проксимальный участок мембраны целевой клетки. Затем участок рефолдинга 2 (RR2), который формирует С-концевую петлю в шиповидном отростке F-белка до слияния и включает гептадный повтор В (HRB), перемещается на другую сторону головки F-белка RSV и связывает суперспиральный тример HRA с доменом HRB с образованием пучка из шести спиралей. Образование суперспиральной структуры RR1 и перемещение RR2 с формированием пучка из шести спиралей представляют собой наиболее важные структурные изменения, которые происходят в ходе процесса рефолдинга.
В настоящее время вакцина против инфекции, вызванной RSV, отсутствует, но является необходимой из-за высокого бремени заболевания. Гликопротеин слияния RSV (F-белок RSV) представляет собой перспективный антиген для получения вакцины, поскольку он является главной мишенью для нейтрализующих антител в сыворотке крови человека. Большинство нейтрализующих антител в сыворотке крови человека направлены против конформации до слияния, однако из-за ее нестабильности конформация до слияния характеризуется склонностью к преждевременному рефолдингу в конформацию после слияния как в жидкой среде, так и на поверхности вирионов. Как указывалось выше, с помощью кристаллических структур обнаружили значительное конформационное изменение между состояниями до слияния и после слияния. Величина перестройки предполагала, что только часть антител, направленных на конформацию RSV-F после слияния, будет способна к перекрестной реакции с нативной конформацией шиповидного отростка до слияния на поверхности вируса. Соответственно, усилия для получения вакцины против RSV сосредоточивались на разработке вакцин, которые содержат формы F-белка RSV до слияния (см., например, WO 20101149745, WO 2010/1149743, WO 2009/1079796, WO 2012/158613). Однако эти усилия не позволили получить стабильных F-белков RSV до слияния, которые можно было бы использовать в качестве кандидатов для тестирования у людей.
Следовательно, сохраняется потребность в эффективных вакцинах против RSV, в частности в вакцинах, содержащих F-белки RSV в конформации до слияния. Целью настоящего изобретения является получение таких стабильных F-белков RSV до слияния для применения в вакцинации против RSV безопасным и эффективным способом.
- 1 039124
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение предусматривает стабильные рекомбинантные белки слияния (F) респираторно-синцитиального вируса (RSV) до слияния, т.е. рекомбинантные F-белки RSV, которые являются стабилизированными в конформации до слияния, и их фрагменты. F-белки RSV или их фрагменты содержат по меньшей мере один эпитоп, который является специфическим для конформации F-белка до слияния. В определенных вариантах осуществления F-белки RSV до слияния представляют собой растворимые белки. В определенных вариантах осуществления F-белки RSV представляют собой тримеры. В определенных вариантах осуществления F-белки RSV представляют собой мультимеры тримерных Fбелков RSV. Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие F-белки RSV до слияния или их фрагменты, а также векторы, содержащие такие молекулы нуклеиновой кислоты.
Настоящее изобретение также относится к композициям, предпочтительно иммуногенным композициям, содержащим F-белок RSV, молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор, а также к их применению в индуцировании иммунного ответа на F-белок RSV, в частности их применению в качестве вакцины. Настоящее изобретение также относится к способам индуцирования у субъекта иммунного ответа на респираторный синцитиальный вирус (RSV), предусматривающим введение субъекту эффективного количества F-белка RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный F-белок RSV, и/или вектора, содержащего указанную молекулу нуклеиновой кислоты. Предпочтительно индуцированный иммунный ответ характеризуется выработкой нейтрализующих антител к RSV и/или защитным иммунитетом против RSV. В конкретных аспектах настоящее изобретение относится к способу индуцирования у субъекта выработки антител к F-белку респираторного синцитиального вируса (RSV), предусматривающему введение субъекту эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей F-белок RSV до слияния, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный F-белок RSV, и/или вектор, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1. Очистка F-белка с мутациями N67I, S215P, Т357К, N371Y и D486N. Хроматограмма элюата из ионообменной колонки, полученная в результате гель-фильтрации с использованием колонки Superdex200. Стрелка указывает на пик, соответствующий собранному материалу.
Фиг. 2. А) Результат SDS-PAGE-анализа в восстанавливающих (R) и невосстанавливающих (NR) условиях для пика SEC-хроматограммы, содержащего образец F-белка N67I, S215P, Т357К, N371Y, D486N. Гели окрашены кумасси бриллиантовым синим.
Фиг. 3. Белковую концентрацию очищенного F-белка RSV F N67I, S215P, Т357К, N371Y, D486N измеряли путем анализа на базе системы Q Octet с помощью моноклональных антител CR9501 и CR9503. CR9501 связывается только с F-белком RSV в конформации до слияния. CR9503 связывается с F-белком RSV как в конформации до слияния, так и в конформации после слияния. Данные на графике представлены в виде средних значений ±SE.
Фиг. 4. Термостабильность F-белка RSV F N671, S215P, Т357К, N371Y, D486N. Температура плавления (Tm, °C), определенная с помощью анализа посредством дифференциальной сканирующей флуориметрии (DSF) с применением флуоресцентного красителя SyproOrange. Введение замен Т357К и N371Y повышало Tm PRPM на значение от 3,5 до 68,5°.
Подробное описание изобретения
Белок слияния (F) респираторного синцитиального вируса (RSV) участвует в слиянии мембраны вируса с мембраной клетки-хозяина, которое требуется для инфицирования. мРНК F-белка RSV транслируется в белок-предшественник из 574 аминокислот, обозначаемый F0, который содержит последовательность сигнального пептида на N-конце (например, аминокислотные остатки 1-26 из SEQ ID NO: 13), которая удаляется сигнальной пептидазой в эндоплазматическом ретикулуме. F0 расщепляется клеточными протеазами (в частности, фурином или фуриноподобной протеазой) по двум сайтам (между аминокислотными остатками 109/110 и 136/137) с удалением короткой гликозилированной последовательности, расположенной посередине (также называемой участком р27, содержащим аминокислотные остатки 110-136) и образованием двух доменов или субъединиц, обозначаемых F1 и F2. Домен F1 (аминокислотные остатки 137-574) содержит гидрофобный пептид слияния на своем N-конце, и С-конец содержит трансмембранный (ТМ) (аминокислотные остатки 530-550) и цитоплазматический участок (аминокислотные остатки 551-574). Домен F2 (аминокислотные остатки 27-109) ковалентно связан с F1 двумя дисульфидными мостиками. Гетеродимеры F1-F2 подвергаются сборке в вирионе в виде гомотримеров.
Вакцина против инфекции, вызванной RSV, в настоящее время еще отсутствует. Одним потенциальным подходом к получению вакцины является получение субъединичной вакцины на основе очищенного F-белка RSV. Однако для данного подхода требуется, чтобы очищенный F-белок RSV находился в конформации, которая подобна конформации F-белка RSV в состоянии до слияния, которая стабильна с течением времени и может быть получена в достаточных количествах. Кроме того, для вакцины на основе растворимой субъединицы необходимо осуществить усечение F-белка RSV путем делеции трансмембранного (ТМ) и цитоплазматического участка с получением растворимого секретируемого F-белка (sF). Поскольку ТМ-участок отвечает за заякоривание в мембране и стабильность, неспособный к заякорива
- 2 039124 нию растворимый F-белок является в значительной степени более лабильным, чем полноразмерный белок, и будет с легкостью подвергаться рефолдингу в конечное состояние после слияния. Для получения растворимого F-белка в стабильной конформации до слияния, который характеризуется высокими уровнями экспрессии и высокой стабильностью, необходимо, таким образом, стабилизировать конформацию до слияния. Поскольку полноразмерный (мембраносвязанный) F-белок RSV также является метастабильным, для полноразмерного F-белка RSV также необходима стабилизация конформации до слияния, например в случае любого подхода по созданию живых аттенуированных вакцин или векторных вакцин.
Для стабилизации растворимого F-белка RSV, который в конформации до слияния расщепляется на субъединицы F1 и F2, производили слияние фибритинового домена тримеризации с С-концом растворимого F-белка RSV (McLellan et al., Nature Struct. Biol.17: 2-248-250 (2010); McLellan et al., Science 340(6136):1113-7 (2013)). Этот домен фибритина или фолдон получают из Т4-фибритина и ранее он был описан как природный домен тримеризации (Letarov et al., Biochemistry Moscow 64: 817-823 (1993); S-Guthe et al., J. Mol. Biol. 337: 905-915. (2004)). Однако применение домена тримеризации не позволяет получить стабильный F-белок RSV до слияния (Krarup et al., Nature Comm. 6:8143, (2015)). Более того, эти усилия даже не позволили получить кандидатов, пригодных для тестирования у людей.
Недавно авторами настоящего изобретения были описаны комбинации из нескольких мутаций, которые способны стабилизировать конформацию F-белка RSV до слияния (WO 2014/174018 и WO 2014/202570). Таким образом, были описаны стабильные F-белки RSV до слияния, содержащие мутацию аминокислотного остатка в положении 67 и/или мутацию аминокислотного остатка в положении 215, предпочтительно мутацию по типу замены аминокислотного остатка N/T в положении 67 на I и/или мутацию по типу замены аминокислотного остатка S в положении 215 на Р. Кроме того, были описаны растворимые F-белки RSV до слияния, содержащие усеченный домен F1 и содержащие мутацию аминокислотного остатка в положении 67 и/или мутацию аминокислотного остатка в положении 215, предпочтительно мутацию по типу замены аминокислотного остатка N/T в положении 67 на I и/или мутацию по типу замены аминокислотного остатка S в положении 215 на Р, при этом белок содержит гетерологичный домен тримеризации, связанный с указанным усеченным доменом F1. Были описаны дополнительные F-белки RSV до слияния, где белки содержат по меньшей мере одну дополнительную мутацию, такую как мутация по типу замены аминокислотного остатка D в положении 486 на N.
В соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что введение двух других мутаций, т.е. в положениях 357 и 371 (нумерация согласно SEQ ID NO: 13), также стабилизирует белок в конформации до слияния.
Настоящее изобретение, таким образом, предусматривает рекомбинантные F-белки до слияния, содержащие мутацию аминокислотного остатка в положении 215, в частности мутацию по типу замены аминокислоты S положении 215 на Р (S215P), в комбинации с мутацией аминокислот в положении 357, в частности мутацией по типу замены аминокислоты Т в положении 357 на K (T357K), и мутацией аминокислоты в положении 371, в частности мутацией по типу замены аминокислоты N в положении 371 на Y (N371Y).
Настоящее изобретение, таким образом, предусматривает уникальную комбинацию мутаций для обеспечения рекомбинантных стабильных F-белков RSV до слияния, т.е. F-белков RSV, которые являются стабилизированными в конформации до слияния, или их фрагментов. Стабильные F-белки RSV до слияния по настоящему изобретению или их фрагменты находятся в конформации до слияния, т.е. они содержат (имеют) по меньшей мере один эпитоп, который является специфическим для конформации Fбелка до слияния. Эпитоп, который является специфическим для конформации F-белка до слияния, представляет собой эпитоп, который не представлен в конформации после слияния. Не ограничиваясь конкретной теорией, полагают, что конформация F-белка RSV до слияния может содержать эпитопы, которые являются такими же, как эпитопы на F-белке RSV, экспрессируемые на встречающихся в природе вирионах RSV, и, следовательно, может предоставлять преимущества для активизации защитных нейтрализующих антител.
В определенных вариантах осуществления F-белки RSV до слияния по настоящему изобретению или их фрагменты содержат по меньшей мере один эпитоп, который распознается моноклональным антителом, специфичным к конформации до слияния, содержащим CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 1, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2, CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 3 и CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 4, CDR2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 5 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 6 (далее в этом документе упоминаемый как CR9501), и/или моноклональным антителом, специфичным к конформации до слияния, содержащим CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 7, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 8, CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 9 и CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 10, CDR2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 11 и CDR3участок легкой цепи с SEQ ID NO: 12 (упоминаемый как CR9502). CR9501 и CR9502 содержат вариабельные участки тяжелой и легкой цепей и, таким образом, обладают связывающими специфичностями антител 58С5 и 30D8 соответственно, которые, как было показано ранее, специфично связываются с Fбелком RSV в его конформации до слияния, но не в конформации после слияния (см. WO 2012/006596).
В определенных вариантах осуществления рекомбинантные F-белки RSV до слияния являются
- 3 039124 тримерными.
Как используется по всей настоящей заявке, нуклеотидные последовательности представлены в направлении от 5'- к 3'-концу, а аминокислотные последовательности от N-конца к С-концу, как принято в данной области.
Как указано выше, настоящим изобретением также охватываются фрагменты F-белка RSV до слияния. Фрагмент может представлять собой результат какой-либо одной или обеих из аминоконцевой (например, осуществляемой путем отщепления сигнальной последовательности) и карбоксиконцевой делеций (например, осуществляемой путем удаления трансмембранного участка и/или цитоплазматического хвоста). Может быть выбран такой фрагмент, который включает иммунологически активный фрагмент F-белка, т.е. часть, которая будет приводить к иммунному ответу у субъекта. Его можно легко определить с применением способов in silico, in vitro и/или in vivo, все из которых хорошо известны специалисту в данной области.
В определенных вариантах осуществления кодируемые белки или фрагменты в соответствии с настоящим изобретением содержат сигнальную последовательность, также называемую лидерной последовательностью или сигнальным пептидом, соответствующую аминокислотам 1-26 из SEQ ID NO: 13. Сигнальные последовательности обычно являются короткими (например, 5-30 аминокислот в длину) аминокислотными последовательностями, присутствующими на N-конце большинства вновь синтезированных белков, которые направляются по секреторному пути и обычно отщепляются сигнальной пептидазой с образованием свободного сигнального пептида и зрелого белка.
В определенных вариантах осуществления белки или их фрагменты в соответствии с настоящим изобретением не содержат сигнальной последовательности.
В определенных вариантах осуществления F-белки RSV до слияния (или их фрагменты) являются растворимыми. В определенных вариантах осуществления стабильные F-белки RSV до слияния или их фрагменты в соответствии с настоящим изобретением содержат усеченный домен F1 и содержат гетерологичный домен тримеризации, связанный с указанным усеченным доменом F1. В соответствии с настоящим изобретением было показано, что путем связывания гетерологичного домена тримеризации с Сконцевым аминокислотным остатком усеченного домена F1, объединенного со стабилизирующей (стабилизирующими) мутацией (мутациями), получают растворимые F-белки RSV, которые характеризуются высокой экспрессией и которые связываются с антителами, специфичными к конформации до слияния, что указывает на то, что белки находятся в конформации до слияния. Кроме того, F-белки RSV стабилизированы в конформации до слияния, т.е. даже после обработки белков они по-прежнему связываются с антителами CR9501 и/или CR9502, специфичными к конформации до слияния, что указывает на то, что сохраняется эпитоп, специфичный к конформации до слияния.
В определенных вариантах осуществления F-белки RSV представляют собой мультимеры тримерных F-белков RSV. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления F-белки RSV могут содержать домен сборки для сборок тримеров более высокого порядка.
Известно, что RSV существует в виде одного серотипа, характеризующегося двумя подгруппами антигенов: А и В. Аминокислотные последовательности зрелых процессированных F-белков двух групп являются идентичными приблизительно на 93%. Как используется по всей настоящей заявке, положения аминокислот приведены по отношению к последовательности F-белка RSV подгруппы A (SEQ ID NO: 13). Используемое в настоящем изобретении выражение аминокислота в положении х F-белка RSV, таким образом, означает аминокислоту, соответствующую аминокислоте в положении х в F-белке RSV с SEQ ID NO: 13. Необходимо отметить, что в системе нумерации, используемой по всей настоящей заявке, 1 относится к N-концевой аминокислоте незрелого F0-белка (SEQ ID NO: 13). При применении другого штамма RSV положения аминокислот F-белка следует нумеровать по отношению к нумерации F-белка с SEQ ID NO: 13 посредством выравнивания последовательностей другого штамма RSV с Fбелком с SEQ ID NO: 13 со вставкой гэпов при необходимости. Выравнивание последовательностей можно выполнять с помощью способов, хорошо известных в данной области, например с помощью CLUSTALW, Bioedit или CLC Workbench.
В определенных вариантах осуществления штамм RSV представляет собой штамм RSV с SEQ ID NO: 20.
В определенных вариантах осуществления штамм RSV представляет собой штамм В RSV. В определенных вариантах осуществления штамм RSV представляет собой штамм В RSV с SEQ ID NO: 15.
Аминокислота в соответствии с настоящим изобретением может быть любой из двадцати встречающихся в природе (или стандартных аминокислот) или их вариантов, таких как, например, Dаминокислоты (D-энантиомеры аминокислот с хиральным центром), или любыми вариантами, которые не встречаются в природе в белках, как, например, норлейцин. Стандартные аминокислоты можно разделить на несколько групп, исходя из их свойств. Важными факторами являются заряд, гидрофильность или гидрофобность, размер и функциональные группы. Эти свойства являются важными для структуры белков и белок-белковых взаимодействий. Некоторые аминокислоты обладают специфическими свойствами, как, например, цистеин, который может образовывать ковалентные дисульфидные связи (или дисульфидные мостики) с другими цистеиновыми остатками, пролин, который индуцирует повороты бел- 4 039124 кового остова, и глицин, который является более гибким, чем другие аминокислоты. В табл. 1 приведены сокращения и свойства стандартных аминокислот.
Специалисту в данной области будет понятно, что вносить мутации в белок можно с помощью стандартных методик молекулярной биологии. Результатом мутаций в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно являются повышенные уровни экспрессии и/или повышенная стабилизация F-белков RSV до слияния по сравнению с F-белками RSV, которые не содержат данную (данные) мутацию (мутации).
В определенных вариантах осуществления F-белки RSV до слияния или их фрагменты содержат по меньшей мере одну дополнительную мутацию, выбранную из группы, состоящей из (а) мутации аминокислотного остатка в положении 67 и (b) мутации аминокислотного остатка в положении 486.
В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна дополнительная мутация выбрана из группы, состоящей из (a) мутации по типу замены аминокислотного остатка N/T в положении 67 на I и (b) мутации по типу замены аминокислотного остатка D в положении 486 на N.
В определенных вариантах осуществления F-белки RSV до слияния или их фрагменты содержат по меньшей мере четыре мутации (по сравнению с F-белком RSV дикого типа, например содержащим аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 13). В определенных вариантах осуществления белки или их фрагменты содержат по меньшей мере пять мутаций.
В определенных вариантах осуществления белки или их фрагменты содержат по меньшей мере шесть мутаций.
В определенных вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния, таким образом, содержат по меньшей мере одну дополнительную мутацию, выбранную из группы, состоящей из (a) мутации аминокислотного остатка в положении 46;
(b) мутации аминокислотного остатка в положении 83;
(c) мутации аминокислотного остатка в положении 92;
(d) мутации аминокислотного остатка в положении 184;
(e) мутации аминокислотного остатка в положении 203;
(f) мутации аминокислотного остатка в положении 207;
(g) мутации аминокислотного остатка в положении 487.
В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна дополнительная мутация выбрана из группы, состоящей из (a) мутации по типу замены аминокислотного остатка S в положении 46 на G;
(b) мутации по типу замены аминокислотного остатка L в положении 83 на М;
(c) мутации по типу замены аминокислотного остатка Е в положении 92 на D;
(d) мутации по типу замены аминокислотного остатка G в положении 184 на N;
(е) мутации по типу замены аминокислотного остатка L в положении 203 на I;
(f) мутации по типу замены аминокислотного остатка V в положении 207 на I;
(g) мутации по типу замены аминокислотного остатка Е в положении 487 на Q, N или I.
В определенных вариантах осуществления гетерологичный домен тримеризации содержит аминокислотную последовательность GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 14).
Как описано выше, в определенных вариантах осуществления белки по настоящему изобретению или их фрагменты содержат усеченный домен F1. Как используется в данном документе, усеченный домен F1 относится к домену F1, который не является полноразмерным доменом F1, т.е. где на N-конце или С-конце были подвергнуты делеции один или несколько аминокислотных остатков. В соответствии с настоящим изобретением, по меньшей мере, трансмембранный домен и цитоплазматический хвост были подвергнуты делеции для обеспечения экспрессии продукта в виде растворимого эктодомена.
В определенных других вариантах осуществления домен тримеризации связан с аминокислотным остатком 513 домена F1 RSV. В определенных вариантах осуществления домен тримеризации, следовательно, содержит SEQ ID NO: 14 и связан с аминокислотным остатком 513 домена F1 RSV.
В определенных вариантах осуществления F-белок RSV по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 21.
В определенных вариантах осуществления уровень экспрессии F-белков RSV до слияния по настоящему изобретению увеличен по сравнению с F-белком RSV дикого типа. В определенных вариантах осуществления уровень экспрессии увеличен по меньшей мере в 5 раз, предпочтительно до 10 раз. В определенных вариантах осуществления уровень экспрессии увеличен более чем в 10 раз.
F-белки RSV до слияния в соответствии с настоящим изобретением являются стабильными, т.е. для них не характерен быстрый переход в конформацию после слияния при обработке белков, как, например, при очистке, циклах замораживания-оттаивания и/или хранении и т.д.
В определенных вариантах осуществления F-белки RSV до слияния в соответствии с настоящим изобретением характеризуются повышенной стабильностью при хранении при 4°C по сравнению с Fбелком RSV без мутации (мутаций). В определенных вариантах осуществления белки являются стабиль- 5 039124 ными при хранении при 4°C в течение по меньшей мере 30 дней, предпочтительно по меньшей мере 60 дней, предпочтительно по меньшей мере 6 месяцев, даже более предпочтительно по меньшей мере 1 года. Стабильный при хранении означает, что белки по-прежнему имеют по меньшей мере один эпитоп, специфичный в отношении антител, специфичных к конформации до слияния (например, CR9501), при хранении белка в растворе (например, среде для культивирования) при 4°C в течение по меньшей мере 30 дней. В определенных вариантах осуществления белки имеют по меньшей мере один эпитоп, специфический для конформации до слияния, в течение по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно в течение по меньшей мере 1 года, при хранении F-белков RSV до слияния при 4°C.
В определенных вариантах осуществления F-белки RSV до слияния в соответствии с настоящим изобретением характеризуются повышенной стабильностью при воздействии теплом по сравнению с Fбелками RSV без указанной (указанных) мутации (мутаций). В определенных вариантах осуществления F-белки RSV до слияния являются термостабильными в течение по меньшей мере 30 мин при температуре 55°C, предпочтительно при 58°C, более предпочтительно при 60°C. Термостабильный означает, что белки по-прежнему имеют по меньшей мере один эпитоп, специфический для конформации до слияния, после того, как их подвергали воздействию повышенной температуры (т.е. температуры, составляющей 55°C или выше) в течение по меньшей мере 30 мин, например, как определяют с помощью способа, описанного в примерах (см. фиг. 4).
В определенных вариантах осуществления белки имеют по меньшей мере один эпитоп, специфический для конформации до слияния, после проведения от 1 до 6 циклов замораживания-оттаивания в соответствующем буферном составе.
Как используется по всей настоящей заявке, нуклеотидные последовательности представлены в направлении от 5'- к 3'-концу, а аминокислотные последовательности от N-конца к С-концу, как принято в данной области.
В определенных вариантах осуществления кодируемые белки в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержат лидерную последовательность, также называемую сигнальной последовательностью или сигнальным пептидом, соответствующую аминокислотам 1-26 из SEQ ID NO: 13. Она представляет собой короткий (обычно 5-30 аминокислот в длину) пептид, присутствующий на N-конце большинства вновь синтезированных белков, которые направляются по секреторному пути. В определенных вариантах осуществления белки в соответствии с настоящим изобретением не содержат лидерную последовательность.
В определенных вариантах осуществления белки содержат HIS-метку. His-метка или полигистидиновая метка представляет собой аминокислотный мотив в белках, который состоит по меньшей мере из пяти остатков гистидина (Н), зачастую на N- или С-конце белка, который, как правило, используют для целей очистки.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие F-белки RSV в соответствии с настоящим изобретением.
В предпочтительных вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие белки в соответствии с настоящим изобретением, являются оптимизированными по кодонам для экспрессии в клетках млекопитающего, предпочтительно клетках человека. Способы оптимизации по кодонам известны и были описаны ранее (например, WO 96/09378). Последовательность считается оптимизированной по кодонам, если по меньшей мере один кодон, не являющийся предпочтительным, по сравнению с последовательностью дикого типа замещен кодоном, который является более предпочтительным. В данном документе кодон, не являющийся предпочтительным, представляет собой кодон, который используется менее часто в организме, чем другой кодон, кодирующий такую же аминокислоту, а кодон, являющийся более предпочтительным, представляет собой кодон, который используется более часто в организме, чем кодон, не являющийся предпочтительным. Частоту использования кодонов для конкретного организма можно найти в таблицах частоты использования кодонов, как, например, на сайте http://www.kazusa.or.jp/codon. Предпочтительно более одного кодона, не являющегося предпочтительным, предпочтительно большинство или все кодоны, не являющиеся предпочтительными, замещают кодонами, которые являются более предпочтительными. Предпочтительно в оптимизированной по кодонам последовательности используют кодоны, наиболее часто используемые в организме. Как правило, замещение предпочтительными кодонами приводит к более высокой экспрессии.
Специалисту в данной области будет понятно, что в результате вырожденности генетического кода несколько различных полинуклеотидов и молекул нуклеиновой кислоты могут кодировать один и тот же белок. Также понятно, что специалисты в данной области с помощью стандартных методик могут осуществлять нуклеотидные замены, которые не влияют на последовательность белка, кодируемую молекулами нуклеиновой кислоты, для достижения соответствия использованию кодонов в любом конкретном организме-хозяине, в котором будут экспрессироваться эти белки. Следовательно, если не указано иное, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными версиями друг друга и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки, и РНК могут включать интроны или могут не включать их.
- 6 039124
Последовательности нуклеиновой кислоты можно клонировать с помощью стандартных методик молекулярной биологии или получать de novo путем синтеза ДНК, который можно осуществлять с помощью стандартных процедур с участием компаний, предоставляющих услуги в области синтеза ДНК и/или молекулярного клонирования (например, GeneArt, GenScripts, Invitrogen, Eurofins).
Настоящее изобретение также предусматривает векторы, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, описанную выше. Таким образом, в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением является частью вектора. С такими векторами можно легко производить манипуляции с помощью способов, хорошо известных специалисту в данной области, и их, например, можно сконструировать так, чтобы они были способны к репликации в прокариотических и/или эукариотических клетках. Кроме того, многие векторы можно использовать для трансформации эукариотических клеток, и они будут интегрироваться целиком или частично в геном таких клеток, что приведет в результате к стабильным клеткам-хозяевам, содержащим в их геноме необходимую нуклеиновую кислоту. Применяемый вектор может представлять собой любой вектор, который подходит для клонирования ДНК и который можно применять для обеспечения транскрипции нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. Подходящими векторами в соответствии с настоящим изобретением являются, например, аденовекторы, векторы на основе альфавируса, парамиксовируса, вируса осповакцины, вируса герпеса, ретровирусные векторы и т.д. Специалист в данной области может выбрать подходящие векторы экспрессии и вставить последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению функциональным образом.
Клетки-хозяева, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие F-белки RSV до слияния, также образуют часть настоящего изобретения. F-белки RSV до слияния можно получать посредством технологии рекомбинантной ДНК, включающей обеспечение экспрессии молекул в клеткаххозяевах, например клетках яичника китайского хомячка (СНО), линиях опухолевых клеток, клетках ВНК, линиях клеток человека, таких как клетки HEK293, клетки PER.C6, или клетках дрожжей, грибов, насекомых и т.п., или в трансгенных животных или растениях. В определенных вариантах осуществления клетки происходят из многоклеточного организма, в определенных вариантах осуществления они происходят из позвоночных или беспозвоночных. В определенных вариантах осуществления клетки представляют собой клетки млекопитающего. В определенных вариантах осуществления клетки представляют собой клетки человека. В целом получение рекомбинантных белков, таких как F-белки RSV до слияния по настоящему изобретению, в клетке-хозяине предусматривает введение гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок в экспрессируемом формате, в клетку-хозяина, культивирование клеток в условиях, способствующих экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, и обеспечение экспрессии белка в указанной клетке. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок в экспрессируемом формате, может находиться в форме кассеты экспрессии и для нее обычно требуются последовательности, способствующие экспрессии нуклеиновой кислоты, такие как энхансер (энхансеры), промотор, сигнал полиаденилирования и т.п. Специалист в данной области осведомлен о том, что для достижения экспрессии гена в клетках-хозяевах можно использовать различные промоторы. Промоторы могут быть конститутивными или регулируемыми, и их можно получить из разных источников, в том числе вирусов, прокариотических или эукариотических источников, или конструировать искусственным способом.
Среды для культивирования клеток доступны от различных поставщиков, и подходящую среду можно обычно выбрать для клетки-хозяина для экспрессии белка, представляющего интерес, в данном случае F-белков RSV до слияния. Подходящая среда может содержать сыворотку крови или может не содержать ее.
Гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты (также называемая в данном документе трансгеном) представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая в природе не присутствует в клеткехозяине. Ее вводят, например, в вектор с помощью стандартных методик молекулярной биологии. Трансген, как правило, функционально связывают с последовательностями, контролирующими экспрессию. Это можно выполнять, например, путем помещения нуклеиновой кислоты, кодирующей трансген (трансгены), под контроль промотора. Можно добавлять дополнительные регуляторные последовательности. Для экспрессии трансгена (трансгенов) можно использовать многие промоторы, и они известны специалисту в данной области, например, они могут включать промоторы вируса, млекопитающего, синтетические промоторы и т.п. Неограничивающим примером подходящего промотора для обеспечения экспрессии в эукариотических клетках является промотор CMV (US 5385839), например предранний промотор CMV, например содержащий нукл. от -735 до +95 из энхансера/промотора предраннего гена CMV. Сигнал полиаденилирования, например сигнал полиА гена бычьего гормона роста (US 5122458), может располагаться позади трансгена (трансгенов). В качестве альтернативы несколько широко используемых векторов экспрессии можно получить на основании знаний из уровня техники и из коммерческих источников, например серии векторов pcDNA и pEF от Invitrogen, pMSCV и pTK-Hyg от BD Sciences, pCMV-Script от Stratagene и т.д., которые можно применять для рекомбинантной экспрессии белка, представляющего интерес, или для получения подходящих промоторов и/или последовательностей терминаторов транскрипции, последовательностей polyA и т.п.
Культура клеток может представлять собой любой тип культуры клеток, в том числе адгезивную
- 7 039124 культуру клеток, например клетки, прикрепленные к поверхности сосуда для культивирования или к микроносителям, а также суспензионную культуру. Для крупномасштабного культивирования большинства суспензионных культур применяют периодический процесс или периодический процесс с подпиткой, поскольку они являются наиболее простыми для управления и увеличения масштаба. В настоящее время непрерывные процессы, основанные на принципах перфузии, становятся более распространенными, и они также являются подходящими. Подходящие среды для культивирования также хорошо известны специалисту в данной области и могут, как правило, быть получены из коммерческих источников в больших количествах или изготовлены по заказу в соответствии со стандартными протоколами. Культивирование можно проводить, например, в чашках, роллер-флаконах или в биореакторах, используя периодические, подпитываемые, непрерывные системы и т.п. Известны подходящие условия для культивирования клеток (см., например, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973), и R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0471-34889-9)).
Настоящее изобретение также предусматривает композиции, содержащие F-белок RSV до слияния, и/или молекулу нуклеиновой кислоты, и/или вектор, которые описаны выше. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает композиции, содержащие F-белок RSV до слияния, который имеет эпитоп, который присутствует в конформации F-белка RSV до слияния, но отсутствует в конформации после слияния. Настоящее изобретение также предусматривает композиции, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор, кодирующие такой F-белок RSV до слияния. Настоящее изобретение дополнительно предусматривает иммуногенные композиции, содержащие F-белок RSV до слияния, и/или молекулу нуклеиновой кислоты, и/или вектор, которые описаны выше. Настоящее изобретение также предусматривает применение стабилизированного F-белка RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты и/или вектора в соответствии с настоящим изобретением для индуцирования иммунного ответа на Fбелок RSV у субъекта. Дополнительно предусмотрены способы индуцирования у субъекта иммунного ответа на F-белок RSV, предусматривающие введение субъекту F-белка RSV до слияния, и/или молекулы нуклеиновой кислоты, и/или вектора в соответствии с настоящим изобретением. Также предусмотрены F-белки RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты и/или векторы в соответствии с настоящим изобретением для индуцирования иммунного ответа у субъекта на F-белок RSV. Дополнительно предусмотрено применение F-белков RSV до слияния, и/или молекул нуклеиновой кислоты, и/или векторов в соответствии с настоящим изобретением для изготовления лекарственного препарата для применения в индуцировании у субъекта иммунного ответа на F-белок RSV.
F-белки RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты или векторы по настоящему изобретению можно применять для предупреждения (профилактики) и/или лечения инфекций, вызванных RSV. В определенных вариантах осуществления предупреждение и/или лечение могут быть направлены на группы пациентов, которые восприимчивы к инфекции, вызванной RSV. Такие группы пациентов включают без ограничения, например, пожилых (например, в возрасте >50 лет, в возрасте >60 лет и предпочтительно в возрасте >65 лет), молодых (например, в возрасте <5 лет, в возрасте <1 года), госпитализированных пациентов и пациентов, которые получали лечение противовирусным соединением, но у которых наблюдался неудовлетворительный противовирусный ответ.
F-белки RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты и/или векторы в соответствии с настоящим изобретением можно применять, например, в отдельности для лечения и/или профилактики заболевания или состояния, вызываемого RSV, или в комбинации с другими профилактическими и/или терапевтическими средствами лечения, такими как (существующие или разработанные в будущем) вакцины, противовирусные средства и/или моноклональные антитела.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способы предупреждения и/или лечения у субъекта инфекции, вызванной RSV, с использованием F-белков RSV до слияния, молекул нуклеиновой кислоты и/или векторов в соответствии с настоящим изобретением. В конкретном варианте осуществления способ предупреждения и/или лечения у субъекта инфекции, вызванной RSV, предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества F-белка RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты и/или вектора, которые описаны выше. Терапевтически эффективное количество относится к количеству белка, молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, которое является эффективным для предупреждения, облегчения и/или лечения заболевания или состояния, возникшего в результате инфекции, вызванной RSV. Предупреждение охватывает подавление или уменьшение распространения RSV, или подавление или уменьшение проявления, развития или прогрессирования одного или нескольких симптомов, ассоциированных с инфекцией, вызванной RSV. Облегчение, как используется в данном документе, может относиться к уменьшению видимых или ощутимых симптомов заболевания, виремии или других поддающихся измерению проявлений инфекции гриппа.
Для введения субъектам, таким как люди, в настоящем изобретении могут применяться фармацевтические композиции, содержащие F-белок RSV до слияния, молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор, которые описаны в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В контексте настоящего изобретения термин фармацевтически приемлемый означает, что носитель или
- 8 039124 наполнитель в используемых дозировках и концентрациях не будет вызывать каких-либо нежелательных или неблагоприятных эффектов у субъектов, которым их вводят. Такие фармацевтически приемлемые носители и наполнители хорошо известны из уровня техники (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]). F-белки RSV или молекулы нуклеиновой кислоты предпочтительно составляют и вводят в виде стерильного раствора, хотя также возможно использование лиофилизированных препаратов. Стерильные растворы получают с помощью стерилизующей фильтрации или с помощью других способов, известных per se из уровня техники. Затем растворы лиофилизируют или заполняют ими контейнеры, предназначенные для лекарственных форм. Значение рН раствора, как правило, находится в диапазоне рН 3,0-9,5, например, рН 5,0-7,5. F-белки RSV обычно находятся в растворе, содержащем подходящий фармацевтически приемлемый буфер, и композиция также может содержать соль. Необязательно может присутствовать стабилизирующее средство, такое как альбумин. В определенных вариантах осуществления добавляют детергент. В определенных вариантах осуществления F-белки RSV могут быть составлены в виде инъекционного препарата.
В некоторых вариантах осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержит один или несколько адъювантов. Адъюванты, как известно из уровня техники, дополнительно повышают иммунный ответ в отношении применяемой антигенной детерминанты. Термины адъювант и иммуностимулятор используются в данном документе взаимозаменяемо, и их определяют как одно или несколько веществ, вызывающих стимуляцию иммунной системы. В данном контексте адъювант используют для усиления иммунного ответа на F-белки RSV по настоящему изобретению. Примеры подходящих адъювантов включают соли алюминия, такие как гидроксид алюминия и/или фосфат алюминия; композиции в виде масляных эмульсий (или композиции типа масло-в-воде), в том числе сквален-водные эмульсии, такие как MF59 (см., например, WO 90/14837); составы с сапонинами, такие как, например, QS21 и иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS) (см., например, US 5057540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620); вещества, происходящие из бактерий или микроорганизмов, примерами которых являются монофосфорил-липид A (MPL), 3-Одеацилированный MPL (3dMPL), олигонуклеотиды, содержащие мотив CpG, ADP-рибозилирующие токсины бактерий или их мутантные формы, такие как термолабильный энтеротоксин LT из Е. coli, холерный токсин СТ и т.п.; белки эукариотов (например, антитела или их фрагменты (например, направленные против самого антигена или CD1a, CD3, CD7, CD80) и лиганды к рецепторам (например, CD40L, GMCSF, GCSF и т.д.), которые стимулируют иммунный ответ при взаимодействии с реципиентными клетками. В определенных вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению содержат в качестве адъюванта алюминий, например в форме гидроксида алюминия, фосфата алюминия, фосфата алюминиякалия или их комбинации, в концентрациях 0,05-5 мг, например, 0,075-1,0 мг алюминия на дозу.
F-белки RSV до слияния можно также вводить в комбинации с наночастицами или в виде конъюгированных с наночастицами, такими как, например, полимеры, липосомы, виросомы, вирусоподобные частицы. F-белки до слияния могут быть комбинированы с наночастицами, инкапсулированы в наночастицах или конъюгированы с наночастицами с адъювантом или без него. Инкапсулирование в липосомы описано, например, в US 4235877. Конъюгирование с макромолекулами раскрыто, например, в US 4372945 или US 4474757. В других вариантах осуществления F-белки RSV собирают в сборки мультимеров более высоких порядков.
В других вариантах осуществления композиции не содержат адъювантов.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способы получения вакцины против респираторного синцитиального вируса (RSV), предусматривающие обеспечение композиции в соответствии с настоящим изобретением и помещение ее в фармацевтически приемлемую композицию. Термин вакцина относится к средству или композиции, содержащим активный компонент, который является эффективным для индуцирования у субъекта определенной степени иммунитета к определенному патогенному микроорганизму или заболеванию, которые приведут по меньшей мере к снижению (до полного отсутствия включительно) тяжести, продолжительности или другого проявления симптомов, ассоциированных с инфекцией, вызванной патогенным микроорганизмом, или заболеванием. В настоящем изобретении вакцина содержит эффективное количество F-белка RSV до слияния, и/или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей F-белок RSV до слияния, и/или вектор, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты, которое вызывает формирование иммунного ответа на F-белок RSV. Это обеспечивает способ предупреждения тяжелого заболевания нижних дыхательных путей, приводящего к госпитализации, и снижает частоту осложнений, таких как пневмония и бронхиолит у субъекта вследствие инфекции и репликации RSV. В соответствии с настоящим изобретением термин вакцина подразумевает, что она представляет собой фармацевтическую композицию и, таким образом, обычно включает фармацевтически приемлемые разбавитель, носитель или наполнитель. Она может содержать дополнительные активные ингредиенты или не содержать их. В определенных вариантах осуществления она может представлять собой комбинированную вакцину, которая дополнительно содержит другие компоненты, которые индуцируют иммунный ответ, например, против других белков RSV и/или
- 9 039124 против других возбудителей инфекции. Введение дополнительных активных компонентов можно, например, осуществлять путем отдельного введения или путем введения комбинации продуктов из вакцин по настоящему изобретению и дополнительных активных компонентов.
Композиции можно вводить субъекту, например субъекту-человеку. Суммарная доза F-белков RSV в композиции для однократного введения может составлять, например, от приблизительно 0,01 мкг до приблизительно 10 мг, например 1 мкг - 1 мг, например 10 мкг - 100 мкг. Определение рекомендуемой дозы будет осуществляться в процессе эксперимента и является стандартным для специалистов в данной области.
Введение композиций в соответствии с настоящим изобретением можно осуществлять с помощью стандартных путей введения. Неограничивающие варианты осуществления включают парентеральное введение, такое как внутрикожное, внутримышечное, подкожное, чрескожное введение или введение через слизистые, например интраназальное, пероральное и т.п. В одном варианте осуществления композицию вводят путем внутримышечной инъекции. Специалисту в данной области известны различные варианты введения композиции, например вакцины, для индуцирования иммунного ответа на антиген (антигены), присутствующий (присутствующие) в вакцине.
Субъект, как используется в данном документе, предпочтительно представляет собой млекопитающее, например грызуна, например мышь, хлопкового хомяка, или примата, отличного от человека, или человека. Предпочтительно субъектом является субъект-человек.
Белки, молекулы нуклеиновых кислот, векторы и/или композиции также можно вводить в виде примирования или в виде усиления в гомологичном или гетерологичном режиме примирования/усиления. При осуществлении бустерной вакцинации, как правило, такую бустерную вакцину будут вводить одному и тому же субъекту с промежутком времени от одной недели до одного года, предпочтительно от двух недель до четырех месяцев, после введения композиции субъекту в первый раз (что в данном случае называется примирующей вакцинацией). В определенных вариантах осуществления введение предусматривает примирование и по меньшей мере одно бустерное введение.
Кроме того, белки по настоящему изобретению могут применяться в качестве диагностического средства, например для тестирования иммунного статуса индивидуума путем установления способности антител в сыворотке крови такого индивидуума к связыванию с белком по настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение также относится к in vitro диагностическому способу выявления у пациента наличия инфекции, вызванной RSV, при этом указанный способ включает стадии a) приведения биологического образца, полученного от указанного пациента, в контакт с белком в соответствии с настоящим изобретением и b) выявления присутствия комплексов антитело-белок.
Стабилизированные F-белки RSV до слияния, получаемые и/или полученные таким способом, тоже образуют часть настоящего изобретения, а также пути их применения, как описано выше.
Примеры
Пример 1. Получение стабильного F-полипептида RSV до слияния с SEQ ID NO: 21.
Для увеличения стабильности F-белка RSV в конформации до слияния в вариант F-белка RSV до слияния, который был описан ранее (WO 2014/174018 и WO 2014/202570), вводили две дополнительные аминокислотные замены. Конструкции синтезировали и подвергали оптимизации по кодонам в Gene Art (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния). Конструкции клонировали в pCDNA2004 или создавали с помощью стандартных способов, широко известных в данной области, включая сайт-направленный мутагенез и ПЦР, и проводили секвенирование. Используемой системой экспрессии были клетки 293Freestyle (Life Technologies). Клетки подвергали временной трансфекции с помощью 293Fectin (Life Technologies) в соответствии с инструкциями изготовителя и культивировали в течение 5 дней при 37°C и 10% СО2. Супернатант культуры собирали и центрифугировали в течение 5 мин при 300 g для удаления клеток и клеточного дебриса. Отцентрифугированный супернатант затем подвергали стерилизующей фильтрации с применением вакуумного фильтра с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C до применения.
Пример 2. Очистка F-белка RSV до слияния.
Рекомбинантный полипептид очищали с помощью 2-стадийного протокола очистки с применением катион-обменной колонки для первичной очистки, а затем колонки superdex200 для завершающей стадии с удалением остаточных примесей. Для исходной ионообменной стадии супернатант культуры разбавляли 2 объемами по 50 мМ NaOAc, pH 5,0, и пропускали через колонку HiTrap Capto S объемом 5 мл при скорости 5 мл/мин. Затем колонку промывали 10 объемами, соответствующими объему колонки (CV), по 20 мМ NaOAc, 50 мМ NaCl, 0,01% (об./об.) tween20, pH 5 и элюировали 2 CV по 20 мМ NaOAc, 1 M NaCl, 0,01% (об./об.) tween20, pH 5. Элюат концентрировали с помощью концентратора-центрифуги, а затем белок очищали с помощью колонки superdex200 с использованием 40 мМ Tris, 500 мМ NaCl, 0,01% (об./об.) tween20, pH 7,4, в качестве подвижного буфера. На фиг. 1 представлена хроматограмма содержимого гель-фильтрационной колонки. Главный пик содержал F-белок RSV до слияния. Фракции, составляющие этот пик, снова объединяли, и определяли концентрацию белка при OD280, и хранили при 4°C до применения. На фиг. 2 представлен результат SDS-PAGE-анализа в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях для конечного препарата белка, и, как можно увидеть, чистота составляла
- 10 039124 >95%. Идентичность полосы подтверждали с помощью вестерн-блоттинга и специфических к F-белку антител (не показано).
Для определения концентрации белка в образцах супернатанта использовали систему количественного анализа Octet (интерферометрия биослоя). CR9501 (антитело, специфично распознающее F-белок RSV до слияния) и CR9503 (распознающее F-белок RSV после слияния) биотинилировали в соответствии со стандартными протоколами и иммобилизовали на стрептавидиновых биосенсорах (ForteBio, Портсмут, Великобритания). После этого покрытые биосенсоры блокировали в супернатанте ложнотрансфицированных клеточных культур. Количественный эксперимент выполняли следующим образом: температура 30°C, скорость встряхивания 1000 об./мин, время анализа 300 с.
Концентрацию белка рассчитывали с применением калибровочной кривой. Калибровочную кривую получали для каждого покрытого антитела с применением F-белка RSV до слияния (Krarup et. al., 2015, выше), разведенного в контроле среды (фиг. 3). Анализ данных выполняли с помощью программного обеспечения ForteBio Data Analysis 6.4 (ForteBio).
Пример 3. Термостабильность F-белка RSV.
Термостабильность очищенного белка определяли с помощью дифференциальной сканирующей флуорометрии (DSF). Очищенный F-белок до слияния смешивали с оранжевым флуоресцентным красителем SYPRO (Life Technologies S6650) в 96-луночном планшете для оптической qPCR. Оптимальную концентрацию красителя и белка определяли экспериментально (данные не показаны). Разведения белка выполняли в PBS, а в качестве вычитаемого эталонного значения использовали значения образца отрицательного контроля, содержащего только краситель. Измерение проводили с помощью прибора для qPCR (Applied Biosystems ViiA 7) с использованием следующих параметров: температурный диапазон 25-95°C со скоростью 0,015°C/c. Данные собирали в непрерывном режиме. Кривые плавления строили с применением программного обеспечения GraphPad PRISM (версия 5.04). Значения температуры плавления рассчитывали при 50% значении максимальной флуоресценции с применением нелинейного уравнения сдвига ЕС50. Температура плавления F-белка RSV с SEQ ID NO: 21 составляла 68,5° (фиг. 4). Контрольный F-белок RSV до слияния без замен в положениях 357 и 371 имел температуру плавления, составляющую 65,0, что значит, что двойная мутация повышала температуру плавления на 3,5°.
Таблица 1. Стандартные аминокислоты, сокращения и свойства
| Амино кислота | 3буквенный код | 1буквенный код | Полярность боковой цепи | Заряд боковой цепи (pH 7,4) |
| аланин | Ala | A | неполярная | Нейтральный |
| аргинин | Arg | R | полярная | Положительный |
| аспарагин | Asn | N | полярная | Нейтральный |
| аспарагиновая кислота | Asp | D | полярная | Отрицательный |
| цистеин | Cys | C | неполярная | Нейтральный |
- 11 039124
| глутаминовая кислота | Glu | E | полярная | Отрицательный |
| глутамин | Gln | Q | полярная | Нейтральный |
| глицин | Gly | G | неполярная | Нейтральный |
| гистидин | His | H | полярная | Положительный (10%); нейтральный (90%) |
| изолейцин | lie | I | неполярная | Нейтральный |
| лейцин | Leu | L | неполярная | Нейтральный |
| лизин | Lys | К | полярная | Положительный |
| метионин | Met | M | неполярная | Нейтральный |
| фенилаланин | Phe | F | неполярная | Нейтральный |
| пролин | Pro | P | неполярная | Нейтральный |
| серин | Ser | S | полярная | Нейтральный |
| треонин | Thr | T | полярная | Нейтральный |
| триптофан | Trp | W | неполярная | Нейтральный |
| тирозин | Tyr | Y | полярная | Нейтральный |
| валин | Val | V | неполярная | Нейтральный |
Таблица 2. Аминокислотные последовательности антител CR9501 и CR9502
| АЬ | Домен VH | CDR1 VH | CDR2 VH | CDR3 VH |
| CR9501 | Аминокислоты 1-125 из SEQ ID NO: 16 | GASINSDNYYWT (SEQ ID NO: 1) | HISYTGNTYYTPSLK S (SEQ ID NO :2) | CGAYVLISNCGWFDS (SEQ ID NO :3) |
| CR9502 | Аминокислоты 1-121 из SEQ ID NO: 18 | GFTFSGHTIA (SEQ ID NO: 7) | WVSTNNGNTEYAQKI QG (SEQ ID NO :8) | EWLVMGGFAFDH (SEQ ID NO:9) |
| АЬ | Домен VL | CDR1 VL | CDR2 VL | CDR3 VL |
| CR9501 | Аминокислоты 1-107 из SEQ ID NO: 17 | QASQDISTYLN (SEQ ID NO: 4) | GASNLET (SEQ ID NO :5) | QQYQYLPYT (SEQ ID NO:6) |
| CR9502 | Аминокислоты 1-110 из SEQ ID NO: 19 | GANNIGSQNVH (SEQ ID NO :10) | DDRDRPS (SEQ ID NO:11) | QVWDSSRDQAVI (SEQ ID NO:12) |
Последовательности.
Полноразмерная последовательность F-белка RSV подгруппы А (SEQ ID NO: 13)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI
ELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK
- 12 039124
KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR KSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIA FSN
Полноразмерная последовательность F-белка RSV Bl (SEQ ID NO: 15)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITI ELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTK NLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV SLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR RSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIWLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIA FSK
SEQ ID NO: 14 (фибритин)
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVL L S T FL
Полноразмерная последовательность F-белка RSV CL57-v224 (SEQ ID NO: 20)
MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNTKNNNVT LSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNI DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD TVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL LHNVNVGKSTTNIMITTIIIVIIVILLLLIAVGLFLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
F-белок RSV c N67I, S215P, D486N, и 357K, и 371Y (SEQ ID NO: 21)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI
- 13 039124
ELSNIKEIKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAEKCKVQSNRVFCDTMYSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIR KSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
Тяжелая цепь CR9501 (SEQ ID NO: 16):
QVQLVQSGPGLVKPSQTLALTCNVSGASINSDNYYWTWIRQRPGGGLEWIGHISYTGNT
YYTPSLKSRLSMSLETSQSQFSLRLTSVTAADSAVYFCAACGAYVLISNCGWFDSWGQGTQVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
Легкая цепь CR9501 (SEQ ID NO: 17):
EIVMTQSPSSLSASIGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGQAPRLLIYGASNLETGVP
SRFTGSGYGTDFSVTISSLQPEDIATYYCQQYQYLPYTFAPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC
Тяжелая цепь CR9502 (SEQ ID NO: 18):
EVQLLQSGAELKKPGASVKISCKTSGFTFSGHTIAWVRQAPGQGLEWMGWVSTNNGNTE
YAQKIQGRVTMTMDTSTSTVYMELRSLTSDDTAVYFCAREWLVMGGFAFDHWGQGTLLTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC
Легкая цепь CR9502 (SEQ ID NO: 19):
QSVLTQASSVSVAPGQTARITCGANNIGSQNVHWYQQKPGQAPVLWYDDRDRPSGIPD
RFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSRDQAVIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPP SSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQ WKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTIAPTECS
Claims (15)
1. Стабильный рекомбинантный белок слияния (F) респираторно-синцитиального вируса (RSV) до слияния, содержащий мутацию аминокислоты S в положении 215 в Р (S215P), мутацию аминокислоты Т в положении 357 в K (Т357К) и мутацию аминокислоты N в положении 371 в Y (N371Y), где указанные аминокислотные положения относятся к SEQ ID NO: 13.
2. F-белок RSV до слияния по п.1, содержащий по меньшей мере одну дополнительную мутацию, выбранную из группы, состоящей из (а) мутации аминокислотного остатка N/T в положении 67 в I;
(b) мутации аминокислотного остатка D в положении 486 в N.
3. F-белок RSV до слияния по любому из предыдущих пунктов, где белок содержит по меньшей мере один эпитоп, который является специфическим для конформации F-белка до слияния, где по меньшей мере один эпитоп распознается моноклональным антителом, специфическим к конформации до слияния, содержащим CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 1, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2, CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 3 и CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 4, CDR2участок легкой цепи с SEQ ID NO: 5 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 6, и/или моноклональным антителом, специфичным к конформации до слияния, содержащим CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 7, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 8, CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 9 и CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 10, CDR2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 67 и CDR3участок легкой цепи с SEQ ID NO: 11.
- 14 039124
4. F-белок RSV до слияния по любому из предыдущих пунктов, где белок является тримерным.
5. F-белок RSV до слияния по любому из предыдущих пунктов, содержащий усеченный домен F1 и гетерологичный домен тримеризации, связанный с указанным усеченным доменом F1.
6. F-белок RSV до слияния по п.5, где гетерологичный домен тримеризации содержит аминокислотную последовательность GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 14).
7. F-белок RSV до слияния по п.5 или 6, где домен тримеризации связан с аминокислотным остатком 513 F-белка RSV.
8. F-белок RSV до слияния по любому из предыдущих пунктов, где F-белок RSV содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 21.
9. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая F-белок RSV до слияния по любому из предыдущих пп.1-8.
10. Молекула нуклеиновой кислоты по п.9, где молекула нуклеиновой кислоты была оптимизирована по кодонам для экспрессии в клетках млекопитающего.
11. Экспрессионный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.9 или 10.
12. Композиция для индуцирования иммунного ответа на F-белок RSV, содержащая F-белок RSV до слияния по любому из пп.1-8, молекулу нуклеиновой кислоты по п.9 или 10 и/или вектор по п.11.
13. Применение F-белка RSV до слияния по любому из пп.1-8 в индуцировании иммунного ответа на F-белок RSV.
14. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по п.9 или 10 в индуцировании иммунного ответа на F-белок RSV.
15. Применение вектора по п.11 в индуцировании иммунного ответа на F-белок RSV.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP16172008 | 2016-05-30 | ||
| PCT/EP2017/062875 WO2017207480A1 (en) | 2016-05-30 | 2017-05-29 | Stabilized pre-fusion rsv f proteins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201892702A1 EA201892702A1 (ru) | 2019-05-31 |
| EA039124B1 true EA039124B1 (ru) | 2021-12-08 |
Family
ID=56131313
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201892702A EA039124B1 (ru) | 2016-05-30 | 2017-05-29 | Стабилизированные f-белки rsv до слияния |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10953087B2 (ru) |
| EP (1) | EP3464331B1 (ru) |
| JP (1) | JP2019523644A (ru) |
| KR (1) | KR102421049B1 (ru) |
| CN (1) | CN109311946A (ru) |
| AU (2) | AU2017272504A1 (ru) |
| BR (1) | BR112018074483A2 (ru) |
| CA (1) | CA3025441A1 (ru) |
| CL (1) | CL2018003383A1 (ru) |
| DK (1) | DK3464331T3 (ru) |
| EA (1) | EA039124B1 (ru) |
| ES (1) | ES2836598T3 (ru) |
| IL (1) | IL264119B2 (ru) |
| MX (1) | MX2018014699A (ru) |
| MY (1) | MY194419A (ru) |
| PE (1) | PE20190110A1 (ru) |
| PH (1) | PH12018502332A1 (ru) |
| PL (1) | PL3464331T3 (ru) |
| SG (1) | SG11201810078PA (ru) |
| WO (1) | WO2017207480A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201808094B (ru) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9630994B2 (en) | 2014-11-03 | 2017-04-25 | University Of Washington | Polypeptides for use in self-assembling protein nanostructures |
| KR102638978B1 (ko) | 2015-07-07 | 2024-02-22 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | Rsv에 대한 백신 |
| EA201892250A1 (ru) | 2016-04-05 | 2019-03-29 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Вакцина против rsv |
| PH12022552125A1 (en) | 2016-04-05 | 2023-04-12 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Stabilized soluble pre-fusion rsv f proteins |
| EA039124B1 (ru) | 2016-05-30 | 2021-12-08 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Стабилизированные f-белки rsv до слияния |
| KR102774312B1 (ko) | 2017-04-04 | 2025-03-05 | 유니버시티 오브 워싱톤 | 파라믹소바이러스 및/또는 뉴모바이러스 f 단백질을 표시하는 자가-조립 단백질 나노구조체 및 이의 용도 |
| KR20250067954A (ko) | 2018-02-28 | 2025-05-15 | 유니버시티 오브 워싱톤 | 자기 조립 나노구조 백신 |
| MX2021005607A (es) * | 2018-11-13 | 2021-06-30 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Proteinas f de prefusion del vrs estabilizadas. |
| US20220306697A1 (en) | 2019-09-04 | 2022-09-29 | University Of Washington | Self-Assembling Protein Nanostructures Displaying Paramyxovirus and/or Pneumovirus F Proteins and Their Use |
| MX2022012361A (es) | 2020-04-02 | 2022-10-21 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Composiciones de vacuna estabilizadas. |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014174018A1 (en) * | 2013-04-25 | 2014-10-30 | Crucell Holland B.V. | Stabilized soluble prefusion rsv f polypeptides |
| WO2015013551A1 (en) * | 2013-07-25 | 2015-01-29 | Marshall Christopher Patrick | Conformationally stabilized rsv pre-fusion f proteins |
Family Cites Families (110)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4235877A (en) | 1979-06-27 | 1980-11-25 | Merck & Co., Inc. | Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit |
| US4372945A (en) | 1979-11-13 | 1983-02-08 | Likhite Vilas V | Antigen compounds |
| IL61904A (en) | 1981-01-13 | 1985-07-31 | Yeda Res & Dev | Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same |
| DE3584341D1 (de) | 1984-08-24 | 1991-11-14 | Upjohn Co | Rekombinante dna-verbindungen und expression von polypeptiden wie tpa. |
| US5168062A (en) | 1985-01-30 | 1992-12-01 | University Of Iowa Research Foundation | Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence |
| US5057540A (en) | 1987-05-29 | 1991-10-15 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin adjuvant |
| NZ230747A (en) | 1988-09-30 | 1992-05-26 | Bror Morein | Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina |
| WO1990014837A1 (en) | 1989-05-25 | 1990-12-13 | Chiron Corporation | Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion |
| US5994108A (en) | 1991-11-05 | 1999-11-30 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Mutant TAR virus and transdominant tat mutants as pharmacological agents |
| FR2705686B1 (fr) | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes. |
| EP1548118A2 (en) | 1994-06-10 | 2005-06-29 | Genvec, Inc. | Complementary adenoviral vector systems and cell lines |
| US5851806A (en) | 1994-06-10 | 1998-12-22 | Genvec, Inc. | Complementary adenoviral systems and cell lines |
| US5965541A (en) | 1995-11-28 | 1999-10-12 | Genvec, Inc. | Vectors and methods for gene transfer to cells |
| US5846782A (en) | 1995-11-28 | 1998-12-08 | Genvec, Inc. | Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs |
| US5559099A (en) | 1994-09-08 | 1996-09-24 | Genvec, Inc. | Penton base protein and methods of using same |
| US5786464C1 (en) | 1994-09-19 | 2012-04-24 | Gen Hospital Corp | Overexpression of mammalian and viral proteins |
| AUPM873294A0 (en) | 1994-10-12 | 1994-11-03 | Csl Limited | Saponin preparations and use thereof in iscoms |
| US5837520A (en) | 1995-03-07 | 1998-11-17 | Canji, Inc. | Method of purification of viral vectors |
| WO1997000326A1 (en) | 1995-06-15 | 1997-01-03 | Introgene B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
| US5837511A (en) | 1995-10-02 | 1998-11-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Non-group C adenoviral vectors |
| US5891690A (en) | 1996-04-26 | 1999-04-06 | Massie; Bernard | Adenovirus E1-complementing cell lines |
| CZ438398A3 (cs) | 1996-07-01 | 1999-03-17 | Rhone-Poulenc Rorer S. A. | Způsob přípravy rekombinantních adenovirů |
| FR2751343B1 (fr) | 1996-07-16 | 1998-12-18 | Transgene Sa | Procede de conservation de virus recombinants infectieux, suspension aqueuse virale et utilisation comme medicament |
| WO1998010087A1 (en) | 1996-09-06 | 1998-03-12 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Chimpanzee adenovirus vectors |
| ATE348155T1 (de) | 1996-11-20 | 2007-01-15 | Introgen Therapeutics Inc | Ein verbessertes verfahren zur produktion und reinigung von adenoviralen vektoren |
| US7732129B1 (en) | 1998-12-01 | 2010-06-08 | Crucell Holland B.V. | Method for the production and purification of adenoviral vectors |
| US6261823B1 (en) | 1996-12-13 | 2001-07-17 | Schering Corporation | Methods for purifying viruses |
| US5851808A (en) | 1997-02-28 | 1998-12-22 | Baylor College Of Medicine | Rapid subcloning using site-specific recombination |
| EP0973866A4 (en) | 1997-03-04 | 2000-04-19 | Baxter Int | ADENOVIRUS E1-COMPLEMENTING CELL LINES |
| US6020191A (en) | 1997-04-14 | 2000-02-01 | Genzyme Corporation | Adenoviral vectors capable of facilitating increased persistence of transgene expression |
| US6210683B1 (en) | 1997-09-05 | 2001-04-03 | Merck & Co., Inc. | Stabilizers containing recombinant human serum albumin for live virus vaccines |
| ES2290613T3 (es) | 1998-02-17 | 2008-02-16 | Schering Corporation | Composiciones que comprenden virus y metodos para concentrar preparaciones de virus. |
| US5981225A (en) | 1998-04-16 | 1999-11-09 | Baylor College Of Medicine | Gene transfer vector, recombinant adenovirus particles containing the same, method for producing the same and method of use of the same |
| US6113913A (en) | 1998-06-26 | 2000-09-05 | Genvec, Inc. | Recombinant adenovirus |
| WO2000029024A1 (en) | 1998-11-16 | 2000-05-25 | Introgen Therapeutics, Inc. | Formulation of adenovirus for gene therapy |
| US6225289B1 (en) | 1998-12-10 | 2001-05-01 | Genvec, Inc. | Methods and compositions for preserving adenoviral vectors |
| ATE364707T1 (de) | 1999-05-17 | 2007-07-15 | Crucell Holland Bv | Rekombinanter humaner adenovirus-serotyp 35 |
| US6913922B1 (en) | 1999-05-18 | 2005-07-05 | Crucell Holland B.V. | Serotype of adenovirus and uses thereof |
| US6492169B1 (en) | 1999-05-18 | 2002-12-10 | Crucell Holland, B.V. | Complementing cell lines |
| US6281823B1 (en) | 1999-09-21 | 2001-08-28 | Agere Systems Guardian Corp. | Direct digital synthesis using a sine weighted DAC |
| DE19955558C2 (de) | 1999-11-18 | 2003-03-20 | Stefan Kochanek | Permanente Amniozyten-Zelllinie, ihre Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Gentransfervektoren |
| CA2399321C (en) | 2000-03-07 | 2013-04-30 | Robert K. Evans | Adenovirus formulations |
| JP2004519204A (ja) | 2000-05-08 | 2004-07-02 | ダビスコ フーズ インターナショナル インコーポレーテッド | 抗高血圧ペプチドの生成のための乳漿タンパク質の酵素処理、得られた産物、および哺乳動物における高血圧の処置 |
| US6861529B2 (en) | 2001-07-06 | 2005-03-01 | Pfizer Inc | Cycloalkypyrrole-3-carboxylic acid derivatives and heterocycloalkylpyrrole-3-carboxylic acid derivatives |
| AUPR878401A0 (en) | 2001-11-09 | 2001-12-06 | Biota Holdings Ltd | Methods for identifying or screening anti-viral agents |
| WO2003049764A1 (en) | 2001-12-12 | 2003-06-19 | Fh Faulding & Co Limited | Composition for viral preservation |
| EP1465664A1 (en) | 2002-01-18 | 2004-10-13 | Schering Aktiengesellschaft | Stabilized formulations of adenovirus |
| US20030180936A1 (en) | 2002-03-15 | 2003-09-25 | Memarzadeh Bahram Eric | Method for the purification, production and formulation of oncolytic adenoviruses |
| CN100497639C (zh) | 2002-04-25 | 2009-06-10 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 生产腺病毒载体的手段和方法 |
| EP1497440B1 (en) | 2002-04-25 | 2008-08-20 | Crucell Holland B.V. | Stable adenoviral vectors and methods for propagation thereof |
| DE60313451T2 (de) | 2002-05-14 | 2008-01-03 | Merck & Co., Inc. | Verfahren zur reinigung von adenovirus |
| SE0202110D0 (sv) | 2002-07-05 | 2002-07-05 | Isconova Ab | Iscom preparation and use thereof |
| EP1585964A4 (en) | 2002-08-28 | 2008-07-16 | Introgen Therapeutics Inc | CHROMATOGRAPHIC METHODS FOR PURIFYING ADENOVIRUSES |
| SE0301998D0 (sv) | 2003-07-07 | 2003-07-07 | Isconova Ab | Quil A fraction with low toxicity and use thereof |
| EP1711518B1 (en) | 2004-01-23 | 2009-11-18 | Istituto di Richerche di Biologia Molecolare P. Angeletti S.p.A. | Chimpanzee adenovirus vaccine carriers |
| EP1780269B1 (en) | 2004-02-23 | 2009-07-08 | Crucell Holland B.V. | Virus purification methods |
| DK1869171T4 (en) | 2005-04-11 | 2016-01-18 | Crucell Holland Bv | Virus cleaning using ultrafiltration |
| WO2007104792A2 (en) | 2006-03-16 | 2007-09-20 | Crucell Holland B.V. | Recombinant adenoviruses based on serotype 26 and 48, and use thereof |
| US20090110695A1 (en) | 2006-03-27 | 2009-04-30 | Menzo Jans Emko Havenga | Compositions Comprising a Recombinant Adenovirus and an Adjuvant |
| EP2099486A2 (en) | 2006-11-30 | 2009-09-16 | Government Of The United States Of America, As Represented by the Secretary | Codon modified immunogenic compositions and methods of use |
| US7901388B2 (en) | 2007-07-13 | 2011-03-08 | Bacoustics, Llc | Method of treating wounds by creating a therapeutic solution with ultrasonic waves |
| MX2010007107A (es) | 2007-12-24 | 2010-12-21 | Id Biomedical Corp Quebec | Antigenos de virus del sincicio respiratorio recombinantes. |
| CA2717142A1 (en) | 2008-02-29 | 2009-09-03 | Tibotec Pharmaceuticals | Method for identifying inhibitors against viruses that use a class i fusion protein |
| US8225289B2 (en) | 2008-03-04 | 2012-07-17 | Wind River Systems, Inc. | Method and system for improved tool interaction with a target |
| WO2010060719A1 (en) | 2008-11-03 | 2010-06-03 | Crucell Holland B.V. | Method for the production of adenoviral vectors |
| EP3718566B1 (en) | 2008-12-09 | 2024-06-12 | Novavax, Inc. | Modified rsv f proteins and methods of their use |
| CN101464897A (zh) | 2009-01-12 | 2009-06-24 | 阿里巴巴集团控股有限公司 | 一种词匹配及信息查询方法及装置 |
| SG172935A1 (en) | 2009-02-02 | 2011-08-29 | Okairos Ag | Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof |
| CA2766211A1 (en) | 2009-06-24 | 2010-12-29 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Recombinant rsv antigens |
| CA2766205A1 (en) | 2009-06-24 | 2010-12-29 | Id Biomedical Corporation Of Quebec | Vaccine comprising at least two paramyxovirus f protein antigens |
| CA2768186A1 (en) | 2009-07-15 | 2011-01-20 | Novartis Ag | Rsv f protein compositions and methods for making same |
| ES2553440T3 (es) | 2009-08-13 | 2015-12-09 | Crucell Holland B.V. | Anticuerpos contra el virus sincitial respiratorio humano (VSR) y método de uso |
| EP2488636B1 (en) | 2009-10-15 | 2014-03-12 | Crucell Holland B.V. | Method for the purification of adenovirus particles from high cell density cultures |
| CN102575233B (zh) | 2009-10-15 | 2014-07-16 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 从高细胞密度培养物纯化腺病毒的方法 |
| WO2011050168A2 (en) | 2009-10-21 | 2011-04-28 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic | Rsv immunogens, antibodies and compositions thereof |
| DK2536829T3 (en) | 2010-02-15 | 2016-07-04 | Crucell Holland Bv | A process for the production of Ad26-adenovirus vectors |
| US8772258B2 (en) | 2010-07-02 | 2014-07-08 | Ensysce Biosciences, Inc. | Single walled carbon nanotube/sirna complexes and methods related thereto |
| MX343298B (es) | 2010-07-09 | 2016-11-01 | Crucell Holland Bv | Anticuerpos contra el virus sincitial respiratorio (rsv) humano y metodos de uso. |
| US8317672B2 (en) | 2010-11-19 | 2012-11-27 | Kensey Nash Corporation | Centrifuge method and apparatus |
| PL2707385T3 (pl) | 2011-05-13 | 2018-03-30 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Prefuzyjne antygeny RSV F |
| CA2864956C (en) | 2012-03-12 | 2021-11-09 | Crucell Holland B.V. | Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends |
| US8932607B2 (en) | 2012-03-12 | 2015-01-13 | Crucell Holland B.V. | Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends |
| KR102023791B1 (ko) | 2012-03-22 | 2019-09-23 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | Rsv에 대한 백신 |
| WO2014005643A1 (en) | 2012-07-05 | 2014-01-09 | Okairos Ag | Novel prime-boosting regimens involving immunogenic polypeptides encoded by polynucleotides |
| JP6210998B2 (ja) | 2012-11-15 | 2017-10-11 | 一般財団法人化学及血清療法研究所 | ベクターワクチンおよび生ワクチンの併用による感染症の予防方法 |
| US9738689B2 (en) | 2013-03-13 | 2017-08-22 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Prefusion RSV F proteins and their use |
| MX385818B (es) * | 2013-03-13 | 2025-03-18 | Us Health | Proteínas f de rsv de prefusión y su uso. |
| WO2014153160A2 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Peroxyium, Inc., Delaware C Corp. | METHOD OF ENHANCING THE BIODISTRIBUTION AND TISSUE TARGETING PROPERTIES OF THERAPEUTIC CeO2 PARTICLES VIA NANO-ENCAPSULATION AND COATING |
| US9060975B2 (en) * | 2013-03-14 | 2015-06-23 | Mucosis Bv | Heat-stable respiratory syncytial virus F protein oligomers and their use in immunological compositions |
| CN105189756B (zh) * | 2013-03-14 | 2021-06-11 | 爱默蕾大学 | 具有沉默突变的重组rsv、其相关疫苗和方法 |
| EP2986638A1 (en) | 2013-04-15 | 2016-02-24 | Crucell Holland B.V. | Human antibodies binding to rsv g proteins |
| CA2908878C (en) | 2013-04-15 | 2021-06-29 | Crucell Holland B.V. | Human antibodies binding to rsv g protein |
| PE20160045A1 (es) | 2013-06-17 | 2016-02-18 | Crucell Holland Bv | Polipeptidos f de prefusion del virus sincicial respiratorio (rsv) solubles y estabilizados |
| RS58393B1 (sr) | 2013-09-19 | 2019-04-30 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Poboljšanje adenovirusnih formulacija |
| JP6664338B2 (ja) | 2014-06-13 | 2020-03-13 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 免疫原性組合せ物 |
| JP6350376B2 (ja) | 2015-04-23 | 2018-07-04 | 住友金属鉱山株式会社 | 非水系電解質二次電池用正極活物質及びその製造方法、並びにその正極活物質を用いた非水系電解質二次電池 |
| KR20180026734A (ko) | 2015-07-07 | 2018-03-13 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 안정화된 가용성 융합-전 rsv f 폴리펩티드 |
| KR102638978B1 (ko) | 2015-07-07 | 2024-02-22 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | Rsv에 대한 백신 |
| PH12022552125A1 (en) | 2016-04-05 | 2023-04-12 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Stabilized soluble pre-fusion rsv f proteins |
| EA201892250A1 (ru) | 2016-04-05 | 2019-03-29 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Вакцина против rsv |
| EA039124B1 (ru) | 2016-05-30 | 2021-12-08 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Стабилизированные f-белки rsv до слияния |
| US10522129B2 (en) | 2016-10-06 | 2019-12-31 | Gopro, Inc. | Active acoustic and vibration noise canceling in waterproof camera |
| KR102771459B1 (ko) | 2016-11-18 | 2025-02-25 | 삼성전자주식회사 | 복합양극활물질, 이를 채용한 양극과 리튬전지 및 그 제조방법 |
| AU2018267971A1 (en) | 2017-05-17 | 2019-11-07 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against RSV infection |
| JP2020533367A (ja) | 2017-09-15 | 2020-11-19 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． | Ｒｓｖに対する免疫の安全な誘導方法 |
| MX2021005607A (es) | 2018-11-13 | 2021-06-30 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Proteinas f de prefusion del vrs estabilizadas. |
| CA3137448A1 (en) | 2019-04-25 | 2020-10-29 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Recombinant influenza antigens |
| KR20220008816A (ko) | 2019-05-15 | 2022-01-21 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 아데노바이러스 기반 백신을 사용한 호흡기 세포융합 바이러스 감염의 예방적 치료 |
| MX2022012361A (es) | 2020-04-02 | 2022-10-21 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Composiciones de vacuna estabilizadas. |
| AU2021302535A1 (en) | 2020-06-29 | 2023-02-09 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Vaccine combination against respiratory syncytial virus infection |
-
2017
- 2017-05-29 EA EA201892702A patent/EA039124B1/ru unknown
- 2017-05-29 DK DK17728101.1T patent/DK3464331T3/da active
- 2017-05-29 MX MX2018014699A patent/MX2018014699A/es unknown
- 2017-05-29 US US16/305,169 patent/US10953087B2/en active Active
- 2017-05-29 EP EP17728101.1A patent/EP3464331B1/en active Active
- 2017-05-29 JP JP2018562665A patent/JP2019523644A/ja active Pending
- 2017-05-29 AU AU2017272504A patent/AU2017272504A1/en not_active Abandoned
- 2017-05-29 CA CA3025441A patent/CA3025441A1/en active Pending
- 2017-05-29 PL PL17728101T patent/PL3464331T3/pl unknown
- 2017-05-29 SG SG11201810078PA patent/SG11201810078PA/en unknown
- 2017-05-29 CN CN201780032415.9A patent/CN109311946A/zh active Pending
- 2017-05-29 MY MYPI2018002162A patent/MY194419A/en unknown
- 2017-05-29 BR BR112018074483-2A patent/BR112018074483A2/pt active Search and Examination
- 2017-05-29 KR KR1020187037067A patent/KR102421049B1/ko active Active
- 2017-05-29 WO PCT/EP2017/062875 patent/WO2017207480A1/en not_active Ceased
- 2017-05-29 ES ES17728101T patent/ES2836598T3/es active Active
- 2017-05-29 PE PE2018003120A patent/PE20190110A1/es unknown
- 2017-05-29 IL IL264119A patent/IL264119B2/en unknown
-
2018
- 2018-11-06 PH PH12018502332A patent/PH12018502332A1/en unknown
- 2018-11-28 CL CL2018003383A patent/CL2018003383A1/es unknown
- 2018-11-29 ZA ZA2018/08094A patent/ZA201808094B/en unknown
-
2021
- 2021-03-01 US US17/249,372 patent/US11759514B2/en active Active
- 2021-09-14 AU AU2021232702A patent/AU2021232702B2/en not_active Ceased
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014174018A1 (en) * | 2013-04-25 | 2014-10-30 | Crucell Holland B.V. | Stabilized soluble prefusion rsv f polypeptides |
| WO2015013551A1 (en) * | 2013-07-25 | 2015-01-29 | Marshall Christopher Patrick | Conformationally stabilized rsv pre-fusion f proteins |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL3464331T3 (pl) | 2021-04-19 |
| ZA201808094B (en) | 2022-05-25 |
| EP3464331A1 (en) | 2019-04-10 |
| AU2021232702B2 (en) | 2023-11-02 |
| KR102421049B1 (ko) | 2022-07-15 |
| CL2018003383A1 (es) | 2019-01-18 |
| IL264119B (en) | 2022-12-01 |
| US20200138940A1 (en) | 2020-05-07 |
| EP3464331B1 (en) | 2020-10-28 |
| SG11201810078PA (en) | 2018-12-28 |
| PH12018502332A1 (en) | 2019-05-15 |
| JP2019523644A (ja) | 2019-08-29 |
| CN109311946A (zh) | 2019-02-05 |
| US11759514B2 (en) | 2023-09-19 |
| AU2021232702A1 (en) | 2021-10-14 |
| BR112018074483A2 (pt) | 2019-03-19 |
| MY194419A (en) | 2022-11-30 |
| KR20190012193A (ko) | 2019-02-08 |
| MX2018014699A (es) | 2019-02-28 |
| EA201892702A1 (ru) | 2019-05-31 |
| DK3464331T3 (da) | 2021-01-18 |
| CA3025441A1 (en) | 2017-12-07 |
| IL264119B2 (en) | 2023-04-01 |
| WO2017207480A1 (en) | 2017-12-07 |
| AU2017272504A1 (en) | 2018-11-29 |
| ES2836598T3 (es) | 2021-06-25 |
| US20210205440A1 (en) | 2021-07-08 |
| PE20190110A1 (es) | 2019-01-15 |
| US10953087B2 (en) | 2021-03-23 |
| IL264119A (en) | 2019-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11034731B2 (en) | Stabilized soluble pre-fusion RSV F polypeptides | |
| US12331077B2 (en) | Stabilized pre-fusion RSV F proteins | |
| AU2021232702B2 (en) | Stabilized pre-fusion RSV F proteins | |
| KR20180027560A (ko) | Rsv에 대한 백신 | |
| WO2017207477A1 (en) | Stabilized pre-fusion rsv f proteins | |
| HK40000138B (en) | Stabilized pre-fusion rsv f proteins | |
| HK40000138A (en) | Stabilized pre-fusion rsv f proteins | |
| OA19273A (en) | Stabilized pre-fusion RSV F proteins. |