EA025000B1 - Засухоустойчивые растения - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение касается области трансгенных и нетрансгенных растений с новыми фенотипами. Здесь представлены белки SlPP2C1 и кодирующие их нуклеиновые кислоты, которые являются полезными в предоставлении новых фенотипов растений, особенно засухоустойчивости.

Description

Изобретение касается области биотехнологии и селекции растений. Предоставлены засухоустойчивые растения, в частности засухоустойчивые овощи, такие виды, как томат (§о1агшт Ьусорег81сит), а также способы получения генетически модифицированных или мутантных засухоустойчивых растений. Изобретение предоставляет новый ген, называемый 81РР2С1, кодирующий белок 81РР2С, который является отрицательным регулятором реакции абсцизовой кислоты (АВА). Понижающая регуляция, модификация или сайленсинг гена 81РР2С1 приводят к получению растений, имеющих значительно повышенную засухоустойчивость. Предоставлены также растения, семена, плоды и части растений, содержащие в своем геноме мутантный аллель 81РР2С1 и имеющие значительно повышенную засухоустойчивость. В настоящем документе в другом варианте осуществления изобретения предоставлены способы получения засухоустойчивых растений, содержащих в своем геноме один или несколько мутантных аллелей 81РР2С1.

Предпосылки к созданию изобретения

Абсцизовая кислота (АВА) фитогормонов имеет важное значение для регулирования абиотических стрессовых реакций (таких как засуха, засоление, холодовой шок, скарификация, патогенная атака), а также для развития семян и периода покоя. Экраны для мутантов с измененными абиотическими стрессовыми реакциями или покоем семян были часто использованы и привели к выявлению генов, важных для биосинтеза АВА и сигнальной трансдукции АВА. С помощью такого экрана были выявлены АгаЫάορδΐδ АВА-нечувствительные мутанты аЫ1-1 и аЫ2-1 (КоотиееГ и др. 1984, РЬу8ю1 Р1аи1агит 61: 377383).

Клонирование и характеристика гена А1АВ11 показали, что он кодирует серин/треониновую протеинфосфатазу типа 2С (РР2С, Ьеиид и др. 1994, 8шеисе 264: 1448-1452; Меуег и др. 1994, Наука 264: 14521455). А1АВ12 также кодирует протеинфосфатазу типа 2С. Мутанты аЫ1-1 и аЫ2-1 несут мутации в гены А1АВ11 и А1АВ12. которые приводят к идентичным С1у-А8р заменам в эквивалентных позициях (Ьеиид и др. 1997, Р1аШ Се11 9: 759-771). Оба мутанта были показаны со сниженной активностью фосфатазы (ВегКшсЬе и др. 1996, Еиг. 1. ВюсЬет 241: 193-200; Ьеиид и др. 1997, выше), которые предполагают, что А1АВ11 и А1АВ12 являются положительными регуляторами чувствительности к АВА. Тем не менее, конститутивная сверхэкспрессия А1АВ11 замедляла активность АВА в протопласте кукурузы, и мутанты А1АВ11 и А1АВ12 снижения функции были показаны как имеющие сверхчувствительную реакцию к АВА (8сЬееи 1998, РЫА8 95:975-980; Оо8Й и др. 1999, Р1аи! Се11 11: 1897-1909; Мег1о1 и др. 2001, Р1аи! 1. 25:295-303). В целом, был сделан вывод, что А1АВ11 и А1АВ12 являются отрицательными регуляторами реакции АВА. Точный механизм, с помощью которого мутации в аЫ1-1 и аЫ2-1 вызывают нечувствительность к АВА, до сих пор неизвестен, хотя это может быть связано с преимущественной ядерной локализацией мутантных белков (Мое8 и др. 2008, Р1аи! 1. 54: 806-819). А1АВ11 и А1АВ12 важны для покоя семян, но также и для роста рассады и регулирования устьичной щели, что указывает на то, что эти белки действуют до основных точек ветвления, которые контролируют ткане-специфические АВА сигнальные каскады (Ьеиид и др. 1997, выше).

Семьдесят шесть РР2С8 были выявлены в АгаЬШор818, из которых одна подгруппа РР2С-А), состоящая из девяти генов, была связана с сигнальной трансдукцией АВА (5>сЬ\уе1дЬоГег и др. 2004, ТгеиЙ8 ш Р1аи! 8аеисе Уо1. 9: 236-243). Некоторые из генов АгаЫбор818, принадлежащих к этой группе, также были найдены для кодирования отрицательных регуляторов реакции АВА. Например, А1Р2С-НА (Робпдне/ и др. 1998, Р1аШ Мо1. Вю1. 38: 879-883) (также называемый А1НАВ1, 5ае/ и др. 2004, Р1аи! 1. 37: 354369) является репрессором сигнального пути АВА, регулирующим многочисленные реакции АВА, такие как закрытость устьиц, прорастание семян и торможение вегетативного роста. Также НАВ2, похоже, имеет аналогичную регуляторную роль. А1РР2СА (КиЬи и др. 2006, Р1аи! РЬу8ю1. 140:127-139) также был описан как отрицательный регулятор АВА с мутантом, показывающим сверхчувствительность к АВА. Интересно, что мутант разрушения гена показал сверхчувствительную к АВА реакцию закрытости устьиц, в то время как транспирация (потеря воды) мутанта ничем не отличалась от растений дикого типа. Также Уо81иба и др. (2006, Р1аШ РЬу8ю1оду 140:115-126) изучали бессмысленную потерю функции мутации в А1РР2СА, которая имела 1/100 активности протеинфосфатазы дикого типа, и в результате чего мутантные растения АгаЬШор818 показали АВА серхчувствительность во время прорастания семян, но мутантные растения не показывали никаких изменений к засухоустойчивости по сравнению с диким типом (стр. 124, ЬН Со1ити, последний абзац).

АВ11 и АВ12 являются репрессорами сигнальных путей АВА, которые регулируют многие реакции АВА, такие как закрытость устьиц, осмотическую водопроницаемость плазматических мембран, засухоустойчивость и ризогенез, реакцию на глюкозу, стресс избыточного освещения, прорастание семян и торможение вегетативного роста. АНО1 (А15д51760) является отрицательным регулятором АВА во время прорастания семян (№8Ытига и др 2007, Р1аШ 1. 50: 935-949), и АНО3 (А!3д11410) является отрицательным регулятором АВА во время прорастания семян и холодной акклиматизации. Три другие, А15д9220, А(2д29380 и АПд07430, могут, в конце концов, не участвовать в передаче сигналов АВА, так как утратившие мутации не выявили никаких изменений в чувствительности к АВА (Уо8ЬШа и др., 2006: Р1аШ РЬу8ю1оду 140:115-126).

- 1 025000

Биосинтез и передача сигналов АВА, таким образом, чрезвычайно сложные, и хотя различные гены были выявлены в АтаЫ6ор818, которые принимали участие (группа РР2С-А), их роль в АВА зависимых реакциях, таких как абиотический стресс, покой семян и рост рассады в значительной степени неясна. Кроме того, белковые последовательности показывают небольшую закрепленность, и аминокислотные последовательности делятся небольшой идентичностью последовательности. Гены сгруппированы вместе филогенетически, на основании белковых доменов (или мотивов), таких как каталитический домен (протеин серин/треониновая фосфата подобный домен), который, как правило, расположен в Стерминалах белков. Ν-терминал значительно варьируется и может играть важную роль в соединении субстратов или предоставлять конкретные сайты присоединения к сигнальным комплексам. В дополнение к неясной функции ίη νίνο также мало известно о внутриклеточной локализации, субстратах и специфичности ферментов или о том, как эти мономерные ферменты регулируются ίη νίνο.

АО 2007/088234 описывает, что комбинированная инактивация АВ11 и НАВ1 укрепляет реакцию к АВА и приводит к получению растений АтаЫ6ор818, которые устойчивы к солености и водному стрессу. Ортологи томатов АВ11 (§ΟΝ-υ231558) и НАВ1 (§ΟΝ-υ217609) представлены на фиг. 6 и 7. См. также Зае/ и др. 2006, Р1ай Рйу8ю1 141:1389-1399.

Хотя двойные мутанты аЫ1 НаЫ приводят к засухоустойчивости в АтаЫ6ор818 (НаПана. остается необходимость в предоставлении генов, которые подходят для создания засухоустойчивости в сельскохозяйственных культурах, особенно в полевых культурах (например, рис, кукуруза, соя, пшеница, ячмень, рожь, сорго, капуста декоративная и т.д.) и овощных культурах (например, помидоры, огурцы, лук, морковь, капуста, цветная капуста, брокколи, арбуз, дыня, салат, лук-порей, шпинат, редис, картофель, артишоки, маш-салат, тыква, кабачки, фасоль, горох, перец и т.д.). Особенно в овощных культурах нехватка воды может быть большой проблемой, так как корни многих культур мелкие, и так как продукты часто продаются в свежем виде, нехватка воды может привести к снижению качества овощей и снижению урожайности. Плоды и семена овощей, такие как томаты, чувствительны к нехватке воды во время цветения и во время созревания плодов и развития семян. Завязь может быть серьезно уменьшена из-за нехватки воды во время развития плода. Обычная практика для решения потенциальных ситуаций водного стресса - это полив сельскохозяйственных культур и/или культиваров или сортов растений с засухоустойчивостью, насколько это доступно. Кроме того, могут быть использованы перегной и сырые покровы.

Несмотря на усилия разведения, растения томатов остаются чувствительными к засухе, и не существует коммерческого культивара с засухоустойчивостью.

Настоящее изобретение предоставляет новые гены, называемые 81РР2С1, пригодные для создания засухоустойчивых сельскохозяйственных культур, особенно томатов и других овощных растений. Настоящее изобретение также предоставляет способы получения засухоустойчивых растений. Также предоставлены и сами засухоустойчивые растения, семена и части растений (собранные плоды и т.д.).

Общие определения

Термин последовательность нуклеиновой кислоты (или молекула нуклеиновой кислоты) относится к ДНК или РНК молекуле в одной или двухцепочной форме, в частности ДНК, кодирующей белок или фрагмент белка согласно данному изобретению. Изолированная нуклеиновая кислота относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая больше не находится в природной среде, из которой она была выделена, например последовательности нуклеиновых кислот в бактериальной клеткереципиенте или в растительном ядерном или пластидном геноме.

Термин белок или полипептид взаимозаменяемы и относятся к молекулам, состоящим из цепочки аминокислот, независимо от конкретного способа действия, размера, 3-мерной структуры и происхождения. Фрагмент или часть белка 81РР2С1, таким образом, может еще называться белок. Изолированный белок используется для обозначения белка, который уже не находится в своей природной среде, например в искусственных условиях или в рекомбинантной бактериальной или растительной клетке-реципиенте.

Термин ген означает последовательность ДНК, содержащую участок (участок транскрипции), который записан в молекуле РНК (например, мРНК) в клетке, функционально связанной с подходящими регулируемыми участками (например, промоторами). Ген может, таким образом, состоять из нескольких функционально связанных последовательностей, таких как промотор, 5' лидерная последовательность, включающая, например, последовательности, участвующие в инициации трансляции, а (белок) кодирующий участок (кДНК или геномной ДНК), а также 3' нетранслируемую последовательность, включающую, например, сайты терминации транскрипции.

Химерный ген (или рекомбинантный ген) относится к любому гену, который обычно не встречается в природе в видах, в частности генах, в которых одна или несколько частей последовательности нуклеиновых кислот присутствуют, которые не связаны друг с другом в природе. Например, промотор не связан в природе с частью или целым транскрибируемым участком или с другим регуляторным участком. Термин химерный ген подразумевает включение экспрессии конструкции, в которых промотор или транскрипция регуляторной последовательности функционально связана с одной или несколькими кодирующими последовательностями или антисмысловой (обратным дополнением к смысловой нити) или последовательностью обращенных повторов (смысл и антисмысл, посредством чего РНК транскрипт

- 2 025000 формирует двухцепочную РНК на транскрипции). Цис-ген - это химерный ген, который является предпочтительным из всех последовательностей генов, и, по меньшей мере, транскрибируемых последовательностей, полученный из видов растений, совместимых для размножения с видами, в которые вводится ген.

Экспрессия гена означает процесс, в котором ДНК участок, который функционально связан с соответствующими регулирующими участками, в частности, промотором, транскрибируется в РНК, которая является биологически активной, то есть которая способна быть переведенной в биологически активный белок или пептид (или активный фрагмент пептида), либо быть активной (например, в посттранскрипционном сайленсинге генов или РНК-интерференции). Кодирующая последовательность может быть в смысловой ориентации и кодирует желаемый биологически активный белок или пептид или активный фрагмент пептида. В подходах сайленсинга генов, ДНК последовательность предпочтительно присутствует в виде ДНК антисмысловых или инвертированных ДНК повторах, состоящих из короткой последовательности гена-мишени в антисмысловой или в смысловой и антисмысловой ориентации (инвертированный повтор). Эктопическая экспрессия относится к экспрессии в тканях, в которых ген, как правило, не выражен.

Активный белок или функциональный белок - это белок, который имеет активность белка, измеримую в искусственных условиях, например при анализе активности в искусственных и/или в естественных условиях, например, по фенотипу, предоставляемому белком. Белок дикого типа представляет собой полностью функциональный белок, представленный в диком виде растений. Мутантный белок это белок, включающий одну или несколько мутаций в последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих белки, причем мутация приводит к (мутантных молекул нуклеиновой кислоты кодирования) ограничению функций или потере функции белка, как, например, измеримых активностью белка в искусственных условиях по сравнению с активностью белка дикого типа, например в анализе активности и/или в естественных условиях, например, по фенотипу, предоставляемому мутантным аллелем.

Мутация в молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, представляет собой изменение одного или нескольких нуклеотидов по сравнению с диким типом последовательности, например, путем замены, удаления или вставки из одного или нескольких нуклеотидов. Точечная мутация заключается в замене одного нуклеотида, или вставке, или удалении одного нуклеотида.

Несмысловая мутация - это (точечная) мутация в последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих белок, в результате чего кодон превращается в терминирующий кодон. Это приводит к преждевременному терминирующему кодону, присутствующему в мРНК и в усеченном белке. Усеченный белок, возможно, имеет сниженную функцию или потерю функции.

Миссенс мутация - это (точечная) мутация в последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих белок, в результате чего кодон меняют для кодирования различных аминокислот. Полученный белок, возможно, имеет сниженную функцию или потерю функции.

Сплайс-сайт мутация - это мутация в последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих белок, в результате чего РНК сплайсинг пре-мРНК изменяется, что приводит к мРНК, имеющей различные нуклеотидные последовательности, и белку, имеющему различные последовательности аминокислот по сравнению с диким типом. Полученный белок, возможно, имеет сниженную функцию или потерю функции.

Мутация сдвига рамки - это мутация последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих белки, в которых рамки считывания мРНК изменены, ведущие к различным последовательностям аминокислот. Полученный белок, возможно, имеет сниженную функцию или потерю функции.

Мутация в регуляторной последовательности, например, в промоторе гена, - это изменение одного или нескольких нуклеотидов по сравнению с диким типом последовательности, например, путем замены, удаления или вставки из одного или нескольких нуклеотидов, что приводит, например, к снижению или к отсутствию мРНК транскрипта полученного гена.

Сайленсинг относится к понижающей регуляции или полному ингибированию экспрессии гена гена-мишени или семейства генов.

Ген-мишень в подходах сайленсинга генов - это ген или семейство генов (или один или несколько конкретных аллелей гена), из которых эндогенная экспрессия гена подавляется или полностью замедляется (подавляется), когда химерный ген сайленсинга (или химерный ген РНК-интерференции) выражается, например, и производит сайленсинг РНК транскрипта (например, йвРНК или ΙιαίΓρίηΡΝΛ способны к сайленсингу эндогенной экспрессии гена-мишени). В подходах мутагенеза, ген-мишень является эндогенным геном, который должен мутировать, что приводит к изменению (снижению или потере) экспрессии генов или изменению (снижения или потери) функции кодируемого белка.

Смысловой РНК транскрипт, как правило, получен путём соединения промотора в двухцепочную молекулу ДНК, в которой смысловая нить (кодирующая цепь) молекулы ДНК в 5' к 3' ориентации, так что при транскрипции РНК смысл транскрибируется, который имеет одинаковую последовательность нуклеотидов в смысловой ДНК нити (за исключением того, что Т заменяется и в РНК). Антисмысловой РНК транскрипт, как правило, получен путем соединения промотора в комплементарную нить (антисмысловые нити) смысловой ДНК, таким образом, при транскрипции антисмысловая РНК транскри- 3 025000 бируется.

Транскрипция регуляторной последовательности здесь определяется как последовательность нуклеиновой кислоты, которая способна регулировать скорость транскрипции (кодирования) последовательности, функционально связанной с транскрипцией регуляторной последовательности. Транскрипция регуляторной последовательности, как определено здесь, таким образом, включает в себя все последовательности элементов, необходимых для инициации транскрипции (элементов промотора), для поддержания и регулирования транскрипции, включая, например, ослабители и усилители. Хотя, главным образом, растущая (5') транскрипция регуляторных последовательностей в кодирующей последовательности относится к регуляторной последовательности, обнаруженной в снижении (3') кодирующей последовательности, также подпадает под это определение.

Используемый здесь термин промотор относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, которая контролирует транскрипцию одного или нескольких генов, расположенных выше по отношению направления транскрипции инициации транскрипции участка гена, и структурно определен наличием участков, связывающих ДНК-зависимую РНК-полимеразу, участки инициации транскрипции и любые другие последовательности ДНК, в том числе, но не ограничиваясь транскрипционными факторами участков связывания, репрессора и активатора связывания участков белка и любой другой последовательности, известному одной из способностей в науке, чтобы прямо или косвенно регулировать количество транскрипции промотора. Конститутивный промотор - это промотор, активный в большинстве тканей в самых физиологических и развивающихся условиях. Индуцируемый промотор - это промотор, который физиологически (например, наружное применение некоторых соединений) или эволюционно регулируется. Тканеспецифичный промотор действует только в определенных типах тканей или клеток.

В соответствии с документом термин функционально связанный относится к соединению полинуклеотидных элементов в функциональной взаимосвязи. Нуклеиновая кислота функционально связана, когда она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновых кислот. Например, промотор, или, скорее, транскрипция регуляторной последовательности, функционально связан с кодирующей последовательностью, если это влияет на транскрипцию кодирующей последовательности. Функционально связан означает, что последовательности ДНК, будучи связанными, как правило, являются смежными и, при необходимости, объединяют два участка кодирования белка, смежных и в рамке считывания, чтобы произвести химерный белок. Химерный белок или гибридный белок представляет собой белок, состоящий из различных белков доменов (или мотивов), который не был найден в качестве такового в природе, но который был объединен для формирования функционального белка, который показывает функциональность присоединённых доменов. Химерный белок также может быть гибридным белком двух или более белков, встречающихся в природе.

Термин домен, используемый в настоящем документе, означает любую часть(части) или домен(ы) белка с определенной структурой или функцией, которые могут быть переданы другому белку для обеспечения нового гибридного белка, по меньшей мере, с функциональной характеристикой домена. Конкретные домены могут также быть использованы для идентификации представителей белков, принадлежащих к З1РР2С1 группе белков, таких как З1РР2С1 ортологов из других видов растений. Примеры доменов, найденных в белках З1РР2С1, - это серин/треониновая фосфатаза 2С (РР2С или РР2С типа) каталитический домен, который включает в себя примерно 84-391 аминокислот из ЗЕЦ ГО N0: 2 или Νтерминальный участок 81РР2С белков (аминокислоты 1-83 из ЗЕЦ ГО N0: 2).

Термин пептид-мишень относится к аминокислотной последовательности, которая нацелена на белки внутриклеточных органелл, таких как пластиды, предпочтительно хлоропласты, митохондрии, или в межклеточное пространство (секрецию сигнального пептида). Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид-мишень, может быть объединена (в рамке) в последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую терминальный конец аминокислоты (Ν-терминальный конец) белка.

Конструкт нуклеиновой кислоты или вектор в данном документе подразумеваются как искусственные молекулы нуклеиновой кислоты, которые получены в результате использования технологии рекомбинантной ДНК и которые используются для доставки экзогенной ДНК в клетку-реципиента. Основной вектор может быть, например, двоичным или супербинарным вектором (см., например, ИЗ 5591616, И8 2002138879 и \У0 9506722), совместной интеграции вектора или Т-ДНК вектора, как известно в науке и в данном документе, в который интегрирован химерный ген, или, если подходящая транскрипция регуляторной последовательности уже существует, только желаемая последовательность нуклеиновых кислот (например, кодирующая последовательность, антисмысловая или последовательность инвертированного повтора) интегрирована на выходе транскрипции регуляторной последовательности. Векторы обычно включают дальнейшие генетические элементы, чтобы облегчить их использование в молекулярном клонировании, такие как, например, селектируемые маркеры, несколько сайтов клонирования и т.п. (см. ниже).

Клетка-реципиент, или рекомбинантная клетка-реципиент, или трансформированная клетка это термины, относящиеся к новой отдельной клетке (или организму), возникающей в результате по меньшей мере из одной молекулы нуклеиновой кислоты, особенно содержащей химерный ген, кодирующий желаемый белок или последовательность нуклеиновых кислот, которые при транскрипции уступают антисмысловой РНК или РНК инвертированного повтора (или шпильки РНК) для сайленсинга

- 4 025000 пают антисмысловой РНК или РНК инвертированного повтора (или шпильки РНК) для сайленсинга целевого гена/семейства генов были введены в указанные клетки. Клетка-реципиент - это предпочтительно растительная клетка или бактериальная клетка. Клетка-реципиент может содержать конструкт нуклеиновой кислоты в качестве экстрахромосомной (эписомной) репликации молекул или более предпочтительно включает в себя интегрированный химерный ген в ядерном или пластидном геноме клеткиреципиента.

Термин селектируемый маркер - это термин, подобный одному из обычных нововведений в науке и используется здесь для описания любого генетического объекта, который, будучи выраженным, может быть использован, чтобы выбрать клетку или клетки, содержащие селектируемый маркер. Селектируемый маркер генных продуктов придает, например, устойчивость к антибиотикам или, еще лучше, устойчивость к гербицидам или иным селектируемым свойствам, таким как фенотипическое свойство (например, изменение пигментации) или потребности в питании. Термин репортер в основном используется для обозначения видимых маркеров, таких как зеленый флуоресцентный белок (СРР), еОРР, люцифераза, ОИ8 и т.д.

Термин ортолог гена или белка относится здесь к гомологичному гену или белку, найденному в другом виде, который имеет ту же функцию, что и ген или белок, но (обычно) разделившиеся в последовательности с момента времени, когда виды, скрывающие ген, разделяются (т.е. гены эволюционировали от общего предка при помощи видообразования). Ортологи гена томатов 81РР2С1, таким образом, можно определить и в других видах растений, основанных на последовательности сравнений (например, на основе процентной идентичности последовательности по всей последовательности и/или во всех определенных доменах) и/или функциональном анализе.

Термины гомологичный и гетерологичный относятся к взаимодействию между нуклеиновой кислотой или последовательностью аминокислоты и ее клетки-хозяина или организма, особенно в контексте трансгенных организмов. Гомологичная последовательность, таким образом, найдена в естественных условиях в видах реципиентов (например, в растении томата, преобразованного геном томата), а гетерологичная последовательность найдена в естественных условиях в клетке-реципиенте (например, растение томата преобразовано последовательностью из растения картофеля). В зависимости от контекста термин гомолог или гомологичный альтернативно может относиться к последовательностям, которые являются потомками от общей последовательности предков (например, они могут быть ортологами).

Жёсткие условия гибридизации могут быть использованы для идентификации нуклеотидных последовательностей, которые существенно идентичны данной нуклеотидной последовательности. Жёсткие условия зависят от последовательности и будут отличаться в различных обстоятельствах. Обычно жёсткие условия следующие: 5°С ниже точки плавления (Т_т) для определенной последовательности под определенной ионной прочностью и рН. Т_т - это температура под определенной ионной прочностью и рН, при которой 50% целевой последовательности гибридизирует в идеально подходящий экземпляр. Обычно строгие условия будут выбраны таким образом, что концентрация солей составляет около 0,02 молярной при рН 7 и температуре менее 60°С. Снижение концентрации соли и/или повышение температуры увеличивает точность. Жесткие условия для РНК-ДНК гибридизации (Иог1Ьегп ЫоК используя, например, 100-й образец) - это, например, те, которые включают по меньшей мере одну промывку в 0,2х 88С при 63°С в течение 20 мин или эквивалентных условиях. Жесткие условия для РНК-ДНК гибридизации (ЪоШйегп Ыо15. используя, например, 100-й образец) - это, например, те, которые включают по меньшей мере одну промывку (обычно 2) в 0,2х§§С при температуре по меньшей мере 50°С, обычно при 55°С, в течение 20 мин или эквивалентных условиях. См. также 8атЬгоок и др. (1989) и ЗатЬгоок и Ки88е11 (2001).

Идентичность последовательности и сходство последовательности можно определить выравниванием двух пептидных или двух нуклеотидных последовательностей с использованием глобальных или локальных алгоритмов выравнивания. Последовательности могут затем считаться практически идентичными или весьма подобными, когда они (оптимально выровнены, например, программой ОАР или ВЕ8ТР1Т или фильтрующей программой №ей1е (с использованием параметров по умолчанию, см. ниже) разделяют, по меньшей мере, определенный минимальный процент идентичности последовательности (как определено ниже). Эти программы используют ИееЛетап и ^ипзсй глобальный алгоритм выравнивания для выравнивания двух последовательностей по всей длине, получая максимальное количество совпадений и сводя к минимуму количество пробелов. Обычно параметры по умолчанию используется с пробелом создания разрыва = 10 и пробелом расширения разрыва = 0,5 (как для нуклеотидного, так и белкового выравнивания). Для нуклеотидов используемый подсчёт значений матрицы по умолчанию - это И№8дарйпа и для белков подсчёт значений матрицы по умолчанию - это В1о§ит62 (НешкоГГ & Нешкой, 1992, РИА§ 89, 915-919). Выравнивания последовательности и показатели процентной идентичности последовательности, например, могут быть определены с помощью компьютерных программ, таких как пакет ОСО Висконсин, версия 10.3, доступных из Ассе1гу§ 1пс., 9685 §сгапЮп КоаД 8ап И1едо, СА 92121-3752 И8А или ΕΜΒΘδδ (1Шр://\у\у\у.еЫ.асл.1к/Тоо15/\уеЬ5ег\тсе5/5ег\тсе5/етЬо55). Альтернативно сходство процентов или идентичность могут быть определены с помощью функции поиска в базах

- 5 025000 данных, таких как ΡΆ8ΤΆ, ВЬЛ§Т и т.д., но совпадения должны быть получены и приведены в соответствие попарно, чтобы сравнить идентичность последовательности.

В этом документе и в его формуле глагол содержать и его спряжения используются в неограниченном смысле, это подразумевает то, что пункты после слова включены, но пункты, которые не были упомянуты, также не исключены. Далее подразумевается, что, когда речь идет о последовательности, здесь, как правило, ссылаются на реальные физические молекулы с определенной последовательностью субъединиц (например, аминокислоты).

В соответствии с документом термин растение включает в себя целое растение или любые части или их производные, такие как органы растений (например, сжатый или несжатый запасающий орган, луковицы, клубни, плоды, листья и т.д.), растительные клетки, протопласты растений, растительные клеточные ткани культур, из которых целые растения могут быть восстановлены, растительные каллюсы, группа побегов растительных клеток и растительные клетки, которые являются неизменными в растениях или частях растений, таких как эмбрионы, пыльца, яйцеклетки, фрукты (например, собранные ткани и органы, такие как собранные помидоры и т.д.), клубни (например, картофель) цветы, листья, семена, клубни, луковицы, клонально размноженные растения, корни, корневые штаммы, стебли, верхушки корня и тому подобное. Также любая стадия развития включена, например, саженцы, незрелые и зрелые, и т.д.

Сорт растения представляет собой группу растений в пределах одного ботанического таксона низшего класса, известно, что (независимо от того, условия для признания права селекционера выполнены или нет) может быть определен на основе экспрессии характеристик, которые получаются из определенного генотипа или комбинации генотипов, может отличить от любой другой группы растений степенью выраженности по меньшей мере одной из этих характеристик и может рассматриваться как единое целое, потому что это может быть умножено без изменений. Таким образом, термин сорт растения не может быть использован для обозначения группы растений, даже если они того же рода, если все они характеризуются наличием 1 локуса или гена (или ряда фенотипических характеристик в связи с одним локусом или геном), но в противном случае могут отличаться друг от друга чрезвычайно, что касается других локусов и генов.

Р1, Р2 и т.д. относятся к последовательно связанным поколениям после скрещивания двух родительских растений или родительских линий. Растения, выращенные из семян, полученных путем скрещивания двух растений или линий, называются Р1 поколение. Самоопыление растений Р1 приводит к поколению Р2 и т.д. Гибрид Р1 растения (или Р1 семя) является генерацией, полученной от скрещивания двух инбредных родительских линий. М1 популяция - это множество мутировавших семян/растений определенной растительной линии или сорта. М1, М2, М3, М4 и т.д. относится к последовательным поколениям, полученным после самоопыления первых мутировавших семян/растений (М1).

Термин аллель(и) означает любую одну или более альтернативную форму гена в определенном локусе, все из которых относятся к аллели одного свойства или характеристике в определенном локусе. В диплоидной клетке организма аллели данного гена находятся в определенном месте или локусе (локусах) в хромосоме. Один аллель присутствует в каждой хромосоме пары гомологичных хромосом. Диплоидные растительные виды могут включать в себя большое число различных аллелей в определенном локусе. Они могут быть идентичными аллелями гена (гомозиготными) или двумя разными аллелями (гетерозиготными).

Термин локус (локусы) означает определенное место или места или участок на хромосоме, где, например, ген или генетический маркер найден. Локус 81РР2С1, таким образом, место в геноме, где ген 81РР2С1 найден.

Аллель дикого типа (^Т) относится здесь к версии гена, кодирующего функциональный белок (дикий тип белка). Аллель 81РР2С1 дикого типа, например, представлена в ЗЕО ГО N0: 1. Мутантный аллель относится здесь к аллелю в составе одной или нескольких мутаций в кодирующих последовательностях (мРНК или кДНК) или геномной последовательности по сравнению с диким типом аллеля. Такая мутация(и) (например, вставка, инверсия, удаление и/или замена одного или нескольких нуклеотидов) может привести к кодируемому белку, сократив в искусственных и/или в естественных условиях (снижение функции), либо не в искусственных и/или в естественных условиях (потеря функции), например, в связи с белком, будучи укороченным, или с аминокислотной последовательностью, в которой одна или более аминокислот удалены, вставлены или заменены. Такие изменения могут привести к белку, имеющему различные 30-конформации, ставшему мишенью для различных субклеточных компартментов, имеющих измененный каталитический домен, имеющий изменение сходства субстрата и/или специфичности и т.д.

Засухоустойчивость или существенно усиленная засухоустойчивость или засухоустойчивые растения относятся здесь к (в среднем) существенно расширенным способностям растительной линии, сорта или многообразия, чтобы противостоять нехватке воды/водного стресса/засухе по сравнению с подходящими контрольными растениями (например, растения дикого типа), то есть симптомы, связанные с недостатком воды (например, увядания листьев), которые (статистически) значительно снижаются в засухоустойчивых растениях по сравнению с контрольной группой, которая подвергается тем же вод- 6 025000 ным стрессовым условиям, (в среднем) восстановление и/или степень выживаемости и/или урожайность после воздействия нехватки воды/водного стресса/засухи значительно увеличилась по сравнению с контрольными растениями, такими как растения диких видов. Существуют различные методы для определения того, устойчивы ли к засухе растения, как это будет объяснено в данной работе. Предпочтительно засухоустойчивые растения имеют существенно усиленную засухоустойчивость на всех стадиях развития, но по меньшей мере на одном из следующих этапов развития: как взрослого растения, в период цветения и опыления, во множестве фруктов и развитии плода, во время развития семян, во время созревания плодов. Желательно, чтобы растение имело в дополнение и засухоустойчивость, по меньшей мере, на стадии семян, и/или во время всходов, и/или от всходов до (и включая) взрослого растения.

Растение дикого типа относится здесь к растению, включающему аллель 81РР2С1 дикого типа (νΤ), кодирующий функциональные белки (например, в отличие от мутантных растений, включающих мутантный аллель 81РР2С1). Такие растения - подходящие контрольные группы в фенотипических анализах. Предпочтительно растения дикого типа и/или мутанты - культурные растения, то есть разнообразие, линии разведения и сорта видов, культивируемые человеком и имеющие хорошие агрономические характеристики, предпочтительно такие растения - не дикие растения, то есть растения, которые обычно имеют намного хуже урожаи и агрономические характеристики, чем культурные растения и, например, растут естественно в диких популяциях. Дикие растения включают, например, экотипы, линии Р1 (интродукции растений), местные сорта и дикие присоединения или дикие родственные формы видов или так называемое видовое разнообразие или сорта, например, разнообразие или сорта обычно выращены в более ранние периоды человеческой истории, но которые не используются в современном сельском хозяйстве.

Засуха относится преимущественно к краткосрочной нехватке воды или стресса (искусственная, например нет орошения почвы, и/или природная, например без осадков), например, равна или менее чем 30 дней, 20, 15, 14, 10, 9, 8, 7, 6, 5 дней или меньше, и/или к долгосрочной нехватке воды или стресса (искусственная, например нет орошения почвы, и/или природная, например без осадков), например, равна или более чем 31 день, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 дней или более.

Варианты гена 81РР2С1 или белка включают как природные, так аллельные варианты, найденные в виде 8. Ьусорег81сит, а также ортологи, найденные в других видах растений, таких как другие виды двудольных или однодольных растений.

Подробное описание изобретения

Авторы настоящего изобретения начали изучение генов, которые дифференциально выражены во множестве плодов томата, проводя анализ транскриптом (кДНК-АРЬР) опыленных завязей и СА₃ (гибберелловой кислоты), обработанных завязей (Упе/еп и др. 2008, Ыете Р11у1о1одк1 177:60-76). Один ген, который был относительно высоко экспрессирован в неопыленных завязях и менее экспрессирован в опылённых завязях, соотнося с уровнями (высокий в неопыленных завязях и низкий после опыления) АВА (абсцизовой кислоты), характеризуется дальнейшим генерированием трансгенных растений в целях изучения роли этого гена в передаче сигналов АВА. Ген томата был назван 81РР2С1 (8о1агшт Ьусорегасит РР2С1), так как он кодирует белок из 397 аминокислот, который содержит серин/треониновая фосфатаза 2С каталитический домен в С-терминальном участке примерно между приблизительно аминокислотами 84-391 (как определено 1йегРго8саи).

Было определено, что 81РР2С1 участвует в АВА индукции и что сверхэкспрессия этого гена под контролем промотора СаМУ 358 приводит к растениям, которые менее чувствительны к АВА фитогормонам, чем дикие виды растений, а растения, в которых ген был подавлен (имеющий более низкий уровень транскрипции 81РР2С1, по меньшей мере, в ткани листа, чем растения дикого типа), имеют более высокую АВА чувствительность (см. примеры). Уменьшение уровней (дикого типа) белка 81РР2С1, таким образом, повысило чувствительность АВА, подразумевая, что белок 81РР2С1 является отрицательным регулятором передачи сигналов АВА.

Удивительно, но было также обнаружено, что растения томатов, в которых уровни транскрипта 81РР2С1 были значительно снижены по сравнению с растениями дикого типа, не показали увядание вообще после 9 дней лишения воды, в то время как растения дикого типа имели увядшие листья, и сверхэкспрессивные растения 81РР2С1 показали серьезные признаки увядания. Это было тем более удивительно, так как ген 81РР2С1 и белок 81РР2С1 не имели никакой значительной идентичности последовательности с известными отрицательными регуляторами АВА, которые, как было показано, играли важную роль в засухоустойчивости в АгаЫбор818, таких как АВ11 и НАВ1, или с любым из белков группы А, см. табл. 1 ниже.

- 7 025000

Таблица 1

Идентичность последовательности белков (предположительно) ЛгаЫйор818, участвующих в передаче сигналов АВА (ЗеШесщсгНоГсг и др. 2004, выше, см. фиг. 1, группа А) и белка 81РР2С1

АгаЬк1ро515 РР2С подгруппа А	81РР2С1 белок (% идентичность последовательности)
А15§51760 (АНС1)	32.3.
А13§11410 (А1РР2СА, АНОЗ)	38.8.
А15§59220	38.6.
АН §07430 (ΑΙΡ1)	37.5.
Αΐ2§29380	39.8.
ΑΗ§17550 (ΗΑΒ2)	33.5.
ΑΙ1 §72770 (ΗΑΒ1)	32.0
А14§26080 (ΑΒΙ1)	36.0
Α(5§51760 (ΑΒΙ2)	37.6

Идентичность последовательности определяется с помощью парного выравнивания по всей длине с №ей1е (ЕшЬо88), В1о88ит 62 матрицей, пробел создания разрыва = 10, пробел расширения разрыва = 0.5.

Идентичность последовательности 81РР2С1 в АгаЫйор818 РР2С, подгруппе А, белках, таким образом, низкая. Примечательно, что нулевые мутации (Т-ДНК вставки, в которой мРНК не была обнаружена КТ-РСК) в белке, в котором обнаруживается наибольшее сходство, А12§29380, не показали изменения в АВА чувствительности в АгаЫйор818 (УокЫйа и др., 2006, Р1аи1 РЬу8ю1оду 140:115-126). Кроме того, этот ген экспрессируется в корни и стручки АгаЫйор818, а не в листья и соцветия (см. фиг. 5 Хие и др. 2008. ВМС Оеиотюк 9:550).

Тот факт, что 81РР2С1 участвует в засухоустойчивости томата, может быть использован для создания трансгенных и/или нетрансгенных растений с повышенной засухоустойчивостью и предпочтительно с желаемыми агрономическими характеристиками. Различные примеры осуществления изобретения описаны здесь ниже и в неограниченных примерах. Части, описанные здесь, применимые к трансгенным подходам, как правило, применимы и к нетрансгенным подходам и наоборот, если не указано иное.

В одном из вариантов осуществления здесь представлены трансгенные растения, в которых эндогенная экспрессия 81РР2С1 снижается или регулируется, по меньшей мере, в ткани листа, и которые являются засухоустойчивыми. В другом из случаев нетрансгенные растения, имеющие в составе один или несколько мутантных аллелей 81РР2С1 (либо в гомозиготной или гетерозиготной форме) и отличающиеся тем, что мутантный аллель(и) кодируют белок 81РР2С1, который снизил функциональность в искусственных и/или в естественных условиях по сравнению с диким типом белка или привел к отсутствию функциональности, в то время как мутация выражается в растениях (мутантных линиях или его потомстве), имеющих существенно повышенную засухоустойчивость по сравнению с растениями с отсутствием мутантного аллеля(ей) (дикие типы растений), представлены в настоящем документе. Такие нетрансгенные, засухоустойчивые растения в одном из случаев изобретения созданы с помощью ΤΙΕΕΙΝΟ подхода или Есо-ΤΙΕΕΙΝΟ, но также может быть созданы с использованием других известных методов мутагенеза в сочетании с методами разведения. Таким образом, в одном из случаев мутантный аллель 81РР2С1 индуцирован и определен людьми, используя методы мутагенеза (индуцированный мутант), а в другом случае изобретения мутантный аллель 81РР2С1 является естественным мутантом, то есть он находится в естественных популяциях растений. Индуцированные мутанты предпочтительно генерируются в культивируемой зародышевой плазме и, таким образом, непосредственно присутствуют в агрономически ценных линиях. С другой стороны, естественные мутанты, или спонтанные мутанты, или естественные варианты, или естественные аллельные варианты/вариации на основе естественной изменчивости (полиморфизма/мутаций), найденные в виде и, таким образом, вероятно, присутствуют в растительных материалах низшего агрономического качества, не культивируются в современном сельском хозяйстве, например в дикорастущих растениях. Позднее аллели должны быть переданы в культивируемые растения, имеющие хорошие агрономические характеристики, что и является одним из пунктов изобретения.

Стресс засухи или стресс дегидратации является одним из самых серьезных абиотических стрессов растений, с которым приходится бороться во всем мире. Четыре десятых сельскохозяйственных земель в мире находится в засушливых и полузасушливых регионах. Кроме того, также растения, выращиваемые в регионах с относительно высоким уровнем осадков, могут пострадать в периоды засухи в течение всего вегетационного сезона. Многие сельскохозяйственные регионы имеют низкий уровень выпадения осадков и полагаются на орошение для поддержания урожайности и качества продукции. Присвоение или повышение устойчивости культурных растений к коротким и длительным периодам засухи и снижения необходимости в воде культур, выращиваемых в орошаемом земледелии, очень важно. Растения, представленные здесь, имеют более низкую необходимость к орошению, и/или более высокий урожай, и/или

- 8 025000 более высокий процент выживаемости при выращивании в регионах с короткими или более длительными периодами засухи.

Последовательности нуклеиновых кислот и белков согласно изобретению.

В одном из вариантов осуществления изобретения предоставлены последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности 81РР2С1, а также способы выделения и определения их вариантов, например аллельных вариантов в пределах вида (8о1атшт Ьусореткюит) или в пределах рода 8о1агшт, или ортологов 81РР2С1 других видов растений, таких как другие виды овощных или полевых культур.

Белок 81РР2С1 дикого типа (полученный из сорта томата Мопеутакег) представлен в ЗЕО ГО N0: 2. Это белок из 397 аминокислот, который содержит (предполагаемый) серин/треониновая фосфатаза 2С каталитический домен с С-терминальным участком примерно между аминокислотами 84 и 391. В частности, домен содержит аминокислоты А5р-Хаа-РЬе-Ееи-11е-Ееи-А1а-8ег-А5р-С1у-Ееи-Тгр-А5р-Уа1 (где Хаа может быть любой аминокислотой, но предпочтительно С1и, см. аминокислоты 307-320 в 8ЕО ГО N0: 2). Существует также (предполагаемый) аспартат марганца/магния, связывающий участок от аминокислоты 147 до 149 (ΌΟΗ или Л^р-СК-Нк. где Акр связывает магний или марганец). Кроме того, домен, содержащий или состоящий из аминокислот от 144 до 150, т.е. СУХЭСНС (где X - это любая аминокислота, предпочтительно Υ) может быть вовлечен во взаимодействие с протеинкиназой.

Белок 81РР2С1 (включая варианты, такие как белки, кодируемые аллельными вариантами гена или ортологами гена) может быть определен по их идентичности аминокислотной последовательности в 8Е0 ГО N0: 2 по всей длине, то есть белки, имеющие идентичность последовательности по меньшей мере 47, 48, 49, 50% или более (такие как, но не ограничиваясь ими, 55, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98, 99% или более) 5>Е0 ГО N0: 2 (как определено попарным выравниванием, используя ЕтЬокк №еб1е, 62 В1ок5ит матрицу, пробел создания разрыва = 10, пробел расширения разрыва = 0.5) и имея в естественных условиях функцию, которая, по существу, аналогична 81РР2С1.

Также сюда включена потеря функции мутантов белков 81РР2С1 дикого типа (или их вариантов, как указано выше) или снижение функции мутантов дикого типа белков 81РР2С1 (или их варианты), как описано в другом месте, и растения или части растений в составе одного или нескольких нуклеотидов, кодирующих такие мутанты и повышенную засухоустойчивость по сравнению с растениями, включающими последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей белок дикого типа.

Предпочтительно белок 81РР2С1 по изобретению также включает в себя, по меньшей мере, каталитический серин/треониновая фосфатаза домен в С-терминальном участке, то есть домене, содержащем не менее 60, 70, 80, 90% или предпочтительно по меньшей мере 95, 98, 99% или более идентичности аминокислотной последовательности к аминокислотам от 84 до 391 8Е0 ГО N0: 2 (как определено попарным выравниванием, используя ЕтЬокк №еб1е, 62 В1ок5ит матрицу, пробел создания разрыва =10, пробел расширения разрыва = 0.5). В одном из вариантов осуществления белок 81РР2С1 по изобретению включает в себя последовательность А5р-Хаа-РЬе-Ееи-11е-Ееи-А1а-8ег-А5р-С1у-Ееи-Тгр-А5р-Уа1 (Хаа может быть любой аминокислотой, но предпочтительно С1и) или последовательность, которая имеет 90, или 95, или 98% или более идентичности последовательности к этой последовательности (как определено попарным выравниванием, используя ЕтЬокк №еб1е, 62 В1ок5ит матрицу, пробел создания разрыва = 10, пробел расширения разрыва = 0.5). Предпочтительно белок 81РР2С1 дополнительно содержит по меньшей мере один ЭСН фрагмент, то есть по меньшей мере одну ЭСН или СУХЭСНС последовательность (где Х - любая аминокислота, предпочтительно Υ).

Функция, которая по сути похожа на функцию 81РР2С1 относится здесь к белку с проверенной функцией чувствительности/устойчивости к стрессу засухи и/или в определении АВА чувствительности тканей растения. Растения с сверхэкспрессией 81РР2С1 или ее вариантом, по меньшей мере, в ткани листа значительно более подвержены засухе, чем дикие виды растений, и/или имеют значительно сниженную АВА чувствительность по сравнению с контрольной группой (например, с дикими видами растений и растений, трансформируемых с пустым вектором). И наоборот, растения со сниженными уровнями полностью функционального (дикого типа) белка 81РР2С1 или его варианта, по меньшей мере, в ткани листьев значительно меньше подвержены засухе, чем дикие виды растений, и/или имеют значительно большую чувствительность по сравнению АВА контрольной группой.

Таким образом, функция (предполагаемая) белка 81РР2С1 может быть проверена, используя различные известные методы, предпочтительно путем сравнения фенотипа трансформированных клеток, конститутивно выражающих белок, прошедший тестирование фенотипом 81РР2С1 сверхэкспрессирующих трансформированных клеток того же вида реципиента (и сорта) (предпочтительно включающих химерный 81РР2С1, кодирующий ген, устойчиво интегрированный в геном реципиента), что позволяет провести прямое сравнение функционального влияния на фенотип трансформированных клеткок.

Кроме того, трансформированная клетка, в которой ген 81РР2С1 (или вариант) будет приглушен или подавлен (например, мРНК 81РР2С1 значительно снижается, по меньшей мере, в ткани листа по сравнению с диким типом или контрольной трансформированной клеткой), может быть использована для определения функции. Значительное сокращение мРНК 81РР2С1 транскрипта относится к мРНК мишени, присутствующей на уровне меньше или равном 90, 80, 70, 60, 50 40, 30, 20% или меньше (10, 5

- 9 025000 или 0%) уровня транскрипта, находящегося в диком виде или контрольной трансформированной клетке (например, пустой трансформированной клетке вектора). Понятно, что в любых преобразовательных экспериментах определенная степень изменения фенотипа трансформированных клеток видна, как правило, из-за позиции воздействия на геном и/или по количеству копий. Квалифицированный специалист знает, как сравнить трансформированные клетки друг с другом, например, выбрав одно число копий событий и анализируя их фенотипы. Другие методы определения или подтверждения в естественных условиях функции гена/белка включают поколение модифицированных мутантов или мутантов со сниженной функцией или переходные исследования экспрессии. Исследования экспрессии гена промоторарепортера могут также предоставлять информацию о пространственно-временном образце экспрессии и роли белка.

Конститутивная (сверх) экспрессия гена 81РР2С1 или ген, кодирующий сам вариант, должны привести к одному или нескольким из следующих фенотипических изменений по сравнению с дикими видами растений или контрольными трансформированными клетками.

Значительно повышенная чувствительность к водному стрессу (т.е. значительно сниженная засухоустойчивость) и/или значительно сниженная АВА чувствительность.

Значительно повышенная чувствительность к водному стрессу или значительно сниженная засухоустойчивость относится к среднему, статистически значимому увеличению симптомов увядания листа множества растений, включающие 81РР2С1 аллели, по меньшей мере на 10% по сравнению с контрольными уровнями и может, например, быть проверена, как описано в примерах или эквивалентных экспериментах. Вкратце, множество (например, по меньшей мере 10, 15, 20 или более трансгенных линий) трансформированных растений и контрольных растений того же возраста (например, взрослые растения) насыщены водой в начале эксперимента и не были политы в течение длительного периода времени, например по меньшей мере около 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 дней или более, например от 3 до 4 недель и более (в зависимости от вида растения). Когда у контрольных растений появляются признаки увядания листьев (легкое увядание или умеренное увядание), все растения оцениваются на наличие признаков увядания листьев с использованием, например, визуальной оценки. Симптомы увядания листьев могут, например, измеряться в соотношении 4:1, а именно очень/сильно увядшие (4), умеренно увядшие (3), слегка увядшие (2) или не увядшие (1). Известно, что растения значительно снижают засухоустойчивость, если (в среднем) увядание увеличивается как минимум на 10%, предпочтительно по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100% по сравнению с диким видом (или пустым вектором трансформации) контрольной группы. В качестве альтернативы или в дополнение полевые испытания могут быть проведены, чтобы проверить и/или подтвердить, что не значительно сниженная засухоустойчивость видна в поле в периоды нехватки воды.

Другие тесты могут быть использованы, конечно. Например, за периодом нехватки воды может последовать период восстановления (полива), и процент выживания растений может быть оценен, см., например, Ζ1κη§ и др. (2009, Биохимические и биофизические исследовательские коммуникации 379: 986, ЬН Со1итп). Известно, что растения значительно снижают засухоустойчивость, если процент выживания снижается как минимум на 10%, предпочтительно по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100% по сравнению с диким видом (или пустым вектором трансформации) контрольной группы. См. также Хюпд и др 2006 (Р1ай РЬуяо1о§у 142: 1065-1074) и Уи и др. 2008 (ТЬе Р1ай Се11 20: 1134-1151).

Значительное снижение чувствительности АВА может быть проверено, как описано в примерах, тестируя процент прорастания семян на одной или нескольких различных концентрациях АВА и/или корневом удлинении на одной или нескольких различных концентрациях АВА. Таким образом, прорастание семян в среде, содержащей АВА, по меньшей мере на 5, 10, 20, 30, 40, 50% и более выше для 81РР2С1 сверхэкспрессии трансформированной клетки, чем в контрольной группе семян на той же концентрации АВА. Например, 1 или 3 мкМ АВА, 50% семян дикого типа прорастают, в то время как 55, 60% или более трансформированных (81РР2С1 сверхэкспрессивных) семян прорастают. Таким образом, прорастание семян сверхэкспрессивных трансформированных клеток подавляется в меньшей степени АВА. Рост корня/удлинение сверхэкспрессивных трансформированных клеток подавляется в меньшей степени АВА.

Понижающая регуляция или сайленсинг 81РР2С1 гена или ген, кодирующий вариант, должны привести к одному или нескольким из следующих фенотипических изменений по сравнению с дикими видами растений или контрольными трансформированными клетками.

Значительно сниженная чувствительность к нехватке воды (т.е. значительно усиленная засухоустойчивость) и/или значительно усиленная чувствительность АВА.

Значительно сниженная чувствительность к нехватке воды или значительно усиленная засухоустойчивость относится к среднему, статистически значимому снижению симптомов увядания листа множества растений, в которых 81РР2С1 ген подавлен или приглушён по меньшей мере на 10% по сравнению с контрольными уровнями (например, растений диких видов или пустой трансформированной клетки вектора) может, например, быть проверена, как описано в примерах или эквивалентных экспериментах. Вкратце, множество трансформированных растений (например, по меньшей мере 10, 15, 20 или более трансгенных линий) и контрольных растений того же возраста насыщены водой в начале экспери- 10 025000 мента и не были политы в течение длительного периода времени, например по меньшей мере около 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 дней или более, например от 3 до 4 недель и более (в зависимости от вида растения). Когда у контрольных растений появляются признаки увядания листьев (легкое увядание или умеренное увядание), все растения оцениваются на наличие признаков увядания листьев с использованием, например, визуальной оценки. Симптомы увядания листьев могут, например, измеряться в соотношении 4:1, а именно очень/сильно увядшие (4), умеренно увядшие (3), слегка увядшие (2) или не увядшие (1). Известно, что растения значительно усиливают засухоустойчивость, если (в среднем) увядание снижается как минимум на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100% по сравнению с контрольной группой растений. Альтернативно или в дополнение полевые испытания могут быть использованы для определения того, появляется ли значительно усиленная засухоустойчивость из-за понижающей регуляции или сайленсинга эндогенного гена(ов) 81РР2С1.

Другие тесты могут быть использованы, конечно. Например, за периодом нехватки воды может последовать период восстановления (полива), и процент выживания растений может быть оценен, см., например, Ζ1ιοη§ и др.. (2009, Биохимические и биофизические исследовательские коммуникации 379: 986, ЬН Со1итп). Известно, что растения показывают значительно усиленную засухоустойчивость, если процент выживания усиливается как минимум на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100% по сравнению с диким видом (или пустым вектором трансформации) контрольной группы. См. также Хюпд и др. 2006 (Р1ап1 Рйукю1оду 142: 1065-1074) и Уи и др. 2008 (ТЬе Р1ап1 Се11 20: 1134-1151).

Вышеуказанные тесты или эквивалентные анализы также могут быть использованы для определения растений, включающих мутантный аллель 81РР2С1 (например, с потерей функции или сниженной функции мутанта), имеющих значительно усиленную засухоустойчивость, как будет описано ниже.

Значительная усиленная чувствительность АВА может быть проверена, как описано в примерах. Таким образом, прорастание семян в среде, содержащей АВА, по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60% и более ниже для 81РР2С1 подавленной или приглушенной трансформированной клетки, чем в контрольной группе семян (например, дикого типа) на той же концентрации АВА. Например, 1 или 3 мкМ АВА, 50% семян дикого типа прорастают, в то время как 40, 35, 30% или меньше трансформированных (81РР2С1 приглушённых) семян прорастают. Таким образом, прорастание семян подавленных или приглушенных трансформированных клеток подавляется в большей степени АВА. Рост корня подавленных или приглушенных трансформированных клеток подавляется в большей степени АВА.

Точные методы могут различаться в зависимости, например, от вида растения. Тесты для определения засухоустойчивости и/или АВА чувствительности овощных видов или сельскохозяйственных культур известны в науке. Известно, что существуют альтернативные методы для оценки фенотипа. Такие методы в компетенции квалифицированного специалиста.

Приведенные выше методы могут быть использованы для проверки любых предполагаемых генов 81РР2С1, таких как аллель от диких или культивируемых растений томата или томатной линии разведения или Р1 (интродукция растений) линии или из другого вида (например, табака или других растительные видов или видов сельскохозяйственных культур), действительно 81РР2С1 вариант, который затем может быть использован для создания трансгенных и/или нетрансгенных растений, имеющих (значительно) усиленную засухоустойчивость по сравнению с подходящими контрольными группами, такими как растения дикого типа. Известно, что относительные трансгенные растения, преимущественно растения, имеющие хорошие агрономические характеристики, преобразованы и регенерированы, то есть культивируемые растения (например, высокоурожайные сорта и селекционные линии), и что наиболее подходящие контрольные группы - пустые трансформированные клетки вектора той же линии или нескольких растений нетрансформированных линий как таковых.

В дополнение в искусственных условиях активность фосфатазы может быть осуществлена для проверки активности/функциональности белка, см., например, Οοκΐί и др. 1999, Р1ап1 Се11 11: 1897-1910, Ма1епа1 апб Ме1Ьобк - РР2С АеНуШек, стр. 1907, где белок выражен в Е.соН и активность энзима проанализирована, используя ³²Р отмеченный казеин в качестве субстрата. Такие анализы активности также подходят для определения того, что конкретные виды мутантов 81РР2С1 белков (например, полученных ТШТШС подходом или другими способами, см. далее в этом документе) или химерные белки сохраняют всю или частичную функциональность. См. также ВейаисЬе и др., 1996, Еиг. 1. ВюсЬет 241: стр. 195 для оценки фосфатов и стр. 194 для экспрессии в Е.соН.

Белок 81РР2С1 имеет сниженную функцию в искусственных условиях, если доля дефосфорилирования ³²Р-казеина мутантным белком равна или менее 70% белка дикого типа (на тех же условиях анализа, например, 1 или 2 мкг белка инкубируют с ³²Р-казеином в течение 2 ч при температуре 30°С в присутствии 20 мМ ацетата магния, а также в присутствии окадаевой кислоты), предпочтительно равного или менее 60, 50, 40, 30, 20% 10% (снижение функции) или около 0% белка дикого типа (т.е. полная потеря функции). Белок, имеющий сниженную функцию в искусственных условиях, может быть использован для того, чтобы сделать вывод, что белок также имеет сниженную функцию или отсутствие функции в естественных условиях, т.е. в растении, например, по меньшей мере, в ткани листьев и/или в ткани плодов. Например, растение, имеющее в составе один (гетерозиготный) или два (гомо- 11 025000 зиготных) аллеля, кодирующих мутантный белок с сниженной функцией или отсутствием функции в искусственных условиях, приводит к растению, имеющему значительно усиленную засухоустойчивость (по сравнению с растениями с нехваткой мутантного аллеля/аллеля дикого типа) и, следовательно, также со сниженной функцией или отсутствием функции в естественных условиях. В естественных условиях сниженная функция или потеря функции белка подтверждается анализами засухоустойчивости (например, в поле или, как описано в примерах) растений гомозиготных или гетерозиготных для мутантного аллеля.

Другие предполагаемые гены/белки 81РР2С1 могут быть определены в кремнии, например, путем определения нуклеиновых кислот и белковых последовательностей в существующей нуклеиновой кислоте или базе данных белков (например, ОеиВаик, 8\У188Рго1. ТтЕМВЬ) и с использованием стандартного программного обеспечения для анализа последовательностей, таких как последовательность инструментов поиска сходства (ΒΕΑδΤΝ, ВБА8ТР, ВБА8ТХ, ТВБА8Т, РА8ТА и т.д.). Предполагаемые аминокислотные последовательности или последовательности нуклеиновых кислот, включающие или кодирующие 81РР2С1 белок (как определено выше) выбраны, клонированные или синтезированные заново и проверены на функциональность в естественных условиях, например, путем сверхэкспрессии или сайленсинга в растении-реципиенте. Следует отметить, что назначение 81РР2С1 также используется здесь для белков, которые вытекают из видов, кроме 8о1атшт Ьусорег81сит, т.е. префикс 81 же здесь не ограничивает белок какого-то конкретного вида.

Один предполагаемый ортолог томата 81РР2С1 гена и белок - белок картофеля 8ЕС ГО N0: 15 (81РР2С1), кодируемый кДНК 8ЕС ГО N0: 14 (81РР2С1). Белок 81РР2С1 имеет 89,1% аминокислотную идентичность последовательности с 81РР2С1 и 91,5% нуклеотидную идентичность последовательности с 81РР2С1 (используя ЕтЪо88-№еД1е, пробел создания = 10.0, пробел расширения = 0,5, и В1о8ит62 для белков или ΌηαΓϊιΙΙ для нуклеиновых кислот).

81РР2С1 белки согласно данному изобретению могут быть выделены из природных источников, синтезированных заново путем химического синтеза (с использованием, например, пептида синтезатора, таких как поставляемых АррБеД Вю8У81ет8) или полученных с помощью рекомбинантных клеток реципиента (например, кишечной палочки). 81РР2С1 белки согласно данному изобретению могут быть использованы для повышения моно- или поликлональных антител, которые могут быть использованы, например, для обнаружения белков 81РР2С1 в образцах тканей, таких как листья (иммунохимические методы анализа и комплекты).

В одном из вариантов осуществления сниженная функция или потеря функций мутантных белков 81РР2С1 предоставляются и растения и их части в составе одного или нескольких аллелей 81РР2С1, которые кодируют сниженную функцию или потерю функции мутантов. Любой тип мутации может привести к снижению функции или потере функции кодируемого белка, например вставки, удаления или замены одного или нескольких нуклеотидов в кДНК (8ЕС ГО N0: 1, или варианты), либо в соответствующей геномной последовательности 81РР2С1 (8ЕС ГО N0: 11, или варианты). Соответствующая геномная последовательность - это эндогенная ДНК последовательность (показанная в 8ЕС ГО N0: 11 или варианты), из которых 8ЕС ГО N0: 1 мРНК (кДНК), или вариант мРНК транскрибируется. Геномный участок дикого типа, который транскрибируется в РНК, состоит из нуклеотидов от 2591 до 5050, которые включают в себя 5' ИТК (нуклеотиды 2591-2675 8ЕС ГО N0: 11), два интрона и 3' ИТК (нуклеотиды 4976-5050 8ЕС ГО N0: 11). В искусственных условиях и/или в естественных условиях функции таких белков могут быть проверены, как описано выше. Растения, содержащие последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих такие мутантные белки со сниженной функцией или с потерей функции и усиленной засухоустойчивостью, могут быть, например, созданы с помощью ТГОЬГОО подхода или идентифицированы с помощью ЕсоТГОЬГОО подхода, как описано ниже.

В одном из вариантов осуществления изобретения (кДНК или геномные) последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих такие мутантные белки, состоят из одной или нескольких смысловых и/или несмысловых мутаций, например, переходов (замена пурина с другим пуринов (А θ С) или пиримидина с другой пиримидином (С θ Т)) или трансверсией (замена пурина с пиримидином, или наоборот (С / Т θ А / С). В одном из вариантов осуществления смысловые или несмысловые мутация(и)/в нуклеотидной последовательности, кодирующей С-терминальный участок, предпочтительно в (предполагаемом) каталитическом домене аминокислоты от 84 до 391 8ЕС ГО N0: 2 (или по существу, аналогичным доменом в варианте 81РР2С1 белка, то есть в домене, содержащем по меньшей мере не менее 80, 90, 95, 98, 99% аминокислотной идентичности этого домена). В одном из вариантов осуществления смысловые или несмысловые мутация(и)/в нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислоты 307-320 8ЕС ГО N0: 2 (или варианты). В одном из вариантов осуществления смысловые или несмысловые мутация(и)/в нуклеотидной последовательности, кодирующей предполагаемый участок связывания магния, то есть А8р-С1у-Н18 (аминокислоты 147-149 8ЕС ГО N0: 2 или ее вариант) и/или в последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих предполагаемый домен взаимодействия протеинкиназы (аминокислоты 144-150 8ЕС ГО N0: 2 или, по существу, аналогичным доменом в варианте 81РР2С1 белка.

В конкретном варианте осуществления последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих та- 12 025000 кие мутантные белки, включают одну или несколько несмысловую мутацию аминокислот О1у148, Зет171, А1а155, О1у132 из 8ЕС ГО N0: 2 (или эквивалент аминокислот в варианте 31РР2С1 белка). Также мутантные растения, семена и части растений, содержащие одну или более из вышеперечисленных несмысловых мутаций и имеющие значительно усиленную стрессоустойчивость, особенно засухоустойчивость, охватываются в этом документе.

В конкретном варианте осуществления изобретения предоставлены засухоустойчивые растения, содержащие мутанты с потерей функции или со сниженной функцией аллеля 31РР2С1, например, в которых мутантный аллель включает в себя несмысловую мутацию в нуклеотидной последовательности, кодирующей ΟνΧΌΟΗΟ (с Х-любой аминокислотой, предпочтительно Υ), или, по существу, аналогичной последовательностью (включая по меньшей мере 80, 90, 95, 98, 99% аминокислотную идентичность в этом домене), в результате чего по меньшей мере одна аминокислота заменяется, например это выражается в ΌνΧΌΟΗΟ или ΟνΧΌΟΗΌ или ΌνΧΌΟΗΌ или ΟνΧΌΌΗΟ.

Функция конкретных доменов, таких как Ν-терминальный или каталитический домен или взаимодействие домена магния и/или протеинкиназы, может быть проанализирована, удалив все или часть домена(ов) в белке 31РР2С1 или введении одной или нескольких мутаций в домене, а также анализе полученного влияния на функции белка 31РР2С1. Кроме того, растения, включающие спонтанные или индуцированные мутации (например, полученные Тиллинг подходом или определенные ЕсоТГОЬГОО подходом), могут быть проанализированы для мутации и фенотипа растения, включающего мутации, в частности засухоустойчивость.

В одном из вариантов осуществления потеря функции или сниженная функция белка 31РР2С1 - это укороченный белок, т.е. фрагмент одного из белков 31РР2С1, определенных ранее (включая варианты). В общем, ЕМЗ (этилметансульфонат) индуцирует замены гуанин/цитозин аденином/тимином. В случае глютамин (О1и или О. кодируемый нуклеотидами САА или САО) или аргинин (Арг или К, кодируемый нуклеотидами СОА) кодона замена цитозина на тимин может привести к введению в стоп-кодон в рамке считывания (например, САА/САО/СОА к ТАА/ТАО/ТОА), в результате получая укороченный белок. Укороченный белок может, например, включать аминокислоты от 1 до любой из О1п (кодируются САА или САО) или Агд аминокислот (кодируется СОА) по направлению вниз старт-кодона 8Е0 ГО N0: 2 или варианта 8ЕС ГО N0: 2. Альтернативно укороченный белок может, например, включать или состоять из аминокислот 1-5, 1-1-20, 1-28, 1-33, 1-35, 1-36, 1-40, 1-43, 1-44, 1-46, 1-48, 1-49, 1-50, 1-51, 1-54, 1-57, 166, 1-70, 1-71, 1-72, 1-73, 1-83 ЗЕС) ГО N0: 2 или 1-85, 1-88, 1-91, 1-93, 1-94, 1-97, 1-104, 1-106, 1-110, 1120, 1-130, 1-141, 1-149, 1-151, 1-160, 1-170, 1-200, 1-301, 1-302, 1-305, 1-307 или других укороченных белков 31РР2С1 (8Е0 ГО N0: 2) или варианта.

Также представлены последовательности нуклеиновых кислот (геномная ДНК, кДНК, РНК), кодирующие 31РР2С1 белки, такие как, например, 81РР2С1, представленный в 8ЕС ГО N0: 2 или их вариантах, как указано выше (в том числе химерные или гибридные белки или мутировавшие белки или укороченные белки), или в любом 31РР2С1 белке из других видов. Из-за вырождения генетический код различных последовательностей нуклеиновых кислот может кодировать ту же аминокислотную последовательность. Любая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей белок 31РР2С1 (как определено выше, в том числе в вариантах), здесь называется 31РР2С1. Представленные последовательности нуклеиновых кислот включают условные, искусственные или синтетические последовательности нуклеиновых кислот. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие 31РР2С1, представлены в 8ЕС ГО N0: 1 (кДНК последовательность из томата) и 8ЕС ГО N0: 11 (геномная ДНК из томата, кодирующая дикий вид 31РР2С1 белка). Соответствующая последовательность генома может быть выделена с помощью обычных методов, таких как РСК, с использованием специфических и вырожденных праймеров, основанных на 8ЕС ГО N0: 1 или 8ЕС ГО N0: 11.

Известно, что когда последовательности изображаются в качестве последовательности ДНК, а РНК называют, фактическая последовательность оснований молекулы РНК совпадает с той разницей, что тимин (Т) заменяет урацил (И).

Также представлены последовательности нуклеиновых кислот (геномная ДНК, кДНК, РНК), кодирующие мутировавшие белки 31РР2С1, то есть белки со сниженной функцией или потерей функции 31РР2С1, как описано выше. Например, 31РР2С1 последовательность нуклеиновых кислот состоит из одной или нескольких смысловых или несмысловых мутаций в диком типе 31РР2С1 кодирующей последовательности, передающей кодируемый белок, нефункциональный или с пониженной функцией в естественных условиях и/или в искусственных условиях. Кроме того, представлены последовательности с другими мутациями, например, сплайс-сайт мутанты, то есть мутации в геномной последовательности 31РР2С1, ведущей к аномальному сращиванию пре-мРНК и/или сдвига рамки мутации и/или вставки и/или удаления одной или более нуклеиновых кислот.

Также включены варианты и фрагменты 31РР2С1 последовательностей нуклеиновых кислот, таких как последовательности нуклеиновых кислот с гибридизацией 31РР2С1 последовательностей нуклеиновых кислот, например, в 8ЕС ГО N0: 1, в жестких условиях гибридизации, как определено. Варианты 31РР2С1 последовательностей нуклеиновых кислот также включают последовательности нуклеиновых кислот, которые имеют идентичность последовательности 8ЕС ГО N0: 1 или 8ЕС ГО N0: 11 (нуклеотиды

- 13 025000

2676-4975) по меньшей мере 50% или более, предпочтительно по меньшей мере 55, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98, 99% или более (как это определены ЕшЬо88 пссй1с. используя параметры по умолчанию, то есть пробел создания разрыва = 10, пробел расширения разрыва = 0,5, измеряемая матрица птедарйпа). Понятно, что многие методы могут быть использованы для выявления, обобщения и выделения вариантов или фрагментов 81РР2С1 последовательностей нуклеиновых кислот, такие как гибридизация нуклеиновых кислот, РСК-технологии, ίη кйсо анализ и синтез нуклеиновых кислот, и тому подобное. Варианты 8Еф ГО N0: 1 или 8Еф ГО N0: 11 (нуклеотиды 2676-4975) могут кодировать либо дикий вид функциональных 81РР2С11 белков (например, аллелей другого видового разнообразия томата или селекционных линий или диких присоединений или ортологов из других видов, чем томаты), или они могут кодировать мутантные аллели со сниженной функцией или с потерей функции любого из них, как, например, подготовленных или определенных методами, такими как ТГОЫЫО подход или ЕсоТГОЬГОО подход или другими способами.

Фрагменты включают части любых из вышеперечисленных 81РР2С1 последовательностей нуклеиновых кислот (или вариантов), которые могут, например, использоваться в качестве праймеров, или образцов, или конструкций подавления активности гена. Части могут быть смежными участками по меньшей мере около 10, 15, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 50, 60, 100, 200, 300, 450, 500, 600, 700, 800, 900, или более нуклеотидов в длину, либо кодирующей нити (смысловой нити) или комплементарной нити (антисмысловой нити). Таким образом, включены фрагменты 81РР2С1 последовательностей нуклеиновых кислот, в результате чего фрагмент по меньшей мере около 20, 30, 40, 50, 60, 100, 150, 200 300, 450, 500, 600, 700, 800, 900 нуклеотидов в длину составляет не менее 50, 60, 70, 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80, 90, 95, 98, 99% или более (100%) идентичности последовательности нуклеиновых кислот в другом фрагменте 81РР2С1 последовательности нуклеиновых кислот примерно такой же длины (как определено попарным выравниванием, используя ЕтЬо88 пссй1с, параметры по умолчанию, то есть пробел создания разрыва = 10, пробел расширения разрыва = 0,5, измеряемая матрица пгедарйпа).

Пары праймеров, которые могут быть использованы для РСК-амплификации 81РР2С1 транскриптов (мРНК или соответствующей кДНК) из растительных образцов ДНК тканей, например, представлены в 8Еф ГО N0: 3 и 4 и в паре праймеров 8Еф ГО N0: 9 и 10. Такие пары праймеров могут быть использованы для выявления и количественной оценки 81РР2С1 экспрессии в растительных тканях, например, в ткани листа томата. Точно так же другие специфические или вырожденные праймеры могут быть разработаны на основе 8Еф ГО N0: 1 или 8Еф ГО N0: 11 (нуклеотиды 2676-4975) и используется для усиления вариантов аллелей 81РР2С1 от других линий томата или от других видов.

После того как конкретный мутантный аллель 81РР2С1 был сформирован и/или определен (например, путем Тиллинг или ЕсоТГОЬЕНО подходов), а также праймеров или образцов, специфичных для мутантного аллеля, может быть разработан, и также анализ может быть разработан, который обнаруживает присутствие и/или отсутствие мутантного аллеля в растении или части растения (с использованием аллеля конкретных анализов обнаружения). Молекулярные маркерные анализы для обнаружения и/или передачи (например, с помощью МА8, вспомогательной маркерной селекции) мутантного аллеля, могут получить развитие. Например, анализ 8№ обнаружения или СЛР8 маркер может быть разработан, который определяет наличие мутанта 81РР2С1 нуклеиновой кислоты в ДНК растений и/или который может быть использован для передачи аллеля в другие растения.

В одном из вариантов осуществления представлен мутант последовательности нуклеиновых кислот, согласно которому 81РР2С1 последовательность нуклеиновой кислоты состоит из одной или нескольких мутаций, приводящих либо к потере функции или снижению функции мутанта белка 81РР2С1. Этот аспект изобретения будет описан более подробно далее.

Растения также могут быть определены или получены (например, с помощью гомологичной рекомбинации или вставки, удаления или замены одного или нескольких нуклеотидов и т.д.), которые имеют одну или несколько мутаций в 81РР2С1 регуляторном участке(ах), например промоторе, в котором экспрессия генов 81РР2С1, то есть уровни мРНК (8Еф ГО N0: 1 или варианты),значительно сокращается в растении по сравнению с диким типом и растение имеет значительно усиленную засухоустойчивость.

Последовательности нуклеиновой кислоты, описанной выше, или их фрагменты, в частности последовательности ДНК, кодирующие белки 81РР2С1 этого изобретения (или их варианты) могут быть вставлены в векторы экспрессии (в подавляющих подходах) или в векторы, подавляющие активность генов засухоустойчивых растений.

В одном из вариантов осуществления изобретения экспрессия 81РР2С1 гена подавлена в клеткереципиенте, растении или конкретной ткани(ях), например КИА! подходами, как это описано далее.

В другом варианте осуществления представлены растения, содержащие один или более мутантных аллелей 81РР2С1, в которых мутация(и) дает усиленную засухоустойчивость в растениях по сравнению с растениями с нехваткой мутантного аллеля(ей). Мутантные аллели предпочтительно порождены мутагенезом растений и семян, а также выявлением тех растений и семян, которые содержат одну или несколько мутаций в РР2С1 мишени аллеле(ях) и в которых мутация приводит к отмене транскрипции или трансляции (чтобы белок 81РР2С1 не производился), или в трансляции сниженной функции или потери функции белка 81РР2С1. Снижение функционального дикого типа белка 81РР2С1, по меньшей мере, в

- 14 025000 ткани листа дает усиленную засухоустойчивость в растении, части растения или семени.

В другом варианте осуществления предоставлены РСК праймеры и/или образцы и комплекты для обнаружения ДНК последовательности 81РР2С1. Вырожденные или РСК пары праймеров для амплификации ДНК 81РР2С1 из образцов могут быть синтезированы на основе 8ЕЦ ГО N0: 1 или §ЕЦ ГО N0: 11 (например, основанной на нуклеотидах 2676-4975 или 2591-5050), как известно, в науке (см. О|еГГепЬаск и ЭуеЫег (1995) РСК праймер: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬогайгу Ргевв, и МсРЬегвоп а1 а1. (2000) РСК-Ва51св: Ргот Васкдгоипй Ю Вепск, ΡίΓβΐ Еййоп, Зрппдег Уег1ад, Оегтапу). Кроме того, фрагменты ДНК §ЕЦ ГО N0: 1 или §ЕЦ ГО N0: 11 (или их варианты) могут быть использованы в качестве образцов гибридизации. 81РР2С1 комплект обнаружения может состоять либо из 81РР2С1 специфических праймеров и/или 81РР2С1 образцов, и связан протоколом при использовании праймеров и образцов для обнаружения 81РР2С1 ДНК в исследуемой пробе. Такой комплект обнаружения может, например, быть использован для определения того, было ли растение преобразовано с помощью гена 81РР2С1 (или его части) изобретения или включает в себя одну или несколько мутантных аллелей 81РР2С1. Из-за вырождения генетического кода некоторые аминокислоты кодонов могут быть заменены другими без изменения аминокислотной последовательности белка.

В другом варианте осуществления предоставлены антитела, которые специфически связываются с белком 81РР2С1 или мутантным белком 81РР2С1 согласно изобретению. В частности, моноклональные или поликлональные антитела, которые связываются с 81РР2С1 или фрагментами или их вариантами (например, мутантные белки), описаны в этом документе. Антитела могут быть получены с помощью 81РР2С1 белка согласно изобретению в качестве антигена животных с использованием методов, известных в науке, как, например, описанные в Наг1о\у апй Ьапе Ивтд АпЬЬойев: А 1аЬога1огу тапиа1 ДОет Уогк: Со1й 8ргшд НагЬог Ргевв 1998) и в Ыййе11 апй Сгуег А Ргасйса1 Ошйе Ю Мопос1опа1 АпЬЬойев (^УНеу апй 8опв, 1991). Антитела могут быть впоследствии использованы для выделения, идентификации, определения свойств или очищения белка 81РР2С1, с которым он связывается, например, для обнаружения белка 81РР2С1 в исследуемой пробе, что позволяет формировать иммунокомплексы и обнаруживать присутствие иммунокомплексов, например, путем ЕЬ1§А (иммуноферментного твердофазного анализа) или анализа иммуноблота. Кроме того, предоставлены иммунологические комплекты, полезные для определения белков 81РР2С1, белковых фрагментов или эпитопов в исследуемой пробе. Исследуемыми пробами могут быть клетки, клеточные супернатанты, суспензии клеток, тканей и т.д. Такой комплект включает в себя, по меньшей мере, антитело, которое специфически связывается с белком 81РР2С1 и один или более реагентов иммунодетекции. Антитела могут также быть использованы для выделения/ выявления других белков 81РР2С1, например, с помощью ЕЬ1§А или ХУеЧегп Ь1ойш§.

Понятно, что многие методы могут быть использованы для выявления, обобщения и выделения вариантов или фрагментов 81РР2С1 последовательностей нуклеиновых кислот, такие как гибридизация нуклеиновых кислот, РСК-технологии, ш вШсо анализ и синтез нуклеиновых кислот и тому подобное. Таким образом, последовательность кодирования 81РР2С1 белка нуклеиновой кислоты может быть последовательностью, которая химически синтезирована или которая клонирована из любых видов растений.

Трансгенные засухоустойчивые растения.

Здесь представлены трансгенные растения, семена и части растений, в которых 81РР2С1 приглушен предпочтительно, по меньшей мере, в ткани листа или воздушных тканях, которые имеют усиленную засухоустойчивость по сравнению с диким типом (нетрансгенных) контрольных растений или других контрольных групп (например, пустых трансформированных клеток вектора).

В одном из вариантов осуществления изобретения гомологичная или гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты используется для приглушения эндогенного 81РР2С1 гена(ов) видареципиента, который должен быть преобразован. Например, 81РР2С1 ген картофеля, такой как 81РР2С1 8Е0 ГО N0: 14 (или вариант или его фрагмент) может быть использован, чтобы приглушить 81РР2С1 экспрессию гена в трансгенных растениях томата или баклажана. Альтернативно, гомологичная 81РР2С1 последовательность нуклеиновой кислоты может быть использована. Например, последовательность происходящих из конкретных видов растений (например, из томатов) будет восстановлена в указанных видах (томата). Таким образом, в одном из вариантов осуществления ДНК 81РР2С1 соответствует или является модификацией/вариантом эндогенной 81РР2С1 ДНК видов, которые используются в качестве рецептивных видов в трансформации. Таким образом, 81РР2С1 кДНК томата или геномная ДНК (или вариант или её фрагмент) предпочтительно используется для трансформации растений томата. Кроме того (для регуляторного одобрения и общественного принятия причин), гомологичная или гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот может быть функционально связана с транскрипцией регуляторной последовательности, особенно промотора, который также происходит от вида растения или даже из того же растения, которое будет трансформировано.

Для создания растений, содержащих химерный ген, который в результате приводит к приглушению экспрессии эндогенного гена или генов семейства 81РР2С1, могут быть использованы методы, известные в науке.

Сайленсинг генов относится к понижающей регуляции или полному подавлению экспрессии ге- 15 025000 нов одного или нескольких генов-мишеней, например 81РР2С1 генов в клетке-реципиенте или ткани. Понятно, что в любых преобразовательных экспериментах определенная степень изменения фенотипа трансформированных клеток видна, как правило, из-за позиции воздействия на геном и/или по количеству копий. Как правило, слабый и сильный сайленсинг генов растений отличается (все из которых являются вариантами осуществления изобретения), в котором слабый сайленсинг гена (РНКинтерференция) относится к растениям или части растений, в которых эндогенная экспрессия генамишени снижается примерно на 15, 20 или 30% по сравнению с контрольной тканью, и сильный сайленсинг генов (РНК-интерференция) относится к растениям или части растений, в которых ген эндогенной экспрессии гена-мишени снижен не менее чем на 50, 60, 70, 80, 90% или более по сравнению с контрольной тканью (например, диким типом). Сайленсинг может быть определен количественно, например, подсчитывая уровень транскрипта гена-мишени (например, с помощью количественного КТ-РСК) и/или определяя и выборочно подсчитывая энзимную активность 81РР2С1 белка-мишени и/или оценивая и выборочно подсчитывая полученный фенотип (усиленная засухоустойчивость и/или усиленная чувствительность АВА).

Не ограничивая масштабы изобретения растения, имеющие оптимальный уровень сайленсинга, могут быть выбраны так, чтобы в результате имеют значительно усиленную засухоустойчивость в климатических условиях, которым они подвергаются в этой области, имея минимальные отрицательные побочные эффекты, такие как снижение урожайности, уменьшение количества фруктов и т.д., по сравнению с контрольной группой. Предпочтительно выживание и/или урожайность увеличиваются в засухоустойчивых растениях.

Применение ингибиторных РНК для сокращения или упразднения экспрессии генов хорошо известно в науке и является предметом нескольких рецензий (например, Ваи1сотЬе 1996, Р1ан( Се11 8(2): 179-188; Эерюкег апб Уап Мойади, 1997, Сигг Ορίη Се11 Вю1. 9(3): 373-82). Есть целый ряд доступных технологий для достижения сайленсинга генов в растениях, таких как химерные гены, которые производят антисмысловую РНК во всех или части гена-мишени (см., например, ЕР 0140308 В1, ЕР 0240208 В1 и ЕР 0223399 В1), которые производят чувствительную РНК гена-мишени (также известную как совместное подавление), см. ЕР 0465572 В1.

Наиболее успешным подходом до сих пор является производство как смысловых, так и антисмысловых РНК гена-мишени (инвертированные повторы), который является двухцепочной РНК (бкРНК) или стволовым циклом структуры (петля РНК, ЬρКNА) в клетке и приглушает ген-мишень(и) при транскрипции из вышестоящего промотора. Методы и векторы бкРНК и ЬρКNА производства и сайленсинга генов были описаны в ЕР 1068311, ЕР 983370 А1, ЕР 1042462 А1, ЕР 1071762 А1 и ЕР 1080208 А1.

Химерный ген для трансформации растений может, таким образом, включать транскрипцию регуляторного участка, который активен в клетках растений, функционально связанных со смысловым и/или антисмысловым фрагментом ДНК (или полной последовательностью нуклеиновой кислоты), или комплиментарного или, по существу, аналогичного §ЬРР2С1 гена-мишени или семейства генов.

Обычно короткие (смысловые и антисмысловые) фрагменты секвенирования последовательности гена-мишени, такие как 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 нуклеотиды, кодирующие и/или не кодирующие последовательности гена-мишени, достаточны. Более длинные последовательности также могут быть использованы, например, по меньшей мере около 50, 100, 200, 250, 500, 1000 или более нуклеотидов. Даже с ДНК, соответствующими или комплиментарными, полный транскрипт РНК или мРНК может быть использован, чтобы создать смысловые и/или антисмысловые конструкции. Желательно, чтобы смысловые и антисмысловые фрагменты/последовательностей были разделены спейсером последовательности, такие как интрон, который образует петлю (или шпильку) на формирование бкРНК.

В принципе, любой ген или ген 81РР2С1 семейства может стать мишенью. Например, одна или несколько определенных аллелей 81РР2С1 может быть приглушена выбором участка нуклеиновой кислоты их первичных или мРНК транскриптов, специфичных для этих аллелей (см. Вуζονа и др. Р1ай 2004 218: 379-387 для специфического сайленсинга аллелей органичным определенным образом). Кроме того, всё семейство гена может стать мишенью для сайленсинга, выбрав один или более закрепленных участков для создания конструкта сайленсинга. Как упоминалось выше, участок ДНК, используемый в смысловой и/или антисмысловой ориентации, не должен быть частью кодирующего участка, но также может соответствовать или дополнять части первичного транскрипта (включая 5' и 3' нетранслируемые последовательности и интроны, как показано на 2591-5050 нуклеотидах §ЕЦ ГО ΝΟ: 11) в частях мРНК (где любые интроны были удалены и полиА окончание было добавлено). Известно, что в последовательности ДНК, которая соответствует последовательности РНК, υ заменяется на Т. Также отмечено, что в химерном гене, который преобразовывает бкРНК или йрКЫА мишени, способном к сайленсингу 81РР2С1 экспрессии генов, на транскрипцию в клетке-реципиенте, смысловые и антисмысловые участки не должны быть одинаковой длины и один участок может быть больше, чем другие.

Так, например 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1 или их варианты, как описано выше, или фрагменты любого из них, или геномная последовательность, или первичная последовательность транскрипта 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1 (как показано в §ЕЦ ГО ΝΟ: 11 из нуклеотидов от 2591 до 5050), могут быть использованы для создания 81РР2С1 сайленсинга гена, и вектора, и трансгенного растения, в которых один или несколько генов

- 16 025000

З1РР2С1 приглушены во всех или некоторых тканях или органах, или по индукции (см., например, ΧνίοΙοροΓΚα и др. Р1ап1 Βίοίοαίιηοΐ 1. 2005 6:583-90). Удобный способ создания шпильки конструкта заключается в использовании общих векторов, таких как ρΗΆΝΝΙΒΆΒ, рНЕЬЬЗОАТЕ, рЗТЛКОАТЕ векторы на основе технологии Оа1е\уау® (см. νβδίβγ и др. 2004, ΜβίΗοάδ Μο1 Βίο1. 265:117-30; νβδίβγ и др..

2003, ΜβΐΗοάδ Μο1 Βίο1. 236:273-86 и НеШ^еН & νΗ^ιΊοι.^ 2003, ΜβίΗοάδ 30(4):289-95.), здесь в качестве ссылки. См. также 1шр://\у\у\урйс81го.аи/гпа1/ других генных сайленсингов векторов, таких как индуцируемый сайленсинг векторов и векторы для сайленсинга из нескольких генов-мишеней и программы Μαΐο№οίηΐ, которая может быть использована, чтобы найти лучшую последовательность, чтобы использовать для сайленсинга гена-мишени.

При выборе консервативных последовательностей нуклеиновых кислот все З1РР2С1 генные представители семейства в растении-реципиенте могут быть приглушены. Сайленсинг всех представителей семейства растения-реципиента является конкретным вариантом осуществления.

В одном из вариантов осуществления промотор, который функционально связан со смысловой и/или антисмысловой нуклеиновой кислотой (чтобы создать химерный сайленсинг/РНК-интерференции генов), выбирается из конститутивного промотора, индуцируемый промотор (например, стресс индуцируемый, индуцируемый светом, химически индуцируемый и т.д.), индуцируемый промотор гормона (например, этилен или АВА индуцируемый и т.д.) конкретный листовой промотор или промотор, активный в воздушных тканях. Также промоторы с ранней реактивной дегидратацией, такие как ΚΌ2, описаны в настоящем документе, а также другие стресс-индуцируемые промоторы, такие как ΡΌ29 (УатадисЫЗ1шк^ак1 и З11ик^а1й 1993 г, Μο1 Оеп Оепе! 236: 331-340).

В некоторых вариантах осуществления конкретные плоды промотора могут быть подходящими. Кроме того, промотор З1РР2С гена сам по себе может быть использован для подходов сайленсинга. Промотор с томатом состоит в ЗЕЦ ГО N0: 11 из нуклеотидов 1-2675, в частности включает в себя промотор либо состоит из около 2000 нуклеотидов перед АТО трансляцией старт-кодона на позиции 2676-2679 ЗЕО ГО N0: 11) или функциональные фрагменты (например, 1500Ьр, 1000Ьр или меньшего увеличения АТО). Дополнительно 3' ИТК может быть функционально связан с 3'' терминальным химерным геном, так что функционально взаимосвязанные элементы ДНК, включают промотор -З1РР2С1 ΚNЛ^ ген 3'ИТК.

Предпочтительные конститутивные промоторы включают в себя сильные конститутивные 35З промоторы или усиленные 35З промоторы (35З промоторы) мозаичного вируса цветной капусты (ίΆΜΥ) изолированных СΜ 1841 (Гарднер и др, 1981, Исследование нуклеиновых кислот, 2871-2887), СаЬЬВ-З (Франк и др., 1980, Се11 21, 285-294) и СаЬЬВ-С0 (Ни11 и Ηο^11, 1987, Вирусология 86, 482493), 35З промотор, описанный 0йе11 и др. (1985, №йиге 313, 810-812) или в ИЗ 5164316, промоторах из семейства убиквитина (например, убиквитин промотор СНпйепкеп кукурузы и др., 1992, Р1ап1 Μο1. Βίο1. 18, 675-689, ЕР 0342926, см. также Ссте^ и др. 1993, Р1ап1 Μο1.Βΐο1. 23, 567-581), §ο§2 промотор (йе Ра1ег и др., 1992 Р1ап1 I 2, 834-844), ети промотор (Ьа81 и др., 1990, Инют Аррд. ОепеР 81, 581-588), АгаЫάορδίδ промотор актина, такой как промотор, описанный Ап и др. (1996, Р1ап1 I 10, 107), рисовые промоторы актина, такие как промотор, описанный Ζΐκπίβ и др. (1991, Р1ап1 Се11 3, 1155-1165) и промотор, описанный в ИЗ 5641876, или рисовый промотор 2 актина, как описано в ν0 070067, промоторы мозаичного венозного вируса маниоки (ν0 97/48819, Уегйадиег и др. 1998, Р1ап1 Μο1. Βίο1. 37,1055-1067), рРЬЕХ виды промоторов из подземного останавливающего развитие вируса клевера (ν0 96/06932, в частности промотор З7), промотор алкогольдегидрогеназы, например рАйН1З (регистрационные номера ОеηΒаηк Х04049, Х00581), а ТК1' промотор и ТК2' промотор (ТК1' промотор и ТК2'промотор соответственно), которые управляют экспрессией 1' и 2' гена, соответственно, Т-ДНК (Фельтен и др., 1984, ЕΜΒ0 I 3, 2723-2730), промотор мозаичного вируса норичника, описанного в ИЗ 6051753 и ЕР 426641, промоторы генов гистонов, таких как РН4а748 промотор из Л^аЬ^йορ8^8 (ΤΜΒ 8: 179-191), или другие.

Альтернативно, может быть использован промотор, который не является конститутивным, а специфичным для одной или нескольких тканей и органов растений (ткань предпочтительная/ткань специфичная, в том числе промоторы, регулируемые развитием). Например, промотор, активный в ткани листьев, или надземных частях растений, или эпидермисе специфичных промоторов, или охраняющих специфичных клеточных промоторах, может быть использован.

Эпидермальные специфичные промоторы, такие как, например, Л^аЬ^йορ8^8 ЬТР1 промотор (Т1юта и др., 1994 г., Р1ап1 РЬу8ю1. 105(1):35-45.), СЕК1 промотор (Аай8 и др. 1995. Р1ап1 Се11. 7:2115-27) и СЕК6 промотор (ΗοοΙ^Γ и др. 2002, Р1ап1 Р1гу8ю1 129:1568-80.) и ортологичные томаты ЬеСЕК6 (Υοββ и др.,

2004, I Ехр Βοΐ. 55: 1401-10), обеспечивают специфичную экспрессию в наземной эпидермальной поверхности.

Также подходят листовые или фотосинтетические ткани специфичных промоторов, таких как светиндуцируемая рибулоза 1,5-бисфосфата карбоксилазы, небольшой промотор субъединицы (Р88и) из АгаЬ^йορ8^8, как описано в ИЗ 5034322, или подсолнечнике, или горохе (США 5254799), или в Ζеа Μау8; промотор картофеля ЗТ-ЬЗ1, который является специфичным стволовым или листовым (ЗГОскНащ и др. 1987, Исследование нуклеиновых кислот 15 (8): 3479-91); промотор хлорофилла а/Ь белка (СЛΒ).

Могут быть использованы замыкающая клетка-специфичный промотор, такой как ЭОР1 промотор

- 17 025000 (Ы и др, δα СЫпа С ЫГе δα. 2005 48 (2): 181-6), или засухоустойчивые индуцируемые промоторы, как КО29 (Υ;-ιιη;·ΐβΐκ:1ιί-δ1ιίηοζ;·ι1<ί и δΙιίηοζαΚί 1993, см. выше), которые являются активными практически во всех органах и тканях вегетативных растений во время нехватки воды.

Квалифицированный специалист может легко проверить различные промоторы на их специфику и целесообразность в методике согласно данному изобретению. Кроме того, специфика промотора может быть изменена путем удаления, добавления или замены части промотора. Такое изменение промоторов может быть функционально связано с геном-репортером, чтобы проверить их пространственновременной активность в трансгенных растениях.

Другая альтернатива - использование промотора, экспрессия которого индуцируема. Примеры индуцируемых промоторов - химически индуцируемые промоторы, такие как дексаметазон, как описано Аоуата и СНиа (1997, Р1ап£ 1оигпа1 11: 605-612) и в υδ 6063985, или тетрациклин (ТОРРКЕЕ или ТОР 10 промотор, см. ОаЮ, 1997, Аппи Кеу. Р1ап£ Рйу81о1 Р1ап£ Мо1 Βίο1. 48: 89-108 и Ьоуе и др. 2000, Р1ап£ 1. 21: 579-88). Другие индуцируемые промоторы - это, например, индуцируемые при изменении температуры, например промотор теплового шока, описаны в υδ 5447 858, в анаэробных условиях (например, промотор кукурузы ΑΌΗ1δ), света (υδ 6455760), патогенных микроорганизмов (например, ЕР 759085 или ЕР 309862) или старения (δΑΟ12 и δΑΟ13, см. υδ 5689042) или засухи (см. выше). Очевидно, что существует целый ряд других доступных промоторов. Примеры других индуцируемых промоторов - АбН1 промотор, который является индуцируемым гипоксией или холодньм стрессом, Нзр70 промотор, которого является индуцируемым тепловым стрессом, и промотор РРЭК, индуцируемый светом. Одним из предпочтительных промоторов - этанол-индуцируемый промотор системы, как описано в АН-аП и др. (2001, Р1ап£ В1о1есНпо1оду 1оигиа1 1, 337-343), где лечение этанолом активизирует АЕСК, который, в свою очередь, индуцирует экспрессию ;·ι1::35δ промотора. См. Также Эеуеаих и др. (2003, ТНе еШапо1 8\уПсН: а Юо1 £ог б88ие-8рес1Йс депе тбисОоп бигтд р1ап£ беуе1ортеп£ Р1ап£ 1. 36, 918-930).

При необходимости, иромотор^1РР2С1 ΡΝΛί гена может дополнительно содержать 3'терминальную регуляцию транскрипции сигналов (3'терминальная или 3'иТК) (т.е. формирование транскрипта и сигналы полиаденилирования). Сигналы полиаденилирования и транскрипта образования сигналов включают иораПие ген синтазы (3' поз) (Эерюкег и и др., 1982 1. Мо1ес. Арр1. Оепейсз 1, 561573.), октопин ген синтазы (3'осз) (О1е1еп и др., 1984, ЕМВО 1. 3, 835-845) и Т-ДНК ген 7 (3' ген 7) (УеНеп апб δсНе11, 1985, №с1ею Аабз КезеагсН 13, 6981-6998), которые действуют как 3нетранслируемая последовательность ДНК в трансформированных клетках растений и т.д.

Химерный ген δ1РР2С1 сайленсинга (например, промотор, функционально связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая при транскрипции в растительной клетке способна к сайленсингу эндогенной δ1РР2С1 экспрессии генов) может быть включен в обычным образом в ядерном геноме одной клетки растения, и так трансформированная растительная клетка может быть использована обычным способом для получения трансформированного растения, которое имеет измененный фенотип из-за δ1РР2С1 сайленсинга в определенных клетках в определенное время. В этой связи Т-ДНК вектор, включающий промотор, функционально связан со смысловой и/или антисмысловой δ1РР2С1 последовательностью (и, возможно 3'иТК), может быть введен в АдгоЪас1егшт ЮтеГааепз и использован для трансформации растительных клеток, а затем трансформированное растение может быть восстановлено из трансформированных клеток растений с использованием процедур, описанных, например, в ЕР 0116718, ЕР 0270822, РСТ публикации \УО 84/02913 и опубликовано в заявке на европейский патент ЕР 0242246 и в Оои1б и др. (1991, Р1ап1 РНу8ю1. 95,426-434). Конструкция Т-ДНК вектора для АдгоЪас1ег1ит, опосредованной растительной трансформацией, хорошо известна в науке. Т-ДНК вектор может быть либо бинарным вектором, как это описано в ЕР 0120561 и ЕР 0120515 или совместно интегрированным вектором, который можно интегрировать в АдгоЪас1ег1ит ТКплазмиду гомологичной рекомбинации, как описано в ЕР 0116718.

Предпочтительные Т-ДНК векторы содержат промотор, функционально связанный с δ1РР2С1 сайленсингом генов между Т-ДНК пограничной последовательности, или, по меньшей мере, расположен слева от правой пограничной последовательности. Пограничная последовательность описана в С1е1еп и др (1984, ЕМВО 1. 3,835-845). Конечно, другие виды векторов могут быть использованы для трансформации растительной клетки, используя процедуры, такие как прямой перенос генов (как это описано, например, в ЕР 0223247), опосредованная пыльцой трансформация (как это описано, например, в ЕР 0270356 и \УО 85/01856), трансформация протопластов, как, например, описанный в υδ 4684611, растительный РНК вирус-опосредованной трансформации (как это описано, например, в ЕР 0067553 и υδ 4407 956), липосомо-опосредованной трансформации (как описано, например, в υδ 4536 475), и другие методы, такие как методы, описанные для трансформации некоторых линий кукурузы (например, υδ 6140 553, Фромм и др., 1990, Вю/ТесНпо1оду 8, 833-839; Оогбоп-Катт и др., 1990, Р1ап1 Се11 2, 603-618) и риса (ЗЫтатоФ и др., 1989, №йиге 338, 274-276; ЭаНа и др. 1990, Вю/ТесНпо1оду 8, 736-740) и метод трансформации однодольных (РСТ публикация \УО 92/09696). Для трансформации хлопка см. также \УО 00/71733, и для трансформации риса см. также способы, описанные в \УО 92/09696, \УО 94/00977 и \УО 95/06722. Для трансформации сорго см., например, 1еоипд ЕМ. и др. 2002, Негебйаз 137: 20-8 или 2Нао Ζ.Υ. и др. 2000, Р1ап1 Мо1. Вю1. 44:789-98). Для трансформации томата или табака см. также Ап О. и др.,

- 18 025000

1986, Р1ай РЬуяок 81: 301-305; НогвсЬ КВ. и др., 1988, в Р1ай Мо1еси1аг Вю1оду Мапиа1 А5, ОогбгесЫ, №Шег1апбв, К1и\\ег Асабетю РиЪЬвЬегв, стр. 1-9; КоогппееГ М. и др., 1986, в: №νίηδ Ό.Ρ апб КА. 1опев, ебв. ТотаЮ Вю1есЬпо1оду, Ыете Уогк, ΝΥ, И8А, А1ап К. Ывв, 1пс. стр. 169-178). Для трансформации картофеля см., например, 8Ьегтап и Веνаη (1988, Р1ап1 Се11 Кер. 7: 13-16). Трансформация томатов и регенерация может осуществляться по Ое 1опд и др. (2008) Р1ап11оигпа1 57:160-170 и 8ип и др. (2006) Р1ап1 Се11 РЬуяок 47: 426-431.

Кроме того, селекция и регенерация трансформированных растений из трансформированных клеток хорошо известны в науке. Очевидно, что для разных видов и даже разных сортов или сортов одного вида протоколы специально приспособлены для регенерации трансформированных клеток на высоких частотах.

Кроме того, трансформация ядерного генома, а также трансформация пластидного генома, предпочтительно генома хлоропластов, включены в изобретение. Одно из преимуществ пластидной трансформации генома в том, что риск распространения трансгена(ов) может быть уменьшен. Пластидная трансформация генома может быть осуществлена, как известно, в науке, см., например, 81бого\' УА и др. 1999, Р1апС I 19: 209-216 или 1.Ш/ К.А. и др. 2004, Р1апС I 37(6):906-13.

Любое растение может быть подходящим реципиентом, например однодольные или двудольные растения, но наиболее предпочтительны растения, которые выиграют от того, что являются засухоустойчивыми, такие как, но не ограничиваясь ими, томат, перец, огурец, баклажан салат-латук, артишок, лукпорей, дыня, арбуз, морковь, Вгаввюа (В. о1егасеа, В. парив, В. |ипсеа), лук, салат ягненка, артишок, картофель, шпинат, виноград, горох, фасоль, соя и многие другие.

Предпочтительны реципиенты из семейства пасленовые, например, виды рода 8о1агшт, например, томат (8. Ьусорег81сит), томатное дерево (8. Ъе1асеит, син. СурЬотапбга Ъе1асеае) и другие виды 8о1агшт, такие как баклажан/бадриджан (8о1агшт те1опдепа), картофель (8о1агшт ШЪеговит), пепино (8. типсаОнп), кокона (8. веввШЯогит) и наранхилла (8. дибоепве). Семейство пасленовые также включает перцы (Сарвюит аппиит, Сарвюит РгШевсепв).

В предпочтительном варианте осуществления реципиент - семейство 8о1апасеае. В более предпочтительном варианте осуществления реципиент - вид 8. 1усорегвюит. Желательно, чтобы реципиент культивируемый томат вида 8. 1усорегв1сит, то есть линия или разнообразие, приносящее высокие урожаи, такие как плоды по меньшей мере 50 г среднего веса или более, например по меньшей мере 80, 90, 100, 200, 300 г или даже до 600 г (томаты мясистого типа). Кроме того, маленькие виды, такие как томаты черри или коктейльные томаты, охватываются, как и наполненные мякотью томаты, такие как пикете разнообразие Шепве, например, с нехваткой геля в семенной камере. Растение-реципиент томата может быть определено или не определено различными размерами и формами плодов, такими как тип Кота, тип гроздь, круглый тип. Это может быть переработанный тип томата или свежий рыночный тип. Также оба, как открытоопыляющиеся растения, так и гибриды, охватываются здесь. В одном из вариантов осуществления засухоустойчивое растение томата - это гибрид Р1 растения, выращенного из гибридных семян Р1. Для того чтобы создать Р1 гибридные семена трансгенного растения согласно данному изобретению, две инбредные родительские линии могут быть созданы, каждая из которых содержит копии трансгена в геноме. Когда эти растения перекрестно опылялись, Р1 семена были собраны, они производят трансгенные Р1 гибридные растения с высокой урожайностью и засухоустойчивостью из-за трансгена.

Варианты, описанные для реципиента растения, также относятся к нетрансгенным мутантным растениям, описанным здесь, в которых вместо трансгенов мутантный аллель 81РР2С1 присутствует эндогенно.

Другие подходящие реципиенты - другие виды овощей и различные виды сочных фруктов (виноград, персики, сливы, клубника, манго, папайя и др.). Также СисигЪЬасеае, например, дыня (СЬги11ив 1апа1ив, Сисит1в Ме1о) и огурцы (Сисит1в ваШив), и тыквы, и кабачки (СисигЪЬа) - подходящие реципиенты. Точно также Ковасеае - подходящие реципиенты, таких как яблоки, груши, сливы и т.д.

Также полевые культуры с повышенной засухоустойчивостью представлены согласно данному изобретению. Например, маис/кукуруза (виды 2еа, например, Ζ. таув, Ζ. б1р1орегептв (скари1е), Ζеа 1ихипапв (Оиа1ета1ап 1еов1Ше), Ζеа таув виЪвр. 1ше1ше1епапдепв1в (8ап Атошо Ншв1а 1еов1Ше), Ζ. таув виЪвр. техюапа (Мехюап ЮовтЮ), Ζ. таув виЪвр. рападкишв (Ва1вав ЮовтЮ), Ζ. регептв (регепта1 1еов1п1е) и Ζ. гатова), пшеница (Тпбсит вр естев), ячмень (например, Ногбеит мбдаге), овес (например, Аνеηа ва1ка), сорго (8огдЬит Ъюо1ог), рожь (8еса1е сегеа1е), соя (О1усте врр, например, О. тах), хлопок (виды Ооввуршт, например, О. ЫгвиШт, О. ЪагЪабепве), Вгаввюа врр. (например, В. парив, В. _)ипсеа, В. о1егасеа, В. гара, и т.д.), подсолнечник (НейапШив аппив), табак (№сойапа вреаев), люцерна (Мебюадо ва1ка), рис (Огуга вреаев, например, О. ва1ка шбюа группа культивара или _)аропюа группа культивара), кормовые травы, просо американское (РептвеШт врр. например, Р. д1аисит).

Другие реципиенты включают декоративные виды (например, розы, петунии, хризантемы, лилии, герберы видов), древесные деревья (например, виды Рори1ив, 8аЬх, Циегсив, Еиса1урШв), например, волоконные виды, хлопок, лен (Ьтит ивбабввшит) и конопля (СаппаЫв ваЫ'а).

В принципе, любой вид растений сельскохозяйственных культур подходит. Хлебные злаки или

- 19 025000 культивируемые растения относятся к видам растений, которые культивируются и разводятся людьми и исключает сорняки, такие как АтаЫбор515 ТНАиАЫА или дикие родственные формы, такие как томатные родственные формы 8о1атшт реппе11и, 8о1атшт сНПепзе. 8о1агшт с1шне1е\У5кн. 8о1агшт ЬаЬгосЬаЪез, 8о1агшт ртршеШкоНит и др. (хотя мутантные аллели 81РР2С1 могут быть получены из таких растений и перенесены в культивируемые томаты методами разведения, см. дальше). Культурное растение может быть выращено для пищевых целей (например, овощные культуры и полевые культуры) или для декоративных целей (например, производства цветов для резки, травы для газонов и т.д.). Культурные растения, как определено здесь,- это также растения, из которых получают непродовольственные товары, такие как масло для топлива, пластиковые полимеры, фармацевтическую продукцию, пробки, волокна и тому подобное.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения трансгенные растения, включающие транскрипцию регуляторным элементом (в частности, промотором, как описано выше), функционально связаны с молекулой нуклеиновой кислоты, которая при транскрипции способна заставить приглушить экспрессию эндогенного 81РР2С1 гена в клетках реципиента.

Конструкция химерных генов и векторов, желательно стабильное, введение 81РР2С1 сайленсинга генов в геном клетки-реципиента, как правило, известны в науке. Для создания химерного гена смысловая и/или антисмысловая 81РР2С последовательность функционально связана с промотором, подходящим для экспрессии в клетке-реципиенте, используя стандартные методы молекулярной биологии. Промотор, возможно, уже может присутствовать в векторе так, чтобы нуклеиновая последовательность просто вставлялась в вектор на выходе из последовательности промотора. Вектор затем используют для трансформации клеток реципиента и химерного гена, вживляют в ядерный геном или в пластид, митохондриальный геном или геном хлоропластов, и выражалась там с помощью подходящего промотора (например, Ме Впбе и др., 1995 Вю/ТесЬпо1оду 13, 362; И8 5693507).

Полученное трансформированное растение может быть использовано в обычной схеме селекции для получения более трансформированных растений с теми же характеристиками или введена часть гена в другие разновидности одного и того же или родственных видов растений. Элитное событие может быть выбрано, это трансформация с трансгеном, вставленным в определенном месте в геноме, что приводит к хорошей экспрессии желаемого фенотипа (например, оптимальному сайленсингу и засухоустойчивости).

В одном из вариантов осуществления изобретения желательно усилить потерю воды, то есть уменьшить засухоустойчивость конкретных тканей и/или снизить чувствительность АВА конкретных тканей, например фруктов, сверхэкспрессией 81РР2С1, по меньшей мере, в таких тканях. Например, для получения плодов (например, томатов) с усиленной потерей воды и, следовательно, более прочной мякотью фруктов и/или усилением вкуса, фруктово-специфический или фруктово-предпочтительный промотор подходит, который функционально связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональный 81РР2С белок (8ЕЦ ГО N0: 2 или вариант. Чтобы придать экспрессию плодам, плод томата и очищающий специфический промотор бета-галактозидаза II (8ιηί11ι и др., 1998, Р1ап1 РЬу5ю1 117.: 417-23), или томатный эпикутикулярный восковой промотор ЬеСЕК6 (Уодд и др., 2004, см. выше) могут быть использованы. Кожура плода или эпидермальный промотор могут быть идентифицированы и изолированы одним специалистом в науке с помощью микрочипов и подтверждения трансформации слияний промотора гена-репортера. Такие промоторы могут быть также использованы для 81РР2С1 сайленсинга в определенных тканях, таких как плоды.

Трансгенные растения или их части, в которых 81РР2С1 приглушен, имеют значительно усиленную засухоустойчивость. Значительно усиленная засухоустойчивость (как описано выше) используется здесь для обозначения усиленной способности трансформированных клеток (по сравнению с диким типом или контрольными трансформированными клетками) переносить один или несколько периодов засухи (лишение воды/истощение, приводящее, например, к видимым симптомам увядания листьев контрольных растений), как описано выше. Желательно, чтобы растения были способны к восстановлению в дальнейшем, что ведет к снижению общей потери урожая, поскольку все больше растений выживают через т и/или урожай из сохранившихся растений существенно не снижается.

Значительно усиленная засухоустойчивость может быть оценена в контролируемых условиях (теплица или камеры роста), как описано выше или используя эквивалентные методы. Например, альтернативный метод заключается в следующем: по меньшей мере около 10 трансформированных клеток в трансформации и не менее 10 контрольных растений находятся различные временные периоды (от нескольких часов до 1-4 недель и более) в окружающей среде без полива, до увядания листьев или потери тургора вызвана на контрольных растениях, а затем и полива растений, например, вновь, по меньшей мере, 1 неделю, 2 недели или больше, а восстановление фенотипа анализируется. Трансформированные клетки с усиленной засухоустойчивостью выживают по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7 дней, предпочтительно по меньшей мере на 2-5 дней без воды дольше, чем контрольно-трансформированные клетки (например, трансформированные с пустым вектором), или растения дикого типа делают в тех же условиях, и которые показывают необратимые повреждения тканей. Альтернативно, % выживаемости может быть рассчитан на определенный период времени, в которой засухоустойчивые растения имеют % выживае- 20 025000 мости, который составляет не менее 10, 20, 30% и более, выше, чем в контрольной группе. Это альтернативный метод может также использоваться для определения того, имеют ли мутантные растения (т.е. нетрансгенные растения в составе одного или нескольких мутантных аллелей 81РР2С1) значительно усиленную засухоустойчивость. Известно, что когда мутантные растения анализируются на их фенотип, контрольные растения предпочтительно находятся около изогенных линий мутанта, который включает в себя дикий тип (типы) аллели. Период лишения воды/стресса и период восстановления может меняться в зависимости от вида растения. Например, в рисе 9,5 ч нехватки воды, за которыми следуют 10 дней восстановления (полива), подходят для определения того, имеет ли линия растения или трансформация усиленную засухоустойчивость по сравнению с контрольной группой, а процент выживаемости значительно увеличивается в засухоустойчивой линии (см., например, 2Ьеп§ и др. ВюсЬет1са1 апй ВюрЬук1са1 КекеагсЬ СоттитсаЬопк 2009, 985-989).

В конце концов, полевые испытания используются, чтобы показать, что трансформированные клетки (или мутантные растения описаны далее ниже) имеют значительно усиленную засухоустойчивость по сравнению с растениями дикого типа.

Как уже упоминалось, трансформированные клетки с оптимальным уровнем сайленсинга могут быть выбраны, например, анализом количества копий (Южный блот анализ), уровни мРНК транскрипции (например, КТ-РСК с использованием 81РР2С1 пары праймеров), либо путем анализа наличия и/или уровеня 81РР2С1 белков в различных тканях (например, δΌδ-РАОЕ, ЕЫ8А анализы и т.д.). Получаются оптимальные трансгенные линии, которые затем используются для дальнейшего пересечения/обратного скрещивания/самоопыления до высокой исполнительской элитной линии со стабильным трансгеном. В одном из вариантов осуществления представлены особенности трансгенных семян, полученных из таких растений, которые могут быть реализованы как засухоустойчивые.

Трансформированные клетки, выражающие один или несколько генов 81РР2С1 согласно данному изобретению, могут также содержать другие трансгены, такие как другие гены с засухоустойчивостью или с устойчивостью к другим биотическим или абиотическим стрессам. Для получения таких растений с уложенными трансгенами другие трансгены могут быть или интрогрессированы в 81РР2С1 трансформированные клетки, или трансформированные клетки могут быть преобразованы в дальнейшем с одним или несколькими другими генами, или же несколько химерных генов могут использоваться для преобразования растительной линии или разновидности. Например, несколько химерных генов могут присутствовать на одном векторе или могут присутствовать на различных векторах, которые совместно трансформированы.

В одном из вариантов осуществления следующие гены сочетаются с 81РР2С1 сайленсингом согласно данному изобретению: Гены, кодирующие другие виды АР2/ЕКЕВР транскрипционных факторов, желательно те, которые играют важную роль в реакции растений на экологические стрессы, такие как, например, СВР1, СВР2, СВР3 и/или СВР4 кодирование генов из АгаЬШорык (1ад1о-Ойокеп и др. 1998, 8с1епсе 280, 104-106, 1998; Какида е! а1. 1999 Ыа! Вю1есЬпо1. 17, 287-291) или ортологов их других видов (БиЬоиге! и др., 2003, Р1ап! 1. 33: 751), с генами устойчивости к насекомым, такими как ВасШик ТЬигш§1епк1к токсичными генами (кодирующими инсектицидные белки, таких как сгу гены, У1Р гены, и т.д. см. 1Шр://\у\у\у.Ью1к.кикх.ас.ик/1юте/ для списка доступных генов), грибковые гены устойчивости, гены устойчивости к гербицидам или другим генам.

Уложенные трансформированные клетки могут, таким образом, иметь более широкую экологическую толерантность стресса, например соленость, холодовой стресс, устойчивость к насекомым, патогенный возбудитель, тепловой стресс, нехватку воды и т.д.

Целые растения, семена, клетки, ткани и потомства (например, Р1, Р2 семян/растений и т.п.) любого из трансформированных растений, описанные выше, представлены здесь и могут быть идентифицированы наличием трансгенов в ДНК, например РСК-анализом. Кроме того, специфические линии РСК диагностических методов могут быть разработаны, где РСК праймеры основаны на фланкирующей ДНК растения вставленного химерного гена, см. И8 6563026. Кроме того, могут быть разработаны конкретные линии АРЬР пептидной карты или КРЬР пептидные карты, которые определяют трансгенное растение или любое растение, семена, ткани или клетки, полученные оттуда.

Известно, что трансгенные растения согласно данному изобретению, не показывают нежелаемые фенотипы, такие как снижение урожайности, уменьшение плодов на растении, усиленная восприимчивость к болезням и нежелательным структурным изменениям (карликовость, деформация) и т.д., и что, если такие фенотипы проявляются в первичных трансформированных клетках, они могут быть удалены обычным методом для разведения и селекции (скрещивание/обратное скрещивание/самоопыления и т.д.). Любое из трансгенных растений, описанных здесь, может быть гомозиготным или гемизиготным для трансгена.

Нетрансгенные засухоустойчивые растения и методы их разведения.

Вариантом осуществления данного изобретения также является использование нетрансгенных методов, например, систем поколения мутантов-мишеней поколения и идентификации, таких как ТЕШХО подход (Ориентация индуцированных локальных поражений в области геномики, МсСа11ит и др., 2000, Ыа! Вю1есЬ 18:455, и МсСа11ит и др. 2000, Р1ап! РЬукю1. 123, 439-442, Неткой и др. 2004, Р1ап! РЬукю1.

- 21 025000

135: 630-636 включены сюда по ссылке) и селекция для получения растительных линий, которые включают по меньшей мере одну мутацию в эндогенном аллеле 81РР2С1 и котором растения, составляющие мутантный аллель 81РР2С1 в гетерозиготных или гомозиготных формах, имеют значительно усиленную засухоустойчивость и/или значительно усиленную чувствительность к АВА по сравнению с растениями с нехваткой мутантного аллеля (с аллелем дикого типа(ов) в локусе 81РР2С1). Таким образом, в одном из вариантов осуществления данного изобретения растения, содержащие один или более мутантных аллелей 81РР2С1 в геноме и значительно усиленную засухоустойчивость по сравнению с растениями с нехваткой указанного мутантного аллеля(ей), но включающие аллели дикого типа вместо этого, представлены в настоящем документе, а также части растений (например, собранные плоды, собранные листья и т.д.), семена, клональное разведение таких растений, потомство таких растений, составляющих мутантный аллель.

Значительно сниженная чувствительность к нехватке воды или значительно усиленная засухоустойчивость относится к (статистически значимо) снижению симптомов увядания листьев множества растений, включающих мутантный аллель(и) по меньшей мере на 10% по сравнению с контрольными уровнями (например, те же растения с нехваткой мутантного аллеля, таких как, не мутировавшие растения) и может быть, например, проверены, как описано выше, для трансгенных растений или используя эквивалентные альтернативные методы. Вкратце, множество мутировавших растений (преимущественно по меньшей мере 10, 15, 20 или более растений линии, включающей особую мутацию аллеля 81РР2С1) и контрольных растений того же возраста насыщены водой в начале эксперимента и не были политы в течение длительного периода времени, например по меньшей мере около 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 дней или более.

Когда у контрольных растений появляются признаки увядания листьев (легкое увядание или умеренное увядание), все растения оцениваются на наличие признаков увядания листьев с использованием, например, визуальной оценки. Симптомы увядания листьев могут, например, измеряться в соотношении 4:1, а именно очень увядшие (4), умеренно увядшие (3), слегка увядшие (2) или не увядшие (1), например. Известно, что мутировавшие растения значительно усиливают засухоустойчивость, если (в среднем) увядание снижается как минимум на 10%, предпочтительно по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100% по сравнению с контрольной группой растений дикого типа. Например, если 10 растений проверены на симптомы увядания (те) на линию, контрольные растения могут иметь средний балл = 40/10 = 4,0, в то время как засухоустойчивая линия может иметь средний балл = 36/10 = 3,6 или меньше, например = 3,4, 3,2, 2,0, 1,4 или 1,0.

Альтернативно или в дополнение полевые испытания могут быть использованы для определения того, появляется ли значительно усиленная засухоустойчивость на линии из-за мутировавшего аллеля 81РР2С1. Например, множество растений, включающих особый мутировавший аллель 81РР2С1 (преимущественно по меньшей мере 10, 20, 30 или более растений линии), выращены в поле вместе с контрольными растениями и не были политы в течение длительного периода времени, например по меньшей мере около 1, 2, 3, 4 недель или более. Когда контрольные растения показывают увядание, симптомы увядания могут быть оценены, как описано выше. Альтернативно, % восстановления и/или % выживаемости после того, как они были политы (восстановлены), может быть оценен. Когда увядание листьев или потеря тургора вызвана на контрольных растениях, растения поливают снова (например, 1 неделя, 2 недели и более), а восстановление их фенотипа анализируется. Мутанты с усиленной засухоустойчивостью выживают по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7 дней, предпочтительно по меньшей мере на 2-5 дней без воды дольше, чем контрольные растения (например, дикого типа или близкие изогенные линии) в тех же условиях, и которые показывают необратимые повреждения тканей. Кроме того, % выживаемости может быть рассчитан с засухоустойчивыми растениями мутировавшей линии с (в среднем) % выживания, который увеличивается по меньшей мере на 10, 20, 30 или более по сравнению с контрольной группой.

Как упоминалось ранее, другие анализы для засухоустойчивости могут быть использованы. Наиболее подходящий анализ может отличаться для различных видов сельскохозяйственных культур, то есть для томатов другие анализы могут быть подходящими, чем для салата или риса. Например, статистически значимое увеличение в растениях (включающих мутантный аллель), восстанавливающихся после периода засухи, может быть измерено и/или значительное снижение смертности растения после периода засухи может быть измерено в растениях, включающих мутантный аллель по сравнению с растениями с его нехваткой. См. например, методы, описанные в 2Ьеп§ и др. (2009, см. выше), Υυ и др. (2008, см. выше) или Хюпд и др. 2006 (см. выше).

Значительно повышенная чувствительность к АВА может быть проверена, как описано в примерах для трансгенных растений. Таким образом, прорастание семян в среде, содержащей АВА, по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60% и более, ниже для растений с мутантным аллелем 81РР2С1, чем в контрольной группе с той же концентрацией АВА. Например, 1 или 3 мкМ АВА, 50% семян дикого типа прорастают, в то время как 40, 35, 30% или меньше мутировавших семян прорастают. Таким образом, прорастание семян с мутантным аллелем подавляется в большей степени АВА. Рост корня растения с мутантным аллелем также подавляется в большей степени АВА.

Предпочтительно, чтобы растения с фенотипами на засухоустойчивость и/или АВА чувствитель- 22 025000 ность, как описано выше, были гомозиготные для мутантного аллеля 81РР2С1, хотя гетерозиготные растения также могут быть с фенотипом, а также могут показывать усиленную засухоустойчивость и/или усиленную чувствительность АВА. Для создания растений, включающих мутантный аллель в гомозиготной форме, самоопыление может быть использовано при необходимости в сочетании с генотипированием (определяя наличие мутантного аллеля, например, РСК методом с использованием специфических праймеров аллеля и/или последовательности). Если ΤΙΕΕΙΝΟ подход используется мутантными растениями (М1), предпочтительно самоопыленные один или несколько раз для создания, например, М2 популяции или предпочтительно М3 или М4 популяции для фенотипа. В М2 популяциях мутантный аллель находится в соотношении 1 (гомозиготный для мутантного аллеля) к 2 (гетерозиготный для мутантного аллеля): 1 (гомозиготный для аллеля дикого типа). Сегрегация засухоустойчивости должна коррелировать с сегрегацией мутантного аллеля.

Растение, включающее мутантный аллель 81РР2С1 или его вариант и повышенную засухоустойчивость, может быть любого вида, как томатная последовательность, указанная в настоящем документе, может быть использована для создания и определения растений, включающих мутации в гомологах и ортологах гена, как описано ниже. Эндогенный 81РР2С1 вариант последовательности нуклеиновых кислот в растениях может быть идентифицирован, затем может быть использован в качестве целевого гена в поколении и/или идентификации растений, включающих 81РР2С1 вариант мутантного аллеля. Таким образом, мутантное засухоустойчивое растение может быть двудольных и однодольных видов. Предпочтительно растение представляет собой культурное растение, хотя это также вариант осуществления для определения мутантных аллелей в диких растениях или некультурных растениях и передачи этих методов путем селекции в культурные растения.

В одном из вариантов осуществления растение, содержащее по меньшей мере один мутантный аллель 81РР2С1 (в гомозиготной или гетерозиготной форме) и имеющее значительно усиленную засухоустойчивость (и/или значительно усиленную чувствительность к АВА), относится к семейству 8о1аиасеае, т.е. охватывающий род 8о1агшт, Саркюит, №сойаиа и другие. В другом варианте осуществления - растения рода 8о1апит, например, охватывающие культивированные томаты, картофель, баклажаны и другие.

В одном из вариантов осуществления засухоустойчивые растения картофеля состоят из мутантных аллелей 81РР2С1 (например, 81РР2С1 из 8ЕЦ ГО N0: 14 или ее вариант), кодирующих снижение функции или потерю функции белка (например, снижение функции или потерю функции белка 81РР2С1 8ЕЦ ГО N0: 15 или её варианта).

В особом варианте осуществления - растение из вида 8. 1усорег8юит. Любой 8. 1усорег8юит может быть создан и/или определен по меньшей мере одним мутантным аллелем 81РР2С1 в своем геноме, будучи засухоустойчивым. Растение томата может, таким образом, быть любым культивируемым томатом любого коммерческого сорта, любой линии разведения или пр., это может быть определенным или неопределенным, открыто опыляющимся или гибридом, производящим плоды любой формы и размера. Мутантный аллель, генерируемый и/или определённый, в частности, в растении томатов, относительно совместим для скрещивания, может быть легко перенесен в любое другое растение томата путём разведения (скрещивание с растением, включающим мутантный аллель, а затем выбрав потомство, включающим мутантный аллель).

Растение может быть любого вида семейства 8о1аиасеае или рода 8о1агшт, вид которого либо мутировавший для генерирования мутантного аллеля (например, ТГОЬГОО подход) или в котором одна или несколько физических или спонтанных мутаций в гене 81РР2С1 (или вариант) определены, например, ЕсойШид подходом.

Мутантный аллель находится в одном из вариантов осуществления, генерирован или определён в культурных растениях, но также может быть получен и/или определен в диких растениях или не культивируемых растениях, а затем перенесен в культурные растения с использованием, например, скрещивания и селекции (возможно использование межвидовых скрещиваний, например, с спасением зародыша для переноса мутантного аллеля). Таким образом, мутантный аллель 81РР2С1 может быть генерирован (человечески-индуцированная мутация, использующая методы мутагенеза, чтобы мутагенезировать 81РР2С1 ген-мишень или его вариант) и/или определен (спонтанный или природный вариант аллеля) в другие виды 8о1аиит, включающие, например, 8. сЬеектаил, 8. сЬЛеике, 8. ЬаЬгосЬайек, 8. сЬпиеЮхъкн. 8. 1усорег81сит х 8. региу1апит, 8. д1апби1о8ит, 8. Ыг5и1ит, 8. тишЮт, 8. рагуШогит, 8. реипе11и, 8. региу1апит, 8. региу1апит уаг. ЬитЛикит и 8. ршртеШ£о1шт, и затем превращен в культивируемое растение 8о1аиит, например 8о1аиит КсорегЧснт, традиционными методами разведения. Термин традиционные методы разведения охватывает здесь скрещивание, самоопыление, селекцию, двойную гаплоидную производительность, спасение зародыша, слияние протопластов и т.д., как известно селекционеру, то есть методы, отличающиеся от генетической модификации, с помощью которой аллели могут быть перенесены.

Предпочтительно мутация(и) в аллеле 81РР2С1 приводит растение к тому, что оно имеет значительно усиленную засухоустойчивость и/или значительно усиленную чувствительность к АВА по сравнению с растениями с нехваткой мутантного аллеля(ей) (то есть включающих аллели 81РР2С1 дикого типа), как

- 23 025000 описано выше.

Без ограничения изобретения мутации в З1РР2С1 (ЗЕО ГО N0: 1, или вариантах), либо в соответствующей геномной последовательности (ЗЕО ГО N0: 11 из нуклеотидов от 2676 до 4975 или их вариантов), в результате сниженной функциональности или потери функции белка З1РР2С1, например, через одну базовую транзицию, бессмысленную или несмысловую мутацию, или вставку или удаление одной или нескольких аминокислот или сдвиг рамки в кодирующей последовательности, которая, в свою очередь, приводит к измененному фенотипу. Наличие и тип мутации(ий) могут быть проанализированы с помощью секвенирования генов, используя З1РР2С1 специфические праймеры. Значительное сокращение функциональности белков З1РР2С1 предпочтительно определяется косвенно в естественных условиях фенотипом (то есть значительно усиленной засухоустойчивостью) в растениях, гетерозиготных или предпочтительно гомозиготных для мутантного аллеля. Засухоустойчивый фенотип выделяется вместе с мутантным аллелем. Тем не менее, значительное сокращение функциональности белков также может быть определено в искусственных условиях путем анализа протеинфосфатазы, в которой мутантная З1РР2С1 активность протеинфосфатазы снижается как минимум на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 (уменьшение функции) или 100% (потеря функции мутации). Для этого мутантный аллель клонируется и выражен, например, Е. сой, затем в искусственных условиях анализа фосфатазы как, например, описывает Сокй и др. 1999, Р1ап1 Се11 11: 1897-1910, Ма1ейа1 апй МеШойк - РР2С АсЙуШек, стр. 1907.

В одном из вариантов осуществления изобретения представлено растение (предпочтительно растение томата), содержащее одну или несколько мутаций в ЗЕО ГО N0: 1 и ЗЕО ГО N0: 11 (из нуклеотидов от 2676 до 4975), либо в последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99% или более идентичности последовательности ЗЕО ГО N0: 1 (как определено) или ЗЕО ГО N0: 11 (из нуклеотидов от 2676 до 4975), или в соответствующую геномную последовательность любого из них, где мутация приводит к закодированному З1РР2С1 белку (или варианту) со сниженной активностью (по сравнению с диким типом функционального белка) или неактивности в естественных и/или в искусственных условиях, и где указано, что растение включает в себя значительно усиленную засухоустойчивость по сравнению с растением (предпочтительно томатом), включающий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей дикий вид белка З1РР2С1 (или варианта).

В одном из вариантов осуществления изобретения представлено растение (предпочтительно растение томата), в состав которого входят одна или несколько мутаций в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ЗЕО ГО N0: 2, или белок, включающий по меньшей мере 45, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98, 99% и более идентичность последовательности ЗЕО ГО N0: 2 (как определено), и где (томат) растение имеет значительно усиленную засухоустойчивость по сравнению с (томат) растением с нехваткой указанной одной или нескольких мутаций.

В одном из вариантов осуществления представлены засухоустойчивые растения (предпочтительно томат), включающие мутантный аллель З1РР2С1, отличающийся тем, что мутации с потерей функции или сниженной функцией мутации, закодированного З1РР2С1 белка, указанный белок - это белок, имеющий по меньшей мере 45, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98, 99% или более идентичности последовательности аминокислот ЗЕО ГО N0: 2.

Растение (например, растение томата) предпочтительно является гомозиготным растением для мутантного аллеля З1РР2С1.

Мутантные растения можно отличить от немутантов молекулярными методами, такими как мутация(и), присутствующие в З1РР2С1 геномной ДНК или РНК (кДНК), белок З1РР2С1 и/или активность белка и т.д., а также измененными фенотипическими характеристикками по сравнению с диким типом. Мутантный аллель может быть перенесен в другие растения, которые являются совместимыми для размножения с мутантным растением, используя традиционное скрещивание и селекцию. Таким образом, мутантный аллель может быть использован для создания засухоустойчивых сортов томата любого вида, например, видовое разнообразие открытого опыления, гибридные сорта, гибриды Р1, вид Кота, вид сйеггу, определенный или неопределенный виды и т.д. В одном из вариантов осуществления растение (предпочтительно З.Ьусорегасит) содержит мутантный аллель З1РР2С1 и усиленную засухоустойчивость, это гибрид Р1 растения или семена Р1, из которых выращивается растение Р1 гибрид. Инбредные родители, чтобы получить Р гибрид, предпочтительно оба включают такой же мутантный аллель З1РР2С1 в их геноме в гомозиготной форме.

В другом варианте осуществления растение, включающее мутантный аллель З1РР2С1 (например, томат), скрещивают с другим растением того же вида или близкородственных видов для создания гибридных растений (гибридных семян), содержащих мутантный аллель З1РР2С1. Такое гибридное растение также является вариантом осуществления изобретения. Также метод переноса мутантного аллеля З1РР2С1 на другое растение осуществляется, включая предоставленное растение с мутантным аллелем З1РР2С1 в своем геноме, скрещивая указанное растение с другим растением и получая семена указанного скрещивания. Выборочно растения, полученные из этих семян, могут дополнительно самоопыляться и/или скрещиваться и выбирается такое потомство, которое имеет в составе мутантный аллель и усиленную засухоустойчивость.

В одном из вариантов осуществления родители, чтобы получить гибрид Р1, включают различные

- 24 025000 мутантные аллели 81РР2С1 в гомозиготной форме, так что гибрид состоит из двух различных мутантных аллелей 81РР2С1. Например, родитель 1 может включать потерею функции мутанта, в то время как родитель 2 включает сниженную функцию мутанта. Гибрид Р1 затем содержит один аллель от каждого родителя. Таким образом, также растения томатов, состоящие из двух различных мутантных аллелей 81РР2С1 в 81РР2С1 локусе и имеющие повышенную засухоустойчивость, представлены здесь.

Растения, содержащие мутантный аллель 81РР2С1, кодирующий потерю функции или снижение функции белка (например, укороченный белок в результате несмысловой мутации белка, изменение аминокислотной последовательности, в результате чего, например, изменяется каталитический участок, видоизмененное сворачивание и т.д, например, из-за бессмысленной мутации, мутации сдвига рамки и/или мутации участков сплайсинга), могут быть получены и/или определены с помощью методов мутагенеза или путем скрининга природных популяций для природных вариантов в аллеле 81РР2С1. В одном из вариантов осуществления изобретения ΤΙΓΓΙΝΟ подход используется для создания таких растений и/или определения такого мутагенеза, индуцирующего мутации, и/или ЕсоТГОЬГОО подход используется для определения растений, таких как дикие растения или некультивируемые растения, включая естественные (спонтанные) мутации в генах 81РР2С1, которые затем могут быть переданы в культивируемые растения традиционными методами селекции. Тем не менее, любой другой способ мутагенеза может быть использован, и понятно, что оба индуцированных человеком мутанта, ИУ или рентгеновский мутагенез, химические мутагены и т.д., и спонтанные мутанты гена 81РР2С1, генерируемые в или переносимые в культивируемые растения и сельскохозяйственные культуры традиционной селекцией, представлены здесь.

В особом варианте осуществления согласно данному изобретению засухоустойчивые растительные мутанты - растения других видов, чем томаты, например однодольное культивируемое растение, предпочтительно рис, кукуруза, пшеница или ячмень, включающее мутантный аллель 81РР2С1 в своем геноме. При использовании таких методов, как ΤΙΓΓΙΝΟ подход, усиление фрагмента гена-мишени может быть основано на 8ЕЦ ГО N0: 1 или их фрагментах (например, с использованием специфических и вырожденных праймеров, например, разработанных на основе одного или более консервативных доменов 81РР2С1) или может сначала изолировать 81РР2С1 ортолог и состав базового праймера на ортологичной последовательности.

ΤΙίΓΙΝΟ подход (ориентация индуцированных локальных повреждений в геномах) - это общий обратный генетический метод, который использует традиционные методы химического мутагенеза для создания библиотек мутировавших единиц, которые затем подвергаются высокому пропускному скринингу для обнаружения мутаций. ТГОЬГОО подход сочетает химический мутагенез с мутацией скриннинга групп РСР продуктов, что приводит к изоляции бессмысленных и несмысловых мутантных аллелей генов-мишеней. Таким образом, ТГОЬГОО подход использует традиционный химический мутагенез (например, ЕМ§ или М^ мутагенез) или другие методы мутагенеза (например, излучения, такие как иУиУ), а затем скрининг с высокой пропускной способностью для мутаций в определенных генахмишенях, таких как 81РР2С1 согласно данному изобретению. 81 нуклеазы, такие как СЕЬ1 или ΕΝΌ01, используются для расщепления гетеродуплексов мутантного и дикого типа ДНК мишени и выявления расщепления продуктов с использованием, например, электрофореза, таких как Ы-С0Р гелевой анализатор системы, см., например, НешкоГГ и др. Р1аи! РЬу8ю1оду 2004, 135: 630-636. ТГОЬГОО подход был применен во многих видах растений, таких как томат (см. Ьйр://Ш1шд.исбау18.еби/тбех.рЬр/ Тота!о_ТШшд), рис (ТШ и др. 2007, ВМС Р1аи! Вю1 7: 19), ЛтаЬШор818 (ТШ и др. 2006, Ме1Ьоб8 Мо1 Вю1. 127-35), Вга88юа, кукуруза (ТШ и др. 2004, ВМС Р1аи! Вю1 4: 12), и т.д. Также ЕсоТГОЬГОО подход, в котором мутанты в природных популяциях не обнаружены, широко используется, см. ТШ и др. 2006 (ΝηΙ РгоЮс 1: 2465-77) и Сота1 и др. 2004, Р1аШ 1 37: 778-86). В одном из вариантов осуществления классический ТГОЬГОО подход изменяется и вместо энзима, основанного на мутантном обнаружении (энзимное пищеварение с однонитевой специфической нуклеазой и высоким разрешением электрофореза полиакриламидного геля), две разные системы обнаружения высокой пропускной способности могут быть использованы, которые ранее использовались только у людей. Эти протоколы обнаружения адаптации КЧКЭ (конформации чувствительного капиллярного электрофореза, см. Ро/уска и др. 2000, Оеиотк8 70, 34-40) или НРМ (высокое разрешение плавления, см. СЬи СЬет 49, 853-860). См. также примеры.

Таким образом, здесь представлены нетрансгенные растения, семена и ткани, содержащие мутантный аллель 81РР2С1 в одной или нескольких тканях и в составе одного или нескольких фенотипов, предоставляемых сниженной функцией или потерей функции белка 81РР2С1 согласно данному изобретению (например, усиленная засухоустойчивость, как описано выше) и методы для создания и выявления таких растений.

Также метод для создания и/или выявления мутантного аллеля 81РР2С1 подходит для создания засухоустойчивых растений и/или метод для создания растения, включающего усиленную засухоустойчивость, предусмотрен и включает следующие этапы:

(а) мутирование семян растений (например, с помощью ЕМ§ мутагенеза) для создания М1 популяции или предоставления мутировавших семян растений или предоставления растений, включающих естественные вариации,

- 25 025000 (b) выборочное самоопыление растений (а) один или несколько раз для создания М2, М3 или М4 семей, (c) подготавка ДНК растений (а) или (Ъ) и объединение ДНК особей, (Д) РСК-амплификация всех или части 81РР2С1 гена-мишени (геномной или кДНК) или ее варианта из ДНК групп, (е) обнаружение присутствия мутировавшего аллеля(ей) 81РР2С1 в продуктах РСК-амплификации и, тем самым, в ДНК группах, (Γ) выбор соответствующих отдельных растений, имеющих мутантный 81РР2С1 аллель(и), (д) выборочное секвенирование мутантного аллеля 81РР2С1 растения;

(Б) фенотипирование растений (Γ) или их потомства для засухоустойчивости и/или АВА чувствительности и (ί) выбор засухоустойчивых растений и, возможно, (ί) разведение с растением (ί) для создания культивируемых засухоустойчивых растений, имеющих хорошие агрономические характеристики.

Этап (а) также может просто предоставить такие растения.

На этапе (с) альтернативно растительная ткань может быть сгруппирована, и ДНК выделена из группы образцов ткани для того, чтобы образовать ДНК группу разных единиц.

На этапе (Д) праймеры, которые усиливают все или часть гена-мишени 81РР2С1 (8Е0 ГО N0: 1) или его варианта, разработаны с использованием стандартных методов, таких как С0ЭЭЕЕ (1Шр://\у\у\у.рго\уеЬ.огд/ДоДД1е). Праймеры могут быть разработаны для усиления, например, по меньшей мере около 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 800 Ър или по меньшей мере до 1000 Ър или более генамишени, то есть 8ЕО ГО N0: 1, или варианта 8ЕО ГО N0: 1, или геномной последовательности 8Е0 ГО N0: 1 (т.е. дополнительно содержащий интроны, например, для томата 8Е0 ГО N0: 11 из нуклеотидов 2676-4975). Геномная последовательность может быть легко изолирована и её последовательность определена, как описано в примерах. Предпочтительно фрагмент, содержащий весь или часть закрепленного домена белка 81РР2С1, усиливается праймером, например, С-терминальным доменом или предполагаемым магнием, связывающим описанный домен.

Для видов растений, кроме помидоров, желательно сначала определить последовательность эндогенного гена 81РР2С1 для того, чтобы быть в состоянии проектировать хорошие последовательности праймеров. Последовательность может быть идентифицирована ίη 8Шсо или, например, разработанными вырожденными РСК праймерами и усиливающими весь или часть варианта гена 81РР2С1 (ортолог гена 81РР2С1 томата) генома растений. Последовательность эндогенного гена 81РР2С1 затем предпочтительно использована для разработки подходящих праймеров для ТГОЬГОС подхода.

Этап (е) может использовать 81 нуклеазы, такие как СЕЬ1, чтобы обнаружить несоответствие между продуктом РСК амплификации, то есть между диким типом 81РР2С1 РСК продукта и мутантом 81РР2С1 РСК продукта, которые формируют гетеродуплексы. Кроме того, этап (е) может использовать С8СЕ или НКМ для обнаружения. В С8СЕ гомодуплексах (ХУТЛУТ или мутант/фрагменты мутанта) формируются и гетеродуплексы (мутант/УТ фрагменты). Из-за сформированного несоответствия гетеродуплексы мигрируют с другой скоростью, чем гомодуплексы, через капилляры, что позволяет идентифицировать группы, содержащие мутацию в пределах фрагмента-мишени. НКМ также является неэнзимной технологией. В РСК-амплификации фрагменты гена-мишени ЬСдгееп Р1и8+ ТМ молекулы включены между гибридизированной парой оснований двухцепочной молекулы ДНК, которые, когда найдены в молекуле, будут излучать флуоресценцию. ЫдБ18сапиег фиксирует интенсивность флуоресценции, в то время как пластинка постепенно нагревается. При определенной температуре РСК продукты начинают плавиться, выделяют ЬСдгееп Р1и8+ ТМ, в которой флуоресценция уменьшается. ДНК группы, содержащие мутации (гетеродуплексы), определены, так как их температура плавления ниже, чем у гомодуплексов.

Этап (]) может включать в себя традиционные методы разведения и фенотипические и/или маркерные методы селекции. Много различного видового разнообразия может быть получено таким образом.

Обширные протоколы для проведения ТГОЬГОС подхода были опубликованы, см., например, Бйр://Ъ1оск8.ГБсгс.огд/%7Е81еуеБ/Т1ЬЬШС_риЪБсаБоп8.Б1т1 и ТБ1 и др. (2006) Манге РгоЮсоЬ 1:24652477; ТШ и др. (2006) МеФосЬ Мо1 Вю1. 323:127-135 и ТШ и др. (2003) Ме1БоД8 Мо1 Вю1. 236:205-220, включенные в данный документ в качестве ссылки.

После того как растение, включающее мутантный аллель, который дает желаемый фенотип, был определен, этот аллель может быть передан другим растениям традиционными методами селекции, например, путем скрещивания растений с другим растением и сбором потомства скрещивания. На этапе (]) аллель, таким образом, может быть использован для создания растений, устойчивых к засухе, которые обеспечивают хорошие агрономические характеристики.

Как уже упоминалось, следует понимать, что другие методы мутагенеза и/или селекции могут также быть использованы для создания мутантных растений согласно данному изобретению. Семена могут быть, например, облучены или химически обработаны для получения мутантных популяций. Кроме того, прямое секвенирование гена 81РР2С1 может быть использовано для скриннинга мутировавших расти- 26 025000 тельных популяций для мутантных аллелей. Например, Кеурош! скрининг основан на последовательности метода, который может быть использован для идентификации растений, включающих мутантный аллель 81РР2С1 (К1§о1а и др. Р1о8 0пе, МагсЬ 2009, νο1. 4(3):е4761).

Таким образом, представлены нетрансгенные мутантные растения, которые производят более низкие уровни (функциональные) белка 81РР2С1 дикого типа в одной или нескольких тканях (в частности, по меньшей мере, в ткани листа) или которые полностью лишены функционального белка 81РР2С1 в определенных тканях, которые производят нефункциональный белок 81РР2С1 в некоторых тканях, например, в связи с мутациями в одном или нескольких эндогенных аллелях 81РР2С1. Эти мутанты могут быть получены с помощью методов мутагенеза, таких как ТГОЬГОО подход или его вариантов, или они могут быть определены ЕсоТГОЬГОО подходом или любым другим способом. Аллели 81РР2С1, кодирующие нефункциональные или со сниженной функциональностью белки 81РР2С1, могут быть выделены, упорядочены или могут быть перенесены на другие растения традиционными методами селекции.

В одном из вариантов осуществления растение с усиленной засухоустойчивостью из-за мутантного аллеля растений томатов 2, 3, 5, 7 или 10 примера 4, присутствующих в геноме, представлено здесь, также потомство и его части, включающие аллель.

Представлена любая часть растения или его засухоустойчивого потомства, в том числе включая собранные плоды, собранные ткани или органы, семена, пыльцу, цветы и т.д.

Также предусмотрены комплекты для определения того, содержит или нет растение мутантный аллель 81РР2С1 согласно данному изобретению. Такой комплект может включать в себя РСК-праймеры и зонды выявления аллелей в образце ткани.

Растения (и соответствующее семя), включающее один или несколько мутантных аллелей 81РР2С1 согласно данному изобретению могут быть обозначены и/или помечены как имеющие (повышенную) засухоустойчивость или как сопротивление к засухе.

Предпочтительно засухоустойчивые мутантные растения также имеют хорошие другие агрономические характеристики, т.е. они не сократили количество плодов и/или снизили урожайность по сравнению с растениями дикого типа и/или качество продукта не ухудшилось. Предпочтительно урожайность и/или выживаемость таких растений выше как при долгосрочном, так и/или краткосрочном стрессе засухи. В предпочтительном варианте осуществления растение - растение томата и плод - плод томата, такой обработанный томат, свежий рыночный томат любой формы, или размера, или цвета. Таким образом, также представлены собранные продукты растений или части растений, включающие один или два мутантных аллеля 81РР2С1. Это включает в себя переработанные продукты, такие как томатная паста, кетчуп, томатный сок, разрезанные плоды томата, консервированные овощи, сухофрукты, очищенные фрукты и т.д. То же самое относится к другим видам растений.

Растения или части растений, включающие один или несколько мутантных аллелей 81РР2С1, являющиеся засухоустойчивыми, могут быть сельскохозяйственными культурами (например, рис, кукуруза, соя, пшеница, ячмень, рожь, сорго, капуста и др.) или овощными культурами (например, помидоры, огурцы, лук, морковь, капуста, цветная капуста, брокколи, арбуз, дыня, салат, лук-порей, шпинат, редис, картофель, артишоки, маш-салат, тыква, кабачки, фасоль, горох, перец и др.).

Различная экспрессия в естественных условиях аллелей 81РР2С1 дикого типа (или вариантов, в том числе ортологов) также может привести к растениям, имеющим значительно усиленную засухоустойчивость. Например, аллели 81РР2С1 дикого типа, включающие промоторы, имеют различный характер экспрессии, особенно сниженной экспрессии, чем аллели, найденные в культивируемых растениях томата, могут быть определены (например, в диких родственных формах томатов) и интрогрессированы (перенесены через скрещивание) в культивируемые томаты. Или аллели, имеющие мутации в промоторе 81РР2С1, могут быть определены или генерированы и использованы для генерации растений, имеющих усиленную засухоустойчивость.

Последовательности

8ЕО ГО N0: 1: кДНК аллеля 81РР2С1 дикого типа из томата.

8Е0 ГО N0: 2: белковая последовательность белка 81РР2С1, кодируемого 8Е0 ГО N0: 1.

8Е0 ГО N0: 3 и 4: праймер 1 и 2 для усиления 81РР2С1 кДНК (О РСК).

8Е0 ГО N0: 5 и 6: пара праймеров для усиления актиновых кДНК.

8Е0 ГО N0: 7 и 8: пара праймеров для усиления убиквитиновых кДНК.

8Е0 ГО N0: 9 и 10: пары праймеров для усиления 81РР2С1 кДНК по всей длине.

8Е0 ГО N0: 11: геномная последовательность аллеля 81РР2С1 дикого типа из томата; регуляторные элементы транскрипции (например, элементы промотора) включены в нуклеотиды 1-2675; белок, кодирующий последовательности (экзонов), состоит из нуклеотидов 2676-3419 (экзон 1), 4247-4351 (экзон 2) и 4632-4975 (экзон 3). Первичная РНК представлена в 2591-5050 нуклеотидах.

8Е0 ГО N0: 12 и 13: праймеры, используемые для обнаружения мутаций в 81РР2С1 мутировавших растениях томата (см. пример 4).

8Е0 ГО N0: 14: предполагаемая 81РР2С1 кДНК картофеля (здесь определена как 81РР2С1).

8Е0 ГО N0: 15: предполагаемый 81РР2С1 белок картофеля (здесь определен как 81РР2С1). Перечень фигур

- 27 025000

Фиг. 1: А) Относительные мРНК уровни 81РР2С1 листа (темные полосы серого цвета) трансгенных линий (Т6_0Е, Т34₀е, Т55_0Е) в 25 раз выше по сравнению с диким видом (νΤ). Б) Относительные мРНК уровни 81РР2С1 в опыленных завязях (светло-серые полоски) в Т55_ОЕ похожи на дикий тип, в то время как уровни в Т6_0Е и Т34_0Е ниже по сравнению с диким типом. С) Относительные мРНК уровни в трансгенных линиях Т12_С8 и Т35_С8 ниже, в листьях (темные полосы серого цвета) и неопыленных завязях (светло-серые полоски) по сравнению с диким типом Т18. Средние значения биологических реплик показаны 8Е, уровни дикого типа были сведены к одному.

Фиг. 2: А) Прорастание семян замедлено меньше АВА в сверхэкспрессии линий Т6_0Е и Т55_0Е и более в подавлении линий Т12_С8 и Т35_С8 Т6 по сравнению с диким типом (\УТ). Линия Т34_0Е ведет себя нетипично. Темно-серые линии составляют линии сверхэкспрессии, светло-серые линии представляют совместное подавление линий и черная линия представляет дикий вид. В) Рост корней замедляется больше АВА в совместном подавлении линий Т12_С8 (белые) и Т35_С8 (светло-серые) по сравнению с Т18 (темно-серые) и диким типом (черные). С) Рост корней замедляется меньше АВА в сверхэкспрессии линий Т34_0Е (темно-серые), но более в Т6_0Е (белые) и Т55_0Е (светло-серые) по сравнению с диким типом (черные). Средний процент роста корней представлен 8Ό. Ό) Через девять дней после начала полива, сдержанные подавленные линии не завяли совсем, в то время как дикий вид показывает умеренное увядание и линии сверхэкспрессии показывают сильное увядание.

Следующие неограничивающие примеры описывают использование 81РР2С1 генов для модификации фенотипов растения. Если не указано иное в примерах, все рекомбинантные ДНК технологии осуществляются согласно стандартным протоколам, как описано в 8атЬгоок и др. (1989) Молекулярное Клонирование: Лабораторный Справочник, Второе издание, Со1й 8рйпд НагЬог БаЬогаЮгу Ргекк, и 8атЬгоок и Ки88е11 (2001) Молекулярное Клонирование: Лабораторный Справочник, третье издание, Со1й 8рйп§ НагЬог ЬаЬога(огу Ргекк, Нью-Йорк, и в томах 1 и 2 Аи8иЬе1 и др. (1994) Текущие Протоколы в Молекулярной Биологии, Текущие Протоколы, США. Стандартные материалы и методы для молекулярной работы с растениями описаны в Молекулярной Биологии Растений БаЬГах (1993) Κ.Ό.Ό. Сгоу, совместно опубликованной ООО В108 8с1епййс РиЬИсайопк (Великобритания) и В1аск\уе11 8с1епййс РиЬйсайопк (Великобритания).

Примеры

Пример 1. Выделение и характеристика 81РР2С1.

1.1. Материалы и методы.

1.1.1. Растительный материал.

Растения томатов (8о1айит 1усорег81сит Ь. су. Мопеутакег) выращивали в тепличных условиях с марта по октябрь под 16/8-часовым ритмом дня и ночи. Дополнительное освещение (600 Вт, натриевые лампы высокого напряжения, РЫйрк, Эйндховен, Нидерланды) включали ниже 200 ν/т² и выключали около 300 \¥/т². Температура находилась выше 20°С в течение светового периода и 17°С в темное время суток с РК1УА Интегро версией 724 системы. Растения поливали ежедневно и удобряли каждую неделю. Листья и завязи тканей разрезали, формируя взрослые растения томатов, и корни, и гипокотили от 10дневных проростков. Ткани были собраны с 11.00 часов до 13.00 часов, а непосредственно замораживали в жидком азоте.

1.1.2. 81РР2С1 экспрессия генов, анализ и О-РСК.

кДНК-АРЬР была предварительно сформирована, как описано в Упе/еп и др. (2008, НьюРЬу1о1од18й 177:60-76, см. стр. 61 и 62), по сравнению с опылёнными завязями гибберелловой кислоты (ОА3) и обработанными завязями. Различно выраженный фрагмент 326 Ьр был вырезан из геля и затем элюирующая ДНК была вновь усилена в тех же условиях и использована для селективного усиления. Фрагмент был привязан в Т-образном состоянии ЕсоКУ, переработанном рНадепий рВ1ие8сйрШ 8К (+) (8йа(адепе, Ла-Хойя, Калифорния, США) и упорядочен, используя СЕО ЭТС8 81аг1 КЬ и СЕЦ2000 ЭНА системный анализ (Весктап СоиЙег, Фуллертон, Калифорния, США).

Для количественного РСК анализа РНК выделена с Тп/о1 (1пуйгодеп, СагКЬай, СА, И8А). Фотометрические измерения РНК были сделаны, чтобы уравновесить РНК концентрацию различных образцов. Равные количества РНК ДНКазы обработаны РНКазой свободной ДНКазы (КЦ1, Рготеда, Майкоп, США). РНК (0,5 мкг), была обратно транскрибирована (КТ) с использованием кДНК комплекта синтеза Й8спр1, Вю-гай ЬаЬогаШйек, Негси1е§, СА, И8А) следующего протокола.

В режиме реального времени количественные РСК (О-РСК) праймеры для количественных 81РР2С1 мРНК уровней были разработаны с использованием компьютерных программ (Веасоп Эе81дпег 8оП\уаге, Ргет1ег Вюкой 1п(етайопа1, СА, И8А) и проверены кросс-гомологии с другими РР2С последовательностями.

- 28 025000

Праймер 1: 5’-ТСССАА(ЗОАОААОАТТАСО- 3 (8Еф ГО N0: 3)

Праймер 2: 5’-ТССАСААТТСССААСААС- 3 (ЗЕ<3 ГО N0: 4)

Пара праймеров 1 и 2 усиливает следующий фрагмент 81РР2С1 транскрипта (174 Ьр):

5'ТСеСААебАОААеАТТАСеАТСССААСАСТАТТААСТСаСАСАААСТТАТСАССбАС

АСТТТСССТААААТССАССААААССТСААСААСбААСССССОЗАСАТССССАСбАТАСе

АТСААС’СЗСССТССТАССССТЗСТССЙАСТССАССААТТТСТТСТТССеААТТСТССА

3'

РСК реакции предварительно были выполнены в 96-м термоциклером (Вю-Каб 1Сус1ег, Вю-Каб ЬаЬогаЮпек) с использованием §УВК зеленого микса (1В-8УВК Огееп кирегт1х, Вю-Каб Б-аЬогаЮпек). Программа РСК начата с 3 мин при температуре 95°С, затем 40 циклов, состоящих из 15 с при температуре 95°С и 45 с при 57°С и, наконец, температура плавления усиленного продукта была определена для проверки наличия специфического продукта. Пять мкл 25-кратной разбавленной кДНК использовали в каждом образце. Технические и биологические реплики были всегда предварительно выполнены.

И актин мРНК, и убиквитин были использованы в качестве внутренних генов контроля.

Актин праймер 1:5 - ССАСТСТСОТОАТОаТОТТАС - 3 (ЗЕЦ ГО N0: 5)

Актин праймер 2:5 - ССОТТСАЙСАСЗТАОТСбТа- 3 (ЗЕЦ ГО N0: 6)

Убиквитин праймер 1: 5 СССТСССТСАТТАСААСАТТС- 3 (8ЕЦ ГО N0: 7)

Убиквитин праймер 2: 5 -ТООТСТСАСТССОТТСААТЗ- 3 (8ЕЦ ГО N0: 8)

Разбавленная ДНКаза обработанной РНК была также включена в О-РСК в качестве контроля для геномной ДНК.

1.1.3. Растительная трансформация.

Для создания трансгенных 81РР2С1 линий кодирующий участок 81РР2С1 (8Е0 ГО ΝΟ: 1) РСК усилен и клонирован в ρ^ΟNК вектор. РСК-праймеры, используемые для усиления целой 81РР2С1 кДНК, были созданы следующим образом:

Праймер 1 (прямой): 5 САССТССАСТСАСССТСТТСАСАТТААААТ 3 (8ЕЦ ГО N0: 9)

Праймер 2 (обратный): 5 АТТТОТАТССбААССТТААСТАТСА 3 (8Ε0ΙΟΝΟ:10)

Используя Оа1е\\ау клонирование, 81РР2С1 был клонирован промотором 358 мозаичного вируса цветной капусты в рАЭ625 вектор (бе РоИег и др. 2006, ТНе Р1ан( 1оигна1 47: 934-946), который также содержит терминатор нопалинсинтетазы (3'пок). Трансгенные растения томатов были генерированы путем АдгоЬасЮгшт 1итеГас1ен5-опосредованной трансформации и тканевой культуры, как описано в Ое 1оп§ и др. (2008, см. выше).

1.1.4. Эксперимент нехватки воды.

Вегетационные сосуды дикого типа и 81РР2С1 трансгенные линии одного и того же возраста и размера были насыщены водой в начале эксперимента. Несколько растений были использованы на линии. Растения не поливали в течение десяти дней. Увядание листьев было оценено визуально, когда первые признаки увядания (небольшое или умеренное увядание) было замечено в диком виде контрольной группы на день 8 и 9 соответственно. Шкала 1-4 была использована: 4 - сильно завяли, 3 - умеренно завяли, 2 немного завяли и 1 - нет признаков увядания листьев.

Фотографии, представленные на фиг. 2Ό, были сделаны через девять дней после начала эксперимента.

1.1.5. Анализ прорастания семени и анализ роста корней.

Прорастание семян.

Семена трансгенных линий собирали, сушили и хранили при температуре 4°С. Семена были стерилизованы в разбавленном хлорном растворе (4% (^/ν) гипохлорит), содержащий 0,1% (ν/ν) Твин-20, промыты и посеяны на 1/2М8 среде (2,25 мг М8 базальной соли с 1% (к/ν) сахарозой и ΝίδΟι витаминами, ЭисНеГа, Нааг1ет, 1Ье №1йег1апб5), содержащие 0, 1, 3, 10 или 30 мкМ АВА (Асгок, Оее1, Бельгия). По меньшей мере 40 семян в АВА концентрации были использованы.

Пластинки были помещены в камеру роста при температуре 25°С при 16/8-часовом дне и ночи. Прорастание семян (появление корешков) было оценено по истечении десяти дней, и проценты прорастания семян были подсчитаны.

- 29 025000

Рост корня.

Семена были стерилизованы, как описано выше, и посеяны в воде, содержащей 1 мкМ СЛ3. После появления корешков десять семян каждой линии были размещены в 1/2МЗ среде, содержащей или 0, 5, 10, или 40 мкМ АВА. Корни были измерены и пластинки поместили в вертикальное положение и выращивали в условиях, описанных выше. Через семь дней после переноса от длины корня снова была измерена, и рост корней был рассчитан, как процент от роста корней по сравнению с 1/2МЗ средой без АВА (100%). Эксперименты проводились три раза, а средние значения плюс 8Ό показаны. Т-тесты были проведены для проверки достоверности (р <0,05).

1.2. Результаты.

1.2.1. Экспрессия 31РР2С1 во время завязывания плодов (данные не представлены).

Ген 31РР2С1 дифференцированно выражен в ходе завязывания плодов (Упс/сп и др 2008, см. выше). 31РР2С1 выражен больше всего в околоплоднике неопыленных завязей и меньше после опыления и СА₃-обработки. Экспрессия в завязи/семяносце, кажется, не меняется. Мы подтвердили экспрессию 31РР2С1 в ткани завязи томата количественной РСК. Снова было отмечено, что мРНК уровни 31РР2С1 выше в околоплоднике, чем в завязи или семяносце в контрольной ткани. В околоплоднике, но и в семяносце, нижний мРНК уровень 31РР2С1 был найден через три дня после опыления. В завязи мРНК уровни не изменились. Ген 31РР2С1 выражен в созревшей неопыленной завязи во время цветения на относительно высоком уровне по сравнению с вегетативными тканями, такими как листья, корни и гипокотиль. В цветочных почках и завязях за три дня до цветения 31РР2С1 мРНК уровень сопоставим с листьями, и это намного ниже, чем в завязи во время цветения (контрольная группа, С4). Через три дня после опыления 31РР2С1 мРНК уровень в завязи был снижен до 50% от уровня неопыленных завязей.

1.2.2. Функциональный анализ 31РР2С1.

Сверхэкспрессия 31РР2С1.

Подход сверхэкспрессии (ОЕ) привел к трем трансгенным линиям томатов, в среднем, с увеличенными в 25 раз мРНК уровнями 31РР2С1 в листьях (с сверхэкспрессией линии Т6_ОЕ, Т34_ОЕ и Т55_ОЕ, фиг. 1А). В опыленных завязях 31РР2С1 мРНК уровни этих линий не выше, чем в диком виде (фиг. 1В). Напротив, Т6_ОЕ и Т34_ое показывают сильное снижение 31РР2С1 мРНК уровней по сравнению с диким типом. Т55_ое имела мРНК уровни, подобные дикому виду в опылённых завязях. 31РР2С1 мРНК уровни в неопыленных завязях этих трансгенных линий были сопоставимы с мРНК уровнями в опыленных завязях и не представлены здесь.

Сайленсинг 31РР2С1.

Кроме того, две линии (совместное подавленные линии Т12_СЗ и Т35_СЗ) были получены так, что имели более низкие 31РР2С1 мРНК уровни в листьях и неопыленных завязях по сравнению с диким типом (фиг. 1С), указывая, что конструкт сверхэкспрессии привел к совместному подавлению 31РР2С1 в этих линиях. Линия Т18 имеет мРНК уровни, которые сопоставимы с диким видом в обеих тканях.

Чувствительность к АВА.

Фенотипические характеристики трансгенных линий показали измененную чувствительность к АВА. Фиг. 2А показывает процент прорастания семян на среде, содержащей различную концентрацию АВА. Совместно подавленные линии Т12_СЗ и Т35_СЗ имеют более низкий процент прорастания на 1 μΜ и 3 μΜ АВА, а Т6 линии сверхэкспрессии Т6_ОЕ и Т55_ОЕ имеют более высокий процент прорастания, чем дикий вид. Линия Т34_ОЕ, которая является линией сверхэкспрессии в листьях, вела себя иначе, чем другие линии сверхэкспрессии, и показала меньшее прорастание семян на АВА по сравнению с диким типом.

Рост корней после прорастания снижается АВА в диком виде. На схеме 2В видно, что рост корня в совместно подавляемых линиях Т12_СЗ и Т35_СЗ был замедлен сильнее, чем в диком виде или Т18. Линия сверхэкспрессии Т34_ОЕ была менее чувствительна к замедлению роста корней АВА, чем дикий вид (фиг. 2). Рост корня линий Т6_ОЕ и Т55_ОЕ был более чувствителен к АВА.

Таким образом, совместное подавление 31РР2С1 приводит к растениям, имеющим значительно усиленную АВА чувствительность, чем АВА дикого типа (прорастание семян замедляется больше и рост корней замедляется больше, чем в диком виде), в то время как сверхэкспрессия приводит к растениям с пониженной АВА чувствительностью, указывая, что 31РР2С1 кодирует отрицательный регулятор АВА.

Засухоустойчивость.

Фиг. 2Ό показывает, что через 9 дней дикие виды растений, имеющие умеренное увядание, совместно подавленные линии, показывают отсутствие увядания и линии сверхэкспрессии показывают сильное увядание. Через 9 дней линии сверхэкспрессии сильно завяли (средний балл увядания = 3.6), в то время как совместно подавленные линии показали небольшое увядание (балл 1.25) и контрольные группы показали умеренное увядание (балл = 3.0). Эксперимент был повторен ещё раз (данные не представлены). Таким образом, увядание снизили в совместно подавленных линиях на 58% по сравнению с контрольной группой дикого типа.

Эти данные свидетельствуют о том, что понижающая регуляция 31РР2С1 приводит к растениям, имеющим значительно усиленную засухоустойчивость по сравнению с диким типом.

- 30 025000

Обсуждение.

Две трансгенных линии, скрывающие сверхэкспрессию конструкта, имели более низкий уровень 81РР2С1 мРНК как в листьях, так и в завязях. РНК сайленсинг путем совместного подавления является общепринятым явлением, хотя механизм до конца не изучен. Было высказано предположение, что совместное подавление индуцировано шпилькой-РНК-транскриптами из обратных повторных копий трансгенов, приводя к кгКЫАк, которые включены в метаболический путь РНК-интерференции (ТотПа и др. 2004, РЕВ8 Ьей. 2004 Аид 27;573(1-3):117-20; \\ апд и МеШаК 2005, Сигг 0рт Р1ап1 Вю1. 8(2): 216-22). Саузерн-Блоттинг (данные не приведены) показал, что в двух совместно подавленных линиях 81РР2С1 были сложно структурированные вставки, которые могли привести к шпилькообразной структуре, которая могла бы заставить приглушить эндогенный ген 81РР2С1.

Три линии с в 25 раз повышенным мРНК уровнем 81РР2С1 в листьях не имели более высоких 81РР2С мРНК уровней в завязях. Это можно отчасти объяснить относительно высоким мРНК уровнем эндогенного гена в завязях, что в семь раз выше, чем в листьях. Вклад трансгенов в общие уровни экспрессии 81РР2С1 в завязи может поэтому был очень невелик. Примечательно, что в линии Т6_0Е и Т34_0Е мРНК уровень 81РР2С1 в завязи еще ниже (10-50%), чем у дикого типа. Особая тканевая контрольная группа эндогенных мРНК уровней трансгена была упомянута ранее. Тошка и др (2004, см. выше) показали, что в том же растении N1^03 ген совместно подавлен в листе, но более выражен в корне, приводя к эквивалентным фенотипам в листьях и корнях. Механизмы, посредством которых тканеспецифическое регулирование совместного подавления происходит, неизвестны, но уровень эндогенного транскрипта представляется важным (ТотПа и др 2004, см. выше).

Две трансгенные линии томатов с пониженным уровнем мРНК в листьях и завязях также отображаются АВА-сверхчувствительными реакциями во время прорастания семян и роста корней и повышения устойчивости к нехватке воды. Это означает, что ген 81РР2С1 является отрицательным регулятором АВА сигнализации каскада в томате. Кроме того, три трансгенные линии с относительно высокими мРНК уровнями 81РР2С1 в листьях также завяли сильнее.

Пример 2. Мутанты ТГОЫЫС подхода, включающие усиленную засухоустойчивость и включающие мутант аллелей 81РР2С1.

2.1. ТГЬЬШС подход популяции томата.

Крайне гомозиготная инбредная линия, используемая в коммерческом обработанном разведении томата, была использована для мутагенеза следующим протоколом. После прорастания семян на влажной бумаге Ватмана® в течение 24 ч, ~20000 семян, разделенных на 8 партий по 2500, соответственно, были вымочены в 100 мл особо чистой воды и этилметансульфонате (ЕМ§) в концентрации 1% в конических колбах. Колбы осторожно встряхивали в течение 16 ч при комнатной температуре. Наконец, ЕМ§ промыли под проточной водой. После обработки ЕМ§ семена непосредственно высеивали в теплице. Из 60% семян, которые проросли, 10600 побегов были пересажены в поле. Из 8810 М1 линий, которые дали плоды, два плода с растения были собраны. ДНК была выделена из семян из первого плода, составляющих М2 популяцию запаса ДНК. Они были самоопыленные, и М3 семена были выделены из плодов, и семена были использованы для ДНК выделения и образования М3 популяции банка ДНК.

2.2. 81РР2С1 ген-мишень для РСК усиления популяции из ТГОЬГНС подхода.

Геномная последовательность, содержащая полный участок транскрипции, включая кодирующий участок (С0И), нетранслируемый 5' терминальный участок (5'иТК) и 3' терминальный участок (3'иТК), была определена, используя РСК с геномной ДНК томата в качестве шаблона и праймеров, созданных на боковой стороне 81РР2С1 последовательности томата. Для сравнения геномных последовательностей генов с 81РР2С1 кДНК последовательностью, расположение, количество и размер интронов и экзонов в этом гене были определены.

Геномная последовательность представлена в 8ЕО ГО N0: 11. Первичная РНК (транскрибируемый участок) от нуклеотида 2591-5050, содержащая 5'ИТК (2591-2675), экзон 1 (2676-3419), интрон 1 (34204246), экзон 2 (4247-4351), интрон 2 (4352-4631), экзон 3 (4632-4975) и 3'ИТК (4976-5050).

ДНК популяция томата ГОШИС подхода, описанная выше, прошла скриннинг для одиночных нуклеотидных полиморфизмов в 81РР2С1 гене-мишени. Для этой цели пары праймеров РСК были разработаны для усиления перекрывающихся фрагментов около 400-500 Ьр из кодирования (экзонов) последовательностей 81РР2С1 гена (5>ЕО ГО N0: 1) или последовательности, включающей всю или часть нуклеиновой кислоты, которая кодирует С-конец белка 81РР2С1 (так как мутации в каталитическом домене, скорее всего, приводят к снижению функции или потере функции белка), то есть кодирующая аминокислоты 84-391 из 8ЕО ГО N0: 2. См. пример 4 ниже, где мутации аминокислот 101-192 были определены.

Пары праймеров были использованы для усиления мишени последовательности из М2 и М3 ДНК ТГОЬГОС популяции и гетеродуплексов между мутантом и мишенью последовательности дикого типа, обнаруженной с помощью С8СЕ и НКМ, как описано ниже. Идентификационный номер ДНК образцов связан с партиями семян растений, несущих аллель дикого типа или мутировавшего аллеля, либо в гетерозиготной, либо в гомозиготной форме.

Семена проросли, и наличие конкретной мутации в отдельных растениях было подтверждено с помощью РСК, используя праймеры, фланкирующие мутировавший участок и геномную ДНК этих расте- 31 025000 ний в качестве шаблонов. ДНК секвенирование фрагментов определило мутанты, гомозиготные и гетерозиготные для ожидаемой мутации. Гомозиготные мутанты выбраны или получены после самоопыления и последующей селекции, и влияние мутации на соответствующие белки и фенотип растения определено.

Растения, включающие одну или несколько мутаций в мишени последовательности, проверены скриннингом фенотипически на засухоустойчивость, используя, например, анализ, описанный выше, и/или полевую оценку.

2.3. Конформация чувствительного капиллярного электрофореза (КЧКЭ).

Мультиплекс РСК реакции проводятся в 10 мкл объеме с 0,15 нг, 4-кратной сгруппированной геномной ДНК. Маркированные праймеры были добавлены в РСК подготовленную смесь к концентрации в 5 раз ниже (1 мкм), чем у немаркированных праймеров. Пост РСК образцы были разбавлены 10 раз. До выполнения КЧКЭ 2 мкл разбавленных продуктов добавили к 38 мкл МО воды.

Образцы будут введены в 50 см капилляры (время инъекции и напряжения: 16 с, 10 кВ; запуск напряжения: 15 кВ) из аппарата АВ1 3130x1, заполненного полуденатурирующими полимерами в следующем составе: 5 г конформационного аналитического полимера (САР) (Аррйеб Вю5у51ет5, 434037, 9%), 2,16 г Игеит, 0,45 г 20хТТЕ (национальная диагностика, ЕС-871), дополненных водой МО до 9 г. Текущий буфер подготовлен с 1х разбавленной ТТЕ и 10% глицерином. Температура в печи установлена на 18°С).

Исходные данные анализируются с гетеродуплексным анализом (НИА) с программным обеспечением В1о№1тепс5, программа отличает пиковые формы гетеродуплексных (мутанты) и гомодуплексных молекул (дикого типа), обеспечивая тем самым возможность выбора ДНК-групп, содержащих отдельные линии, мутировавшие в ген-мишень.

2.4. Анализ высокого разрешения кривых плавления (НКМ).

ЬСдтееп РСК5 выполняется на 8 плотно прилегающих группах в Ртат81ат 96 колодцах пластинок (4 Шибе, Великобритания). 2 мкл (15 нг) сгруппированных ДНК смешиваются с 2 мкл Р-524 Р1йге™ 5х буфером реакции (ΡΙΝΝΖΥΜΕ8, Финляндия), 0.1 мкл Р1йге™ Но! 81аг1 ДНК-полимеразой (ΡΙΝΝΖΥΜΕ8, Финляндия), 1 мкл ЬСОтееп™ Р1и5+ (ВюСЬет, США), 0.25 мкл 5 мм праймерами и дополнены 10 мкл с МО водой) согласно рекомендациям производителя. Группы, содержащие мутации, проходят скриннинг с помощью ЫдЙ8саппет® 8у51ет (1баЬо ТесЬпо1оду 1пс., США). Положительные группы выбираются на основе анализа профилей температуры плавления, когда группа содержит мутации, она покажет более низкую температуру плавления.

Пример 3. Перенос мутантного аллеля 81РР2С1 в сорта томата.

Мутанты ТГОЬШО подхода, содержащие мутантный аллель 81РР2С1, пересекаются с различными линиями томатов для переноса мутантного аллеля в эти линии, генерируя томаты с хорошими агрономическими характеристиками и значительно усиленной засухоустойчивостью.

ТацМап® 8ΝΓ маркер анализа генотипирования (Аррйеб Вю5у51ет5) разработан, чтобы определить наличие модифицированного нуклеотида. Этот анализ используется для маркерно-вспомогательной приоритетной селекции, который эффективен для переноса рецессивных генов в необходимую среду, например коммерческих родительских линий томата, так как их классический перенос требует дополнительных периодически повторяющихся поколений самоопыления (К1Ьаи1 и др. Репортер Молекулярной Биологии Растений 15:154-162).

Пример 4.

ДНК М2 популяция ТШЬШО подхода, описанная в примере 2.1, была проверена скриннингом для одиночных нуклеотидных полиморфизмов в 81РР2С1 гене-мишени (как описано в 2.2), в частности, для мутаций в последовательности, кодирующей аминокислоты от 101 до 192.

Для этой цели следующая РСК пара была разработана, чтобы усилить Ьр фрагмент 277 нуклеотидов 301-577 8Е0 ГО N0: 1:

Прямой праймер: “3863 5’- ОТОАСОТОСТОТТСАСАТООАТС -3’ (ЗЕО ΙΟΝΟ: 12)

Обратный праймер: “3861“ 5’ -ТАСООАААСТСТССОТСАТААС-3’ (ЗЕО ГО КО: 13)

Пара праймеров была использована для усиления мишеней последовательностей из М2 ДНК популяции ТШшд подхода. Усиленная мишень последовательности включает в себя нуклеотиды от 301 до 577 из 8Е0 ГО N0: 1, то есть участок кодирования аминокислот от 101 до 192 из 8Е0 ГО N0: 2. Гетеродуплексы между мутантом и мишенью последовательности дикого типа были определены, используя НКМ, как описано в примере 2.3 (или 2.4).

Десять растений, включающие 8№ в участке-мишени, были выявлены, и РСК продукт мишени последовательности был упорядочен для того, чтобы определить характер и положение 8№. Результаты приведены в табл. 2.

- 32 025000

Таблица 2

Номер растения (М2, гетерозигот ный)	3ΝΡ в мишени последовательности	Воздействие мутации на последовательность белка (5Е<3 ΙΟ ΝΟ; 2)	3ΙΡΤ прогноз на функцию бежа
1	Т -> А в нуклеотиде 372 последовательности 8Е() ГО ΝΟ: 1 (аГГ -> агА)	Не 124 -> Не	нулевой
2	О -> А в нуклеотиде 442 последовательности ЗЕр ГО ΝΟ: 1 (θ88 -» А§§)	СНу 148 -> Агд	(1С§1Тё)
3	С -> Т в нуклеотиде 512 последовательности 8Е<2 ГО ΝΟ: 1 (1С8 Э 1Т§)	Зег 171 -> Ьеи	(саО саА)
4	О Э А в нуклеотиде 504 последовательности ЗЕС) ГО ΝΟ: 1 (саО -> саА)	О1п 168 О1п 168	нулевой
5	О А в нуклеотиде 463 последовательности 840 ГО ΝΟ: 1 (Ос8 Э Лсд)	А1а155-»ТЬг	(1С§1Т8)
6	О -> А в нуклеотиде 465 последовательности ЗЕО ГО ΝΟ: 1 (§сС -> дсА)	А1а155->А1а	нулевой
7	О -> А в нуклеотиде 394	О1у 132 -> 8ег	(саО саА)
	последовательности ЗЕС) ГО ΝΟ: 1 (О8с -> Аде)
8	Должно быть определено	Должно быть определено	Должно быть определено
9	Должно быть определено	Должно быть определено	Должно быть определено
10	О -> А в нуклеотиде 463 последовательности ЗЕО ГО ΝΟ: 1 (Ос§ -> Асу)	А1а 155 -> ТЬг	(1С§1Т§)

На основе анализа З1РТ (РаиЬпе С. N5 и НешкоГГ 2003, №.1с1ею Ас1й КекеагсЬ т. 31, стр. 3812-3814) влияние на функции белка было прогнозировано, см. табл. 2.

Три растения (растения №№ 1, 4 и 6) содержали приглушенную мутацию в гене З1РР2С1, а пять растений (№№ 2, 3, 5, 7 и 10) содержали З№, которые приводят к заменам аминокислот. Растения 5 и 10 содержали идентичные мутации. На основе анализа З1РТ, было прогнозировано, что растения №№ 2, 5 и 10 составляют мутации в аллеле З1РР2С1, которые снижают или отменяют РР2С1 функции белка и, следовательно, предоставляют усиленную засухоустойчивость. Следует отметить, что мутантный аллель З1РР2С1, находящийся в растении 2, есть в Л$р-С1у-Н15 (ΌΟΗ) домене.

Растения №№ 3 и 7 могут также содержать мутантный аллель, который может предоставить усиленную засухоустойчивость.

Чтобы проверить реакцию растений 2, 3, 5, 7 и 10 на засуху и/или другие абиотические стрессы, 14дневная рассада подвергается различным формам стрессовой обработки, выбранным из одной или нескольких следующих процедур.

1. Стресс засухи может быть наложен, как представлено в общем описании, примеры выше и/или путем выращивания рассады в течение 21 дней в искусственных условиях на МЗ (для получения гомогенных популяций), после чего они были перенесены в горшки с песчаной почвой. Через две недели после пересадки их не поливали в течение 6 дней, после чего 50 мл воды/на растение было добавлено сразу. Результаты оцениваются, когда непарные и контрольные растения желтеют (модифицированные из ТЬе Р1ап1 1оигпа1, 2004, 41, 95-106).

2. Стресс солености накладывается путем выращивания рассады в МЗ среде, содержащей 250 мМ №ιθ от 0 до 48 ч.

3. Осмотический стресс накладывается путем выращивания рассады в МЗ среде с добавлением маннитола на 75 мм или АВА на 0,1 или 1,0 мм. Общая длина корня и количество боковых корней, развивающихся во время роста растений, является мерой осмотической стрессоустойчивости и АВА чувствительности соответственно (модифицированные из Хюп и др., Р1ап1 РЬукю1оду, 2006, 142, 1065-1074).

Растения, включающие значительно усиленную стрессоустойчивость, особенно засухоустойчивость, по сравнению с контрольной группой, используются для создания сортов томата с хорошими агрономическими характеристиками, как, например, описано в примере 3. Растения с значительно повышенной засухоустойчивостью могут в дополнение или в качестве альтернативы включать значительно усиленную соленость и/или осмотическую стрессоустойчивость по сравнению с контрольной группой.

- 33 025000

Список последовательностей <110> ыипКетз Β.ν.

<120> ОгоидНх хоТегапх р1ат$ <130> ВС509-2002-МО1 <150> ЕР09007544.1 <151> 2009-06-08 <160> 15 <170> Рахепхт уегзтоп 3.5 <210> 1 <211> 1194 <212> ΡΝΑ <213> 5о1апит Тусорегзтсит

<400> 1 ахдаххдаха	асдххааадд	хахдссдссд	дсаассдада	ааддххдссд	дххаасддсд	60
ххдахадахх	ссддхддасх	адсадаадха	дахсхдадхд	адааддадса	аааххсхасх	120
сдасдхаддс	даХХддаХда	асдхххдххд	ааахсдасда	схдадсхасс	ддаааахххс	180
дахдхсххсд	садахдахха	саддсаххдх	аададдаааа	ааадхасхдх	аасхдахасх	240
даХдаХсаХс	дадххсаасх	адсдххахсх	адхдаадхда	ааааадхаад	ддададсххд	300
дхдасдхдсх	дххсасахдд	ахсдахахсд	ххдахсддсс	ддадааддда	аахддаадах	360
дсддхддсда	хххахссдхд	ххххххсадх	дааддсддсд	дсддсддсад	саддаддхах	420
даххаххххд	дхдхххасда	сдддсахдда	дддхсасдхд	хадсдаасдх	дхдссдхдас	480
хххххдсасс	дхххадхдах	асадсаадхх	хсддааддад	аадаХХасда	ХдддаададХ	540
аххаасхддд	адааадххах	дасддададх	ххссдхаааа	Хддасдаааа	ддхдаасаад	600
дааддддсдд	адахддсдас	дахаддахса	асддсддхдд	хадсддхддх	дддадхддад	660
даахххдххд	ххдсдааххд	хддадаххса	ададсхдхдс	хххсасдхдс	хддадххдсс	720
дхассхххдх	схаххдахса	хаадссхдас	адассхдахд	адсхддахад	ааххдаааах	780
хсаддхддда	аадхсахааа	ХХддааХдда	сааададхсх	хаддадххсх	хдсхасххса	840
адахссахад	дхдахахдха	ссхсааассд	хасдхдахас	садахссхда	адхдахадхх	900
адсаааадаа	дсдахдаада	хдадххсхха	ахасххдсаа	дхдахддхсх	ахдддахдхс	960
аххссааахд	ахдххдсдхд	хдасдххаса	адаадаХдсХ	хдаахддхса	аасдххсада	1020
аддхдсдахс	аасааассаа	ахссхахаад	ададахдаад	дсдхсааада	аадхсхсдса	1080
дсасдддсад	сххссххссх	хдсададхха	дсааххдсхс	ддддхадхад	ддахаасахс	1140
адсдхааххд	хсдхсааххх	даахадахсх	дхасдххсах	ссаххдахад	ххаа	1194

<210> 2 <211> 397 <212> РРТ

<213>

5о1апит

Тусорегзт

сит

<400>

2

мех

Не

Азр

АЗП

Уа1

Ьуз

61 у

мех

РГО

рго

А1а

тНг

б1и

ьуз

С1у

суз

1

5

10

15

Агд

Те и

ТНг

А1а 20

ьеи

Не

АЗР

зег

б1у С1у 25

ьеи

А1а

б1и

уа! 30

АЗр

ьеи

5ег

б1и

ьуз

б!и

61 п

Азп

Зег

ТНг

Агд

Агд

Агд

Агд

ьеи

А5Р

с1и

Агд

35

40

45

Теи

ьеи

туз

Зег

ТНг

ТНг

б1и

ьеи

Рго

б1и

Азп

РНе

АЗр

Уа1

РНе

А1а

50

55

60

Азр

Азр

туг

Агд

НТЗ

суз

ьуз

Агд

ьуз

ьуз

зег

тНг

уа1

тНг

Азр

ТНг

65

70

75

80

А5Р

Азр

НТЗ

Агд

Уа1

б1п

ьеи

А1а

ьеи

Зег

Зег

61 и

уа!

ьуз

ьуз

уа!

85

90

95

Агд

б1и

зег

Ьеи

Уа1

ТНг

Суз

СУ5

Зег

НТ 5

61 у

Зег

Пе

зег

ьеи

Не

100

105

110

б1у

Агд

Агд

Агд

б!и

мех

б1и

АЗР

А1а

Уа1

А1а

Не

туг

РГО

суз

РНе

115

120

125

рНе

5ег

61 и

б1у

С1у 61 у

61 у

61 у

зег

Агд

Агд

туг

АЗр

Туг

РНе

б1у

130

135

140

Уа1

туг

А5р

б1у

НТ5

б1у

С1у

зег

Агд

Уа1

А1а

АЗП

уа!

Суз

Агд

АЗР

145

150

155

160

РНе

ьеи

НТЗ

Агд

ьеи 165

Уа1

Не

61 п

61 п

уа! 170

зег

б!и

б1у

б!и

Азр 175

туг

Азр

61 у

ьуз

Зег

Не

АЗП

Тгр

61 и

Ьуз

Уа1

мех

ТНг

61 и

зег

РНе

Агд

180

185

190

1_У5

мех

Азр 195

б1и

Ьуз

Уа1

А5П

ьуз 200

61 и

б!у

А1а

б1и

Мех 205

А1а

ТНг

Х1е

б1у

Зег

ТНг

А1а

УаТ

Уа1

А1а

уа1

уа1

б!у

Уа!

б1и

б1и

РНе

Уа1

Уа!

210

215

220

А1а

АЗП

Суз

С1у

Азр

5ег

Агд

а! а

Уа1

ьеи

Зег

Агд

А1а

61 у

уа!

А1а

225

230

235

240

Уа1

РГО

ьеи

Зег

11е

Азр

НТЗ

ьуз

РГО

Азр

Агд

РГО

АЗр

б1и

ьеи

Азр

245

250

255

Агд

Не

б1и

А$П 260

зег

б1у о!у

ьуз

Уа! 265

Пе

Азп

тгр

АЗП

б!у 270

6ΐη

Агд

Уа1

ьеи

61 у

Уа!

ьеи

А1а тЬг

зег

Агд

зег

Не

61 у

АЗр

мех

Туг

ьеи

- 34 025000

275

280

285

ьуз

Рго 290

Туг

Уа1

11е

Рго

Азр 295

Рго

б1и

Уа1

Пе

Уа1 300

5ег

ьуз

Агд

Зег

АЗР

б1и

АЗр

б! и

РКе

Ьеи

Не

Ьеи

д!а

Зег

АЗр

61 у

ьеи

тгр

лзр

уа!

305

310

315

320

Пе

Рго

АЗП

Азр

Уа1

А! а

суз

Азр

Уа1

тКг

Агд

Агд

Суз

ьеи

АЗП

б1у

325

330

335

61 п

ТКг

РКе

Агд 340

Агд

суз

АЗр

б!п

б!п 345

тКг

ьуз

Зег

Туг

ьуз 350

Агд

Азр

С1и

б!у

Уа!

Ьуз

б!и

Зег

ьеи

А1а

А1а

Агд

л!а

А1а

Зег

РКе

ьеи

А1а

355

360

365

б1и

Ьеи

А1а

11е

А1а

Агд

61 у

Зег

Агд

Азр

Азп

11е

зег

Уа1

Пе

Уа1

370

375

380

Уа1

АЗП

ьеи

АЗП

Агд

Зег

Уа1

Агд

Зег

Зег

Не

АЗР

зег

385

390

395

<210> 3 <211> 19 <212> ΟΝΑ <213> аггИ1С1а1 <220>

<223> рптег 1 <400> 3 гсддааддад аадагсасд

<210> <211> <212> <213>	4 18 ΟΝΑ агХ1-рт ста!
<220> <223>	рптег 2
<400> 4 хссасаахгс дсаасаас
<210> <211> <212> <213>	5 21 ΟΝΑ агп' Ртста1
<220> <223>	асНп рптег 1
<400> 5 ддасхсхддх дахддхдхха д
<210> <211>	6 19
<212> <213>	ϋΝΑ агН Ртста1
<220> <223>	асНп рптег 2
<400>	6

ссдгссадса дхадхддхд <210> 7 <211> 21 <212> ΟΝΑ <213> аггтЯста!

<220>

<223> иЫцитхтп рптег 1 <400> 7 сссхддсхда ххасаасахх с <210> 8 <211> 20 <212> ΟΝΑ <213> агхт-Мста!

<220>

<223> иЫфКЪп рптег 2 <400> 8 хддхдхсадх дддххсаахд <210> 9 <211> 30 <212> ΟΝΑ <213> агН-рлста!

<220>

<223> 51РР2С1 рптег 1 <400> 9 сассхдсадх сассдхсххс асаххаааах <210> 10 <211> 25 <212> ΟΝΑ <213> аггИ1с1а1 <220>

<223> 51РР2С1 рптег 2 <400> 10 агсхдтахдд даадсххаас хахса <210> 11 <211> 5683 <212> ΟΝΑ <213> ипкпоип <220>

<223> Зо1апит Тусорегзтсоп депоппс 51РР2С ϋΝΑ <220>

<221> 5'υτκ

- 35 025000

<222> <223>	(2591)..(2675) 5’ итк οί ιπκνα
<22О> <221> <222> <223>	ехол (2676)..(3419) ехоп 1 Ггош хгапз1ах1оп зхагх	οοάοη
<220> <221> <222> <223>	ехоп (4247)..(4352) ехоп 2
<220> <221> <222> <223>	ехоп (4632)..(4975) ехоп 3 ир ΐο хгапз1ахтоп зхор	содоп
<220> <221> <222> <223>	З’итк (4976)..(5050) 3’ итк οί ιηΚΝΑ
<400>	11

дхасаааааа	дддадасдхс	дсададдсхд	сададдхссд	ххдддххахх	хсдххссхсс	60
асдсдсхада	дадададддд	дададхахсх	сдсдхдадад	асдсдддада	дадддсдхдд	120
дддсаасдсд	дхххсхдххд	дддхсдсдхд	ддддадддп	ХддсдХХХСХ	аддххсхдхх	180
хдсхдххсхд	дссдсдхдад	ддадддааад	ададдаддад	ададхдхддд	дададасдсд	240
сдддддддад	аддхсдсахд	адддададдх	сдсдхдаддд	хххссдхххх	ХдддХдаХХХ	300
ххдххххххс	ХддааХХддд	асхдххдддх	сдХдсдаадд	дддаадаада	даадссдддХ	360
сддхддхсдд	дхсааасдад	дасддддсдд	дххадахххх	хаадхххадх	дддхсдссхд	420
ддсахахсаа	ахдддсхддд	аахххдадхх	ддаасдддах	хххдддсххд	адддаххддд	480
ссхдддддхх	аахдхдххдд	дххдаддахх	аххааахада	ахдддсхдах	ддааддааха	540
аадддаххдд	дсххдадаах	ХдддХХддХХ	хсдаахахас	асаддахаха	ссддсхахах	600
асасаасхах	дхаахассаа	сдхдддхсаа	ааххдддхдх	саасаахаха	хахахахаха	660
хахахахдхд	ХдХдХдХдХд	ХдХдХдХдХд	ХдХдХдХдХд	хдхааххаса	асадаасааа	720
дхдахаахда	ХааХХадаса	хаххааахса	ххххассхса	саааахсааа	ахахдсаааа	780
хахахаасах	ххххсаххах	асахсссхсх	ссхдсааааа	хсадахсааа	хаадасаааа	840
аааааахаах	хаасааахса	ааддхахааа	ааахдаадаа	хааддаааах	ааааахаааа	900
хдассахсах	ддаахахсхс	ааадХдддХХ	хххахаддхд	хаахахххад	дадххахаах	960
ххххахахха	аахаххххда	аддххахдаа	хахдаааддх	хаддадххад	даддхдхаах	1020
дххсаххаас	хаахххахха	ахадсаахах	ахахахасас	асахаахахх	аххдхдхааа	1080
аадааахаах	схаааааасс	схххххахха	ааахааааах	ахахаххххх	схсахсаххд	1140
адасахдсса	сахаддсхда	ХХдаадаХсс	хсахххахах	ахахаххдах	ххахссааах	1200
сасххадада	хдхдххдсхх	адххххаааа	дддааасхаа	дххдадахаа	ахаааадахх	1260
сахахххсха	дасхсасхха	дадаадхдса	схсаахсдхс	ахсасххадд	ххсааахдаа	1320
ххсддхсааа	аахаадсхса	аааххдхдас	схххаадххх	аааададсаа	дахсааааха	1380
адсхахаааа	аххдааххха	аххахаахсс	дхссадххсх	ахсдаададд	схссхххсса	1440
ахаахдаахс	хсхссахххс	схсддаххах	схахсасада	сахдхсссах	аххдаасаах	1500
хххааддада	ххххасдхаа	ахххдахдда	схсдааадхх	ааххасххдх	дхахахххха	1560
ахххдсааха	ххахсхахсх	хасхаааххх	хаддхдхххс	хааахахдсх	хадахаадхд	1620
хахххсадах	дсахаддаха	ааахххаддх	дхаасхдахх	ххдхахахах	хахаххсаад	1680
хаааххсаха	хдхахсхада	ахахахадха	ааххаддххс	дссдсхсххс	дахсххасдх	1740
дхсасхсхсс	ХдХдааХХХд	дхахсссаха	хасаадааас	асдхдхссхс	хаадхадхса	1800
ахахххххдх	ссассааасд	дсадааддхх	хадахадххх	сассадааас	сххадсаасх	1860
адаадасдсс	асххдхссха	хсхссасахс	схасхддхсс	сассхассса	сдсааааХаа	1920
ахдхсдахсх	хааххааааа	сххааааххд	хасхссхссх	ссхххсдхха	ххахххдсах	1980
аахххххахх	хххаааххха	ааххахасаа	аххххаахха	асахххаада	хдхххххаха	2040
аааааххаса	ахххахадха	схххххааах	хааахаххха	аахххххдхх	хаассхххдх	2100
асаххаххаа	хасаасдсах	хаахаассхх	дахаххаххс	дхахассхаа	дххсаааада	2160
адддхассдх	ассааасаад	асдххдаххх	хххдахаахх	даахаадааа	хаааххххах	2220
ххдахахаас	ххахахахха	хаххаасаах	ххаааааххс	дааХассдХа	хаасхаахсх	2280
ххахахааах	ххаххсахаа	ххахххххха	саххаххаах	аххххасахс	аххххаахха	2340
адхаххахаа	аадаааддаа	хааххаахаа	ХсасдСаааа	хаххххсдсс	асдхаххххс	2400
ххсххссххс	ахссахассд	сссасдхдхх	хсадхссхсд	хссхасхсах	саххддсдхх	2460
ххсахсхххд	даасхсаасс	адссдсххса	ХсаХсдссас	дхддсахааа	хсаахсахсс	2520
хахххсхахс	саасддххса	ххххсхсхсх	асасххххдх	ххаахддххс	ааххсхсхах	2580
хасхххсхсх	схсхххххдд	ассдааххас	дсаааахахс	ххахасхасх	хссдххххах	2640
аахсххсдса	аХдсадХсас	сдхсххсаса	ХХааа ахд ахх дах аас мех ίίе Азр азп	дХХ ааа Уа! Ьуз	2693

5

ддх б!у

ахд ссд ссд дса асе дад

ааа ддх хде сдд ХХа асд дед ххд аха

2741

мех Рго

Рго А1а тНг 10

С1и

хуз с!у Суз Агд хеи 15

ТКг

А1а 20

Хеи

Не

дах

хсс

дд* С1у

дда С1у

сха

дса

даа

дха

дах

ехд

адх

дад

аад

дад

саа

аах

2789

Азр

Зег

хеи

А1а

б!и

уа!

АЗр

хеи

зег

б1и

хуз

б!и

б1п

АЗП

25

30

35

хсх

асх

еда

едх

адд

еда

ххд

дах

даа

сдх

ххд

**9

ааа

Хсд

асд

асх

2837

5ег

тКг

Агд

Агд

Агд

Агд

хеи

АЗр

61 и

Агд

Хеи

хеи

хуз

зег

тКг

тКг

40

45

50

дад

сха

ссд

даа

аах

ххе

дах

дгс

ххе

дса

дах

дах

Хас

адд

сах

хдх

2885

о!и 55

хеи

Рго

С1и

Азп

РНе 60

Азр

Уа1

РКе

А1а

Азр 65

Азр

туг

Агд

нтз

суз 70

аад

адд

ааа

ааа

адх

асх

дха

асх

дах

асх

дах

дах

с ах

еда

дхх

саа

2933

ьуз

Агд

хуз

хуз

Зег 75

ТНг

уа!

тКг

Азр

ТЬг 80

Азр

АЗр

нтз

Агд

Уа! 85

б1п

сха

дед

ХХа

хсх

адх

даа

ааа

ааа

дха

адд

дад

аде

ххд

№

асд

2981

сей

а! а

Хеи

5ег

5ег

б!и

Хуз

хуз

Уа!

Агд

б!и

5ег

хеи

тКг

90

95

100

тдс

хдх

хса

сах

дда

кд

аха

хед

ххд

ах с

ддс

едд

ада

адд

даа

ахд

3029

СУ5

Суз

Зег

Н15

оТу

зег

Пе

Зег

Ьеи

11е

С1у

Агд

Агд

Агд

о! и

мех

105

110

115

даа

дах

дед

дхд

дед

аХХ

хах

ссд

хдх

ххх

ХХС

адх

даа

ддс

ддс

зде

3077

Οΐυ

Азр

а! а

УаТ

АТа

И е

Туг

Рго

суз

РКе

РНе

Зег

01 и

сТу

сТу

оТу

120

125

130

ддс

ддс

аде

адд

адд

хах

дах

хах

ХХХ

ддх

дхх

хас

дас

ддд

сах

дда

3125

С1у 135

оТу

Зег

Агд

Агд

туг 140

Азр

туг

рНе

сТу

уа1 145

туг

Азр

оТу

Н15

оТу 150

ддд

хса

едх

дХа

дед

аас

дхд

хде

едх

дас

ХХХ

ххд

сас

едх

хха

дхд

3173

О1у

Зег

Агд

Уа!

А! а

АЗП

УаТ

Суз

Агд

Азр

РНе

Ьеи

Ηί 5

Агд

Ьеи

уа1

155

160

165

аха

сад

саа

дхх

гсд

даа

дда

даа

дах

Хае

дах

ддд

аад

адх

ахх

аас

3221

Пе

С1п

о!п

уа!

Зег

с! и

оТу

о! и

Азр

туг

Азр

оТу

ьуз

зег

П е

АЗП

170

175

180

хдд

дад

ааа

дхх

ахд

асд

дад

адх

ххе

едх

ааа

ахд

дас

даа

аад

дхд

3269

тгр

с! и

ьуз 185

Уа!

мех

тКг

с! и

зег 190

рНе

Агд

ьуз

мех

Азр 195

01 и

ьуз

уа!

аас

аад

даа

ддд

дед

дад

аХд

дед

асд

аха

дда

хса

асд

дед

дхд

дха

3317

АЗП

Ьуз

01 и

01у

а! а

о! и

мех

А1а

тпг

Пе

01 у

5ег

ТКг

А1а

УаТ

Уа1

200

205

210

дед л1а

№

дда о!у

дад с!и

даа О1и

ххх рНе

дхх Уа1

дхх Уа1

дед АТа

аах Азп

хдх суз

дда оТу

дах Азр

хса Зег

3365

215

220

225

230

ада

дсх

дха

схх

хса

едх

дсх

дда

дхх

дсс

дха

ссх

ххд

ХсХ

ахх

дах

3413

Агд

А1а

УаТ

ьеи

Зег

Агд

А! а

оТу

Уа!

а! а

уа!

Рго

Феи

Зег

Не

Α5Ρ

235

240

245

саг аад дхасасдххх ххаахсхааа ххдадххаад атхааххсаа схгахтаааа 3469

Н15 Хуз

хххадахххх ааааадххах ахдаааааха ххадхадххд хсаххдхххс ххахаххдах	3529
даааааахах аеххаххааа ссхааааххх дсадаадасд аасасхххах хххххсхссх	3589
ххедхххдеа ахххаххадх хххаехххеа ххеххххахе хахдхаадаа адаахахахс	3649
ххххххххеа аххехххаах хсхахххххх аахахсасах аххххдххах аахххахаха	3709
ахахххххад хахаааахед хаадассдаа хххахххахх ххххеахххх дхдхссадха	3769
аааахсаааа сдхасасххх хсхаааадах ахддехдхда ахаахдхсаа аддаххадсс	3829
схасхсааас асдаасааад аедхдхедхх ахааххххас хххахахххх хххедххдха	3889
аахссхссха хахаассасд дддссхддса аехххддхах дееххххахх хаасасхдхх	3949
аХХдсадХда Хсххаасхсд ссдааддхсх аахдххдхах дддхедххеа асахахаахх	4009
ааасхдасаа сдадхаахда хахдахсадх аххеадхдах хдахдххадс схххадсдсх	4069
дсдддхдахс аахдеххаад ассахсааах хдааахссхд аахххдедхд хадахахдах	4129
адддаХдааХ хааеххддхх ахаааааехх схсхсдасах ххдахадхде саадхадахх	4189
дхсхххдахх хххдааахдд аахдехххех дххдаеддад ххеехдхахд ддсдсад	4246
ссх дас ада ссх дах дад ехд дах ада ахх даа аах хса ддх ддд ааа	4294

Рго Азр Агд Рго Азр С1и ьеи Азр Агд 11е о1и Азп 5ег с!у о1у ьуз 250 255 260 дхс аха аах хдд аах даа саа ада дхс хха дда дхх схх дсх асх хса 4342

Уа1 11е Азп тгр Азп оТу 01п Агд уа! Ьеи оТу Уа! ьеи А1а тКг зег

265 270 275 280 ада хсс аха д дхасдхсдаа дасхсадсхх асхдсасххд хаддхсхххс 4392

Агд 5ег 11е ссхааххсах хсхсахсххх дхсдаддсаа ссаасадааа хддахахдас ааахсадахс 4452 аххаххдаха аасхадсхдс хддаааххдд ааХдаХаХХд хдсаасахха ххахдхадсс 4512 ссхдассадх ссдххасааа ссхссааххд ааасаххасх ааххахсхха сххдххсдхд 4572 дсададсхда хсдхадхааа хсахдсххсх хахдахассх хаххдаххда хдахдссад 4631

9? С1у

дах Азр 285

ахд хас схс ааа ссд хас дхд

аха сса дах ссх даа дхд аха

4678

мех

туг ьеи Ьуз

Рго 290

туг

Уа1

11е Рго Азр 295

Рго 01и

Уа1

Пе

дхх

аде

ааа

ада

аде

дах

даа

дах

дад

ХХС

хха

аха

схх

дса

адх

дах

4726

Уа1

Зег

ьуз

Агд

Зег

Азр

01 и

Азр

О! и

рКе

хеи

Пе

хеи

А1а

Зег

АЗр

300

305

310

315

ддс сТу

сха

хдд

дах

дхс

ахх

сса

аах

дах

д«

дед

хдх

дас

дхх

аса

ада

4774

иеи

тгр

АЗр

Уа1

11е

Рго

Азп

Азр

Уа1

а! а

Суз

Азр

Уа1

тКг

Агд

320

325

330

ада

хдс

ххд

аах

ддх сТу

саа

асд

ххе

ада

адд

хдс

дах

саа

саа

асе

ааа

4822

Агд

Суз

ьеи

АЗП

С1п

ТКг

РКе

Агд

Агд

суз

Азр

С1п

О1п

ТКг

хуз

335

340

345

хсс

хах

аад

ада

дах

даа

ддс оТу

дхс

ааа

даа

адх

схс

дса

дса

едд

дса

4870

Зег

туг

хуз

Агд

АЗр

С1и

Уа1

хуз

01 и

Зег

хеи

А1а

А1а

Агд

А1а

350

355

360

дсх

хсс

ХХС

схх

дса

дад

хха

дса

ахх

дсх

едд

ддх оТу

адх

адд

дах

аас

4918

а! а

зег

РКе

Хеи

а! а

С1и

хеи

А1а

Пе

А1а

Агд

Зег

Агд

Азр

АЗП

365

370

375

ах с

аде

дха

ахх

дхс

дхс

аах

ххд

аах

ада

ХСХ

дха

едх

Хса

хсс

ахх

4966

11 е

Зег

уа!

Пе

уа!

Уа!

Азп

Хеи

АЗП

Агд

Зег

Уа!

Агд

Зег

зег

Пе

380

385

390

395

дах адх хаа дсххсссаха сааахдааса аххххасдда хддахсхххс 5015

Азр 5ег

еххххдаххд	хсхдсадсаа	хассаххасх	дееххдеххд	еххдххххех	ххххеххххх	5075
ххххссаххх	адаехдххах	хддссххддх	хаххсасахх	хдаахдаххх	ххаасхдаса	5135
ддххадххде	хдхаахддаа	дхсхххдаад	ххассаассх	саассахаса	хххххххасх	5195
аасаадаххд	асдааххсах	аахххххххд	хххедхаххх	дхаехдхххе	аасххссада	5255
ххееххаахд	адасахдаха	асаадсаасс	хасахххаса	дхххахедха	аххсасхдаа	5315
дххассаадс	ахххахсада	аададхааха	хахаддссаа	хдсдхдхсах	дасахадххх	5375
аххсдадхсх	саахахааас	хаададаада	дхассахаса	ахадахахад	садхадхдаа	5435
ассхдсахах	хасахдххаа	хдхсххсаах	дхххаахасс	ааахасааас	сасахадаха	5495
ааХадссаса	хсхасахххс	ехдехдехах	дсдхдхдаса	адхдддаадд	ахахддххда	5555

- 37 025000 дсххасхсса дсадсаадда ааадааахдд дхааххаахх хсахадаааа хдсассххсх 5615 хааахсххда схссасхссс хдсддаасдх дддсхахсдс ддадассдсх сассхсссхс 5675 сххааааа 5683 <210> 12 <211> 23 <212> ΟΝΑ <213> АгХтТтста1 Зечиепсе <220>

<223> Ропчагд рптег 3863 <400> 12 дхдасдхдсх дххсасахдд ахс 23 <210> 13 <211> 22 <212> ΡΝΑ <213> АгхтЯста1 зециепсе <220>

<223> ΚβνβΓδβ ргттег 3861 <400> 13

Хасддааасх сХссдХсаХа ас 22 <210> 14 <211> 1200 <212> ϋΝΑ <213> ЗоТапит ХиЬегозит <400> 14

ахдаххдаха	асдххааадд	хххдссдссд	дхадссдааа	ааддххдссд	дххаасддсд	60
ххадхддахх	ссддсддасХ	адсадаадХа	даХсХдадХд	адааддадсс	ааахххсасх	120
сдхсдхаддс	даххдаахда	асдхсддххд	ааахсдхсдс	схдассхасс	ддаааахххс	180
аахдхсххсд	ссдсхдахха	саддсаххах	аадаадаааа	аассддаааа	садхассдха	240
асхдахасхд	ахдахсаадх	хсаасхадсд	асахсхадхд	аадхдааааа	адхаадддад	300
адсххддхса	сдхдсхдххс	асахддахсд	ахахсдххда	хсддссддад	аадддааахд	360
даадахдсдд	хддсдаххха	хссдадхххх	ххсадхдаад	дсадсадсад	даадхасдах	420
хаххххддхд	ХХХасдасдд	дсахддаддд	хсасдхдхад	сдсасдсдхд	ссдхдасххх	480
ххдсассдхх	хадхдахаса	дсаадхххсд	дааддадаад	аххахдахдд	даададхахх	540
ааххдддада	ахдххахдах	ддададхххс	сдхаааахдд	асдааааддх	даасааддаа	600
ддддсддада	ХддсдасдаХ	аддахсаасд	дссдххдхад	сддхддхсдд	ададдаддаа	660
хххдххдххд	сдаасхдхдд	адаххсаада	дсхдхдсххх	сасдхдсхдд	адххдсадха	720
ссхххдхсха	ххдахсахаа	дссхдасада	ссхдахдадс	хддахадаах	хдааааххса	780
ддхдддааад	хсахаааххд	даахддасаа	ададхсххад	дадххсххдс	хасххсаада	840
хссахаддхд	ахахдхассх	сааассахах	дхсаххссад	ахссхдаадх	сххадххадс	900
сааадаадхд	ахдаадахда	аххсххахха	сххдсаадхд	ахддхсхахд	ддахдхсахх	960

ссааахдахд ххдсдхдхда сдххасаада адахдсххда ахддхсааас дххсаддадд 1020 хдхдассаас ааассааахс ссахаадада дахдахсадх саадхдаадд хдхсааадаа 1080 адхсхсдсад сасдадсадс ххссххссхх дсададххдд сааххдсхсд дддхадхадд 1140 дахаасахса дхдхааххдх сдхсдахххд аахадахсхд хахдххсахс сасхдасхда 1200 <210> 15 <211> 399 <212> РКТ

<213> 5о1апит ХиЬегозит

<400> 15

мех

11е

А5р

АЗП

Уа1

ьуз

61 у

ьеи

РГО

РГО

Уа1

А1а

б1и

ьуз

б1у

суз

1

5

10

15

Агд

ьеи

ТЬг

А1а

Ьеи

Уа1

А5р

зег

61 у

61 у

ьеи

А1а

61 и

Уа1

АЗР

Ьеи

20

25

30

зег

С1и

ьуз

<51 и

РГО

АЗП

РЬе

тЬг

Агд

Агд

Агд

Агд

ьеи

АЗП

61 и

лгд

35

40

45

Агд

ьеи

ьуз

5ег

зег

Рго

Азр

ьеи

Рго

б1и

АЗП

РЬе

АЗП

Уа1

РЬе

А1а

50

55

60

А1а

А5р

туг

Агд

нтз

Туг

ьуз

ьуз

ьуз

ьуз

Рго

б!и

АЗП

зег

тЬг

Уа1

65

70

75

80

ТЬг

А5Р

ТЬг

Азр

Азр 85

б!п

Уа1

6ΐη

ьеи

А1а 90

ТЬг

Зег

Зег

б1и

Уа1 95

ьуз

ьуз

Уа1

Агд

<31 и

Зег

ьеи

Уа1

ТЬг

суз

Суз

Зег

НТЗ

б!у

Зег

Не

зег

100

105

110

ьеи

Пе

<31 у

Агд

Агд

Агд

б!и

мех

б!и

АЗР

А1а

Уа1

А1а

Не

Туг

РГО

115

120

125

зег

РЬе

РЬе

Зег

<31 и

б1у

Зег

Зег

Агд

ьуз

Туг

АЗр

Туг

РЬе

61 у

уа1

130

135

140

ТУГ

АЗр

<31 у

НТЗ

<31 у 61 у

Зег

Агд

Уа1

А1а

Н15

А1а

Суз

Агд

А5р

рЬе

145

150

155

160

Ьеи

НТЗ

Агд

Ьеи

Уа1

Не

6ΐη

б1п

Уа1

Зег

б!и

б1у

б!и

Азр

ТУГ

Азр

165

170

175

б!у

ьуз

Зег

11е

АЗП

Тгр

С1и

АЗП

Уа1

мех

мех

б1и

Зег

РЬе

Агд

ьуз

180

185

190

мех

АЗР

<51 и

1-УЗ

уа!

АЗП

ьуз

б1и

б!у

А1а

б!и

мех

А1а

ТЬг

Пе

б1у

195

200

205

зег

ТЬг

А1а

Уа1

Уа1

А1а

Уа1

Уа1

б!у

б1и

б!и

б1и

РЬе

Уа!

Уа1

А1а

210

215

220

А5П

СУ5

сТу

А5р

5ег

Агд

а! а

уа!

иеи

5ег

Агд

а! а

с! у

уаТ

а! а

Уа!

225

230

235

240

Рго

Ьеи

5ег

Не

Азр 245

НтЗ

Ьуз

РГО

АЗр

Рго

Азр

СТ и

иеи

Агд

11е

с1и

АЗП

5ег

С! у

б1у

ьуз

уа1

11 е

АЗП

Тгр

АЗП

с! у

с! η

Агд

Уа1

260

265

270

иеи

С1у

Уа1

иеи

а! а

тНг

зег

дгд

5ег

Не

С1у

А5р

мет

туг

иеи

иуз

275

280

285

Рго

Туг

Уа!

Пе

Рго

Азр

Рго

<31 и

уа!

иеи

уа!

зег

<31 п

Агд

Зег

А5Р

290

295

300

сТи

Агр

с! и

рНе

иеи

иеи

иеи

а! а

зег

Азр

с! у

иеи

тгр

Азр

УаТ

Пе

305

310

315

320

РГО

А5П

Азр

уа!

л!а

су 5

Азр

уа!

тНг

Агд

Агд

Суз

иеи

АЗП

с1у

СТп

325

330

335

тЬг

РНе

дгд

Агд

Су$

А$р

сТп

сТп

ТНг

иуз

зег

НТ 5

ЬУ5

Агд

АЗр

АЗр

340

345

350

СТп

5ег

5ег

С! и

у

Уа!

Ьуз

С1и

Зег

иеи

а! а

А1а

Агд

А1а

А1а

Зег

355

360

365

рЬе

иеи

д!а

сТи

иеи

АТа

П е

АТа

Агд

С1у

Зег

Агд

Азр

АЗП

Пе

зег

370

375

380

УаТ

Пе

уа!

Уа!

Азр

иеи

АЗП

Агд

зег

уа!

Суз

зег

зег

тНг

Азр

385

390

395

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (10)

1. Нетрансгенное растение 8о1аиит ксорегЧснт, обладающее повышенной засухоустойчивостью по сравнению с растением дикого типа, содержащее в своем геноме аллель 8о1аиит 1усорег8юит РР2С1 (81РР2С1), кодирующий белок, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности 8ЕО ГО N0: 2, и при этом содержит аминокислотную замену О1у148Агд, 8ег171Ьеи, А1а155ТЬг или О1у1328ег.

2. Растение по п.1, в котором указанный мутантный аллель 81РР2С1 присутствует в гомозиготной форме.

3. Растение по п.1 или 2, в котором симптомы увядания листьев указанного растения снижаются по меньшей мере на 10% по сравнению с симптомами увядания листьев растения, содержащего в своем геноме аллель 81РР2С1 дикого типа, когда растения подвергаются одинаковому стрессу, вызванному засухой.

4. Растение по любому из предыдущих пунктов, где растение представляет собой гибридное растение.

5. Растение по п.1, представляющее собой нетрансгенное, устойчивое к засухе растение томата, получаемое подходом ориентации индуцированных локальных поражений в области геномики (ТГОЬШО), содержащее в своем геноме мутантный аллель 81РР2С1.

6. Часть растения, в том числе плод или семя, по любому из предыдущих пунктов.

7. Применение последовательности нуклеиновой кислоты, представляющей собой аллель, кодирующий белок 81РР2С1, для создания нетрансгенных растений с повышенной засухоустойчивостью по сравнению с растением дикого типа, в котором белок 81РР2С1 имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности 8Е0 ГО N0: 2, и при этом содержит аминокислотную замену 01у148Агд, 8ег171Ьеи, А1а155ТЬг или 01у1328ег.

8. Семена томата, содержащие в их геноме мутантный аллель 81РР2С1, отличающиеся тем, что указанный мутантный аллель кодирует белок 81РР2С1, содержащий аминокислотную замену 01у148Агд, 8ег171Ьеи, А1а155ТЬг или 01у1328ег.

9. Способ переноса мутантного аллеля 81РР2С1 на другое растение, включающий стадии:

а) предоставление растения по любому из пп.1-6;

б) скрещиваниеуказанного растения с другим растением того же вида и

в) получение семян после указанного скрещивания.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что дополнительно включает стадии:

г) самоопыление или дополнительное скрещивание растений, полученных из семян по стадии в); и

д) выбор потомства, которое имеет в составе указанный мутантный аллель и обладает повышенной засухоустойчивостью.