EA022993B1 - Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие альфа- и бета-цепи фолликулостимулирующего гормона человека (fsh) - Google Patents
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие альфа- и бета-цепи фолликулостимулирующего гормона человека (fsh) Download PDFInfo
- Publication number
- EA022993B1 EA022993B1 EA201070071A EA201070071A EA022993B1 EA 022993 B1 EA022993 B1 EA 022993B1 EA 201070071 A EA201070071 A EA 201070071A EA 201070071 A EA201070071 A EA 201070071A EA 022993 B1 EA022993 B1 EA 022993B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- nucleic acid
- nucleotide sequence
- acid molecule
- ιιιιι
- recombinant nucleic
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 152
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 51
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 51
- 102000003864 Human Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 title claims abstract 5
- 108010082302 Human Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 title claims abstract 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 99
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 94
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 claims abstract description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 40
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 39
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 33
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 28
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 2
- ZXVONLUNISGICL-UHFFFAOYSA-N 4,6-dinitro-o-cresol Chemical compound CC1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O ZXVONLUNISGICL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101000658124 Apomastus schlingeri Mu-cyrtautoxin-As1a Proteins 0.000 claims 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims 1
- 240000005499 Sasa Species 0.000 claims 1
- 101000986389 Spodoptera exigua Paralytic peptide 3 Proteins 0.000 claims 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 abstract description 2
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 abstract description 2
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 abstract description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 5
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 5
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 5
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 4
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- YQNRVGJCPCNMKT-LFVJCYFKSA-N 2-[(e)-[[2-(4-benzylpiperazin-1-ium-1-yl)acetyl]hydrazinylidene]methyl]-6-prop-2-enylphenolate Chemical compound [O-]C1=C(CC=C)C=CC=C1\C=N\NC(=O)C[NH+]1CCN(CC=2C=CC=CC=2)CC1 YQNRVGJCPCNMKT-LFVJCYFKSA-N 0.000 description 3
- 101100462537 Caenorhabditis elegans pac-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 101100117764 Mus musculus Dusp2 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001033280 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit beta Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000010413 gardening Methods 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 102000055647 human CSF2RB Human genes 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102100021283 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150011812 AADAC gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100324465 Caenorhabditis elegans arr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100366936 Caenorhabditis elegans sto-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000675558 Homo sapiens 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010058359 Hypogonadism Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 1
- DUUJYQYCUIUXTN-UHFFFAOYSA-N SSSSSSSSSSSS Chemical compound SSSSSSSSSSSS DUUJYQYCUIUXTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RRTCJVBFMMTZSS-UHFFFAOYSA-N SSSSSSSSSSSSS Chemical compound SSSSSSSSSSSSS RRTCJVBFMMTZSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100373124 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) wis1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004198 anterior pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- -1 ascorbic acid Chemical compound 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GIXWDMTZECRIJT-UHFFFAOYSA-N aurintricarboxylic acid Chemical compound C1=CC(=O)C(C(=O)O)=CC1=C(C=1C=C(C(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C(C(O)=O)=C1 GIXWDMTZECRIJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000001456 gonadotroph Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000003368 hypogonadotropic hypogonadism Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α- и β-цепь фолликулостимулирующего гормона человека (FSH) соответственно, которые модифицированы в отношении использования кодонов в клетках CHO. Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей такие последовательности нуклеиновых кислот, и к клеткам-хозяевам, содержащим такие рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, а также к их применению при получении рекомбинантного FSH человека. В заключение, настоящее изобретение также относится к способу получения клеток-хозяев, экспрессирующих фолликулостимулирующий гормон человека, посредством трансфицирования клеток в суспензионной культуре в условиях отсутствия сыворотки рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.
Description
Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α- и β-цепь фолликулостимулирующего гормона человека (Р8Н) соответственно, где последовательность нуклеиновой кислоты модифицирована в отношении использования кодонов в клетках СНО, по сравнению с последовательностью нуклеиновой кислоты Р8Н человека дикого типа.
Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей такие последовательности нуклеиновых кислот, и к клеткам-хозяевам, содержащим такие рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, а также к их применению при получении рекомбинантного Р8Н человека.
В заключение, настоящее изобретение также относится к способу получения клеток-хозяев, экспрессирующих фолликулостимулирующий гормон человека посредством трансфицирования клеток в суспензионной культуре в условиях отсутствия сыворотки рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.
Фолликулостимулирующий гормон (Р8Н) продуцируется гонадотропными клетками передней доли гипофиза и высвобождается в кровоток. Р8Н действует вместе с лютеинизирующим гормоном (ЬН) при регуляции созревания ооцитов у женщин и сперматогенеза у мужчин. Как Р8Н, так и ЬН принадлежат к семейству гетеродимерных гликопротеинов, которые состоят из двух нековалентно связанных α- и βцепей, которые кодируются отдельными генами. В то время как последовательности аминокислот α-цепи Р8Н и ЬН являются идентичными, последовательности аминокислот β-цепи у двух белков отличаются. Как α-, так и β-цепи являются гликозилированными. α-цепь Р8Н имеет два потенциальных аспарагинсвязанных сайта гликозилирования в положениях 52 и 78, в то время как β-цепь Р8Н имеет два потенциальных аспарагинсвязанных сайта гликозилирования в положениях 7 и 24 (О1ууе с1 а1. (1996) Мо1. Нит. Кергоб. 2(5): 371-382).
Р8Н человека используют для лечения женщин с отсутствием овуляции, для стимулирования мультифолликулярного развития (суперовуляции) и при подготовке к искусственному оплодотворению, такому как 1УР (оплодотворение ίη νίίτο), О1РТ (перенос гаметы в маточную трубу) или ΖΙΓΤ (перенос зиготы в маточную трубу). Кроме того, Р8Н человека используют для стимулирования созревания фолликул у женщин с низкой выработкой Р8Н или с его отсутствием и для стимулирования сперматогенеза у мужчин с врожденным или приобретенным гипогонадотропным гипогонадизмом.
Первоначально, Р8Н для медицинских использований очищали из постменопаузальной мочи человека. Однако этот очищенный Р8Н имеет тот недостаток, что он также содержит ЬН и другие загрязняющие белки человеческого происхождения. Кроме того, использование такого природного источника накладывает ограничения на доступность и однородность продукта.
С развитием технологии рекомбинантных ДНК стало возможным продуцирование Р8Н человека в культурах клеток, трансфицированных последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующих α- и βцепи. Последовательности ДНК, кодирующие α- и β-цепи, и способы получения рекомбинантного Р8Н человека описываются, например, в νθ 88/10270, νθ 86/04589 и в ЕР 0735139.
В настоящее время на рынке в Германии имеются два коммерческих продукта рекомбинантного Р8Н человека, а именно ΟΟΝΛΕ-Р® и ΡυΚΕΟΟΝ®, оба из которых получают посредством экспрессии ДНК дикого типа, кодирующих α- и β-цепи в клетках СНО.
Однако по-прежнему сохраняется необходимость в оптимизации экспрессии цепей Р8Н для улучшения выхода и скорости экспрессии Р8Н для данного количества клеток. Таким образом, в основе настоящего изобретения лежит проблема создания последовательности нуклеиновой кислоты и рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот, с помощью которых рекомбинантный Р8Н человека может быть получен в больших количествах в эукариотических клетках.
В соответствии с настоящим изобретением эта и другие задачи решены посредством признаков, представленных в независимом пункте формулы изобретения.
Преимущественные варианты осуществления охарактеризованы в зависимых пунктах формулы изобретения.
В соответствии с настоящим изобретением молекулы нуклеиновых кислот, содержащие модифицированные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих α- и β-цепи Р8Н человека, которые адаптированы в отношении использования кодонов в клетках яичников китайских хомячков (СНО), используют для трансфицирования клеток СНО и приводят к значительному увеличению продуцирования Р8Н в трансфицированных клетках СНО.
В контексте настоящего изобретения термин увеличение продуцирования Р8Н относится к ситуации, когда при экспрессии модифицированной последовательности нуклеиновой кислоты в клеткехозяине, в клетке-хозяине продуцируется большее количество Р8Н по сравнению с ситуацией, когда немодифицированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая Р8Н с такой же последовательностью аминокислот, экспрессируется в таком же типе клеток-хозяев при сходных условиях, таких, например, как сравнимые процедуры трансфицирования, сравнимые векторы экспрессии и тому подобное.
- 1 022993
Генетический код является избыточным, поскольку 20 аминокислот определяются с помощью 61 триплетного кодона. Таким образом, большинство из 20 протеиногенных аминокислот кодируются с помощью нескольких основных триплетов (кодонов). Однако кодоны, которые описывают конкретную аминокислоту, не используются с такой же частотой в конкретном организме, но имеются предпочтительные кодоны, которые используются часто, и редкие кодоны, которые используются не так часто. Упоминаемые различия в использовании кодонов связываются с понижением селективного эволюционного давления и, в частности, эффективности трансляции. Одна из причин более низкой эффективности трансляции редко встречающихся кодонов могла бы заключаться в том, что соответствующие пулы аминоацил-ίΡΗΚ обеднены и по этой причине не являются более доступными для синтеза белка.
Кроме того, различные организмы предпочитают различные кодоны. Таким образом, например, экспрессия рекомбинантных ДНК, происходящих из клеток млекопитающих, в клетках Е.соП часто происходит только субоптимально. По этой причине замена редко используемых кодонов на часто используемые кодоны может улучшить экспрессию в некоторых случаях.
Для многих организмов последовательность ДНК большого числа генов является известной, и имеются таблицы, из которых может быть получена частота использования конкретных кодонов в соответствующем организме. Посредством использования упоминаемых таблиц последовательности белков могут быть относительно точно транслированы обратно, с образованием последовательностей ДНК, которые содержат кодоны, предпочтительные в соответствующем организме для различных аминокислот белка. Таблицы для использования кодонов могут, среди прочего, быть найдены на следующих интернет-адресах:
1П(р:/Лс\с\у.ка/и5а.огар./кодон/тбех.1Пт1 или
1П(р:/Лс\с\с.еп(е1ес1юп.сот/епбех.р1ю?1б=(оо15/тбех.
Имеются также программы, доступные для обратной трансляции последовательности белка, например последовательности белка α- или β-цепи ΡδΗ человека, с образованием вырожденной последовательности ДНК, подобные, например, программам на сайте
ЬЬЬр: //мим, епЬеТесЬоп. сот/епд/ЬаскЬгап51аЫоп ЬЬш!
Термин последовательность нуклеиновой кислоты для целей настоящего изобретения относится к любой молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептиды, такие как пептиды, белки и тому подобное. Эти молекулы нуклеиновых кислот могут быть получены из ДНК, РНК или их аналогов. Однако молекулы из нуклеиновых кислот, получаемые из ДНК, являются предпочтительными.
Специалист в данной области, несомненно, знает, что модификация исходной нуклеотидной последовательности описывает процесс оптимизации по отношению к использованию кодона.
Если кодирующая последовательность чужого фермента дикого типа подбирается, например, для использования кодона клеток СНО, внесенные изменения могут легко идентифицироваться посредством сравнения модифицированной последовательности и исходной последовательности (см. фиг. 1а и 1Ь). Кроме того, обе последовательности будут кодировать одну и ту же последовательность аминокислот. Последовательность аминокислот α-цепи ΡδΗ человека показана в δΕΟ ГО Ио. 5 и последовательность аминокислот β-цепи ΡδΗ человека показана в δΕΟ ГО Ио. 6. Эти последовательности аминокислот соответствуют последовательности аминокислот α- и β-цепи ΡδΗ человека дикого типа, депонированным под номером доступа 1 00152 в базе данных ЕМВЬ и под номером доступа ИМ 000510 в базе данных ИСВ1 соответственно.
В случае α-цепи ΡδΗ человека исходная последовательность нуклеиновой кислоты показана в δΕΟ ГО Ио. 3, а в случае β-цепи ΡδΗ человека исходная последовательность нуклеиновой кислоты показана в δΕΟ ΙΌ Ио. 4.
В соответствии с настоящим изобретением последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая α-цепь ΡδΗ человека, модифицируется по отношению к использованию кодона в клетках ΟΗΟ по меньшей мере в 30 положениях, предпочтительно по меньшей мере в 40 положениях, особенно предпочтительно по меньшей мере в 50 положениях, также особенно предпочтительно по меньшей мере в 60 или 70 положениях, а наиболее предпочтительно по меньшей мере в 75 положениях по сравнению с исходной последовательностью.
Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая β-цепь ΡδΗ человека, модифицируют по отношению к использованию кодона в клетках ΟΗΟ по меньшей мере в 25 положениях, предпочтительно по меньшей мере в 30 положениях, более предпочтительно по меньшей мере в 40 положениях, особенно предпочтительно по меньшей мере в 50 положениях, также особенно предпочтительно в 60 положениях, а наиболее предпочтительно по меньшей мере в 65 положениях по сравнению с исходной последовательностью.
Наиболее предпочтительно модифицированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая β-цепь ΡδΗ человека, представляет собой кодирующую область последовательности нуклеиновой кислоты, приведенную в δΕΟ ГО Ио. 1, или последовательность нуклеиновой кислоты, которая идентична кодирующей области последовательности нуклеиновой кислоты, приведенной в δΕΟ ГО Ио. 1, по меньшей мере на 98% по всей кодирующей области. В δΕΟ ГО Ио. 1 кодирующая область начинается с
- 2 022993 нуклеотида 56 и простирается до нуклеотида 442.
Наиболее предпочтительно оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая α-цепь ΡδΗ человека, представляет собой кодирующую область последовательности нуклеиновой кислоты, приведенную в 8ЕО ГО Νο. 2, или последовательность нуклеиновой кислоты, которая идентична кодирующей области последовательности нуклеиновой кислоты, приведенной в 8ЕО ГО Νο. 2, по меньшей мере на 98% по всей кодирующей области. В 8ЕО ГО Νο. 2 кодирующая область начинается с нуклеотида 19 и простирается до нуклеотида 366.
Термины немодифицированная последовательность нуклеиновой кислоты, последовательность нуклеиновой кислоты дикого типа или исходная последовательность нуклеиновой кислоты для целей настоящего изобретения относятся к последовательности нуклеиновой кислоты, которая предназначена для использования для (сверх)экспрессии в клетке-хозяине и которая не адаптирована в отношении использования кодона в клетке-хозяине, но представляет собой действительную последовательность нуклеиновой кислоты дикого типа, кодирующую белок.
Термины модифицированная последовательность нуклеиновой кислоты или оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты для целей настоящего изобретения относятся к последовательности, которая модифицирована для экспрессии в клетке-хозяине посредством адаптирования последовательности немодифицированной/исходной последовательности нуклеиновой кислоты в отношении использования кодона клетки-хозяина. Модифицированная или оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует белок, имеющий такую же последовательность аминокислот, что и белок, кодируемый немодифицированной последовательностью.
Идентичность последовательностей определяют с помощью ряда программ, основанных на различных алгоритмах. В настоящем изобретении алгоритмы №еб1етап и УипксН или §тйй и \Уа1егтап дают особенно надежные результаты. Для сравнения последовательностей используют программу РбеИр (Репд апб БооШИе (1987) 1. Мо1. ЕуойШоп 25: 351-360; Н1дд1пк е1 а1. (1989) САВЮ8 5: 151-153) или программы Оар апб Век! РН (№еб1етап апб УипксН (1970) 1. Мо1. Βίο1. 48: 443-453 и διηίΐΐι апб \Уа1егтап (1981) Лбу. Арр1. Ма!Н. 2: 482-489), которые содержатся в пакете программного обеспечения ОСО (Оепебск Сотри!ег Огоир, 575 8с1епсе Опус. МабЖоп, УЖсопып И8А).
Значения идентичности последовательностей, приведенные в настоящем документе в процентах, определяют с помощью программы Оар по всей области последовательности со следующими настройками: Оар Уе1дЫ: 50, ЬепдЪ Уе1дЫ: 3, Ауетаде Ма1сй: 10000 и Ауегаде М1кта1сй: 0.000.
Если не указано иначе, указанные настройки используют как стандартные настройки для сравнения последовательностей.
Без намерения ограничиваться гипотезами, предполагается, что кодоноптимизированные последовательности ДНК позволяют более эффективную трансляцию и мРНК, полученные с их помощью, возможно, имеют более продолжительные периоды полужизни в клетке и по этой причине являются чаще доступными для трансляции.
Специалисты в данной области хорошо знакомы с методиками, которые позволяют преобразовывать исходную начальную последовательность нуклеиновой кислоты в модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептиды идентичных аминокислот, но с различным использованием кодонов. Это может достигаться, например, с помощью методик мутагенеза на основе цепной полимеразной реакции, с помощью обычных известных процедур клонирования, с помощью химического синтеза и тому подобное.
Также целью настоящего изобретения является рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь ΡδΗ человека, где модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты выбирают из группы, состоящей из кодирующей области нуклеотидной последовательности в соответствии с 8ЕО ГО Νο. 1 и нуклеотидной последовательности, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 90%, с кодирующей областью нуклеотидной последовательности, как показана в 8ЕО ГО Νο. 1, и где модифицированная последовательность нуклеиновой кислоты находится под контролем промотора, который является активным в клетке-хозяине.
Термин промотор, который является активным в клетке-хозяине предназначается для обозначения того, что промотор в рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты позволяет экспрессировать последовательность нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, в которой экспрессия последовательности нуклеиновой кислоты является желательной. Активность промотора обычно определяется присутствием факторов транскрипции, которые способны связываться с промотором и активировать транскрипцию.
Промоторы, которые являются пригодными для экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот в клетках млекопитающих, хорошо известны специалистам в данной области и включают вирусные промоторы, такие как СМУ, 8У40, НТЬУ или главный поздний промотор аденовируса и другие промоторы, такие как промотор ЕР-1а- или промотор ИЬС.
Термин клетка-хозяин для целей настоящего изобретения относится к любой клетке, которая обычно используется для экспрессии, то есть для транскрипции и трансляции последовательностей нук- 3 022993 леиновых кислот для продуцирования, например, полипептидов. В частности, термин клетка-хозяин или организм относится к прокариотам, низшим эукариотам, клеткам растений, насекомых или к системам культур клеток млекопитающих. Предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, более предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку грызуна, еще более предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку грызуна, которая имеет использование кодона, сходное с клетками СНО, а наиболее предпочтительно эта клетка-хозяин представляет собой клетку СНО.
Линия клеток-хозяев СНО, используемая для экспрессии модифицированной последовательности и для продуцирования рекомбинантного Р8Н человека, представляет собой производную линию клеток СНО-К1 и имеет дефицит активности дигидрофолатредуктазы (бПГг). Линии клеток получают из ΌδΜΖ (Са!. Νο. АСС 126) и адаптируют для суспензии и условий отсутствия сыворотки в культуре.
Линия клеток СНО, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую первую оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь Р8Н человека, и вторую оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь Р8Н человека, была депонирована с 28 марта 2007 г. в ΌδΜΖ, ВгашъЛиусщ. под номером депозита ΌδΜ АСС2833.
Термин рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты в значении, используемом в настоящем изобретении, предназначается для включения в него всех видов молекул нуклеиновых кислот, которые способны вводиться в клетку-хозяина и осуществлять экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержится в рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты. Термин включает, среди прочего, векторы плазмид и вирусные векторы, такие как аденовирусный, лентивирусный и ретровирусный вектор, при этом векторы плазмид являются предпочтительными.
Примеры пригодных для использования векторов плазмид, которые могут использоваться для экспрессирования белков в клетках млекопитающих, хорошо известны и включают, например, ряд векторов рС1, ρδΐ (Рготеда), векторы ροΌΝΑ®, рСЕР4, рКЕР4, ρδНООΤΕΚ™, ρΖοοδΥ2 (1иу1!годеи), рВ1а§!, ρΜοηο, рЗЕРЕСТ, рУ!ТКО и рУ1УО (Ιη Ущодеи). Кроме промотора и последовательности нуклеиновой кислоты, которая должна экспрессироваться, рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты обычно содержит другие функциональные элементы, такие как последовательности полиаденилирования, гены прокариотической и/или эукариотической селекции, которые позволяют идентификацию положительно трансформированных прокариотических и/или эукариотических клеток, и источник репликации. Специалист в данной области знает, какие элементы, которые он должен выбирать для конкретной цели, и какой вектор плазмиды является пригодным для экспрессии конкретной последовательности нуклеиновой кислоты в конкретной клетке-хозяине.
Рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, содержащие последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, могут быть получены с помощью стандартных способов молекулярной биологии, которые описаны в литературе(см., например, в δатЬ^οοк аиб Ки88е11 (2001) ΜοΚοιιΌγ ο1οηίη§ - а ΡιΟοηιΙοιύ таииа1, 3гб ебйюи, С.о1б Зргшд ΒηΓόουΓ ^аЬο^а!ο^у Рге88, С.о1б Зргшд ΒηΓόουΓ, ΝΥ, υδΑ).
Предпочтительно рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержит как модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь РδН человека, так и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь ΡδΚ
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая α-цепь РδН человека, выбирается из оптимизированной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей α-цепь РδН человека, которую выбирают из группы, состоящей из кодирующей области последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с δΕΟ ΙΌ Νο. 2, последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 85%, с кодирующей областью последовательности нуклеиновой кислоты, как показана в δΕΟ ΙΌ Νο. 2, с кодирующей областью немодифицированной последовательности нуклеиновой кислоты, как показано в δΕΟ ΙΌ Νο. 3, и из последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 70%, с кодирующей областью последовательности нуклеиновой кислоты, как показана в δΕΟ ΙΌ Νο. 3.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая α-цепь РδН человека, может находиться под контролем того же промотора, что и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая β-цепь РδН человека, например, посредством участка внутренней посадки рибосомы (ΙΡΕδ), или она может находиться под контролем отдельного промотора. Предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая α-цепь РδН человека, находится под контролем отдельного промотора. Более предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая оптимизированную β-цепь РδН человека, находится под контролем промотора δν40, а последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая α-цепь РδН человека, находится под контролем промотора ΘΜΥ. Наиболее предпочтительно рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению имеет последовательность нуклеиновой кислоты, показанную в δΕΟ ΙΌ Νο. 7.
Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, которая содержит рекомбинант- 4 022993 ную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь Р8Н человека, и которая дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь Р8Н человека, которую выбирают из модифицированной последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из кодирующей области нуклеотидной последовательности в соответствии с 8ЕО ГО Νο. 2 и нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 85%, с кодирующей областью последовательности нуклеиновой кислоты, как показана в 8ЕО ГО Νο. 2, и кодирующей областью немодифицированной последовательности нуклеиновой кислоты, как показана в 8ЕО ГО Νο. 3, и последовательностей нуклеиновых кислот, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 70%, с кодирующей областью последовательности нуклеиновой кислоты, как показана в 8ЕО ГО Νο. 3.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая α-цепь Р8Н человека, может присутствовать в той же рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты, что и оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая β-цепь Р8Н человека, или она может вводиться в клеткихозяева на отдельной рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты. Предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая α-цепь Р8Н человека, присутствует в той же рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты, что и оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая β-цепь Р8Н человека.
Клетка-хозяин может выбираться из системы культур клеток млекопитающих, таких как клетки №Н3Т3, клетки СНО, клетки СО8, клетки 293, клетки 1игка1. клетки ВНК и клетки НеЬа. Предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку грызуна, более предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку грызуна, которая имеет использование кодона, сходное с клеткой СНО, а наиболее предпочтительно эта клетка-хозяин представляет собой клетку СНО.
Также объектом настоящего изобретения является культура клеток, содержащая клетки-хозяева, содержащие рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь Р8Н человека, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь Р8Н человека, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая α-цепь, может выбираться из группы, состоящей из немодифицированной последовательности нуклеиновой кислоты и модифицированной последовательности нуклеиновой кислоты, как определено выше, в подходящей культурной среде.
Культуру клеток получают посредством культивирования клеток-хозяев в подходящей культурной среде в условиях, которые поддерживают рост клеток-хозяев.
Термин культивирование клеток должен пониматься как означающий, что клетки поддерживаются ίη νίνο при условиях, которые делают возможными пролиферацию, нормальный метаболизм клеток и образование рекомбинантного белка. Это означает, что клетки снабжаются всеми необходимыми питательными веществами, а также кислородом, и поддерживаются при соответствующем рН и при соответствующей осмолярности. Клетки могут культивироваться любым пригодным для этого образом. Предпочтительно клетки культивируют как суспензионные культуры, например, в колбах или во вращающихся колбах. Термин культивирование включает периодическое культивирование, культивирование с подпиткой, а также перфузионные культуры и другие соответствующие способы культивирования.
Культивирование в суспензии означает, что клетки не прилипают к поверхности, а распределяются в культурной среде.
Периодическое культивирование, как используется в настоящем изобретении, представляет собой способ культивирования, при котором культурная среда не добавляется и не удаляется во время культивирования.
Способ с подпиткой, как используется в настоящем изобретении, представляет собой способ культивирования, при котором культурную среду добавляют во время культивирования, но культурная среда не удаляется.
Перфузионное культивирование в рамках настоящего изобретения представляет собой способ культивирования, при котором среда культивирования удаляется и новую культурную среду добавляют во время культивирования.
Культурная среда предпочтительно имеет только низкое содержание сыворотки, например максимальное содержание (об./об.) сыворотки 1%; наиболее предпочтительно среда не содержит сыворотки. Примеры соответствующих культурных сред представляют собой минимальные среды, такие как ΚΡΜΙ 1640, ΌΜΕΜ, Р12, РгоСНО5 или еКЭР, которые могут смешиваться друг с другом и с добавками, в соответствии с потребностями клеток. В дополнение к глюкозе и аминокислотам среда может содержать хелаторы, такие как ауринтрикарбоновая кислота (АТА), неорганические соли, такие как фосфатные соли, полиамины и их предшественники, такие как путресцин, гормоны, такие как инсулин, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, и смеси витаминов, предшественники липидов, такие как этаноламин, и защищающие клетки вещества, такие как Р1игошс Р68. Специалисты в данной области знают, какую культурную среду используют для культивирования конкретного типа клеток. Предпочтительно культурная среда представляет собой РгоСНО5.
- 5 022993
Также объектом настоящего изобретения является способ, в котором клетки-хозяева в соответствии с настоящим изобретением сначала культивируют в подходящей культурной среде в течение определенного периода времени, а затем супернатант культуры клеток собирают.
Супернатант культуры клеток представляет собой культуральную среду для клеток, которая находится в контакте с клетками в течение определенного периода времени и которую затем отделяют от клеток. Супернатант культуры клеток содержит рекомбинантный белок, продуцируемый клетками. Клетки могут отделяться от супернатанта с помощью обычных методик разделения, таких как фильтрование и центрифугирование. В долговременных культурах супернатант клеток-хозяев в соответствии с настоящим изобретением содержит концентрации Р8Н по меньшей мере 500 нг/мл, предпочтительно по меньшей мере 1000 нг/мл, более предпочтительно по меньшей мере 1500 нг/мл и наиболее предпочтительно по меньшей мере 2000 нг/мл.
Рекомбинантный Р8Н человека может быть очищен от супернатанта культур клеток с помощью одной или нескольких стадий очистки. Подходящие способы очистки известны специалистам в данной области и включают ионообменную хроматографию, хроматографию гидрофобных взаимодействий, хроматографию на гидроксиапатите, афинную хроматографию и гельпроникающую хроматографию. Способы очистки рекомбинантного Р8Н человека описаны, например, в \УО 00/63248, \УО 2006/051070 и \УО 2005/063811.
Для введения в качестве лекарственного средства очищенный рекомбинантный Р8Н человека смешивают с одним или несколькими наполнителями с получением композиции, которую можно вводить пациентам. Соответствующие композиции для рекомбинантного Р8Н человека описываются, среди прочего, в ЕР 0853945, ЕР 1285665, ЕР 0974359, ЕР 1188444 и ЕР 1169349.
Клетку-хозяина по настоящему изобретению получают посредством трансфицирования клетки рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, которая содержит либо только модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь Р8Н человека, либо также последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь Р8Н человека. Альтернативно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая β-цепь, и нуклеотидная последовательность, кодирующая α-цепь, могут присутствовать на отдельных рекомбинантных молекулах нуклеиновых кислот, которые вводят в клетку-хозяина либо одновременно, либо последовательно.
Подходящие способы трансфицирования известны специалистам в данной области и включают в себя, например, осаждение с фосфатом кальция, трансфицирование, опосредуемое ИЕЛЕ-декстраном, электропорацию и липофекцию. Могут также использоваться коммерчески доступные наборы для трансфицирования, такие как 8ирегРес1, Ро1уРес1, Ейсс1еие (Οίαβοη). ТтапзРак!™, РтоРесИоп®, ТгапПес1аш® (Рготеда) и ТтаикРакк™ (ИЕВ). Предпочтительно клетки трансфицируют в то время, когда они находятся в суспензии, и они трансфицируются в условиях отсутствия сыворотки.
Для получения рекомбинантного Р8Н человека в промышленном масштабе клетки обычно стабильно трансфицируют, что означает, что успешно трансформированные клетки отбирают после трансфицирования посредством агента селекции, который уничтожает нетрансфицированные клетки, в то время как трансфицированные клетки, содержащие ген устойчивости, продолжают расти. Подходящие реагенты включают антибиотики, такие как зеоцин, неомицин и пуромицин, и другие лекарственные средства, такие как метотрексат.
Настоящее изобретение иллюстрируется с помощью следующих далее примеров, которые не должны пониматься как ограничивающие.
Примеры
1. Клонирование рекомбинантной молекулы из нуклеиновой кислоты, содержащей оптимизированные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие α- и β-цепь Р8Н человека.
Используют основную цепь вектора рИС18, которая уже содержит сайт полиаденилирования 8У40 и сайт сплайсирования, и кассету гена бЫт, состоящую из промотора К8У, гена дигидрофолиатредуктазы мыши и сайта полиаденилирования и сплайсирования 8У40. Ген дигидрофолиатредуктазы делает возможной селекцию положительно трансфицированных клеток и амплификацию трансфицированного гена с помощью лекарственного средства метотрексата.
Немодифицированные последовательности α- и β-цепей Р8Н человека получают из Р1ббе8 апб Сообтап (1979) ИаШте 281: 351-356, и Типеюп е1 а1. (1988) Мо1. Епбостшо1. 2(9): 806-815 соответственно. Эти последовательности оптимизируют, при этом кодирующие области адаптируют для использования кодона в часто используемых генах СНО.
Кроме того, вводят дополнительный стоп-кодон для обеспечения эффективного завершения трансляции.
Оптимизированные нуклеотидные последовательности для β- и α-цепи показаны в 8ЕО ГО Ио. 1 и 2 соответственно, и сравнение последовательности дикого типа и модифицированной последовательности нуклеиновой кислоты показано на фиг. 1а и 1Ь. Сравнение последовательностей показывает, что модифицированная и немодифицированная последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие α-цепь Р8Н человека, идентичны на 80%, в то время как модифицированная и немодифицированная последова- 6 022993 тельности нуклеиновых кислот, кодирующие β-цепь Р5Н человека, идентичны на 85%.
Модифицированные последовательности инсертируют по отдельности в две копии основной цепи риС18 посредством разрезания их с помощью ферментов рестрикции 8ас11 и Ναοί и последующего лигирования.
Промотор СМУ и промотор 5У40 амплифицируют из соответствующего шаблона ДНК с помощью следующих праймеров, одновременно вводя сайт рестрикции Акс1 и Рас1 (подчеркнут в следующих праймерах):
Праймер Акс-СМУ-Р
5' - ССССССССТ ТТТ ОСТ САС АТС ОСТ СС - 3'(ЗЕф ГО Νο. 8)
Праймер Рас-СМУ-К
5' - ССТ ТАА ТТА АСА ОСТ СТА АТТ САА СТО ОСА СТО - 3' (5ЕС ГО Νο. 9)
Праймер Акс-8У40-Р
5' - ССС ССС ССС САТ АСС ССС АТС ТС - 3' (5ЕС ГО Νο. 10)
Праймер Рас-5У40-К
5' - ССТ ТАА ТТА АСТ ТСС АСА СТО ТТС ТОТ САС ААС А - 3' (5ЕС ГО Νο. 11)
Промотор СМУ вводят в плазмиду, содержащую α-цепь Р5Н человека, посредством разрезания плазмиды с помощью ферментов рестрикции Акс1 и Рас1 и лигирования, и промотор 5У40 вводят в плазмиду, содержащую β-цепь Р5Н человека, посредством разрезания плазмиды с помощью ферментов рестрикции Акс1 и Рас1 и лигирования.
Наконец, кассету экспрессии для β-цепи Р5Н человека, содержащую промотор 5У40, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь, и сигнал полиаденилирования 5У40 амплифицируют с помощью следующих праймеров, одновременно вводя сайт рестрикции Νοΐί, как на 5', так и на 3' конце амплификата (подчеркнуто в следующих праймерах):
Праймер ΡβίΗ-ΝοίΙ-Ρ
5' - ССС ССС ССА ТАС ССС САТ СТО С - 3' (5ЕС ГО Νο. 12)
Праймер ΡβίΗ-ΝοίΙ-Κ.
5' - ССС ССС ССТ САС ТСА ТТА ССС АСС ССА СС - 3' (5ЕС ГО Νο. 13)
Затем амплификат вставляют в разрезанную с помощью Νοΐί плазмиду, содержащую α-цепь Р5Н человека. Полученная плазмида, содержащая как оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь, так и оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь, показана на фиг. 2. Последовательность плазмиды с обеими оптимизированными последовательностями нуклеиновых кислот показана в 8ЕС ГО Νο. 7.
2. Транзиентная трансфекция клеток СНО рекомбинантными молекулами нуклеиновых кислот, содержащими различные сочетания α- и β-цепей Р5Н человека.
Плазмиды, содержащие либо оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь, либо оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую βцепь, в сочетании с соответствующей β-цепью или α-цепью дикого типа, или содержащие обе оптимизированные последовательности, получают, как описано в 1), выше. ДНК смешивают со средой РгоСНО5 (Εοη/а). содержащей 8 мМ глютамина без НТ (5-гидрокситритамина), до получения общего объема 200 мкл. Затем 20 мкл реагента 5ирегРес1 (01адсп) добавляют к раствору ДНК и перемешивают. Затем эту смесь инкубируют в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
Аликвоты, содержащие 1,68х106 клеток СНО, центрифугируют (5 мин, 800 об/мин, 18-25°С), супернатант удаляют и клетки повторно суспендируют в 1,1 мл культурной среды РгоСНО5, содержащей 8 мМ глютамина без НТ. Затем суспензию переносят в смесь ДНК, затем смесь ДНК инкубируют в течение 5-10 мин, перемешивают и переносят в лунки 6-луночного планшета. Клетки инкубируют в течение 3 ч при 37°С, это инкубирование приводит к прилипанию клеток. Супернатант удаляют, клетки промывают три раза 1 мл РВ5, а затем добавляют свежую культурную среду (2 мл РгоСНО5, содержащую 8 мМ глютамина без НТ). После 2 дней инкубирования при 37°С супернатант удаляют и центрифугируют. Супернатант концентрируют (коэффициент концентрирования 16,67) и концентрацию Р5Н определяют с помощью устройства для считывания ЕЫ5А (Ληο^η). Результаты этого измерения показаны на фиг. 3.
Результаты показывают, что введение модифицированной α-цепи в сочетании с β-цепью дикого типа приводит к уменьшению экспрессии почти на 50% по сравнению с сочетанием двух цепей дикого типа. В противоположность этому введение модифицированной β-цепи в сочетании с α-цепью, как дикого типа, так и модифицированной, приводит к транзиентной экспрессии Р5Н, которая усиливается с коэффициентом 1,5-3 по сравнению с сочетанием α-цепи дикого типа и β-цепи дикого типа. По этой причине, в частности, использование модифицированной β-цепи приводит к значительному усилению экспрессии Р5Н после транзиентного трансфицирования, в то время как модифицированная α-цепь не влияет положительно на продуцирование Р5Н.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Сравнение немодифицированных и модифицированных последовательностей нуклеиновых
- 7 022993 кислот, кодирующих α-цепь и β-цепь Р8Н человека
a) сравнение последовательностей модифицированной и немодифицированной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей α-цепь Р8Н человека, рХМ17зз#6: часть плазмиды, содержащая модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь Р8Н человека (8Ер Ιϋ Νο. 2),
У α Р8Н: немодифицированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая α-цепь Р8Н человека (8Ες Ιϋ Νο. 3).
Инициирующий кодон и стоп-кодоны показаны выделенными буквами.
b) Сравнение последовательностей для модифицированной и немодифицированной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей β-цепь Р8Н человека рпегу: немодифицированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая β-цепь Р8Н человека (8Ер Ιϋ Νο. 4),
8иЬ]есР модифицированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая β-цепь Р8Н человека (8Ер Ιϋ Νο. 1).
Инициирующие кодоны и стоп-кодоны показаны выделенными буквами.
Фиг. 2. Карта рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей как модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую α-цепь Р8Н человека, так и модифицированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую β-цепь Р8Н человека.
Фиг. 3. Анализ экспрессии различных сочетаний α- и β-цепей после транзиентной экспрессии в клетках СНО.
Показана относительная экспрессия Р8Н по отношению к клеткам, экспрессирующим сочетание αи β-цепей дикого типа.
у/у: немодифицированная α- и β-цепь, з/у: модифицированная α-цепь и немодифицированная β-цепь, у/з: модифицированная β-цепь и немодифицированная α-цепь, з/з: модифицированная α- и β-цепь.
Список последовательностей <110> В1одепег1х АС <120> ГЗН-Клон <130> В 8700 / ΚΝ <150> ЕР07111257 <151> 28.06.2007 <160> 13 <170> РаЬепЫп уегз±оп 3.3 <210> 1 <211> 471 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Модифицированная Сета цепь <400> 1
| аддаЬссссд | ддьассьссс | сдсддддадд | сдсдссссЬЬ | ааЬЬаадссд | ссассаЬдаа | 60 |
| дасссьдсад | ЬЬсЬЬсЬЬСС | ьдььсьдсьд | сьддааддсс | аЬсЬдсьдса | асадсЬдсда | 120 |
| дсЬдассаас | аьсассаьсд | ссаьсдадаа | ддаддадьдс | аддЬЬсЬдса | Ьсадсаьсаа | 180 |
| сассассьдд | ьдсдссддаь | асЬдсьасас | садддассьд | дЬдЬасаадд | ассссдссад | 240 |
| дсссаадаЬс | садаадассЬ | дсассЬЬсаа | ддадсЬддьд | Ьасдадассд | ьдадддьдсс | 300 |
| сддсЬдсдсс | сассасдссд | асадссЬдЬа | сассЬасссс | дЬддссассс | адЬдссасЬд | 360 |
| сддсаадЬдс | дасадсдаса | дсассдасЬд | сассдЬдадд | ддссЬдддсс | ссадсЬасЬд | 420 |
| садсЬЬсддс | дадаЬдаадд | адЬааЬдасс | аЬддсаьдсд | адсьсдааЬЬ | с | 471 |
<210> 2 <211> 372 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Модифицированная альфа цепь <400> 2
| сЬЬааЬЬаад | ссдссадсаь | ддасЬасЬас | аддаадЬасд | ссдссаЬсЬЬ | ссьддьдасс | 60 |
| сЬдадсдьдЬ | ЬссьдсасдЬ | дсЬдсасадс | дссссадасд | ЬдсаддасЬд | ссссдадЬдс | 120 |
| асссьдсадд | адаасссаЬЬ | сЬЬсадссад | сссддадссс | ссаьссЬдса | дЬдсаЬдддс | 180 |
| ьдсьдсььса | дсадддссЬа | ссссассссс | сЬдаддадса | адаадассаь | дсЬддЬдсад | 240 |
| аадаасдьда | ссадсдадад | сассЬдсЬдС | дЬддссаада | дсЬасаасад | ддЬдассдЬд | 300 |
| аьдддсддсЬ | ЬсааддЬдда | даассасасс | дссЬдссасЬ | дсадсассьд | сЬасЬассас | 360 |
| аададсЬааЬ | да | 372 |
- 8 022993 <210> 3 <211> 369 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 3
| сЬЬааЬЬаад | ссдссадсаЬ | ддаЬЬасЬас | адааааЬаЬд | садсЬаЬсЬЬ | ЬсЬддЬсаса | 60 |
| ььдьсддьдь | ЬЬсьдсаЬдЬ | ьсьссаььос | дссссЬдаьд | ЬдсаддаЬЬд | сссадааЬдс | 120 |
| асдсьасадд | аааасссаЬЬ | сЬЬсЬсссад | ссдддЬдссс | сааЬасЬЬса | дЬдсаЬдддс | 180 |
| ЬдсЬдсЬЬсь | сьададсаьа | ЬсссасЬсса | сЬааддЬсса | адаадасдаЬ | дЬЬддЬссаа | 240 |
| аадаасдЬса | ссЬсададЬс | сасЬЬдсЬдЬ | дЬадсЬаааЬ | саЬаьаасад | ддЬсасадЬа | 300 |
| аьддддддьь | ЬсааадЬдда | даассасасд | дсдЬдссасЬ | дсадьасььд | ЬЬаЬЬаЬсас | 360 |
<210> 4 <211> 474 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 4
| аддаЬссссд | ддсЬассЬсс | ссдсддддад | дсдсдссссЬ | ЬааЬЬаадсс | дссассаЬда | 60 |
| адасасЬсса | дЬЬЬЬЬсЬЬс | сЬЬЬЬсЬдЬЬ | дсЬддааадс | ааЬсЬдсЬдс | ааЬадсЬдЬд | 120 |
| адсьдассаа | саьсассаЬЬ | дсааЬадада | аадаадааЬд | ьсдЬЬЬсЬдс | аЬаадсаЬса | 180 |
| асассасЬЬд | дЬдЬдсЬддс | ЬасЬдсЬаса | ссадддаЬсЬ | ддЬдЬаЬаад | дасссадсса | 240 |
| ддсссааааЬ | ссадааааса | ЬдЬассЬЬса | аддаасьддь | аЬаЬдаааса | дьдададЬдс | 300 |
| ссддсЬдЬдс | ЬсассаЬдса | даЬЬссЬЬдЬ | аЬасаЬассс | адьддссасс | садЬдЬсась | 360 |
| дЬддсаадьд | Ьдасадсдас | адсасЬдаЬЬ | дЬасЬдЬдсд | аддссьдддд | сссадсЬасЬ | 420 |
дсЬссЬЬЬдд ЬдаааЬдааа дааСааасаЬ дссаЬддсаЬ дсдадсЬсда аЬЬс <210> 5 <211> 116 <212> РКТ <213> Ното зарДепз <400> 5
МеЬ Азр Туг Туг Агд Ьуз Туг А1а А1а 11е РНе Деи Уа1 ТНг Деи Зег 15 10 15
Уа1 РНе Деи Ηίδ Уа1 Деи Ηίδ Зег А1а Рго Азр Уа1 С1п Азр Суз Рго
С1и Суз ТНг Деи С1п С1и Азп Рго РНе РНе Зег С1п Рго С1у А1а Рго
- 9 022993 <210> 7 <211> 8983 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Плазмида <400> 7
| ддааЬаадаа | адсддссдсь | сасьсаььад | дсассссадд | сСССасасСС | СаСдссьссд | 60 |
| дсьсдсаЬдЬ | ьдьдсддааь | ЬдЬдадсдда | СаасааСССс | асасаддааа | садсСаСдас | 120 |
| аЬдаЬЬасда | аЬЬсдадсЬс | ддсасссддд | даСссадаса | СдасаадаСа | саССдаьдад | 180 |
| СЕЛддасааа | ссасаасьад | ааСдсадСда | ааааааСдсС | ССасьСдСда | ааСССдСдаС | 240 |
| дсЬаЬЬдсЬС | ЬаЬЬСдЬаас | саССаСаадс | СдсааСааас | аадссаасаа | саасааССдс | 300 |
| асссассьса | СдССЬсаддС | Ссадддддад | дСдСдддадд | ССССССааад | саадСаааас | 360 |
| сСсьасаааС. | дСддьаСддс | сдассасдас | ссссадСсаа | ддсасСаСас | аЬсааасасс | 420 |
| ссьСаЬЬаас | сссЬСЬасаа | ассааааадс | саааддсаса | сааСССССда | дсаСадсьаС | 480 |
| ЬааЬадсада | сасЬсЬаЬдс | сСдСдСддад | Саадаааааа | садСаСдССа | СдаССаСаас | 540 |
| ЬдЬСаСдссЬ | асПаЬааад | дССасадааС | аСССССссаС | аассссессд | сасадсадСд | 600 |
| садсьььььс | сСЬЬдЬддЬд | СаааСадсаа | адсаадсаад | адСьсСаССа | сЬааасасад | 660 |
| саьдасЬсаа | аааасьсадс | аассссдаад | дааадсссСС | ддддСсССсС | ассССьсСсС | 720 |
| ЬсСССН.Ьдд | аддадсадаа | СдЕСдададС | садсадСадс | сСсаЬсаСса | сьадаьддса | 780 |
| ьььсььсьда | дсаааасадд | ССССссСсаС | СаааддсаСС | ссассасСдс | ссссасссаь | 840 |
| садЬЬссаЬа | ддЬСддааЬс | СааааСасас | ааасааССад | ааСсадсадс | ССаасасаСС | 900 |
| асасасЬЬаа | аааСЛЬСаЬа | СССассССад | адсьССаааС | сСсСдСаддС | адСССдСсса | 960 |
| аЬЬабдЬсас | ассасадаад | ъааддСЛссС | ссасааадаС | сссасьасад | аадсааСсСа | 1020 |
| садьсьсьаь | ЬдсадСЬЬдЬ | аасссссСсс | сссьсссссс | СССааСасСд | ааЬдадаСсд | 1080 |
| ааЬдЬСаддС | ссаСдсадЬЬ | сССддСсааС | дССаасдааа | дСссаасдСС | ссдЬЬсдсдс | 1140 |
| ддддасадсс | сдЬссдсааа | дсддддсадс | ссдсаддсдд | ссссСсдадд | ЬсдасддЬаЬ | 1200 |
| сдаьаадсЬС | ддЬассдадс | ссддаСссас | Садсаасддс | сдссадьдСд | сЬддааЬЬсд | 1260 |
| дсЬЬдадсЬс | аддсдСсЬЬс | ссадсаСддс | СсСдСсссСд | адСССааадс | ЬдсЬсСсЬда | 1320 |
| асдсЬСссЬд | сьсьдддссс | Ссаадьсддс | ссСдСдасаь | ссьсадаСсС | сададсьдсЬ | 1380 |
| сЬсЬддасад | СЬссисЬддс | сссСдадаСд | СсаьСдссдд | сасьддадСд | СссаЬддСса | 1440 |
| иьасСссЬЬс | аЬсьсдссда | адссдсадса | дсСддддссс | аддссссСса | сддСдсадьс | 1500 |
| ддЬдсьдссд | сСдСсдсась | СдссдсадСд | дсасьдддСд | дссасддддС | аддЬдЬасад | 1560 |
| дсЬдЬсддсд | ьддьдддсдс | адссдддсас | ссСсасддьс | СсдСасасса | дсЬссЬЬдаа | 1620 |
| ддЬдсаддьс | ЬСсЬддаьсь | сдддсссддс | ддддСссьСд | сасассаддс | сссЬддЬдЬа | 1680 |
| дсадЬаьссд | дсдсассадд | СддСдССдаС | дссдаСдсад | аассСдсасС | ссЬссЬЬсЬс | 1740 |
| даЬддсдаЬд | дьдаьдььдд | Ссадсьсдса | дссдссдсад | садаСддссь | ьссадсадса | 1800 |
| даасаддаад | аадаасЬдса | дддСсССсаС | ддСддсддсС | СааССаадСС | сдадасЬдЬС | 1860 |
| дьдьсадаад | ааСсаадсьь | СССдсаааад | ссСаддссСс | саааааадсс | ЬссссасЬас | 1920 |
| ььсьддааьа | дсьсададдс | сдаддсддсс | СсддссСсСд | саСааасааа | аааааЫгадь | 1980 |
| садссаьддд | дсддадааСд | ддсддаасСд | ддеддадсса | ддддсдддаС | дддсддадСЬ | 2040 |
| аддддсддда | сЬаСддЬЬдс | сдасСааССд | адаСдсаСдс | СССдсаСасс | ЬсЬдссСдсЬ | 2100 |
| ддддадссьд | дддасьььсс | асассьддСС | дссдасьааС | сдадаСдсаС | дсььедЬаЬа | 2160 |
| сЬЬсСдссЬд | сЬддддадсс | СддддасССС | ссасасссСа | асьдасасас | аЬЬссасадс | 2220 |
| ьддььсьььс | сдссьсадаа | ддсассСаас | саадССссСс | СССсададдС | СаЬСЬсаддс | 2280 |
| саЬддЬдсЬд | сдсадаСсдс | ддссдсСааа | ссааддсдсд | ссССССдсСс | асаСддсЬсд | 2340 |
| асадаЬсЬЬс | ааСаСЬддсс | аССадссаСа | ССаССсаССд | дССаСаСадс | асаааьсааЬ | 2400 |
| аьсддсьаСЬ | ддссаЬСдса | СасдССдСаС | сСаСаСсаСа | асасдсасас | ЬЬаЬаЬЬддс | 2460 |
| ЬсаЬдЬссаа | ьаЬдассдсс | аСдССддсаС | сдаССаССда | сСадССаССа | аСадСааЬса | 2520 |
| аСЬасддддЬ | саььадьсса | Садсссасаь | аСддадсСсс | дсдССасаСа | асьЬасддСа | 2580 |
| ааЬддсссдс | сЬддсьдасс | дсссаасдас | ссссдсссас | СдасдСсааС | ааьдасдьаЬ | 2640 |
| дЬЬсссаЬад | ьаасдссааЬ | адддаесссс | сассдасдсс | ааЬдддСдда | дЬаЬСЬасдд | 2700 |
| ьааасьдссс | асСЬддсадЬ | асаСсаадСд | СаСсаСаСдс | саадьссдсс | сссЬаЬЬдас | 2760 |
| дЬсааьдасд | дьаааЬддсс | сдссСддсаС | СаСдсссадь | асаСдассСС | асдддасСЬЬ | 2820 |
| ссЬасЬЬддс | адЬасаЬсба | сдСаССадСс | ассдссасса | ссаСддьдас | дсддьсльдд | 2880 |
| садьасасса | аСдддсдьдд | аСадсддССС | дасСсасддд | даСССссаад | СсЬссасссс | 2940 |
| аььдасдьса | аЬдддадСЬЬ | дССССддсас | сааааЬсаас | дддасСССсс | ааааьдьсдь | 3000 |
| аасаасьдсд | аьсдсссдсс | ссдССдасдс | ааасдддсдд | Саддсдсдса | сддьдддадд | 3060 |
| ЬсСаСаЬаад | сададсЬсдЬ | ССадСдаасс | дСсадаСсас | СадаадсССь | аЬЬдсддЬад | 3120 |
| ЪЬЬаЬсасад | ЫаааСЬдсь | аасдсадСса | дсдсССсьда | сасаасадСс | ьсдаасЬЬаа | 3180 |
| дсЬдсадьда | сьсСсССаад | дСадссьСдс | адаадссддс | сдсдаддсас | ьдддсаддьа | 3240 |
| адьаЬсаадд | ЬЬасаадаса | ддсссаадда | дассааСада | аасСдддсСС | дьсдадасад | 3300 |
| адаадасЬсЬ | ЬдсдСЬЬсЬд | асаддсассС | аССддСсССа | сСдасассса | сЬЬЬдссЬЫ: | 3360 |
| сЬсЬссасад | дЬдЬссассс | ссадьссаас | сасадсссьс | аассаадссд | ссадсаЬдда | 3420 |
| сЬасЬасадд | аадсасдссд | ссаЬсССссС | ддСдасссСд | адсдсдсссс | ьдсасдьдсь | 3480 |
| дсасадсдсс | ссадасдьдс | аддасСдссс | сдадЬдсасс | сСдсаддада | асссаЬЬсЬЬ | 3540 |
| садссадссс | ддадссссса | СссСдсадСд | саСдддсСдс | СдсССсадса | дддссСассс | 3600 |
| сассссссьд | аддадсаада | адассасдсс | ддсдсадаад | аасдСдасса | дсдададсас | 3660 |
| сьдсьдсдСд | дссаададсС | асаасадддс | дассдСдасд | ддсддсССса | аддсддадаа | 3720 |
| ссасассдсс | СдссасСдса | дсассСдсСа | сСассасаад | адсСааСдас | саСддасасС | 3780 |
| ссадСдссад | сааСдасаСс | ьсаддддсса | даддаассдс | ссадададса | асСсСдадаС | 3840 |
| ссааддасдс. | сасадддсса | асССдадддс | ссададсадд | аадсасссад | ададсадссс | 3900 |
| СааасСсадд | дасададсса | ьдсСдддаад | асдсссдадс | Ссаадссдаа | ссссадсаса | 3960 |
| сСддсддссд | ССасСадСдд | аСссдадсСс | ддСассаадс | ССаСсдагас | сдСсдассСс | 4020 |
| даддддссдс | сСдсдддсьд | ссссдсСССд | сддасдддсС | дсссссдсдс | даасддаасд | 4080 |
| ссддассссс | дССаасаССд | ассаадаасс | дсаСддассС | аасаССсдас | сСсаССсадс | 4140 |
| ассааадддд | ддадддддад | ддддССасаа | асСдсааСад | адасСдсада | ььдсььседь | 4200 |
| адСдддаСсь | ССдСдаадда | ассССасССс | СдсддсдСда | саСааССдда | сааасЬассЬ | 4260 |
| асададаССЬ | ааадсСсСаа | ддСаааСаСа | ааасссссаа | дСдСасааСд | ЬдЬЬааасСа | 4320 |
| ссдаССсьаа | ссдсссдсдс | аССССадасС | ссаассСасд | дааесдасда | аЬдддадсад | 4380 |
| СддСддааСд | сссссаасда | ддаааассСд | ССССдсСсад | аадаааСдсс | аЬсЬадЬдаЬ | 4440 |
| дасдаддсса | сСдсСдасСс | ЬсаасаССсС | асСссСссаа | аааадаадад | аааддЬадаа | 4500 |
| дассссаадд | асСССссССс | адааССдсСа | адССССССда | дСсаСдсСдС | дЬЬЬадЬааЬ | 4560 |
| адаасСсССд | сССдсСССдс | СаСССасасс | асаааддааа | аадсСдсасС | дсЪаьасаад | 4620 |
| аааас саСдд | ааааасассс | СдсаассССС | асаадсаддс | аСаасадсса | СааСсаЬаас | 4680 |
| аСассдьССС | ССсССасСсс | асасаддсаС | ададсдСссд | сСаССааСаа | сЬаСдсЬсаа | 4740 |
| ааассдсдса | ссСССадсСС | сссаасссдс | аааддддсса | асааддааса | ССЬдаСдЬаЬ | 4800 |
| адСдссССда | сСададаСса | СааСсадсса | СассасаССС | дСададдССС | ЬасЬЬдсЬЬЬ | 4860 |
| аааааасссс | ссасассьсс | сссСдаассС | дааасаЬааа | аСдааСдсаа | ьсдььдььдь | 4920 |
| саасссдссс | ассдсадссс | аСааСддССа | саааСааадс | ааСадсаСса | саааЫЬсас | 4980 |
| аааСааадса | СССССССсас | СдсаСссСад | ссдсддсссд | сссааассса | ЬсааьдьаСс | 5040 |
| ССаСсаСдьс | сддасссссд | ддСассдадс | СсдааССсдС | ааСсаСдСса | ЬадсЬдЬЬЬс | 5100 |
| сСдСдСдааа | ССдьСаСссд | сСсасааССс | сасасаасаС | асдадссдда | адсаЬааадЬ | 5160 |
| дСааадссСд | дддсдсссаа | СдадСдадсс | аасСсасасс | аассдсдссд | сдсЪсасьдс | 5220 |
| ссдсьССсса | дСсдддааас | ссдСсдСдсс | адсСдсаССа | аСдааСсддс | саасдсдсдд | 5280 |
| ддададдсдд | СССдсдЬаСС | дддсдсСсСС | ссдсССссСс | дсссасСдас | ссдссдсдсс | 5340 |
| сддСсдСьсд | дсСдсддсда | дсддСаСсад | сссасьсааа | ддсддСааСа | сддььаьсса | 5400 |
| садааСсадд | ддаСаасдса | ддааадааса | СдСдадсааа | аддссадсаа | ааддссадда | 5460 |
| ассдСааааа | ддссдсдССд | ссддсдсссс | Ссеасаддсс | ссдссссссь | дасдадсаЬс | 5520 |
| асаааааСсд | асдсСсаадС | сададдеддс | дааасссдас | аддасСаСаа | адаЬассадд | 5580 |
| сдссьссссс | СддаадсСсс | сСсдСдсдсС | сСссСдССсс | дасссСдссд | сьъассддаь | 5640 |
| асссдсссдс | сСССсСсссС | Ссдддаадсд | СддсдсСССс | СсаСадсСса | сдсьдЪаддь | 5700 |
| аьсссадССс | ддСдСаддСс | дССсдсСсса | адсСдддсСд | СдСдсасдаа | ссссссдСЕс | 5760 |
| адсссдассд | сСдсдссССа | СссддСаасС | аСсдСсССда | дСссаасссд | дьаадасасд | 5820 |
| асССаСсдсс | асСддсадса | дссассддса | асаддаССад | сададсдадд | ЬаЬдьаддсд | 5880 |
| дСдсСасада | дССсьСдаад | СддСддссСа | асСасддсСа | сасСадаада | асадЬаЬЬЬд | 5940 |
| дСаСсСдсдс | СсСдсСдаад | ссадссассС | Ссддааааад | адссддсадс | ссьсдаьссд | 6000 |
| дсааасааас | сассдсСддС | адсддСддСС | СССССдСССд | саадсадсад | аььасдсдса | 6060 |
| дааааааадд | аСсСсаадаа | даСссСССда | СсССССсСас | ддддСсСдас | дсЬсадСдда | 6120 |
| асдаааасьс | асдССааддд | ассссддсса | сдадассасс | аааааддасс | ССсассьада | 6180 |
| сссссссааа | ССааааасда | адссссааас | саасссааад | СаЬасасдад | СааасЬЬддЬ | 6240 |
| сСдасадССа | ссааьдсССа | ассадсдадд | сассСаСссс | адсдаСссдС | сЬаСЬЬсдЬЬ | 6300 |
| сасссаьадС | сдсссдасСс | сссдСсдсдс | адасаассас | дасасдддад | ддсСЬассаь | 6360 |
| сСддссссад | сдсСдсааСд | аСассдсдад | асссасдсСс | ассддсСсса | даЬСЬаЬсад | 6420 |
| сааСааасса | дссадссдда | адддссдадс | дсадаадсдд | СссСдсаасС | ЬЬаЬссдссь | 6480 |
| ссаСссадСс | саССааСЬдс | Сдссдддаад | сСададСаад | СадССсдсса | дсьааЬадЬЬ | 6540 |
| СдсдсаасдС | СдьСдссаСС | дсСасаддса | ссдСддСдсс | асдсссдьсд | ЬЬС.ддС.аЬдд | 6600 |
| сьссасссад | сСссддССсс | саасдаСсаа | ддсдадССас | аСдаСссссс | аьдЬЬдьдса | 6660 |
| ааааадсддС | СадсСссССс | ддСссСссда | СсдССдСсад | аадСаадССд | дссдсадСдь | 6720 |
| сассасСсаС | ддьСаСддса | дсасСдсаСа | асссссссас | сдСсаСдсса | Ьссдьаадаь | 6780 |
| дсССССсСдС | дасСддСдад | сасссаасса | адСсасСссд | адаасадсдс | асдсддсдас | 6840 |
| сдадссдссс | ССдсссддсд | ссаасасддд | асаасассдс | дссасасадс | адаасЬЬЬаа | 6900 |
| аадСдсСсаС | саССддаааа | сдссссссдд | ддсдаааасс | сСсааддаСс | ССассдсьдь | 6960 |
| Сдадасссад | сссдасдсаа | сссасссдсд | сасссаасСд | аСссссадса | ЬсЬЬЬСасЬЬ | 7020 |
| ссассадсдС | ССсСдддьда | дсааааасад | дааддсаааа | сдссдсаааа | аадддааЬаа | 7080 |
| дддсдасасд | дааасдссда | асасСсасас | сссссесссс | ссаасассас | ЬдаадсаЫхЬ | 7140 |
| аСсадддССа | ССдСсСсаСд | адсддаСаса | СаСССдааСд | сасссадааа | ааЬааасааа | 7200 |
| СаддддССсс | дсдсасаССС | ссссдаааад | Сдссасссда | сдсссаадаа | ассаЬЬаЬЬа | 7260 |
| ссасдасасс | аассСаСааа | аасаддедСа | ссасдаддсс | сСССсдссСс | дсдсдЬСЬсд | 7320 |
| дсдаСдасдд | СдаааассСс | СдасасаСдс | адсСсссдда | дасддСсаса | дсССдСсЬдь | 7380 |
| аадсддаЕдс | сдддадсада | саадсссдЕс | адддсдсдЕс | адсдддЕдЕХ | ддсдддЕдЕс | 7440 |
| ддддсЕддсЕ | ЕаасЕаЕдсд | дсаЕсададс | адаЕЕдЕасЕ | дададЕдсас | саЕаЕдсдад | 7500 |
| ссаадасхдс | сасЕдсасхс | садссЕддЕЕ | сссааЕадас | ссХдааддсс | схасаддххд | 7560 |
| ЕсЕЕсссаас | схдссссххд | сЕссаЕасса | сссдссЕсса | ссссахааха | ЕХаХасаадд | 7620 |
| асассЕадЕс | ааасааааЕд | аЕдсаасЕЕа | аЕЕЕЕаЕХад | дасааддсЕд | дХдддсасХд | 7680 |
| дадЕадсасс | ЕЕссасдасс | аддададдса | сЕддддаддд | дЕсасаддда | Хдссасссдд | 7740 |
| дсадсЕадаа | дссасадсЕд | садЕЕадЕсЕ | ЕЕсЕЕсЕсдЕ | адасЕЕсааа | сХЕаХасЕХд | 7800 |
| аЕдссЕЕЕЕЕ | ссЕссЕддас | сЕсадададд | асдссЕдддЕ | аЕЕсЕдддад | аадХХЕаХаХ | 7860 |
| ЕЕссссаааЕ | сааЕЕЕсЕдд | дааааасдЕд | ЕсасЕЕЕсаа | аЕЕссЕдсаЕ | даЕссЕХдХс | 7920 |
| асааададЕс | ЕдаддЕддсс | ЕддЕЕдаЕЕс | аХддсЕЕссЕ | ддЕааасада | асхдссХссд | 7980 |
| асЕйЕССааа | ссаЕдЕсЕас | ЕЕЕасЕЕдсс | ааЕЕссддСЕ | дЕЕсааЕаад | Есххааддса | 8040 |
| Есахссааас | ЕЕЕЕддсаад | ааааЕдадсЕ | ссЕсдхддЕд | дЕХсХЕХдад | ххсхсхасхд | 8100 |
| адаасЕаЕаЕ | ЕааЕЕсЕдЕс | сЕЕЕаааддЕ | сдаЕЕсЕЕсЕ | саддааЕдда | даассаддЕЕ | 8160 |
| ЕЕссЬассса | ЕааЕсассад | аЕЕсЕдЕ ЕЕа | ссЬЕссасЕд | аададдЕЕдЕ | ддЬсаХЕсЕХ | 8220 |
| ЕддаадЕасЕ | ЕдаасЕсдЕЕ | ссЕдадсдда | ддссадддЕа | ддЕсЕссдЕЕ | сХХдссааХс | 8280 |
| сссаЕаЕЕЕЕ | дддасасддс | дасдаЕдсад | ХЕсааХддЕс | даассаЕдаЕ | ддаадсХЕдд | 8340 |
| аддЕдсасас | сааЕдЕддЕд | ааЕддЕсааа | ЕддсдЕЕЕаЕ | ЕдЕаЕсдадс | хаддсасЕХа | 8400 |
| ааЕасааЕаЕ | сЕсЕдсааЕд | сддааЕЕсад | ЕддЕЕсдЕсс | ааЕссаЕдЕс | адасссдХсХ | 84 60 |
| дЕЕдссЕЕсс | ЕааЕааддса | сдаЕсдЕасс | ассЕЕасЕЕс | сассааЕсдд | саХдсасддХ | 8520 |
| дсЕЕЕЕЕсЕс | ЕссЕЕдЕаад | дсаЕдЕЕдсЕ | аасЕсаЕсдХ | ЕассаЕдЕЕд | саадасХаса | 8580 |
| ададСаЕЕдс | аЕаадасЕас | аХХЕсссссХ | сссХаХдсаа | аадсдааасЕ | асХахаХссХ | 8640 |
| даддддасЕс | сЕаассдсдЕ | асаассдаад | ссссдсЕЕЕЕ | сдссЕаааса | сасссХадХс | 8700 |
| сссЕсадаЕа | сдсдЕаЕаЕс | ЕддсссдЕас | аЕсдсдаадс | адсдсаааас | дссЕаасссЕ | 8760 |
| аадсадаххс | ЕЕсаЕдсааЕ | ЕдЕсддЕсаа | дссЕЕдссЕЕ | дЕЕдЕадсЕЕ | аааХХХХдсЕ | 8820 |
| сдсдсасЕас | ЕсадсдассЕ | ссаасасаса | адсадддадс | адаЕасЕддс | ххаасхаЕдс | 8880 |
| ддсаЕсадад | садаЕЕдЕас | ЕдададЕдса | ссаЕаЕддЕд | сасЕсЕсадЕ | асааХсЕдсХ | 8940 |
| сЕдсадаЕсЕ | ддссЕссдсд | ссдддЕЕЕЕд | дсдссЕсссд | сдд | 8983 |
<210> 8 <211> 26 <212> ДНК <21 3> Искусственная <220>
<223> Азс-СМУ-Г Праймер <400> 8 ддсдсдссХХ ХХдсХсасаХ ддсХсд 26 <210> 9 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Рас-СМУ-К Праймер <400> 9 ссХХааХХаа дадсХдХааХ ЕдаасХддда дхд 33 <210> 10 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Азс-ЗУ40-Г Праймер <400> 10 ддсдсдссдс аЕасдсддаЕ сЕд 23 <210> 11 <211> 34 <212> ДНК < 213 > Искусственная <22 0>
<223> Рас-5У40-К Праймер <400> 11 ссЕЕааЕЕаа дЕЕсдадасЕ дЕЕдЕдЕсад аада 34 <210> 12 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> ЬеЕа-ΝοΕΙ-Γ Праймер <400> 12 дсддссдсаЕ асдсддаЕсЕ дс 22 <210> 13 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> ЬеЕа-ΝοΕΙ-Κ Праймер <400> 13 дсддссдсЕс асЕсаЕЕадд сассссадд 2'
Claims (21)
1. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую β-цепь фолликулостимулирующего гормона человека (ΡδΗ), которая выбрана из группы, состоящей из кодирующей области нуклеотидной последовательности δΕΟ ΙΌ Ио. 1 и нуклеотидных последовательностей, идентичных по меньшей мере на 98% кодирующей области нуклеотидной последовательности δΕΟ ΙΌ Ио. 1, где нуклеотидная последовательность δΕΟ ΙΌ Ио. 1 модифицирована в соответствии с кодонами, предпочтительными для использования в клетках яичников китайских хомячков (ΟΗΟ).
2. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую α-цепь фолликулостимулирующего гормона человека (ΡδΗ), которая выбрана из группы, состоящей из кодирующей области нуклеотидной последовательности δΕΟ ΙΌ Ио. 2 и нуклеотидных последовательностей, идентичных по меньшей мере на 98% кодирующей области нуклеотидной последовательности δΕΟ ΙΌ Ио. 2, где нуклеотидная последовательность δΕΟ ΙΌ Ио. 2 модифицирована в соответствии с кодонами, предпочтительными для использования в клетках яичников китайских хомячков (ΟΗΟ).
3. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, раскрытую в п.1, под контролем промотора, который является активным в клетке-хозяине.
4. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.3, дополнительно содержащая нуклеотидную последовательность, раскрытую в п.2.
5. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.3, дополнительно содержащая нуклеотидную последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из кодирующей области нуклеотидной последовательности δΕΟ ΙΌ Ио. 3 и нуклеотидных последовательностей, идентичных по меньшей мере на 70% кодирующей области нуклеотидной последовательности δΕΟ ΙΌ Ио. 3, где нуклеотидная последовательность δΕΟ ΙΌ Ио. 3 представляет собой немодифицированную нуклеотидную последовательность, кодирующую альфа-цепь ΡδΗ человека.
6. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.4 или 5, в которой дополнительная нуклеотидная последовательность находится под контролем отдельного промотора.
7. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.3-6, в которой нуклеотидная последовательность, раскрытая в п.1, и/или дополнительная нуклеотидная последовательность находится под контролем вирусного промотора.
8. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.7, в которой нуклеотидная последовательность, раскрытая в п.1, находится под контролем промотора δν40.
9. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.7, в которой дополнительная нуклеотидная последовательность находится под контролем промотора СМV.
10. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.3-9, имеющая нуклеотидную последовательность δΕΟ ΙΌ Ио. 7.
11. Клетка-хозяин, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.4-10.
12. Клетка-хозяин по п.11, представляющая собой клетку млекопитающего.
13. Клетка-хозяин по п.11 или 12, представляющая собой клетку яичника китайского хомячка ^ΗΟ).
14. Клетка-хозяин, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты по п.3 и дополнительную рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, выбранную из нуклеотидной последовательности, раскрытой в п.2, и нуклеотидной последовательности δΕΟ ΙΌ Ио. 3, указанной в п.5.
15. Линия клеток яичников китайских хомячков, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую кодирующую область нуклеотидной последовательности, представленной δΕΟ ΙΌ Ио. 1, и кодирующую область нуклеотидной последовательности, представленной δΕΟ ΙΌ Ио. 2, и имеющая номер депозита ΌδΜ АСС2833.
16. Культура клеток, содержащая клетку-хозяина по любому из пп.11-14 или линию клеток по п.15 в подходящей культуральной среде.
17. Способ получения рекомбинантного ΡδΗ человека, включающий культивирование клеткихозяина по любому из пп.11-14 или линии клеток по п.15 в подходящей культуральной среде и сбор супернатанта культуры клеток.
18. Способ по п.17, дополнительно включающий стадию очистки рекомбинантного ΡδΗ человека от супернатанта культуры клеток.
19. Способ получения клетки-хозяина по любому из пп.11-13, включающий трансфицирование клеток в суспензионной культуре в условиях отсутствия сыворотки рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.4-10.
20. Способ получения клетки-хозяина по п.14, включающий трансфицирование клеток в суспензионной культуре в условиях отсутствия сыворотки рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты по п.3 и дополнительной рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из нуклеотидной последовательности, раскрытой в п.2, и нуклеотидной
- 13 022993 последовательности 8ЕР ΙΌ Νο. 3, указанной в п.5.
21. Применение нуклеотидной последовательности 8ЕР ΙΌ Νο. 1 и/или 8ЕР ГО Νο. 2 для получения рекомбинантного Р8Н человека.
рХМ17вз 3398 3457 \νί α Р5Н 65 124 рХМ17зз 3458 3517 \γ| а Р8Н 125 184 рХМ17зз 3518 3577 \νΐ аР5Н 185 244 рХМ17аз 3578 3637 ννΐ а Р5Н 245 304 рХМЗ.733 3638 3697
М пР8Н 305 364
РХМ1733 3698
3757 \νί а Р5Н 365 424 рХМ17зе 3758 «4 а Р8Н 425 ссЬаа^Саадссдссадсж^сгдассасЬасаддаадСасдссдссаЬсЬСссСддСдасс
ΙΙΙΠΙΠΙ.ΙΙΙΙΙΙΙ ΙΙΙΙΙ IIIIIIII II II II II ΙΙΙΙΙ ПП и с£СааЬСаадссдссадса£дда££.асЬасадаааа1:а1:дсадсЬа1:с1СС.сСдд£саса сСдадсдедЪЬсеЬдсасдСдседсасадсдссссадасдЬдсаддас^дссссдадЬдс
Π ΙΙΙΙΙ ΙΙΙΙΙ Π Π И III Η II I Η Η III I ΗΙ I К III
ЬЪдСсдд£д1Х£<:ьдсаСдС£с£ссаЬ.1;ссдсЬссС.даЪдЪдсаддаЫ1дсссадаа1:дс асссЪдсаддадаасссаеьсСЪсадссадсссддадсссссаЬсс^дсадСдсаСдддс
II Π III Π ΙΙΙΙΙ I ПН И НИН II ΙΙΙΙΙ II II ΙΙΙΙΙ ΙΙΙΙΙΙΙ асдс£асаддаааасссаС£с££с1;сссадссдддЪдссссаа£ас£.Ьсад£дса1:дддс
ЬдсСдсСЬсадсадддссЬассссассссссЪдаддадсаадаадасса^дсЪддЬдсад
ΙΠΙΙΗΙΙ И И II ΙΙΙΙΙ II И III ΙΙΙΗΙΙΠ III ни и
СдсСдсЫхсЬсЬададсаСаСсссасСссасЬааддЪссаадаадасдаЬдЪЬддЬссаа аадаасдедассадсдададсассСдсЬдсдЬддссаададсм; асаасадддЪдассд£д
ИНПП III III III ΙΙΙΙΙ И II И II IIIIIIII И II аадаасдесассРсададСссасХЪдсСдЬдСадс^аааРсаеаСаасадддЬсасадСз аСдддсддсъьсааддСддадаассасассдссЬдссасЪдсадсассСдсСас^ассас
ШИ И ΙΙΙΙΙ II НН I ПП III II ΙΙΙΠΙΠΗΙ II II II II III аСддддддЫ:1:сааадЬддадаассасасддсд1:дссасРдсадЬасЬЁдС.СаЫ:аЬсас аададсЪааЪда 3769
II III ааа^сбЬаа 433
Фиг. 1а
Оиегу; ЗЬ^СЬ:
Оиехгу:
ЗЪ^СЬ : Оиегу:
5Ь]СЬ:
Оиегу:
ЗЬ]сЬ;
Оиегу;
5Ъ}С£:
Оиегу:
8Ь]Сб:
Оиегу;
ЗЬдсЬ:
З^СС :
1 аддаЬссссдддсЬассЬссссдсддддаддсдсдссссбЪаабЬаадссдссассаЪда
II1111IIII11 ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΗΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΗΗΙΗΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΗΙΙ
2 аддасссссддд-ъассЬссссдсддддаддсдсдсссссьаансаадссдссассаЪда
61 адасасЪссадссСССс&СссеьъссСдЪЬдсЬддааадсааЬсЬдсбдсааЪадсбдбд
НИ II ΙΙΙΙΙ IΙΙΙΙΙΙΙ ΙΙΙΙΙ ΙΙΙΙΙΙΙΙ II ΙΙΙΙΙΙΙ ΙΗΙ ΙΙΙΙΙ I
61 адасссъдсадЬЬсЫдсЬСсссдЪЬсЬдседсСддааддссаСссдсЬдсаасадсСдсд
121 адсидассаасассассассдсаасададааадаадааЬдЬсд^сЪссдсаСаадсабса
II111IIII11111IIIII II II ΙΙΙΙΙ II II II I ΙΙΙΙΙΙΙΙ ΙΙΙΙΙΙΙ
121 адс£дассаасаЬсасса£сдссаЪсдадааддаддадЪдсадд£ЬсЬдсабсадсаЬса
181 асассасбЪддсдСдсСддсбасЪдсСасассадддаЬсСддСдбаСааддасссадсса
181 асассассбддрдсдссддабасСдсСасассадддассЬддРдЁасааддассссдсса
241 ддсссааааСссадаааасаЬдСасссьсааддаасСддбаСасдааасадЬдададгдс
ΙΙΙΙΙΙΙ IIIIIIII II II 1111IIIIIII ΙΙΙΙΙ II II II ΙΙΙΙΙ ιιιι
241 ддсссаадабссадаадассбдсассЪЬсааддадсГддСдЪасдадассдСдадддбдс
301 ссддсЬдЬдсРсассабдсадаЬЪссСЬдбабасаЪасссадЁддссасссадрдбсасЬ
301 ссддсгдсдсссассасдссдасадссьдбасасссассссдеддссасссадсдссас!:
361 дсддсаадбд^дасадсдасадсассдассдсассдсдсдаддссгддддсссадсСасг
I ΙΙ1ΙΗΗ ΙΠΙΠΙΙΙΙΙΙΙΙ II Η II III I ΙΙΙΙΙΙΙΙ ΙΙΙΗΙΙΙΙΙ
361 дсддсаадСдсдасадсдасадсассдасСдсассд^даддддссСдддссссадссас!:
421 дсессбъеддСдааабдааадааЪааасаСдссабддсаЬдсдадсбсдааСЛс 474
120
120
180
180
240
240
300
300
360
360
420
420
421 дсадсЫзсддсдадабдааддадЪавСда--ссабддсаЬдсдадсЬсдааСЬс 472
Фиг. 1Ь
ЯасП - 8981 ΝοΑ -13
Фиг. 2
ΝαΛ - 3770
- 14 022993
Конструкция вектора Фиг. 3
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP07111257 | 2007-06-28 | ||
| PCT/EP2008/058274 WO2009000913A1 (en) | 2007-06-28 | 2008-06-27 | Fsh producing cell clone |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201070071A1 EA201070071A1 (ru) | 2010-10-29 |
| EA022993B1 true EA022993B1 (ru) | 2016-04-29 |
Family
ID=39745099
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201070071A EA022993B1 (ru) | 2007-06-28 | 2008-06-27 | Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие альфа- и бета-цепи фолликулостимулирующего гормона человека (fsh) |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8318457B2 (ru) |
| EP (2) | EP2492280A1 (ru) |
| JP (1) | JP5570980B2 (ru) |
| KR (1) | KR101522217B1 (ru) |
| CN (1) | CN101720332B (ru) |
| AU (1) | AU2008267138B9 (ru) |
| BR (1) | BRPI0813913B1 (ru) |
| CA (1) | CA2690844C (ru) |
| CY (1) | CY1114463T1 (ru) |
| DK (1) | DK2170942T3 (ru) |
| EA (1) | EA022993B1 (ru) |
| ES (1) | ES2432183T3 (ru) |
| HK (1) | HK1140782A1 (ru) |
| HR (1) | HRP20130921T1 (ru) |
| IL (1) | IL202280A (ru) |
| MX (1) | MX2010000385A (ru) |
| NZ (1) | NZ581702A (ru) |
| PL (1) | PL2170942T3 (ru) |
| PT (1) | PT2170942E (ru) |
| RS (1) | RS52976B (ru) |
| SI (1) | SI2170942T1 (ru) |
| UA (1) | UA103598C2 (ru) |
| WO (1) | WO2009000913A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA200908168B (ru) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2009211331B2 (en) | 2008-02-08 | 2014-07-03 | Theramex HQ UK Limited | Liquid formulation of FSH |
| HUE025959T2 (en) * | 2009-04-01 | 2016-05-30 | Ratiopharm Gmbh | A method for purifying recombinant FSH |
| EP2325194A1 (en) | 2009-11-24 | 2011-05-25 | Glycotope GmbH | Process for the purification of glycoproteins |
| JP6279466B2 (ja) * | 2012-04-27 | 2018-02-14 | Ｊｃｒファーマ株式会社 | 新規な発現ベクター |
| CN103554269B (zh) * | 2013-11-01 | 2015-02-11 | 广州联康生物科技有限公司 | 重组猪促卵泡激素融合蛋白 |
| CN103539860B (zh) * | 2013-11-01 | 2014-12-03 | 广州优联康医药科技有限公司 | 一种长效重组人促卵泡激素融合蛋白 |
| CN103539861B (zh) * | 2013-11-01 | 2015-02-18 | 广州联康生物科技有限公司 | 长效重组人促卵泡激素融合蛋白 |
| CN105462909B (zh) * | 2015-12-31 | 2019-09-27 | 哈药集团技术中心 | 一种高效表达人促卵泡激素的cho细胞的培养方法 |
| CN107460206B (zh) * | 2017-09-11 | 2020-05-01 | 深圳市深研生物科技有限公司 | 人fsh的重组表达载体、重组细胞株及重组人fsh的制备方法 |
| CN111349154A (zh) * | 2018-12-21 | 2020-06-30 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 一种重组人促卵泡激素及其制备方法和药物应用 |
| CN110812366B (zh) * | 2019-11-18 | 2023-11-17 | 珠海丽凡达生物技术有限公司 | 一种可用于激素补充的mRNA药物及其制备方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0404546A2 (en) * | 1989-06-20 | 1990-12-27 | Genzyme Corporation | Heteropolymeric protein production |
| WO2001058493A1 (en) * | 2000-02-11 | 2001-08-16 | Maxygen Aps | Conjugates of follicle stimulating hormones |
| WO2005030969A1 (en) * | 2003-10-02 | 2005-04-07 | Progen Co., Ltd. | Method for mass production of human follicle stimulating hormone |
| WO2007003640A1 (en) * | 2005-07-05 | 2007-01-11 | Ares Trading S.A. | Serum-free culture medium for the production of recombinant gonadotropins |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4923805A (en) | 1983-11-02 | 1990-05-08 | Integrated Genetics, Inc. | Fsh |
| IT1206302B (it) | 1987-06-26 | 1989-04-14 | Serono Cesare Ist Ricerca | Ormone follicolo-stimolante urinario |
| CA2223125A1 (en) | 1995-02-17 | 1996-08-22 | Stichting Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid | Production of biologically active recombinant bovine follicle stimulating hormone (recbfsh) in the baculovirus expression system |
| TW518235B (en) | 1997-01-15 | 2003-01-21 | Akzo Nobel Nv | A gonadotropin-containing pharmaceutical composition with improved stability on prolong storage |
| NZ508874A (en) | 1998-07-23 | 2004-03-26 | Lilly Co Eli | FSH and FSH variant formulations, products and methods of treating infertility. |
| BRPI0010677B8 (pt) | 1999-04-16 | 2021-05-25 | Inst Massone S A | processo de purificação de gonadotropinas urinárias humanas a partir de gonadotropinas brutas. |
| US20020127652A1 (en) | 2000-02-11 | 2002-09-12 | Schambye Hans Thalsgard | Follicle stimulating hormones |
| WO2004024915A1 (en) * | 2002-09-13 | 2004-03-25 | The University Of Queensland | Gene expression system based on codon translation efficiency |
| DE602004023757D1 (de) | 2003-12-22 | 2009-12-03 | Ares Trading Sa | Methode zur reinigung von fsh |
| PL1809663T3 (pl) | 2004-11-09 | 2009-01-30 | Ares Trading Sa | Sposób oczyszczania FSH |
| US20070281883A1 (en) | 2006-06-05 | 2007-12-06 | Hanna Rosenfeld | Development of follicle stimulating hormone agonists and antagonists in fish |
-
2008
- 2008-06-27 EP EP12169533A patent/EP2492280A1/en not_active Withdrawn
- 2008-06-27 DK DK08774439.7T patent/DK2170942T3/da active
- 2008-06-27 BR BRPI0813913-0A patent/BRPI0813913B1/pt active IP Right Grant
- 2008-06-27 RS RS20130443A patent/RS52976B/en unknown
- 2008-06-27 PT PT87744397T patent/PT2170942E/pt unknown
- 2008-06-27 NZ NZ581702A patent/NZ581702A/en not_active IP Right Cessation
- 2008-06-27 KR KR1020107001959A patent/KR101522217B1/ko active IP Right Grant
- 2008-06-27 SI SI200831065T patent/SI2170942T1/sl unknown
- 2008-06-27 CA CA2690844A patent/CA2690844C/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-06-27 AU AU2008267138A patent/AU2008267138B9/en active Active
- 2008-06-27 UA UAA201000813A patent/UA103598C2/ru unknown
- 2008-06-27 EA EA201070071A patent/EA022993B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-06-27 PL PL08774439T patent/PL2170942T3/pl unknown
- 2008-06-27 ES ES08774439T patent/ES2432183T3/es active Active
- 2008-06-27 JP JP2010513938A patent/JP5570980B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-06-27 US US12/666,257 patent/US8318457B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-06-27 WO PCT/EP2008/058274 patent/WO2009000913A1/en active Application Filing
- 2008-06-27 EP EP08774439.7A patent/EP2170942B1/en active Active
- 2008-06-27 MX MX2010000385A patent/MX2010000385A/es active IP Right Grant
- 2008-06-27 CN CN200880022358.7A patent/CN101720332B/zh active Active
-
2009
- 2009-11-20 ZA ZA200908168A patent/ZA200908168B/xx unknown
- 2009-11-23 IL IL202280A patent/IL202280A/en active IP Right Grant
-
2010
- 2010-07-27 HK HK10107184.9A patent/HK1140782A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-09-30 HR HRP20130921AT patent/HRP20130921T1/hr unknown
- 2013-10-09 CY CY20131100874T patent/CY1114463T1/el unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0404546A2 (en) * | 1989-06-20 | 1990-12-27 | Genzyme Corporation | Heteropolymeric protein production |
| WO2001058493A1 (en) * | 2000-02-11 | 2001-08-16 | Maxygen Aps | Conjugates of follicle stimulating hormones |
| WO2005030969A1 (en) * | 2003-10-02 | 2005-04-07 | Progen Co., Ltd. | Method for mass production of human follicle stimulating hormone |
| WO2007003640A1 (en) * | 2005-07-05 | 2007-01-11 | Ares Trading S.A. | Serum-free culture medium for the production of recombinant gonadotropins |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| GUSTAFSSON C. ET AL.: "Codon bias and heterologous protein expression". TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, ELSEVIER PUBLICATIONS, CAMBRIDGE, GB, vol. 22, no. 7, 1 July 2004 (2004-07-01), p. 346-353, XP004520507, ISSN: 0167-7799, abstract page 346, column 2, paragraph 2 - page 347, column 2, paragraph 3 - page 348, column 1, paragraph 2 - page 348, column 2, paragraph 5 - page 350, column 1, paragraph 2 - page 351 * |
| KEENE J.L. ET AL.: "Expression of biologically active human follitropin in Chinese hamster ovary cells". JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY OF BIOLOCHEMICAL BIOLOGISTS, BIRMINGHAM, US, vol. 264, no. 9, 25 March 1989 (1989-03-25), p. 4769-4775, XP003001629, ISSN: 0021-9258, abstract * |
| WANG Z.Y. ET AL.: "Codon usage of Chinese hamster ovary cells". ZHONGHUA SHI YAN HE LIN CHUANS BING DU XUE ZA ZHI = ZHONGHUA SHIYAN HE LINCHUANG BINGDUXUE ZAZHI = CHINESE JOURNAL OF EXPERIMENTAL AND CLINICAL VIROLOGY SEP 2006, vol. 20, no. 3, September 2006 (2006-09), p. 266-269, XP002497445, ISSN: 1003-9279, the whole document * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA022993B1 (ru) | Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие альфа- и бета-цепи фолликулостимулирующего гормона человека (fsh) | |
| Bragonzi et al. | A new Chinese hamster ovary cell line expressing α2, 6-sialyltransferase used as universal host for the production of human-like sialylated recombinant glycoproteins | |
| RU2453597C2 (ru) | Способ получения иммортализованной клетки человека, стабильно трансфицированная иммортализованная клетка человека, способ рекомбинантной продукции целевого белка человека, применение вектора трансфекции | |
| JP4712694B2 (ja) | 哺乳動物細胞中で分泌型組換えタンパク質を高生産させるための分子シャペロンの使用方法 | |
| JPH0655136B2 (ja) | ヒトエリスロポエチンをコードするｄｎａにより形質転換されている細胞 | |
| CN110343668B (zh) | 一种敲除gs基因的cho细胞株及其制备方法与应用 | |
| KR20170132784A (ko) | 글로빈 유전자 클러스터의 조절 요소를 포함하는 진핵생물 발현 벡터 | |
| KR102135745B1 (ko) | 발현 카세트 | |
| EP0743982B1 (en) | Immortalized human fetal osteoblastic cells | |
| EP1141366B1 (en) | Transfectacons comprising calcium phosphate and a nucleic acid | |
| RU2560596C2 (ru) | Плазмида для экспрессии в клетках сно рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (фсг) человека, плазмида для экспрессии в клетках сно бета-субъединицы рекомбинантного фсг человека, клетка сно - продуцент рекомбинантного фсг человека и способ получения указанного гормона | |
| RU2502798C2 (ru) | КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ huFSHIK, СЕКРЕТИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ФСГ | |
| JPH01120300A (ja) | 組換え細胞培養中でのポリペプチド発現の増大法 | |
| CA1324097C (en) | Inducible heat shock and amplification system | |
| US5686263A (en) | Method for enhancing gene expression | |
| RU2697273C1 (ru) | Способ получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, клеточная линия - продуцент и плазмидные экспрессионные векторы | |
| WO2001059075A1 (en) | Improved sialylation of glycoproteins | |
| JPH0984582A (ja) | 糖転移酵素活性を強化した動物細胞、糖鎖改変糖蛋白質ならびにその製造方法 | |
| KR101971614B1 (ko) | 목적 단백질의 생산이 증가된 세포주 및 이를 이용한 목적 단백질 생산 방법 | |
| RU2548806C1 (ru) | Синтетическая днк, кодирующая эритропоэтин человека, содержащий её вектор, способ получения штамма-продуцента эритропоэтина, штамм-продуцент эритропоэтина | |
| RU2616273C1 (ru) | Синтетическая ДНК, кодирующая антимюллеров гормон человека, содержащий ее экспрессионный вектор pTVK4pu/MISOPT и штамм клеток яичников китайского хомячка CHO-MIS - продуцент рекомбинантного антимюллерового гормона человека | |
| TWI304094B (en) | Use of aminoglycoside resistance gene | |
| WO2021137742A1 (ru) | Генотерапевтический днк-вектор | |
| JP3570721B2 (ja) | 組換えｄｎａからの高タンパク質産生のための方法および組成物 | |
| JP3570721B6 (ja) | 組換えｄｎａからの高タンパク質産生のための方法および組成物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |