EA026006B1 - Соединения тетрагидропирролотиазина - Google Patents

Abstract

В изобретении предложено соединение формулы Iгде R представляет собой Н или F и А представляет собойили его фармацевтически приемлемая соль, которое применяется для лечения болезни Альцгеймера и других заболеваний и расстройств, связанных с β-амилоидным (Abeta) пептидом.

Description

Изобретение относится к новым соединениям тетрагидропирролотиазина, к фармацевтическим композициям, содержащим указанные соединения, к способам применения указанных соединений для лечения физиологических расстройств и к промежуточным соединениям и способам, пригодным для синтеза указанных соединений.

Изобретение относится к области лечения болезни Альцгеймера и других заболеваний и расстройств, связанных с β-амилоидным (АЬс1а) пептидом, нейротоксическим и высоко агрегированным пептидным сегментом белка-предшественника амилоида (АРР). Болезнь Альцгеймера представляет собой тяжелое нейродегенеративное расстройство, которое поражает миллионы пациентов во всем мире. Принимая во внимание утвержденные в настоящее время агенты на рынке, которые обеспечивают только временный симптоматический благоприятный эффект для пациента, существует значительная нереализованная потребность в лечении болезни Альцгеймера.

Болезнь Альцгеймера характеризуется образованием, агрегацией и отложением АЬе1а в головном мозге. Было показано, что полное или частичное ингибирование β-секретазы (β-участка фермента, расщепляющего белок-предшественник амилоида; ВАСЕ) оказывает существенное влияние на патологии, связанные с бляшками и зависимые от бляшек, в моделях мышей, на основании чего можно предположить, что даже незначительное снижение уровня Ав-пептида может привести к долговременному значительному снижению объема бляшек и синаптической недостаточности, обеспечивая тем самым значительные терапевтические преимущества, в частности, при лечении болезни Альцгеймера.

В И8 2009/0209755 раскрыты конденсированные производные аминодигидротиазина, которые обладают ВАСЕ-ингибирующей активностью и также описаны в качестве подходящих терапевтических агентов для нейродегенеративных заболеваний, вызванных Λβ-пептидом. таких как деменция по типу Альцгеймера. Кроме того, в I. Ыеигокаепсе, 31(46), сс. 16507-16516 (2011), раскрыт ^)-4-(2,4-дифтор-5пиримидин-5-илфенил)-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]тиазин-2-иламин, ЦНС-активный ингибитор ВАСЕ, вводимый перорально.

Для обеспечения лечения расстройств, опосредованных АЬе1а-пептидом, таких как болезнь Альцгеймера, желательны ингибиторы ВАСЕ, которые являются эффективными и имеют достаточную проникающую способность в ЦНС. В настоящем изобретении предложены некоторые новые соединения, которые являются эффективными ингибиторами ВАСЕ. Кроме того, в настоящем изобретении предложены некоторые новые соединения с проникающей способностью в ЦНС.

Таким образом, в настоящем изобретении предложено соединение формулы I

где К представляет собой Н или Р; и А представляет собой

или его фармацевтически приемлемая соль.

В настоящем изобретении также предложен способ лечения болезни Альцгеймера у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.

В настоящем изобретении также предложен способ предотвращения прогрессирования умеренного когнитивного нарушения до болезни Альцгеймера у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.

В настоящем изобретении также предложен способ ингибирования ВАСЕ у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.

В настоящем изобретении также предложен способ ингибирования ВАСЕ-опосредованного расщепления белка-предшественника амилоида, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.

В настоящем изобретении также предложен способ ингибирования продуцирования АЬе1а-пептида, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.

Кроме того, в настоящем изобретении предложено соединение формулы I или его фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии, в частности для лечения болезни Альцгеймера или для предотвращения прогрессирования умеренного когнитивного нарушения до болезни Альцгеймера. Даже более того, в настоящем изобретении предложено применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера. В

- 1 026006 настоящем изобретении также предложено применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для предотвращения прогрессирования умеренного когнитивного нарушения до болезни Альцгеймера. В настоящем изобретении также предложено применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для ингибирования ВАСЕ. Кроме того, в настоящем изобретении предложено применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для ингибирования продуцирования ЛЪе1а-пептида.

Кроме того, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами. В конкретном варианте реализации настоящего изобретения композиция дополнительно содержит один или более других терапевтических агентов. Настоящее изобретение также охватывает новые промежуточные соединения и способы синтеза соединений формулы I.

Умеренное когнитивное нарушение было определено как потенциальная продромальная фаза деменции, связанной с болезнью Альцгеймера, на основании клинических проявлений и прогрессирования у пациентов, у которых наблюдается умеренное когнитивное нарушение, до деменции Альцгеймера с течением времени. (Μοττίδ с1 а1., Атсй. №ито1, 58, 397-405 (2001); Ре1ег5еп с1 а1., Лге1т №ито1, 56, 303-308 (1999)). Термин предотвращение прогрессирования умеренного когнитивного нарушения до болезни Альцгеймера включает замедление, задержку или обращение прогрессирования умеренного когнитивного нарушения до болезни Альцгеймера у пациента.

Предпочтительное соединение представляет собой

или его фармацевтически приемлемую соль, особенно предпочтительно в форме свободного основания.

В настоящем документе термины лечение или лечить включают подавление, замедление, прекращение или обращение прогрессирования или тяжести существующего симптома или расстройства.

В настоящем документе термин пациент относится к человеку.

Термин ингибирование продуцирования АЪе1а-пептида обозначает снижение уровней АЪе1апептида у пациента ίη νίνο.

В настоящем документе термин эффективное количество относится к количеству или дозе соединения согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, которое при единичном или многократном введении дозы пациенту обеспечивает необходимый эффект у пациента при диагностике или лечении.

Эффективное количество может быть легко определено штатным диагностом, как специалистом в данной области, с применением известных методик и путем наблюдения результатов, полученных в аналогичных условиях. При определении эффективного количества для пациента штатный диагност рассматривает ряд факторов, включая, но не ограничиваясь ими, вид пациента; его размер, возраст и общее состояние здоровья; поражение конкретным заболеванием или расстройством; степень или поражение или тяжесть заболевания или расстройства; ответ индивидуального пациента; конкретное вводимое соединение; способ введения; характеристики биодоступности вводимого препарата; выбранную схему приема; применение сопутствующих лекарственных средств и другие существенные обстоятельства.

Соединения согласно настоящему изобретению в целом эффективны в широком диапазоне доз. Например, дозы в день обычно находятся в диапазоне от примерно 0,01 до примерно 20 мг/кг массы тела. В некоторых случаях уровни дозы ниже нижнего предела вышеуказанного диапазона могут быть более чем достаточными, тогда как в других случаях можно применять еще более высокие дозы с приемлемыми побочными эффектами, и, следовательно, вышеуказанный диапазон доз не предназначен для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом.

Соединения согласно настоящему изобретению предпочтительно изготавливают в форме фармацевтических композиций, вводимых любым путем, который делает данное соединение биологически доступным, включая пероральный и парентеральный пути. Наиболее предпочтительно такие композиции предназначены для перорального введения. Такие фармацевтические композиции и способы их получения хорошо известны в данной области. (см., например, РетищЮп: Т1е §шепсе апб Ртасйсе о£ РЬаттасу (Ό.Β. Тгоу, Εάίΐοτ, 2151 Εάίίίοη, ЫрршсоИ, ХУПЬапъ & ХУНЮт, 2006).

Специалисту в данной области будет понятно, что соединения согласно настоящему изобретению могут существовать в таутомерных формах, как показано на схеме А. В случае, когда в данной заявке приведена любая ссылка на один из конкретных таутомеров соединений согласно настоящему изобретению, следует понимать, что охвачены обе таутомерные формы и все их смеси.

- 2 026006

Соединения согласно настоящему изобретению или их соли могут быть получены различными методиками, известными в данной области, некоторые из которых проиллюстрированы ниже на схемах, в способах получения и примерах. Для получения соединений формулы I или их солей конкретные стадии синтеза для каждого из описанных путей могут быть объединены различными способами или в сочетании со стадиями из разных схем. Продукты каждой стадии в приведенных ниже схемах могут быть выделены с помощью традиционных способов, включая экстракцию, выпаривание, осаждение, хроматографию, фильтрование, растирание и кристаллизацию.

Некоторые стереохимические центры не определены, и некоторые заместители на следующих схемах были исключены для целей ясности и не предназначены для ограничения схем каким-либо образом. Более того, отдельные изомеры, энантиомеры или диастереомеры могут быть выделены или разделены любым специалистом в данной области в любой удобной точке в синтезе соединений формулы I такими способами, как селективные методики кристаллизации или хиральной хроматографии (см., например, 1. Нссщех е! а1., Епайютещ РасстаЮх. апй Ке8о1ийоп8, 1оЬп \УПсу апй δοηδ, 1пс., 1981, апй Е.Ь. ЕПс1 апй δ.Η. ХСйеп БЮгеосНепщПу о£ Огдатс Сотроипйх, ^Йеу-1п1ег8с1епсе, 1994). Обозначения изомер 1 и изомер 2 относятся к соединениям, которые элюируются посредством хиральной хроматографии в первую и вторую очередь, соответственно, и если хиральную хроматографию проводят в начале синтеза, то же самое обозначение применяют к последующим промежуточным соединениям и примерам. Кроме того, промежуточные соединения, описанные в следующих схемах, содержат ряд защитных групп азота. Переменная защитная группа может быть одинаковой или различной в каждом случае в зависимости от конкретных условий реакции и конкретных преобразований, которые должны быть проведены. Условия для введения защиты и снятия защиты хорошо известны специалистам в данной области и описаны в литературе (см., например, Огеепе'х Рго1есИуе Огоирх ш Огдатс δуηΐЬеδ^δ, РоийЬ ЕйНюп, Ьу Ре1ег О.М. \νιιΙδ апй ТЬеойота V. Огеепе, 1оЬп УПеу апй δοηδ, 1пс. 2007).

Специалисту в данной области будет понятно, что соединения согласно настоящему изобретению состоят из ядра, содержащего по меньшей мере два хиральных центра.

Несмотря на то что настоящее изобретение предусматривает все индивидуальные энантиомеры, а также смеси энантиомеров указанных соединений, включая рацематы, соединения с абсолютной конфигурацией при атомах углерода, отмеченных 1 и 2, как показано на схеме В, являются предпочтительными соединениями согласно настоящему изобретению.

Аббревиатуры, используемые в настоящем документе, определены согласно А1йг1сйт1са Ас1а, Уо1. 17, №. 1, 1984. Другие аббревиатуры определены следующим образом: АРР относится к белкупредшественнику амилоида; ВОС относится к трет-бутилоксикарбонилу; ΤδΡ относится к спинномозговой жидкости; ОСС относится к 1,3-дициклогексилкарбодиимиду; Э1С относится к диизопропилкарбодиимиду; ΌΜΕΜ относится к среде игла, модифицированной по способу Дульбекко; ДМСО относится к диметилсульфоксиду; ЕЭС1 относится к 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлориду; ее относится к энантиомерной чистоте; ЕЮАс относится к этилацетату; Ех относится к примеру; Р12 относится к среде Хама Р12; ΡΒδ относится к фетальной бычьей сыворотке; РКЕТ относится к резонансному переносу энергии флуоресценции; ΗΕΚ относится к эмбриональной почке человека; НОАс относится к уксусной кислоте; НОА1 относится к 1-гидрокси-7азобензотриазолу; НОВ! относится к 1-гидроксилбензотриазола гидрату; НРЬС относится к высокоэффективной жидкостной хроматографии; ч относится к часу или часам; 1С₅₀ относится к концентрации агента, которая вызывает 50% от максимального ингибирующего ответа, возможного для данного агента; мин относится к минуте или минутам; МТВЕ относится к метил-трет-бутиловому эфиру; РЭАРР относится к белку-предшественнику амилоида, полученному из тромбоцитов; Ргер относится к способу получения; КРИ относится к относительной единице флуоресценции; К относится к времени удерживания; КТ относится к комнатной температуре; 5СХ относится к обмену сильными катионами; 5РС относится к сверхкритической жидкостной хроматографии; и ТГФ относится к тетрагидрофурану.

В приведенных ниже схемах все заместители, если не указано иное, являются такими, как определено ранее. Реагенты и исходные материалы в целом легко доступны специалисту в данной области. Другие могут быть получены с помощью стандартных методик химии органических и гетероцикличе- 3 026006 ских соединений, которые аналогичны синтезу известных соединений с аналогичной структурой, и методик, описанных в способах получения и примерах, которые следуют далее, включая любые новые процедуры.

На схеме 1 показано образование оксимов (4) и (8). Каждый из оксимов может быть использован для образования бициклического изоксазола (5). Замещенная ароматическая группа может быть введена в любых точках синтеза, как показано на схеме 1, стадия 1 и стадия 7. РС представляет собой защитную группу, разработанную для аминогруппы, такую как карбаматы и аллил. Такие группы хорошо известны и приняты в данной области.

В реакции на стадии 2 кетон с бета галогеном (1) может быть алкилирован (3, стадия 1) защищенным аллиламином (2) с применением неорганического основания, такого как карбонат калия, и затем обработан гидроксиламина гидрохлоридом и органическим основанием, таким как пиридин в полярном протонном растворителе, таком как этанол, с получением оксима (4, стадия 2). Данный оксим (4) может затем быть превращен в бициклический изоксазол (5) с 3+2 циклизацией посредством некоторых способов, таких как нагревание оксима (4) в неполярном растворителе, таком как толуол или ксилены, с получением бициклического изоксазола (5, стадия 3). Кроме того, оксим может быть получен из диметилацеталя (6), который обрабатывают кислотой, такой как муравьиная кислота, с получением альдегида (7, стадия 4). На стадии 5 альдегид (7) может быть превращен в оксим (8) с помощью гидроксиламина гидрохлорида и основания, такого как натрия ацетата тригидрат. Бициклический изоксазол (9) может быть получен из оксима (8), как показано на стадии 6, с применением водного раствора натрия гипохлорита. На стадии 7 защищенный бициклический изоксазол (9) затем вступает в реакцию с ароматическим литийорганическим реагентом или реактивом Гриньяра с получением защищенного бициклического изоксазола (5).

Схема 2 он

Схема 2 иллюстрирует различные пути получения защищенного пирролотиазина (12). Защищенный бициклический изоксазол (5) может быть обработан порошкообразным Ζη в уксусной кислоте или никелем Ренея в полярном растворителе, таком как этанол, при условиях гидрирования под давлением с получением аминопирролидинметанола (13, стадия 11). Аминопирролидинметанол (13) затем вступает в реакцию с бензоилизотиоцианатом в полярном растворителе, таком как ТГФ, после чего следует добавление 1,1-карбонилдиимидазола (СЭ1) с получением конденсированного защищенного пирролидинтиазина (12, стадия 12). Кроме того, амин бициклического изоксазола (5) может вступать в реакцию с бензоилизотиоцианатом с получением тиомочевины (10, стадия 8), и затем, на стадии 9, изоксазольное кольцо может быть раскрыто под действием порошкообразного цинка в уксусной кислоте с получением

- 4 026006 гидроксильного соединения (11). Гидроксильное соединение (11) может затем быть обработано СИ1 в полярном апротонном растворителе, таком как ТГФ или 1-хлор-М,Ы,2-триметилпропениламин в ИСМ, с получением конденсированного защищенного пирролидинтиазина (12, стадия 10). Конденсированный пирролидинтиазин (12) может также быть получен посредством реакции Мицунобу, такой как с применением трифенилфосфина и диизопропилазодикарбоксилата (ΌΙΛΌ).

На схеме 3 показано превращение пирролотиазина (12) в анилин (14, стадия 13), который затем может быть алкилирован, после чего следует снятие защиты и гетероарилирование пирролидина. Снятие защиты тиазинамина приводит к образованию соединений формулы I.

Азидо-дегалогенирование проводят для подходящего пирролотиазина (12) в присутствии источника азида, такого как азид натрия. Такие реакции азидо-дегалогенирования хорошо известны и приняты в данной области. Восстановление полученного азидного промежуточного соединения до анилина (14, стадия 13) может быть осуществлено при условиях гидрирования, которые хорошо известны и описаны в данной области, или посредством восстанавливающих агентов, хорошо известных в данной области, таких как ЫА1Н₄, ЫаВН₄, РРй₃.

С пирролидина, защищенного ВОС, защита может быть снята в условиях кислой среды, хорошо известных в данной области (стадия 1 стадии 14). Пирролидин со снятой защитой затем может быть гетероарилирован посредством нуклеофильного ароматического замещения (δΝΑτ) замещенным ароматическим пиримидином с применением органического основания, такого как диизопропилэтиламин, триэтиламин или Ν,Ν,Ν,Ν'-тетраметилгуанидин с получением соединения 15 (стадия 2 стадии 14). Анилин (15) может быть соединен с гетероароматическими карбоновыми кислотами (16) в условиях присоединения (стадия 1 стадии 15). Специалистам в данной области техники очевидно, что существует ряд способов и реагентов для получения амида в результате реакции карбоновых кислот и аминов. Например, реакция подходящего анилина (15) с подходящей кислотой соединения 16 в присутствии реагента сочетания и аминного основания, такого как ΌΙΡΕΑ или триэтиламин, дает соединение формулы I, после чего следует снятие защиты тиазинамина. Реагенты сочетания включают карбодиимиды, такие как ОСС, Э1С. ΕΌίΤ и ароматические оксимы, такие как НОВ! и НОА1. Кроме того, соли урония или фосфония ненуклеофильных анионов, такие как НВТи, НАТИ, РуВОР и РуВгОР, можно применять вместо более традиционных реагентов сочетания. Добавки, такие как ПМАР, можно применять для усиления реакции. Кроме того, защищенный анилиновый амин (15) может быть ацилирован с применением замещенных бензоилхлоридов в присутствии основания, такого как триэтиламин или пиридин. С защищенного тиазинамина затем можно снять защиту посредством органического основания, такого как пиридин и метилгидроксиламина гидрохлорид, в полярном апротонном растворителе, таком как этанол, или неогранического основания, такого как гидроксид лития в метаноле, с получением соединений формулы I.

На необязательной стадии может быть получена фармацевтически приемлемая соль соединения формулы I посредством реакции соответствующего свободного основания формулы I с соответствующей фармацевтически приемлемой кислотой в подходящем растворителе при стандартных условиях. Кроме того, образование таких солей может происходить одновременно при снятии защиты с азотной защитной группы. Получение таких солей хорошо известно и признано в данной области. См., например, ОоиМ

- 5 026006

Р.Ь., 8а11 5е1есЬоп £ог ЬакК бгидк, 1п!егпайопа1 1оита1 о£ РЬагтасеийск, 33: 201-217 (1986); Вак1ш К.1. е1 а1. 8а11 8е1есИоп апб ОрОпи/аиоп Ргосебигек £ог РЬагтасеиЬса1 №υ СЬет1са1 ЕпОИек, Огдашс Ргосекк КезеагсЬ апЬ Оеуе1ортеп1. 4: 427-435 (2000); и Вегде 8.М. е1 а1., РЬагтасеийса1 8а115, 1оита1 о£ РЬагтасеиОса1 §с1епсек, 66: 1-19, (1977). Специалисту в данной области будет понятно, что соединение формулы I легко преобразуется и может быть выделено в виде фармацевтически приемлемой соли, такой как соль хлористоводородной кислоты.

Способы получения и примеры

Следующие способы получения и примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение. Если не указано иное, соединения, проиллюстрированные в настоящем документе, названы и пронумерованы с применением §утух® Όηι\υ версии 3.2 или версии 4.0 (§утух §о1и1юи5, 1пс.) или ШРАСЛЛМЕ АСПЬЛВ8.

Способ получения 1. 1-(3-Бромфенил)-2-(диаллиламино)этанон

Карбонат калия (38,8 г, 281 ммоль) добавляли к 3-бромфенацил бромиду (60 г 216 ммоль) в ацетонитриле (430 мл) и смесь охлаждали в токе азота до 0°С. Диаллиламин (34,6 мл, 280,63 ммоль) по каплям добавляли в течение 1 ч и оставляли реакцию нагреваться до 22°С в течение ночи. Неочищенную реакционную смесь концентрировали и остаток разделяли в воде (300 мл) и МТВЕ (300 мл). Удаляли водный слой и органический слой промывали водой (100 мл, 2х)и солевым раствором (100 мл). Органический слой сушили над сульфатом натрия, фильтровали и растворитель выпаривали до постоянной массы с получением титульного соединения (62 г, 98%). Е8/М8 (т/е): 294 (М+1).

Способ получения 2. Бензил-Л-(2,2-диметоксиэтил)карбамат

Раствор аминоацетальдегида диметилацеталя (25 мл, 229 ммоль) в толуоле (120 мл) обрабатывали при 0°С 4,85М раствором гидроксида натрия (70,8 мл, 343,5 ммоль). Смесь перемешивали при 0°С в течение 10 мин и добавляли бензилхлорформиат (33,8 мл, 229 ммоль), поддерживая в процессе добавления внутреннюю температуру ниже 20°С. Смесь нагревали до комнатной температуры более 4 ч. Отделяли органический слой, промывали солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия и концентрировали досуха с получением титульного соединения (54 г, 98%). Е8/М8 (т/е): 240 (М+Н).

Способ получения 3. Бензил-Н-аллил-М-(2,2-диметоксиэтил)карбамат

Раствор бензил-Ы-(2,2-диметоксиэтил)карбамата (50 г, 208,9 ммоль) в толуоле (180 мл) обрабатывали твердым гидроксидом натрия (51,6 г, 919,69 ммоль) в токе азота. Через 10 мин добавляли бензилтриэтиламмония хлорид (0,8 г, 3,1 ммоль). Еще через 10 мин по каплям добавляли раствор аллилбромида (33 г, 272,8 ммоль) в толуоле (50 мл) в течение 10 мин. Полученную смесь перемешивали при 50°С в течение 48 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры и гасили водой. Отделяли органический слой, промывали солевым раствором, высушивали над сульфатом магния и концентрировали досуха с получением титульного соединения (44 г, 75%). Е8/М8 (т/е): 280 (М+Н).

Способ получения 4. Бензил-М-аллил-Н-(2-оксоэтил)карбамат

Раствор бензил-Н-аллил-П-(2,2-диметоксиэтил)карбамата (30 г, 107 ммоль) в муравьиной кислоте (36,8 мл, 860 ммоль) и воде (4,84 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь концентрировали и разбавляли гексаном/этилацетатом (1:2) и водой. Отделяли органический слой, промывали солевым раствором до рН 6 и высушивали над сульфатом натрия. Растворитель выпаривали с получением титульного соединения (25 г, 99%). Е8/М8 (т/е): 234 (М+Н).

Способ получения 5. 1-(3-Бромфенил)-2-(диаллиламино)этанон оксим

- 6 026006

Раствор 1-(3-бромфенил)-2-(диаллиламино)этанона (60 г, 204,7 ммоль) в этаноле (720 мл) и пиридине (24,8 мл, 307 ммоль) перемешивали 15 мин при 22°С. Гидроксиламина гидрохлорид (17 г, 246 ммоль) по порциям добавляли к раствору в течение 1 ч. Реакцию нагревали до 50°С в течение 2 ч и затем нагревали до 70°С в течение 16 ч. Растворитель выпаривали и остаток разделяли в воде (300 мл) и метилтрет-бутиловом эфире (300 мл). Отделяли органический слой и промывали водой (100 мл, 2х) и солевым раствором (100 мл). Органический слой сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали досуха с получением титульного соединения (75,5 г, 79%). Εδ/Μδ (т/е): 309 (М+1).

Способ получения 6. Бензил-Н-аллил-Н-[2-гидроксииминоэтил]карбамат о _οΛ._ν<--+^ν'-οη

Раствор бензил-М-аллил-М-(2-оксоэтил)карбамата (25 г, 107 ммоль) в ацетонитриле (150 мл) обрабатывали гидроксиламина гидрохлоридом (9,68 г, 139 ммоль) и раствором натрия ацетата тригидрата (16 г, 117,9 ммоль) в воде (75 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Ацетонитрил выпаривали и водный раствор экстрагировали этилацетатом. Отделяли органический слой, высушивали над сульфатом магния и концентрировали под вакуумом с получением титульного соединения (24 г, 90%). Εδ/Μδ (т/е): 249 (М+Н).

Способ получения 7. 5-Аллил-6а-(3-бромфенил)-3,3а,4,6-тетрагидро-1Н-пирроло[3,4-с]изоксазол

Неочищенный 1-(3-бромфенил)-2-(диаллиламино)этанон оксим (75,5 г, 195,34 ммоль) растворяли в толуоле (600 мл) и нагревали с обратным холодильником в течение 12 ч. Растворитель выпаривали под вакуумом и остаток растворяли в смеси водного 1н. НС1 (1 л) и метил-трет-бутилового эфира (300 мл). Смесь перемешивали в течение 15 мин и добавляли кизельгур (10 г). Смесь перемешивали в течение дополнительных 20 мин и фильтровали через кизельгур. Осадок на фильтре промывали дополнительным водным 1н. НС1 (200 мл) и метил-трет-бутиловым эфиром (200 мл). Отделяли органический слой и промывали 1н. НС1 (2х 100 мл). Водные слои объединяли и доводили рН до 9 с помощью ΝαΟΗ 50% мас./мас. Водную смесь экстрагировали метил-трет-бутиловым эфиром (3х250 мл). Органические слои объединяли, высушивали над сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали и сушили под вакуумом с получением красного твердого вещества (60 г). Красное твердое вещество растворяли в гептане (600 мл) и смесь нагревали до кипения с обратным холодильником в течение 20 мин. Добавляли активированный уголь (2 г) и смесь фильтровали через кизельгур. Фильтрат концентрировали при атмосферном давлении до получения конечного объема 300 мл. Раствор охлаждали до 22°С и перемешивали в течение 3 ч. Твердое вещество бледно-желтого цвета собирали посредством фильтрации и сушили под вакуумом до постоянной массы с получением титульного соединения (40 г, 60%). Εδ/Μδ (т/е): 309 (М+1).

Способ получения 8. Бензил-3,3а,4,6-тетрагидропирроло[3,4-с]изоксазол-5-карбоксилат

Раствор бензил^-аллил^-[2-гидроксииминоэтил]карбамата (24 г, 96,6 ммоль) в дихлорметане (338 мл) по каплям обрабатывали более 10 мин 5% мас./мас. водным раствором гипохлорита натрия (106,08 ммоль, 143,06 мл). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакцию гасили 40% водным раствором бисульфита натрия (7 г). Отделяли органический слой, высушивали над сульфатом магния и концентрировали под вакуумом. Неочищенный продукт очищали на силикагеле, проводя элюирование 5% этилацетатом в гексане с получением титульного соединения (18 г, 75%). Εδ/Μδ (т/е): 247 (М+Н).

Способ получения 9. Бензил-6а-(5-бром-2-фторфенил)-3,3а,4,6-тетрагидро-1Н-пирроло[3,4-с]изоксазол-5-карбоксилат

1,6М раствор н-бутил-лития в гексане (25,4 мл, 40,6 ммоль) по каплям добавляли к -78°С раствору 4-бром-1-фтор-2-йодобензола (12,22 г, 40,6 ммоль) в тетрагидрофуране (60 мл) с получением желтого раствора, который перемешивали при -78°С в течение 15 мин.

Трифторид бора эфират (5,14 мл, 40,6 ммоль) добавляли к отдельному -78°С раствору бензил- 7 026006

3,3а,4,6-тетрагидропирроло[3,4-с]изоксазол-5-карбоксилата (5 г, 20,3 ммоль) в тетрагидрофуране (60 мл), и смесь перемешивали при -78°С в течение 5 мин. Данный раствор добавляли к ранее полученной -78°С литийорганической смеси через канюлю. Объединенную смесь перемешивали в течение 30 мин при -78°С. Смесь гасили насыщенным водным раствором хлорида аммония и нагревали до комнатной температуры. Смесь экстрагировали этилацетатом (3х) и объединяли органические экстракты, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель под вакуумом. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с помощью градиента от 5 до 100% этилацетата в гексане в течение 35 мин с получением титульного соединения (2,27 г, 27%). Εδ/Μδ (т/е): (⁷⁹Вг/⁸¹Вг) 421/423 (М+Н).

Способ получения 10. Бензил-1-(бензоилкарбамотиоил)-6а-(5-бром-2-фторфенил)-3,3а,4,6-тетрагидропирроло[3,4-с]изоксазол-5-карбоксилат

Бензоилизотиоцианат (2,87 мл, 21,28 ммоль) по каплям добавляли к раствору бензил-6а-(5-бром-2фторфенил)-3,3а,4,6-тетрагидро-1Н-пирроло[3,4-с]изоксазол-5-карбоксилата (5,977 г, 14,2 ммоль) в тетрагидрофуране (95 мл) и перемешивали в течение ночи в токе азота. Растворитель удаляли под вакуумом. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с помощью градиента от 5 до 100% ЕЮЛс в гексане в течение 30 мин с получением титульного соединения (6,05 г, 73%). Εδ/Μδ (т/е): (⁷⁹Вг/⁸¹Вг) 584/586 (М+Н).

Способ получения 11. [1-Аллил-4-амино-4-(3-бромфенил)пирролидин-3-ил]метанол

22°С раствор 5-аллил-6а-(3-бромфенил)-3,3а,4,6-тетрагидро-1Н-пирроло[3,4-с]изоксазола (40 г, 129,4 ммоль) в уксусной кислоте (400 мл) обрабатывали цинковой пылью (42,3 г, 646,8 ммоль) одной порцией. Реакцию интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Добавляли этилацетат (400 мл) и смесь фильтровали через кизельгур. Фильтрат упаривали и остаток сушили под вакуумом. Остаток разделяли в воде (300 мл) и МТВЕ (300 мл). Доводили рН до 8 гидроксидом натрия 50% мас./мас. и отделяли органический слой, высушивали над сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали и остаток сушили под вакуумом с получением титульного соединения (41 г, 97%). Εδ/Μδ (т/е): 311 (М+1).

Способ получения 12. Бензил-3-(бензоилкарбамотиоиламино)-3-(5-бром-2-фторфенил)-4-(гидроксиметил)пирролидин-1 -карбоксилат

Смесь бензил-1-(бензоилкарбамотиоил)-6а-(5-бром-2-фторфенил)-3,3а,4,6-тетрагидропирроло[3,4с]изоксазол-5-карбоксилата (6,05 г 10,4 ммоль) и цинка (пыль, <10 мкм) (6,77 г, 103,5 ммоль) перемешивали в уксусной кислоте (52 мл) при комнатной температуре в течение ночи в токе азота. Реакцию разбавляли этилацетатом и фильтровали через кизельгур. Растворитель удаляли под вакуумом и остаток разбавляли этилацетатом, водой и насыщенным водным раствором бикарбоната. Смесь экстрагировали этилацетатом (3х), объединенные органические слои объединяли и высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель под вакуумом. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с помощью градиента от 5 до 100% ЕЮЛс в гексане в течение 30 мин с получением титульного соединения (5,222 г, 86%). Εδ/Μδ (т/е): (⁷⁹Вг/⁸¹Вг) 586/588 (М+Н).

Способ получения 13. [(3К^)-1-Аллил-4-амино-4-(3-бромфенил)пирролидин-3-ил]метанол;

(2К,3К)-2,3-бис[(4-метилбензоил)окси]бутандиовая кислота

Раствор [1-аллил-4-амино-4-(3-бромфенил)пирролидин-3-ил]метанола (77 г, 235 ммоль) в изопропиловом спирте (914 мл) нагревали до 70°С. Добавляли ди-п-толуоил-Ь-тартаровую кислоту (86,2 г, 223 ммоль) и смесь охлаждали до 22°С более 2 ч и перемешивали в течение ночи. Суспензию фильтровали, чтобы собрать бледно-желтое твердое вещество, и промывали изопропиловым спиртом. Твердое вещест- 8 026006 во сушили под вакуумом с получением титульного соединения (63 г, 36%). Εδ/Μδ (т/е): 311 (М+1). Продукт анализировали посредством обращенно-фазной хиральной хроматографии: анализ первого элюируемого изомера (колонка: СПта1рак ГО-3 4,6x50 мм; элюент: 70:30, водный раствор 20 мМ аммония бикарбоната: ацетонитрил; скорость потока: 1,5 мл/мин при ИУ 215 нм) подтвердил энантиомерно обогащенный (96% ее) энантиомер с Ю = 1,26 мин.

Способ получения 14. [(3К^)-1-Аллил-4-амино-4-(3-бромфенил)пирролидин-3-ил]метанол

[(3К^)-1-аллил-4-амино-4-(3-бромфенил)пирролидин-3-ил]метанол; (2К,3К)-2,3-бис[(4-метилбензоил)окси]бутандиовую кислоту (63 г 85,8 ммоль) объединяли с водным раствором 1н. НС1 (800 мл) и этилацетатом (400 мл) и смесь перемешивали в течение 15 мин при 22°С. Слои разделяли и рН водного слоя доводили до 10 гидроксидом натрия 50% мас./мас. Водную смесь экстрагировали метил-третбутиловым эфиром (3x250 мл). Объединенные органические слои высушивали над сульфатом магния, фильтровали и упаривали досуха с получением титульного соединения (27 г, 99%). Εδ/Μδ (т/е): 311 (М+1).

Способ получения 15. N-[(4аΚ,7аδ)-6-аллил-7а-(3-бромфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4б][1,3]тиазин-2-ил]бензамид

Раствор [(3К^)-1-аллил-4-амино-4-(3-бромфенил)пирролидин-3-ил] метанола (27 г; 86,7 ммоль) в тетрагидрофуране (270 мл) охлаждали до -5°С в атмосфере азота. Бензоилизотиоцианат (12,3 мл, 91 ммоль) добавляли по каплям, поддерживая температуру ниже 0°С. Реакцию оставляли нагреваться 22°С более 1 ч. 1,1'-карбонилдиимидазол (28,1 г, 173,5 ммоль) добавляли одной порцией и реакцию перемешивали в течение 1 ч при 22°С, и затем нагревали до кипения с обратным холодильником в течение 16 ч. Растворитель удаляли под вакуумом и остаток сушили под вакуумом. Неочищенный материал разделяли в метил-трет-бутиловом эфире (500 мл) и воде (250 мл). Отделяли органический слой, высушивали над сульфатом магния, фильтровали и выпаривали досуха. Неочищенный материал очищали на силикагеле с помощью градиента от 90/10 до 60/40 метиленхлорид/этилацетат с получением титульного соединения (27 г, 68%). Εδ/Μδ (т/е): 456 (М+1).

Способ получения 16. Бензил-2-бензамидо-7а-(5-бром-2-фторфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропир-

1,1'-карбонилдиимидазол (2,87 г, 17,7 ммоль) добавляли к раствору бензил-3-(бензоилкарбамотиоиламино)-3-(5-бром-2-фторфенил)-4-(гидроксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (5,198 г, 8,86 ммоль) в тетрагидрофуране (52 мл). Смесь перемешивали в течение 1,5 ч при комнатной температуре и затем реакцию нагревали с обратным холодильником в течение ночи в токе азота. Реакцию охлаждали, разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом (3х). Органические слои объединяли, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель под вакуумом. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с помощью градиента от 5 до 100% ЕЮАс в гексане в течение 30 мин с получением титульного соединения (2,93 г, 58%). Εδ/Μδ (т/е): (⁷⁹Вг/⁸¹Вг). 568/570 (М+Н).

Способ получения 17. N-[(4аΚ,7аδ)-7а-(3-бромфенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4ά][1,3] тиазин-2 -ил] бензамид

Смесь N-[(4аΚ,7аδ)-6-аллил-7а-(3-бромфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-ά][1,3]тиазин-2ил]бензамида (1 г, 2,19 ммоль) и Ν,Ν-диметилбарбитуровой кислоты (0,868 г, 5,48 ммоль) в хлороформе (22 мл) комнатной температуры дегазировали посредством барботажа азота через полученную эмульсию при комнатной температуре в течение 5 мин. Смесь обрабатывали тетракис(трифенилфосфин)палладием (0,261 г, 219 мкмоль) и перемешивали в течение 1,5 ч в токе азота.

В отдельной колбе смесь N-[(4аΚ,7аδ)-6-аллил-7а-(3-бромфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4б][1,3]тиазин-2-ил]бензамида (22,2 г, 48,6 ммоль) и Ν,Ν-диметилбарбитуровой кислоты (19,28 г, 121,6

- 9 026006 ммоль) в хлороформе (486 мл) дегазировали посредством барботажа азота через полученную эмульсию при комнатной температуре в течение 5 мин. Смесь обрабатывали тетракис(трифенилфосфин)палладием (5,79 г, 4,86 ммоль) и перемешивали в течение 2 ч в токе азота.

Две реакции объединяли и растворитель удаляли под вакуумом с получением неочищенного продукта. Неочищенный материал очищали на силикагеле с помощью градиента от 0,5 до 10% метанола в дихлорметане в течение 30 мин с получением титульного соединения (22,4 г, 100%). Εδ/Μδ (т/е): (⁷⁹Вг/⁸¹Вг) 416/418 (М+Н).

Способ получения 18. Ы-[7а-(5-бром-2-фторфенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4-й][1,3]тиазин-2-ил] бензамид

Йодотриметилсилан (2,21 мл, 15,46 ммоль) по каплям добавляли к раствору бензил 2-бензамидо-7а(5-бром-2-фторфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-4][1,3]тиазин-6-карбоксилата (2,93 г, 5,15 ммоль) в ацетонитриле (44 мл) комнатной температуры. Реакцию перемешивали при комнатной температуре в течение двух часов и растворитель удаляли под вакуумом. Неочищенный продукт очищали на δί','Χ колонке с применением смеси 3:1 дихлорметан:метанол и затем 2:1 дихлорметан:7н. аммиак в метаноле с получением титульного соединения (2,098 г, 94%). Εδ/Μδ (т/е): (⁷⁹Вг/⁸¹Вг) 434/436 (М+Н).

Способ получения 19. трет-Бутил-(4аК,7аδ)-2-бензамидо-7а-(3-бромфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-ά] [ 1,3]тиазин-6-карбоксилат

Раствор N-[(4аК,7аδ)-7а-(3-бромфенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4-ά][1,3]тиазин-2ил]бензамида (22,4 г, 36,69 ммоль) в дихлорметане (367 мл) комнатной температуры обрабатывали дитрет-бутилдикарбонатом (8,81 г, 40,36 ммоль), после чего обрабатывали триэтиламином (7,67 мл, 55,04 ммоль) и реакцию перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч в токе азота. Растворитель удаляли под вакуумом и неочищенный продукт очищали на силикагеле с применением градиента от 5 до 100% этилацетата в гексане в течение 25 мин с получением титульного соединения (20,22 г, 100%). Εδ/Μδ (т/е): (⁷⁹Вг/⁸¹Вг) 516/518 (М+Н).

Способ получения 20. трет-Бутил-2-бензамидо-7а-(5-бром-2-фторфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-ά] [ 1,3]тиазин-6-карбоксилат

Ди-трет-бутилдикарбонат (1,16 г, 5,31 ммоль) и триэтиламин (1,01 мл, 7,25 ммоль) добавляли к раствору Х-[7а-(5-бром-2-фторфенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4-0][1,3]тиазин-2-ил]бензамида (2,098 г, 4,83 ммоль) в дихлорметане (48 мл). Реакцию перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре в токе азота. Растворитель удаляли под вакуумом и неочищенный продукт очищали на силикагеле с помощью градиента от 5 до 100% ЕЮАс в гексане в течение 30 мин с получением титульного соединения (2,556 г, 99%). Εδ/Μδ (т/е): (⁷⁹Вг/⁸¹Вг) 534/536 (М+Н).

Способ получения 21. трет-Бутил-(4аК,7аδ)-7а-(3-аминофенил)-2-бензамидо-4,4а,5,7-теΊрагидропирроло [3,4-ά] [ 1,3]тиазин-6-карбоксилат

Раствор трет-бутил-(4аК,7аδ)-2-бензамидо-7а-(3-бромфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4ά][1,3]тиазин-6-карбоксилата (5 г, 9,7 ммоль) и транс-Н,№-диметил-1,2-циклогександиамина (220,3 мг, 1,5 ммоль) в этаноле (100 мл) обрабатывали азидом натрия (1,30 г, 19,4 ммоль). Добавляли водный раствор натриевой соли Ь-аскорбиновой кислоты (0,66М, 3,2 мл, 2,1 ммоль) и воды (10 мл) и верхнюю часть колбы продували азотом. Смесь обрабатывали водным раствором сульфата меди(П) пентагидрата (0,33М, 3,2 мл, 1,1 ммоль) и смесь немедленно нагревали на предварительно нагретой горячей плите при 80°С в течение 1,5 ч в токе азота. При нагревании получали гомогенную смесь. Реакцию охлаждали и добавляли ледяную воду. Смесь экстрагировали этилацетатом (3х). Органические слои объединяли и высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и растворитель удаляли под вакуумом с получением

- 10 026006 неочищенного продукта азида. Неочищенный продукт азида объединяли с 10% палладием на угле (2 г) в холодном этаноле (150 мл) и смесь продували с применением вакуума/азота и затем вакуума/водорода. Смесь перемешивали при комнатной температуре при 30 ρδί водорода в течение 2 ч. Из реакции удаляли газ, и смесь фильтровали через кизельгур, применяя дихлорметан для промывки остатка на фильтре. Растворитель удаляли из фильтрата под вакуумом и неочищенный продукт очищали на силикагеле 50% этилацетатом в дихлорметане с получением титульного соединения (4 г, 91%). Εδ/Μδ (т/е): 453 (М+Н).

Способ получения 22. трет-Бутил-7а-(5-амино-2-фторфенил)-2-бензамидо-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-ά] [ 1,3]тиазин-6-карбоксилат

Раствор трет-бутил-2-бензамидо-7а-(5-бром-2-фторфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4й][1,3]тиазин-6-карбоксилата (2,556 г, 4,8 ммоль) и транс-М,№-диметил-1,2-циклогександиамина (150 мг, 1,1 ммоль) в этаноле (50 мл) обрабатывали азидом натрия (933 мг, 14,3 ммоль). Добавляли водный раствор натриевой соли Ь-аскорбиновой кислоты (0,66М, 3,2 мл, 2,1 ммоль) и воду (1 мл) и верхнюю часть колбы продували азотом. Смесь обрабатывали водным раствором сульфата меди (II) пентагидрата (0,33М, 3,2 мл, 1,1 ммоль) и смесь немедленно нагревали на предварительно нагретой горячей плите при 80°С в течение 1,5 ч в токе азота. При нагревании получали гомогенную смесь. Реакцию охлаждали, разбавляли ледяной водой и смесь экстрагировали этилацетатом (3х). Органические слои объединяли и высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель под вакуумом с получением неочищенного продукта азида. Неочищенный продукт азида объединяли с 10% палладием на угле (1 г) в холодном этаноле (150 мл) и смесь продували с применением вакуума/азота и затем вакуума/водорода. Смесь перемешивали при комнатной температуре при 30 ρδί водорода в течение 5 ч. Из реакции удаляли газ, фильтровали через кизельгур и остаток на фильтре промывали дихлорметаном. Растворитель удаляли из фильтрата под вакуумом и неочищенный продукт очищали на силикагеле 50% этилацетатом в дихлорметане с получением титульного соединения (2,014 г, 89%). Εδ/Μδ (т/е): 471 (М+Н).

Способ получения 23. трет-Бутил-(4аΚ,7аδ)-2-бензамидо-7а-[3-[(5-фторпиридин-2-карбонил)амино] фенил] -4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-ά] [ 1,3]тиазин-6-карбоксилат

Суспензию трет-бутил-(4аΚ,7аδ)-7а-(3-аминофенил)-2-бензамидо-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4й][1,3]тиазин-6-карбоксилата (93 мг, 0,21 ммоль), 5-фторпиридин-2-карбоновой кислоты (31,9 мг, 0,23 ммоль), 1-гидроксибензотриазол гидрата (56,7 мг, 0,41 ммоль) и 1-(2-диметиламинопропил)-3этилкарбодиимид гидрохлорида (40 мг, 0,21 ммоль) в дихлорметане (4 мл), содержащем диметилформамид (1 мл), обрабатывали диизопропилэтиламином (179,2 мкл, 1,03 ммоль) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном (5 мл) и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (15 мл). Отделяли органический слой и промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия (10 мл), высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель под вакуумом с получением неочищенного титульного соединения (105 мг, 89%). Εδ/Μδ (т/е): 576 (М+Н).

Способ получения 24. N-[3-[(4аΚ,7аδ)-2-Бензамидо-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4й][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамид; 2,2,2-трифторуксусная кислота

трет-Бутил-(4аΚ,7аδ)-2-бензамидо-7а-[3-[(5-фторпиридин-2-карбонил)амино]фенил]-4,4а,5,7тетрагидропирроло[3,4-й][1,3]тиазин-6-карбоксилат (105 мг, 0,18 ммоль) растворяли в дихлорметане (2 мл) и обрабатывали трифторуксусной кислотой (500 мкл, 6,6 ммоль). Полученный желтый раствор перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре и удаляли растворитель под вакуумом с получением неочищенного титульного продукта (190 мг, 100%). Εδ/Μδ (т/е): 476 (М+Н).

Способ получения 25. N-[(4аΚ,7аδ)-7а-(3-Аминофенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4й][1,3]тиазин-2-ил]бензамид

- 11 026006

Трифторуксусную кислоту (25 мл) добавляли к раствору трет-бутил-(4аК,7а8)-7а-(3-аминофенил)2-бензамидо-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-4][1,3]тиазин-6-карбоксилата (4 г, 8,84 ммоль) в дихлорметане (100 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в токе азота в течение 4 ч. Растворитель удаляли под вакуумом и неочищенный продукт очищали на 8СХ колонке с применением смеси 3:1 дихлорметан:метанол и затем 2:1 дихлорметан:7н. аммиак в метаноле с получением титульного соединения (2,49 г, 80%). Εδ/Μδ (т/е): 353 (М+Н).

Способ получения 26. Ш[7а-(5-Амино-2-фторфенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,44][1,3]тиазин-2-ил]бензамид

Трифторуксусную кислоту (10 мл) добавляли к раствору трет-бутил-7а-(5-амино-2-фторфенил)-2бензамидо-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-4][1,3]тиазин-6-карбоксилата (2,013 г, 4,28 ммоль) в дихлорметане (30 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в токе азота в течение 4 ч. Растворитель удаляли под вакуумом и неочищенный продукт очищали на δСX колонке с применением смеси 3: 1 дихлорметан:метанол и затем 2:1 дихлорметан:7 н аммиак в метаноле с получением титульного соединения (1,555 г, 98%). Εδ/Μδ (т/е): 371 (М+Н).

Способ получения 27. N-[(4аΚ,7аδ)-7а-(3-Аминофенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-ά] [ 1,3]тиазин-2-ил]бензамид

Раствор N-[(4аΚ,7аδ)-7а-(3-аминофенил)-4а,5,6,7-теΊрагидро-4Н-пирроло[3,4-ά][1,3]тиазин-2ил]бензамида (2,49 г, 7,06 ммоль), 5-фтор-2-хлорпиримидина (3,74 г, 28,26 ммоль) и диизопропилэтиламина (6,16 мл, 35,32 ммоль) в 1,4-диоксане (60 мл) нагревали до кипения в течение 4 ч в токе азота. Реакцию охлаждали, разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом (3х). Объединенные органические экстракты высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и растворитель удаляли под вакуумом с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с применением градиента от 5 до 100% этилацетата в гексане в течение 25 мин с получением титульного соединения (2,51 г, 79%). Εδ/Μδ (т/е): 449 (М+Н).

Способ получения 28. N-[3-[(4аΚ,7аδ)-2-Бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-ά] [ 1,3]тиазин-7а-ил] фенил] -5-фторпиридин-2-карбоксамид

Раствор N-[3-[(4аΚ,7аδ)-2-бензамидо-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4-ά][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамида; 2,2,2-трифторуксусной кислоты (150 мг, 254 мкмоль), 5-фтор-2хлорпиримидина (68 мг, 51 мкмоль) и диизопропилэтиламина (98 мкл, 56 мкмоль) нагревали в диметилсульфоксиде (5 мл) в течение ночи при 40°С. Добавляли дополнительный 5-фтор-2-хлорпиримидин (68 мг, 51 мкмоль) и диизопропилэтиламин (98 мкл, 56 мкмоль) и смесь нагревали в течение ночи при 50°С. Добавляли дополнительный 5-фтор-2-хлорпиримидин (68 мг, 51 мкмоль) и диизопропилэтиламин (98 мкл, 56 мкмоль) и смесь нагревали в течение ночи при 50°С в течение третьей ночи. Реакцию охлаждали, разбавляли насыщенным водным раствором карбоната натрия (50 мл) с получением суспензии, которую фильтровали и сушили в вакуумном шкафу при 50°С в течение 4 ч с получением титульного соединения (60 мг, 41%). Εδ/Μδ (т/е): 449 (М+Н).

Альтернативный вариант примера получения 28.

N-[(4аΚ,7аδ)-7а-(3-аминофенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,44][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (282 мг, 628,73 мкмоль) и 5-фторпиридин-2-карбоновую кислоту (106,46 мг, 754,47 мкмоль) объединяли в дихлорметане (3 мл) и диметилформамиде (0,5 мл). Добавляли 1гидроксибензотриазол (112,70 мг, 817,35 мкмоль) и затем 1-(3-диметиламинопропил)-3этилкарбодиимид гидрохлорид (159,07 мг, 817,35 мкмоль) и полученную смесь перемешивали в течение 5 ч при комнатной температуре в токе азота. Реакционную смесь разбавляли водой и рН доводили 1н.

- 12 026006

ΝαΟΗ до ~12. Смесь экстрагировали этилацетатом (3х). Органические экстракты объединяли, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель под вакуумом с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с применением градиента от 5 до 100% этилацетата в гексане в течение 20 мин с получением титульного соединения (327 мг, 91%). Εδ/Μδ (т/е): 571 (М+Н).

Способ получения 29. ^[7а-(5-Амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7тетрагидропирроло [3,4-ά] [ 1,3]тиазин-2-ил]бензамид

Раствор ^[7а-(5-амино-2-фторфенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4-б][1,3]тиазин-2-ил]бензамида (705 мг, 1,90 ммоль), 5-фтор-2-хлорпиримидина (1,01 г, 7,61 ммоль) и диизопропилэтиламина (1,66 мл, 9,52 ммоль) нагревали в 1,4-диоксане (20 мл) до кипения с обратным холодильником в течение 4 ч в токе азота. Реакцию охлаждали, разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом (3х). Органические слои объединяли, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель под вакуумом с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с применением градиента от 5 до 100% этилацетата в гексане в течение 25 мин с получением титульного соединения (590 мг, 66%). Εδ/Μδ (т/е): 467 (М+Н).

Способ получения 30. N-[3-[(4аΚ,7аδ)-2-Бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7тетрагидропирроло [3,4-ά] [ 1,3]тиазин-7а-ил] фенил] -5-метоксипиразин-2-карбоксамид

N-[(4аΚ,7аδ)-7а-(3-аминофенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,40][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (400 мг, 891,81 мкмоль) и 5-метоксипиразин-2-карбоновую кислоту (165 мг, 1,07 ммоль) объединяли в дихлорметане (4 мл) и диметилформамиде (0,5 мл). Добавляли 1гидроксибензотриазол (160 мг, 1,16 ммоль) и затем 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (226 мг, 1,16 ммоль) и полученную смесь перемешивали в течение 5 ч при комнатной температуре в токе азота. Реакционную смесь разбавляли водой и рН доводили до ~12 с помощью 1н. ΝαΟΗ. Смесь экстрагировали этилацетатом (3х). Объединенные органические экстракты высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель под вакуумом. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с применением градиента от 5 до 100% этилацетата в гексане в течение 20 мин с получением титульного соединения (482 мг, 92%). Εδ/Μδ (т/е): 585 (М+Н).

Способ получения 31. ^[3-[2-Бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-ά] [ 1,3]тиазин-7а-ил] -4-фторфенил] -5-фторпиридин-2-карбоксамид

^[7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-0][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (302 мг, 647 мкмоль) и 5-фторпиридин-2-карбоновую кислоту (110 мг, 777 мкмоль) объединяли в дихлорметане (3 мл) и диметилформамиде (0,5 мл). Добавляли 1-гидроксибензотриазол (116 мг, 842 мкмоль) и затем 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (164 мг, 842 мкмоль) и смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре в токе азота. Реакционную смесь разбавляли водой и рН доводили 1н. ΝαΟΗ до ~12 и затем экстрагировали этилацетатом (3х). Органические слои объединяли и фильтровали, чтобы собрать нерастворимый материал. Твердое вещество промывали водой и этилацетатом и сушили под вакуумом с получением указанного в заголовке соединения. Органические слои из фильтрата высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель под вакуумом. Остаток очищали на силикагеле с применением градиента от 5 до 100% этилацетата в гексане в течение 20 мин с получением дополнительного количества титульного соединения с общим выходом (275 мг, 72%). Εδ/Μδ (т/е): 590 (М+Н).

Способ получения 32. N-[(4аΚ,7аδ)-7а-(5-Амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7тетрагидропирроло[3,4-0][1,3]тиазин-2-ил]бензамид, (изомер 1)

- 13 026006

Рацемический Ы-[7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-4][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (1,694 г, 3,63 ммоль) хирально очищали посредством ВЭЖХ (колонка: СЫга1ее1 01, 8x35 см; элюент: 90% метанол (0,2% диметилэтиламин) и 10% ацетонитрил; скорость потока 400 мл/мин при ИУ 280 нм). Анализ первого элюируемого изомера (колонка: СЫга1ее1 01-Н 0,46x15 см; элюент: 10:90 ацетонитрил:метанол (с 0,2% диметилэтиламина); скорость потока: 0,6 мл/мин при ИУ 280 нм) подтвердил наличие энантиомерно обогащенного (99% ее) энантиомера с Κ_ί = 6,70 мин, (723 мг, 43%). Εδ/Μδ (т/е): 467 (М+Н).

Способ получения 33. N-[3-[(4аΚ,7аδ)-2-Бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-ά] [ 1,3]тиазин-7а-ил] -4-фторфенил] -5-метоксипиразин-2-карбоксамид, (изомер 1)

Ы-[(4аК,7аБ)-7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,44][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (0,361 г, 0,77 ммоль, изомер 1) растворяли в смеси дихлорметана (4 мл) и ДМФА (0,5 мл). К смеси добавляли 5-метоксипиразин-2-карбоновую кислоту (240 мг, 1,55 ммоль), 1гидроксибензотриазол (210 мг, 1,55 ммоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (300 мг, 1,55 ммоль) и смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционный раствор помещали непосредственно в колонку с силикагелем с загрузкой 12 г и очищали с применением колонки с 40 г силикагеля и элюировали с помощью градиента 0-100% этилацетат/гексан. Продукт растворяли в этилацетате (200 мл), промывали 1н. ЫаОН (2x50 мл) и солевым раствором (1x50 мл). Очистку силикагелем повторяли, как описано выше, с получением титульного соединения (350 мг, 74%). Εδ/Μδ (т/е): 603 (М+Н).

Способ получения 34. N-[3-[(4аΚ,7аδ)-2-Бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-ά] [ 1,3]тиазин-7а-ил] фенил] -5-цианопиридин-2-карбоксамид

N-[(4аΚ,7аδ)-7а-(3-аминофенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4Д][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (0,30 г, 0,67 ммоль) растворяли в дихлорметане (10 мл) и добавляли 5цианопиридин-2-карбоновую кислоту (129 мг, 0,87 ммоль), 1-гидроксибензотриазол (185 мг, 1,34 ммоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (169 мг, 0,87 ммоль). Добавляли диизопропилэтиламин (0,35 мл, 2 ммоль) и реакцию перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Материал очищали непосредственно хроматографией на силикагеле, проводя элюирование градиентом 0-100% этилацетат/гексан, с получением титульного соединения (360 мг, 88%). Εδ/Μδ (т/е): 579 (М+Н).

Способ получения 35. N-[3-[(4аΚ,7аδ)-2-Бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-ά] [ 1,3]тиазин-7а-ил] фенил] -3,5-дифторпиридин-2-карбоксамид

N-[(4аΚ,7аδ)-7а-(3-аминофенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,40][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (0,30 г, 0,67 ммоль) растворяли в дихлорметане (10 мл) и добавляли 3,5дифторпиридин-2-карбоновую кислоту (138 мг, 0,87 ммоль), 1-гидроксибензотриазол (185 мг, 1,34 ммоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (169 мг, 0,87 ммоль). Добавляли диизопропилэтиламин (0,35 мл, 2 ммоль) и реакцию перемешивали при комнатной температуре в тече- 14 026006 ние ночи. Реакцию очищали непосредственно хроматографией на силикагеле, проводя элюирование градиентом 0-100% этилацетат/гексан, с получением титульного соединения (330 мг, 84%). Εδ/Μδ (т/е): 590 (М+Н).

Способ получения 36. N-[3-[(4аΚ,7аδ)-2-Бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-ά] [ 1,3]тиазин-7а-ил] -4-фторфенил] -5 -цианопиридин-2-карбоксамид, (изомер 1)

Ы-[(4аК,7аБ)-7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4б][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (0,180 г, 0,39 ммоль, изомер 1) растворяли в смеси дихлорметана (2 мл) и ДМФА (0,25 мл). Добавляли 5-цианопиридин-2-карбоновую кислоту (114 мг, 0,77 ммоль), 1гидроксибензотриазол (106 мг, 0,77 ммоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (150 мг, 0,77 ммоль) и реакцию перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь разбавляли водой (10 мл), этилацетатом (10 мл) и добавляли к раствору 1н. ΝαΟΗ (100 мл). Смесь экстрагировали ЕЮАс (2x100 мл) и органические слои объединяли и промывали солевым раствором. Органический слой сушили над Μ§δΟ₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали хроматографией на силикагеле с применением градиента 0-100% этилацетат/гексан с получением титульного соединения (133 мг, 57%). Εδ/Μδ (т/е): 597 (М+Н).

Способ получения 37. N-[3-[(4аΚ,7аδ)-2-Бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-б] [1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-3,5-дифторпиридин-2-карбоксамид, (изомер 1)

N-[(4аΚ,7аδ)-7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4б][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (0,180 г, 0,39 ммоль, изомер 1) растворяли в смеси дихлорметана (2 мл) и ДМФА (0,25 мл). Добавляли 5-цианопиридин-2-карбоновую кислоту (114 мг, 0,77 ммоль), 1гидроксибензотриазол (106 мг, 0,77 ммоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (150 мг, 0,77 ммоль) и реакцию перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь разбавляли водой (10 мл) и этилацетатом (10 мл) и затем выливали в раствор 1н. ΝαΟΗ (100 мл). Смесь экстрагировали ЕЮАс (2х 100 мл), органические экстракты объединяли и промывали солевым раствором. Органические слои сушили над Μ§δΟ₄, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле с применением градиента 0-100% этилацетат/гексан с получением титульного соединения (190 мг, 80%). Εδ/Μδ (т/е): 608 (М+Н).

Пример А. ^[3-[2-Амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин7а-ил]-4-фторфенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамид

Смесь ^[3-[2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин7а-ил]-4-фторфенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамида (293 мг, 497 мкмоль), О-метилгидроксиламина гидрохлорида (430 мг, 4,97 ммоль) и пиридина (402 мкл, 4,97 ммоль) нагревали в этаноле (13 мл) до 70°С в закупоренной колбе в течение 2,5 ч. Добавляли диметилсульфоксид (3 мл) и смесь нагревали при 70°С в течение ночи. Добавляли дополнительный диметилсульфоксид (10 мл) и продолжали нагревание при 70°С в течение 4 ч. Добавляли дополнительный О-метилгидроксиламин гидрохлорид (208 мг, 2,48 ммоль) и пиридин (201 мкл, 2,48 ммоль) и смесь нагревали до 60°С в течение 3 ч и смесь перемешивали в течение 3 дней при комнатной температуре. В отдельной колбе смесь ^[3-[2-бензамидо-6-(5фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-б][1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамида (276 мг, 468 мкмоль), О-метилгидроксиламина гидрохлорида (405 мг, 4,68 ммоль) и пиридина (478 мкл, 4,68 ммоль) нагревали в этаноле (15 мл) и диметилсульфоксиде (4 мл) при 70°С в закупоренной колбе в течение ночи. Добавляли дополнительный диметилсульфоксид (10 мл) и продолжали нагревание при 70°С в течение 4 ч. Добавляли дополнительный О-метилгидроксиламина гидрохло- 15 026006 рид (195 мг, 2,34 ммоль) и пиридин (189 мкл, 2,34 ммоль) и продолжали нагревание при 70°С в течение 3 ч, после чего проводили перемешивание смеси в течение 3 дней при комнатной температуре. Две реакционные смеси объединяли и большую часть растворителя удаляли под вакуумом. Неочищенный продукт очищали на 8СХ колонке с применением смеси 3:1 дихлорметан:метанол и затем 2:1 дихлорметан:7н. аммиак в метаноле. Неочищенный продукт далее очищали на силикагеле с применением градиента от 0,5 до 10% 7н. аммиак в метаноле:дихлорметан в течение 20 мин с получением титульного соединения (451 мг, 96%). Е8/М8 (т/е): 486 (М+Н).

Пример 1. М-{3-[(4аК,7а8)-2-Амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4й][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]фенил}-5-фторпиридин-2-карбоксамида гидрохлорид

Смесь Ы-[3-[(4аК,7а8)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4й][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамид (320 мг, 560 мкмоль), О-метилгидроксиламин гидрохлорид (485 мг, 5,60 ммоль) и пиридин (453 мкл, 5,60 ммоль) в этаноле (15 мл) нагревали при 65°С в закупоренной колбе в течение пяти часов. Реакцию охлаждали и удаляли растворитель под вакуумом. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с применением градиента от 0,5 до 10% 7н. аммиак в метаноле в дихлорметане в течение 30 мин с получением Ы-[3-[(4аК,7а8)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-й][ 1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамида (219 мг, 84%). Данный материал растворяли в дихлорметане (1 мл) и метаноле (0,5 мл) и добавляли 1М хлористый водород в диэтиловом эфире (0,47 мл, 470 мкмоль). Растворитель удаляли под вакуумом с получением титульного соединения (228 мг, 81%). Е8/М8 (т/е): 468 (М+Н).

Пример 2. Ы-{3-[(4аК,7а8)-2-Амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4й][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]фенил}-5-метоксипиразин-2-карбоксамида гидрохлорид

Смесь Ы-[3-[(4аК,7а8)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4й][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид (479 мг, 819 мкмоль), Ометилгидроксиламина гидрохлорида (709 мг, 8,19 ммоль) и пиридина (663 мкл, 8,19 ммоль) в этаноле (20 мл) нагревали при 50°С в закупоренной колбе в течение ночи. Добавляли диметилсульфоксид (4 мл) и смесь нагревали до 70°С в течение 4 ч с получением раствора. Реакцию охлаждали и большую часть растворителя удаляли под вакуумом. Добавляли воду и доводили рН до ~12 с помощью 1н. гидроксида натрия. Смесь экстрагировали этилацетатом (5х). Объединенные органические экстракты высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель под вакуумом. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с применением градиента от 0,5 до 10% 7н. аммиак в метаноле:дихлорметан в течение 30 мин. Смесь снова очищали на 8СХ колонке с применением смеси 3:1 дихлорметан:метанол и затем 2:1 дихлорметан:7н. аммиак в метаноле для удаления остаточного диметилсульфоксида. Смесь в последний раз очищали на силикагеле с применением градиента от 0,5 до 10% 7н. аммиак в метаноле в дихлорметане в течение 20 мин с получением Ы-[3-[(4аК,7а8)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7тетрагидропирроло[3,4-й][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамида. Данный материал растворяли в дихлорметане (1 мл) и добавляли метанол (0,5 мл) и 1М хлористый водород в диэтиловом эфире (0,66 мл, 660 мкмоль). Растворитель удаляли под вакуумом с получением титульного соединения (329 мг, 78%). Е8/М8 (т/е): 481 (М+Н).

Пример 3. Ы-[3-[(4аК,7а8)-2-Амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4й] [ 1,3]тиазин-7 а-ил] -4 -фторфенил] -5 -фторпиридин-2 -карбоксамида гидрохлорид

Рацемический Ы-[3-[2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-й][1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамид (451 мг, 929 мкмоль) хирально очищали посредством 8РС (колонка: СЫга1се1 ОЭ-Н (5 мкм), 2,1х25 см; элюент: 40% метанол (0,2% изопропиламина) в СО₂; скорость потока 70 мл/мин при ИУ 225 нм). Хиральный анализ первого элюируемого изомера: ко- 16 026006 лонка: СЫга1се1 ΟΌ-Н (5 мкм), 4,6x150 мм; элюент: 40% метанол (0,2% изопропиламина) в СО₂; скорость потока 5 мл/мин при ИУ 225 нм подтвердил наличие энантиомерно обогащенного (>99% ее) энантиомера с Κι = 1,01 мин (175 мг, 360 мкмоль). Данный материал (свободное основание, изомер 1) растворяли в дихлорметане (1 мл) и метаноле (0,5 мл) и добавляли 1М хлористый водород в диэтиловом эфире (0,36 мл, 360 мкмоль). Растворитель удаляли под вакуумом с получением титульного соединения (183 мг, 38%). Εδ/Μδ (т/е): 486 (М+Н).

Пример 4. N-[3-[(4аΚ,7аδ)-2-Амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4ά] [ 1,3]тиазин-7 а-ил] -4 -фторфенил] -5 -метоксипиразин-2-карбоксамида гидрохлорид

N-[3-[(4аΚ,7аδ)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-теΊрагидропирроло[3,4-ά][1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид (0,350 г, 0,58 ммоль, изомер 1) растворяли в ТГФ (2 мл) и затем добавляли метанол (4 мл) и этанол (4 мл). К смеси добавляли О-метилгидроксиламин гидрохлорид (495 мг, 5,81 ммоль) и пиридин (470 мкл, 5,81 ммоль) и реакцию нагревали до 50°С и перемешивали в течение ночи. К реакции добавляли силикагель (~10 г) и смесь концентрировали. Образец, высушенный на силикагеле, помещали в пустой картридж и очищали, проводя элюирование градиентом 0-10% 7н. аммиак в метаноле в дихлорметане. Продукт второй раз очищали на δСX колонке с применением смеси 3:1 дихлорметан:метанол и затем 2:1 дихлорметан:7 н. аммиак в метаноле. Продукт в последний раз очищали на силикагеле с применением градиента от 0 до 10% 7н. аммиак в метаноле в дихлорметане с получением свободного основания указанного в заголовке соединения. Данный материал растворяли в дихлорметане (5 мл) и добавляли 1М хлористый водород в диэтиловом эфире (0,20 мл, 660 мкмоль). Растворитель удаляли под вакуумом с получением титульного соединения (71 мг, 23%). Εδ/Μδ (т/е): 498 (М+Н).

Пример 5. N-[3-[(4аΚ,7аδ)-2-Амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4й][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-5-цианопиридин-2-карбоксамида гидрохлорид

N-[3-[(4аΚ,7аδ)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-теΊрагидропирроло[3,4-ά][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-5-цианопиридин-2-карбоксамид (360 мг, 0,59 ммоль) растворяли в этаноле (10 мл) и дихлорметане (2 мл). Добавляли О-метилгидроксиламина гидрохлорид (504 мг, 5,91 ммоль) и пиридин (478 мкл, 5,91 ммоль) и реакцию перемешивали при комнатной температуре в течение выходных (70 ч). Реакцию нагревали до 60°С и перемешивали в течение 24 ч. Реакцию концентрировали с получением неочищенного продукта и очищали посредством хроматографии на силикагеле с применением градиента 0-10% 7н. аммиак в метаноле в дихлорметане с получением свободного основания указанного в заголовке соединения. Данный материал растворяли в дихлорметане (5 мл) и добавляли 1М хлористый водород в диэтиловом эфире (0,54 мл, 540 мкмоль). Растворитель удаляли под вакуумом с получением указанного в заголовке соединения (240 мг, 75%). Εδ/Μδ (т/е): 475 (М+Н).

Пример 6. N-[3-[(4аΚ,7аδ)-2-Амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4й][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-3,5-дифторпиридин-2-карбоксамида гидрохлорид

N-[3-[(4аΚ,7аδ)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-теΊрагидропирроло[3,4-ά][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-3,5-дифторпиридин-2-карбоксамид (330 мг, 0,53 ммоль) растворяли в ТГФ (10 мл) и разбавляли этанолом (10 мл). Добавляли О-метилгидроксиламина гидрохлорид (453 мг, 5,32 ммоль) и пиридин (430 мкл, 5,91 ммоль) и реакцию перемешивали при комнатной температуре в течение выходных (70 ч). Реакцию нагревали до 60°С и перемешивали в течение 24 ч. Смесь концентрировали на силикагеле (~10 г) и очищали посредством хроматографии на силикагеле с применением градиента 0-10% 7н. аммиак в метаноле в дихлорметане с получением свободного основания указанного в заголовке соединения. Данный материал растворяли в дихлорметане (5 мл) и добавляли 1М хлористый водород в диэтиловом эфире (0,49 мл, 490 мкмоль). Растворитель удаляли под вакуумом с получением указанного в заго- 17 026006 ловке соединения (159 мг, 54%). Εδ/Μδ (т/е): 486(М+Н).

Пример 7. N-[3-[(4аΚ,7аδ)-2-Амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4ά] [ 1,3]тиазин-7а-ил] -4-фторфенил] -5 -цианопиридин-2-карбоксамида гидрохлорид

N-[3-[(4аΚ,7аδ)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-ά][1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-цианопиридин-2-карбоксамид (133 мг, 0,22 ммоль, изомер 1) растворяли в ТГФ (1 мл) и разбавляли метанолом (3 мл) и этанолом (3 мл). Добавляли О-метилгидроксиламина гидрохлорид (190 мг, 2,2 ммоль) и пиридин (180 мкл, 2,2 ммоль). Реакцию нагревали до 50°С и перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали на силикагеле (~10 г) и очищали посредством хроматографии на силикагеле, проводя элюирование градиентом 0-10% 7 н. аммиак в метаноле:дихлорметан. Материал второй раз очищали на δί','Χ колонке с применением смеси 3:1 дихлорметан:метанол и затем 2:1 дихлорметан:7н. аммиак в метаноле. Смесь в последний раз очищали на силикагеле с применением градиента от 0 до 10% 7н. аммиак в метаноле в дихлорметане с получением свободного основания указанного в заголовке соединения. Данный материал растворяли в дихлорметане (5 мл) и добавляли 1М хлористый водород в диэтиловом эфире (0,27 мл, 270 мкмоль). Растворитель удаляли под вакуумом с получением указанного в заголовке соединения (114 мг, 97%). Εδ/Μδ (т/е): 493 (М+Н).

Пример 8. N-[3-[(4аΚ,7аδ)-2-Амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4ά] [ 1,3]тиазин-7 а-ил] -4 -фторфенил] -3,5 -дифторпиридин-2-карбоксамида гидрохлорид

Н-|3-|(4аР^^)-2-бенэамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4.4а.5.7-тетрагидропирроло|3.4-б||1.3|тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-3,5-дифторпиридин-2-карбоксамид (190 мг, 0,31 ммоль, изомер 1) растворяли в ТГФ (1 мл) и разбавляли метанолом (3 мл) и этанолом (3 мл). Добавляли О-метилгидроксиламина гидрохлорид (267 мг, 3,1 ммоль) и пиридин (253 мкл, 3,1 ммоль) и реакцию нагревали до 50°С и перемешивали в течение ночи. Реакцию очищали на δί','Χ колонке с применением смеси 3:1 дихлорметан:метанол и затем 2:1 дихлорметан:7н. аммиак в метаноле. Материал в последний раз очищали на силикагеле с применением градиента от 0 до 10% 7н. аммиак в метаноле:дихлорметан с получением свободного основания указанного в заголовке соединения. Данный материал растворяли в дихлорметане (5 мл) и добавляли 1М хлористый водород в диэтиловом эфире (0,20 мл, 200 мкмоль). Растворитель удаляли под вакуумом с получением указанного в заголовке соединения (101 мг, 60%). Εδ/Μδ (т/е): 504 (М+Н).

Методики анализов ίη νίίΓΟ.

Для ферментных и клеточных анализов ίη νίίτο тестируемые соединения готовили в ДМСО с получением 10 мМ исходного раствора. Исходный раствор серийно разводили в ДМСО для получения десятиточечной кривой разведения с конечными концентрациями соединения в диапазоне от 10 мМ до 0,05 нМ в 96-луночном круглодонном планшете до проведения ферментного анализа и анализа на целых клетках ίη νίίτο.

Анализы ингибирования протеазы ίη νίίτο.

Экспрессия человеческой ВАСЕ1.

Человеческую ВАСЕ1 (учетный номер: АР190725) клонировали из общей кДНК головного мозга посредством ПЦР в реальном времени. Нуклеотидные последовательности, соответствующие последовательностям аминокислот #1 до 460, вставляли в кДНК, кодирующую полипептид 1дС] (Ре) человека (Уаззаг еί а1. 1999). Данный гибридный белок ВАСЕ1(1-460) и человеческий Рс, названный 1иВАСЕ1:Рс, встраивали в вектор ρίΒ02. Клетки НЕК293 временно экспрессировали человеческую ВАСЕ1(1-460):Рс (йиВАСЕ1:Рс). 250 мкг кДНК каждой конструкции перемешивали с Ридеие 6 и добавляли к 1 л НЕК293 клеток. Через четыре дня после трансфекции кондиционированные среды собирали для очистки.

Очистка йиВАСЕ1 :Рс.

1шВАС'Е1:Рс очищали с помощью хроматографии с применением протеина А. Ферменты хранили при -80°С в виде маленьких аликвот.

Анализ резонансного переноса энергии флуоресценции (РКЕТ) ВАСЕ1.

Серийные разведения тестируемых соединений получали, как описано выше. Соединения далее разбавляли 20х в КН₂РО₄ буфере. Десять мкл каждого разведения добавляли в каждую лунку в рядах от А до Н соответствующего черного планшета с низким связыванием белков, содержащего реакционную

- 18 026006 смесь (25 мкл 50 мМ КН₂РО₄, рН 4,6, 1 мМ ΤΡΙΤΟΝ® Х-100, 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и 15 мкМ ΡΡΕΤ-субстрата) (см. Уап§ е1. а1., I. №игос11ет181гу, 91(6) 1249-59 (2004)). Содержимое хорошо перемешивали на шейкере для планшетов в течение 10 мин. Пятнадцать мкл 200 пкМ человеческой ВАСΕ1(1-460):Рс (см. Уа88ег е! а1., δ^ι^, 286, 735-741 (1999)) в КН₂РО₄ буфере добавляли в планшет, содержащий субстрат и тестируемые соединения для инициирования реакции. КРИ (относительные единицы флуоресценции) смеси в момент времени 0 записывали при длине волны возбуждения 355 нм и длине волны излучения 460 нм после кратковременного перемешивания на шейкере для планшетов. Реакционный планшет накрывали алюминиевой фольгой и выдерживали в темной влажной печи при комнатной температуре в течение от 16 до 24 ч. КРИ в конце инкубирования записывали с теми же настройками возбуждения и излучения, которые применяли для момента времени 0. Различие в ВРИ в момент времени 0 и в конце инкубирования является показателем активности ВАСЕ1 при обработке соединением. Различия ВРИ нанесены в зависимости от концентрации ингибитора, и для получения значений ЕС₅₀ и Ю₅₀ кривая приведена к четырехпараметрическому логистическому уравнению. (См. δίη1ι;·ι е! а1., №!иге, 402, 537-540 (2000)).

Следующие примеры соединений были протестированы, по существу, как описано выше, и для них наблюдали следующую активность в отношении ВАСЕ1.

Таблица 1

Пример #	ВАСЕ1 1С»(нМ)
1	0,610 (+ 0,0948, 11=8/9)
2	0,482 (± 0,0580, п=6/7)
3	0,554 (+ 0,0674, п=3)
4	0,569 (+ 0,0796, п=2)
5	0,450(+0,0911,11=4)
6	0,739(+0,181, п=7)
7	0,358 (п=1/3)
8	0,730(+0,0951,11=3)

Среднее значение ±δΕΜ; δΕΜ - стандартная ошибка среднего значения.

Эти данные показывают, что соединения из табл. 1 эффективно ингибируют активность очищенного рекомбинантного фермента ВАСЕ1 ίη νίίτο.

Анализ на целых клетках для определения ингибирования активности Бета-секретазы ΗΕΚ293δ\\ν в анализе на целых клетках.

В стандартном анализе на целых клетках для определения ингибирования активности бетасекретазы применяли клеточную линию эмбриональных клеток человека НΕК293р (АТСС Ассе88юп Νο. СВГ-1573), стабильно экспрессирующих человеческую АРР751 кДНК, содержащую двойную мутацию, возникшую естественным путем, ^у8651Μе!652 в А8п651Ьеи652, обычно называемую Шведской мутацией (обозначено ΗΕΙ<293δ\\ν), и проявляющих избыточную продукцию АЬе!а (Сйгоп е! а1., №!иге, 360, 672-674 (1992)). Ш νίίτο анализ снижения уровня АЬе!а описан в литературе (см. ^ονеу е! а1., 1оигпа1 οί №игосЬет18!гу, 76, 173-181 (2001); δеиЬе^ι е! а1., №!иге, 361, 260 (1993); и Ιοίιι^οιι-Χνοοά е! а1., Ргос. №!1. Асаά. 8с1. υδΑ, 94, 1550-1555 (1997)).

Клетки (ΗΕΚ293δ\\ν при 3,5х10⁴ клеток/лунка, содержащих 200 мкл культуральной среды, ΌΜΕΜ, содержащей 10% РВδ) инкубировали при 37°С в течение от 4 до 24 ч в присутствии/отсутствие ингибиторов (разведенных в ДМСО) в необходимой концентрации. В конце инкубирования кондиционированную среду анализировали на наличие бета-секретазной активности, например, посредством анализа АЬе!а пептидов. Общие АЬе!а пептиды (АЬе!а 1-х) определяли посредством иммуноферментного анализа сэндвич-типа (ΕΗ[δΑ) с применением моноклональных 266 в качестве иммобилизованного антитела и биотинилированных 3Ό6 в качестве визуализирующих антител. Кроме того, пептиды АЬе!а 1-40 и АЬе!а 1-42 определяли посредством иммуноферментного анализа сэндвич-типа (ΕίΙδΑ) с применением моноклональных 203 в качестве иммобилизованного антитела для АЬе!а 1-40 и моноклональных 21Р12 в качестве иммобилизованного антитела для АЬе!а 1-42. Как для АЬе!а 1-40, так и для АЬе!а 1-42 в иммуноферментных анализах ΕίΙδΑ применяли биотинилированные 3Ό6 в качестве визуализирующих антител. Концентрация АЬе!а, высвобожденного в кондиционированную среду после обработки соединением, соответствует активности ВАСЕ1 при таких условиях. 10-точечная кривая ингибирования построена и приведена к четырехпараметрическому логистическому уравнению для получения значений ЕС₅₀ и КУ, для эффекта снижения АЬе!а. Следующие примеры соединений были протестированы, по существу, как описано выше, и для них наблюдали следующую активность в отношении эффекта снижения АЬе!а.

- 19 026006

Таблица 2

Пример	Имму ноферментный анализ Е1Л8А НЕК	Иммуноферментный анализ ЕЫ8А НЕК
	293 Зте А-Ье(а (140) 1С;о (нМ)	293 Зтее А-Ье1а (142) 1С;о (нМ)
1	0,619	0,437
2	0,324	0,289
3	1,26	0,299
5	0,0887	0,0785
6	0,220	0,211

Среднее значение ±δΕΜ; δΕΜ - стандартная ошибка среднего значения Эти данные показывают, что соединения из табл. 2 эффективно ингибируют естественное продуцирование АЬе1а в целых клетках.

Анализ белка-предшественника амилоида (ΡΌΑΡΡ) первичных нейронов.

Подтверждающий анализ на целых клетках также проводили на первичных культурах нейронов, полученных из эмбрионов ΡΌΑΡΡ-трансгенных мышей. Первичные кортикальные нейроны получали из ΡΌΑΡΡ-эмбрионов на 16-й эмбриональный день и культивировали в 96 луночных планшетах (15х10⁴ клеток/лунка в ΌΜΕΜ/Ρ12 (1:1) с добавлением 10% ΡΒδ). Через 2 дня ίη νίίτο культуральную среду замещали ΌΜΕΜ/Ρ12 (1:1), свободной от сыворотки, содержащей добавку В27 и 2 мкМ (конечная) Ага-С (δίβΐηα. С1768). На день 5 ίη νίίτο нейроны инкубировали при 37°С в течение 24 ч в присутствии/отсутствие ингибиторов (разбавленных в ДМСО) в необходимой концентрации. По окончании инкубирования, кондиционированную среду анализировали на наличие бета-секретазной активности, например, посредством анализа ΑЬеίа пептидов. Общее количество ΑЬеίа пептидов (ΑЬеίа 1-х) определяли посредством иммуноферментного анализа сэндвич-типа (ΕΌΙδΑ) с применением моноклональных 266 в качестве иммобилизованного антитела и биотинилированных 3Ό6 в качестве визуализирующих антител. Кроме того, пептиды ΑЬеίа 1-40 и ΑЬеίа 1-42 определяли посредством иммуноферментного анализа сэндвич-типа (ΕΌΙδΑ) с применением моноклональных 203 в качестве иммобилизованного антитела для ΑЬеίа 1-40 и моноклональных 21Р12 в качестве иммобилизованного антитела для ΑЬеίа 1-42. Как для ΑЬеίа 1-40, так и для ΑЬеίа 1-42 в иммуноферментных анализах (ΕΌΙδΑ) применяли биотинилированные 3Ό6 в качестве визуализирующих антител. Концентрация ΑЬеίа, высвобожденного в кондиционированную среду после обработки соединением, соответствует активности ВАСЕ1 при таких условиях. 10точечная кривая ингибирования построена и приведена к четырехпараметрическому логистическому уравнению для получения значений ЕС₅₀ и 1С₅₀ для эффекта снижения ΑЬеίа. Следующие примеры соединений были протестированы, по существу, как описано выше, и для них наблюдали следующую активность в отношении эффекта снижения ΑЬеίа.

Таблица 3

Пример	Иммуноферментный анализ ЕЫ8А А-Ье1а Ρϋ АРР-нейронов (140) 1С5о (нМ)	Иммуноферментный анализ ЕЫ5А А-Ье1а РОАРР-нейронов (142) 1С5о (нМ)
1	0,487 (+ 0,0946, п-2)	0,591 (+ 0,268, п=2)
2	0,244 (п=1/2)	1,22 (+0,967, п=2)
3	0,309 (+ 0,0478, п=2)	0,184(+0,0234, п=2)
4	0,134	0,131
5	0,132 (+ 0,0717, п—2)	0,0813
6	0,279 (+ 0,0607, п=2)	0,308 (+0,115, п=2)
7	0,0873	0,0649
8	0,285	0,29

Среднее значение ±δΕΜ; δΕΜ - стандартная ошибка среднего значения Эти данные демонстрируют, что соединения из табл. 3 эффективно ингибируют продуцирование ΑЬеίа в целых клетках.

Ингибирование Бета-секретазы ίη νίνο.

Некоторые модели животных, включая мышей, морских свинок, собак и обезьян, можно применять для оценки ингибирования активности бета-секретазы ίη νίνο после обработки соединениями. В настоящем изобретении можно использовать животных дикого типа, трансгенных или животных с нокаутом генов. Например, ΡΌΑΡΡ-модель мышей, полученная как описано в 0ате8 еί а1., №1иге 373, 523-527 (1995), и другие нетрансгенные или с нокаутом генов животные подходят для анализа ίη νίνο ингибиро- 20 026006 вания АЬе!а и продукции зАРРЬе!а в присутствии ингибирующих соединений. В целом, РИАРР-мышам возраста от 2 до 12 месяцев, мышам с нокаутом генов или нетрансгенным животным вводили соединения, приготовленные в носителях, таких как кукурузное масло, циклодекстран, фосфатные буферы, ΡΗΆΚΜΆδΟυνΈ® или других подходящих носителях. Животных умерщвляли через период от одного до двадцати четырех часов после введения соединения и для анализа фрагментов АЬе!аз, С99 и зАРР удаляли головной мозг, а также спинномозговую жидкость и плазму (см. Мау е! а1., 1оигпа1 οί №игозс1епсе, 31, 16507-16516 (2011)).

В качестве стандарта в фармакологических исследованиях ίη νίνο животным вводили различные концентрации соединения и сравнивали с контрольной группой, обработанной носителем в то же время. Через некоторое время исследований для установления базового уровня из выбранных животных получали ткани головного мозга, плазму или спинномозговую жидкость, начиная с момента времени 0. Другим группам вводили соединение или подходящий носитель и умерщвляли животных в различные моменты времени после введения дозы. Из выбранных животных получали ткани головного мозга, плазму или спинномозговую жидкость и анализировали на наличие продуктов расщепления АРР, включая пептиды АЬе!а, зАРРЬе!а и другие фрагменты АРР, например, посредством специфического иммуноферментного анализа сэндвич-типа (ЕЫ8А). По окончании периода анализа животных умерщвляли, и ткани головного мозга, плазму и спинномозговую жидкость анализировали на наличие пептидов АЬе!а, С99 и зАРРЬе!а, в соответствующих случаях. Ткани головного мозга АРР-трансгенных животных также могут быть проанализированы на количество бета-амилоидных бляшек после обработки соединением. АЬе!а 1-х пептид в настоящем документе обозначает сумму видов АЬе!а, которые начинаются с остатка 1 и заканчиваются С-концом более, чем остаток 28. Это обнаруживает большинство видов АЬе!а и их часто называют общий АЬе!а.

Животные (РЭАРР или другие АРР-трансгенные или нетрансгенные мыши), которым вводили ингибирующее соединение, могут демонстрировать снижение АЬе!а или зАРРЬе!а в тканях головного мозга, плазме или спинномозговой жидкости и уменьшение бета-амилоидных бляшек в тканях головного мозга в сравнении с контролем, обработанным носителем, или контролем в нулевой момент времени. Например, через 3 ч после введения пероральной дозы соединения примера 1, составляющей 1, 3 или 10 мг/кг, молодым самкам РИАРР-мышей, уровни пептида АЬе!а 1-х снизились приблизительно на 34, 48 и 53% в гиппокампе головного мозга и приблизительно на 43, 59 и 66% в коре головного мозга, соответственно, в сравнении с мышами, обработанными носителем.

Например, через 3 ч после введения пероральной дозы соединения примера 3, составляющей 1 или 3 мг/кг, уровни пептида АЬе!а 1-х снизились приблизительно на 38 и 50% в гиппокампе головного мозга и приблизительно на 34 и 53% в коре головного мозга, соответственно, в сравнении с мышами, обработанными носителем.

Учитывая активность примеров 1 и 3 против фермента ВАСЕ ίη νίΐΓο, данные эффекты снижения АЬе!а согласуются с ингибированием ВАСЕ ίη νίνο и далее демонстрируют проникновение примеров 1 и 3 в ЦНС.

Данные исследования показывают, что соединения согласно настоящему изобретению ингибируют ВАСЕ и, следовательно, подходят для снижения уровней АЬе!а.

Claims (8)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение формулы I в котором К представляет собой Η или Е; А представляет собой или его фармацевтически приемлемая соль.
2. 2. Соединение или соль по п.1, которое представляет собой

   - 21 026006

   Н₃СО
3. 3. Соединение по п.2, которое представляет собой

   Н₃СО собой
4. 4. Способ лечения болезни Альцгеймера у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения по любому из пп. 1 -3 или его фармацевтически приемлемой соли.
5. 5. Способ предотвращения прогрессирования умеренного когнитивного нарушения до болезни Альцгеймера у пациента с риском развития болезни Альцгеймера, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения по любому из пп. 1 -3 или его фармацевтически приемлемой соли.
6. 6. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-3 в терапии заболеваний и расстройств, связанных с β-амилоидным (АЬе1а) пептидом.
7. 7. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-3 для лечения болезни Альцгеймера.
8. 8. Фармацевтическая композиция для лечения болезни Альцгеймера, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль по любому из пп.1-3 с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами.