EA019636B1 - Связывающие белки, включающие антитела, производные антител и фрагменты антител, которые специфически связываются с cd154, и их применения - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к связывающим белкам, включающим антитела, производные антител и фрагменты антител, которые специфически связываются с белком CD154 (CD40L). Также данное изобретение относится к химерному, гуманизированному или полностью человеческому антителу, производному антитела и фрагменту антитела, которые специфически связываются с эпитопом, с которым специфически связывается гуманизированный фрагмент Fab, содержащий последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 1 и содержащий последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 2. CD154-связывающие белки по данному изобретению могут проявлять пониженную эффекторную функцию по сравнению со вторым анти-CD154-антителом. CD154-связывающие белки по данному изобретению могут быть пригодными для диагностических и терапевтических способов, например при лечении и профилактике заболеваний, в том числе таковых, которые включают нежелательные иммунные реакции, опосредуемые взаимодействиями CD154-CD40.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к связывающим белкам, включающим антитела, производные антител и фрагменты антител, которые специфически связываются с белком СО154 (СЭ40Ь). Также данное изобретение относится к химерному, гуманизированному и полностью человеческому антителу, производному антитела или фрагменту антитела, которые специфически связываются с эпитопом, с которым специфически связывается гуманизированный ТаЬ-фрагмент, содержащий последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8ЕО ΙΌ N0: 1 и содержащий последовательность вариабельной области легкой цепи 8ЕО ΙΌ N0: 2. СО154-связывающие белки по данному изобретению могут проявлять пониженную эффекторную функцию по сравнению со вторым анти-СЭ154-антителом. СО154-связывающие белки по данному изобретению пригодны для диагностических и терапевтических способов, например при лечении и профилактике заболеваний, включая таковые, в развитии которых принимают участие нежелательные иммунные ответные реакции, которые опосредуются взаимодействиями СЭ154-СО40.

Уровень техники

Генерация гуморальных и клеточных иммунных реакций регулируется взаимодействием активированных Т-клеток-хэлперов с антигенпрезентующими клетками (АРС) и эффекторными Т-клетками. Активация Т-клеток-хелперов зависит не только от взаимодействия с антигенспецифическим рецептором Т-клеток (ТСВ) с его родственным пептидом-лигандом МНС, но также необходимо скоординированные связывание и активация под действием ряда адгезии клеток и костимулирующих молекул; см., например, 8а1ахаг-Еон1апа Ь.1. и Шегег В.Е., 2001, Сигг. Ορίη. Нета!. 8:5.

Одной критической костимулирующей молекулой является СЭ154. трансмембранный белок типа II, который экспрессируется на поверхности СЭ4' Т-клеток зависимым от активации, ограниченным во времени образом. СО154 также экспрессируется после активации на субпопуляции СЭ8' Т-клеток, базофилах, тучных клетках, эозинофилах, природных клетках-киллерах, В-клетках, макрофагах, дендритных клетках и тромбоцитах. Противорецептором СО154, т.е. СЭ40, является мембранный белок типа I, который конститутивно и на высоком уровне экспрессируется на поверхности клеток многих типов, включая АРС; см., например, Еоу Т.М. е! а1., 1996, Αηη. Веу. 1ттипо1., 14:591.

Сигнальный путь через СЭ40 с участием СО154 инициирует каскад событий, которые приводят к активации клеток, несущих СЭ40-рецептор, и оптимальному СЭ4' Т-клеточному праймированию. Конкретнее, связывание СО154 с СЭ40 стимулирует дифференцировку В-клеток в секретирующие антитела клетки и В-клетки памяти; см., например, Вигк1у Ь.С., 2001, Ιη Αάν. Ехр. Мей. Βίο., νοί. 489., Ό.Μ. Мопгое е! а1., ейв., К1и\\ег Асайет1с/Р1епит РиЬйвйегв, р. 135 (далее по тексту Вигк1у, выше). Кроме того, взаимодействие СЭ154-СО40 стимулирует развитие клеточных иммунных реакций посредством активации макрофагов и дендритных клеток и продукцию природных клеток-киллеров и цитотоксических Тлимфоцитов; см., например, Вигк1у, выше.

Важная роль СО154 в регуляции функции гуморальных и клеточных иммунных реакций вызвала большой интерес к применению ингибиторов данного пути для терапевтической иммуномодуляции. Было показано, что анти-СЭ154-антитела обладают целительными свойствами на широком ряде моделей иммунного ответа на другие терапевтические белки или генную терапию, аллергены, при аутоиммунных заболеваниях и трансплантации; см., например, патент США № 5474771, Вигк1у, выше.

Было показано, что взаимодействие СЭ40-СО154 является важным при нескольких индуцированных в эксперименте аутоиммунных заболеваниях, где было установлено, что индукцию заболевания можно блокировать антагонистами СО154 во время введения антигена (Вигк1у, выше). Также было показано подавление развития заболевания с использованием антагонистов СО154 на моделях спонтанного аутоиммунного заболевания на животных; см., например, Вигк1у, выше.

В настоящее время существует потребность в усовершенствованных анти-СЭ154-антителах с более высокой аффинностью связывания и меньшими нежелательными побочными эффектами. Повышенные эффекторные функции, такие как прямая цитотоксичность, комплементзависимая цитотоксичность (СЭС), антителозависимая цитотоксичность (АЭСС) и аномальная продукция антител, представляют собой нежелательные побочные эффекты, которые могут быть связаны с применением терапевтических антител.

Несколько эффекторных функций антител опосредуются, по меньшей мере, частично Есрецепторами (ЕсВ), которые связываются с Ес-областью антитела в константном домене типичного иммуноглобулина. Существует ряд Ес-рецепторов, которые являются специфическими для различных классов иммуноглобулинов. Данные классы иммуноглобулинов включают 1дО, 1дЕ, 1дА, Ι§Μ и Ι§ϋ. Классы иммуноглобулинов дополнительно подразделяют на подклассы: 1дО разделяют на четыре подкласса ДдСЕ Ι§Ο2, 1дС3 и 1дС4) и 1дА подразделяют на два подкласса (Ι§Α1 и Ι§Α2). Существует три известных рецептора для !дС: ЕсγВI (ΟΌ64), ЕсуВП (ΟΌ32) и ЕсуВШ (СЭ16). Каждый подкласс ЕсуВ кодируется

- 1 019636 двумя или тремя генами, и альтернативный сплайсинг РНК приводит к образованию множества транскриптов и широкому разнообразию изоформ РсуК.

Как правило, иммуноглобулины представляет собой молекулы Υ-образной формы, содержащие две идентичные тяжелые цепи и две идентичные легкие цепи. Дисульфидные связи связывают вместе пары тяжелой и легкой цепей, в также две тяжелые цепи. Каждая цепь состоит из одного вариабельного домена, который варьирует по последовательности и является ответственным за связывание с антигеном; эти домены известны как ν_Η- и У_ъ-домены для тяжелой и легкой цепей соответственно. В легкой цепи имеется один константный домен (С_ъ) и в тяжелой цепи находится три константных домена (С_Н1, С_Н2 и С_Н3). Молекулы, содержащие все вариабельные и константные домены, можно отнести к целым антителам.

Остатки в вариабельных доменах антитела обычно нумеруют согласно системе, разработанной КаЬа1 е! а1. Данная система была представлена в КаЬа! е! а1., 1987 в 8ес.|иепсе5 о! РгсИенъ о! 1тшипо1ощса1 1п1еге8!, И8 ЭсраПтсЩ о! НеаИй апб Нитап Зегуюез, ΝΙΗ, И8Л (далее по тексту КаЬа! е! а1., выше). Данная система нумерации используется в этом документе, за исключением тех случаев, когда указано иначе. Следует отметить, что обозначение остатков согласно системе КаЬа! не всегда непосредственно соответствует линейной нумерации аминокислотных остатков. Фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше или, напротив, больше аминокислот по сравнению со строгой нумерацией по КаЬа!, соответствующей укорочению или вставке структурного компонента, каркасной области или определяющей комплементарность области (СЭК) основной структуры вариабельного домена. Правильную нумерацию остатков по КаЬа! можно определить для данного антитела выравниванием гомологичных остатков в последовательности антитела со стандартной, нумерованной по КаЬа! последовательностью.

В вариабельных доменах имеются три области, которые являются гипервариабельными по последовательности в четырех более консервативных каркасных областях. Данные гипервариабельные области СЭК в основном ответственны за распознавание антигена. Области СЭК вариабельного домена тяжелой цепи расположены в остатках 31-35 (СЭК-Н1), остатках 50-65 (СЭК-Н2) и остатках 95-102 (СОК-Н3) согласно системе нумерации КаЬа1 Однако согласно системе С1ю11на (Сйо!Ыа С. апб Ьезк А.М., 1. Мо1. Вю1., 1987, 196:901-917) петля, эквивалентная СОК-Н1, распространяется от остатка 26 до остатка 32. Таким образом, СЭК-Н1, в том смысле, в котором этот термин используется в данном документе, также включает СЭК, расположенный в остатках 26-35, как описано при сочетании системы нумерации по КаЬа! и топологического определения петли по С1ю11аа. Области СЭК вариабельного домена легкой цепи расположены в остатках 24-34 (СОК-Ы), остатках 50-56 (СПК-Ь2) и остатках 89-97 (СОК-Ь3) согласно системе нумерации КаЬа1

Несмотря на то что природные антитела в виде целых антител или в виде фрагментов, сохраняющих специфические связывающие свойства, первоначально были получены от одного вида, генноинженерные антитела могут происходить от более чем одного вида животных, например химерные антитела. К настоящему времени, главным образом, были получены химерные мышиные/человеческие антитела и мышиные/антитела приматов, отличных от человека, хотя возможны другие видовые гибридные комбинации. В настоящее время известны многие другие конфигурации природных и генно-инженерных полипептидов антител, их производных и фрагментов. Общим свойством для всех является то, что полипептид или полипептиды сохраняют специфичность связывания антигена посредством одного или более доменов, связывающихся с эпитопом. Помимо связывания с эпитопом функциональные свойства полипептида антитела могут различаться в зависимости от того, какие другие последовательности присутствуют, например Рс-домены или другие последовательности, которые активируют эффекторные функции и/или взаимодействуют с другими клеточными путями.

СО154-связывающие белки, которые содержат эпитопсвязывающие домены (такие как области СЭК или вариабельные домены), включенные в остов или каркас, отличные от иммуноглобулинов (см., например, Βίπζ е! а1., 2005, №1. Вю!есй., 23:1257-1268; Ноззе е! а1., 2006, Рто!еш 8с1епсе, 15:14-27), могут проявлять сниженные эффекторные функции.

Желательно иметь новые связывающие белки, которые специфически препятствуют связыванию СО154 с СЭ40 и снижают или элиминируют в прямом направлении функции комплекса СЭ154-СО40. Было бы желательным иметь СО154-связывающие белки, такие как анти-СО154-аититела, с пониженными эффекторными функциями по сравнению с известными анти-СО154-антителами.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к решению данных и других проблем получением связывающего белка, такого как выделенное, рекомбинантное или синтетическое антитело, или его фрагмент или производное, которые специфически связываются с белком СО154, который может представлять собой человеческий белок СЭ154. Анти-СО154-антитела по изобретению, включая их фрагменты и производные, могут представлять собой моноклональные, поликлональные, мышиные, химерные, приматизированные, гуманизированные или полностью человеческие антитела. Аити-С^154-антитела по изобретению могут быть мультимерными, гетеродимерными, гемидимерными, моновалентными, бивалентными, тетравалентными, биспецифическими и могут включать одноцепочечные антитела и их производные.

В некоторых вариантах осуществления СО154-связывающие белки, например анги-СО154

- 2 019636 антитела, по настоящему изобретению обладают высокой селективностью по отношению к СЭ154 и в некоторых вариантах осуществления также обладают одной или более сниженными эффекторными функциями по сравнению, например, с анти-СО154-антителом 5с8 (продуцированным гибридомой, депонированной в АТСС под инвентарным номером НВ 10916, как описано в патенте США № 5474771; или гуманизированное антитело 5с8). Некоторые из СО154-связывающих белков, например анти-СО154антитела, по изобретению являются моновалентными в отношении связывания с СО154.

СО154-связывающие белки и анти-СЭ154-антитела (включая фрагменты и производные антител) по изобретению являются пригодными для ингибирования связывания СО154 с СЭ40 и делают это с высокой специфичностью, например, со значением 1С₅₀ в пределах от 20 пкМ до 1,5 мкМ включительно. В некоторых вариантах осуществления СО154-связывающие белки, например анти-СО154-антитела, по изобретению могут иметь значение 1С₅₀ в пределах от 20 до 500 пкМ, 50 до 500 пкМ или от 100 до 500 пкМ. В некоторых вариантах осуществления СО154-связывающие белки и анти-СО154-антитела (включая фрагменты и производные антител) по изобретению, по существу, не оказывают агонистического действия на активность СЭ40.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к СО154-связывающим белкам, например анти-СО154-антителам, которые проявляют высокую аффинность к человеческому СО154. Например, в некоторых вариантах осуществления СО154-связывающий белок, например антиСО154-антитело, диссоциирует от человеческого СО154 (человеческого СО40Б) со значением К_с в пределах от 50 нМ до 1 пкМ включительно по данным поверхностного плазмонного резонанса (например, В1асоге®). Например, К_с для человеческого СЭ154 может составлять от 50 до 1 пкМ, от 20 до 1 пкМ или даже от 10 до 1 пкМ. В некоторых вариантах осуществления К_с для человеческого СО154 составляет менее чем 20 пкМ. В других вариантах осуществления К_с для человеческого СО154 составляет менее чем 10 пкМ.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к СО154-связывающему белку, например анти-СО154-антителу, который, когда находится в насыщающих концентрациях или выше для связывания с СЭ154. основываясь на его аффинности связывания, способен блокировать связывание антитела 5с8 с СО154, в том случае, когда его добавляют к СО154 первым, и также способен вытеснять антитело 5с8, связанное с СО154, в том случае, когда его добавляют к СО154 после антитела 5с8.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку, например антителу, который специфически связывается с белком СО154 и который содержит или состоит из последовательности(й) одной или нескольких СЭВ (Н) тяжелой цепи, выбранных из СОВ-Н1 (8ЕО ΙΌ N0: 3), СОВ-Н2 (8ЕО ΙΌ N0: 4) и СЭВ-НЗ (8Е0 ΙΌ N0: 5). В дополнительных вариантах осуществления СО154-связывающий белок или антитело содержит или состоит по меньшей мере из двух СЭВ, выбранных из СЭВ-Н1 (НЕС) Ш N0: 3), С12В-Н2 (НЕС) ГО N0: 4) и ССВ-НЗ (НЕС) ГО N0: 5). В еще одних вариантах осуществления связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательностей всех трех СОВ Н, которые представляют СЭВ-Н1 (8Е0 ΙΌ N0: 3), СЭВ-Н2 (8Е0 ΙΌ N0: 4) и СЭВ-НЗ (НЕ(') ΙΌ N0: 5).

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку, например антителу, который специфически связывается с белком СО154 и который содержит или состоит из последовательности(й) одной или нескольких СЭВ (Ь) легкой цепи, выбранных из СОВ-Ь1 (8Е0 ΙΌ N0: 6), С0В-Б2 (8Е0 ΙΌ N0: 7) и СЭВ-БЗ (8Е0 ΙΌ N0: 8). В дополнительных вариантах осуществления СО154-связывающий белок или антитело содержит или состоит по меньшей мере из двух СЭВ, выбранных из С1)В-Е1 (НЕС) ΙΌ N0: 6), С1)В-Е2 (НЕС) ΙΌ N0: 7) и С1)В-ЕЗ (НЕС) ΙΌ N0: 8). В еще одних вариантах осуществления СО154-связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательностей всех трех СЭВ Ь, выбранных из С1)В-Е1 (НЕС) ΙΌ N0: 6), С1)В-Е2 (НЕС) ΙΌ N0: 7) и С1)В-ЕЗ (НЕС) ΙΌ N0: 8).

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку, например антителу, который специфически связывается с белком СО154 и который содержит или состоит из одной или нескольких из С12В-Е1 (НЕС) ΙΌ N0: 6), С12В-Е2 (НЕС) ΙΌ N0: 7) и СЕВ-Е.З (НЕС) ΙΌ N0: 8), и где связывающий белок или антитело дополнительно содержит или состоит из СОВ-Н1 (8Е0 ΙΌ N0: З), СОВ-Н2 (НЕ(') ΙΌ N0: 4) и СЭВ-НЗ (8Ер ΙΌ N0: 5).

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку, например антителу, который специфически связывается с белком СО154, где СО154-связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательности У_Н, выбранной из 8Е0 ΙΌ N0: 1, 8Е0 ΙΌ N0: 9, 8Е0 ΙΌ N0: 10 и 8Е0 ΙΌ N0: 11. В некоторых других вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку, например антителу, который специфически связывается с белком СО154, где СО154-связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательности тяжелой цепи, выбранной из 8Е0 ΙΌ N0: 12 и 8Е0 ΙΌ N0: 1З.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку, например антителу, который специфически связывается с белком СО154, где СО154-связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательности У_ь, выбранной из 8Е0 ΙΌ N0: 2 и 8Е0 ΙΌ N0: 14. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку,

- З 019636 например антителу, который специфически связывается с белком СЭ154. где СО154-связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательности легкой цепи 8ЕО ΙΌ N0: 13.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку, например антителу, который специфически связывается с белком ί.Ό154. где СО154-связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательности У_ь, выбранной из 8Е0 ΙΌ N0: 2 и 8Е0 ΙΌ N0: 14, и последовательности У_Н, выбранной из 8Е0 ΙΌ N0: 1, 8Е0 ΙΌ N0: 9, 8Е0 ΙΌ N0: 10 и 8Е0 ΙΌ N0: 11. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку, например антителу, который специфически связывается с белком СЭ154, где СО154-связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательности легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 15 и последовательности тяжелой цепи, выбранной из 8Е0 ΙΌ N0: 12 и 8Е0 ΙΌ N0: 13. В других вариантах осуществления СО154-связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательности легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 15 и последовательности тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 13.

В других вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку, например антителу, который специфически связывается с белком СЭ154 и который содержит или состоит из последовательности(й) одной или нескольких СОВ (Н) тяжелой цепи, выбранных из СЭВ-Н1 (8Е0 ΙΌ N0: 42), СОВ-Н2 (8Е0 ΙΌ N0: 43) и СЭВ-Н3 (8Е0 ΙΌ N0: 44). В дополнительных вариантах осуществления связывающий белок или антитело содержит или состоит по меньшей мере из двух СОВ, выбранных из СЭВ-Н1 (8ЕО ΙΌ N0: 42), С0В-Н2 (8ЕО ΙΌ N0: 43) и СОВ-Н3 (8ЕО ΙΌ N0: 44). В еще одних вариантах осуществления связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательностей всех трех СОВ Н, которые представляют СЭВ-Н1 (8Е0 ΙΌ N0: 42), СЭВ-Н2 (8Е0 ΙΌ N0: 43) и СОВ-Н3 (8ЕО ΙΌ N0: 44).

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку, например антителу, который специфически связывается с белком СЭ154, где связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательности(й) одной или нескольких СОВ (Ь) легкой цепи, выбранных из С1)1СЕ1 (8ЕО ΙΌ N0: 45), С0В-Е2 (8ЕО ΙΌ N0: 46) и С0В-Е3 (8ЕО ΙΌ N0: 47). В дополнительных вариантах осуществления связывающий белок или антитело содержит или состоит по меньшей мере из двух СОВ, выбранных из С0В-Е1 (8ЕО ΙΌ N0: 45), С0В-Е2 (8ЕО ΙΌ N0: 46) и С0В-Е3 (8ЕО ΙΌ N0: 47). В еще одних дополнительных вариантах осуществления связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательностей всех трех СОВ Ь, которые представляют СОВ-Ы (8Е0 ΙΌ N0: 45), С0В-Е2 (8Ер ΙΌ N0: 46) и С0В-Е3 (8ЕО ΙΌ N0: 47).

В некоторых вариантах осуществления СО154-связывающий белок или анти-СО154-антитело по настоящему изобретению содержит комплементарную последовательность, содержащую или состоящую из одной или нескольких СОВ легкой цепи СОВ-Ы, СПВ-Ь2 и СПВ-Ь3, соответственно приведенных выше, или комплементарную последовательность, содержащую или состоящую из одной или нескольких СОВ тяжелой цепи СОВ-Н1, СОВ-Н2 и СОВ-Н3, соответственно приведенных выше. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления связывающий белок или антитело по данному изобретению содержит или состоит из СОВ-Н1 (8ЕО ΙΌ N0: 42), СОВ-Н2 (8ЕО ΙΌ N0: 43) и СОВ-Н3 (8ЕО ΙΌ N0: 44) и С0В-Е1 (8ЕО ΙΌ N0: 45), С0В-Е2 (8ЕО ΙΌ N0: 46) и С0В-Е3 (8ЕО ΙΌ N0: 47).

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к СО154-связывающему белку, например анти-СП154-антителу, где связывающий белок или антитело содержит или состоит из следующих последовательностей трех СОВ Ь: СОВ-Ы (8Е0 ΙΌ N0: 45), СПВ-Ь2 (8Е0 ΙΌ N0: 46) и СЭВЬ3 (8Е0 ΙΌ N0: 47) и где связывающий белок или антитело дополнительно содержит или состоит из следующих последовательностей трех СОВ Н: СОВ-Н1 (8Е0 ΙΌ N0: 42), СОВ-Н2 (8Е0 ΙΌ N0: 43) и СОВ-Н3 (8ЕО ΙΌ N0: 44).

В дополнительных вариантах осуществления данное изобретение относится к связывающему белку, например антителу, который специфически связывается с СЭ154 и который содержит или состоит из последовательности вариабельной области легкой цепи (У_ь) 8Е0 ΙΌ N0: 54. Также изобретение относится к СО154-связывающему белку или анти-СП154-антителу, которые содержат или состоят из последовательности вариабельной области тяжелой цепи (У_Н) 8Е0 ΙΌ N0: 56. В некоторых вариантах осуществления СО154-связывающий белок или анти-СО154-антитело по изобретению может содержать или состоять из последовательности У_ъ 8Е0 ΙΌ N0: 54 и последовательности У_Н 8Е0 ΙΌ N0: 56.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к СО154-связывающему белку, например анти-СП154-антителу, который специфически связывается с СЭ154, где СЭ154связывающий белок или анти-СО154-антитело содержит или состоит из последовательности(й) одной или нескольких СОВ (Н) тяжелой цепи, выбранных из СОВ-Н1 (8Е0 ΙΌ N0: 48), СОВ-Н2 (8Е0 ΙΌ N0: 49) и СОВ-Н3 (8Е0 ΙΌ N0: 50). В дополнительных вариантах осуществления СЭ154-связывающий белок или анти-СО154-антитело содержит или состоит по меньшей мере из двух СОВ, выбранных из СОВ-Н1 (8ЕС) ΙΌ N0: 48), С0В-Н2 (8ЕО ΙΌ N0: 49) и СОВ-Н3 (8ЕО ΙΌ N0: 50). В еще одних вариантах осуществления СО154-связывающий белок или анти-СО154-антитело содержит или состоит из последовательностей всех трех СОВ, которые представляют СОВ-Н1 (8Е0 ΙΌ N0: 48), СОВ-Н2 (8Е0 ΙΌ N0: 49) и СЭВН3 (8 ЕС) ΙΌ N0: 50).

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к СО154-связывающему бел

- 4 019636 ку, например анти-СО154-антителу, который специфически связывается с белком СЭ154. где СЭ154связывающий белок или анти-СО154-антитело содержит или состоит из последовательности(й) одной или нескольких СОК (Б) легкой цепи, выбранных из СОК-Б1 (8ЕЦ ГО N0: 51), СОК-Б2 (8ЕЦ ГО N0: 52) и СГОБ-БЗ (8ЕЦ ГО N0: 53). В дополнительных вариантах осуществления СО154-связывающий белок или анти-СГО154-антитело содержит или состоит по меньшей мере из двух СОК, выбранных из С0К-Б1 (8ЕЦ ГО N0: 51), С0Б-Б2 (§ЕЦ ГО N0: 52) и СОБ-Б.'З (§ЕЦ ГО N0: 53). В еще одних вариантах осуществления СГО154-связывающий белок или анти-СГО154-антитело содержит или состоит из последовательностей всех трех СОК Ь, которые представляют СОБ-Б1 (8ЕЦ ГО N0: 51), СГОБ-Б2 (8ЕЦ ГО N0: 52) и СОБЬЗ (8ЕЦ ГО N0: 53).

В некоторых вариантах осуществления СГО154-связывающий белок, например анти-СО154антитело, по настоящему изобретению содержит комплементарную последовательность, содержащую или состоящую из одной или нескольких СОК легкой цепи С0К-Б1, СОБ-Б2 и СЭБ-БЗ, соответственно приведенных выше, или комплементарную последовательность, содержащую или состоящую из одной или нескольких СОК тяжелой цепи СГОБ-НБ СГОБ-Н2 и СЭБ-НЗ, соответственно приведенных выше. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитело по данному изобретению содержит или состоит из СОК Н, выбранных из СОК-111 (8ЕЦ ГО N0: 48), СОК-112 (8ЕЦ ГО N0: 49) и СОБ-НЗ (§ЕЦ ГО N0: 50), и СОК Б, выбранных из С0Б-Б1 (8ЕЦ ГО N0: 51), С0Б-Б2 (§ЕЦ ГО N0: 52) и СОБ-Б.'З (§ЕЦ ГО N0: 5З).

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к СО154-связывающему белку, например анти-СО154-антителу, где СО154-связывающий белок или анти-СО154-антитело содержит или состоит из последовательностей всех трех СОК Б, которые представляют СЭБ-Б1 (8ЕЦ ГО N0: 51), СГОБ-БТ (8ЕЦ ГО N0: 52) и СЭБ-БЗ (8ЕЦ ГО N0: 5З), и где связывающий белок, например антитело, дополнительно содержит или состоит из последовательностей всех трех СЭК Н, которые представляют СОК-Н1 (8ЕЦ ГО N0: 48), СОК-Н2 (8ЕЦ ГО N0: 49) и СОК-НЗ (8ЕЦ ГО N0: 50).

В дополнительных вариантах осуществления данное изобретение относится к СО154связывающему белку, например анти-СО154-антителу, который специфически связывается с СО 154, где СО154-связывающий белок или анти-СО154-антитело содержит или состоит из последовательности У_ъ 8ЕЦ ГО N0: 58. В дополнительных вариантах осуществления антитело содержит или состоит из последовательности У_Н 8ЕЦ ГО N0: 60. В дополнительных вариантах осуществления антитело содержит или состоит из последовательности У_Н 8ЕЦ ГО N0: 60 и последовательности У_ъ 8ЕЦ ГО N0: 58.

В некоторых вариантах осуществления СО154-связывающий белок по данному изобретению содержит последовательность легкой цепи 8ЕЦ ГО N0: 62 и последовательность тяжелой цепи 8ЕЦ ГО N0: 65. В других вариантах осуществления СО154-связывающий белок по данному изобретению содержит последовательность легкой цепи 8ЕЦ ГО N0: 6З и последовательность тяжелой цепи 8ЕЦ ГО N0: 66.

В некоторых вариантах осуществления СО154-связывающий белок по данному изобретению содержит последовательность легкой цепи 8ЕЦ ГО N0: 68 и последовательность тяжелой цепи 8ЕЦ ГО N0: 71. В других вариантах осуществления СО154-связывающий белок по данному изобретению содержит последовательность легкой цепи 8ЕЦ ГО N0: 69 и последовательность тяжелой цепи 8ЕЦ ГО N0: 72. В других вариантах осуществления СО154-связывающий белок содержит по меньшей мере одну из последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 68, 8ЕЦ ГО N0: 69, 8ЕЦ ГО N0: 71 и 8ЕЦ ГО N0: 72.

Последовательности СОК 8ЕЦ ГО N0: З-8 получены из крысиного моноклонального антитела З42. В альтернативном варианте осуществления изобретения анти-СО154-антитело представляет собой крысиное антитело З42, содержащее последовательность У_Н-домена 8ЕЦ ГО N0: 29 и последовательность Уь-домена 8ЕЦ ГО N0: З0. Также изобретение относится к молекуле выделенной, рекомбинантной или синтетической ДНК, которая содержит или состоит по меньшей мере из одной последовательности, выбранной из 8ЕЦ ГО N0: З1 и 8ЕЦ ГО N0: З2. Дополнительно предоставляется вектор, содержащий по меньшей мере одну последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО N0: ЗЗ и 8ЕЦ ГО N0: З4.

Также изобретение относится к СО154-связывающим белкам, например анти-СО154-антителам, которые селективно связываются с тем же самым эпитопом, что и любое из анти-СО154-антител, раскрытых в данном документе (например, антитела З42, З81 и ЗЗ8 и их связывающиеся с эпитопом последовательности). В частности, антитела З42 и ЗЗ8 по настоящему изобретению проявляют аналогичные связывающие СО154 свойства, когда используются в качестве первого или второго антител в конкурентных тестах с анти-СО154-антителом 5с8, как описано в данном документе.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретение относится к СО154связывающим белкам и анти-СО154-антителам, которые связываются с тем же самым эпитопом, что и гуманизированное антитело, содержащее последовательность тяжелой цепи 8ЕЦ ГО N0: 12 или 8ЕЦ ГО N0: 1З и содержащее последовательность легкой цепи 8ЕЦ ГО N0: 15 (ЕаЬ- и ЕаЬ'-фрагменты З42), и которое проявляет аналогичные связывающие СО154 свойства в том случае, когда используются в качестве первых или вторых антител в конкурентных тестах с анти-СО154-антителом 5с8, как описано в данном документе. В других вариантах осуществления изобретение относится к СО154-связывающим белкам и анти-СО154-антителам, которые связываются с тем же самым эпитопом, что и гуманизированное антитело, содержащее последовательность У_ъ-домена 8ЕЦ ГО N0: 58 и последовательность У_Н-домена

- 5 019636

8ЕО ΙΌ N0: 60 (вариабельные последовательности антитела 338), и которые проявляют аналогичные связывающие СЭ154 свойства в конкурентных тестах с анти-СЭ154-антителом 5с8, как описано в данном документе.

В любом из описанных выше вариантов осуществления, относящихся к СЭ154-связывающему белку по изобретению, связывающий белок может быть ПЭГилирован. В вариантах осуществления, в которых СЭ154-связывающий белок является анти-СЭ154-антителом. полипептидом антитела или его фрагментом или производным, антитело может быть ПЭГилировано в тяжелой цепи, легкой цепи или обеих цепях.

Также настоящее изобретение относится к молекуле выделенной, рекомбинантной и/или синтетической ДНК, которая содержит или состоит по меньшей мере из одной последовательности, выбранной из 8ЕО ΙΌ N0: 16, 8ЕО ΙΌ N0: 17, 8ЕО ΙΌ N0: 18 и 8ЕО ΙΌ N0: 25.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение также относится к молекуле выделенной, рекомбинантной и/или синтетической ДНК, которая содержит или состоит по меньшей мере из одной последовательности, выбранной из 8Е0 ΙΌ N0: 19, 8Е0 ΙΌ N0: 20, 8Е0 ΙΌ N0: 21, 8Е0 ΙΌ N0: 22, 8ЕО ΙΌ N0: 23, 8ЕО ΙΌ N0: 24, 8ЕО ΙΌ N0: 26, 8ЕО ΙΌ N0: 27, 8ЕО ΙΌ N0: 67, 8ЕО ΙΌ N0: 70 и 8ЕО ΙΌ N0: 73.

В еще одних вариантах осуществления изобретение относится к молекуле выделенной, рекомбинантной и/или синтетической ДНК, которая содержит или состоит по меньшей мере из одной последовательности, выбранной из 8Е0 ΙΌ N0: 28 и 8Е0 ΙΌ N0: 41.

Также данное изобретение относится к вектору, который содержит любую из молекул выделенной, рекомбинантной и/или синтетической ДНК по данному изобретению. В одном варианте осуществления вектор содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из 8Е0 ΙΌ N0: 25, 8Е0 ΙΌ N0: 26, 8ЕО ΙΌ N0: 27, 8ЕО ΙΌ N0: 28 и 8ЕО ΙΌ N0: 41.

В дополнительных вариантах осуществления данное изобретение относится к молекуле выделенной, рекомбинантной и/или синтетической ДНК, которая содержит или состоит по меньшей мере из одной последовательности, выбранной из 8Е0 ΙΌ N0: 55 и 8Е0 ΙΌ N0: 57. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к молекуле выделенной, рекомбинантной и/или синтетической ДНК, содержащей или состоящей из обеих последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 55 и 8Е0 ΙΌ N0: 57.

В дополнительных вариантах осуществления данное изобретение относится к молекуле выделенной, рекомбинантной и/или синтетической ДНК, которая содержит или состоит по меньшей мере из одной последовательности, выбранной из 8Е0 ΙΌ N0: 59 и 8Е0 ΙΌ N0: 61. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к молекуле выделенной, рекомбинантной и/или синтетической ДНК, содержащей или состоящей из обеих последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 59 и 8Е0 ΙΌ N0: 61.

В любом из вариантов осуществления изобретения, относящихся к СЭ154-связывающим белкам и анти-СП154-антителам, которые содержат последовательности, вносящие свой вклад в обеспечение эффекторных функций, указанные связывающие белки и анти-СЭ154-антитела могут быть дополнительно выбраны или сконструированы для проявления пониженной эффекторной функции по сравнению с антиСЭ154-антителом с Ее-областью, как описано в данном документе. Например, СЭ154-связывающие белки и анти-СЭ154-антитела, которые не содержат последовательностей Ес-области или константной области или у которых отсутствуют последовательности функциональных Ес-области или константной области, могут быть выбраны для использования по данному изобретению.

В некоторых вариантах осуществления СЭ154-связывающие белки и анти-СЭ154-антитела по изобретению являются моновалентными в отношении связывания с СЭ154 и предпочтительно проявляют пониженные эффекторные функции при введении субъекту по сравнению с СЭ154-связывающим белком сравнения, таким как бивалентное анти-СЭ154-антитело.

В некоторых других вариантах осуществления последовательности Ес-области или константной области, если они присутствуют в СЭ154-связывающем белке, например полипептиде анти-СЭ154антитела, могут быть выбраны или сконструированы для содержания одной или более модификаций (например, аминокислотных замен, вставок, аддуктов или делеций), что приводит к снижению или элиминации одной или более эффекторных функций по сравнению с контрольным анти-СЭ154-антителом, содержащим нативные, исходные или немодифицированные последовательности Ес-области или константной области.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения Ес-область, в том случае, когда она имеется, представляет собой Ес-область из или полученную из !цС1, Ι§02, ΙβΟ3 или ΙβΟ4 антитела. В некоторых вариантах осуществления можно использовать гибридные Ес-области, т.е. Ι§01/Ι§04 гибридные Ес-последовательности. В конкретных вариантах осуществления Ес-область содержит Еспоследовательности Ι§04 или она получена из [дС4-антитела. Необходимо понимать, что можно использовать любую гибридную комбинацию между различными Ес-областями, которая приводит к снижению одной или более эффекторных функций по данному изобретению.

В некоторых других вариантах осуществления уменьшают или элиминируют гликозилирование Есобласти антитела или изменяют профиль гликозилирования антитела, как описано далее в данном документе. В некоторых вариантах осуществления СЭ154-связывающий белок или полипептид анти-СЭ154

- 6 019636 антитела содержит С_н2-домен с Ес-областью, содержащей модификацию с модификацией в или вблизи консервативного сайта Ы-связанного гликозилирования. Модификация в консервативном сайте Несвязанного гликозилирования может включать мутацию в или вблизи сайта гликозилирования тяжелой цепи, где мутация снижает, изменяет или предупреждает гликозилирование в сайте. В дополнительных вариантах осуществления модификация включает мутацию N2980 (N297 при использовании ЕЙ нумерации КаЬа!). В некоторых вариантах осуществления модификация включает удаление гликанов в С_н2домене или их фрагментах. В некоторых альтернативных вариантах осуществления модификация предупреждает образование зрелого Ν-гликана в сайте гликозилирования.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к СБ154-связывающему белку, например анти-СБ154-антителу. содержащему последовательность СБК3 тяжелой цепи, выбранную из 8Е0 ΙΌ N0: 5, 44 и 50, и вариантную Ес-область, где вариантная Ес-область содержит первый аминокислотный остаток и сайт Ν-гликозилирования, где первый аминокислотный остаток модифицирован изменением боковой цепи или аминокислотной заменой для достижения повышенного стерического размера или повышенного электростатического заряда по сравнению с немодифицированным первым аминокислотным остатком, со снижением тем самым уровня или изменением иным образом гликозилирования в сайте Ν-гликозилирования. В некоторых из данных вариантов осуществления вариантная Есобласть придает пониженную эффекторную функцию по сравнению с контрольной, невариантной Есобластью.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к СБ154-связывающему белку, например анти-СБ154-антителу, содержащему последовательность СБК3 тяжелой цепи, выбранную из 8Е0 ΙΌ N0: 5, 44 и 50, и вариантную Ес-область, где вариантная Ес-область содержит первый аминокислотный остаток и сайт N-гликозилирования, где первый аминокислотный остаток содержит тиол цистеин со снижением тем самым уровня или изменением иным образом гликозилирования в сайте N гликозилирования, где вариантная Ес-область придает пониженную эффекторную функцию.

В некоторых вариантах осуществления первый аминокислотный остаток и сайт N гликозилирования анти-СБ154-антител, содержащиих вариантные Ес-области, описанные выше, находятся вблизи или в мотиве ^связанного гликозилирования. В дополнительных вариантах осуществления мотив ^связанного гликозилирования содержит аминокислотную последовательность NXΤ или NX8. В некоторых вариантах осуществления мотив ^связанного гликозилирования содержит аминокислотную последовательность NXΤ. В некоторых вариантах осуществления сайт N-гликозилирования расположен в аминокислоте 297 по системе нумерации КаЬа!. В дополнительных вариантах осуществления первый модифицированный аминокислотный остаток представляет аминокислоту 299 по системе нумерации КаЬа!.

В некоторых из описанных выше вариантов осуществления пониженная эффекторная функция, проявляемая любым из антител или фрагментов антител, содержащих связывающие белки, описанные в данном документе, представляет пониженное связывание с Ес-рецептором (ЕсК). В некоторых вариантах осуществления Ес-рецептор (ЕсК) выбран из ЕсуК1, ЕсуКЛ и ЕсуКШ и одного или более их подтипов, например, таких как ЕсуКЛа. В некоторых вариантах осуществления связывание с ЕсК ниже по меньшей мере примерно в 1,5 раза или более, примерно в 2 раза или более, примерно в 3 раза или более, примерно в 4 раза или более, примерно в 5 раз или более, примерно в 6 раз или более, примерно в 7 раз или более, примерно в 8 раз или более, примерно в 9 раз или более, примерно в 10 раз или более, примерно в 15 раз или более, примерно в 50 раз или более или примерно в 100 раз или более.

В некоторых вариантах осуществления СБ154-связывающий белок, например анти-СБ154антитело, по изобретению с одной или более пониженными эффекторными функциями, описанными в данном документе, не связывается со специфическим эффекторным рецептором или подтипом эффекторного рецептора. В некоторых из данных вариантов осуществления СБ154-связывающий белок, например анти-СБ154-антитело, не связывается с ЕсуКЛа.

В некоторых вариантах осуществления пониженная эффекторная функция, проявляемая любым одним из антител, описанных в данном документе, представляет пониженное связывание с белком комплемента. В некоторых вариантах осуществления белок комплемента представляет С1с.|. В некоторых вариантах осуществления связывание с белком комплемента ниже по меньшей мере примерно в 1,5 раза или более, примерно в 2 раза или более, примерно в 3 раза или более, примерно в 4 раза или более, примерно в 5 раз или более, примерно в 6 раз или более, примерно в 7 раз или более, примерно в 8 раз или более, примерно в 9 раз или более, примерно в 10 раз или более, примерно в 15 раз или более.

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения СБ154-связывающий белок, например анти-СБ154-антитело, по изобретению содержит одну или более модификаций или вариаций Ес-области, не гликозилирован и проявляет одну или более пониженных эффекторных функций при введении субъекту.

В некоторых вариантах осуществления СБ154-связывающий белок, например анти-СБ154антитело, по изобретению вызывает меньше тромбоэмболических осложнений по сравнению с введением анти-СБ154-антитела 5с8 при введении субъекту.

- 7 019636

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения модифицированный первый аминокислотный остаток СЭ154-связывающих белков или анти-СО154-антител. содержащих вариантные Реобласти, описанные в данном документе, связан с функциональной группой. В дополнительных вариантах осуществления функциональная группа представляет блокирующую группу, детектируемую группу, диагностическую группу или терапевтическую группу или их комбинации. Блокирующая группа в некоторых вариантах осуществления может представлять, например, цистеиновый аддукт, смешанный дисульфид, полиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль-малеимид. Детектируемая группа в некоторых вариантах осуществления может представлять, например, флуоресцентную группу, люминесцентную группу или изотопную группу. В вариантах осуществления, в которых используется диагностическая группа, эта диагностическая группа может быть способной выявлять наличие состояния, заболевания или нарушения. В других вариантах осуществления можно использовать терапевтическую группу, например, такую как противовоспалительное средство, противоопухолевое средство, средство для лечения нейродегенеративного заболевания, антитело, которое является селективным для молекулы, отличной от СЭ154, или противоинфекционное средство.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения СО154-связывающий белок, например анти-СО154-антитело, содержит модифицированный аминокислотный остаток, где модификация обеспечивает сайт-направленное конъюгирование белка или антитела с функциональной группой, такое как сайт-направленное пэгилирование. В некоторых вариантах осуществления модифицированный аминокислотный остаток представляет остаток цистеина, модифицированный цистеиновым или смешанным дисульфидным аддуктом. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления СО154-связывающий белок представляет полипептид анти-СЭ154-антитела, который пэгилирован по модифицированному аминокислотному остатку, например по остатку цистеина или лизина. В некоторых вариантах осуществления анти-СЭ154-антитело является РаЬ- или РаЬ'-фрагментом, пэгилированным ПЭГ-малеимидом.

Также данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, например последовательностям ДНК, кодирующим СО154-связывающие белки, например анти-СО154-антитела, по изобретению.

Последовательности ДНК по настоящему изобретению могут включать синтетическую ДНК, например, полученную химической обработкой, кДНК, геномную ДНК или любую их комбинацию. Данное изобретение дополнительно относится к клонирующим или экспрессирующим векторам, содержащим одну или более нуклеиновых кислот, например последовательности ДНК по настоящему изобретению. Также изобретение относится в некоторых вариантах осуществления к вектору, содержащему любую из синтетических, выделенных и/или рекомбинантных нуклеиновых кислот, описанных выше.

Данное изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей последовательность ДНК или вектор по изобретению. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способу получения СО154-связывающего белка, например анти-СО154-антитела, включающему культивирование клеткихозяина, содержащей любой из векторов, описанных выше, в условиях, подходящих для продукции СО154-связывающего белка или анти-СЭ154-антитела клеткой-хозяином. В некоторых вариантах осуществления способ включает выделение СО154-связывающего белка или анти-СЭ154-антитела из культуры клеток-хозяев.

В некоторых вариантах осуществления СО154-связывающий белок, анти-СЭ154-антитело или нуклеиновую кислоту по данному изобретению метят детектируемым маркером, который может представлять собой радиоактивный изотоп, фермент, краситель или биотин. В некоторых других вариантах осуществления антитело по данному изобретению конъюгируют по меньшей мере с одним другим терапевтическим средством, которое, например, может представлять радиоактивный изотоп, радионуклид, токсин, токсоид, полипептид или фрагмент не специфического к СЭ154 антитела (например, получив при этом биспецифическое или мультиспецифическое антитело) или химиотерапевтическое средство. В еще одних вариантах осуществления антитело по данному изобретению конъюгируют с визуализирующим агентом, который может представлять группу для мечения. Агент для мечения также может представлять биотин, флуоресцентную или люминесцентную группу, радиоактивную группу, гистидиновую метку или пептидную метку.

Также настоящее изобретение относится к вариантам последовательностей СО154-связывающих белков, например анти-СЭ154-антител, описанных в данном документе, последовательностям нуклеиновых кислот, которые их кодируют. Варианты последовательностей по изобретению предпочтительно обладают по меньшей мере 90, 91, 92, 93 или 94% идентичностью с полипептидом по изобретению или с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует его. Более предпочтительно вариант последовательности обладает по меньшей мере 95, 96, 97 или 98% идентичностью на уровне аминокислот или нуклеиновых кислот. Наиболее предпочтительно вариант последовательности по изобретению предпочтительно обладает по меньшей мере 99, 99,5, 99,9% идентичностью с полипептидом по изобретению или с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует его.

Следовательно, настоящее изобретение относится к выделенному белку, содержащему последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9 или 100% идентична последовательности 81Т) ГО N0: 1, 81Т) ГО N0: 2, 81Т) ГО N0: 3, 81Т) ГО N0: 4, 81Т) ГО N0: 5, 81Т) ГО N0: 6, 81Т) ГО N0:7, 81Т) ГО N0: 8, 81Т) ГО N0: 9, 81Т) ГО N0: 10, 81Т) ГО N0: 11, 81Т) ГО N0: 12, 81Т)

- 8 019636

ΙΌ N0: 13, 8ΕΟ ΙΌ N0: 14, 8Ер ΙΌ N0: 15, 8ΕΟ ΙΌ N0: 16, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 29, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 30, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 42, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 43, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 44, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 45, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 46, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 47, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 48, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 49, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 50, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 51, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 52, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 53, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 54, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 56, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 58, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 60, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 68, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 69, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 71 или 8ΕΕ) ΙΌ N0: 72.

В некоторых вариантах осуществления полипептид химерного, гуманизированного или человеческого анти-СО154-антитела по изобретению представляет, например, ЕЛЬ, ЕаЬ, ЕаЬ', ксЕу, Εν, связанный через дисульфид Εν, или содержит один вариабельный домен иммуноглобулина, такой как ν_Η- или У|,-домен. который является специфическим или моновалентным в отношении связывания СО154. Некоторые СО154-связывающие белки, например полипептиды химерных, гуманизированных или человеческих анти-СО154-антител по изобретению, содержат одну, две или более областей СОВ по изобретению и альтернативный остов или универсальные каркасные последовательности. В некоторых вариантах осуществления СО154-связывающие белки и анти-СО154-антитела по изобретению содержат единственный вариабельный домен, выбранный из вариабельной области тяжелой цепи (ν_Η) и вариабельной области легкой цепи (νΒ).

Также изобретение относится к СО154-связывающему белку, например полипептиду химерного, гуманизированного или человеческого анти-СО154-антитела, которое является моновалентным в отношении связывания с СО154, которое конъюгировано с функциональной группой, которая приводит к повышению его времени полужизни в условиях ίη νίνο по сравнению с тем же полипептидом без функциональной группы. В некоторых вариантах осуществления функциональная группа включает или состоит из полиэтиленгликоля. В некоторых вариантах осуществления функциональная группа включает или состоит из молекулы альбумина, такого как человеческий сывороточный альбумин. Следовательно, изобретение относится к связанному с ПЭГом СО154-связывающему белку, например связанному с ПЭГом полипептиду химерного, гуманизированного или человеческого анти-СО154-антитела, которое специфически и моновалентно связывается с СО154, и который имеет увеличенное время полужизни в условиях ίη νίνο по сравнению с тем же полипептидом без связанного полиэтиленгликоля.

Также данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один СО154-связывающий белок, например анти-СО154-антитело, по настоящему изобретению, которая может в некоторых вариантах осуществления дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция по изобретению может необязательно дополнительно содержать дополнительное биологически активное соединение или терапевтическое средство, например, такое как иммуносупрессивное или иммуномодулирующее соединение или средство, или диагностическое средство. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит терапевтически эффективное количество пэгилированного анти-СО154-ЕаЬ'-антитела, обладающего специфичностью к эпитопу анти-СО154-антитела 342 или 338, описанных в данном документе.

Дополнительно настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики состояния, нарушения, заболевания у человека, опосредованного в целом или частично сигнальным путем с участием СО40, или симптома любого из упомянутого выше, где способ включает стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей СО154-связывающий белок, например анти-СО154-антитело, по настоящему изобретению, таким образом, что обеспечивается лечение или профилактика состояния, заболевания или нарушения.

Также данное изобретение относится к способу ингибирования или профилактики иммунной, аутоиммунной или воспалительной ответной реакции, опосредованной в целом или частично сигнальным путем с участием СО40, или симптома любого из упомянутого выше, где способ включает стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей СО154-связывающий белок, например анти-СО154-антитело, по настоящему изобретению, таким образом, что обеспечивается терапевтическая или профилактическая ответная реакция. В некоторых вариантах осуществления способ используют для лечения субъекта, имеющего симптомы или которому поставлен диагноз системной красной волчанки (8ΌΕ). В других вариантах осуществления способ используют для лечения субъекта, имеющего симптомы или которому поставлен диагноз ревматоидного состояния, например, такого как ревматоидный артрит (ВА).

Данное изобретение относится к полипептиду человеческого антитела, который является моновалентным в отношении связывания с СО154. В некоторых вариантах осуществления полипептид человеческого антитела, который является моновалентным в отношении связывания с СО154, когда находится в насыщающих концентрациях или выше для связывания с СО154, основываясь на его аффинности связывания, блокирует связывание антитела 5с8 с СО154 в том случае, когда его добавляют к СО154 первым, и вытесняет антитело 5с8, связанное с СО154, в том случае, когда его добавляют после антитела 5с8. В некоторых вариантах осуществления полипептид человеческого антитела связан с ПЭГом. В некоторых вариантах осуществления полипептид человеческого антитела не содержит Ес-домена. В некоторых из описанных выше вариантов осуществления СО154-связывающий белок или полипептид человеческого антитела не вытесняет СО154, связанный с СО40.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к пэгилированному анти-СО154ЕаЬ'-антителу, которое является моновалентным в отношении связывания с СО154 и дополнительно от

- 9 019636 носится к способам лечения или профилактики одного или более симптомов артрита, такого как ревматоидный артрит, или системной красной волчанки (8ЬЕ), включающим стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей пэгилированное анти-СО 154-ЕаЬ'-антитело, таким образом, что обеспечивается терапевтическая или профилактическая ответная реакция.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена таблица с аминокислотными последовательностями определяющих комплементарность областей (СОВ) анти-СП154-антител 342, 381 и 338.

На фиг. 2 представлена таблица с аминокислотными и соответствующими нуклеотидными последовательностями У_Н- и Уь-доменов крысиного анти-СЭ154-антитела 342. Подчеркнутые последовательности соответствуют нуклеотидной последовательности, кодирующей лидерный (т.е. сигнальный) пептид.

На фиг. 3 представлена таблица с аминокислотными и соответствующими нуклеотидными последовательностями человеческих акцепторных каркасных областей, использованных для получения гуманизированных анти-СЭ154-антител в примерах.

На фиг. 4 представлена таблица с аминокислотными и соответствующими нуклеотидными последовательностями У_Н- и У_ъ-доменов, в которых СЭВ антитела 342 были пересажены в каркасные области, приведенные на фиг. 3.

На фиг. 5 представлена таблица с аминокислотными и соответствующими нуклеотидными последовательностями У_н-доменов антитела 342 (УН3 дН1 и УН4 дН1). в которых СЭВ антитела 342 были пересажены в человеческие акцепторные каркасные области и в которых были сохранены некоторые ключевые донорные остатки.

На фиг. 6 представлена таблица с аминокислотными и соответствующими нуклеотидными последовательностями домена У_ъ антитела 342 (УК1 дЬ1), в которых СЭВ антитела 342 были пересажены в человеческие акцепторные каркасные области и в которых были сохранены некоторые ключевые донорные остатки.

На фиг. 7 представлена таблица с последовательностями для полной легкой цепи (вариабельной и константной областей легкой цепи) и областей тяжелой цепи антитела 342. Подчеркнуты последовательности, соответствующие сигнальному/лидерному пептидам.

На фиг. 8 показана нуклеотидная последовательность экспрессирующих инсертов, которые использовали для получения вариантов ЕаЬ (8ЕО ΙΌ N0: 28) и ЕаЬ' (8Е0 ΙΌ N0: 41) пересаженного 342 дЬ4дН1. Подчеркнуты сигнальная/лидерная последовательности и выделены заглавными буквами и жирным шрифтом сайты рестрикции (использованные для клонирования в экспрессирующий вектор Е. со11, как описано в примере 2).

На фиг. 9 показано выравнивание аминокислотной последовательности легкой и тяжелой цепей крысиного анти-СЭ154-антитела 342 (донорного антитела) с человеческими каркасными (акцепторными) областями зародышевой линии, использованными при гуманизации антитела 342. Легкая цепь антитела 342 представляет собой последовательность крысиного Уь-домена. Тяжелая цепь антитела 342 представляет последовательность крысиного У_Н-домена. Остатки СЭВ выделены жирным шрифтом и подчеркнуты. Показаны акцепторная каркасная область легкой цепи (2 1 1 О12; 8Е0 Ш N0: 35) и тяжелой цепи (1-1 3-66; 8Е0 ΙΌ N0: 37 и 1-1 4-59; 8Е0 ΙΌ N0: 39). Также показаны только пересаженные СЭВ в человеческие акцепторные каркасные области зародышевой линии (УК1 дЬ3, УН3 дН7 и УН4 дН6). В некоторых гуманизированных тяжелых и легких цепях сохраняются донорные остатки антитела 342 в каркасной области и данные ключевые остатки донорной каркасной области выделены курсивом и жирным шрифтом. Донор УК1 дЬ4 представляет В38, Υ71 и 885. Донор УН3 дН1 представляет У24, М48, 049, Т83 и У78. Донор УН4 дН1 представляет М48, В71 и У78. Приведены 8Е0 ΙΌ N0 для легких цепей в порядке сверху вниз: 8ЕО ΙΌ N0: 30 (342), 8ЕО ΙΌ N0: 35 (2 1 1 О12), 8ЕО ΙΌ N0: 14 (342 дЬ3) и 8Е0 ΙΌ N0: 2 (342 дЬ4). Приведены 8Е0 ΙΌ N0 для тяжелых цепей (пересаженные УН3) в порядке сверху вниз: 8ЕО ΙΌ N0: 29 (342), 8ЕО ΙΌ N0: 37 (1-1 3-66), 8ЕО ΙΌ N0: 10 (342 дН7) и 8ЕО ΙΌ N0: 1 (342 дН1). Приведены 8Е0 ΙΌ N0 для тяжелых цепей (пересаженные УН4) в порядке сверху вниз: 8ЕО ΙΌ N0: 29 (342), 8ЕО ΙΌ N0: 39 (1-1 4-59), вариант 8ЕО ΙΌ N0: 9 (УН4 дН6 (8ЕО ΙΌ N0: 74)) и вариант 8ЕО ΙΌ N0: 11 (УН4 дН1 (8ЕО ΙΌ N0: 75)). Варианты 8ЕО ΙΌ N0: 9 и 8ЕО ΙΌ N0: 11, приведенные на фиг. 9, начинаются с аминокислоты Е (вместо 'Ή, как имеет место соответственно на фиг. 4 и 5) для экспрессии в Е. сой. Следовательно, нуклеотидные последовательности, которые соответствуют данным мутантным 8Е0 ΙΌ N0: 9 и 11, отличаются от нуклеотидных последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 19 и 8Е0 ΙΌ N0: 21 в том, что они начинаются с нуклеотида д вместо с.

На фиг. 10 представлены аминокислотные и соответствующие нуклеотидные последовательности У_Н- и Уь-доменов анти-СЭ154-антитела 381. Подчеркнуты аминокислотные последовательности СЭВ.

На фиг. 11 представлены аминокислотные и соответствующие нуклеотидные последовательности У_Н- и Уь-доменов анти-СЭ154-антитела 338. Подчеркнуты аминокислотные последовательности СЭВ.

На фиг. 12 представлена таблица с перечнем крысиных антител против человеческого СЭ154. выделенных методом отбора антител лимфоцитов (8ЬАМ). В таблице приведены значения К,| и ТС₅₀, полученные для данных антител при постановке анализа В1асоге®, тестов со связыванием СЭ40 и тестов по

- 10 019636 активации 1САМ-1. Выделены данные, полученные с антителом 342.

На фиг. 13 представлены аминокислотные и соответствующие нуклеотидные последовательности легкой каппа-цепи агликозилированного анти-СО154-антитела 1и5с8 (1и5с8 ад1уР-йи1дС4).

На фиг. 14 представлены аминокислотные и соответствующие нуклеотидные последовательности тяжелой цепи агликозилированного анти-СО154-антитела Йи5с8 (Йи5с8 ад1уР-йи1дС4). Введенные мутации для получения агликозилированного варианта (8228Р/Т299А согласно ЕЙ номенклатуре КаЬа1; остатки 226 и 297) подчеркнуты и выделены жирным шрифтом в последовательности зрелого белка.

На фиг. 15 представлены аминокислотные и соответствующие нуклеотидные последовательности легкой каппа-цепи агликозилированного анти-СО154-антитела йи342 (йи342 ад1уР-йи1дС4).

На фиг. 16 представлены аминокислотные и соответствующие нуклеотидные последовательности тяжелой цепи агликозилированного анти-60154-антитела йи342 (йи342 ад1уР-йи1дС4). Введенные мутации для получения агликозилированного варианта (8228Р/Т299А согласно номенклатуре КаЬа! ЕЙ; остатки 226 и 297) подчеркнуты и выделены жирным шрифтом в последовательности зрелого белка.

На фиг. 17 приведены примерные ЕаЬ'-фрагменты и гель, показывающий сайт-направленное ПЭГилирование ЕаЬ'-фрагмента анти-60154-антитела. ЕаЬ'-фрагмент пэгилировали взаимодействием ПЭГмалеимида с одним остатком цистеина в шарнирной области.

На фиг. 18 представлена таблица со значениями К,| и 1С₅₀, полученными при постановке анализа В1асоге®, тестов со связыванием СЭ40. тестов по активации 1САМ-1 и конкурентных тестов с СЭ40 для различных вариантов осуществления гуманизированного антитела 342 дЬ4дН1, включая ЕаЬ'-фрагменты и конъюгаты антитело-ПЭГ.

На фиг. 19 приведено два графика значений титра анти-ТТ (столбнячного токсоида) 1дС как функция времени у макак циномолгус, которые получали контрольный физиологический раствор или различные дозы анти-СО154-антитела. На верхнем графике приведены значения титра 1дС для периода 0-20 суток после введения антитела и заражения ТТ (первичный иммунный ответ) и на нижнем графике приведены значения для периода 30-50 суток после введения антитела и второго заражения ТТ на 30 сутки.

На фиг. 20 приведен график значений титра анти-ТТ (столбнячного токсоида) 1д6 как функцию времени у макак циномолгус, которые получали различные форматы анти-СП154-антигел в однократной дозе (20 мг/кг для 1ш5с8. агликозильного антитела 5с8 и агликозильного антитела 342 и 40 мг/кг для 342 ЕаЬ'-ПЭГ и 342 ΌΕΜ-ПЭГ). ΌΕΜ-ПЭГ представляет фрагмент антитела, в котором два ЕаЬ'-фрагмента сшиты пэгилированным дималеимидным мостиком.

На фиг. 21 приведен график значений титра анти-ТТ (столбнячного токсоида) 1дМ как функцию времени у макак циномолгус, которые получали контрольный физиологический раствор или различные дозы анти-СО154-антитела. На графике приведены значения титра 1дМ для периода 0-20 суток после стимуляции ТТ (первичный ответ).

На фиг. 22 приведены сравнительные данные по фармакокинетике антитела 342 ЕаЬ'-ПЭГ и антитела 1ш5с8 у макак циномолгус.

На фиг. 23 приведены результаты анализа проточной цитометрией перекрестного блокирования связывания меченого 342 ЕаЬ' с экспрессирующими СЭ154 клетками 1игка1 Ό1.1, предварительно связанными с немеченым первым анти-СО154 ЕаЬ', как указано на каждой панели (23А - А33; 23В - 338; 23С 402; 23Ό - 381; 23Е - 300; 23Е - 294; 236 - 335; 23Н - 303) (см. пример 9). А33 представляет подобранное по изотипу контрольное антитело, и показано, что в данном случае неспецифическое перекрестное блокирование отсутствует.

На фиг. 24 приведены результаты анализа проточной цитометрией перекрестного блокирования связывания меченого Ни5с8 ЕаЬ' с экспрессирующими СЭ154 клетками 1игка1 Ό1.1, предварительно связанными с немеченым первым анти-СО154-ЕаЬ', как указано на каждой панели (24А - 338; 24В - 402; 24С - 381; 24Ό - 303; 24Е - 335; 24Е - 300; 246 - 294; 24Н - А33) (см. пример 9). А33 представляет подобранное по изотипу контрольное антитело, и показано, что в данном случае неспецифическое перекрестное блокирование отсутствует.

На фиг. 25А-Е приведены результаты анализа конкурентного связывания с использованием В1асоге® различных форм антител 342 и 1ш5с8 с растворимым белком СЭ154 (ЕСЭ) или комплексом ί.Ό40:ί.Ό154. ЕЬ-полноразмерное антитело. СЭ40НЕс - человеческий слитый белок СЭ40.

На фиг. 26 приведен график, показывающий результаты теста агрегации тромбоцитов, описанного в примере 11 (тест 1), который был проведен с 1ш5с8 анти-СП154-антителом, 342 ЕаЬ'-ПЭГ анти-СО154антителом и контрольным антителами. На первой панели приведены результаты, полученные с комплексами СЭ40Е, образованными цельным 1д6, и на второй панели комплексы, образованные ЕаЬ'-ПЭГ или ди-ЕаЬ'-ПЭГ. На третьей панели приведены результаты, полученные с три-ЕаЬ'-ПЭГ и агликозилированным анти-СО154-антителом 1ш342.

На фиг. 27 приведен график, показывающий результаты теста агрегации тромбоцитов, описанного в примере 11 (тест 2), который был проведен с положительными и отрицательными контрольными антителами. Результаты показывают, что агрегация тромбоцитов специфически усиливается под действием комплексов положительного контрольного анти-СО154-антитела и рекомбинатного человеческого рас

- 11 019636 творимого СО40Ь (зСО154).

На фиг. 28 показано выравнивание аминокислотных последовательностей человеческого (ЯЕЦ ΙΌ N0: 76) и мышиного растворимого СО40Ь (8ЕЦ ΙΌ N0: 77). Различия между человеческими и мышиными последовательностями указаны красным цветом. Последовательности эпитопа Ни5с8 указаны синим цветом. Внутренние остатки отмечены чертой «|». Отобрано шесть областей (1-6) последовательности, где человеческие последовательности были введены в растворимый мышиный СО40Ь.

На фиг. 29 приведены результаты постановки конкурентной ЕЫ8Л для демонстрации перекрестного блокирования 342 РаЬ' и Ьи5с8 РаЬ' (см. пример 14). На фиг. 29А приведены результаты титрования биотин-342 РаЬ' на СЭ154. Концентрация 1 нМ находится в линейной части кривой. На фиг. 29В приведены результаты титрования биотин-1ш5с8 РаЬ' на СЭ154. Концентрация 0,3 нМ находится в линейной части кривой. На фиг. 29С показано перекрестное блокирование биотин-342 и биотин-5с8 под действием немеченого 342 РаЬ'. СЬ342 РаЬ представляет собой химерный 342 РаЬ'. На фиг. 29Ό показано перекрестное блокирование биотин-342 под действием немеченого 5с8 РаЬ'.

Подробное описание изобретения

Для более полного понимания описанного в данном документе изобретения ниже приводится подробное описание. Если не указано иначе, то все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют те же значения, которые обычно понимаются специалистами в области, к которой относится данное изобретение. Ниже описаны примерные методы и материалы, хотя в практике настоящего изобретения также можно использовать методы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, и они понятны специалистам в данной области.

В данном изобретении имеются обращения к различным патентам, публикациям и литературным источникам. Раскрытие данных патентов, публикаций и литературных источников в полном объеме включено в данный документ для сведения.

Классические литературные источники, в которых изложены основные принципы технологии рекомбинантной ДНК, известные специалистам в данной области, включают АизиЬе1 е! а1., Ситгеп! Рго!осо1з Ιη Мо1еси1аг Вю1оду, 1оЬи ЭДйеу & 8опз, №\ν Уотк (1998 апб 8ирр1етеп!з !о 2001); 8ашЬтоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота!огу Мапиа1, 2б Еб., Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬота!огу Ргезз, Ρ1;·ιίη\Κ\ν. №\ν Уотк (1989); КаиГтап е! а1., Ебз., НапбЬоок оГ Мо1еси1аг апб Се11и1аг Ме!Ьобз Ιη Вю1оду апб Мебюше, СВС Ргезз, Воса Ва!оп (1995); МсРЬегзоп, Еб., Э|гес1еб Ми!адепез1з: А Ртас!юа1 АрргоасЬ, 1ВЬ Ргезз, ОхГогб (1991).

Классические литературные источники, в которых изложены основные принципы иммунологии, известные специалистам в данной области, включают Наг1о\у апб Ьапе, АпйЬоб1ез: А ЬаЬота!огу Мапиа1, 2б Еб., Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬота!огу Ргезз, Со1б 8ртшд НагЬог, Ν.Υ. (1999) и Вой! е! а1., 1ттипо1оду, 3б Еб., МозЬу№еаг Воок Еигоре Ытйеб, Ьопбоп (1993). Классические литературные источники, в которых изложены основные принципы медицинской физиологии и фармакологии, известные специалистам в данной области, включают Раис1 е! а1., Нагпзоп'з Рппар1ез оГ 1п!егпа1 Мебюше, 14¹¹' Еб., МсСга\\-НШ Сотрашез, 1пс. (1998).

Определения.

В том смысле, в котором термин СО154-связывающий белок используется в данном документе, то он включает любую молекулу, в том числе антитело, которая специфически связывается или обладает антагонистическим действием по отношению к ί.Ό154. Таким образом, в том смысле, в котором данный термин используется в данном документе, то анти-СО154-антитело представляет один класс белков, специфически связывающихся с СЭ154. СЭ154-связывающий белок по изобретению может включать по меньшей мере одну, предпочтительно две, три или более СОВ, раскрытых в данном документе. СЭ154связывающий белок или другой такой антагонист СЭ154 может включать молекулы, которые не являются классическими фрагментами или производными антител, но которые, тем не менее, содержат аминокислотные последовательности и/или химические структуры, которые придают специфичность связывания с эпитопом СЭ154. Такие антагонисты СЭ154 можно получить, например, из альтернативных остовов (см., например, Вш/ е! а1., 2005, №11. Вю!есЬ., 23:1257-1268 и Ноззе е! а1., 2006, Рто!еш 8с1епсе, 15:1427). Такой СО154-связывающий белок или антагонист может быть слит с Рс-областью антитела, которая в функциональном отношении является недостаточной, или с гетерологичной функциональной группой, описанной в данном документе, в целях повышения времени полужизни и/или улучшения других ш у1уо свойств СЭ154-связывающего белка.

СО154-связывающие белки могут содержать по меньшей мере одну из СОВ, описанных в данном документе, включенную в биологически совместимую каркасную структуру. В одном примере биологически совместимая каркасная структура включает полипептид или его фрагмент, который является достаточным для образования конформационно стабильной структурной подложки или каркаса, или остова, который способен к размещению одной или более последовательностей аминокислот, которые связываются с антигеном (например, СОВ, вариабельный домен и т.д.) в локализованной области поверхности. Такие структуры могут представлять природный полипептид или складку полипептида (структурный мотив), или могут иметь одну или более модификаций, таких как добавления, делеции или замены аминокислот по сравнению с природным полипептидом или складкой полипептида. Данные остовы можно

- 12 019636 получить из полипептида от любого вида (или от более чем одного вида), такого как человек, другое млекопитающее, другое позвоночное, беспозвоночное, растение, бактерия или вирус.

Как правило, биологически совместимые каркасные структуры основаны на белковых остовах или скелетах иных, чем иммуноглобулиновые домены. Например, можно использовать таковые на основе доменов фибронектина, анкирина, липокалина, неокарзиностатина, цитохрома Ь, СР1 цинкового пальца, Р8Т1, закрученной спирали, ЬАС1-Э1, Ζ-домена и домена тендамистата (см., например, Ыудгеи апб иЫеп, 1997, Ситтеп! Ορίηίοη ίη 81тис1ига1 Вю1оду, 7, 463-469).

В том смысле, в котором термин антитело используется по отношению к изобретению, то он включает выделенное, рекомбинантное или синтетическое антитело, конъюгат антитела или производное антитела. Термин антитело часто предназначается для включения фрагмента антитела, в том числе антигенсвязывающего фрагмента, если не указано иначе или понимается иначе по контексту. Антигенсвязывающий фрагмент конкурирует с интактным антителом за специфическое связывание; см. в общем Рипбатеп1а1 1ттнпо1оду. Сй. 7 (Раи1 еб., 2^пб еб. Ратен Ргекк, Ν.Υ. (1989)). Антигенсвязывающие фрагменты можно получить методами рекомбинантной ДНК или ферментативным или химическим расщеплением интактных антител. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие фрагменты включают РаЬ, Р(аЬ)₂, РаЬ', Р(аЬ')₂, Р(аЬ')₃, Рб, Ρν, однодоменные антитела (бАЬ), другие моновалентные и дивалентные фрагменты, определяющие комплементарность области (СОК), одноцепочечные антитела (например, ксРм, ксРаЬ и ксРаЬДС), химерные антитела, диантитела (б1аЬобу), триантитела (йтаЬобу), миниантитела (т1шЬобу), наноантитела (папоЬобу) и полипептиды, которые содержат, по меньшей мере, фрагмент антитела, который является достаточным для придания способности к специфическому связыванию антигена с полипептидом; и слитые конструкции и производные описанного выше; см., например, НоШдет апб Нибкоп, №11иге Вю!есйпо1оду, 23:1126-1136 (2005) и Ник! е! а1., ВМС Вю!есй., 7:14 (2007).

Рб-фрагмент представляет фрагмент антитела, который состоит из У_Н и С_Н,-доменов; Ρνфрагмент состоит из У_ъ и У_Н-доменов одного плеча антитела; ксΡν-фрагмент представляет одноцепочечное антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (У_Н) и вариабельную область легкой цепи (Уь), соединенные пептидным линкером; ксРаЬ-фрагмент является одноцепочечным антителом, содержащим фрагмент трудный (Рб), соединенный с легкой цепью посредством пептидного линкера; ксРаЬДС'-фрагмент представляет вариант ксРаЬ без цистеина (см., например, Ник! е! а1., выше) и бАЬфрагмент (однодоменное антитело) содержит один вариабельный домен (например, У_Н- или У_ъ-домен) (\Уагб е! а1., №!ите, 341:544-546 (1989)). Кроме того, сюда входят диантитела и триантитела. Диантитела и триантитела по настоящему изобретению включают, например, гомодимерные и гетеродимерные диантитела и триантитела. Например, в некоторых вариантах осуществления вариабельные домены, входящие в состав триантитела, могут связываться с тремя различными эпитопами или с идентичными эпитопами.

Если не указано иначе или понимается иначе по контексту, то антитело по настоящему изобретению включает целые антитела и их любые антигенсвязывающие фрагменты, производные и варианты антител, которые могут содержать одну или более модификаций (например, аминокислотную вставку, делецию, замену, посттрансляционную модификацию или ее отсутствие и т.д.), включая конъюгаты антител (т.е. антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгированные или связанные с функциональной группой). Производные антител, включая конъюгаты антител, могут быть основаны на или могут содержать антигенсвязывающий фрагмент по изобретению, который специфически связывается с СЭ154. Кроме того, описанные выше варианты осуществления антител могут представлять мышиные антитела, антитела хомяка, козьи, кроличьи, химерные, гуманизированные или полностью человеческие антитела, их фрагменты, производные или конъюгаты. Очевидно, понятно, что в некоторых аспектах изобретения термин антитело может исключать один или более вариантов осуществления антитела, упомянутых выше; такие обстоятельства будут понятны специалистам в данной области.

Термины пэгилирование, полиэтиленгликоль или ПЭГ включают полиалкиленгликоль или его производное с или без применения сочетающих агентов или дериватизации сочетающими или активирующими группами (например, тиолом, трифлатом, трезилатом, азирдином, оксираном или предпочтительно малеимидом, например ПЭГ-малеимидом). Другие соответствующие полиалкиленгликоли включают, не ограничиваясь этим, малеимидомонометокси-ПЭГ, активированный ПЭГ пропиленгликоль, но также заряженные или нейтральные полимеры следующих типов: декстран, коломиновая кислота или другие полимеры на основе углеводов, полимеры аминокислот и биотин и другие производные аффинных реагентов.

Термин эффекторная функция относится к функциональной способности Рс-области или константной области антитела связываться с белками и/или клетками иммунной системы. В данной области хорошо известны антитела с пониженной эффекторной функцией и методы конструирования таких антител (см., например, \¥О 05/18572, \УО 05/03175 и патент США № 6242195) и они подробно описаны в данном документе. Типичные эффекторные функции включают способность связываться с белком комплемента (например, белком комплемента С1ц) и/или Рс-рецептором (РсК) (например, РсуШ, РсуКП, РсуКНа, РсуКШ и/или РсуКШЬ). Функциональные последствия способности связываться с одной или

- 13 019636 более указанных выше молекул включают, не ограничиваясь этим, опсонизацию, фагоцитоз, антигензависимую клеточную цитотоксичность (ЛЭСС). комплементзависимую цитотоксичность (СЭС) и/или модификацию эффекторных клеток. Снижение эффекторной функции относится к снижению одной или более биохимической или клеточной активности, идуцированной, по меньшей мере, частично связыванием Ре с его близким рецептором или белком комплемента, или эффекторной клеткой, с одновременным сохранением антигенсвязывающей активности вариабельной области антитела (или его фрагмента), тем не менее, с пониженной, аналогичной, идентичной или повышенной аффинностью связывания. Конкретные антитела по изобретению проявляют пониженную эффекторную функцию. Снижение эффекторной функции, например связывания Рс-области с Рс-рецептором или белком комплемента, может выражаться в кратном снижении (например, снижении в 1,5 раза, 2 раза и т.п.) и его можно рассчитать, основываясь, например, на процентном снижении активности связывания по данным тестов оценки связывания, известных в данной области (см., например, заявку νθ 05/18572).

Если не требуется иначе по контексту, то термины в единственном числе будут включать термины во множественном числе, и термины во множественном числе будут включать термины в единственном числе.

В данном описании и формуле изобретения слово содержать или его вариации, такие как содержит или содержащий, означают включение определенного целого числа или группы целых чисел, но не означает исключение любого другого целого числа или группы целых чисел.

СО154.

СО154 известен в данной области под несколькими другими названиями, такими как лиганд СЭ40 (СП40Ь), СЭ40 противорецептор (СЭ40СВ), др39, Т-ВАМ, активирующая Т-клетки молекула, ТВАР, ΤΝΡ-связанный белок активации (ТВАР) и член 5 надсемейства лигандов фактора некроза опухолей (ΤΝΡ3Ρ5) (Саисйа! е! а1., 1993, РЕВЗ Ьей., 315:259-266; Сга£ е! а1., Еигор. 1. 1ттип., 22:3191-3194; Но11спЬаид11 е! а1., 1992, ЕМВО 1., 11:4313-4321). В изобретении данные термины используются взаимозаменяемо. СО154-связывающие белки, включая антитела, по данному изобретению специфически связываются с человеческим СО154 и могут перекрестно реагировать и, следовательно, специфически связываться с СО154 других видов. В некоторых вариантах осуществления СО154-связывающие белки, включая антитела, по данному изобретению специфически связываются с человеческим СО154, мышиным СО154 или СО154 примата, не относящегося к человеку.

Анти-СО154-антитела и СО154-связывающие белки.

В том смысле, в котором термин анти-СО154-антитело используют в данном документе, он относится к молекуле иммуноглобулина, которая способна специфически связываться с эпитопом в антигене СО154. Анти-СО154-антитела могут представлять интактные иммуноглобулины, полученные из природных источников или из рекомбинантных источников, и они могут представлять иммунореактивные участки интактных иммуноглобулинов. Как правило, антитела являются тетрамерами иммуноглобулиновых молекул.

Следовательно, и это относится ко всем вариантам осуществления или способам по данному изобретению, анти-СО154-антитело включает (если не указано иначе или в случаях, когда это следует понимать иначе по контексту) моноклональное антитело, поликлональное антитело, мышиное антитело, антитело хомяка, козье антитело, кроличье антитело, химерное антитело, приматизированное антитело, гуманизированное антитело, (полностью) человеческое антитело, мультимерное антитело, гетеродимерное антитело, гемидимерное антитело, би-, три- или тетравалентное антитело, биспецифическое антитело, одноцепочечное антитело (например, ксРу, ксРаЬ и ксРаЬДС), бис-ксРу, диантитело, триантитело или тетрантитело, однодоменные антитела с одной областью и модифицированные РаЬ-фрагменты. В некоторых вариантах осуществления анти-СО154-антитело является антителом, содержащим только один вариабельный домен иммуноглобулина. Следовательно, моновалентные антитела включают антитела, которые содержат только один вариабельный домен иммуноглобулина (т.е. одну вариабельную область легкой цепи или тяжелой цепи) и которые специфически связываются с СО154. Кроме того, анти-СО154антитела по изобретению могут быть моновалентными, дивалентными или мультивалентными в отношении связывания с СО154.

В некоторых вариантах осуществления СО154-связывающий белок, например анти-СО154антитело, с пониженной эффекторной функцией содержит любой фрагмент анти-СО154-антитела, который является достаточным для поддержания специфического связывания с антигеном СО154. Например, антитело может содержать только один вариабельный домен иммуноглобулина - У_Н- или У_ъ-домен.

Следовательно, в некоторых вариантах осуществления СО154-связывающий белок, например антиСО154-антитело, является фрагментом антитела. Фрагменты антитела включают, например, РаЬфрагмент, Р(аЬ)₂-фрагмент, РаЬ'-фрагмент, Р(аЬ')₂-фрагмент, Р(аЬ')₃-фрагмент, одноцепочечный Р(у)фрагмент или Ру-фрагмент и связывающиеся с эпитопом фрагменты любого из указанных выше (см., например, НоШдег апб Нибкоп, 2005, №Ц.1ге Вю1есйпо1оду, 23(9):1126-1136). Фрагменты антител по настоящему изобретению более подробно описаны ниже.

В одном примере СО154-связывающие белки или анти-СО154-антитела представляют антитела (например, антитела подтипа 1дС4) или фрагменты (например, РаЬ'-фрагменты), которые содержат на

- 14 019636 тивную или модифицированную шарнирную область. Описан ряд модифицированных шарнирных областей, например, в патенте США № 5677425, заявках \У0 99/15549 и \У0 98/25971. В другом примере антитела по изобретению модифицированы в их константных областях, как, например, антитела, описанные в заявках \У0 05/003169, \У0 05/003170 и \У0 05/003171. Любые из приведенных выше антиСБ154-антител, производных антител или фрагментов антител можно использовать для получения конъюгатов антител по настоящему изобретению. Любые из приведенных выше антител, фрагментов или конъюгатов могут проявлять пониженную эффекторную функцию по сравнению со вторым антиСБ 154-антителом.

Молекулы антител по изобретению могут происходить из любого класса (например, 1дС, 1дЕ, 1дМ, 1дБ или 1дА) или подкласса молекул иммуноглобулинов. Домены константной области антитела, если они имеются, могут быть выбраны с учетом предполагаемой функции молекулы антитела. Например, домены константной области могут представлять домены 1дА, 1дБ, 1дЕ, 1дС или 1дМ человека. В частности, можно использовать домены константной области человеческого 1дС, особенно 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4. Изотипы 1дС2 и 1дС4 можно использовать в некоторых вариантах осуществления, где молекула антитела предназначается для терапевтических применений, при которых желательны пониженные или элиминированные эффекторные функции антитела. Альтернативно можно использовать изотипы 1дС1 и 1дС3, когда молекула антитела предназначается для терапевтических целей, для которых требуются эффекторные функции антитела.

В некоторых вариантах осуществления одну или более СБК СБ154-связывающего белка, например анти-СБ154-антитела, по изобретению можно включить в одну или более иммуноглобулиновых доменов, универсальных каркасных структур, белковых остовов или других биологически совместимых каркасных структур на основе белковых остовов или иных каркасов, чем иммуноглобулиновые домены ^удгеи & иЫеи, 1997, Сигг. 0ρίη. 8!гига1. ΒίοΙ., 7:463-469; 8агадоу1 е! а1., 1992, В1о/Тесйио1оду, 10:773-779; 8кегга, 2000, I. Мо1. Кесодшбои, 13:167-187). В некоторых вариантах осуществления СБК анти-СБ154антитела включают в универсальную каркасную структуру (т.е. каркасную структуру, которую можно использовать для создания полной вариабельности функций, специфичностей и свойств, которые исходно поддерживаются большой коллекцией различных каркасов, см. патент США № 6300064). В других вариантах осуществления можно использовать альтернативные остовы (см., например, Βίηζ е! а1., 2005, №11. Вю!есК, 23:1257-1268 Нокке и е! а1., 2006, Рго!еш 8с1епсе, 15:14-27) для создания СБ154связывающих белков по изобретению.

Также термин анти-СБ154-антитело включает синтетическое антитело или рекомбинантное антитело, которое получено с использованием технологии рекомбинантной ДНК, например, такое как антитело, экспрессированное бактериофагом. Термин анти-СБ154-антитело также следует понимать, как включающий антитело, которое получено синтезом молекулы ДНК, кодирующей антитело, и молекула данной ДНК экспрессирует белок антитела или аминокислотную последовательность, определяющую антитело, где ДНК или аминокислотная последовательность получены с использованием технологии синтетической ДНК или аминокислотной последовательности, которая доступна и хорошо известна в данной области.

В одном варианте осуществления изобретение относится к анти-СБ154-антителу, которое является моноклональным антителом. Моноклональное антитело относится к антителу, полученному из популяции, по существу, гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Прилагательное моноклональное указывает на природу антитела, как полученного, по существу, из гомогенной популяции антител, и это не следует рассматривать как обязательное получение антитела каким-либо конкретным методом. Например, моноклональные антитела для применения по настоящему изобретению можно получить гибридомным методом (с использованием мышиной или человеческой гибридомы), впервые описанным КоЫег е! а1., №·ιΙι^, 256:495 (1975), или можно получить методами рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 4816567). Моноклональные антитела также можно выделить из фаговых библиотек антител с использованием методов, описанных, например, С1асккои е! а1., №·ιΙι^, 352:624-628 (1991) и Магкк е! а1., I. Мо1. Вю1., 222:581-597 (1991). Также следует понимать, что некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к композициям, содержащим одно или более различных моноклональных антител, которые специфически связываются с СБ154, т.е. композиции поликлональных антител, содержащих множество моноклональных антител с различными специфичностями к эпитопам.

В другом варианте осуществления изобретения анти-СБ154-антитело относится к антителу, которое является химерным антителом, или производному антитела или конъюгату или его антигенсвязывающему фрагменту. Как правило, химерные антитела содержат вариабельные области тяжелой и/или легкой цепи, включающие остатки СБК и каркасной области одного вида (как правило, мыши), слитые с константными областями другого вида (как правило, человека). Данные химерные мышиные/человеческие антитела содержат примерно 75% человеческих и 25% мышиных аминокислотных последовательностей. Человеческие последовательности представляют константные области антитела, в то время как мышиные последовательности представляют вариабельные области (и таким образом, со

- 15 019636 держат антигенсвязывающие сайты) антитела.

В другом варианте осуществления СО154-связывающие белки, анти-СЭ154-антитела по данному изобретению включают антитела, производные антител и антигенсвязывающие фрагменты, содержащие вариабельный домен, включающий каркасные области из одного антитела, и области СОВ - из другого антитела.

В более конкретном варианте осуществления СО154-связывающие белки и анти-СЭ154-антитела по данному изобретению включают химерные антитела, содержащие каркасные области и области СОВ из различных человеческих антител.

Способы получения всех химерных антител, описанных выше, хорошо известны специалистам в данной области; см., например, патент США № 5807715; Мотвоп е! а1., 1984, Ргос. №!1. Асай. 8ск И8А, 81(21):6851-5; 8Иагоп е! а1., 1984, №!иге, 309(5966):364-7; Такейа е! а1., 1985, №!иге, 314(6010):452-4.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-СЭ154-антитело, которое связывается с ΟΌ154, получают методом отбора антител лимфоцитов (8ЬАМ) (ВаЬсоок е! а1., 1996, Ргос. №!1. Асай. 8ск И8А, 93:7843-7848; №0 92/02551; йе №11й! е! а1., 1997, 1. Iттиηο1. МеШойв, 207:61-67 и йадегкуй! е! а1., 1995, ВюТесйшдиев, 18:862-869), с помощью которых можно выделить клетки любого вида, продуцирующие высокоаффинные антитела во время иммунных ответов в условиях ш νί\Ό. Другие методы включают описанные йе №11й! е! а1., 1997, 1. ^типок Ме!Иойв, 207:61-67 и Ьадегкххв! е! а1., 1995, ВюТесйшдиев, 18(5):862-869. Указанные выше методы основаны на выделении отдельных продуцирующих антитела клеток, которые затем подвергают клональной экспансии с последующим скринингом на клоны, которые продуцируют анти-СЭ154-антитела, с последующей идентификацией последовательности генов их вариабельной области тяжелой цепи (Ун) и легкой цепи (У_ъ). Конкретный метод скрининга подробно описан в №0 04/051268. Таким образом, выделяют В-клетки, которые являются позитивными на антитела против СЭ154. В-клетки могут происходить от человека, мыши, крысы, хомяка, кролика, козы или другого вида млекопитающих. Гены антител в данных В-клетках можно клонировать и экспрессировать в клетке-хозяине, например, с использованием обычной технологии рекомбинантной ДНК. В некоторых вариантах осуществления клеткой-хозяином является Е. сой. Другие клетки-хозяева подробно описаны ниже. Антитела (которые включают фрагменты антител, такие как ЕаЬ'-фрагменты), экспрессированные в данных клетках, можно выделить обычными методами. Если антитела происходят из источника, отличного от человека, то их можно подвергнуть гуманизации обычными методами, такими как мутагенез их генов. Затем гуманизированные антитела можно экспрессировать в клетке-хозяине и затем можно выделить.

Моноклональные антитела можно получить любым методом, известным в данной области, таким как гибридомный метод (КоЫег & М11в!е1п, 1975, 256:495-497), триомный метод, метод человеческих Вклеточных гибридом (КохЬог е! а1., Iттиηο1οду Тойау, 1983, 4, 72) и ЕВУ-гибридомный метод (Со1е е! а1., Мопос1опа1 АпйЬой1ев апй Сапсег Тйегару, р. 77-96, А1ап В. Ь1вв, Шс., 1985). В данной области хорошо известны методы создания и получения рекомбинантных антител (см., например, патент США № 4816397; патент США № 6331415; 81ттопв е! а1., 2002, 1онгпа1 о£ [ттипо1ощса1 МеШойв, 263, 133-147; №0 92/02551; 0г1апй1 е! а1., 1989, Ргос. №111. Асай. 8ск И8А, 86:3833; Векйтапп е! а1., 1988, №-Щ.1ге: 322, 323; патент США № 5585089; №0 91/099967; Моип1аш апй Айай, 1992, Вю!есйпо1од. Сепе!. Епд. Веν., 10: 1-142; Уегта е! а1., 1998, I. ^типок МеШойв, 216:165-181; НоШпдег апй Нийвоп, 2005, №т.1ге Вю!есй., 23 (9)=1126-1136).

Антитела по настоящему изобретению также можно получить с использованием различных методов фагового дисплея, известных в данной области, и они включают описанные Вппктап е! а1., 1995, 1. Iттиηο1. Ме!Иойв, 182:41-50; Атев е! а1., 1995, I. ^типок Ме!Иойв, 184: 177-186; КейкЬогоидй е! а1., 1994, Еиг. I. Iттиηο1., 24: 952-958; Регвк е! а1., 1997, Сепе, 187: 9-18 и Вийоп е! а1., 1994, Айхапсев ш Iттиηο1., 57: 191-280; №0 90/02809; №0 91/10737; №0 92/01047; №0 92/18619; №0 93/11236; №0 95/15982 и №0 95/20401; патенты США № 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908;5516637;5780225;5658727;5733743 и 5969108.

Также можно использовать трансгенных (например, генно-инженерных) мышей или другие организмы, включая других млекопитающих, для получения связывающих белков и антител по данному изобретению (см., например, патент США № 6300129). Например, известно, что можно получить мышей с целью замещения только вариабельных областей мышиных иммунных локусов (сегменты У, Ό и 1 тяжелой цепи, сегменты У и I легкой цепи) на соответствующие человеческие вариабельные последовательности, для получения больших количеств высокоаффинных антител с человеческими вариабельными последовательностями (см., например, патент США № 6586251; патент США № 6596541 и патент США № 7105348).

В еще одном варианте осуществления данного изобретения анти-СЭ154-антитело относится к антителу, производному или конъюгату антитела либо антигенсвязывающему фрагменту, которые подверглись приматизации или гуманизации. Приматизированные и гуманизированные антитела, как правило, включают СЭВ тяжелой и/или легкой цепи из мышиного антитела, пересаженного в каркасную Уобласть антитела примата, отличного от человека, или человека, которые обычно дополнительно содержат человеческую константную область; см., например, Вксйтапп е! а1., 1988, №!иге, 332:323-327; па

- 16 019636 тенты США № 6054297; 5821337; 5770196; 5766886; 5821123; 5869619; 6180377; 6013256; 5693761 и 6180370.

Логическим обоснованием применения таких приматизированных или гуманизированных антител является сохранение (человеческой) антигенной специфичности мышиного антитела, которую придают мышиные СОК, с одновременным снижением иммуногенности мышиного антитела (мышиное антитело будет вызывать иммунный ответ против него у видов, отличных от мыши) посредством использования как можно больше человеческих каркасных последовательностей. Такие антитела можно применять при лечении человека в целях сведения до минимума или устранения нежелательных побочных эффектов, таких как иммунные ответные реакции. Описаны антитела, содержащие донорные СОК, пересаженные из антиген-специфических антител, отличных от человеческих, на гомологичные акцепторные каркасные области от примата, отличного от человека, с пониженной имммуногенностью у людей (заявки на патент США 2005/0208625; 2002/0062009; патент США № 7338658).

Следовательно, гуманизированные формы антител, отличных от человеческих (например, мышиных), являются специфическими химерными иммуноглобулинами, цепями иммуноглобулинов или их фрагментами (такими как Ρν, РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂ или другими антигенсвязывающими последовательностями антител), которые содержат последовательности, полученные из иммуноглобулиновых последовательностей, отличных от человеческих, и человеческих иммуноглобулиновых последовательностей. В своем большинстве гуманизированные антитела представляют человеческие иммуноглобулины (реципиентное антитело), в которых остатки из определяющих комплементарность областей (СОК) реципиентного антитела замещены на остатки СОК от видов, отличных от человека (донорное антитело), таких как мышь, крыса или кролик, с желаемой специфичностью, аффинностью или емкостью. В некоторых случаях остатки каркасной Ρν-области (РК) человеческого иммуноглобулина замещают на соответствующие остатки РК, отличные от человеческих.

Кроме того, гуманизированное антитело может содержать остатки, которые невозможно найти ни в реципиентном антителе, ни в импортированных последовательностях СОК или РК. Данные модификации проводят для дополнительной обработки и оптимизации функциональной способности антитела. В целом гуманизированное антитело может содержать, по существу, все по меньшей мере один и, как правило, два вариабельных домена, в которых все или, по существу, все участки СОК соответствуют таковым в иммуноглобулине, отличном от человеческого, и все или, по существу, все остатки РК представляют таковые консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина.

Гуманизированное антитело необязательно может также содержать, по меньшей мере, участок константной области иммуноглобулина (Рс), как правило, таковой человеческого иммуноглобулина.

Гуманизированное антитело (которое включает, например, фрагменты антитела, производные или конъюгаты антитела) можно получить технологией рекомбинантной ДНК, в которой некоторые или все аминокислоты легкой и тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, которые не требуются для связывания антигена (например, константные области и каркасные области вариабельного домена) используют для замены соответствующих аминокислот из легкой и тяжелой цепи близкого антитела, отличного от человеческого. Способы получения гуманизированных антител хорошо известны специалистам в области антител; см., например, ЕР 239400; 1опе8 е! а1., 1986, №!ите, 321:522-525; ШесЬтапп е! а1., 1988, №!ите, 332:323-327; Vе^Ьоеуеп е! а1., 1988, 8с1епсе, 239:1534-1536; Оиееп е! а1., 1989, Ргос. №!. Асаб. 8ст И8А, 86:10029; Ог1апб1 е! а1., 1989, Ргос. №!. Асаб. 8οΐ. И8А, 86:3833; патент США № 6180370 и ЕР 519596, в которых описано изменение антител через поверхностные остатки.

Следовательно, в одном варианте осуществления данного изобретения анти-СП154-антитело относится к гуманизированному антителу (которое включает, без ограничения, гуманизированный антигенсвязывающий фрагмент и производное или конъюгат гуманизированного антитела), которое получают Ίраисплаитацией мышиных или крысиных (или других нечеловеческих) СОК в человеческое антитело. Конкретнее, данную гуманизацию антитела проводят следующим образом: (1) выделяют кДНК, кодирующие вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, из гибридомы или В-клеток, которые секретируют антитело; (2) определяют секвенированием последовательности ДНК вариабельных доменов, включающих СОК; (3) ДНК, кодирующие СОК, переносят в соответствующие области последовательности, кодирующей вариабельные домены тяжелой и легкой цепи человеческого антитела сайт-направленным мутагенезом, и (4) добавляют сегменты гена человеческой константной области желаемого изотипа (например, 1 для С_Н и к для Сь). Наконец, гены гуманизированных тяжелой и легкой цепей коэкспрессируют в клетках-хозяевах млекопитающих (например, клетках СНО или N80) для получения растворимого гуманизированного антитела.

Однако прямой перенос СОК в человеческую каркасную область приводит к потере аффинности связывания антигена у полученного связывающего белка или антитела. Потеря аффинности связывания антигена может иметь место, поскольку в некоторых близких антителах некоторые аминокислоты в константных областях взаимодействуют с СОК и, таким образом, оказывают влияние на аффинность связывания антигена у антитела в целом. В таких случаях специалист поймет, что будет критическим ввести обратные мутации в каркасные области акцепторного антитела для сохранения апгигенсвязывающей активности близкого антитела. Общие подходы проведения обратных мутаций хорошо известны специа

- 17 019636 листам в данной области; см., например, Оиееп е! а1., 1989, Ргос. N31. Асаб. 8ст И8А, 86:10029; Со е! а1., 1991, Ргос. N3!. Асаб. 8ск И8А, 88:2869-2873; №0 90/07861; Тетрей 1991, Вю!есЬпо1о§у, 9:266-271. Примеры обратных мутаций антител по настоящему изобретению включают таковые остатки, показанные на фиг. 9, под названием доноры.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок или антитело по настоящему изобретению может содержать домен ν_Η, который не является вариабельным доменом верблюжьего или мышиного иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления полипептид антитела содержит ν_Ηдомен, который не содержит одну или более аминокислот, которые являются специфическими для вариабельных доменов верблюжьего иммуногобулина по сравнению с человеческими ^-доменами.

В одном варианте осуществления данного изобретения анти-СО154-антитело относится к антителу (которое включает антигенсвязывающий фрагмент и производное или конъюгат антитела), которое является полностью человеческим. Полностью человеческое антитело содержит полипептид антитела или вариабельный домен иммуноглобулина, который имеет последовательность, полученную из человеческого иммуноглобулина (например, полученную из кодирующей последовательности человеческого иммуноглобулина). Термин человеческое антитело включает, например, антитела с вариабельной и константной областями (если присутствуют), полученные из человеческих иммуноглобулиновых последовательностей зародышевой линии. В том смысле, в котором термин человеческие используется в данном документе по отношению к антителу или фрагменту, такому как вариабельный домен, то он не включает антитело от другого вида, например мыши, которое было гуманизировано посредством переноса последовательностей человеческой константной области на полипептид антитела (т.е. замещением константных областей, отличных от человеческих, на человеческие константные области), или посредством переноса последовательностей человеческой каркасной области ν-домена в вариабельный домен иммуноглобулина от млекопитающего, отличного от человека (например, замещением каркасных областей ν-домена, отличных от человеческих, на человеческие каркасные области). Описаны способы гуманизации вариабельных областей иммуноглобулина посредством рациональной модификации определяющих комплементарность остатков (заявка на патент США 2006/0258852).

В некоторых вариантах осуществления человеческие антитела включают аминокислотные остатки, которые не кодируются человеческими иммуноглобулиновыми последовательностями зародышевой линии (например, мутации, введенные случайным или сайт-специфическим мутагенезом в условиях ίη νίΐτο, или соматической мутацией в условиях ίη νίνο). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-СО154-антителу, содержащему вариабельную область с одной или более каркасными областями (например, Е№1, Е\У2, Е\У3 и/или Е\У4), имеющими аминокислотную последовательность, которая является такой же, как аминокислотная последовательность соответствующей каркасной области, кодированной сегментом гена человеческого антитела зародышевой линии, или аминокислотные последовательности одной или более указанных каркасных областей, в целом содержащих до 5 аминокислотных различий по сравнению с аминокислотной последовательностью указанной соответствующей каркасной области, кодированной сегментом гена человеческого антитела зародышевой линии. В дополнительных вариантах осуществления аминокислотные последовательности каркасных областей (Е№1, Е\У2, Е\У3 и/или Е№4) вариабельного домена являются такими же, как аминокислотные последовательности соответствующих каркасных областей, кодированных сегментом гена человеческого антитела зародышевой линии, или последовательности Е№1, Е\У2, Е№3 и/или Е№4 в целом содержат до 10 аминокислотных различий по сравнению с последовательностями соответствующих каркасных областей, кодированных сегментом гена человеческого антитела зародышевой линии. Примерные сегменты гена антитела зародышевой линии включают, например, ΌΡ47, ΌΡ45, ΌΡ48 и ΌΡΚ9 (заявка на патент США 2006/00627784) и сегменты, кодирующие акцепторные каркасные последовательности, описанные в примерах и приведенные на чертежах.

В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело (которое включает фрагмент антитела или последовательность вариабельного домена) имеет по меньшей мере 85% идентичность аминокислотной последовательности (в том числе, например, 87, 90, 93, 95, 97, 99% или выше идентичность последовательностей) с природным человеческим антителом.

Полностью человеческие или человеческие антитела можно получить из трансгенных (например, генно-инженерных, таких как нок-ин) мышей, несущих гены человеческого антитела (несущие экзоны вариабельной области (V), разнообразия (Ό), соединения (1) и константной области (С)) или человеческие V-, Ό- и 1-области из человеческих клеток. Например, в настоящее время возможно получить генноинженерных животных (например, мышей), которые способны, при иммунизации, продуцировать полный репертуар человеческих антител при отсутствии эндогенной продукции иммуноглобулинов (см., например, ^οΕον^ е! а1., ΡNА8, 90:2551, 1993; ,1акоЬо^!8 е! а1., №т.1ге, 362:255-258, 1993; Вгиддегтапп е! а1., Уеаг т Iттиηе, 7:33, 1993 и Эис1ю5а1 е! а1., №!иге, 355:258, 1993). Можно получить трансгенную линию мышей (например, генно-инженерных, включая нок-аут, нок-ин, замещение генов и т.п.) с последовательностями генов из нереарранжированных генов человеческих иммуноглобулинов. Человеческие последовательности могут кодировать тяжелые и легкие цепи человеческих антител и они будут функционировать правильно у мышей, подвергаясь реарранжировке с получением широкого репертуара анти

- 18 019636 тел, аналогичных таковым у людей. Генно-инженерных мышей можно иммунизировать белкоммишенью (например, 00154, его фрагментами или клетками, экспрессирующими СО154) с получением широкого спектра специфических антител и кодирующих их РНК. Нуклеиновые кислоты, кодирующие компоненты цепей таких антител, затем можно клонировать из животного в векторный дисплей. Как правило, клонируют отдельные популяции нуклеиновых кислот, кодирующих последовательности тяжелой и легкой цепей, и затем отдельные популяции рекомбинируют при вставке в вектор таким образом, чтобы любая данная копия вектора получала случайную комбинацию тяжелой и легкой цепей. Вектор сконструирован для экспрессии цепей антитела таким образом, чтобы их можно было собрать и расположить на внешней поверхности упаковки дисплея, содержащей вектор. Например, цепи антитела можно экспрессировать в виде слитых конструкций с белком оболочки фага с внешней поверхности фага. Затем упаковки дисплея можно подвергнуть скринингу для расположения антител, связывающихся с мишенью.

Кроме того, человеческие антитела можно получить из библиотек фагового дисплея (НоодеиЬоот е! а1., I. Мо1. Вю1., 227:381, 1991; Магкк е! а1., I. Мо1. Вю1., 222:581-597, 1991; Уаидкаи е! а1., №11иге В1о!еск., 14:309, 1996; патент США № 6300064). Можно создать синтетические фаговые библиотеки, в которых используются рандомизированные комбинации У-областей синтетических человеческих антител. Можно провести отбор полностью человеческих антител с использованием антигена, в которых Уобласти по своей природе являются очень близкими к человеческим; см. патенты США № 6794132, 6680209, 4634666 и 0к!Ьегд е! а1., 1983, НуЬпйота, 2:361-367.

Получение человеческих антител также см. у Меийех е! а1., №1иге Сеиейсз, 15:146-156, 1997; Стееи аий 1акоЬоу1!з, I. Ехр. Мей., 188:483-495. Дополнительно человеческие антитела обсуждаются и описаны в патентах США № 5939598 и 6673986; также см. патенты США № 6114598, 6075181 и 6162963; также см. патенты США № 6150584, 6713610, 6657103, заявки на патент США 2003/0229905 А1, 2004/0010810 А1, 2004/0093622 А1, 2006/0040363 А1, 2005/0054055 А1, 2005/0076395 А1 и 2005/0287630 А1; также см. ЕР 0463151 В1, А0 94/02602, А0 96/34096 и А0 98/24893.

В альтернативном подходе другие авторы использовали минилокусный подход. При минилокусном подходе имитируют экзогенный локус 1д посредством включения участков (отдельных генов) из локуса 1д. Таким образом, один или более У_Н-генов, один или более О_Н-генов, один или более 1_Н-генов, ти-генов константной области и второй константной области (предпочтительно константной гаммаобласти) формируют в конструкцию для вставки животному. Данный подход описан, например, в патентах США № 5545807, 5545806, 5625825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650, 5814318, 5591669, 5612205, 5721367, 5789215 и 5643763; также см. патенты США № 5569825, 5877397, 6300129, 5874299, 6255458 и 7041871, раскрытие которых в полном объеме включено в данный документ для сведения; также см. ЕР 0546073, А0 92/03918, А0 92/22645, А0 92/22647, А0 92/22670, А0 93/12227, А0 94/00569, А0 94/25585, А0 92/14436, А0 97/13852 и А0 98/24884; также см. Тау1ог е! а1. (1992, №ю. Ас1йк Вез., 20:6287); Скеи е! а1. (1993, Ιη!. 1ттиио1., 5:647); ТиаШои е! а1. (1993, Р^8 И8А, 90:3720-4); Ско1 е! а1. (1993, №11иге Сеиейсз, 4:117); ЬоиЬетд е! а1. (1994, №!ите, 368:856-859); Тау1ог е! а1. (1994, Ιη!етиа1юиа1 1ттиио1оду, 6:579-591) и ТиаШои е! а1. (1995, I. 1ттиио1., 154:6453-65), Р1зкМ1й е! а1. (1996, №11иге В^о!ескηо1оду, 14:845) и ТиаШои е! а1. (2000, Еиг. I. 1ттиио1., 10:2998-3005).

В более конкретном варианте осуществления данного изобретения полностью человеческие антитела получают с использованием праймированных в условиях 1и У1!то человеческих спленоцитов (Воегиег е! а1., 1991, I. 1ттиио1., 147:86-95).

В более конкретном варианте осуществления данного изобретения полностью человеческие антитела получают клонированием репертуара (Ретззои е! а1., 1991, Ргос. №1. Асай. 8ск И8А, 88:2432-2436; Ниаид аий 8!о11аг, 1991, I. 1ттиио1. МеШойз, 141:227-236). Кроме того, в патенте США 5798230 описано получение человеческих моноклональных антител из В-клеток человека, где человеческие В-клетки, продуцирующие антитела, иммортализуют заражением вирусом Эпштейна-Барра, или их производных, которые экспрессируют ядерный антиген 2 вируса Эпштейна-Барра (ЕВNА2), белок, необходимый для иммортализации. Затем отключают функцию ЕВNА2, что приводит к повышению продукции антител.

Другие способы получения полностью человеческих антител включают применение животных, отличных от человека, у которых имеются инактивированные локусы эндогенного 1д и которые являются трансгенными для нереарранжированных генов тяжелой и легкой цепи человеческого антитела. Таких трансгенных животных можно подвергнуть иммунизации активированными Т-клетками или белком Ό1.1 (патенты США № 5474771; 6331433 и 6455044) и гибридомы можно получить из В-клеток, полученных от них. В данной области подробно описаны эти методы; см., например, различные публикации/патенты, касающиеся трансгенных мышей, содержащих минилокусы человеческого 1д, включая патент США № 5789650; различные публикации/патенты относительно мышей XЕN0М0υ8Е®, включая патенты США № 6075181, 6150584 и 6162963; Стееи, 1997, №11иге Сеиейсз, 7:13-21; Меийех, 1997, №11иге Сеиейсз, 15:146-56, и различные публикации/патенты, касающиеся трансомных мышей, включая ЕР 843961 и Топлхика е! а1., 1997, №11иге Сеиейсз, 16:1433-43.

СО154-связывающие белки и анти-СО154-антитела по настоящему изобретению также относятся к белкам или антителам, перекрестно блокирующим связывание, или связывающим белкам или антителам, которые связываются с одним и тем же эпитопом или которые связываются с очень близким или пере

- 19 019636 крывающимся эпитопом, что и любые антитела, описанные в данном документе. Белки или антитела, перекрестно блокирующие связывание, могут конкурентно ингибировать или блокировать связывание любого из антител, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к СО154-связывающим белкам и анти-СО154-антителам, которые связываются с одним и тем же эпитопом, что и гуманизированное антитело, содержащее последовательность тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 12 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 13 и содержащее последовательность легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 15 (ЕаЬ- и ЕаЬ'фрагменты антитела 342), и которое проявляет аналогичные по отношению к СЭ154 связывающие свойства в конкурентных тестах с анти-СО154-антителом 5с8, описанным в данном документе. В других вариантах осуществления изобретение относится к СО154-связывающим белкам и анти-СО154-антителам, которые связываются с одним и тем же эпитопом, что и гуманизированное антитело, содержащее последовательность У_ь-домена 8ЕЦ ΙΌ N0: 58 и последовательность У_Н-домена 8ЕЦ ΙΌ N0: 60 (последовательности вариабельной области антитела 338) и которые проявляют аналогичные по отношению к СЭ154 связывающие свойства в конкурентных тестах с анти-СО154-антителом 5с8, описанным в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения СО154-связывающий белок, например анти-СО154-антитело. проявляет высокую аффинность для человеческого СЭ154. Например, в некоторых вариантах осуществления СО154-связывающий белок диссоциирует от человеческого СЭ154 (человеческого СО40Ь) со значением К,| в пределах от 50 нМ до 1 пкМ включительно по данным поверхностного плазмонного резонанса (например, В1асоге®). Например, К,| для человеческого СЭ154 может составлять от 25 до 1, от 10 до 1, от 5 до 1, от 1 до 1, от 0,5 до 1, от 0,1 нМ до 1 пкМ, от 75 до 1, от 50 до 1, от 20 до 1 или даже от 10 до 1 пкМ. В других вариантах осуществления СО154-связывающий белок по настоящему изобретению диссоциирует от человеческого СЭ154 со значением К,| в пределах от 500 до 1 пкМ включительно по данным поверхностного плазмонного резонанса (например, В1асоге®). В некоторых вариантах осуществления К,| для человеческого СЭ154 равняется менее 50 пкМ. Например, в некоторых вариантах осуществления СО154-связывающий белок диссоциирует от человеческого СЭ154 со значением К,| менее 20 пкМ. В некоторых вариантах осуществления СО154-связывающий белок диссоциирует от человеческого СЭ154 со значением К,| менее 10 пкМ. В некоторых вариантах осуществления СО154-связывающий белок связывается с СЭ154 с высокой аффинностью, но не вытесняет связанный СЭ154 от СЭ40. Аффинность антитела можно повысить способами, известными в данной области (см., например, С1агк е! а1., 2006, Рго!еш 8сЕ, 15 (5):949-60, в данном источнике описано повышение аффинности антитела с использованием основанного на структуре компьютерного анализа, и Скао е! а1., 2006, №11. Рго!ос, 1:755-768, в данном источнике описаны методы выделения и конструирования 5сЕу с желаемыми свойствами с использованием дисплея на поверхности дрожжей).

В тех случаях, когда желательно повысить аффинность антител по изобретению, содержащих одну или более указанных выше СОВ, то такие антитела с повышенной аффинностью можно получить с использованием ряда протоколов созревания аффинности, включая, но не ограничиваясь этим, сохранение СИВ (Υιπ§ е! а1., 1. Мо1. Вю1., 254:392-403, 1995), поворот цепей (Магкк е! а1., Вю/Тескпо1оду, 10:779783, 1992), применение мутантных штаммов Е. сок (Бою е! а1., 1. Мо1. Вю1., 250:350-368, 1996), поворот ДНК (Ра!!еп е! а1., Сигг. 0ρίη. Вю!ескпо1., 8:724-733, 1997), фаговый дисплей (Ткотркоп е! а1., 1. Мо1. Вю1., 256:7-88, 1996) и ПЦР (Статей е! а1., №!иге, 391:288-291, 1998). Все данные методы созревания аффинности обсуждаются Уаидкап е! а1. (№11иге Вю!ескпо1оду, 16:535-539, 1998). Таким образом, изобретение относится к вариантам последовательностей антител по изобретению, которые специфически связываются с СО154. Такие варианты последовательностей содержат одну или более полуконсервативных или консервативных замен в их последовательности, и такие замены предпочтительно не оказывают существенного влияния на желаемую активность полипептида. Замены могут быть естественными или их можно ввести, например, с помощью мутагенеза (например, НШсккъоп е! а1., 1978, 1. Вю1. Скет., 253:6551). Например, аминокислоты глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин часто можно заместить на другие аминокислоты (аминокислоты, имеющие алифатические боковые цепи). Из данных возможных замен предпочтительно, чтобы глицин и аланин использовали для замены на другую аминокислоту (поскольку они имеют относительно короткие боковые цепи) и чтобы валин, лейцин и изолейцин использовали для замены на другую аминокислоту (поскольку они имеют большие алифатические боковые цепи, которые являются гидрофобными). Другие аминокислоты, которые часто можно заменить на другую аминокислоту, включают, но не ограничиваются этим:

фенилаланин, тирозин и триптофан (аминокислоты, имеющие ароматические боковые цепи); лизин, аргинин и гистидин (аминокислоты, имеющие основные боковые цепи);

аспартат и глутамат (аминокислоты, имеющие кислые боковые цепи); аспарагин и глутамин (аминокислоты, имеющие амидные боковые цепи) и цистеин и метионин (аминокислоты, имеющие серосодержащие боковые цепи).

Аффинность связывания СО154-связывающих белков, например анти-СО154-антител, по настоящему изобретению также можно представить в относительных показателях или при сравнении с аффинностью связывания второго антитела, которое также специфически связывается с СЭ154 (например, вто

- 20 019636 рого анти-СЭ154-антитела, которое является СЭ154-специфическим, которое можно отнести в данном документе ко второму СЭ154-специфическому антителу). В некоторых вариантах осуществления СЭ154-специфическое антитело может представлять антитело 5с8 (продуцированное гибридомой, депонированной в АТСС под инвентарным номером НВ 10916, описанной в патенте США № 5474771) или гуманизированное антитело 5с8. В других вариантах осуществления второе СЭ154-специфическое антитело может представлять любое из антител по изобретению, такое как 342, 381, 338, 294, 295, 300, 335, 303 или 402 (фиг. 12). Следовательно, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к анти-СО154-антителу, которое связывается с человеческим СЭ154 с более высокой аффинностью по сравнению с антителом 5с8 или с К_с, которая ниже чем К_с антитела 5с8. В некоторых вариантах осуществления анти-СЭ 154-антитело по настоящему изобретению также ингибирует активность СЭ154 или блокирует взаимодействие СЭ154:СЭ40 в большей степени по сравнению со вторым СЭ154специфическим антителом, таким как 5с8, в эквимолярных концентрациях. Относительную способность анти-СЭ154-антитела блокировать взаимодействие СЭ154:СЭ40 можно оценить любым доступным методом анализа, например, таким как тест позитивной регуляции 1САМ-1, описанный в данном документе и в тестах конкурентного связывания.

Следовательно, в некоторых вариантах осуществления СЭ154-связывающие белки и анти-СО154антитела (включая фрагменты и производные антител) по изобретению являются пригодными для ингибирования связывания СЭ154 с СЭ40 и делают это с высокой специфичностью, например со значением 1С₅₀ в пределах от 10 пкМ до 1,5 мкМ включительно. В некоторых вариантах осуществления СЭ154связывающие белки, например анти-СО154-антитела, по изобретению могут иметь значение 1С₅₀ в пределах от 10 до 500, от 50 до 500, от 100 до 500, от 250 до 750 пкМ, от 500 до 1 мкМ или от 750 пкМ до 1,5 мкМ. В дополнительных вариантах осуществления анти-СЭ154-антитело, по существу, не обладает агонистическим действием в отношении активности СЭ40 или не активирует сигнальный путь с участием СЭ40. В некоторых вариантах осуществления анти-СО154-антитело по настоящему изобретению оказывает антагонистическое действие на активность СЭ154 или СЭ40 либо обеих молекул.

Следовательно, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к СЭ154связывающим белкам и анти-СО154-антителам, которые связываются с человеческим СЭ154 с более высокой или равной аффинностью по сравнению со вторым СЭ154-специфическим антителом (например, антителом 5с8 или гуманизированным антителом 5с8), или со значением К_с, которое ниже или равно К_с второго СЭ154-специфического антитела, где анти-СЭ154-антитело, по существу, не ингибирует взаимодействие СЭ154:СЭ40 по сравнению со вторым СЭ154-специфическим антителом. Такие антитела могут быть пригодными, например, для постановки теста связывания и в качестве диагностических реагентов. Примерные антитела, которые проявляют высокую аффинность для человеческого СЭ154, но обладают более низкой степенью ингибирования взаимодействия СЭ154:СЭ40 по сравнению со вторым СЭ154-специфическим антителом, являются антителами 381 и 338, описанными в данном документе. Например, настоящее изобретение относится к анти-СЭ154-антителам, которые специфически связываются с человеческим СЭ154 с более высокой или равной аффинностью (по сравнению со вторым СЭ154специфическим антителом, например, таким как гуманизированное антитело 5с8), но которое блокирует взаимодействие СЭ154:СЭ40 в меньшей степени, чем это делает второе СЭ154-специфическое антитело. В дополнительных вариантах осуществления данные анти-СЭ154-антитела, которые ингибируют связывание СЭ154 (СЭ40Ь) с СЭ40 в меньшей степени, чем это делает второе СЭ154-специфическое антитело, также, по существу, не оказывают агонистического действия в отношении активности СЭ40 или не активирует сигнальный путь с участием СЭ40. Например, такие антитела, если их применяют в тесте оценки эффективности в условиях ίη νίίτο, как описано в примере 7, могут не проявлять статистически значимого агонистического действия по сравнению с контрольной обработкой или могут проявлять агонистическое действие на уровне 1, 2, 3, 5 или 10% по сравнению с положительным контролем (например, лигандом СЭ154). У1ба1аш еί а1. (Т1е ЕМВО 1оигпа1, 2000, 19:3304-3313) и Реагаоп еί а1. (1п1егпа1юпа1 1ттипо1оду, 2001, 13:273-283) описывают сигнальный путь СЭ40 и также приводят тесты, которые можно использовать для определения того, блокируется или ингибируется, или нет, взаимодействие СЭ154:СЭ40, и в какой степени.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-СЭ154-антителу, содержащему по меньшей мере одну СЭК, выбранную из ΟΌΚ-Η1 (8ЕО ГО N0: 3), ΟΌΚ-Η2 (8ЕО ГО N0: 4) и ΟΌΚ-Η3 (8ЕО ГО N0: 5). Предпочтительно антитело содержит по меньшей мере две СЭК, выбранные из СОК-111 СЕО ГО N0: 3), ΟΌΚ-Η2 СЕО ГО N0: 4) и ΟΌΚ-Η3 СЕО ГО N0: 5) и более предпочтительно все три данные ΟΌΚ-Η1, ΟΌΚ-Η2 и ΟΌΚ-Η3.

В другом варианте осуществления анти-СЭ154-антитело по изобретению содержит по меньшей мере одну СЭК, выбранную из С1Ж-1.1 (5ЕО ГО N0: 6), С1Ж-1.2 (5ЕО ГО N0: 7) и СЭК-Ь3 СЕО ГО N0: 8). Предпочтительно антитело содержит по меньшей мере две СЭК, выбранные из СЭК-Ь1 (8Е0 ГО N0: 6), СЭК-Ь2 (8Е0 ГО N0: 7) и СЭК-Ь3 (8Е0 ГО N0: 8), и более предпочтительно все три данные СЭК-Ь1, СЭК-Ь2 и СЭК-Ь3.

В дополнительных вариантах осуществления антитело содержит все три СЭК-Ш, ΟΌΚ-Η2 и СЭКГО СЕО ГО N0: 3-5) и все три СЭК-Ь1, С1Ж-1.2 и СЭК-Ь3 СЕО ГО N0: 6-8).

- 21 019636

В дополнительных вариантах осуществления анти-СО154-антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи одной из 8ΕΟ ΙΌ N0: 1, 9, 10 или 11 и содержит последовательность вариабельной области легкой цепи одной из 8Ε0 ΙΌ N0: 2 или 14.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-СО154-антителу, содержащему по меньшей мере одну СОВ, выбранную из СЭВ-Н1 (8Ε0 ΙΌ N0: 42), СЭВ-Н2 (8Ε0 ΙΌ N0: 43) и 0ΌΒ-Η3 (8Ε0 ΙΌ N0: 44). Предпочтительно антитело содержит по меньшей мере две ΟΌΒ, выбранные из 0ΌΒ-Η1 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 42), 0ΌΒ-Η2 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 43) и 0ΌΒ-Η3 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 44), и более предпочтительно все три данные 0ΌΒ-Η1, 0ΌΒ-Η2 и 0ΌΒ-Η3.

В другом варианте осуществления анти-СО154-антитело по изобретению содержит по меньшей мере одну ΟΌΒ, выбранную из С0Е-Е1 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 45), (ΌΒ-Ε2 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 46) и 0ΌΒ-Ό3 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 47). Предпочтительно антитело содержит по меньшей мере две ΟΌΒ, выбранные из 0ΌΒ-Ό1 (8Ε0 ΙΌ N0: 45), 0ΌΒ-Ό2 (8Ε0 ΙΌ N0: 46) и 0ΌΒ-Ό3 (8Ε0 ΙΌ N0: 47), и более предпочтительно все три данные ΟΌΒЬ1, (ΌΒ-Ε2 и 0ΌΒ-Ό3.

В дополнительных вариантах осуществления антитело содержит все три 0ΌΒ-Η1, 0ΌΒ-Η2 и ΟΌΒΗ3 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 42-44) и все три (ΌΒ-ΕΕ С0Е-Е2 и 0ΌΒ-Ό3 (8Ερ ΙΌ N0: 45-47).

В дополнительных вариантах осуществления анти-СО154-антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8Ε0 ΙΌ N0: 56 и содержит последовательность вариабельной области легкой цепи 8Ε0 ΙΌ N0: 54.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-СО154-антителу, содержащему по меньшей мере одну ΟΌΒ, выбранную из 0ΌΒ-Η1 (8Ε0 ΙΌ N0: 48), 0ΌΒ-Η2 (8Ε0 ΙΌ N0: 49) и 0ΌΒ-Η3 (8Ε0 ΙΌ N0: 50). Предпочтительно антитело содержит по меньшей мере две ΟΌΒ, выбранные из 0ΌΒ-Η1 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 48), 0ΌΒ-Η2 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 49) и 0ΌΒ-Η3 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 50), и более предпочтительно все три данные 0ΌΒ-Η1, 0ΌΒ-Η2 и 0ΌΒ-Η3.

В другом варианте осуществления анти-СО154-антитело по изобретению содержит по меньшей мере одну ΟΌΒ, выбранную из С0Е-Е1 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 51), С0Е-Е2 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 52) и 0ΌΒ-Ό3 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 53). Предпочтительно антитело содержит по меньшей мере две ΟΌΒ, выбранные из 0ΌΒ-Ό1 (8Ε0 ΙΌ N0: 51), 0ΌΒ-Ό2 (8Ε0 ΙΌ N0: 52) и 0ΌΒ-Ό3 (8Ε0 ΙΌ N0: 53), и более предпочтительно все три данные ΟΌΒЬ1, С0Е-Е2 и 0ΌΒ-Ό3.

В некоторых вариантах осуществления антитела содержат комплементарную последовательность, включающую одну или более ΟΌΒ легкой цепи 0ΌΒ-Ε1, С0Е-Б2 и 0ΌΒ-Ε3, соответственно приведенные выше, или комплементарную последовательность, включающую одну или более ΟΌΒ тяжелой цепи 0ΌΒ-Η1, 0ΌΒ-Η2 и 0ΌΒ-Η3, соответственно приведенных выше. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитело по данному изобретению содержит 0ΌΒ-Η1 (8Ε0 ΙΌ N0: 48), 0ΌΒ-Η2 (8Ε0 ΙΌ N0: 49) или 0ΌΒ-Η3 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 50) и С0Е-Е1 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 51), С0Е-Е2 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 52) или 0ΌΒ-Ε3 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 53).

В дополнительных вариантах осуществления антитело содержит все три 0ΌΒ-Η1, 0ΌΒ-Η2 и ΟΌΒΗ3 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 48-50) и все три 0ΌΒ-Ε1, С0Е-Е2 и 0ΌΒ-Ε3 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 51-53).

В дополнительных вариантах осуществления анти-СО154-антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8Ε0 ΙΌ N0: 60 и/или содержит последовательность вариабельной области легкой цепи 8Ε0 ΙΌ N0: 58.

В некоторых вариантах осуществления СО154-связывающий белок по данному изобретению содержит последовательность легкой цепи 8Ε0 ΙΌ N0: 62 и последовательность тяжелой цепи 8Ε0 ΙΌ N0: 65. В других вариантах осуществления СО154-связывающий белок по данному изобретению содержит последовательность легкой цепи 8Ε0 ΙΌ N0: 63 и последовательность тяжелой цепи 8Ε0 ΙΌ N0: 66.

В некоторых вариантах осуществления СО154-связывающий белок по данному изобретению содержит последовательность легкой цепи 8Ε0 ΙΌ N0: 68 и последовательность тяжелой цепи 8Ε0 ΙΌ N0: 71. В других вариантах осуществления СО154-связывающий белок по данному изобретению содержит последовательность легкой цепи 8Ε0 ΙΌ N0: 69 и последовательность тяжелой цепи 8Ε0 ΙΌ N0: 72. В еще одних вариантах осуществления СО154-связывающий белок по данному изобретению содержит последовательности 8Ε0 ΙΌ N0: 68, 8Ε0 ΙΌ N0: 69, 8Ε0 Ш N0: 71 или 8Ε0 ΙΌ N0: 72.

Данное изобретение также относится к связывающему ΕΌ154 белку, который предпочтительно обладает по меньшей мере 90, 91, 92, 93 или 94% идентичностью с СО154-связывающим белком по изобретению. Более предпочтительно СО154-связывающий белок обладает по меньшей мере 95, 96, 97 или 98% идентичностью. Наиболее предпочтительно СО154-связывающий белок обладает по меньшей мере 99, 99,5, 99,9% идентичностью с СО154-связывающим белком по изобретению. СО154-связывающие белки по изобретению могут содержать последовательность вариабельного домена, по меньшей мере на 85% идентичную вариабельному домену 8Ε0 ΙΌ N0: 1, 8Ε0 ΙΌ N0: 2, 8Ε0 ΙΌ N0: 9, 8Ε0 ΙΌ N0: 10, 8Ε0 ΙΌ N0: 11, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 14, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 29, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 30, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 54, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 56, 8ΕΕ) ΙΌ N0: 58 или 8Ε0 ΙΌ N0: 60, или ее одной или более ΟΌΒ.

Другие варианты осуществления изобретения относятся к биспецифическим антителам. Биспецифические антитела являются моноклональными, предпочтительно человеческими или гуманизированными антителами, которые обладают специфичностью связывания по меньшей мере к двум антигенам.

- 22 019636

Их можно использовать самостоятельно или смешанными в композиции, содержащей поликлональные популяции. В настоящем изобретении одна из специфичностей связывания представляет таковую для антигена СИ154, в то время как другая специфичность связывания является таковой для любого другого антигена и предпочтительно для белка или рецептора клеточной поверхности, или субъединицы рецептора. Например, другая специфичность связывания может быть лигандом, выбранным из человеческого сывороточного альбумина (Н8А), ΤΝΤα, 1Ь-1, 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-6, 1Ь-8, 1Б-12, 1Б-18, ΙΤΝ-γ, СИ2, СИ4, СИ8, СТБА4, ЬРА1, ЬРА3 и УЬА4.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения анти-СИ154-антитело содержит сайт связывания близкого лиганда. Близкий лиганд (например, полипептид) способен связываться с функциональными членами репертуара независимо от специфичности лиганда-мишени. Следовательно, близкий лиганд можно использовать для идентификации или отбора (например, при очистке или скрининге) функциональных членов репертуара (таких как панель или группа антител, независимо от специфичности связывания антигена у антитела). Близкие лиганды включают, например, протеин А, протеин С и протеин Ь. Предварительный отбор членов фаговой библиотеки с помощью близких лигандов описан в заявке ЭДО 99/20749.

Фрагменты антител.

Также настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим или эпитопсвязывающим фрагментам анти-СИ154-антитела. Все способы и реагенты, описанные выше, в отношении анти-СИ154антител можно в одинаковой степени использовать для получения и применения фрагментов антиСИ154-антител по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения фрагменты анти-СИ154-антитела включают гетеродимерные комплексы антител и гибридные антитела, такие как биспецифические антитела, гемидимерные антитела, мультивалентные антитела (т.е. тетравалентные антитела) и одноцепочечные антитела.

Гемидимерное антитело состоит из Рс-области и одного РаЬ-фрагмента. Одноцепочечное антитело состоит из вариабельных областей, связанных белковыми спейсерами, в одну белковую цепь.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения фрагменты анти-СИ154-антитела по изобретению также могут включать белки, содержащие одну или более иммуноглобулиновых легких цепей и/или тяжелых цепей, таких как мономеры и гомо- или гетеромультимеры (например, димеры или тримеры) данных цепей, где данные цепи необязательно связаны дисульфидной связью или связаны иначе. Данные антитела могут быть способны связываться с одним или более антигенами.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает антигенсвязывающие фрагменты цельных антител, такие фрагменты антитела, как РаЬ, Р(аЬ)₂, РаЬ', Р(аЬ')₂, Р(аЬ')₃, Ру, Рб, бАЬ, диатела, минитела или нанотела. Также настоящее изобретение относится к фрагментам, содержащим только один вариабельный домен, такой как У_Н- или Уь-домен, или фрагменту, содержащему только домен тяжелой цепи или легкой цепи. Фрагменты могут быть гуманизированными или полностью человеческими. Также настоящее изобретение включает антигенсвязывающие фрагменты, которые состоят из альтернативных остовов (см., например, Вт/, выше и Ноззе, выше) или которые содержат универсальный каркас. Также настоящее изобретение относится к конъюгатам, содержащим любой антигенсвязывающий фрагмент или СИ154-связывающий белок, который специфически связывается с СИ154, конъюгированный ковалентно или нековалентно, прямо или опосредованно, с функциональной группой, например, такой как белок-носитель или ПЭГ.

Анти-СИ154-антитела по настоящему изобретению включают дивалентные антитела. Так, в некоторых вариантах осуществления изобретение относится к фрагменту дивалентного анти-СИ154антитела, содержащему две тяжелых цепи антитела и по меньшей мере одну полимерную молекулу в ковалентной связи, где каждая тяжелая цепь ковалентно связана с другой, по меньшей мере, посредством одного мостика между цепями, отличного от дисульфидного, соединяющего атом серы остатка цистеина в одной цепи с атомом серы остатка цистеина в другой цепи, где остатки цистеина расположены вне домена вариабельной области каждой цепи, отличающемуся тем, что по меньшей мере один мостик между цепями, отличный от дисульфидного, содержит ковалентно связанную полимерную молекулу. В том смысле, в котором термин отличный от дисульфидного используется в данном документе, то он означает, что мостики 8-8, например, типа обычно имеющегося в антителах, исключаются. Однако мостик между цепями типа имеющегося во фрагменте по изобретению может быть связанным с тяжелой цепью посредством связи 8-8, описанной ниже. В общем каждая полимерная молекула во фрагменте дивалентного антитела по изобретению образует часть мостика между цепями. Каждый мостик служит для связывания двух тяжелых цепей и в каждой цепи он будет ковалентно связан с атомом серы остатка цистеина. Как правило, ковалентная связь будет представлять дисульфидную связь или в конкретных вариантах осуществления связь сера-углерод. Примерные структуры дивалентных антител см. в ЭДО 99/64460 и ЭДО 05/061005.

Также изобретение относится к анти-СИ154-антителу, которое является моновалентным антителом или моновалентным антигенсвязывающим фрагментом. В том смысле, в котором термин моновалентный используется в данном документе, то он означает, что данное антитело или антигенсвязывающий

- 23 019636 фрагмент (например, Εν, одноцепочечный 8сЕу, бАЬ, ЕаЬ, ЕаЬ', Еб, ксЕаЬ, ксЕаЬДС и т.д.) могут связываться только с одной молекулой их мишени. Обычно природные антитела являются дивалентными в том отношении, что они имеют два антигенсвязывающих плеча, где каждое содержит ν_Η- и Уь-домен. Дивалентное антитело может связываться с двумя отдельными молекулами одного и того же антигена, в том случае когда не отсутствует стерическое препятствие. В противоположность моновалентное антитело имеет антигенсвязывающий сайт для мишени. Антигенсвязывающий домен моновалентного антитела может содержать ν_Η- и У_ъ-домен или может содержать только один иммуноглобулиновый вариабельный домен, т.е. ν_Η- или У_ъ-домен, который обладает способностью связываться с СЭ154 без необходимости в соответствующем ν_Η- или У_ъ-домене. Таким приведенным в качестве примера моновалентным антителом является Еб-фрагмент, который содержит один иммуноглобулиновый вариабельный домен и который может связываться только с одной молекулой СЭ154 антитела. У моновалентного антитела отсутствует способность перекрестно связываться с молекулами одного антигена.

Данное изобретение относится к анти-СО154-антителу, где антитело специфически связывается с эпитопом, с которым специфически связывается гуманизированный ЕаЬ- или ЕаЬ'-фрагмент с последовательностью тяжелой цепи соответственно 8ЕО ΙΌ N0: 12 или 13 и последовательностью легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 15. В некоторых вариантах осуществления антитело по данному изобретению представляет фрагмент антитела с последовательностью вариабельной области тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 1, 9, 10 или 11 и с последовательностью вариабельной области легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 2 или 14. В других вариантах осуществления антитело по данному изобретению представляет фрагмент антитела с последовательностью тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 12 или 13 и с последовательностью легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 15.

В некоторых вариантах осуществления СО154-связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательности легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 15 и последовательности тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 13. В некоторых вариантах осуществления СО154-связывающий белок или антитело содержит или состоит из последовательности легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 15 и последовательности тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 12.

В альтернативных вариантах осуществления изобретение относится к фрагменту антитела, содержащему последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 56 и содержащему последовательность вариабельной области легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 54. В других вариантах осуществления антитело по данному изобретению представляет фрагмент антитела, содержащий последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 60 и содержащий последовательность вариабельной области легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 58.

В одном варианте осуществления данное изобретение относится к ЕаЬ-, или Е(аЬ')₂-, или Е(аЬ')₃фрагменту, который специфически связывается с СЭ154. Данный ЕаЬ'-, или Е(аЬ')₂-, или Е(аЬ')₃-фрагмент может быть гуманизирован и может содержать последовательность тяжелой цепи, которая содержит или состоит из последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 13, и может включать последовательность легкой цепи, которая содержит или состоит из последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 15.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-СО154-антителу. которое не содержит Ес-домена. Такое антитело или фрагмент без Ес-области могут быть моновалентными, дивалентными или дополнительно мультивалентными.

Также данное изобретение относится к антителам или фрагментам антител, которые специфически связываются с эпитопом, с которым специфически связываются ЕаЬ'-, или Е(аЬ')₂-, или Е(аЬ')₃-фрагменты, описанные выше. Данные антитела или фрагменты антител можно идентифицировать в тесте перекрестного связывания, описанном в данном документе (пример 9). Данные антитела или фрагменты антител могут быть выделенными, рекомбинантными или синтетическими и их можно присоединить ко второй молекуле с образованием конъюгата антитела.

Антитела с пониженной эффекторной функцией.

Взаимодействие антител и комплексов антиген-антитело с клетками иммунной системы приводит к запуску различных ответных реакций, которые относятся в данном документе к эффекторным функциям. ^О-антитела активируют эффекторные пути иммунной системы посредством связывания с членами семейства клеточных поверхностных рецепторов Есу и с С1с.| системы комплемента. Лигирование эффекторных белков кластерными антителами запускает различные ответные реакции, включающие высвобождение воспалительных цитокинов, регуляцию продукции антигенов, эндоцитоз и гибель клеток. В некоторых клинических применениях данные ответные реакции являются критическими для проявления эффективности моноклонального антитела. В других они провоцируют развитие нежелательных побочных эффектов, таких как воспаление и элиминация антиген-несущих клеток. Следовательно, настоящее изобретение дополнительно относится к СО154-связывающим белкам, включая антитела, с измененными, например пониженными, эффекторными функциями. Важно, что пониженная эффекторная функция не обязательно приводит к уменьшению способности анти-СО154-антитела ингибировать одно или несколько заболеваний посредством блокирования взаимодействия СО154:СЭ40 (см. заявку ЭД0 05/03175, которая в полном объеме включена в данный документ для сведения).

Анти-СО154-антитела с пониженной эффекторной функцией (например, опосредованными Ес

- 24 019636 областью эффекторными функциями; см. ниже) являются особенно желательными для применения у субъектов, у которых существует потенциальная вероятность проявления нежелательной тромбоэмболической активности. Дополнительно пониженная эффекторная функция анти-СП154-антител может приводить к снижению или устранению других потенциальных нежелательных эффектов, возникающих при терапии анти-СП154-антителами, таких как делеция активированных Т-клеток и других популяций клеток, индуцированных на экспрессию ί.Ό154, или Рс-зависимая активация моноцитов/макрофагов.

Эффекторную функцию анти-СП154-антитела по настоящему изобретению можно определить с использованием многих известных тестов. Эффекторная функция анти-СО154-антитела может быть снижена относительно второго анти-СП154-антитела. В одних вариантах осуществления второе антиСО154-антитело может представлять любое антитело, которое специфически связывается с СЭ154. В некоторых вариантах осуществления второе анти-СО154-антитело может представлять антитело 5с8 (продуцированное гибридомой, депонированной в АТСС под инвентарным номером НВ 10916, описанной в патенте США № 5474771) или гуманизированное антитело 5с8. В других вариантах осуществления второе СЭ154-специфическое антитело может быть любым из антител по изобретению, таким как 342, 381, 338, 294, 295, 300, 335, 303 или 402 (фиг. 12). В еще одних вариантах осуществления в том случае, когда интересующее анти-СО154-антитело подверглось модификации в целях снижения эффекторной функции, то второе антитело может представлять немодифицированный или исходный вариант антитела.

Эффекторную функцию анти-СО154-антитела по настоящему изобретению также можно оценить, например, по определению уровня агрегации или активации тромбоцитов, вызванной обработкой антиСО154-антителом, по сравнению с контрольным антителом. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления анти-СО154-антитела по настоящему изобретению не опосредуют или не усиливают агрегацию или активацию тромбоцитов в стандартном тесте агрегации или активации тромбоцитов. В других вариантах осуществления анти-СО154-антитела опосредуют более низкий уровень агрегации или активации тромбоцитов по сравнению со вторым анти-СП154-антителом (например, 5с8 или гуманизированным 5с8).

Приводимые в качестве примера эффекторные функции включают связывание с Рс-рецептором, фагоцитоз, апоптоз, провоспалительные ответные реакции, отрицательную регуляцию клеточных поверхностных рецепторов (например, В-клеточного рецептора; ВСК) и т.д. Другие эффекторные функции включают антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АЭСС), посредством которой антитела связываются с Рс-рецепторами на цитотоксических Т-клетках, природных клетках-киллерах (ΝΚ) или макрофагах, приводя к гибели клеток, и комплементзависимую цитотоксичность (СЭС), при которой гибель клеток индуцируется посредством активации каскада комплемента (см. обзор Оаегоп, Аппи. Кем. 1ттипо1., 15:203-234, 1997; \Уагб апб Сйейе, ТйегареиПс 1ттипо1., 2:77-94, 1995 и Кауе1сй апб К1пе!, Аппи. Кет. 1ттипо1., 9:457-492, 1991)). Как правило, для проявления таких эффекторных функций требуется, чтобы Рс-область сочеталась со связывающей областью (например, вариабельным доменом антитела), и их можно оценить с использованием стандартных методов, которые известны в данной области (см., например, заявку \УО 05/018572, \УО 05/003175 и патент США № 6242195).

Эффекторные функции можно отменить при использовании фрагментов без Рс-домена, таких как РаЬ, Р(аЬ')₂ или одноцепочечный Εν. Альтернативой является использование подтипа 1дС4 антитела, который связывается с РсуК1, но который слабо связывается с С1ц и РсуКП и РсуКШ. Подтип 1дС2 также обладает пониженным связыванием с Рс-рецепторами, но сохраняет способность к значительному связыванию с аллотипом Н131 РсуКНа и С1ц. Таким образом, необходимы дополнительные изменения в последовательности Рс для элиминации связывания со всеми Рс-рецепторами и с С1ц.

Несколько эффекторных функций, включая АЭСС, опосредуются Рс-рецепторами (РсК), которые связываются с Рс-областью антитела. Аффинность антитела для конкретного РсК и, следовательно, эффекторную активность, опосредованную антителом, можно модулировать изменением аминокислотной последовательности и/или посттрасляционными модификациями Рс-области и/или константной области антитела.

РсК определяются их специфичностью для изотипов иммуноглобулинов; Рс-рецепторы для 1дСантител относятся к РсуК, для 1дЕ к РсеК, для 1дА к РсаК и т.д. Было установлено три подкласса РсуК: РсуК1 (СБ64), РсуКП (СО32) и РсуКШ (ϋϋ16). РсуКП и РсуКШ имеют два типа: РсуКПА (СП32) и РсуКПВ (СЭ32); РсуКША (СЭ16а) и РсуКШВ (СЭ16Ь). Поскольку каждый подкласс РсуК кодируется двумя или тремя генами и альтернативный сплайсинг РНК приводит к многочисленным транскриптам, то существует широкое разнообразие изоформ РсуК. Например, РсуКП (ί.Ό32) включает изоформы 11а, 11Ь1, 11Ь2, 11Ь3 и 11с.

Сайт связывания в человеческих и мышиных антителах для РсуК ранее был картирован к так называемой нижней шарнирной области, состоящей из остатков 233-239 (ЕЙ нумерация по системе КаЬа! е! а1., 8ециепсек оГ Рто!етк оГ 1ттипо1одюа1 1п!егек!, 5^4Ь Кб., РиЬПс Неа1111 8егуюе, №-11юпа1 1пк!йи!ек оГ Неа1!й, ВеШекба, Мб., 1991; \УооГе! а1., Мо1ес. 1ттипо1., 23:319-330, 1986; Эппсам е! а1., №!иге, 332:563, 1988; Сапйе1б апб Моткоп, 1. Ехр. Меб., 173:1483-1491, 1991; Сйарре1 е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А, 88:9036-9040, 1991). Остатки 233-239, Р238 и 8239 находятся среди тех, которые упоминаются в качестве

- 25 019636 принимающих участие в связывании. Другими ранее упоминавшимися областями, которые, возможно, принимают участие в связывании с ЕсуК, являются: СЗ16-КЗЗ8 (человеческий 1дС) для человеческого ЕсуК1 (только при сравнении последовательностей; мутанты по замене не оценивались) (\УооГ е! а1., Мо1ес. 1ттипо1., 2З:З19-ЗЗ0, 1986); К274-КЗ01 (человеческий 1дС1) для человеческого ЕсуКШ (основываясь на пептидах) (8агтау е! а1., Мо1ес. 1ттипо1, 21:4З-51, 1984 и У407-К416 (человеческий 1дС) для человеческого ЕсуКШ (основываясь на пептидах) (Сетде1у е! а1., ВюсЬет. 8ос. Ттаик., 12:7З9-74З, 1984) и 8Ые1б§ е! а1., 1. Вю1. СЬет., 276:6591-6604, 2001; Ез/аг С.А. е! а1., Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8οΐ. И8А, 10З:40054010, 2006). Данные и другие участки или области аминокислотных остатков, принимающие участие в связывании с ЕсБ, могут быть очевидными специалистам в данной области по данным исследования кристаллической структуры комплексов 1д-ЕсК (см., например, 8опбегтапп е! а1., 2000, №11игс, 406(679З):267-7З и 8опбегтапп е! а1., 2002, ВюсЬет. 8ос. Тгапк., З0(4):481-6). Следовательно, антиСО154-антитела по настоящему изобретению включают модификации одного или более указанных выше остатков.

Другие известные подходы снижения эффекторной функции тАЬ включают мутирование аминокислот на поверхности тАЬ, которые принимают участие в эффекторных взаимодействиях связывания (Ьипб 1. е! а1., 1991, 1. 1ттипо1., 147(8):2657-62; 8Ые1б§ К.Ь. е! а1., 2001, 1. Вю1. СЬет., 276(9):6591-604 и использование комбинаций последовательностей сегментов различных подтипов (например, комбинации 1дС2 и 1дС4) с получением более существенного снижения связывания с Есу-рецепторами по сравнению с одним подтипом (Агтоиг е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1., 1999, 26:261З-1624; Мо1. 1ттипо1., 40, 200З, 585-59З).

В данной области известно большое количество вариантов Ес-области с измененной и/или пониженной аффинностью для Ес-рецепторов некоторых или всех подтипов (и таким образом для эффекторных функций); см., например, заявки на патент США 2007/0224188; 2007/0148171; 2007/0048З00; 2007/0041966; 2007/000952З; 2007/00З6799; 2006/027528З; 2006/02З5208; 2006/019З856; 2006/0160996; 2006/01З4105; 2006/0024298; 2005/024440З; 2005/02ЗЗЗ82; 2005/02157 68; 2005/0118174; 2005/00548З2; 2004/0228856; 2004/1З2101; 200З/158З89; также см. патенты США №№ 718ЗЗ87; 67З7056; 65З8124; 6528624; 6194551; 5624821;5648260.

При СЭС комплекс антитело-антиген связывается с комплементом, приводя к активации каскада комплемента и генерации атаки мембраны комплексом. Активация классического пути комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (С1с.|) с антителами (соответствующего подкласса), которые связаны с их антигеном; таким образом, активация каскада комплемента частично регулируется аффинностью связывания иммуноглобулина с белком С1с.|. Для активации каскада комплемента необходимо, чтобы С1с.| связался по меньшей мере с двумя молекулами 1дС1, 1дС2 или 1дСЗ, но только с одной молекулой с 1дМ, присоединенной к антигенной мишени (^атб апб СЬебе, ТЬегареибс 1ттипо1оду, 2:77-94, 1995, р. 80). Для оценки активации комплемента можно провести тест СЭС, например, описанный Саххапо-8ап1ого е! а1., 1. 1ттипо1. МеШобк, 202:16З, 1996.

Было высказано предположение, что различные остатки молекулы 1дС принимают участие в связывании с С1д, включая остатки С1иЗ18, Ьу§З20 и Ьу§З22 в СН2-домене, аминокислотный остаток ЗЗ1, расположенный в максимальной близости к той же бета-цепи, остатки Ьу§2З5 и С1у2З7, расположенные в нижней шарнирной области, и остатки 2З1-2З8, расположенные в №концевой области в СН2-домене (см., например, Хи е! а1., 1. 1ттипо1., 150:152А (АЬйгас!), 199З, \У0 94/29З51; Тао е! а1., 1. Ехр. Меб., 178:661-667, 199З; Вгекке е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1., 24:2542-47, 1994; Вийоп е! а1., №11иге, 288:ЗЗ8-З44, 1980; Эипкап апб ХУйНек ХаРпе, ЗЗ2:7З8-40, 1988; 1би8од1е е! а1., 1. 1ттипо1., 164:4178-4184, 2000; патенты США № 5648260 и 5624821). В качестве примера в 1дС1 две мутации в СООН концевой области СН2домена человеческого 1дС1 - КЗ22А и РЗ29А - не активируют путь СЭС и было показано, что они приводят к более чем 100-кратному снижению связывания С1с.| (патент США № 6242195).

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения можно модифицировать, заместить или удалить один или более данных остатков или один или более аминокислотных остатков можно вставить в целях снижения активности СЭС антител против СО154, описанных в данном документе. Например, в некоторых вариантах осуществления может быть желательным снизить или элиминировать эффекторную функцию(и) данных антител для снижения или элиминации вероятности активирования иммунных ответных реакций. Антитела с пониженной эффекторной функцией также могут снизить риск развития тромбоэмболических осложнений у субъектов, получающих антитела.

В некоторых других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-СО154антителу, которое проявляет пониженное связывание с одним или более Ес-рецепторами, но которое сохраняет его способность связываться с комплементом (например, в аналогичной или в некоторых случаях меньшей степени по сравнению с нативным, немутантным или исходным анти-СО154-антителом). Следовательно, анти-СО154-антитело по настоящему изобретению может связываться и активировать комплемент, одновременно проявляя пониженное связывание с ЕсК, например, таким как ЕсуКИа (например, ЕсуБ11а, экспрессированным на тромбоцитах). Такое антитело с пониженным связыванием или не связывающееся с ЕсуКИа (например, таким как ЕсуКИа, экспрессированным на тромбоцитах), но которое может связываться с С1с.| и активировать каскад комплемента, по меньшей мере, до некоторой сте

- 26 019636 пени будет снижать риск развития тромбоэмболических осложнений, одновременно с сохранением желаемых эффекторных функций. В альтернативных вариантах осуществления анти-СП154-антитело по настоящему изобретению показывает пониженное связывание с одним или более РсВ, но сохраняет способность связываться с одним или более другим РсВ; см., например, заявки на патент США 2007/000952З, 2006/0194290, 2005/02ЗЗЗ82, 2004/0228856 и 2004/0191244, в которых описываются различные аминокислотные модификации, приводящие к получению антител с пониженным связыванием с РсуШ, РсуКП и/или РсуКШ, а также аминокислотные замены, которые обеспечивают повышенное связывание с одним РсВ, но пониженное связывание с другим РсВ

Следовательно, эффекторные функции, в обеспечении которых принимает участие константная область анти-СО154-антитела, можно модулировать изменением свойств константой области и Рс, в частности. В некоторых вариантах осуществления анти-СП154-антитело с пониженной эффекторной функцией сравнивают со вторым антителом с эффекторной функцией и которое может быть немутантным, нативным или исходным антителом (например, антителом З42 или антителом 5с8, которое описано в патенте США № 5474771), содержащим константную область или Рс-область, которая опосредует эффекторную функцию. В конкретных вариантах осуществления модуляция эффекторной функции включает ситуации, при которых активность отменяется или полностью отсутствует.

Нативная последовательность Рс-области или константной области содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Рс-области или константной области цепи, обнаруживаемой в естественных условиях. Предпочтительно контрольная молекула, используемая для оценки относительной эффекторной функции, содержит тот же тип/подтип Рс-области, что и тестируемое или мутантное антитело. Вариантная или измененная Рс-область или константная область содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от таковой нативной последовательности области тяжелой цепи в результате по меньшей мере одной аминокислотной модификации (например, такой как посттрансляционная модификация, аминокислотная замена, вставка или делеция). Следовательно, мутантная константная область может содержать одну или более аминокислотных замен, делеций или вставок, которые приводят к измененным посттрансляционным модификациям, включающим, например, измененный профиль гликозилирования. Исходное антитело или Рс-область представляет, например, вариант, обладающий нормальной эффекторной функцией, используемый для конструирования константной области (т.е. Рс-области) с измененной, например, пониженной эффекторной функцией.

Антитела с измененной (например, пониженной или элиминированной) эффекторной функцией(ми) можно получить конструированием или продукцией антител с вариантной константной областью, Рсобластью или областью тяжелой цепи. Можно использовать технологию рекомбинантной ДНК и/или культивирование клеток и условия экспрессии для получения антител с изменой функцией и/или активностью. Например, технологию рекомбинантной ДНК можно использовать для конструирования одной или более аминокислотных замен, делеций или вставок в областях (например, таких как Рс-область или константная область), которые оказывают влияние на функции антител, включая эффекторные функции. Альтернативно, можно обеспечить изменения в посттрансляционных модификациях, таких как профили гликозилирования (см. ниже), посредством манипуляций с клетками-хозяевами и культивированием клеток и условиями экспрессии, с помощью которых получают антитело.

Изменения аминокислот, такие как аминокислотные замены, могут привести к изменению эффекторной функции анти-СО154-антител по настоящему изобретению без изменения аффинности связывания антигена. Описанные выше аминокислотные замены (в частности, О1иЗ18, Ьу8З20, Ьу8З22, Ьу82З5, О1у2З7, КЗЗ2 и РЗ29), например, можно использовать для получения антител с пониженной эффектоной функцией.

В других вариантах осуществления аминокислотные замены можно провести для одного или более следующих аминокислотных остатков: 2З4, 2З5, 2З6, 2З7, 297, З18, З20 и З22 константной области тяжелой цепи (см. патенты США № 5624821 и 5648260). Такие замены могут изменить эффекторную функцию с одновременным сохранением при этом активности связывания антигена. Изменение по одной или более аминокислотам 2З4, 2З5, 2З6 и 2З7 может снизить аффинность связывания Рс-области с РсуШрецептором по сравнению с немодифицированным или немутантным антителом. Аминокислотные остатки 2З4, 2З6 и/или 2З7 можно подвергнуть замещению, например, на аланин, и аминокислотный остаток 2З5 можно заместить, например, на глутамин. В другом варианте осуществления анти-СО154антитело может содержать замену Ьеи в положении 2З4 на А1а, замену Ьеи в положении 2З5 на О1и и замену О1у в положении 2З7 на А1а.

Дополнительно или альтернативно, можно изменить аминокислотные остатки в Рс-области в положениях З18, З20 и З22. Данные аминокислотные остатки, которые являются высококонсервативными в мышином и человеческом Ι§Ο, опосредуют связывание комплемента. Было показано, что изменение данных аминокислотных остатков снижает связывание с С1с|, но не изменяет связывание с антигеном, связывание с протеином А или способность Рс-области связываться с мышиными макрофагами.

В другом варианте осуществления анти-СО154-антитело по настоящему изобретению представляет

- 27 019636 иммуноглобулин 1дС4, содержащий замены, которые снижают или элиминируют эффекторную функцию. Рс-область 1дС4 анти-СО154-антитела по изобретению может содержать одну или более из следующих замен: замену пролина на глутамат в остатке 233, аланина или валина на фенилаланин в остатке 234 и аланина или глутамата на лейцин в остатке 235 (ЕЙ нумерация по КаЬа! Е.А. е! а1., 1991, выше). Кроме того, удаление сайта Ν-связанного гликозилирования в Рс-области 1дС4 заменой А1а на Акп в остатке 297 (ЕЙ нумерация) может дополнительно снизить эффекторную функцию и элиминировать любую остаточную эффекторную активность, которая может иметь место. Другим примерным мутантом 1дС4 с пониженной эффекторной функцией является вариант подтипа 1дС4, содержащий мутации З228Р и Ь235Е (РЕ мутация) в константной области тяжелой цепи. Данная мутация приводит к обеспечению пониженной эффекторной функции; см. патенты США № 5624821 и 5648260. Другой примерной мутацией в 1дС4, которая приводит к снижению эффекторной функции, является З228Р/Т229А, описанная в данном документе.

Другие приводимые в качестве примера изменения аминокислотных последовательностей в константной области включают, но не ограничиваются этим, мутацию А1а-А1а, описанную В1иек!опе е! а1. (см. νθ 94/28027 и νθ 98/47531; также см. Хи е! а1., 2000, Се11 1ттипо1., 200:16-26). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления анти-СО154-антитела с мутациями в константной области, включая мутацию А1а-А1а, можно использовать для снижения или отмены эффекторной функции. По данным вариантам осуществления константная область анти-СО154-антитела содержит мутацию на аланин в положении 234 или мутацию на аланин в положении 235. Дополнительно константная область может содержать двойную мутацию: мутацию на аланин в положении 234 и вторую мутацию на аланин в положении 235.

В одном варианте осуществления анти-СО154-антитело содержит каркасную область 1дС4, где мутация А1а-А1а будет относиться к мутации(ям) фенилаланина на аланин в положении 234 и/или мутации лейцина на аланин в положении 235. В еще одном варианте осуществления анти-СО154-антитело содержит каркасную область 1дС1, где мутация А1а-А1а будет относиться к мутации(ям) лейцина на аланин в положении 234 и/или мутации лейцина на аланин в положении 235. Анти-СО154-антитело может, альтернативно или дополнительно, содержать другие мутации, включая точковую мутацию К322А в СН2домене (Нехагей е! а1., 2001, 1. У1го1., 75:12161-8).

Другие примерные аминокислотные замены приведены в заявке νθ 94/29351 (этот источник в полном объеме включен в данный документ для сведения), в которой описаны антитела с мутациями в Ν-концевой области СН2-домена, которые приводят к изменению способности антител связываться с РсШ со снижением тем самым способности антител связываться с С1с|, что, в свою очередь, подавляет способность антител фиксировать комплемент; также см. Со1е е! а1. (1. 1ттипо1., 1997, 159:3613-3621), в этом источнике описаны мутации в верхних областях СН2 в 1дС2, которые приводят к снижению связывания с РсВ

Способы получения любого из описанных выше вариантов антител, содержащих аминокислотные замены, хорошо известны в данной области. Данные методы включают, не ограничиваясь этим, получение посредством сайт-направленного (или олигонуклеотид-опосредованного) мутагенеза, ПЦРмутагенеза и кассетного мутагенеза полученной молекулы ДНК, кодирующей антитело или, по меньшей мере, константную область антитела.

Сайт-направленный мутагенез является хорошо известным в данной области (см., например, Сайег е! а1., ШсШс Ас1бк Век., 13:4431-4443, 1985 и Кипке1 е! а1., Ргос. №!1. Асаб. Зск ИЗА, 82:488, 1987).

ПЦР-мутагенез также подходит для получения вариантов аминокислотных последовательностей исходного полипептида; см. НщисЫ в РСВ Рго!осо1к, р. 177-183 (Асабетю Ргекк, 1990) и Уа11ейе е! а1., Шс. Ас1бк Век., 17:723-733, 1989.

Другим способом получения вариантов последовательностей является кассетный мутагенез, основанный на методе, описанном Vе11к е! а1., Сепе, 34:315-323, 1985.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к анти-СО154-антителу с пониженной эффекторной функцией, в котором Рс-область антитела или ее участки заменены на Рс-область (или ее участки) с естественной пониженной индуцирующей активностью. Например, константная область человеческого 1дС4 проявляет пониженную способность к активации комплемента или ее отсутствие. Кроме того, различные молекулы 1дС различаются по их аффинности связывания в отношении РсВ, что частично может быть результатом различной длины или гибкости шарнирных областей 1дС (которая снижается в следующем порядке 1дС3>1дС1>1дС4>1дС2). Например, 1дС4 показывает пониженное связывание с РсуВПа или его отсутствие. Примеры химерных молекул и химерных константных областей см., например, у С1Шек е! а1. (Сапсег Век., 1999, 59:2159-2166) и М111ег е! а1., (Мо1. 1ттипо1., 1997, 34:441452).

Также изобретение относится к анти-СО154-антителам с пониженной эффекторной функцией, в которых Рс-область полностью отсутствует. Такие антитела также можно отнести к производным антител и антигенсвязывающим фрагментам по настоящему изобретению. Такие производные и фрагменты можно слить с белковыми последовательностями, отличными от антител, или небелковыми структурами, особенно структурами, предназначенными для способствования доставке и/или биодоступности при введе

- 28 019636 нии животному, например человеку (см. ниже).

Как уже обсуждалось выше, изменения в шарнирной области также оказывают влияние на эффекторные функции. Например, делеция шарнирной области может привести к снижению аффинности для Рс-рецепторов и может снизить активацию комплемента (К1ет е! а1., 1981, ΡΝΛ8 И8А, 78:524-528). Следовательно, настоящее изобретение относится к антителам с изменениями в шарнирной области.

В конкретных вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению можно модифицировать с целью ингибирования комплементзависимой цитотоксичности (СЭС). Модулированную активность СЭС можно обеспечить введением одной или более аминокислотных замен, вставок или делеций в Рс-области антитела (см., например, патенты США № 6194551 и 6242195). Альтернативно или дополнительно, можно ввести остаток(и) цистеина в Рс-область с созданием тем самым дисульфидной связи между цепями в данной области. Полученное, таким образом, гомодимерное антитело может обладать повышенной или пониженной способностью к интернализации и/или повышенной или пониженной комплементзависимой гибели клеток; см., например, Сагоп е! а1., 1. Ехр. Меб., 176:1191-1195, 1992 и 8Ьорез В., 1. 1ттипо1., 148:2918-2922, 1992, №0 99/51642, Описан & №тег, Νιΐιιιχ 322:738-40, 1988; патент США № 5648260; патент США 5624821 и №0 94/29351.

Кроме того, следует понимать, что эффекторная функция может варьировать в зависимости от аффинности связывания антитела. Например, антитела с высокой аффинностью могут быть более эффективными в активации системы комплемента по сравнению с антителами с относительно низкой аффинностью (Магхосс1п-Мас11або е! а1., 1999, 1ттипо1. НтмезЕ, 28:89-101). Следовательно, антитело можно изменить таким образом, что аффинность связывания с его антигеном была снижена (например, изменением вариабельных областей антитела с использованием таких способов, как замена, добавление или делеция одного или более аминокислотных остатков). Антитело с пониженной аффинностью связывания может проявлять пониженные эффекторные функции, включая, например, пониженную АЭСС и/или СПС.

Анти-СП154-антитела по настоящему изобретению с пониженной эффекторной функцией включают антитела с пониженной аффинностью связывания с одним или более Рс-рецепторами (РсК) по сравнению с исходным или немутантным анти-СП154-антителом. Следовательно, аити-С^154-аититела с пониженной аффинностью связывания с РсК включают аити-С^154-аититела, которые имеют 1,5-, 2-, 2,5-, 3-, 4- или 5-кратное или более снижение аффинности связывания с одним или более Рс-рецепторами по равнению с исходным или немутантным аити-С^154-аитителом (например, антителом 342 или 5с8). В некоторых вариантах осуществления анти-СП154-антитело с пониженной эффекторной функцией связывается с РсК с аффинностью примерно в 10 раз ниже по сравнению с исходным или немутантным антителом. В других вариантах осуществления аити-С^154-аититело с пониженной эффекторной функцией связывается с РсК с аффинностью примерно в 15 раз ниже или с аффинностью примерно в 20 раз ниже по сравнению с исходным или немутантным антителом. РсК-рецептор может представлять один или более из РсуК1 (ΟΌ64), РсуК11 (СЭ32) и РсуКШ (СЭ16) и их изоформы, и РсеК, РсцК, Рс5К и/или РсаК. В конкретных вариантах осуществления анти-СП154-антитело с пониженной аффинностью имеет 1,5-, 2-, 2,5-, 3-, 4- или 5-кратное или более снижение аффинности связывания с РсуКПа.

Следовательно, в некоторых вариантах осуществления аити-С^154-аититело по настоящему изобретению проявляет пониженное связывание с белком комплемента по сравнению со вторым антиСП154-антителом. В некоторых вариантах осуществления аити-С^154-аититело проявляет связывание, которое ниже примерно в 1,5 раза или более, примерно в 2 раза или более, примерно в 3 раза или более, примерно в 4 раза или более, примерно в 5 раз или более, примерно в 6 раз или более, примерно в 7 раз или более, примерно в 8 раз или более, примерно в 9 раз или более, примерно в 10 раз или более или примерно в 15 раз или более по сравнению со вторым аити-С^154-аитителом.

Следовательно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителам, которые проявляют пониженную эффекторную функцию при введении субъекту. В некоторых вариантах осуществления аити-С^154-аититело по данному изобретению не вызывает тромбоза у субъекта, которому вводят антитело. Тромбоз включает, например, тромбоэмболические осложнения. Такие осложнения включают, например, вазопатию (например, сосудистые изменения, такие как утолщение внутренней оболочки сосудов и изменения в сосудистой стенке). В некоторых вариантах осуществления анти-СП154-антитело по данному изобретению вызывает меньшие тромбоэмболические осложнения по сравнению со вторым СО154-специфическим антителом (например, антителом 342, антителом 5с8 или гуманизированным антителом 5с8). Аити-С^154-аититело с пониженной эффекторной функцией может показывать 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 или 50% снижение частоты проявления тромбоэмболических осложнений при введении субъекту и по сравнению с немутантным или исходным аити-С^154-аитителом.

В некоторых вариантах осуществления анти-СП154-антитело по данному изобретению не вызывает агрегацию или активацию тромбоцитов в условиях ΐπ νίΙΐΌ и/или в меньшей степени повышает агрегацию или активацию тромбоцитов по сравнению со вторым СЭ154-специфическим антителом (например, антителом 5с8 или гуманизированным антителом 5с8; см. пример 1). Следовательно, в некоторых вариантах осуществления присутствие СО154-связывающего белка, например анти-СП154-антитела, по на

- 29 019636 стоящему изобретению в обычном тесте оценки агрегации или активации тромбоцитов не приводит к повышению агрегации или активации более чем 20, 25, 30 или 50% по сравнению с агрегацией или активацией, наблюдаемой в тесте с отрицательным контролем. Примерным стандартным тестом оценки агрегации тромбоцитов является тест, описанный в данном документе (пример 11, тест 1) и приведенный на фиг. 26. Оба стандартный тест и альтернативный тест агрегации тромбоцитов (тест 2, фиг. 27), которые можно использовать в изобретении, описаны в примере 11. СО154-связывающий белок может быть растворимым.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение также относится к СО154связывающему белку, например анти-СО154-антителу, где указанный белок содержит один вариабельный домен иммуноглобулина, который специфически и моновалентно связывается с СО40Ь, где связывание указанного растворимого белка с СЭ154, по существу, не индуцирует фосфорилирование 1ЫК в Тклетках 1игка1. Также данное изобретение относится к СО154-связывающему белку, например антиСО154-антителу, где указанный белок содержит один вариабельный домен иммуноглобулина, который специфически и моновалентно связывается с €0154, где связывание указанного растворимого белка с СЭ154, по существу, не индуцирует секрецию ШЫ-гамма Т-клетками 1игка1, костимулированными антиСО3-антителом.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к анти-СО154-антителу, содержащему одну или более последовательностей СОВ тяжелой цепи, выбранных из СОВ-Н1 (8Е0 ГО N0: 3), СОВ-Н2 (8Е0 ГО N0: 4) и СОВ-Н3 (8Е0 ГО N0: 5), где антитело дополнительно содержит вариантную Ес-область, которая придает пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативной или исходной Ес-областью. В дополнительных вариантах осуществления анти-СО154-антитело содержит по меньшей мере две СОВ, и в других вариантах осуществления антитело содержит все три последовательности СОВ тяжелой цепи, которые представляют СОВ-Н1 (8Е0 ГО N0: 3), СОВ-Н2 (8Е0 ГО N0: 4) и СОВ-Н3 (8ЕО ГО N0: 5).

Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к анти-СО154-антителу, содержащему одну или более последовательностей СОВ легкой цепи, выбранных из СОВ-Ь1 (8Е0 ГО N0: 6), СОВ-Ь2 (8Е0 ГО N0: 7) и СОВ-Ь3 (8Е0 ГО N0: 8), где антитело дополнительно содержит вариантную Ес-область, которая придает пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативной или исходной Ес-областью. В дополнительных вариантах осуществления анти-СО154-антитело содержит по меньшей мере две из СОВ легкой цепи, и в других вариантах осуществления антитело содержит все три последовательности СОВ легкой цепи, которые представляют СОВ-Ь1 (8Е0 ГО N0: 6), СОВ-Ь2 (8Е0 ГО N0: 7) и СОВ-Ь3 (8Ер ГО N0: 8).

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения анти-СО154-антитело с пониженной эффекторной функцией содержит последовательности всех трех СОВ легкой цепи, которые представляют СОВ-Ь1 (8ЕО ГО N0: 6), СОВ-Ь2 (8ЕО ГО N0: 7) и СОВ-Ь3 (8ЕО ГО N0: 8), и содержит последовательности всех трех СОВ тяжелой цепи, которые представляют СОВ-Н1 (8Е0 ГО N0: 3), СОВН2 (8ЕО ГО N0: 4) и СОВ-Н3 (8ЕО ГО N0: 5).

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к анти-СО154-антителу, которое специфически связывается с белком СО154, где антитело содержит последовательность У_Н, выбранную из 8Е0 ГО N0: 1, 8Е0 ГО N0: 9, 8Е0 ГО N0: 10 и 8Е0 ГО N0: 11. В некоторых других вариантах осуществления данное изобретение относится к анти-СО154-антителу, которое специфически связывается с белком СО154, где антитело содержит последовательность тяжелой цепи, выбранную из 8Е0 ГО N0: 12 и 8Е0 ГО N0: 13. В дополнительных вариантах осуществления анти-СО154-антитело, содержащее любую одну или более СОВ или последовательности тяжелой или легкой цепи, описанные выше, представляет ЕаЬ- или ЕаЬ'-фрагмент или их производное. В еще одних вариантах осуществления антитело представляет Е(аЬ')₂-фрагмент или его производное. Также включаются другие фрагменты антител или их производных, содержащие СОВ или последовательности тяжелой или легкой цепи, которые специфически связываются с белком СО154. Данные антитела можно модифицировать для проявления пониженных эффекторных функций или их отсутствия. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-СО154-антителу, содержащему последовательность У_Н, выбранную из 8Е0 ГО N0: 1, 8Е0 ГО N0: 9, 8Е0 ГО N0: 10 и 8Е0 ГО N0: 11, где антитело дополнительно содержит вариантную Ес-область, которая придает пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативной или исходной Ес-областью.

В других вариантах осуществления изобретение относится к анти-СО154-антителу, содержащему последовательность У_ь, выбранную из 8Е0 ГО N0: 2 и 8Е0 ГО N0: 14, где антитело дополнительно содержит вариантную Ес-область, которая придает пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативной или исходной Ес-областью.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит последовательность вариабельной области легкой цепи 8Е0 ГО N0: 2. В дополнительных вариантах осуществления антитело, содержащее 8Е0 ГО N0: 2, представляет ЕаЬ- или ЕаЬ'-фрагмент или их производное. В еще одних вариантах осуществления антитело является фрагментом Е(аЬ')₂ или его производным. Также включаются другие фрагменты антител или их производные, содержащие СЭВ или последовательности тяжелой или легкой це

- 30 019636 пи, которые специфически связываются с белком СБ154.

В дополнительных вариантах осуществления изобретение относится к анти-СБ154-антителу, содержащему последовательность У_ъ, выбранную группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 2 и 8Е0 ΙΌ N0: 14, и дополнительно содержащему последовательность У_н, выбранную из 8Е0 ΙΌ N0: 1, 8Е0 ΙΌ N0: 9, 8Е0 ΙΌ N0: 10 и 8Е0 ΙΌ N0: 11, где антитело дополнительно содержит вариантную Ес-область, которая придает пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативной или исходной Ес-областью.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-СБ154-антителу, содержащему последовательность У_н 8Е0 ΙΌ N0: 29 и последовательность У_ъ 8Е0 ΙΌ N0: 30, где антитело дополнительно содержит вариантную Ес-область, которая придает пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативной или исходной Ес-областью.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-СБ154-антителу, которое специфически связывается с белком СБ154, где антитело содержит последовательность легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 15. В дополнительных вариантах осуществления антитело, содержащее последовательность легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 15, дополнительно содержит вариантную Ес-область, которая придает пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативной или исходной Ес-областью (например, Есобласть с измененным гликозилированием и/или другой модификацией).

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-СБ154-антителу, содержащему последовательность легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 15 и последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 12 и 8Е0 ΙΌ N0: 13, где антитело дополнительно содержит вариантную Ес-область, которая придает пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативной или исходной Ес-областью (например, Ес-область с измененным гликозилированием и/или другой модификацией).

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к анти-СБ154-антителу, содержащему последовательность легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 2 или 14 и последовательность тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 1, 9, 10 или 11. В некоторых вариантах осуществления анти-СБ154-антитело может быть фрагментом антитела. В дополнительных вариантах осуществления антитело является ЕаЬ- или ЕаЬ'-фрагментом или их производным. В еще одних вариантах осуществления антитело является Е(аЬ')₂-фрагментом или его производным. Также включаются другие фрагменты антител или их производные, содержащие СБК или последовательности тяжелой или легкой цепи, которые специфически связываются с белком СБ154. Дополнительно антитела могут проявлять пониженную эффекторную функцию. Например, антитела, содержащие Ес-область, могут содержать Ес-область с одной или более модификациями (например, измененным гликозилированием, конъюгированием и т.д.), таким образом, что антитело будет проявлять пониженную эффекторную функцию(и) или ее отсутствие.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-СБ154-антителу, содержащему последовательность легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 15 и последовательность тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 13, где антитело дополнительно содержит вариантную Ес-область, которая придает пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативной или исходной Ес-областью. В еще одних вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-СБ154-антителу, содержащему последовательность легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 15 и последовательность тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 12, где антитело дополнительно содержит вариантную Ес-область, которая придает пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативной или исходной Ес-областью.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-СБ154-антителу, содержащему одну или более последовательностей СБК тяжелой цепи, выбранных из СБК-н1 (8Е0 ΙΌ N0: 42), СБК-н2 (8Е0 ΙΌ N0: 43) и СБК-н3 (8Е0 ΙΌ N0: 44), где антитело дополнительно содержит вариантную Ес-область, которая придает пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативной или исходной Ес-областью. В некоторых вариантах осуществления анти-СБ154-антитело содержит по меньшей мере две из СБК тяжелой цепи и в других вариантах осуществления антитело содержит последовательности всех трех СБК тяжелой цепи, которые представляют СБК-Ш (8Е0 ΙΌ N0: 42), СБК-н2 (8ЕО ΙΌ N0: 43) и СБК-№ (8ЕО ΙΌ N0: 44).

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-СБ154-антителу, содержащему одну или более последовательностей СБК легкой цепи, выбранных из СБК-Б1 (8Е0 ΙΌ N0: 45), СБК-Б2 (8Е0 ΙΌ N0: 46) и СБК-Б3 (8Е0 ΙΌ N0: 47), где антитело дополнительно содержит вариантную Ес-область, которая придает пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативной или исходной Ес-областью. В некоторых вариантах осуществления анти-СБ154-антитело содержит по меньшей мере две из СБК легкой цепи, и в других вариантах осуществления антитело содержит последовательности всех трех СБК легкой цепи, которые представляют СБК-Б1 (8Е0 ΙΌ N0: 45), СБК-Б2 (8ЕО ΙΌ N0: 46) и СБК-Б3 (8ЕО ΙΌ N0: 47).

Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к анти-СБ154антителу, содержащему вариантную Ес-область, которая придает пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативной или исходной Ес-областью, где антитело содержит все три последовательности СБК легкой цепи, которые представляют СБК-Б1 (8Е0 ΙΌ N0: 45), СБК-Б2 (8Е0 ΙΌ N0: 46) и СБК-Б3 (8Е0 ГБ N0: 47), и где антитело содержит последовательности всех трех СБК тяжелой цепи, которые

- 31 019636 представляют СОЯ-Н1 (8ЕС ΙΌ N0: 42), СЭЯ-Н2 (8ЕО ΙΌ N0: 43) и СОЯ-Н3 (8ЕО ΙΌ N0: 44).

В еще одних вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-СО154-антителу, содержащему одну или более последовательностей СОЯ тяжелой цепи, выбранных из С0Я-Н1 (8Е0 ГО N0: 48), СОЯ-Н2 (8Е0 ГО N0: 49) и С0Я-Н3 (8Е0 ГО N0: 50), где антитело дополнительно содержит вариантную Ес-область, которая придает пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативной или исходной Ес-областью. В дополнительных вариантах осуществления анти-СО154-антитело содержит по меньшей мере две из СОЯ тяжелой цепи, и в других вариантах осуществления антитело содержит последовательности всех трех СОЯ тяжелой цепи, которые представляют СОЯ-Н1 (8Е0 ГО N0: 48), СОЯН2 (8 ЕС) ГО N0: 49) и СОЯ-Н3 (8ЕС) ГО N0: 50).

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-СО154-антителу, содержащему одну или более последовательностей СОЯ легкой цепи, выбранных из СОЯ-Ь1 (8Е0 ГО N0: 51), СОЯ-Ь2 (8Е0 ГО N0: 52) и СОЯ-Ь3 (8Е0 ГО N0: 53), где антитело дополнительно содержит вариантную Ес-область, которая придает пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативной или исходной Ес-областью. В дополнительных вариантах осуществления антитело содержит по меньшей мере две из СОЯ легкой цепи, и в других вариантах осуществления антитело содержит последовательности всех трех СОЯ легкой цепи, которые представляют СОЯ-Я1 (8Е0 ΙΌ N0: 51), СОЯ-Я2 (8Е0 ΙΌ N0: 52) и СОЯ-Я3 (8ЕС) ГО N0: 53).

В некоторых вариантах осуществления анти-СО154-антитело с пониженной эффекторной функцией содержит все три последовательности СОЯ легкой цепи, которые представляют С0Я-Ь1 (8Е0 ГО N0: 51), СОЯ-Я2 (8Е0 ГО N0: 52) и СОЯ-Я3 (8Е0 ГО N0: 53), и дополнительно содержит последовательности всех трех СОЯ тяжелой цепи, которые представляют СОЯ-Н1 (8Е0 ГО N0: 48), СОЯ-Н2 (8Е0 ГО N0: 49) и СОЯ-Н3 (8ЕС) ГО N0: 50).

В дополнительных вариантах осуществления данное изобретение относится к анти-СО154антителу, которое специфически связывается с СО154, где антитело содержит последовательность ν_ρ 8Е0 ΙΌ N0: 54. Также данное изобретение относится к анти-СО154-антителу, которое содержит последовательность 8Е0 ГО N0: 56. Анти-СО154-антитело по изобретению может содержать последовательность V,. 8Е0 ГО N0: 54 и последовательность 8Е0 ГО N0: 56. В дополнительных вариантах осуществления антитело является ЕаЬ- или ЕаЬ'-фрагментом или их производным. В еще одних вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела является Е(аЬ')₂-фрагментом или его производным. Антитело или фрагмент также может представлять гуманизированное или полностью человеческое антитело или его фрагмент. Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к антиСО154-антителу, содержащему последовательность 8Е0 ГО N0: 56 и последовательность ν_ρ 8Е0 ΙΌ N0: 54, где антитело дополнительно содержит вариантную Ес-область, которая придает пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативной или исходной Ес-областью.

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-СО154антителу, которое специфически связывается с белком СО154, где антитело содержит последовательность ν_ρ 8Е0 ΙΌ N0: 58. В дополнительных вариантах осуществления антитело содержит последовательность 8Е0 ГО N0: 60. В дополнительных вариантах осуществления антитело или фрагмент содержит последовательность 8Е0 ГО N0: 60 и последовательность ν_ρ 8Е0 ΙΌ N0: 58. Антитело может быть ЕаЬ-или ЕаЬ'-фрагментом или их производным. В еще одних вариантах осуществления антитело является Е(аЬ')₂-фрагментом или его производным. Также антитело может быть гуманизированным или полностью человеческим антителом или его фрагментом. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-СО154-антителу, содержащему последовательность 8Е0 ГО N0: 58 и последовательность ν_ρ 8Е0 ΙΌ N0: 60, где антитело дополнительно содержит вариантную Ес-область, которая придает пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативной или исходной Есобластью.

Анти-СО154-антитела с измененным гликозилированием.

Удаление гликана приводит к структурному изменению, которое будет существенно снижать связывание со всеми членами семейства Ес-рецепторов различных видов. В гликозилированных антителах, включая анти-СО154-антитела, гликаны (олигосахариды), присоединенные к консервативному N связанному сайту, в СН2-доменах Ес-димера, находятся между СН2-доменами, с остатками сахара, обеспечивающими контактирование с определенными аминокислотными остатками в противоположном СН2-домене. Различные профили гликозилирования связаны с различными биологическими свойствами антител (.Тейегщ апб Ьипб, 1997, СНет. Iттиηο1., 65:111-128; \Упд1и апб Моткоп, 1997, Тгепбк Вйо1есНпо1., 15:26-32). Некоторые определенные гликоформы придают потенциально преимущественные биологические свойства. Потеря гликанов изменяет пространственное расположение областей и повышает их подвижность относительно друг друга, и как полагают, это оказывает ингибирующее действие на связывание со всеми членами семейства Ес-рецепторов. Например, результаты опытов в условиях т νίΙΐΌ с различными гликозилированными антителами показали, что удаление гликанов в СН2-домене изменят структуру Ес-области таким образом, что связывание с Ес-рецепторами и белком комплемента С1с.| существенно снижается. Другим известным подходом к снижению эффекторных функций является ингибирование продукции или удаление ^связанных гликанов в положении 297 (ЕЙ нумерация) в СН2

- 32 019636 домене Рс-области (№зе е! а1., 1983, ΡNА8, 80:6632; ЬеаШегЬаггоу е! а1., 1985, Мо1. 1ттипо1., 22:407; Тао е! а1., 1. 1ттипо1., 143:2595; Ьипб е! а1., 1990, Мо1. 1ттипо1., 27:1145; Иога1 е! а1., 1991, НуЬпбота, 10:211; Напб е! а1., 1992, Сапсег 1ттипо1. 1ттипо!Ьег., 35:165; Ьеабег е! а1., 1991, 1ттипо1оду, 72:481; Роипб е! а1., 1993, Мо1. 1ттипо1., 30:233; Воуб е! а1., Мо1. 1ттипо1., 32:1311). Также известно, что различные гликоформы могут оказывать существенное влияние на свойства терапевтического средства, включая фармакокинетику, фармакодинамику, взаимодействие с рецептором и тканеспецифическую направленность (Сгабб1з е! а1., 2002, Сигг. РЬагт. Вю!есЬпо1., 3:285-297). В частности, в отношении антител, то структура олигосахарида может влиять на свойства антитела, связанные с резистентностью к протеазе, временем полужизни в сыворотке крови, опосредованным РсВп-рецептором, фагоцитозом и обратной связью антитела, в дополнении к эффекторным функциям антитела (например, связыванию с комплексом комплемента С1, которое индуцирует СЭС, и связыванию с РсγВ-рецеπторами, которое ответственно за модулирование пути ЛИСС (№зе апб ЭД1дхе11, 1983; Ьеа!ЬегЬаггоу апб Иуек, 1983; Ьеа!ЬегЬаггоу е! а1., 1985; ЭДа1кег е! а1., 1989; Сайег е! а1., 1992, Р^8, 89:4285-4289).

Следовательно, другой способ модуляции эффекторной функции антител включает изменение гликозилирования константной области антитела. Измененное гликозилирование включает, например, снижение или повышение числа гликозилированных остатков, изменение характера или расположения гликозилированных остатков, а также изменение в структуре(ах) сахара. Олигосахариды, обнаруженные в человеческих 1дС, оказывают влияние на степень проявления их эффекторной функции (Ва_)и Т.8., ВюРгосезз 1п!егпайопа1, Арп1 2003, 44-53); микрогетерогенность олигосахаридов человеческого 1дС может оказать влияние на биологические функции, такие как СЭС и АОСС, связывание с различными Рсрецепторами и связывание с белком С1с.| (ЭДпдЬ! А. & Мотзоп 8.Ь., Т1ВТЕСН 1997, 15:26-32; 8Ь1е1бз е! а1., 1. Вю1. СЬет., 2001, 276 (9):6591-604; 8Ь1е1бз е! а1., 1. Вю1. СЬет., 2002, 277 (30):26733-40; 8Ь1пкауа е! а1., 1. Вю1. СЬет., 2003, 278 (5):3466-73; Итапа е! а1., №1. Вю!есЬпо1., 1999 РеЬ., 17(2):176-80). Например, способность 1дС связываться с С1с.| и активировать каскад комплемента может зависеть от присутствия, отсутствия или модификации углеводной группы, расположенной между двумя СН2-доменами (которая в норме связана с остатком Азп297) (ЭДагб апб СЬейе, ТЬегареийс 1ттипо1оду, 2:77-94, 1995).

Сайты гликозилирования в Рс-содержащем полипептиде, например в антителе, таком как 1дСантитело, можно идентифицировать стандартными методами. Идентификация сайта гликозилирования может быть экспериментальной или может основываться на анализе последовательности или данных моделирования. Описаны консенсусные мотивы, т.е. аминокислотные последовательности, распознаваемые различными гликозилтрансферазами. Например, консенсусный мотив для мотива Ν-связанного гликозилирования обычно представляет NXΤ или ΝΧ8, где X может быть любой аминокислотой, за исключением пролина. Также описано несколько алгоритмов для определения локализации потенциального мотива гликозилирования. Следовательно, для идентификации потенциальных сайтов гликозилирования в антителе или Рс-содержащем фрагменте исследуют последовательность антитела, например, при использовании широко доступной базы данных, такой как уеЬзйе, приведенной Центром анализа биологических последовательностей (см. №ШС1ус для прогноза сайтов Ν-связанного гликозилирования и №!ОС1ус для прогноза сайтов О-связанного гликозилирования).

Результаты опытов ш у1уо подтвердили снижение эффекторной функции у агликозильных антител. Например, агликозильное анти-СП8-антитело не способно приводить к элиминации СИ8-несущих клеток у мышей (1заасз, 1992, 1. 1ттипо1., 148:3062) и агликозильное анти-СП3-антитело не индуцирует синдром высвобождения цитокинов у мышей или людей (Воуб, 1995, выше; Рпепб, 1999, Тгап8р1ап1айоп, 68:1632).

Важно, что несмотря на то что удаление гликанов в СН2-домене оказывает существенное влияние на проявление эффекторной функции, другие функциональные и физические свойства антитела остаются без изменений. В частности, было показано, что удаление гликанов оказывало незначительное воздействие на время полужизни в сыворотке крови и связывание с антигеном (№зе, 1983, выше; Тао, 1989, выше; Оогаг 1991, выше; Напб, 1992, выше; НоЬЬз, 1992, Мо1. 1ттипо1., 29:949).

Несмотря на то что имеется признание агликозильного подхода в условиях ш у1уо, имеются сообщения об остаточной эффекторной функции у агликозильных тАЬ (см., например, Роипб Ю. е! а1., 1993, Мо1. 1ттипо1., 30(3): 233-41; Иога1 Н. е! а1., 1991, НуЬпбота, 10(2):211-7). Агтоиг е! а1. установили сохранение остаточного связывания с белками РсγВIIа и РсγВIIЬ (Еиг. 1. 1ттипо1., 1999, 29:2613-2624; Мо1. 1ттипо1., 40, 2003, 585-593). Таким образом, дополнительное снижение эффекторной функции, особенно активации комплемента, в некоторых случаях может быть важным для гарантии полной отмены активности. По этой причине агликозильные формы 1дС2 и 1дС4 и гибрида С1/С4 предусматриваются в качестве пригодных в способах и композициях антител с пониженными эффекторными функциями по изобретению.

Получение дегликозилированных или агликозильных анти-СП154-антител.

Анти-СО154-антитела по настоящему изобретению можно модифицировать или изменить с целью проявления пониженной эффекторной функции(й) (по сравнению со вторым СИ154-специфическим антителом), одновременно сохранив другие ценные свойства Рс-области.

- 33 019636

Следовательно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к агликозильным анти-СО154-антителам с пониженной эффекторной функцией, которые отличаются модификацией в консервативном Ν-связанном сайте в СН2-доменах Ес-области антитела. Модификация консервативного Ν-связанного сайта в СН2-доменах Ес-димера может привести к обеспечению агликозильных анти-СП154-антител. Примеры таких модификаций включают мутацию консервативного Ν-связанного сайта в СН2-доменах Ес-димера, удаление гликанов, присоединенных к Ν-связанному сайту в СН2доменах, и предупреждение гликозилирования. Например, агликозильное анти-СО154-антитело можно получить изменением канонического Авп Ν-связанного сайта в СН2-домене тяжелой цепи на остаток С1п (см., например, заявку №0 05/03175 и заявку на патент США 2006/0193856).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения модификация включает мутацию в сайте гликозилирования тяжелой цепи в целях отмены гликозилирования в сайте. Таким образом, в одном варианте осуществления данного изобретения агликозильные анти-СП154-антитела получают мутацией сайта гликозилирования тяжелой цепи, т.е. мутацией Ν298Ο (Ν297 с использованием ЕЙ нумерации КаЬа!) и экспрессируют в подходящей клетке-хозяине. Например, данную мутацию можно провести, следуя рекомендованному изготовителем протоколу к набору для мутагенеза уникальных сайтов производства Атегвйат-Рйагтас1а Вю!есй® (Р1вса1атау, ΝΥ, США).

Мутированное антитело можно стабильно экспрессировать в клетке-хозяине (например, клетке Ν80 или СНО) и затем выделить. В качестве одного примера выделение можно проводить с использованием протеина А и гель-хроматографии. Специалистам в данной области, очевидно, понятно, что также можно использовать другие подходящие способы экспрессии и выделения.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения агликозильные анти-СО154антитела обладают пониженной эффекторной функцией, где модификация в консервативном Νсвязанном сайте в СН2-доменах Ес-области указанного антитела или производного антитела включает удаление гликанов в СН2-доменах, т.е. дегликозилирование. Данные агликозильные анти-СО154антитела можно получить обычными методами и затем подвергнуть ферментативному дегликозилированию. Способы ферментативного дегликозилирования антител являются хорошо известными специалистам в данной области (№1Шат8, 1973; №тке111аке & №со1воп, 1976, 1. Вю1. СИет., 251:1074-80).

В другом варианте осуществления данного изобретения дегликозилирование можно обеспечить культивированием клеток-хозяев, которые продуцируют антитела, в культуральной среде, содержащей ингибитор гликозилирования, такой как туникамицин (№ве & \№1дхе1к 1983). То есть модификация представляет собой снижение или отмену гликозилирования в консервативном Ν-связанном сайте в СН2-доменах Ес-области указанного антитела.

В еще одних вариантах осуществления данного изобретения рекомбинантные СЭ154 полипептиды (или клетки либо клеточные мембраны, содержащие такие полипептиды) можно использовать в качестве антигена для получения анти-СО154-антител или производных антител, которые затем можно дегликозилировать.

В альтернативных вариантах осуществления агликозильные анти-СП154-антитела или анти-СО154антитела с пониженным гликозилированием по настоящему изобретению можно получить способом, описанным Тау1ог е! а1. (№0 05/18572 и заявка на патент США 2007/0048300). Например, в одном варианте осуществления агликозильное антитело против СЭ154 можно получить изменением первого аминокислотного остатка (например, заменой, вставкой, делецией или химической модификаций), где измененный первый аминокислотный остаток приводит к ингибированию второго аминокислотного остатка посредством стерического препятствия или заряда или обоими факторами вместе. В некоторых вариантах осуществления первый аминокислотный остаток модифицирован аминокислотным замещением. В дополнительных вариантах осуществления аминокислотная замена выбрана из группы, состоящей из С1у, А1а, Уа1, Ьеи, Не, РИе, Авп, С1п, Тгр, Рго, 8ег, ТИг, Туг, Сув, Ме!, Авр, С1и, Ьув, Агд и Н1в. В еще одних вариантах осуществления аминокислотная замена представляет введение необычного аминокислотного остатка. Второй аминокислотный остаток может находиться около или внутри мотива гликозилирования, например в мотиве Ν-связанного гликозилирования, который содержит аминокислотную последовательность NXТ или ΝΧ8. В одном приведенном в качестве примера варианте осуществления первый аминокислотный остаток является аминокислотой 299 и второй аминокислотный остаток является аминокислотой 297 согласно нумерации КаЬа!. Например, первое замещение аминокислоты может представлять Т299А, Т299№ Т299С, Ϊ299Υ, Т299С, Т299Н, Т299Е, Т299П, Т299К, Т299В, Т299С, Έ299Ι, Т299Ь, Т299М, Т299Е, Т299Р, Т299№ и Т299У согласно нумерации КаЬа!. В конкретных вариантах осуществления аминокислотная замена представляет Т299С.

Также эффекторную функцию можно снизить модификацией антитела по настоящему изобретению таким образом, что антитело будет содержать блокирующую группу. Приведенные в качестве примера блокирующие группы включают группы с достаточным стерическим размером и/или зарядом таким образом, что обеспечивается пониженное гликозилирование, например, блокированием способности гликозидазы катализировать гликозилирование полипептида. Блокирующая группа может, дополнительно или альтернативно, подавлять эффекторную функцию, например, ингибированием способности Ес-области связываться с рецептором или комплементом. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобре

- 34 019636 тение относится к СО154-связывающему белку, например анти-СО154-антителу, содержащему последовательность СЭВ3 тяжелой цепи, выбранную из 8ЕО ΙΌ N0: 5, 44 и 50, и вариантную Рс-область, где вариантная Рс-область содержит первый аминокислотный остаток и сайт ^гликозилирования, первый аминокислотный остаток, модифицированный изменением боковой цепи в целях достижения повышенного стерического размера и/или повышенного электростатического заряда по сравнению с немодифицирванным первым аминокислотным остатком, со снижением, таким образом, уровня или изменением иным образом изменения гликозилирования в сайте ^гликозилирования. В некоторых из данных вариантов осуществления вариантная Рс-область придает пониженную эффекторную функцию по сравнению с контрольной, невариантной Рс-областью. В дополнительных вариантах осуществления боковая цепь с повышенным стерическим размером представляет боковую цепь аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из Рке, Тгр, Н1з, С1и, С1и, Агд, Ьуз, Ме! и Туг. В еще одних вариантах осуществления боковая химическая группа с повышенным электростатическим зарядом является боковой цепью аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из Азр, С1и, Ьуз, Агд и Н1з.

Следовательно, в одном варианте осуществления гликозилирование и Рс-связывание можно модулировать заменой Т299 на заряженную боковую цепь, такую как Ό, Е, К или В. Полученное антитело будет иметь пониженный профиль гликозилирования, а также пониженную аффинность связывания Рсобласти с Рс-рецептором за счет неблагоприятных электростатических взаимодействий.

В еще одном варианте осуществления мутантное антитело Т299С, которое одновременно является агликозилированным и способным образовывать цистеиновый аддукт, может проявлять меньшую эффекторную функцию (например, связывание с РсуВ1) по сравнению с агликозилированным прототипом антитела (см., например, заявку А0 05/18572). Следовательно, изменение первой аминокислоты, которая находится проксимальнее к мотиву гликозилирования, может ингибировать гликозилирование антитела во втором аминокислотном остатке; когда первая аминокислота является остатком цистеина, то антитело может проявлять даже еще более пониженную эффекторную функцию. Кроме того, ингибирование гликозилирования антитела подтипа 1дС4 может оказывать более выраженное воздействие на связывание с РсуВ1 по сравнению с влиянием агликозилирования в других подтипах.

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-СЭ154антителу с измененным гликозилированием, которое проявляет пониженное связывание с одним или более РсВ-рецепторами и которое также необязательно показывает повышенное или нормальное связывание с одним или более Рс-рецепторами и/или комплементом, например антитела с измененным гликозилированием, которые, по меньшей мере, сохраняют такую же или близкую аффинность связывания с одним или более Рс-рецепторами и/или комплементом, что и у нативного, контрольного анти-СЭ154антитела. Например, анти-СП154-антитела преимущественно с Маη5С1сNАс₂N-гликаном в качестве имеющейся гликановой структуры (например, где Маη5С1сNАс₂N-гликан находится в количестве, составляющем по меньшей мере примерно 5 мол.% выше по сравнению со следующей преимущественной гликановой структурой композиции 1д) могут проявлять измененную эффекторную функцию по сравнению с популяцией анти-СП154-антител, в которых структура Маи5С1сNАс₂N-гликана не является доминирующей. Антитела преимущественно с данной гликановой структурой проявляют пониженное связывание с РсуВЛа и РсуВ11Ь, повышенное связывание с РсуВШа и РсуВШЬ и повышенное связывание с субъединицей С1с.| комплекса С1 (см. заявку на патент США 2006/0257399). Данная гликановая структура, в том случае, когда она является основной гликановой структурой, придает повышенную АЭСС, повышенную СЭС повышенное время полужизни в сыворотке крови, повышенную продукцию антител Вклетками и пониженный фагоцитоз макрофагами.

В целом структуры гликозилирования в гликопротеине будут варьировать в зависимости от экспрессии хозяином и условий культивирования (Ващ Т.8., ВюРтосезз Юетайоиаф Артй 2003, 44-53). Такие различия могут привести к одновременным изменениям эффекторной функции и фармакокинетики (1згае1 е! а1., 1ттиио1оду, 1996, 89 (4):573-578; №^кпк е! а1., Р. С1т. Ехр., 106(2):259-64). Например, галактозилирование может варьировать в зависимости от культуральных условий, которые могут сделать некоторые иммуногобулины иммуногенными в зависимости от их специфического профиля галактозы (Ра!е1 е! а1., 1992, Вюскет I., 285:839-845). Для олигосахаридов гликопротеинов, продуцированных клетками млекопитающих, отличных от человека, свойственна тенденция быть ближе к человеческим гликопротеинам. Кроме того, можно сконструировать и отобрать белки-экспрессирующие системы-хозяева для экспрессии доминирующей гликоформы 1д, или, альтернативно, могут естественно продуцировать гликопротеины с доминирующими гликановыми структурами. Примеры сконструированных экспрессирующих белки систем-хозяев, продуцирующих гликопротеин с преимущественной гликоформой, включают нок-ауты/мутации генов (8Ые1йз е! а1., 2002, 1ВС, 277:26733-26740); генную инженерию (Итаиа е! а1., 1999, №1Шге Вю!еск., 17:176-180) или их сочетание. Альтернативно, некоторые клетки естественно экспрессируют доминирующую гликоформу, например клетки кур, людей и коров (Ващ е! а1., 200, С1усоЬю1оду, 10:477-486). Таким образом, специалист в данной области может получить экспрессию антиСО154-антитела или композиции антитела с измененным гликозилированием (например, преимущественно с одной определенной гликановой структурой) отбором по меньшей мере одной из многих экс

- 35 019636 прессирующих систем-хозяев. Экспрессирующие белки системы-хозяева, которые можно использовать для продукции анти-СП154-антител по настоящему изобретению, включают клетки животных, растений, насекомых, бактерий и т.п. Например, в заявках на патент США 2007/0065909, 2007/0020725 и 2005/0170464 описано получение молекул агликозилированных иммуноглобулинов в бактериальных клетках. В качестве дополнительного примера \Упд1Ц и Мотткои получали антитела в линии клеток СНО с недостаточным гликозилированием (1994, 1. Ехр. Меб., 180:1087-1096) и показали, что антитела, продуцированные данной клеточной линией, не способны к комплементзависимому цитолизу. Другие примеры экспрессирующих систем-хозяев, найденные в области получения гликопротеинов, включают клетки СНО: Ка)и \¥0 99/22764 и Ртейа \¥0 0З/З58З5; гибридомные клетки: ТгеЬак ек а1., 1999, ί. Iттипо1. Мекйобк, 2З0:59-70; клетки насекомых: Нки ек а1., 1997, ДВС, 272:9062-970 и растительные клетки: Сегидго88 ек а1., \У0 04/74499. Оценку степени, до которой данная клетка или экстракт обеспечивает гликозилирование данного мотива, можно провести известными в данной области методами определения того, насколько мотив гликозилирован, например, с использованием гель-электрофореза и/или массспектроскопии.

Дополнительные способы изменения сайтов гликозилирования антител описаны, например, в патенте США № 6З50861 и патенте США № 5714З50, \\'0 05/18572 и \\'0 05/0З1175; данные способы можно использовать для получения анти-СО154-антител по настоящему изобретению с измененным, пониженным гликозилированием или его отсутствием.

Агликозильные анти-СЭ 154-антитела с пониженной эффекторной функцией могут представлять антитела, которые содержат модификации или которые можно конъюгировать для включения функциональной группы. Такие группы включают блокирующую группу (например, ПЭГ, цистеиновый аддукт и т.д.), детектируемую группу (например, флуоресцентные группы, радиоизотопные группы, непроницаемые для радиоактивности группы и т.д., включая диагностические группы) и/или терапевтическую группу (например, цитотоксические агенты, противовоспалительные средства, иммуномодуляторы, противоинфекционные средства, противоопухолевые средства, средства для лечения нейродегенеративных заболеваний, радионуклиды и т.д.).

Конъюгаты антител.

При введении часто антитела обычно быстро элиминируются из кровотока и, следовательно, могут проявлять фармакологическую активность в течение относительно непродолжительного периода времени. Следовательно, могут быть необходимыми частые введения относительно больших доз антител для поддержания терапевтической эффективности при лечении антителами.

В одном варианте осуществления данного изобретения анти-СО154-антитела по данному изобретению могут представлять модифицированные антитела (например, соединенные с другими группами, такими как гетерологичная функциональная группа) с целью повышения целостности и существования антитела в условиях ίη у1уо. Например, анти-СО154-антитела по данному изобретению могут представлять антитела, которые модифицированы для включения группы (функциональной группы), которая может повысить стабильность, тем самым пролонгируя время полужизни в сыворотке крови антитела. Время полужизни в сыворотке крови СЭ154-связывающего белка, например антитела по изобретению, может составлять по меньшей мере З суток, по меньшей мере 7 суток, по меньшей мере 14 суток, по меньшей мере 21 сутки, по меньшей мере 28 суток, по меньшей мере 1 месяц или более. Такие функциональные группы, которые повышают время полужизни антител, могут быть особенно пригодными в вариантах осуществления, когда антитело представляет, например, фрагмент антитела.

Модификации антител также могут приводить к повышению растворимости белка в водном растворе, предупреждению агрегации, повышению физической и химической стабильности белка и существенному снижению иммуногенности и антигенности белка. В результате желаемую биологическую активность в условиях ίη у1уо можно обеспечить введением таких аддуктов полимер-белок реже или в более низких дозах по сравнению с немодифицированным белком.

Следовательно, в некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению являются антителами, соединенными с гетерологичными функциональными группами, с получением конъюгатов антител. Функциональная группа относится к любой функциональной группе (например, полипептиду, домену белка, носителю, полимеру и т.д.), которая связана с антителом по изобретению. Связывание антиСО154-антитела может быть ковалентным или нековалентным и также может быть обратимым или контролируемым. Примерные молекулы, которые можно использовать для получения конъюгатов антител против СЭ154, включают, но не ограничиваются этим, функциональные молекулы, например, такие как противоопухолевые средства, лекарственные средства, токсины, биологически активные белки, например ферменты, другое антитело, производное антитела или фрагменты антитела, синтетические (например, ПЭГ) или природные полимеры, нуклеиновые кислоты и их фрагменты, например ДНК, РНК и их фрагменты, аптамеры, радионуклиды, особенно радиойодиды, радиоизотопы, хелатированные металлы, наночастицы и репортерные группы, такие как флуоресцентные или люминесцентные соединения, или соединения, которые можно детектировать с помощью визуализирующих методов, таких как ЯМР- или ЕБВ-спектроскопия.

В дополнительном примере функциональная группа, с которой конъюгируют антитела по изобре

- З6 019636 тению, могут привести к повышению времени полужизни антитела в условиях ίη νΐνο, и/или снижению иммуногенности антитела, и/или повышению прохождения антитела через эпителиальный барьер в иммунную систему. Примеры подходящих функциональных молекул данного типа включают полимеры, декстран, гидроксипропилметакриламид (НРМА), трансферрин, альбумин, связывающие белки альбуминовой фракции или связывающиеся с альбумином соединения, такие как описаны в РСТ/СВ2005/002084.

В тех случаях, когда функциональная группа является полимером, то, в общем, он может представлять собой синтетический или природный полимер, например необязательно замещенный полиалкилен, полиалкенилен или полиоксиалкилен с прямой или разветвленной цепью или разветвленный или неразветвленный полисахарид, например гомо- или гетерополисахарид; см., например, Уегопеке апб Раки!, 2005, Эгид Э|ксоуегу Тобау, 10(21):1451-1458; Раки! е! а1., 2004, Е.хрей 0ρίηίοη ίη Тйетареийс Ра!ейк, 14(6):859-894.

Конкретные необязательные заместители, которые могут присутствовать в вышеуказанных синтетических полимерах, включают одну или более гидроксильных, метильных или метоксильных групп.

Конкретные примеры синтетических полимеров включают необязательно замещенные полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, поливиниловый спирт с прямой или разветвленной цепью или их производные, особенно необязательно замещенный полиэтиленгликоль, такой как метоксиполиэтиленгликоль или его производные.

Конкретные природные полимеры включают лактозу, амилозу, декстран, гликоген или их производные. Производные в данном контексте включают реакционноспособные производные, например тиол-избирательные реакционноспособные группы, такие как малеимиды и т.п. Реакционноспособная группа может быть связана с полимером прямо или через линкер. Очевидно, понятно, что в некоторых случаях такая группа будет образовывать часть продукта в виде связывающей группы между фрагментом антитела и полимером.

Размер полимера может варьировать, как желательно, но как правило, будет иметь среднюю молекулярную массу в пределах от 500 до 50000 Да, предпочтительно от 5000 до 40000 Да и более предпочтительно от 20000 до 40000 Да. Размер полимера, в частности, может быть выбран на основе предполагаемого применения продукта, например, с учетом способности локализоваться в определенных тканях, таких как опухоли, и удлинения времени полужизни в кровотоке (см. обзор СПартан, 2002, Αбνаηсеб Эгид Эекуегу Веу1е^8, 54:531-545). Так, например, в тех случаях, когда предполагается, чтобы продукт удалялся из кровотока и проникал в ткани, например, при лечении опухоли, то может быть преимущественным использовать полимер с низкой молекулярной массой, например с молекулярной массой примерно 5000 Да. Для применений, при которых требуется, чтобы продукт оставался в кровотоке, то может преимущественным использовать полимер с более высокой молекулярной массой, например с молекулярной массой в пределах от 20000 до 40000 Да.

Особенно предпочтительные полимеры включают полиалкилен, такой как полиэтиленгликоль, или, в частности, метоксиполиэтиленгликоль или его производное, и, в частности, с молекулярной массой в пределах примерно от 15000 до примерно 40000 Да.

Предпочтительно антитело, производное антитела или фрагмент антитела по данному изобретению, в том числе антитело или фрагмент с пониженной эффекторной функцией, были соединены с полиалкиленом, в частности полиэтиленгликолем (сокращенно в данном документе ПЭГом) или его производным. В некоторых вариантах осуществления антитело, производное антитела или фрагмент антитела по данному изобретению представляет фрагмент антитела, который является ЕаЬ'- или Е(аЬ')₂-фрагментом или производным, который соединен с ПЭГом по тяжелой цепи или легкой цепи, или обеим вместе. Данный ЕаЬ'- или Е(аЬ')2-фрагмент может быть человеческим или гуманизированным.

Следовательно, в некоторых вариантах осуществления данного изобретения анти-СП154-антитела по данному изобретению являются антителами, которые модифицированы ковалентным присоединением функциональных групп, таких как водорастворимые полимеры, например полиэтиленгликоль, сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон или полипролин - о которых всех известно, что они имеют более длинное время полужизни в крови после внутривенного введения по сравнению с соответствующими немодифицированными белками; см., например, АЬис1ю\\'кк| е! а1., 1981, в Епхутек ак Эгидк, Но1сеиЬегд е! а1. (еб.), 1981. ЭД^1еу-Iη!е^кс^еηсе, №\ν Уотк, ПУ, 367-383, 1981; АгнЮком ЭД.Р., 1992, Ηитаη Семе Тйетару. Заенсе, 256:808-813; №\утагк е! а1., 1982, 1. Арр1. Вюсйет., 4:185-189; Ка!ге е! а1., 1987, Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А, 84:1487-1491.

В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению представляют антитела, соединенные с функциональными группами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ). В одном конкретном варианте осуществления антитело представляет фрагмент антитела и молекулы ПЭГа можно присоединить через любую доступную боковую цепь аминокислоты или концевую функциональную группу аминокислоты, расположенную во фрагменте антитела, например любую свободную группу, такую как амино, имино, тиол, гидроксил или карбоксил. Такие аминокислоты могут, естественно, находиться во фрагменте антитела или их можно ввести во фрагмент с использованием методов рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 5219996; патент США № 5667425; заявка ЭД0 98/25971). В

- 37 019636 других вариантах осуществления ЕаЬ-фрагмент по данному изобретению модифицируют добавлением одной или более аминокислот к С-концу его тяжелой цепи для обеспечения присоединения функциональной группы.

Предпочтительно дополнительные аминокислоты образуют модифицированную шарнирную область, содержащую один или более остатков цистеина, к которым можно присоединить функциональную группу. Можно использовать множество сайтов для присоединения одной или более молекул ПЭГа.

В некоторых аспектах данного изобретения молекулы ПЭГа ковалентно связаны через тиольную группу по меньшей мере одного остатка цистеина, находящегося во фрагменте антитела по настоящему изобретению. Каждая молекула ПЭГа, присоединенная к модифицированному фрагменту антитела, может быть ковалентно связана с атомом серы остатка цистеина во фрагменте. Как правило, ковалентная связь будет представлять дисульфидную связь или, в частности, связь сера-углерод. В том случае, когда используется тиольная группа в качестве места присоединения соответствующим образом активированных групп, например тиол-избирательных производных, таких как малеимиды, то можно использовать производные цистеина. Активированный ПЭГ можно использовать в качестве исходного вещества в получении модифицированных ПЭГом фрагментов антитела, как описано выше. Активированный ПЭГ может быть любым ПЭГом, содержащим тиольную реакционноспособную группу, такую как αгалогенкарбоновая кислота или эфир, например йодацетамид, имид, например малеимид, винилсульфон или дисульфид. В некоторых вариантах осуществления конъюгат анти-СО154-антитела может содержать две молекулы ПЭГа с двумя молекулами малеимида. Исходные вещества можно получить из коммерческих источников (например, от №к!аг, прежнее название 8кеаг\\а1ег Ро1утег§ Шс., НипйуШе, АЬ, США) или можно приготовить из промышленно доступных соединений с использованием обычных химических реакций. Конкретные молекулы ПЭГ а включают 20К метокси-ПЭГ -амин (производства №к!аг, прежнее название 8кеагюа!ег; Варр Ро1утеге и 8ипВю) и М-ПЭГ-8РА (производства №к!аг, прежнее название 8кеагюа!ег).

В одном предпочтительном варианте осуществления антитело по изобретению представляет модифицированный ЕаЬ-фрагмент, который ПЭГилирован, т.е. содержит ПЭГ (полиэтиленгликоль), ковалентно присоединенный к нему, например, с использованием метода, описанного в ЕР 0948544 (также см. Ро1у(е!ку1епед1усо1) СкетЩгу, Вю!есктса1 ап4 ВютеШса1 Арр1юа!юп8, 1992, 1. М11!оп Наггй (е4), Р1епит Рге§8, №\ν Υо^к. Ро1у(е!ку1епед1усо1) СкетЩгу, Вю!ескшса1 ап4 Вюте4юа1 АррНсайопз, 1997, 1. М11!оп Наггй ап4 8. 2а11р§ку (е4§), Атепсап Скетюа1 8ос1е1у, ХУайппдЮп ΌΟ и Вюсопщдайоп Рго!еш Сонркпд Тескпк.|ие5 ког !ке ВютеШса1 8с1епсе5, 1998, М. А§1ат ап4 А. Оеп!, Сгоуе РиЬШкета, №\ν Υо^к; Скартап А., 2002, А4уапсе4 Эгид Оекуегу Веу1ею8, 2002, 54:531-545). В одном примере ПЭГ присоединяется к цистеину в шарнирной области. В другом примере модифицированный ПЭГом ЕаЬ-фрагмент содержит малеимид, ковалентно связанный с одной тиольной группой в модифицированной шарнирной области. Остаток лизина можно ковалентно связать с малеимидной группой, и к каждой аминогруппе в остатке лизина можно присоединить метоксиполиэтиленгликоль с молекулярной массой примерно 20000 Да. Следовательно, общая молекулярная масса ПЭГа, присоединенного к ЕаЬ-фрагменту, может составлять примерно 40000 Да.

В другом варианте осуществления функциональная группа представляет ПЭГ и его присоединяют с использованием методов, описанных в заявках \¥0 98/25971 и \У0 04/72116, посредством которых лизил-малеимид присоединяют к остатку цистеина в С-конце тяжелой цепи, и каждую аминогруппу лизилового остатка ковалентно связывают с остатком метоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой примерно 20000 Да. Следовательно, общая молекулярная масса ПЭГа, присоединенного к антителу, составляет примерно 40000 Да.

В еще одном варианте осуществления функциональная группа представляет ПЭГ и его присоединяют к Е(аЬ)₂-фрагменту с использованием методов, описанных в заявках \¥0 98/25971 и \У0 04/072116, посредством которых лизил-дималеимид соединяется с остатком цистеина в С-конце тяжелой цепи и каждая аминогруппа лизилового остатка ковалентно связывается с остатком метоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой примерно 20000 Да. Следовательно, общая молекулярная масса ПЭГа, присоединенного к Е(аЬ)2-фрагменту, составляет примерно 40000 Да.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело по данному изобретению представляет ЕаЬ'-фрагмент, который может быть полностью человеческим или гуманизированным, и он ПЭГилирован либо по тяжелой цепи, либо по легкой цепи, либо по обеим цепям. В других вариантах осуществления фрагмент антитела, который может быть полностью человеческим или гуманизированным, ПЭГилирован по одной или обеим тяжелым цепям, по одной или обеим легким цепям, по тяжелой и легкой цепям.

Следовательно, в некоторых вариантах осуществления анти-СО154-антитело представляет связанное с ПЭГом антитело (например, связанное с ПЭГом человеческое антитело), где ПЭГ связан с антителом по остатку цистеина или остатку лизина. В некоторых вариантах осуществления ПЭГилированное анти-СО154-антитело имеет гидродинамическую массу по меньшей мере 24 кДа. В других вариантах осуществления ПЭГ может варьировать по массе в пределах от 20 до 60 кДа (включительно). В дополнительных вариантах осуществления связанное с ПЭГом анти-СО154-антитело имеет гидродинамическую

- 38 019636 массу по меньшей мере 200 кДа. В вариантах осуществления настоящего изобретения, когда антиСО154-антитело связано с ПЭГом, то ПЭГилированное анти-СО154-антитело может иметь повышенное время полужизни в условиях ш у1уо по сравнению с антителом, в котором отсутствует ПЭГ.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к СО154-связывающему белку, содержащему последовательность легкой цепи ЗЕЦ ΙΌ N0: 15 и последовательность тяжелой цепи ЗЕЦ ΙΌ N0: 13, где белок является ПЭГилированным.

Другие функциональные группы, которые могут быть пригодными для повышения целостности и существования антител по настоящему изобретению в условиях ш у1уо, включают полипептиды. Например, анти-СП154-антитела или фрагменты антител по данному изобретению можно модифицировать для включения полипептида человеческого сывороточного альбумина (НЗА). Такой конъюгат антитела может иметь повышенную стабильность и повышенное время полужизни в сыворотке крови по сравнению с неконъюгированным антителом или антигенсвязывающим фрагментом. Например, в некоторых вариантах осуществления анти-СП154-антитело, конъюгированное с НЗА, может иметь повышенное время полужизни в условиях 1п у1уо по сравнению с неконъюгированным анти-СП154-антителом. Время полужизни (время !α- или Ιβ-полужизни) конъюгированного с НАЗ антитела может быть выше на 10, 20, 30, 40, 50% или более. Время !а-полужизни может находиться, например, в пределах от 0,25 мин до 12 ч, в то время как время ф-полужизни составляет, например, 12-48 ч. Предпочтительно время !α- или !βполужизни может равняться по меньшей мере 3 суток, по меньшей мере 7 суток, по меньшей мере 14 суток, по меньшей мере 21 сутки, по меньшей мере 28 суток, по меньшей мере 1 месяц или более.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения анти-СП154-антитела по данному изобретению представляют антитела, модифицированные функциональной группой, мечением детектируемой меткой, например радиоактивным изотопом, ферментом, красителем или биотином, или другим аффинным реагентом.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения анти-СП154-антитела по данному изобретению представляют антитела, модифицированные функциональной группой, конъюгированием с терапевтическим агентом, например радиоизотопом или радионуклидом (например, ^1Н1п или ⁹⁰Υ), с токсином (например, столбнячным токсоидом или рицином), с токсоидом или химиотерапевтическим средством (патент США № 6307026).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения анти-СП154-антитела по данному изобретению являются антителами, модифицированными конъюгацией с визуализирующим агентом. Визуализирующие агенты могут включать, например, группу для мечения (например, биотин, флуоресцентные группы, радиоактивные группы, гистидиновую метку или тус-метку либо другие пептидные метки) для упрощения выделения или детектирования.

Дополнительные примеры функциональных групп для модификации или конъюгации анти-СЭ154антител по изобретению могут включать серотоксины или цитотоксические вещества, в том числе любое вещество, которое оказывает разрушающее действие на клетки (т.е. приводит к их гибели). Примеры включают комбрестатины, доластатины, эпотилоны, стауроспорин, маитанзиноиды, спонгистатины, ризоксин, галихондрины, роридины, гемиастерлины, таксол, цитохалазин В, грамицидин Ό, этидий бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин, ИД-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи.

Функциональные группы, пригодные для конъюгации, включают, но не ограничиваются этим, антифолаты (например, аминоптерин и метотрексат), антиметаболиты (например, метотрексат, 6меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил, декарбазин), алкилирующие агенты (например, меклоретамин, тиоепа хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (Ε3Νυ) и ломустин (ΟΟΝυ), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлордиамин платины(11) (ПОР) цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (ранее называвшийся дауномицином) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее называвшийся актиномицином), блеомицин, митрамицин, антрамицин (АМС), калихеамицины или даунокармицины, СС-1065, энедиены, неокарзиностатин) и антимитотические вещества (например, винкристин и винбластин). Более подробно см. Сате!!, 2001, Абуапсеб Эгид ОеНуегу Веу1е^к, 53:171-216.

Другие функциональные группы могут включать хелатированные радионуклиды, такие как ¹³¹Ι, 1п, Υ, Ьи , висмут , калифорний , иридий , тунгстен /рений , астатин; или лекарственные средства, такие, но не ограничиваясь этим, алкилфосфохолины, ингибиторы топоизомеразы Ι, таксоиды и сурамин.

Дополнительные функциональные группы включают белки, пептиды и ферменты. Интересующие ферменты включают, не ограничиваясь этим, протеолитические ферменты, гидролазы, лиазы, изомеразы, трансферазы. Интересующие белки, полипептиды и пептиды включают, не ограничиваясь этим, иммуноглобулины, токсины, такие как абрин, рицин А, экзотоксин Ркеиботопак или дифтерийный токсин, маитанзиноиды (например, не ограничиваясь этим, ΌΜ1), белок, такой как инсулин, фактор некроза опухолей, α-интерферон, β-интерферон, ростовый фактор нервов, тромбоцитарный ростовый фактор или

- 39 019636 активатор тканевого плазминогена, тромботический агент или антиангиогенное вещество, например ангиостатин или эндостатин, ангиогенин, гелонин, долстатины, вещества, связывающиеся с минорной бороздой, бис-идофенольный иприт, или модификатор биологической ответной реакции, такой как лимфокин, интерлейкин-1 (1Ь-1), интерлейкин-2 (1Ь-2), интерлейкин-6 (1Ь-6), колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (6М-С8Р), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (6-С8Р), ростовый фактор нервов (Ν6Ε) или другой ростовый фактор.

Другие функциональные группы могут включать детектируемые соединения, пригодные, например, для диагностики. Примеры детектируемых соединений включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные соединения, люминесцентные соединения, биолюминесцентные соединения, радионуклиды, испускающие позитроны металлы (для применения в позитронно-эмиссионной томографии) и ионы нерадиоактивных парамагнитных металлов. Общую информацию по ионам металлов, которые можно конъюгировать с антителами для применения в диагностике, см. в патенте США № 4741900. Подходящие ферменты включают пероксидазу из хрена, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; подходящие простетические группы включают стрептавидин, авидин и биотин; подходящие флуоресцентные соединения включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, данзилхлорид и фикоэритрин; подходящие люминесцентные соединения включают люминол; подходящие биолюминесцентные соединения включают люциферазу, люциферин и экворин и подходящие радионуклиды включают ¹²⁵1, ¹³¹Ι, ^!111п и ⁹⁹Тс.

Нуклеиновые кислоты.

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим СЭ154-связывающие белки, например анти-СЭ154-антитела, по настоящему изобретению.

Следовательно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к молекуле выделенной, рекомбинантной и/или синтетической ДНК, которая содержит одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 16, 8Е0 ГО ΝΟ: 17, 8Е0 ГО ΝΟ: 18, 8Е0 ГО ΝΟ: 19, 8ЕО ГО ΝΟ: 20, 8ЕО ГО ΝΟ: 21, 8ЕО ГО ΝΟ: 22, 8ЕО ГО ΝΟ: 23, 8ЕО ГО ΝΟ: 24, 8ЕО ГО ΝΟ: 25, 8ЕО ГО ΝΟ: 26, 8ЕО ГО ΝΟ: 27, 8ЕО ГО ΝΟ: 28, 8ЕО ГО ΝΟ: 31, 8ЕО ГО ΝΟ: 32, 8ЕО ГО ΝΟ: 33, 8ЕО ГО ΝΟ: 34, 8ЕО ГО ΝΟ: 41, 8ЕО ГО ΝΟ: 55, 8ЕО ГО ΝΟ: 57, 8ЕО ГО ΝΟ: 59, 8ЕО ГО ΝΟ: 61, 8ЕО ГО ΝΟ: 67, 8ЕО ГО ΝΟ: 70 и 8ЕО ГО ΝΟ: 73.

В еще одном аспекте в изобретении описывается выделенная нуклеиновая кислота, которая содержит одну или более последовательностей, которая кодирует полипептид, включающий последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 и 100% идентичную последовательности вариабельного домена 8ЕО ГО ΝΟ: 1, 8ЕО ГО ΝΟ: 2, 8ЕО ГО ΝΟ: 9, 8ЕО ГО ΝΟ: 10, 8ЕО ГО ΝΟ: 11, 8ЕО ГО ΝΟ: 14, 8ЕО ГО ΝΟ: 29, 8ЕО ГО ΝΟ: 30, 8ЕО ГО ΝΟ: 54, 8ЕО ГО ΝΟ: 56, 8ЕО ГО ΝΟ: 58 или 8ЕО ГО ΝΟ: 60, или последовательности, которая гибридизуется (например, в жестких условиях) с нуклеиновой кислотой, кодирующей последовательность вариабельного домена 8ЕО ГО ΝΟ: 1, 8ЕО ГО ΝΟ: 9, 8ЕО ГО ΝΟ: 10, 8ЕО ГО ΝΟ: 11, 8ЕО ГО ΝΟ: 29, 8ЕО ГО ΝΟ: 56 или 8ЕО ГО ΝΟ: 60.

Нуклеиновые кислоты по изобретению могут дополнительно содержать регуляторные последовательности (например, промоторную последовательность, нетранслируемую 5'-область и нетранслируемую 3'-область) и/или векторные последовательности. Например, нуклеиновая кислота составляет вектор. В еще одних дополнительных вариантах осуществления изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей вектор. Клетка-хозяин может продуцировать антитело таким образом, что антитело проявляет пониженное гликозилирование или его отсутствие (например, если имеется Рс-область).

Также настоящее изобретение относится к вариантам последовательностей нуклеиновых кислот, описанных выше.

Например, настоящее изобретение включает последовательности нуклеиновых кислот, которые примерно на 75, примерно на 80, примерно на 85, примерно на 90, примерно на 91, примерно на 92, примерно на 93, примерно на 94, примерно на 95, примерно на 96, примерно на 97, примерно на 98, примерно на 99, 99,5, 99,9 или 100% идентичны любой из последовательностей, приведенных в данном документе, включая их фрагменты и комплементарные им последовательности. Также настоящее изобретение включает нуклеиновые кислоты, которые отличаются от конкретных последовательностей, приведенных в данном документе, в результате вырожденности генетического кода.

Кроме того, настоящее изобретение включает последовательности, которые специфически гибридизуются с любой из нуклеиновых кислот, приведенных в данном документе. Термин специфически гибридизуются относится к способности последовательности нуклеиновой кислоты гибридизоваться по меньшей мере с 12, 15, 20 25, 30, 35, 40, 45, 50 или 100 последовательными нуклеотидами в последовательности, приведенной в данном документе, или последовательности, комплементарной ей, таким образом, что она имеет менее чем 15%, предпочтительно менее чем 10% и более предпочтительно менее чем 5% фоновой гибридизации с контрольной нуклеиновой кислотой (например, неспецифической ДНК или ДНК иной, чем конкретная последовательность антитела, приведенная в данном документе). Для детектирования специфической гибридизации можно использовать различные условия гибридизации, и жесткость определяется, главным образом, условиями на стадии промывания при гибридизации. Как правило, высокая температура и низкая концентрация солей обеспечивают высокую жесткость, в то время как

- 40 019636 низкая температура и высокая концентрация солей обеспечивают низкую жесткость. Гибридизация в условиях низкой жесткости достигается промыванием, например, примерно при 2,0х88С при 50°С и высокая жесткость обеспечивается примерно при 0,2х88С при 50°С.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие СО154-связывающие белки по настоящему изобретению, могут содержать лидерную или сигнальную последовательности. Лидерная или сигнальная последовательность могут варьировать и могут быть замещены альтернативной лидерной последовательностью и, очевидно, понятно, что в некоторых вариантах осуществления СО154-связывающие белки по настоящему изобретению содержат последовательности без лидерной последовательности. Можно использовать любую альтернативную лидерную или сигнальную последовательность.

Клетки-хозяева.

Настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, сконструированным для экспрессии любой из молекул ДНК, приведенных на фиг. 2-8, 10, 11 и 13-16, включая варианты последовательностей.

Также обеспечиваются клетки-хозяева, экспрессирующие СО154-связывающие белки, например анти-СО154-антитела, по настоящему изобретению. Связывающий белок или антитело может содержать только одну цепь, тогда в таком случае необходимо использовать только последовательность ДНК, кодирующую полипептид данной цепи, для трансфекции клеток. Для продукции антител, содержащих две цепи, клеточную линию можно трансфектировать двумя векторами. Альтернативно, когда это является подходящим, один вектор может кодировать последовательности обеих цепей, например легкую и тяжелую цепь аити-С^154-антитела, и вариации в зависимости от конкретной структуры антитела, которое необходимо экспрессировать. Клетка-хозяин может представлять собой, например, прокариотические клетки, такие как Е. сой, или другие микробные клетки, или эукариотические клетки, включая, не ограничиваясь этим, клетки млекопитающих, такие как клетки человека, мыши, обезьяны, кролика, козы, хомяка или крысы, клетки насекомых, клетки птиц, клетки растений и клетки низших эукариотов, такие как клетки грибов (см. ниже). Очевидно, понятно, что организация клетки-хозяина ответственна за гликозилирование рекомбинантно экспрессированных белков и, таким образом, можно выбрать конкретные профили гликозилирования для дальнейшего изменения эффекторной функции антител по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения клетки-хозяева, пригодные для практики изобретения, могут представлять, например, (1) бактериальные клетки, такие как Е. сой, Саи1оЬас!ег сгезсеп!из, 8!гер!ососс1, 8!арйу1ососс1, виды 8!гер!отусез и клетки ВасШиз зиЬ!Шз, 8а1топе11а !урЫтигшт; (2) клетки грибов и клетки АзрегдШиз, дрожжевые клетки, такие как 8ассйаготусез сегеУ131ае, 8сЫхозассНаготусез ротЬе, РюЫа раз!опз, РюЫа те!йапо1юа, другие виды РюЫа, К. 1ас!1з; (3) линии клеток насекомых, такие как из 8робор!ега !гцд1регба, например клеточные линии 8!9 и 8!21, и клетки ехргез8Р™ (Рго!ет 8с1епсез Согр., Мепбап, СТ, США) - клетки ОгозорНПа 82 и клетки Тпсйорйыа п Н11д р|уе® (ЧпуЦгодеп, Саг1зЬаб, СА, США); (4) клетки млекопитающих или (5) растительные клетки.

Следовательно, СО154-связывающие белки, например анти-С^154-аититела, по данному изобретению можно продуцировать в любых доступных прокариотических или эукариотических клеткаххозяевах, которые можно изменить для экспрессии экзогенных последовательностей нуклеиновых кислот. Низшие эукариотические клетки-хозяева, которые можно использовать для продукции антиСО154-антител по настоящему изобретению, включают клетки, описанные в данной области (см., например, №0 01/00879, №0 03/056914, №0 04/074498, №0 04/074499, С1о1 е! а1., 2003, Р^8, 100:50225027; Натй!оп е! а1., 2003, №!иге, 301:1244-1246 и ВоЬго\\асх е! а1., 2004, С1усоЬю1оду, 14:757-766).

Типичные клетки млекопитающих включают клетки С081 и С087, клетки яичника китайских хомяков (СНО), клетки миеломы N80, клетки МН 3Т3, клетки 293, клетки НЕРС2, клетки НеЬа, С127, 3Т3, ВНК, клетки меланомы Вотеез, клетки Ь, МОСК, НЕК293, №138, линии мышиных клеток Е8 (например, штаммы 129/8ν, С57/ВБ6, ОВА-1, 129/8УТ), К562, клетки 1игка! и В№5147. Таким образом, изобретение относится к клеткам, которые экспрессируют антитела по настоящему изобретению, включая, не ограничиваясь этим, гибридомные клетки, В-клетки, плазматические клетки, а также клетки-хозяева млекопитающих и человека, модифицированные рекомбинантным путем для экспрессии антител по настоящему изобретению (например, эмбриональные стволовые клетки). Хорошо известны другие линии клеток млекопитающих и они легко доступны из Американской коллекции типовых культур (АТСС) (Мапаззаз, VА, США) и Национального института общих медицинских исследований (МСМС), Генетического хранилища клеток человека при хранилище клеток Сопе11 (Сатбеп, ΝΥ, США). Данные типы клеток приводятся только в качестве примера, и данный перечень не является исчерпывающим перечнем.

Среди других положений, некоторые из которых уже упоминались выше, клетку-хозяин можно выбрать с учетом ее способности желаемым образом процессировать экспрессированные анти-СО154антитела. В дополнении к модифицированному гликозилированию и агликозилированию такие посттрансляционные модификации полипептида включают, не ограничиваясь этим, ацетилирование, карбоксилирование, карбоксиметилирование, фосфорилирование, липидирование и ацилирование.

В еще одном варианте осуществления данного изобретения анти-С^154-аититела по данному изобретению получают трансляцией в бесклеточной системе или синтезом в условиях ш νίΙΐΌ. Гены, которые кодируют данные белки, можно синтезировать в условиях ш νίΙΐΌ.

- 41 019636

В еще одном варианте осуществления анти-СО154-антитела по данному изобретению получают в биореакторах, содержащих клетки, экспрессирующие антитела, для проведения крупномасштабной продукции.

В другом варианте осуществления СО154-связывающие белки или анти-СО154-антитела по данному изобретению получают с использованием генно-инженерных или трансгенных млекопитающих (например, коз, коров, овец), которые экспрессируют антитело в молоко для продукции анти-СЭ154антител в больших количествах (патент США № 5827690; Ро11оск е! а1., 1999, 1. 1ттипо1. Ме!Ь., 2З1(12):147-57).

Терапевтические способы.

В одном варианте осуществления данного изобретения СО154-связывающий белок, например антиСО154-антитело, или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать иммунный ответ у субъекта. Антитело по данному изобретению или фармацевтическую композицию по изобретению вводят субъекту в эффективном ингибирующем количестве.

В некоторых вариантах осуществления эффективное ингибирующее количество анти-СЭ154антитела или фармацевтической композиции, содержащей антитело, является любым количеством, которое эффективно для ингибирования взаимодействия ί.Ό154-ί.Ό40 у субъекта, которому их вводят. Способы определения ингибирующего количества хорошо известны специалистам в данной области, и оно зависит от факторов, включая, не ограничиваясь этим, тип субъекта, который подвергается лечению, массу и возраст субъекта, и фармакокинетические свойства конкретного терапевтического агента, который вводят.

В другом конкретном варианте осуществления данного изобретения СО154-связывающий белок, например анти-СО154-антитело, или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать иммунный ответ посредством ингибирования взаимодействия ί.Ό154-ί.Ό40.

В еще одном конкретном варианте осуществления данного изобретения СО154-связывающий белок, например анти-СО154-антитело, или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать воспаление. Для целей данного изобретения воспалительные реакции характеризуются покраснением, набуханием, жаром и болью, вследствие расширения капилляров с отеком и миграцией фагоцитирующих лейкоцитов. Некоторые примеры воспалительных реакций включают артрит, контактный дерматит, гипер-1дЕ-синдром, воспалительное заболевание кишечника, аллергическую астму и идиопатическое воспалительное заболевание. Идиопатическое воспалительное заболевание, например, включает псориаз и волчанку (например, системную красную волчанку (8ЬЕ), индуцированную лекарственным средством красную волчанку и волчанку с поражением почек); см., например, СаШп, 1989, Еипбатеп!а1 1ттипо1оду, СЬар!ег 26, Кауеп Рге§8, 2б Еб., р. 721-7ЗЗ, №\ν Уогк. Данное изобретение относится к способу лечения или профилактики симптома системной красной волчанки (8ЬЕ) у индивидуума, где способ включает введение моновалентного СО154-связывающего белка, например моновалентного анти-СО154-антитела, индивидууму в количестве, эффективном для лечения или профилактики симптома 8ЬЕ.

Некоторые примеры артрита включают ревматоидный артрит, неревматоидный воспалительный артрит, артрит, ассоциированный с болезнью Лима, и воспалительный остеоартрит. Некоторые примеры идиопатического воспалительного заболевания включают псориаз и системную волчанку.

В одном варианте осуществления данного изобретения анти-СО154-антитело или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать отторжение трансплантированного органа у субъекта.

В более конкретном варианте осуществления данного изобретения СИ154-связывающий белок, например анти-СП154-антитело, по данному изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать отторжение трансплантированного сердца, почек, кожи, островков Лангерганса поджелудочной железы или костного мозга у субъекта.

В одном варианте осуществления данного изобретения СИ154-связывающий белок, например антиСО154-антитело, или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны подавлять синдром трансплантат против хозяина у субъекта.

В одном варианте осуществления данного изобретения СИ154-связывающий белок, например антиСО154-антитело, или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать аллергические реакции у субъекта, например сенную лихорадку или аллергию на пенициллин или другие лекарственные средства.

В одном варианте осуществления данного изобретения СО154-связывающий белок, например антиСО154-антитело, по данному изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать аутоиммунную реакцию у субъекта, страдающего аутоиммунным заболеванием. В некоторых вариантах осуществления аутоиммунная реакция ассоциирована с или возникает в результате состояния, выбранного из группы, состоящей из ревматоидного артрита, тяжелой псевдопаралитической миастении, системной красной волчанки, болезни Граве, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, гемолитической анемии, сахарного диабета, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, рассеянного склероза, псориаза, индуцированных лекарственными средствами аутоиммунных

- 42 019636 заболеваний или индуцированной лекарственным средством волчанки. В некоторых вариантах осуществления аутоиммунная реакция связана с или возникает в результате системной красной волчанки.

В одном варианте осуществления данного изобретения СЭ154-связывающий белок, например антиСЭ154-антитело, по данному изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать аутоиммунную реакцию у субъекта, страдающего аутоиммунной реакцией в результате инфекционного заболевания.

В одном варианте осуществления данного изобретения СЭ154-связывающий белок, например антиСЭ154-антитело, по данному изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать аутоиммунную реакцию у субъекта, страдающего аутоиммунной реакцией в результате синдрома Рейтера, спондилоартрита, болезни Лима, ВИЧ-инфекции, сифилиса или туберкулеза.

В одном варианте осуществления данного изобретения СЭ154-связывающий белок, например антиСЭ154-антитело, по данному изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать фиброз у субъекта.

Некоторые примеры фиброза включают фиброз или фиброзное заболевание легких. Некоторые примеры фиброза легких включают фиброз легких, вторичный респираторному дистресс-синдрому у взрослых, индуцированный лекарственными средствами фиброз легких, идиопатический фиброз легких или пневмонию при гиперчувствительности. Некоторые примеры фиброзных заболеваний включают гепатит С, гепатит В, цирроз, цирроз печени, вторичный токсическому поражению, цирроз печени, вторичный токсическому действию лекарственных средств, цирроз печени, вторичный вирусной инфекции, и цирроз печени, вторичный аутоиммунному заболеванию.

В одном варианте осуществления данного изобретения СЭ154-связывающий белок, например антиСЭ154-антитело, по данному изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать желудочно-кишечное заболевание. Некоторые примеры желудочно-кишечных заболеваний включают дискинезию пищевода, воспалительное заболевание кишечника (включая болезнь Крона и язвенный колит), гастрит, коллагенозный колит (включая лимфоцитарный колит и микроскопический колит), целиакию (так называемую глютеновую энтеропатию, спру-целиакию или глютеновую недостаточность) и склеродерму.

В одном варианте осуществления данного изобретения СЭ154-связывающий белок, например антиСЭ154-антитело, по данному изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать сосудистое заболевание. Некоторые примеры сосудистого заболевания включают атеросклероз, заболевание почечных артерий, лимфедему, ишемические нарушения и нарушение при реперфузии. Также сюда входят комплексные сосудистые/иммунные заболевания, такие как системная красная волчанка или криоглобулинемия.

В одном варианте осуществления данного изобретения СЭ154-связывающий белок, например антиСЭ154-антитело, по данному изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать пролиферацию опухолевых Т-клеток у субъекта, страдающего Т-клеточным злокачественным заболеванием, например Т-клеточной лейкемией или лимфомой. Такое анти-СЭ154антитело или фармацевтическую композицию, содержащую антитело, можно вводить субъекту в количестве, эффективном для ингибирования пролиферации Т-клеточных злокачественных заболеваний у данного субъекта.

В одном варианте осуществления данного изобретения СЭ154-связывающий белок, например антиСЭ154-антитело, по данному изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны ингибировать вирусную инфекцию Т-клеток у субъекта, вызванную человеческим Тлимфотропным вирусом типа 1 (ИТБУ I). Такое анти-СЭ154-антитело или фармацевтическую композицию, содержащую антитело, можно вводить субъекту в количестве, эффективном для ингибирования вирусной инфекции.

В одном варианте осуществления данного изобретения СЭ154-связывающий белок, например антиСЭ154-антитело, по данному изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны обеспечивать визуализацию опухолевых клеток или неопластических клеток у субъекта, которые экспресссируют белок СЭ154, с которым специфически связывается антитело по данному изобретению. Способ визуализации опухолевых клеток или неопластических клеток у субъекта включает стадии введения субъекту эффективного количества анти-СО154-антитела по данному изобретению или фармацевтической композиции, содержащей его, в условиях, позволяющих образоваться комплексу между антителом и белком на поверхности опухолевых клеток или неопластических клеток; и визуализации любого образовавшегося комплекса антитело/белок с визуализацией, таким образом, любых опухолевых клеток или неопластических клеток у субъекта.

В одном варианте осуществления данного изобретения СЭ154-связывающий белок, например антиСЭ154-антитело, по данному изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны детектировать наличие опухолевых клеток или неопластических клеток у субъекта, которые экспресссируют белок СЭ154, с которым специфически связывается антитело по данному изобретению. Один такой способ детектирования наличия опухолевых клеток или неопластических клеток у субъекта включает стадии введения субъекту эффективного количества анти-СЭ154-антитела по данному изобре

- 43 019636 тению или фармацевтической композиции, содержащей его, в условиях, позволяющих образоваться комплексу между антителом и белком; удаления любого несвязанного визуализирующего агента из организма субъекта и детектирования наличия любого образовавшегося комплекса антитело/белок, где наличие такого комплекса указывает на наличие опухолевых клеток или неопластических клеток у субъекта.

Фармацевтические композиции.

Данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим СО154связывающий белок, например анти-СП154-антитело, описанное в данном изобретении.

В одном варианте осуществления данного изобретения фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере один СО154-связывающий белок, например анти-СП154-антитело, по данному изобретению.

В одном варианте осуществления данного изобретения агликозильное анти-СО154-антитело (или другое анти-СО154-антитело с пониженной эффекторной функцией) по изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны связываться с антигеном СЭ154 (например, антигеном СЭ154, который специфически связывается с агликозильным антителом Ьи5с8, продуцированным клеточной линией, депонированной в АТСС под инвентарным номером РТА-4931), и где агликозильное анти-СО154-антитело характеризуется наличием мутации N2980 (N297 с использованием ЕЙ нумерации по КаЬа!) и которое дополнительно проявляет пониженную эффекторную функцию, как неоднократно описано в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения агликозильное анти-СО154-антитело (или другое анти-С0154-антитело с пониженной эффекторной функцией) или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, не связываются с эффекторным рецептором. В более конкретном варианте осуществления агликозильное анти-СО154-антитело или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны связываться с белком СЭ154, который специфически связывается с агликозильным антителом Ьи5с8, продуцированным клеточной линией, депонированной в АТСС под инвентарным номером РТА-4931, и где агликозильное анти-СО154-антитело или фармацевтическая композиция не связываются с эффекторным рецептором.

В конкретных вариантах осуществления данного изобретения агликозильное анти-СО154-антитело (или другое анти-С0154-антитело с пониженной эффекторной функцией) или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, не вызывают тромбоз, включая тромбоэмболические осложнения. В более конкретном варианте осуществления данного изобретения агликозильное анти-СО154-антитело или фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способны связываться с белком СЭ154, который специфически связывается с агликозильным антителом Ьи5с8, продуцированным клеточной линией, депонированной в АТСС под инвентарным номером РТА-4931, и где агликозильное анти-СО154-антитело или фармацевтическая композиция не вызывают тромбоз.

В еще одном варианте осуществления данного изобретения фармацевтические композиции могут дополнительно содержать любой один или более фармацевтически приемлемых носителей, адъювантов, растворителей для доставки, буферов и/или стабилизаторов. Примерные методы формуляции и введения антител по настоящему изобретению можно найти, например, в ВеттдФп'к Р11агтассиНса1 8с1епсе5, Маск РиЫМнпд Со., Еайоп, РА, самое последнее издание.

В более конкретном варианте осуществления данного изобретения фармацевтически приемлемый носитель представляет забуференный фосфатом физиологический раствор, физиологический раствор, воду, композиции цитрат/сахароза/твин и эмульсии, например эмульсии масло/вода.

В одном варианте осуществления данного изобретения фармацевтическую композицию можно вводить в устройстве для микроинкапсулирования для того, чтобы снизить или предупредить иммунный ответ у хозяина на композицию. Также связывающие агенты, такие как антитела или фрагменты антител по данному изобретению, можно вводить микроинкапсулированными в мембране, например в липосоме, или другом носителе для инкапсулирования или защиты от иммунной системы для доставки.

В одном варианте осуществления данного изобретения фармацевтическая композиция может находиться в виде стерильного инъекционного средства, например в виде стерильной водной или масляной суспензии для инъекций. Данную суспензию можно формулировать согласно методам, известным в данной области, с использованием подходящих диспергирующих, смачивающих и суспендирующих агентов.

В одном варианте осуществления данного изобретения фармацевтическую композицию можно вводить перорально, местно или внутривенно. Для системного введения терапевтическая композиция должна быть стерильной, по существу, не содержащей пирогенов и в приемлемом для парентерального введения растворе с подходящими рН, изотоничностью и стабильностью. Например, фармацевтическое средство должно, по существу, не содержать пирогенных веществ, чтобы оно было подходящим для введения в качестве терапевтического средства человеку. Данные требования известны специалистам в данной области.

В более конкретном варианте осуществления данного изобретения для перорального введения фармацевтическую композицию формулируют в виде подходящей капсулы, таблетки, водной суспензии или

- 44 019636 раствора. Твердые лекарственные формы для перорального введения могут содержать подходящие носители или наполнители, такие как кукурузный крахмал, желатин, лактозу, аравийскую камедь, сахарозу, микрокристаллическую целлюлозу, каолин, дикальций фосфат, кальций карбонат, хлорид натрия или альгиновую кислоту. Разрыхлители, которые можно использовать, включают без ограничения, микрокристаллическую целлюлозу, кукурузный крахмал, натрий-крахмал гликолят и альгиновую кислоту. Связующие вещества для таблеток, которые можно использовать, включают аравийскую камедь, метилцеллюлозу, натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, поливинилпирролидон (Повидон™), гидроксипропилметилцеллюлзу, сахарозу, крахмал и этилцеллюлозу. Скользящие вещества, которые можно использовать, включают стеарат магния, стеариновую кислоту, жидкий кремний, тальк, воска, масла и колоидный диоксид кремния.

В более конкретном варианте осуществления данного изобретения для местных применений фармацевтические композиции можно формулировать в подходящей мази. Некоторые примеры формуляций композиции для местного применения включают капли, настойки, лосьоны, кремы, растворы и мази, содержащие активный ингредиент и различные основы и носители.

В одном варианте осуществления данного изобретения полутвердая мазь для местного применения, как правило, содержит активный ингредиент в концентрации примерно от 1 до 20%, например от 5 до 10%, в носителе, таком как фармацевтический крем в качестве основы.

В одном варианте осуществления данного изобретения также можно легко приготовить фармацевтические композиции для ингаляционного и трансдермального введения. Терапевтическую композицию можно вводить через нос или легкие, например, в виде жидкого или порошкового аэрозоля (лиофилизованного).

В одном варианте осуществления данного изобретения жидкие лекарственные формы фармацевтической композиции для перорального введения, приготовленные на воде или других водных растворителях, могут содержать различные суспендирующие агенты, такие как метилцеллюлоза, альгинаты, трагакант, пектин, кельгин, каррагинан, аравийскую камедь, поливинилпирролидон и поливиниловый спирт. Жидкие формуляции фармацевтических композиций по данному изобретению также могут включать растворы, эмульсии, сиропы и эликсиры, содержащие вместе с активным соединением(и) смачивающие вещества, подсластители и красители, вкусовые вещества. Различные жидкие и порошковые формуляции фармацевтических композиций можно приготовить с использованием обычных методов для ингаляции в легкие млекопитающего, которое подвергается лечению.

В одном варианте осуществления данного изобретения жидкие лекарственные формы фармацевтической композиции для инъекции могут содержать различные носители, такие как растительные масла, диметилацетамид, диметилформамид, этиллактат, этилкарбонат, изопропилмиристат, этанол, полиолы, т.е. глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит носитель цитрат/сахароза/твин. Для внутривенных введений водорастворимые варианты композиций можно вводить капельным вливанием, при этом фармацевтическую композицию, содержащую противогрибковое средство и физиологически приемлемый наполнитель, вводят инфузией. Физиологически приемлемые наполнители включают, например, 5% декстрозы, 0,9% физиологический раствор, раствор Рингера и другие подходящие наполнители. Можно приготовить подходящую нерастворимую форму композиции и вводить в виде суспензии на водной основе или фармацевтически приемлемой масляной основе, такой как эфир длинноцепочечной жирной кислоты, например этилолеат.

В одном варианте осуществления данного изобретения фармацевтическая композиция содержит примерно от 0,1 до 90 мас.% (например, от 1 до 20% или от 1 до 10%) анти-СП154-антитела по данному изобретению в фармацевтически приемлемом носителе.

В одном варианте осуществления данного изобретения оптимальный процент анти-СП154-антитела по данному изобретению в каждой фармацевтической композиции варьирует в зависимости от самой формуляции и желаемого терапевтического эффекта при конкретных патологиях и скорректированных терапевтических схем. Фармацевтическая формуляция является хорошо известной в данной области. Можно использовать обычные способы, известные специалистам в области медицины, для введения фармацевтической композиции субъекту.

Следовательно, фармацевтические композиции по настоящему изобретению относятся к композициям с длительным высвобождением. Длительное высвобождение, или контролируемое высвобождение, или замедленное высвобождение относится к лекарственным композициям, которые высвобождают активное лекарственное средство, такое как полипептид или антитело, в течение периода времени после введения субъекту. Длительное высвобождение полипептидных лекарственных средств, которое может иметь место в течение желаемых периодов времени (например, исчисляемых минутами, часами, сутками, неделями или более, в зависимости от формуляции лекарственного средства), отличается от стандартных формуляций, в которых, по существу, вся лекарственная форма доступна для немедленного всасывания или немедленного распределения кровотоком. Композиции для длительного высвобождения в некоторых вариантах осуществления обеспечивают уровень циркулирующего лекарственного средства в результате одного введения, который поддерживается, например, в течение 8 ч или более, 12 ч или более, 24 ч или более, 36 ч или более, 48 ч или более, 60 ч или более, 72 ч или более, 84 ч или более, 96 ч или более или

- 45 019636 даже в течение 1 или 2 недель или более, например в течение 1 месяца или более. Композиции для длительного высвобождения могут содержать моновалентное анти-СБ154-антитело по настоящему изобретению. В дополнительных вариантах осуществления моновалентное антитело является гуманизированным или полностью человеческим антителом. В дополнительных вариантах осуществления анти-СБ154антитело является антителом с пониженной эффекторной функцией, описанной в данном документе.

В некоторых вариантах данного изобретения фармацевтическая композиция дополнительно содержит иммуносупрессивное или иммуномодулирующее соединение. Например, такое иммуносупрессивное или иммуномодулирующее соединение может представлять одно из следующего: агент, который прерывает костимулирующий сигнальный путь Т-клеток через СБ28; агент, который прерывает сигнальный путь с участием кальцинейрина, кортикостероид, антипролиферативное средство и антитело, которое специфически связывается с белком, экспрессированным на поверхности иммунных клеток, включая, не ограничиваясь этим, СБ45, СБ2, Ш2К, СБ4, СБ8 и 1К\\К ЕсК, В7, СТБЛ4, Т№, ΕΓβ и УЪЛ-4.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения иммуносупрессивное или иммуномодулирующее соединение представляет такролимус, сиролимус, микофенолят мофетил или активную форму микофенольной кислоты, мизорубин, дезоксиспергуалин, бреквинар натрий, лефлуномид, рапамицин или азаспиран.

В других вариантах осуществления данного изобретения антитела по данному изобретению или фармацевтические композиции, содержащие их, можно включить в контейнер, упаковку или диспенсер самостоятельно или в виде части набора с этикетками и инструкциями по применению.

Введение и пути доставки.

Анти-СБ154-антитела по данному изобретению и фармацевтические композиции по данному изобретению можно вводить субъекту любым путем, который является приемлемым с медицинской точки зрения. Для целей данного изобретения введение означает любой из обычных способов введения антитела, фрагмента антитела или фармацевтической композиции, известный специалистам в данной области, и он не ограничивается приведенными в данном документе примерами.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения анти-СБ154-антитела по данному изобретению и фармацевтические композиции по данному изобретению можно вводить субъекту инъекцией внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно, внутримышечно, интрамедуллярно, интравентрикулярно, интраэпидурально, внутриартериально, внутрисосудисто, внутриартикулярно, интрасиновиально, интрастернально, интратекально, внутри печени, интраспинально, в опухоль, интракранеально; энтерально, внутрипульмонально, через слизистую, внутрь матки или сублингвально, или местно, например в места воспаления или роста опухоли.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения анти-СБ154-антитела по данному изобретению и фармацевтические композиции по данному изобретению можно вводить субъекту перорально или интраназально либо ингаляцией, внутрь глаза, ректально или местно.

В более конкретных вариантах осуществления данного изобретения анти-СБ154-антитела по данному изобретению и фармацевтические композиции по данному изобретению можно вводить субъекту перорально в виде капсул, таблеток, водных суспензий или растворов.

В некоторых более конкретных вариантах осуществления данного изобретения анти-СБ154антитела по данному изобретению и фармацевтические композиции по данному изобретению можно вводить субъекту местно при аппликации крема, мази или т.п.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения анти-СБ154-антитела по данному изобретению и фармацевтические композиции по данному изобретению также можно вводить ингаляционно с использованием распылителя, ингалятора для сухих порошков или дозирующего ингалятора.

В дополнительных вариантах осуществления данного изобретения анти-СБ154-антитела по данному изобретению и фармацевтические композиции по данному изобретению можно вводить субъекту введением с длительным высвобождением с помощью инъекций-депо рассасывающихся имплантатов, введенных субъекту непосредственно во время хирургической операции или имплантацией инфузионного насоса либо биологически совместимого имплантата для длительного высвобождения.

В более конкретном варианте осуществления анти-СБ154-антитела по данному изобретению и фармацевтические композиции по данному изобретению можно вводить субъекту введением депонирующих инъекций, например, с использованием инъекций-депо или биодеградируемых соединений и методов на 1, 3 или 6 месяцев.

В более конкретном варианте осуществления анти-СБ154-антитела по данному изобретению и фармацевтические композиции по данному изобретению можно вводить субъекту аппликацией на кожу субъекта трансдермального пластыря, содержащего антитело, производное антитела или фармацевтическую композицию, и обеспечением нахождения пластыря в контакте с кожей субъекта, как правило, в течение 1-5 ч на пластырь.

В еще одних вариантах осуществления данного изобретения анти-СБ154-антитела по данному изобретению и фармацевтические композиции по данному изобретению можно вводить субъекту в любой дозе в пересчете на массу тела и с любой кратностью введения, которые являются приемлемыми с медицинской точки зрения. Приемлемые дозы находятся в пределах от 0,01 до 200 мг/кг массы тела субъекта.

- 46 019636

В любом из способов применения антител или фармацевтических композиций по данному изобретению антитела или фармацевтические композиции можно вводить субъекту в однократной или многократной дозах каждый день, каждые 2, 3, 4, 5 или 6 дней, каждую неделю, каждый месяц или любую их промежуточную часть или многократно, и дополнительно можно вводить субъекту повторно с интервалом в пределах от введения каждый день до введения каждый месяц, что определяет специалист в данной области.

В любом из способов применения антител или фармацевтических композиций по данному изобретению связывающие белки, антитела или фармацевтические композиции, содержащие их, можно вводить субъекту, нуждающемуся в этом, с интервалом в течение периода времени, показанного с медицинской точки зрения, в пределах от дней или недель до показания вводить средство субъекту в течение всей жизни. В дополнительных вариантах осуществления данного изобретения анти-СО154-антитела по данному изобретению и фармацевтические композиции по данному изобретению можно вводить субъекту многократно с интервалом от одного дня до каждого месяца.

В одном варианте осуществления данного изобретения анти-СО154-антитела по данному изобретению и фармацевтические композиции по данному изобретению можно вводить многократно в день, если желательно, для обеспечения общей желаемой суточной дозы. Эффективность способа лечения можно оценить мониторингом состояния субъекта в отношении проявления известных признаков или симптомов нарушения.

Для всех вариантов осуществления данного изобретения дозировка и кратность введения антиСЭ154-антител по данному изобретению и фармацевтических композиций по данному изобретению, эффективные для получения желаемых эффектов, будут зависеть от различных факторов, таких как природа заболевания, которое подвергается лечению, масса и возраст субъекта, цель лечения, конкретная используемая фармацевтическая композиция и фармакокинетика активного вещества, а также мнение лечащего врача.

Следовательно, анти-СО154-антитела по данному изобретению и фармацевтические композиции по данному изобретению вводят в количестве, эффективном для достижения предназначенной для них цели. Терапевтически эффективное количество относится к количеству антитела, эффективному для профилактики, ослабления или подавления симптомов заболевания или пролонгации продолжительности жизни субъекта, который подвергается лечению. Терапевтически эффективное количество можно обеспечить изменением дозы и схемы введения антител по изобретению субъекту.

Анти-СО154-антитела по данному изобретению и фармацевтические композиции по данному изобретению можно вводить в виде однократной дозы для некоторых показаний, таких как предупреждение иммунного ответа на антиген, воздействию которого субъект подвергается в течение короткого периода времени, такой как экзогенный антиген, вводимый по однократной схеме лечения. Примеры такой терапии будут включать совместное введение фрагмента антитела по изобретению с терапевтическим средством, например антигенным фармацевтическим средством, аллергеном или продуктом, полученным из крови, или вектором для генной терапии. При тех показаниях, когда воздействие антигена является длительным, например при контролировании иммунной реакции на трансплантированную ткань или на длительно вводимые антигенные фармацевтические средства, фрагменты антитела или фармацевтические композиции по изобретению вводят с интервалами в течение периода времени, показанного по медицинским соображениям, в пределах от суток или недель до показания вводить средство в течение всей жизни субъекта.

В любом из способов, описанных в данном документе, антитела или фармацевтические композиции можно вводить субъекту со вторым средством. В некоторых вариантах осуществления средство является терапевтическим средством, например, таким как иммуномодулирующее или иммуносупрессивное средство. Иммуномодулирующее или иммуносупрессивное средство может представлять одно из следующего:

(a) агент, который прерывает костимулирующий сигнальный путь Т-клеток через СЭ28;

(b) агент, который прерывает сигнальный путь с участием кальцинейрина;

(c) кортикостероид;

(б) антипролиферативное средство и (е) антитело, которое специфически связывается с белком, экспрессированным на поверхности иммунных клеток, включая, не ограничиваясь этим, СЭ45, СЭ2, ΙΕ2Κ, СЭ4, СЭ8 и ЯАИК ЕсЯ, В7, СТЬА4, 'ТЫЕ, ЬТЗ и νΓΛ-4. Иммуносупрессивное или иммуномодулирующее соединение может представлять, например, такролимус, сиролимус, микофенолят мофетил, мизорубин, дезоксиспергуалин, бреквинар натрий, лефлуномид, рапамицин или азаспиран. Антитело и второе средство можно вводить одновременно или последовательно.

В некоторых случаях может быть преимущественным вводить одну или более нуклеиновых кислот по изобретению субъекту, нуждающемуся в этом. Терапевтические и диагностические способы по изобретению, включающие стадию введения по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты по изобретению согласно хорошо известным способам, входят в объем настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления данного изобретения субъект(ы), которого можно лечить с при

- 47 019636 менением описанных выше способов, представляет животное. Предпочтительно животное является млекопитающим. Примеры млекопитающих, которых можно лечить, включают, не ограничиваясь этим, людей, приматов, отличных от человека, грызунов (включая крыс, мышей, хомяков и морских свинок), коров, лошадей, овец, коз, свиней, собак и кошек. Предпочтительно млекопитающее является человеком.

Данное изобретение можно лучше понять на основе примеров, которые следуют далее. Однако специалисты в данной области, очевидно, понимают, что описанные конкретные способы и результаты только иллюстрируют изобретение, описанное в данном документе.

Примеры

Последующие примеры иллюстрируют способы и продукт по настоящему изобретению. Подходящие модификации и адаптации описанных условий и параметров, обычно принятых в области молекулярной биологии, которые известны специалистам в данной области, не отступают от сути и объема настоящего изобретения.

Пример 1. Получение антител против человеческого СО154 методом 8ЬАМ.

Метод отбора антител лимфоцитов (8ЬАМ) (ВаЬсоок е! а1., 1996, Ргос. №Н. Асай. 8ск, 93:79437848; №0 92/02551; йе №11й1 е! а1., 1997, 1. Iттиηο1. МеШойв, 207:61-67 и Ьадегкх1в! е! а1., 1995, ВюТескшдиев, 18:862-869) использовали для идентификации и выделения антител против человеческого СЭ154. С помощью 8ЬАМ возможно получать высокоаффинные антитела, продуцированные во время иммунного ответа в условиях ш х1хо из любого вида. Затем выделенные отдельные клетки, продуцирующие антитела, подвергают клональной экспансии с последующим скринингом на клоны, которые продуцируют анти-СЭ154-антитела с последующей идентификацией последовательности генов их вариабельной области тяжелой (У_н) и легкой (У_ъ) цепей. Конкретный метод скрининга подробно описан в заявке №0 04/051268. Таким образом, выделяют В-клетки, позитивные на антитела к человеческому СО154.

Было идентифицировано и выделено несколько крысиных антител против человеческого СЭ154 с использованием технологии 8ЬАМ (фиг. 12). Одно из данных антител СА081 00342 (антитело 342) гуманизировали, как описано в последующем примере. Его ДНК и выведенные аминокислотные последовательности приведены на фиг. 2. Клонировали ген, кодирующий данное антитело.

Пример 2. Гуманизация антитела СА081 00342 - создание антитела 342.С2.

Полученное с помощью 8ЬАМ антитело 342 гуманизировали переносом СОВ на человеческие каркасные области зародышевой линии. Выравнивание последовательности крысиного антитела (донорного антитела) с человеческими каркасными областями зародышевой линии (акцепторные) приведено на фиг. 9 вместе с полученной гуманизированной последовательностью. Выбранная акцепторная последовательность легкой цепи зародышевой линии представляла человеческую УК1 2-1-(1) О12 У-область плюс 1К1 1-область (У ВА8Е, МВС Сеп!ге £ог Рго!еш Епдтеегшд; Великобритания; 8Е0 ΙΌ Ν0: 35 и 36) (фиг. 3). Выбранная акцепторная последовательность тяжелой цепи зародышевой линии представляла человеческую У_н 3 1-1 3-66 У-область плюс 1Н4 1-область (У ВА8Е, МВС Сепйе £ог Рго!ет Епдтеегшд; Великобритания; 8Е0 ΙΌ Ν0: 37 и 38) (фиг. 3). В дополнении была выбрана другая акцепторная каркасная У_нобласть, последовательность человеческой У_н4 1-1 4-59 (8Е0 ΙΌ Ν0: 39 и 40) (фиг. 3). СЭВ, пересаженные из донорной в акцепторную последовательность, определены по системе нумерации КаЬа! (КаЬа! е! а1., 8ес.|иепсев о£ Рго!ешв о£ !ттипо1од1са1 Е-ЦегевЕ Ве!кевйа МО, №1юпа1 [пв111и1ев о£ неа1!к, И8) за исключением СЭВ-Ш, когда использовали комбинированное определение по системе СИогЫа/КаЬа! (см. заявку №0 91/09967). В отношении трансплантатов, где переносили только СЭВ из донорного антитела на акцепторные каркасные области, то конструировали варианты, в которые также включали ключевые остатки донорной каркасной области. Данные остатки идентифицировали с использованием метода, описанного в заявке №0 91/09967. Например, трансплантат легкой цепи УК1дЬ4 содержит донорные остатки в положениях 38, 71 и 85; трансплантат тяжелой цепи Ун3дн1 содержит остатки донорной каркасной области в положениях 24, 48, 49, 73 и 78; трансплантат тяжелой цепи Ун4дн1 содержит донорные каркасные области в положениях 48, 71 и 78. Последовательности всех данных трансплантатов приведены на фиг. 9.

Разработали и сконструировали гены, кодирующие последовательности данных У-областей, с использованием стандартных методов молекулярной биологии по контракту с компаниями, занимающимися синтезом генов (Еп!е1ескоп СтВн; ΌΝΛ 2.0; В1ие негоп). Модификации для получения трансплантированных вариантов проводили с использованием обычного олигонуклеотид-направленного мутагенеза с ПЦР. Последовательности сигнальных пептидов из исходных крысиных антител включали в исходные генные конструкции для обеспечения экспрессии с использованием экспрессирующих векторов на основе клеток млекопитающих.

Гены пересаженной легкой цепи субклонировали в экспрессирующий вектор легкой цепи, который содержит ДНК, кодирующую константную область человеческой каппа-цепи (аллотип Кт3). Гены пересаженной тяжелой цепи субклонировали в экспрессирующий вектор человеческой гамма-4 цепи, который содержал ДНК, кодирующую константную область человеческой гамма-4 цепи, содержащую стабилизирующую мутацию 8241Р в шарнирной области (Апда1 е! а1., Мо1. Iттиηο1., 1993, 30(1):105-8). Можно использовать любой подходящий экспрессирующий вектор. Гены исходного крысиного антитела также субклонировали в данные векторы с получением плазмид, экспрессирующих химерное антитело

- 48 019636 крысиная У-область/человеческая С-область для сравнения в тестах.

Совместная трансфекция плазмид с геном легкой цепи и геном тяжелой цепи в клетки СНО обеспечивает экспрессию 1дС и анализ человеческого СО154-связывающего белка с помощью В1асоге™.

Для анализа экспрессии в Е. сой и активности в качестве моновалентного РаЬ'-фрагмента гены ключевых конструкций субклонировали в экспрессирующий вектор рТТ0Э (РаЬ) (А0 03/48208, А0 03/031475). Субклонирование проводили двухстадийным способом: на первой стадии фрагмент гена УК клонировали во фрагмент ЕсоВУ-Вз1А1; затем фрагмент гена У_Н клонировали во фрагмент Руи11-Хко1. С помощью данного процесса происходит слияние ДНК, кодирующей сигнальный пептид из белка 0трА, с генами, кодирующими легкую и тяжелую цепи, что придает способность к секреции транслированного белка в периплазму бактерий. Полученные экспрессирующие плазмиды трансформировали в штамм К12 Е. сой и использовали в опытах по индукции во встряхиваемых колбах небольшого объема и для ферментации с высоким клеточным титром.

Таблица 1

Аффинность конструкций РаЬ 342 с использованием анализа В1асоге™ (выделенный РаЬ из среды ферментации объемом 1 л) Трансплантат ка (1 Мс) кЦ (1/с) КО (М) КЭ (пкМ) дЪ4дН1 1,53Е+07 6,97Е-05 4,55Е-12 4,55

Выбор оптимального трансплантата проводили с учетом активности в тесте и уровня экспрессии РаЬ при ферментации в Е. со11. Пример определения аффинности с использованием анализа В1асоге™ приведен в табл. 1. На данной основе был выбран трансплантат дЬ4§Н1.

Получали плазмиду, кодирующую вариант РаЬ' трансплантата дЬ4дН1. ДНК-последовательность инсерта для вставки данного трансплантата приведена на фиг. 8 (8ЕО ΙΌ N0: 41). Также на чертеже представлена последовательность инсерта (8ЕО ΙΌ N0: 28) для экспрессии РаЬ-фрагмента, который можно использовать для получения Р(аЬ)₂-фрагмента.

Пример 3. Получение агликозилированных антител ки5с8 и ки342 сайт-направленным мутагенезом.

Агликозилированные антитела ки5с8 и ки342, использованные в последующих опытах, получали, следуя стандартным методам рекомбинантной ДНК. Агликозилированное антитело ки5с8, по существу, получали, как описано в заявке на патент США 2006/0193856, за исключением замены Рс-домена ки[дС4 на Рс-домен [дСЕ использованной ранее, для дополнительного снижения эффекторной функции. Последовательность легкой каппа-цепи агликозилированного антитела ки5с8 приведена на фиг. 13 (8Е0 ΙΌ N0: 62, 8Е0 ΙΌ N0: 63 и 8Е0 ΙΌ N0: 64). Тяжелая цепь агликозилированного антитела ки5с8 содержит две мутации, сделанные сайт-направленным мутагенезом в СН2-домене (Т299А, ЕЙ нумерация КаЬа!) и шарнирном домене (8228Р ЕЙ нумерация КаЬа!) (фиг. 14; 8Е0 ΙΌ N0: 65, 8Е0 ΙΌ N0: 66 и 8Е0 ΙΌ N0: 67). В результате мутации Т299А происходит модификация сайта ^гликозилирования в СН2-домене таким образом, что субстрат для ферментов ^гликозилирования отсутствует, что делает молекулу агликозилированной.

Агликозилированное антитело ки342 получали из вектора РаЬ-фрагмента 342. Данную последовательность модифицировали добавлением человеческих сигнальных последовательностей и подходящих последовательностей человеческих константных областей. Также агликозилированное антитело ки342 содержит Рс-домен ки[дС4. Последовательность легкой каппа-цепи агликозилированного антитела ки342 приведена на фиг. 15 (8Е0 ΙΌ N0: 68; 8Е0 ΙΌ N0: 69 и 8Е0 ΙΌ N0: 70). Тяжелая цепь агликозилированного антитела ки342 содержит две мутации, сделанные сайт-направленным мутагенезом в СН2-домене (Т299А, ЕЙ нумерация КаЬа!) и шарнирном домене (8228Р ЕЙ нумерация КаЬа!) (фиг. 16; 8Е0 ΙΌ N0: 71, 8Е0 ΙΌ N0: 72 и 8Е0 ΙΌ N0: 73). В результате мутации Т299А происходит модификация сайта N гликозилирования в СН2-домене таким образом, что субстрат для ферментов ^гликозилирования отсутствует, что делает молекулу агликозилированной. Агликозилированное антитело ки5с8 и ки342 стабильно экспрессировали в клетках СНО.

Пример 4. Связывание с СЭ154: определение аффинности связывания.

С помощью технологии В1асоге™ можно проводить мониторинг связывания между биологическими молекулами в режиме реального времени и без необходимости в мечении. Одно из взаимодействующих соединений, называемое лигандом, иммобилизуют непосредственно или оно захватывается иммобилизованной поверхностью, в то время как другое, называемое аналитом, продвигается в растворе вдоль захваченной поверхности. Сенсор детектирует изменение в массе на поверхности сенсора, поскольку аналит связывается с лигандом с образованием комплекса на поверхности. Это соответствует процессу ассоциации. Процесс диссоциации прослеживается, когда аналит вытесняется буфером. В тесте определения аффинности В1асоге™ лиганд является анти-СО154-антителом, таким как антитело 342, и аналит представляет внутриклеточный домен человеческого СЭ154.

Детали постановки метода являются следующими.

Прибор: В1асоге® 3000, В1асоге АВ, Иррза1а, Швеция.

Сенсорный чип: СМ5 (для анализов) номер по каталогу: ВВ-1001-14, В1асоге АВ, Иррза1а, Швеция. Чипы хранили при 4°С.

В^-нормализующий раствор: 70% (мас./мас.) глицерин. Входит в набор для В^тайеиаисе, номер

- 49 019636 по каталогу: ВК-1002-51, В1асоге АВ, Иррка1а, Швеция. Набор для ВШпайепапсе хранили при 4°С.

Набор для сочетания амина: номер по каталогу ВК-1000-50, В1асоге АВ, Иррка1а, Швеция. Этил-3(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид (ЕЭС). Доводили до концентрации 75 мг/мл дистиллированной водой и хранили порциями по 200 мкл при -70°С.

N-Гидроксисукцинимид (N48). Доводили до концентрации 11,5 мг/мл дистиллированной водой и хранили порциями по 200 мкл при -70°С.

Этаноламин гидрохлорид-Ла0Н рН 8,5. Хранили порциями по 200 мкл при -70°С.

Буферы: подвижным буфером для анализа является НВ8-ЕР (представляет 0,01 М НЕРЕ8, рН 7,4, 0,15 М ИаС1, 3 мМ ЭДТА, 0,005% поверхностно-активного вещества Р20). Номер по каталогу: ВК-100188, В1асоге АВ, Иррка1а, Швеция. Буферы хранили при 4°С. Буфер для иммобилизации представляет собой ацетатный буфер, рН 5,0 (10 мМ ацетата натрия, рН 5,0). Номер по каталогу: ВК-1003-51, В1асоге АВ, Иррка1а, Швеция. Буфер хранили при 4°С.

Лиганд для захвата: Е(аЬ')₂-фрагмент козьего античеловеческого Ι§Ο АГПп1рнге, специфический ЕаЬ'-фрагмент (номер по каталогу: 109-006-097) или специфический Ес-фрагмент (номер по каталогу: 109-006-098), .Тасккоп IттиηοΒекеасй Ею (Реппкукаша, США). Реагенты хранили при 4°С.

Лиганд: анти-СП154-антитела.

Аналит: рекомбинантный внеклеточный домен человеческого СЭ154. Вещество готовили в концентрации 2 мг/мл (40 мкМ) в забуференном фосфатом физиологическом растворе, хранили при 4°С и разводили подвижным буфером для анализа НВ8-ЕР. Обычно СЭ154 растворяли в концентрации в пределах от »1 нМ до ~ 100 пкМ двойными разведениями для постановки анализа аффинности.

Раствор для регенерации: 40 мМ НС1 готовили разведением дистиллированной водой из 11,6 М маточного раствора (ВОН, Роо1е, Англия. Номер по каталогу: 101254Н). 5 мМ раствор №104 готовили разведением дистиллированной водой из 50 мМ маточного раствора. Номер по каталогу: ВК-1003-58, В1асоге АВ, Иррка1а, Швеция.

Метод анализа: В№ (В1ато1еси1ат Шетасйоп Апа1ук1к) проводили с использованием В1асоге® 3000 (В1асоге АВ). Е(аЬ')₂-фрагмент козьего античеловеческого Ι§Ο АТйшриге, специфический Ес- или ЕаЬ'фрагмент Оасккоп, IттиηοΒекеасй) иммобилизовали на сенсорных чипах СМ5 посредством реакции сочетания аминов до уровня захвата »6000 единиц отклика (КО). Буфер НВ8-ЕР (10 мМ НЕРЕ8, рН 7,4, 0,15 М ИаС1, 3 мМ ЭДТА, 0,005% поверхностно-активного вещества Р20, В1асоге АВ) использовали в качестве подвижного буфера для анализа со скоростью потока 10 мкл/мин. Анти-СО154-антитела или ЕаЬ-фрагменты использовали в таких концентрациях, что при захвате иммобилизованным на поверхности античеловеческим Ι§0-Ρο (или античеловеческим Ι§Ο ЕаЬ') воспроизводился сигнал, равный »200 Ки. Человеческий СЭ154 титровали против захваченного антитела в различных концентрациях. Вводили 90 мкл СЭ154 на поверхность (фаза ассоциации) с последующей фазой диссоциации 240 с, все при скорости потока, равной 30 мкл/мин. Поверхность регенерировали двукратным введением 40 мМ НС1 объемом 10 мкл с последующим введением 5 мкл 5 мМ №104 со скоростью потока, равной 10 мкл/мин. Получали кривые связывания после вычитания фонового связывания с использованием программного обеспечения В^еуаШайоп (версия 3.2), следуя стандартным методикам. Определяли кинетические параметры с использованием алгоритма подбора.

Данный метод можно использовать для оценки аффинности для белка СЭ154 или его фрагмента у антитела, производного антитела или фрагмента антитела по данному изобретению. Значения Кз, полученные с использованием анализа В1асоге™ для анти-СО154-антител, выделенных при постановке 8ЬАМ, приведены на фиг. 12 и 18.

Пример 5. Ингибирование связывания с СЭ154.

Анализ на основе проточной цитометрии использовали для оценки связывания меченого СЭ40 с экспрессирующими СЭ154 клетками Ό1.1. Клетки 1игка! Ό1.1 (Американская коллекция типовых культур) поддерживали в среде ΚΓΜΙ 1640 (С1Ьсо, 31870-025)), содержащей 10% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки (ЕС8), 2 мМ глутамина Опуйгодеп, 23030024), 1 мМ пирувата натрия Дпуйтодеп, 11360-039), 1% (об./об.) И-(+)-глюкозы (81дта, С8769) & 10 мМ НЕРЕ8 (81дта, Н0887). Во время анализа клетки Ό1.1 с титром 100000 инкубировали в 100 мкл среды ΚΓΜΙ 1640 + 10% ЕС8 в присутствии или отсутствие серии разведений анти-СП154-антитела в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 5 мкл разведения 1:75 11СО40-тЕс-РЕ (А1ех1к Согр., АNС-504-050) и инкубировали еще в течение 30 мин при комнатной температуре. После двукратного промывания забуференным фосфатом физиологическим раствором (РВ8), содержащим 1% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина (фракция V В8А, 8его1од1са1 Рго1етк Ιηα, 81-068-5) и 0,02% (мас./об.) азида натрия (ВИН, 103692К), клетки ресуспендировали в 200 мкл смеси РВ8/1% В8А/0,02% азид натрия и проводили проточную цитометрию Вес!оп Эюк1пкоп ЕАС8сап. Во всех случаях рассчитывали значения средней геометрической флуоресценции (ЕЬ2). Определяли ингибирование связывания 11СО40-шЕс-РЕ по отношению к сигналу в отсутствие антитела (0% ингибирования) и к сигналу в отсутствие 11СО40-шЕс-РЕ (100% ингибирование) с использованием формулы

- 50 019636

0% ингибирование-% в опыт I X 100

0% ингибирование -100% ингибирование

Значения Ιϋ₅₀ определяли по данным, полученным с использованием ХЬйк в качестве части программы АскМку Вазе.

Значения Ιί.'₅₀ для анти-СО154-антител, выделенных с использованием 8ЬАМ, приведены на фиг. 12 и 18.

Пример 6. Конкурентный анализ связывания.

Анализ на основе проточной цитометрии использовали для оценки анти-СО154-антитела с экспрессирующими СЭ154 клетками Ό1.1. Клетки .Тигкак Ό1.1 (Американская коллекция типовых культур) поддерживали в среде ВРМI 1640 (С1Ьсо, З1870-025), содержащей 10% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки (РС8), 2 мМ глутамина (Вю\У11Шакег, 17-605Е и 1 смеси пенициллин-стрептомицин (Меб1акесй, З0002107). Во время анализа клетки Ό1.1 с титром 100000 инкубировали в 10 мл Р8А, 0,01% В8А, 0,02% азида натрия (буфер для РАС8) в присутствии или отсутствие серии разведений анти-СО154-антитела и биотинилированного анти-СО154-РаЬ (клон З42) в течение 2 ч при 4°С. Клетки промывали три раза буфером для РАС8 с центрифугированием при 290/д в течение З мин между промываниями. Добавляли разведение 1:500 конъюгата стрептавидин-В-фикоэритрин (Пасккои Иптипогекеагск 016-110-084) в 150 мкл буфера для РАС8 и клетки инкубировали в течение 1 ч при 4°С. Клетки промывали один раз и фиксировали в РВ8 с З% формальдегида при комнатной температуре в течение 10 мин. Клетки ресуспендировали в буфере для РАС8 и анализировали на проточном цитометре РаскСайЬит (ВО). Во всех случаях определяли средние геометрические значения флуоресценции (РЬ2). Строили график зависимости связывания биотинилированного З42 РаЬ против концентрации конкурентного антитела с получением сигмоидальных кривых ингибирования, для чего строили четырехпараметровую кривую с использованием программы СгарНРаб Рпкт. Значения ΙΟ₅₀, полученные в данном тесте, приведены на фиг. 18.

Пример 7. Тест активации Ι0ΛΜ-1.

Способность анти-СЭ154-антител ингибировать взаимодействия С040Б:С040 на поверхности клеток определяли в сокультуре в тесте в условиях ίη νίΙΐΌ. Лигирование (т.е. связывание) СЭ40 с СЭ154 (СЭ40Ь) активирует В-лимфоциты, приводя к активации СЭ154 (ТСАМ-1) на поверхности клеток, и данный контакт, зависимый от СЭ40Ь:СС40-активации В-клеток, можно блокировать анти-СЭ154антителами. Вкратце, клетки Т-лимфомы 1игкак Ό1.1 (СВЬ-10915, Американская коллекция типовых культур (АТСС), Маиаккак, УА, США), экспрессирующие СЭ154, и В-клетки лимфомы Ваток 2С6.4С10 (СВБ-192З, АТСС), экспрессирующие СЭ40, культивировали совместно в термостате при З7°С в атмосфере 5% СО₂ в течение ночи в соотношении 1:4 с титрами анти-СО154-РаЬ или контрольного интактного АЬ (1ш5с8). Тест проводили в 96-луночных круглодонных планшетах с титром 1/10⁶ клеток/мл в полной среде ВРМI (ВРМI с 10% РВ8, 1% Ь-глутамина, 1% пирувата натрия и 10 мМ НЕРЕ8 рН 6,8, С1Ьсо ВВЬ, ВосктШе, МО, США). На следующие сутки клетки окрашивали в течение 1 ч при 4°С СЭ20 ПТС (#555622) и СЭ54 АРС (#559771) производства ВО Рйатттдеи (8аи Э1едо, СА, США) в концентрации соответственно 1:100 и 1:200 в РВ8, содержащем 1% В8А и 0,1% азида натрия. Клетки промывали и фиксировали в 1% параформальдегиде и анализировали на проточном цитометре РАС8саи СаНЬит (ВО Вюкшеисек). Определяли среднее геометрическое значение флуоресценции клеток Ваток (двойные позитивные клетки) против концентрации анти-СО154-антител (СЭ40Ь) по четырехпараметровой кривой, которую строили с использованием программного обеспечения ЭеНаСгарй (Веб Воск 8оП\уаге, 8а1к Ьаке СВу, США) (фиг. 12 и 18). Значения Ιί.'₅₀ использовали для определения относительной активности антиСО154-антител.

Пример 8. Активность на модели иммунного ответа у макак циномолгус.

Модель, использованная для демонстрации активности в условиях 1и νί\Ό, описана СоЬЬити ек а1., 1998, ί. Р1агтасо1. Ехр. Тйетареийск, 286:925. Макакам циномолгус внутривенно вводили однократные дозы физиологического раствора, антитела 1ш5с8 или дозу З42 РаЬ'-ПЭГ за 4 ч до заражения однократной дозой столбнячного токсоида (ТТ) внутримышечно объемом 0,5 мл. Каждая опытная группа состояла из З самцов и З самок. На З0 сутки вводили вторую дозу ингибитора и животных повторно заражали ТТ (вторая реакция). В определенные периоды времени отбирали пробы крови вплоть до 50 суток для определения титров Ι§Ο и ^М против ТТ (фиг. 19 и 21). Данные показывают, что З42 РаЬ'-ПЭГ ингибирует Ι§Ο и ^М иммунный ответ на ТТ в зависимости от дозы.

Также определяли титры Ι§Ο против ТТ у макак циномолгус после обработки однократной дозой различных форм анти-СО154-антител (20 мг/кг - антитело 1ш5с8, агликозильное антитело 5с8 и агликозильное антитело З42 и 40 мг/кг - РаЬ'-ПЭГ и З42 ЭРМ-ПЭГ) (фиг. 20). Подавление иммунного ответа ТТ наблюдали при введении всех тестированных антител.

Пример 9. Тест перекрестного блокирования на основе клеточного сортинга с возбуждением флуоресценции.

Связывающие свойства анти-СО154-РаЬ'-фрагментов по изобретению оценивали тестами перекрестного блокирования связывания антител. Вкратце, СЭ154-экспрессирующие клетки Лика! Ό1.1 инкубировали со средой или 10 мкг/мл немеченого первого анти-СО154-РаЬ' в течение 60 мин при комнатной

- 51 019636 температуре. Без отмывки вносили оптимальное разведение второго анти-СО154-РаЬ' (300 нг/мл), меченного А1еха Р1иог 488, в течение 60 мин. Затем клетки отмывали и анализировали проточной цитометрией. Если первый и второй РаЬ' связываются с одним и тем же эпитопом, то первый РаЬ' будет конкурентно блокировать связывание второго РаЬ'. Если два антитела связываются с различными эпитопами, то первый РаЬ' не будет блокировать связывание второго РаЬ'. В том случае, когда меченым тестированным вторым РаЬ' является антитело 342, то можно показать, что 342 РаЬ' перекрестно блокируется 338 (фиг. 23В), 381 (фиг. 23Ό) и 335 (фиг. 23С) РаЬ', но не блокируется перекрестно 295 (не показано), 402 (фиг. 23С), 300 (фиг. 23Е), 303 (фиг. 23Н) или 294 (фиг. 23Р) РаЬ'. В том случае, когда меченый РаЬ' представляет Ьи5с8, то может иметь место перекрестное блокирование под действием 338 (фиг. 24 А), 402 (фиг. 24В), 381 (фиг. 24С), 303 (фиг. 24Ό), 335 (фиг. 24Е), 300 (фиг. 24Р) и 294 (фиг. 24С) РаЬ'. Тестирование с А33 (подобранное по изотипу контрольное антитело) подтверждает, что отсутствует неспецифическое перекрестное связывание (фиг. 23А и 24Н). Антитела 342 и Ьи5с8 конкурировали друг с другом за связывание с СИ154 независимо от того, не содержали они метку (первый) или содержали метку (второй) РаЬ'.

Пример 10. Анализ В1асоге™ связывания антител.

Результаты анализа с помощью В1асоге™ связывания антител 342 и Ьи5с8 с растворимым белком СЭ154 (зСИ154) (внеклеточный домен; ЕСИ) указывали на то, что антитело 342 вытесняло антитело Ьи5с8 из комплекса с 8СЭ154 при добавлении вторым к 8СЭ154 (фиг. 25А и В). Антитело 5с8 не было способно вытеснять 342 от 8СИ154 при добавлении вторым к 8СЭ154 (фиг. 25С). Антитело 338 вело себя аналогично антителу 342 по результатам в конкурентном тесте с Ьи5с8.

Ни5с8 РаЬ может связываться с комплексом полноразмерное антитело 342 (РЬ)/зСИ154 (фиг. 25Ό). На основании этих результатов можно предположить, что Ьи5с8 не конкурирует со связывающим сайтом 342 РЬ, когда 342 РЬ вносили первым. Не связываясь теорией, данные результаты предполагают, что связывание одного или более плеч тримера 8СЭ154 с антителом 342 не препятствует связыванию Ьи5с8 со свободным плечом(и).

Имеет место незначительное («20 ВИ) повышение связывания, когда Ьи5с8 РаЬ следует за 342 РаЬ' (фиг. 25Е). Данный результат поднимает вопрос о возможности того, что Ьи5с8 РаЬ блокировал связывание 342 РаЬ' или что 342 РаЬ' замещал Ьи5с8 РаЬ' в захваченном 8СЭ154.

Ни 342 РаЬ', ни Ьи5с8 РаЬ' не связывались с комплексом СЭ40:зСЭ154 или не оказывали влияния на диссоциацию комплекса в тесте с белком. Тот факт, что РаЬ' не мог связываться с комплексом СЭ40:зСЭ154, позволяет предположить, что комплекс использует все три плеча 8СЭ154 или что комплекс стерически препятствует доступу РаЬ' к свободному плечу.

Пример 11. Активация человеческих тромбоцитов.

Тест 1.

Агрегацию тромбоцитов можно определить с использованием опубликованных методов анализа (например, Р1опап е! а1., 2005, ТЬготЬоз1з Нетоз!аз1з, 93:1137). В одном тесте тромбоциты вымывали из плазмы крови от нормального донора с высоким содержанием тромбоцитов с использованием забуференного НЕРЕ8 физиологического раствора в покрытых В8А пробирках и доводили до титра 250000 на 1 мкл. Затем вымытые тромбоциты переносили пипеткой в кювету агрегометра (СЬгопо-Ьод 490Ό) и записанные сигналы калибровали до нулевого процента агрегации с использованием буфера НЕРЕ8 (для анализа) в качестве контроля. В данном приборе кювету поддерживали при 37,0°С и тромбоциты перемешивали силиконовой палочкой магнитной мешалки со скоростью 1000 об/мин. К тромбоцитам добавляли полностью образованные иммунные комплексы (т.е. антитело плюс рекомбинантный человеческий растворимый СИ40Ь (гЬзСИ40Ь) в стехиометрическом соотношении 1:1, где гЬзСИ40Ь обрабатывали в виде тримера) и оценивали агрегацию в виде кривой, полученной по данным оптической плотности раствора. В частности, 15 мкл иммунного комплекса добавляли к 285 мкл суспензии вымытых тромбоцитов таким образом, что после внесения в кювету конечная концентрация 8СЭ154 составляла 10 мкг/мл, 1дСантитела - 27,8 мкг/мл и РаЬ'-ПЭГ - 16,7 мкг/мл. Данные показывают, что агрегация имела место в присутствии интактного 1дС анти-СП154-антитела Ьи5с8, но не с 342 РаЬ'-ПЭГ (фиг. 26).

Тест 2.

В другом тесте, описанном в заявке ЭДО 07/59332, агрегацию тромбоцитов оценивали при контактировании тромбоцитов с активирующим тромбоциты агентом (например, аденозиндифосфатом (АДФ), коллагеном, тромбином, тромбоксаном, эластазой нейтрофилов, п-селектином или конвулксином), при контактировании активированных тромбоцитов с анти-СП154-антителом, и затем при контактировании активированных тромбоцитов со сшивающим агентом (например, растворимым СЭ154 (зСИ154), античеловеческим 1дС-антителом, анти-ЬРс-антителом, ВР, положительной на Рс-рецептор вспомогательной клеткой, растворимым протеином А или растворимым человеческим Рс-рецептором). Затем агрегацию определяли количественно осаждением тромбоцитов, где осаждение тромбоцитов указывает на агрегацию тромбоцитов. Тест оценки агрегации проводили на богатой тромбоцитами плазме (РВР). Примерно 50 мл цельной крови отбирали аликвотными порциями объемом 4,5 мл в вакуумные пробирки с 0,5 мл 3,8% раствора цитрата натрия. РВР готовили центрифугированием крови с антикоагулянтом при 200 д в течение 10 мин и отбирали супернатант. Для постановки теста использовали 4-канальный прибор для

- 52 019636 определения агрегации тромбоцитов Вю4а!а (РАР-4; Вю4а1а Согр., На!Ього, РА) с использованием кюветы, содержащей только бедную тромбоцитами плазму (РРР). Аликвотную порцию РВР объемом 350 мкл, содержащую примерно 2-5х10⁸ мл тромбоцитов, вносили в кювету с палочкой для перемешивания. Добавляли анти-СП40Ь-антитело, человеческий ЦС, нормальную человеческую сыворотку, СЭ40-ЕС или анти-кЕс в общем объеме 100 мкл. Нагруженные кюветы помещали в прибор и компоненты реакционной смеси смешивали перед внесением АДФ.

Агрегацию инициировали добавлением субоптимальной концентрации АДФ в 50 мкл (конечная концентрация варьирует для каждой отдельной пробы). Прибор для определения агрегации имеет четыре канала, которые работают одновременно. Для каждого образца получали кривую в течение 4 мин после внесения АДФ. В конце регистрации на приборе определяли процент агрегации сравнением с трансмиссией света через пробу и трансмиссией света через контроль РРР. Титрование проводили в начале каждого опыта и последующие анализы проводили при субоптимальной концентрации АДФ.

Результаты данного теста приведены на фиг. 27. РВР получали от здорового субъекта. Агрегацию индуцировали внесением 0,75 мкл АДФ, значение, как было определено, является субоптимальным для данного донора. Положительное контрольное анти-СП154-антитело и отрицательное контрольное антитело ЫдС оценивали в концентрации 200 мкг/мл и при концентрации 8СЭ154 30 мкг/мл. Анти-СЭ154антитело или ЫдС смешивали с рекомбинантным 8СЭ154 не более чем в течение 20 мин перед внесением в кювету с РВР. Столбики показывают средние значения и стандартные отклонения данных в двух точках. Результаты показывают, что несмотря на то что отрицательный контрольный человеческий [дС (ЫдС) и 8СЭ154 вместе не оказывали влияния на агрегацию тромбоцитов, положительное контрольное анти-СО154-антитело приводило к повышению агрегации тромбоцитов. Результаты данного анализа с использованием положительного или отрицательного контроля показывают, что данный тест можно использовать для сравнения относительного влияния антител по настоящему изобретению на агрегацию тромбоцитов.

Для определения того, насколько тромбоциты экспрессируют СЭ154 на их поверхности, тромбоциты инкубируют с конъюгированным с биотинилированным анти-СП154-антителом и наличие поверхностного СЭ154 определяют количественным анализом связанного биотинилированного анти-СЭ154антитела.

Следовательно, экспрессию СЭ154 на поверхности оценивали через 1, 10, 20, 40 и 60 мин после инкубации с или без 10 мкл АДФ. Экспрессию СЭ154 на поверхности детектировали на активированных АДФ тромбоцитах через 1 мин после активации, и она повышалась со временем. Связывание конъюгированного с биотином анти-СО154-антитела с 8СЭ154 является специфическим для СЭ154, поскольку предварительная инкубация конъюгированного с биотином анти-СО154-антитела приводила к ингибированию связывания с активированными тромбоцитами. Количество поверхностного ί.Ό154, обнаруженное на неактивированных (покоящихся) тромбоцитах, также возрастало со временем. Вероятно, данное явление можно отнести к фоновому уровню активации тромбоцитов в экспериментальных условиях.

Пример 12. Способы определения измененной эффекторной функции агликозилированных и других мутантных антител.

В следующем примере описаны тесты, пригодные для определения и характеристики эффекторной функции(и) агликозированных и других модифицированных мутантных антител по изобретению.

Эффекторную функцию агликозированных и других модифицированных мутантных антител по изобретению можно охарактеризовать по способности антител связываться с антигеном и также связываться с Ес-рецептором или молекулой комплемента С1с.|. В частности, аффинность связывания с ЕсуВ можно определить с использованием тестов, основанных на способности антитела образовывать мостик между антигеном СЭ154 и клеткой с Ес-рецептором. Аффинность связывания с С1с.| можно определить тестами на основе оценки способности антитела образовывать мостик между антигеном СЭ154 и С1с.|. Взаимодействие антител по настоящему изобретению с ЕсВ или с комплементом также можно проанализировать технологией на основе шариков А1рка8сгееп™ (Регкт Е1тег®).

Тесты оценки связывания с Ес-рецептором.

Тест образования мостика с ЕсуВ можно провести покрытием 96-луночных планшетов для постановки ЕЫ8А МахщогЬ ^а1де-Ыипе Воскек!ег, ΗΥ, США) рекомбинантным растворимым человеческим лигандом СЭ154 (например, в концентрации 1 мкг/мл в течение ночи при 4°С в РВ8; Кагрикак е! а1., 1995, 8!гис!иге, 3(10):1031-1039 и 3(12): 1426; Кагрикак е! а1., 2001, 81гис!иге, 9(4):321-329). Титрование гликозилированных или агликозилированных форм анти-СО154-антитела проводили на СЭ154 в течение 30 мин при 37°С, затем планшеты промывали и анализировали связывание меченных флуоресцентной меткой клеток И937 (СЭ64'). Клетки И937 можно культивировать в среде ВРМI с 10% ЕВ8, 10 мМ НЕРЕ8, Ь-глутамином и смесью пенициллин/стрептомицин, расщепление 1:2, и активировали в течение 1 суток перед постановкой анализа с 1000 Е/мл ШЫу для повышения экспрессии Ес-рецептора (ЕсуШ).

В другом варианте теста можно оценить способность антител по изобретению связываться, или точнее не связываться, с другим Ес-рецептором, таким как ЕсуВШ (СЭ16) с использованием описанного выше образования мостика против меченных флуоресцентной меткой человеческих Т-клеток (клеток

- 53 019636

1игка!), трансфектированных СЭ16-экспрессирующей конструкцией. Лиганд можно продуцировать в монослое СЭ154-экспрессирующих клеток яичника китайского хомяка (СНО), культивированных в 96луночных планшетах для культивирования тканей (Согшпд ЫГе 8с1епсек Ас!оп, МА, США). Например, клетки 040^0154' высевали в 96-луночные планшеты с титром 1х10⁵ клеток/мл и культивировали до слияния в среде ос-МЕМ с 10% диализованной РВ8, 100 нМ метотрексата, Ь-глутамином и смесью пенициллин/стрептомицин (С1Ьсо-ВКЬ КоскуШе, МЭ, США). Клетки СЭ16' 1игка! культивировали в среде КРМ1 с 10% РВ8, 400 пкг/мл генетицина, 10 мМ НЕРЕ8, пируватом натрия, Ь-глутамином и смесью пенициллин/стрептомицин (С1Ьсо-ВКЬ) и расщепляли 1:2 за сутки до постановки анализа.

В тестах для обоих рецепторов клетки с Рс-рецепторами можно пометить ацетоксиметиловым эфиром 2',7'-бис-(2-карбоксиэтил)-5-(6)карбоксифлуоресцеина (ВСЕСР-АМ) (Мо1еси1аг РгоЬек Еидепе, ΟΗ, США) в течение 20 мин при 37°С. После промывания для удаления избытка метки 1х 10⁵ меченых клеток инкубируют в тесте в течение 30 мин при 37°С. Несколькими промываниями удаляют несвязанные с РсуК положительные клетки и планшеты читают на ридере для микропланшетов (Су!оГ1иог 2350 Р1иогексеп! Мюгор1а!е Кеабег, М1Шроге Согрога!юп ВебГогб, МА, США) при длине волны возбуждения 485 нм и длине волны эмиссии 530 нм.

В дополнении к тестам, описанным выше, связывание антител по изобретению с Рс-рецепторами можно определить в формате конкурентного теста с использованием А1рйа8сгееп™ (АшрйПеб Ьиттексеп! Ргох1тйу Нотодепеоик аккау; Регкт Е1тег) или непосредственно с использованием поверхностного плазмонного резонанса (В1асоге®). С помощью анализа В1асоге можно регистрировать связывание рецептора-аналита с антителом, иммобилизованным на чипе протеин А/С с использованием прибора В1асоге® 3000. В1асоге® является хорошо известным методом, применяющимся для характеристики белок-белковых взаимодействий (Мукхка, 1997, Сигг. Ορ^η. Вю!есйпо1., 8:50-57; Ма1тЬогд & ВоггеЬаеск, 1995, 1. 1ттипо1. Ме!йобк, 183:7-13) и его успешно применяли для оценки связывания 1дС-антител с РсуКШ (Са1оп е! а1., 1997, Еиг. 1. 1ттипо1., 27:1928-1932). Например, протеин А/С ковалентно связывают с сенсорным чипом (например, сенсорный чип СМ5 с использованием реакции ΝΉ8). Подвижный буфер для анализа (например, НВ8-ЕР (0,01 М НЕРЕ8, рН 7,4, 0,15 М №С1, 3 мМ ЭДТА, 0,005% поверхностноактивного вещества Р20 (об./об.), В1асоге®)) и буфер для регенерации чипов (например, глициновый буфер, рН 1,5 (10 мМ глцин-НС1, рН 1,5, В1асоге®)) использовали в тесте. Мутантные антитела против СЭ154 с пониженной эффекторной функцией и дикого типа или нативные антитела против СЭ154 разводили до 100 нМ подвижным буфером для анализа (например, буфером НВ8-ЕР) и связывали с чипом протеин А/С в течение 5 мин. Рецепторы связываются в фазе ассоциации в концентрациях с последующей фазой диссоциации буфером. Цикл без антитела обеспечивает фоновую реакцию. В целом сенсограммы можно подогнать 1:1 к модели связывания Ьапдтшг с получением констант равновесия диссоциации (К|,)8) с использованием, например, программного обеспечения ВIАеνа1иа!^οη, версия 4.1 (В1асоге®).

В тестах с А1рйа8сгееп используют немеченое антитело для конкуренции для взаимодействия биотинилированного 1дС, связанного с донорными шариками со стрептавидином, и РсуК-Н1к-С8Т, связанного с акцепторными шариками с анти-С8Т. Анти-СЭ154-антитело дикого типа или нативное (такое как 1дС1-антитело) подвергают биотинилированию с использованием стандартных методов и диализу в РВ8. Акцепторные шарики с анти-С8Т и донорные шарики со стрептавидином являются промышленно доступными и их можно использовать в конечной концентрации 20 мкг/мл. РсуК1-Н1к-С8Т, РсуКШа-Н1кС8Т, РсуК11а-Н1к-С8Т или любой другой меченый РсК в 1х буфере (например, 25 мМ НЕРЕ8, 100 мМ №С1, 0,1% В8А, 0,01% твина-20, рН 7,4) вносят в каждую лунку 96-луночного планшета до конечной концентрации 0,5 нМ. Анти-СЭ154-антитела дикого типа или нативные, мутантное анти-СЭ154-антитело или буфер готовят в виде '/₂ 1од разведений в 1х буфере для анализа и вносят в каждую лунку. После непродолжительного центрифугирования биотинилированное анти-СЭ154-антитело дикого типа (например, 1дС1-антитело) в 1х буфере для анализа вносят в каждую лунку до конечной концентрации 5 нМ. 100 мкг/мл акцепторных шариков с анти-С8Т вносят в каждую лунку и планшет инкубируют в темноте в течение 1 ч при комнатной температуре. 100 мкг/мл донорных шариков со стрептавидином вносят в каждый планшет и после непродолжительного центрифугирования планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Пробы реакционной смеси переносят в белые непрозрачные планшеты и определяют флуоресценцию на ридере для микропланшетов Рикюп™ А1рйа-РР НТ (Регкт Е1тег). Данные нормализуют к наиболее высокому сигналу (без конкуренции) и подгоняют до модели односайтовой конкуренции с использованием нелинейной регрессии, например, с помощью программного обеспечения СгарйРаб Рпкт (программного обеспечения СгарйРаб).

Специалисты в данной области могут провести вышеописанные или аналогичные тесты для определения связывания вариантов-антител с любым РсК, включая, например, РсуКНа.

Тесты связывания с С1с.|.

Тест оценки связывания с С1с.| можно провести покрытием 96-луночных планшетов для постановки ЕЫ8А Мах1когЬ (№1де-Ыипе Косйек!ег, ΝΥ, США) 50 мкл рекомбинантного растворимого человеческого лиганда СЭ154 (Кагрикак е! а1., 1995, 8!гис!иге, 15; 3(12): 1426) в концентрации 10 мкг/мл в течение ночи

- 54 019636 при 4°С в РВЗ. Содержимое лунок аспирировали, промывали три раза буфером для промывания (РВЗ, 0,05% твина-20) и блокировали по меньшей мере в течение 1 ч из расчета 200 мкл/лунку буфером для блокирования/разведения (0,1 М №₂НРО₄, рН 7,0, 0,1 М №С1, 0,05% твина-20, 0,1% желатина). Антитело, предназначенное для тестирования, разводят в буфере для блокирования/разведения, начиная с 15 мкг/мл при 3-кратных разведениях. Вносят 50 мкл на 1 лунку и планшеты инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре.

После аспирации содержимого и промывания лунок, как описано выше, добавляют человеческий С1с.| (З1дта) (С0660) с концентрацией 2 мкг/мл из расчета 50 мкл/лунку, разведенный в буфере для блокирования/разведения, и инкубируют в течение 1,5 ч при комнатной температуре. После аспирации содержимого и промывания лунок, как описано выше, добавляют овечий анти-С1с.| (Зего!ес АНРН033), разведенный в 3,560 раз буфером для блокирования/разведения из расчета 50 мкл/лунку. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре содержимое лунок аспирируют и промывают, как описано выше. Затем вносят конъюгат ослиного антиовечьего 1дС НРВ (Засккоп 1ттипоВекеагсй 713-035-147), разведенный 1:10000 в буфере для блокирования/разведения, и лунки инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре.

После аспирации и промывания, как описано выше, добавляют 100 мкл субстрата ТМВ (420 мкМ ТМВ, 0,004% Н₂О₂ в 0,1 М буфере ацетат натрия/лимонная кислота, рН 4,9) (З1дта) и инкубируют в течение 2 мин перед тем, как реакцию останавливают внесением 100 мкл 2 N серной кислоты. Определяют поглощение при 450 нм на приборе Зойтах РВО и используют программное обеспечение ЗоПгпа.х для определения относительной аффинности связывания (С значение) на 4-параметровом графике.

В альтернативном тесте оценки связывания с С1с.| используют ЕЫЗА для определения связывания анти-СП154-антител с С1с.|, но не применяют СЭ154 в качестве мостика. Вкратце, планшеты для постановки анализа можно покрыть в течение ночи при 4°С мутантным антителом или исходным антителом (контрольным) в буфере для покрытия. Затем планшеты можно промыть и блокировать. После промывания вносят аликвотную порцию человеческого С1с.| в каждую лунку и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. После дополнительного промывания вносят в каждую лунку 100 мкл овечьего антитела против комплемента С1с.|, конъюгированного с пероксидазой из хрена, и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшет вновь промывают буфером для промывания и в каждую лунку добавляют 100 мкл субстрата в буфере, содержащем ОРО (О-фенилендиамин дигидрохлорид (З1дта)). В течение 30 мин проводят реакцию окисления, о ходе которой судят по появлению желтого окрашивания, и ее останавливают добавлением 100 мкл 4,5 №Н₂ЗО₄. Затем можно определить поглощение при (492405) нм.

Приведенное в качестве примера мутантное антитело представляет таковое, которое показывает достоверное снижение связывания с С1с.| в данном тесте. В некоторых вариантах осуществления достоверным снижением является, когда примерно 100 мкг/мл мутантного антитела вызывают снижение связывания С1с.| примерно в 50 или более раз по сравнению с 100 мкг/мл контрольного антитела с невариантной Рс-областью 1дС1. В наиболее предпочтительном варианте осуществления мутантный полипептид (т.е. антитело) не связывается с С1с.|, т.е. 100 мкг/мл мутантного антитела вызывает снижение связывания С1с.| примерно в 100 или более раз по сравнению с 100 мкг/мл контрольного антитела.

Активация комплемента и СЭС.

Для оценки активации комплемента можно провести тест комплементзависимой цитотоксичности (СЭС)· например, как описано Саххапо-Зап1ого е! а1., I 1ттипо1. Мебюбк, 202: 163, 1996. Вкратце, различные концентрации мутантного полипептида (т.е. антитела) и человеческого комплемента разводят буфером. Клетки, экспрессирующие антиген, с которым связывается мутантный полипептид, разводят до титра 1х10⁶ клеток/мл. Смеси мутантного полипептида, разведенного человеческого комплемента и клеток, экспрессирующих антиген, вносят в 96-луночный плоскодонный планшет для культивирования тканей и инкубируют в течение 2 ч при 37°С в атмосфере СО2 для обеспечения протекания опосредуемого комплементом лизиса клеток. В каждую лунку вносят 50 мкл а1атаг синего (Асситеб 1п!ета!юпа1) и инкубируют в течение ночи при 37°С. Поглощение определяют на флуорометре для 96-луночных планшетов при длине волны возбуждения 530 нм и длине волны эмиссии 590 нм. Результаты выражают в относительных единицах флуоресценции (ВРИ). Концентрации образца можно рассчитать на компьютере по стандартной кривой и определить процент активности для интересующего мутантного полипептида в сравнении с немутантным полипептидом.

Пример 13. Картирование связывающего антитело 342 сайта в белке СЭ154.

Проводили опыты для идентификации аминокислотных остатков в человеческом СЭ154, которые являются важными для связывания антитела 342 с использованием химерных человеческих-мышиных белков СЭ154. Антитело 342 связывается с высокой аффинностью с человеческим СЭ154, но не связывается с мышиным СЭ154. Следовательно, в результате мутирования мышиных остатков СЭ154 в таковые, соответствующие человеческим остаткам, и определения изменения аффинности мутированного белка для антитела 342 можно установить важные для связывания остатки. Отбирали шесть групп мутантов, в которых человеческие остатки были введены в отобранные области растворимого мышиного СЭ154 (отмечены 1-6 на фиг. 28). Также оценивали не подвергшиеся мутации человеческий и мышиный раствори

- 55 019636 мый белок СЭ154 (8СЭ154). Различные белки СЭ154 использовали в опытах по анализу В1асоге® с использованием антитела 342 (в формате Ι§0), иммобилизованного на чипе и с супернатантами 8СЭ154 в фазе растворения. Результаты показывали, что связывание антитела 342 имеет место только при введении человеческих остатков группы 5 в мышиный СЭ154.

Пример 14. Тест перекрестного блокирования в конкурентной ΕΕΙ8Α.

Для демонстрации перекрестного блокирования антитела 342 и 5с8 ЕаЬ' авторы использовали конкурентную ΕΗδΑ. В данном тесте планшет для ΕΗδΑ покрывали анти-Мус-антителом 9Е10. Мусмеченный СЭ154 связывался данным антителом. Серию разведений немеченых 342 и 5с8 ЕаЬ' инкубировали с 1 нМ биотин-342 ЕаЬ' или 0,3 нМ биотин-5с8 в планшете в течение 2 ч при комнатной температуре в РВ8, 0,05% твина-20, 1% В8А. Планшет промывали и определяли количество биотинилированного 5с8 ЕаЬ' с использованием стрептавидин-ΗΒΡ. Регистрировали сигналы и строили график с использованием гиперболической кривой с одним сайтом связывания или гиперболической кривой с двумя сайтами связывания с программным обеспечением Ргып (Сгарй Раб).

Проводили титрование биотин-342 ЕаЬ' на СЭ154 с целью определения соответствующей концентрации для анализа перекрестного блокирования (фиг. 29А). Было установлено, что концентрация, равная 1 нМ, находится в линейной части кривой. Также проводили титрование биотин-5с8 ЕаЬ' на СЭ154 с целью определения соответствующей концентрации для перекрестного блокирования (фиг. 29В). Было установлено, что концентрация, равная 0,3 нМ, находится в линейной части кривой. В опыте по оценке перекрестного блокирования биотин-342 и биотин-5с8 ЕаЬ' немеченым 342 ЕаЬ', оказалось, что 342 ЕаЬ' ингибировал связывание биотин-342 ЕаЬ' с аффинностью, равной 0,09 нМ (фиг. 29С). 342 ЕаЬ' ингибировали связывание биотин 5с8 ЕаЬ' с двумя показателями аффинности 0,134 и 76 нМ (фиг. 29С). Перекрестное блокирование биотин-342 под действием немеченого 5с8 ЕаЬ' показано на фиг. 29Ό. Максимальная концентрация 5с8 ЕаЬ' на данной кривой составляет 50 нМ, которая находится значительно выше точки насыщения для 5с8 и также значительно выше концентрации 1 нМ биотин-342. На основании отсутствия полного ингибирования при данных концентрациях можно предположить, что антитело 5с8 не способно конкурентно блокировать все сайты связывания 342 на ί.Ό40Ε

- 56 019636

Список последовательностей <110> ΒΙΟΟΕΝ ЮЕС МА 1ЫС.

исв РНАКМА 5. А.

<12 0> СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ АНТИТЕЛА, ПРОИЗВОДНЫЕ АНТИТЕЛ И ФРАГМЕНТЫ АНТИТЕЛ, КОТОРЫЕ СПЕЦИФИЧЕСКИ СВЯЗЫВАЮТСЯ С СО154, И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ <130> 000455-0381-И01 <140> РСТ/и506/003735 <141> 2008-03-21 <150> 60/920,495 <151> 2007-03-27 <150> 60/919,938 <151> 2007-03-22 <150> 60/919,816 <151> 2007-03-22 <160> 77 <170> РаеепЫп уегзюп 3.3 <210> 1 <211> 117 <212> РК.Т <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 1

С1и 1

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1 5

С1и

Зег

С1у

С1у

С1у 10

Ьеи

Уа1

С1п

Рго

С1у 15

С1у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

Уа1

Зег

О1у

РНе

Зег

Зег

ТНг

Азп

Туг

20

25

30

Н1з

Уа1

Н13

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1 у

Ьуз

О1у

Ьеи

С1и

Тгр

МеЬ

35

40

45

С1у

Уа1

Не

Тгр

С1у

Азр

С1у

Азр

ТНг

Зег

Туг

Азп

Зег

Уа1

Ьеи

Ьуз

50

55

60

Зег

Агд

РНе

ТНг

Не

Зег

Агд

Азр

ТНг

Зег

Ьуз

Азп

ТНг

Уа1

Туг

Ьеи

65

70

75

80

С1п

мен

АЗП

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТНг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

85

90

95

Агд

С1п

Ьеи

ТИг

Н13

Туг

Туг

Уа1

Ьеи

А1а

А1а

Тгр

С1у

О1п

С1у

ТНг

100

105

110

- 57 019636

Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег

115 <21С> 2 <211> 107 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 2

Зег

Зег 10

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1 15

С1у

Азр 1

Не

С1п МеС

ТНг С1п 5

Зег

Рго

Авр

Агд

Уа1

ТНг

11е

ТНг

Суз

Агд

А1а

Зег

С1и

Азр

Ьеи

Туг

Туг

Азп

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

Агд

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

35

<10

45

Туг

Аар

ТИг

Туг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

01у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РНе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

С1у

ТНг

Азр

Туг

ТНг

Ьеи

ТНг

11е

Зег

Зег

Ьеи

О1п

Рго

65

70

75

80

С1и

Азр

РНе

АТа

Зег

Туг

Туг

Суз

С1п

61п

Туг

Туг

Ьуз

РНе

Рго

РНе

85

90

95

ТИг

РЬе

С1у

61п

С1у

ТГг

Ьуз

Уа1

С1и

Не

Ьуз

100

105

<210> 3 <211> 10 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <4С0> 3

С1у РНе Зег Зег ТНг Азп Туг Ηΐ5 ϋθ! Ηΐ3

5 10 <210> 4 <211> 16 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид

- 58 019636 пептид <400> 4

Уа1 Не Тгр 31у Азр С1у Азр ТНг Зег Туг Азп Зег Уа1 Ьеи Ьуз Зег 1 10 <210>

<211 >

<212>

<2 1 3>

РКТ

Искусственная последовательность <220>

<223>

Описание искусственной последовательности:

синтетический <4 00>

С1П Ьеи ТНг Ηί3 Туг Туг 7а1 Ьеи А1а А1а <210>

<211>

<212>

<213>

РКТ

Искусственная последовательность <220>

<223>

Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид <4 00>

Агд А1а Зег С1и Азр Ьеи Туг Туг Азп Ьеи А1а <210>

<2 11>

<212>

<213>

РКТ

Искусственная последовательность <220>

<223>

Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид <4СЮ>

Азр Тпг Туг Агд Ьеи А1а Азр <210>

<211 >

<212>

<213>

РКТ

Искусственная последовательность <220>

<223>

Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид <400> 8

С1п С1п Туг Туг ьуз РНе Рго РНе ТНг <210> 9 <211> 117 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

- 59 019636 полипептид <400> 9

С1п ]

Уа1

С1п

Ьеи

С1п 5

31и Зег С1у

Рго

С1у 10

Ьеи Уа1

Ьуз

Рго

Зег 15

С1и

Тйг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

Уа1

Зег

С1у

Рйе

Зег

Зег

ТНг

Азп

Туг

20

25

30

Н13

Уа1

Н13

Тгр

Не

Агд

С1п

Рго

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Не

35

40

45

С1у

Уа1

Не

Тгр

61у

Азр

С1у

Азр

ТЬг

Зег

Туг

Азп

Зег

Уа!

Ьеи

Ьуз

50

55

60

Зег

Агд

Уа1

ТНг

Не

Зег

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

С1п

РНе

Зег

Ьеи

65

70

75

60

Ьуз

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

А1а

Азр

ТНг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

95

90

95

Агд

61 η

Ьеи

ТНг

Н13

Туг

Туг

Уа1

Ьеи

А1а

А1а

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

100

105

но

Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег

115 <210> 10 <211> 117 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 10

С1и 1

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1 5

С1и

Зег

С1у

С1у

С1у 10

Ьеи

Уа1

С1п

Рго

С1у 15

С1у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

61у

Рйе

Зег

Зег

ТНг

Азп

Туг

20

25

30

Н15

Уа1

Ηι з

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуэ

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Уа1

35

40

45

Зег

Уа1

11е

Тгр

С1у

Азр

61 у

Азр

Тйг

Зег

Туг

Азп

Зег

Уа1

Ьеи

Ьуз

50

55

60

Зег

Агд

Рйе

ТНг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТНг

Ьеи

Туг

Ьеи

65

70

75

90

- 60 019636

С1п

Ме!

Азп

Зег

Ьеи 85

Агд

А1а

О1и

Азр

ТЬг 90

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз 95

А1а

Агд

С1п

Ьеи

ТЬг 100

Нхз

Туг

Туг

7а1

Ьеи 105

А1а

А1а

Тгр

С1у

С1п 110

С1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТНг 115

Уа1

Зег

<210> И <211> 117 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 11

С1п 1

Уа1

О1п

Ьеи

61п 5

С1и

Зег

С1у

Рго

С1у 10

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

Зег 15

<31и

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

Уа1

Зег

С1у

РЬе

Зег

Зег

ТЬг

Азп

Туг

20

25

30

Н1 5

ν3ι

Н1з

Тгр

11е

Агд

С1п

Рго

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

МеЬ

35

40

45

С1у

Уа1

Не

Тгр

С1у

Азр

С1у

Азр

ТНг

Зег

Туг

АЗП

Зег

Уа1

Ьеи

Ьуз

50

55

€0

Зег

Агд

ν*1

ТНг

Не

Зег

Агд

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

65

70

75

80

Ьуз

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

А1а

Агр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

85

90

95

Агд

О1п

Ьеи

ТЬг

Н13

Туг

Туг

ναΐ

Ьеи

А1а

А1а

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТНг

100

105

110

Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег

115 <210> 12 <211> 221 <212> РИТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

- 61 019636 <400> 12

С1и 1

ν=α

С1п

Геи

Уа1 5

С1и

Зег

С1у

С1у

С1у 10

Ьеи

УаЬ

С1п

Рго

С1у 15

С1у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

Уа1

Зег

С1у

РНе

Зег

Зег

ТНг

Азп

Туг

20

25

30

Н15

νοί

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Мес

35

40

45

С1у

Уа!

Не

Тгр

С1у

Азр

С1у

Азр

ТНг

Зег

Туг

Азп

Зег

Уа1

Ьеи

Ьуз

50

55

60

Зег

Агд

РНе

ТНг

11е

Зег

Агд

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ТНг

Уа1

Туг

Ьеи

65

70

75

80

С1п

МеЬ

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТНг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

85

90

95

Агд

С1п

Ьеи

ТНг

Н1Э

Туг

Туг

Уа1

Ьеи

А1а

А1а

Тгр

С1у

С1п

□ 1у

ТНг

100

105

110

Ьеи

Уа1

ТНг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

ТНг

Ьуз

С1у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Рго

115

120

125

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Зег

Ьуз

Зег

ТНг

Зег

С1у

61у

ТНг

А1а

А1а

Ьеи

СИу

130

135

140

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РНе

Рго

С1и

Рго

Уа1

ТНг

Уа1

Зег

Тгр

Азп

145

150

155

160

5ег

С1у

А1а

Ьеи

ТНг

Зег

С1у

Уа1

ΗΪ3

ТНг

РЬе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

С1п

165

170

175

Зег

Зег

31у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

Уа1

ТНг

Уа1

Рго

Зег

Зег

180

185

190

Зег

Ьеи

С1у

ТНг

С1п

ТИг

Туг

Не

Суз

Азп

Уа1

Азп

Н1з

Ьуз

Рго

Зег

195

200

205

Азп

ТИг

Ьуз

Уа1

Азр

Гуз

Ьуз

Уа1

С1ц

Рго

Ьуз

Зег

Суз

210

215

220

<210 13 <211> 229 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

- 62 019636 полипептид <400> 13

(Ии 1

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1 5

СЬи

Зег С1у

С1у С1у 10

Ьеи

Уа1

С1п

Рго

С1у 15

<31у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

Уа1

Зег

31у

РЬе

Зег

Зег

ТЬг

Азп

Туг

20

25

30

Н15

Уа1

Н13

Тгр

νβΐ

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

МеС

35

40

45

С1у

Уа1

11е

Тгр

С1у

Азр

С1у

Азр

ТЬг

Зег

Туг

Азп

Зег

Уа1

Ьеи

Ьуз

50

55

60

5ег

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Агд

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Уа1

Туг

Ьеи

65

70

75

80

С1п

МеС

Азп

Зег

Ьеи

Агд

ДЬа

С1и

Азр

ТЬг

А1а

νοί

Туг

Туг

Суз

А1а

85

90

95

Агд

С1п

ьеи

ТЬг

Н13

Туг

туг

УаЬ

Ьеи

А1а

А1а

тгр

С1у

С1п

31у

ТЬг

100

105

110

Ьеи

Уа1

ТНг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

С1у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Рго

115

120

125

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Зег

Ьуз

Зег

ТЬг

Зег

С1у

С1у

ТЬг

А1а

А1а

Ьеи

С1у

130

135

140

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

С1и

Рго

Уа!

ТНг

Уа1

Зег

Тгр

Азп

145

150

155

160

Зег

С1у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

С1у

Уа1

Н15

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

С1п

165

170

175

Зег

Зег

СХу

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

Уа1

ТЬг

Уа1

Рго

Зег

Зег

180

185

190

Зег

Ьеи

С1у

ТНг

О1п

ТЬг

Туг

Г1е

Суз

Азп

Уа1

Азп

Н1&

Ьуз

Рго

Зег

195

200

205

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьуз

Уа1

С1и

Рго

Ьуз

Зег

Суз

Азр

Ьуз

ТЬг

210

215

220

Н15

ТЬг

Суз

А1а

А1а

225 <210> 14

- 63 019636 <211> 107 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности г синтетический полипептид <400> 14

Аэр 1

Не

С1п

Меи

ТНг 5

С1п

Зег

Рго

5ег

Зег 10

Ьеи

5ег

А1а

Зег

Уа1 15

С1у

Авр

Агд

Уа1

ТНг

Не

ТНг

Суз

Агд

А1а

Зег

С1и

Азр

Ьеи

Туг

Туг

Азп

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

σΐη

С1п

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Г1е

35

40

45

Туг

Азр

ТЬг

Туг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РНе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

С1у

ТНг

Азр

РНе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьеи

С1п

Рго

65

70

75

80

С1и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

С1П

С1п

Туг

Туг

Ьуз

РЬе

Рго

РНе

85

90

95

Тпг

РЬе

С1у

С1п

С1у

ТНг

Ьуз

7а1

С1и

11е

Ьуз

100

105

<210> 15 <211> 214 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <40С> 15

Азр 1

Не

С1п

МеИ.

ТНг 5

С1п

Зег

Рго

Зег

Зег 10

Ьеи

Зег

А1а

Зег

νβΐ 15

С1у

Азр

Агд

Уа1

ТИг

11е

ТИг

Суз

Агд

А1а

Зег

С1и

Азр

Ьеи

Туг

Туг

А5П

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

Агд

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

Азр

ТИг

Туг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

С1у

ТНг

Азр

Туг

ТЬг

Ьеи

ТИг

Не

Зег

Зег

Ьеи

С1п

Рго

- 64 019636

65

70

75

80

С1и

Азр

Рке

А1а

Зег

Туг

Туг

Суз

С1п

С1п

Туг

Туг

Ьуз

Рке

Рго

Рке

85

90

95

Ткг

Рке

61у

С1п

С1у

Ткг

Ьуз

Уа1

31и

Не

Ьуз

Агд

Ткг

Уа1

А1а

А1а

100

105

110

Рго

Зег

Уа1

Рке

Не

РЬе

Рго

Рго

Зег

Азр

С1и

С1П

Ьеи

Ьуз

Зег

С1у

115

120

125

Ткг

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

Рке

Туг

Рго

Агд

С1и

А1а

130

135

140

Ьуз

Уа1

С1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

С1п

Зег

С1у

Азп

Зег

С1п

145

150

155

160

О1и

Зег

νδΐ

Ткг

С1и

С1п

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

Ткг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

165

170

175

Зег

Ткг

Ьеи

Ткг

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

С1и

Ьуз

Н15

Ьуз

Уа1

Туг

180

185

190

А1а

Суз

С1и

7а1

Ткг

Н1 3

С1п

С1у

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Уа1

Ткг

Ьуз

Зег

195

200

205

Рке Азп Агд С1у С1и Суз

210 <210> 16 <211> 321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <400> 16

даЬаЬссада	Сдасссадад	^ссаадсадЬ	сЬсЬссдсса	дсдьаддсда	Ъсд^дсдасС	60
а£ ЬассЕдЬс	дСдсоадЬда	ддасс^сЬаЬ	СасаассСдд	ссЬддЬаЬса	дсааааасед	120
ддсааадссс	сдаадсЁдсС	саСсСа^даи	асдЬассдсс	ьддссдасдд	Ьдидссаадс	180
сдЬЬЁсадЧд	дсадИддсад	сддЪассдас	ЬЬЬасссСса	сааЫЛсдСс	ЬсСссадссд	240
даадасЬЁсд	ссасЬЬас1:а	СИдСсадсаа	СаС^асаадС	Ьсссс СЬсас	сььеддьсад	300
ддсасСааад	С/адаааСсаа	а				321
<210> 17 <211> 321

- 65 019636 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <400> 17

дагагссада	Сдасссадад	ЕссаадсадС	сСсбссдсса	дсдСаддсда	ЪсдЪдкдасЬ	60
аЕбассбдбс	дЕдссадЕда	ддассЬсЕаЬ	ЕасаассСдд	ссВддЬаЕса	дсдЬааассд	120
ддсааадссс	сдаадсЬдсЕ	са5с1:а1:да1:	асдЬассдсс	Иддсвдасдд	вдгдссаадс	180
сдЫЬсадЬд	дсадСддсад	сддсассдас	ваЕасссЕса	сааСЕЕсдЕс	ЕсЕссадссд	240
даадабб Есд	ссбс^Еасба	ИдЪсадсаа	ЕаббасаадО	ГсссЕЕЕсас	сЕ5сдд5сад	300
ддсасСааад	^адаааЬсаа	а				321

<210> 18 <211> 705 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <400> 18

аЕдааааада	садсЕаЕсдс	ааЕЕдсадЕд	дссЕСддсСд	дСЕСсдсЕас	сдЕадсдсаа	60
дссдасассс	адагдассса	дадЕссаадс	адЕсЕсЕссд	ссадсдСадд	сдаЕсдЕдЕд	120
аслагсассс	дЛсдЕдссад	ЬдаддассСс	ЕаЕСасаасс	ЕддссЕддЕа	ЕсадсдЕааа	180
ссдддсааад	ссссдаадСЕ	дсЕсаЕсбаГ	даьасдЕасс	дссЕддсЕда	сддидЕдсса	240
адссдсгЕса	дЕддсадбдд	садсддСасЕ	дасСапассс	ГсасааЬЬВс	дЕсЕсЕссад	300
ссддаадаи	дсдссссгга	свагсдссад	сааваЕЕаса	адШгсссспп	сассЕЕсддЕ	360
садддсасба	аадЕадаааб	сааасдбасд	дЕадсддссс	сабсЕдЕссг	саЕсЕЕссод	420
ссаЕсЕдаЕд	адсадЕЕдаа	аСсЕддаасЕ	дссбсвдЕЕд	ЕдЕдсссдсЕ	дааЕаасЕЕс	480
ЕаЕсссадад	аддссааадб	асадЕддаад	дСдда^аасд	сссЕссааЕс	дддЕаасЕсС	540
саддададСд	Есасададса	ддасадсаад	дасадсассЕ	асадссЕсад	садоассссд	600
асдсбдадса	аадсадасСа	сдадааасас	ааадбсЕасд	ссбдсдаадЕ	сасссаЕсад	660
ддссСдадсС	сассадбаас	ааааадЫЕЕ	ааЕададддд	адЕдЕ		705

<210> 19 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид

- 66 019636 <400> 19

саддЕдсадс	ЕдсаддадЕс	Еддассдддд	сЕЕдЕсаадс	сЕадЕдадас	ссЕдадссгс	60
асЕЕдЕассд	ЕдадсддсЕЕ	садсЕссасс	ааЕЕассагд	ЕдсасЕддаЕ	ЕсдЕсадсса	120
ссЕдддаадд	дссЕддадЕд	даЕЕддЕдЕЕ	аЕЕЕддддсд	асддсдаЕас	аЕссЕасаас	180
ЕссдЕссЕда	ададссдЕдЕ	сассассссс	дЕЕдасассЕ	сааадааЕса	аЕЕЕЕсссЕс	240
аадЕЕдадсЕ	сЕдЕсассдс	адсддасаса	дсадЕсЕаЕЕ	асЕдЕдсасд	ЕсаасЕдасс	300
сасЕаЕЕасд	ЕЕЕЕддсадс	сЕддддЕсаа	дддасгсгдд	ЕсасадЕсЕс	д	351

<210> 20 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <400> 20

даддЕдсадс	ЕддЕсдадЕс	Еддаддсддд	сЕЕдЕссадс	сЕддЕдддад	ссЕдсдЕсЕс	60
ЕСЕЕдЕдсад	сдадсддсЕо	садсЕссасс	ааггассагд	ЕдсасЕдддЕ	дсдгсаддса	120
ссЕдддаадд	дссЕддадЕд	ддЕдадЕдЕЕ	аЕЕЕддддсд	асддсдаЕас	аЕссЕасаас	180
ЕссдЕссЕда	ададссдЕЕЕ	сассаЕ ЕЕсс	сдЕдасаасЕ	сааадааЕас	СОЕЕЕасСЕС	240
садаЕдаасЕ	сЕсЕссдсдс	ададдасаса	дсадЕсЕаЕЕ	асЕдЕдсасд	ЕсаасЕдасс	300
сасЕа Е сасд	ЕЕЕЕддсадс	сЕддддЕсаа	дддасЕсЕдд	ЕсасадЕсЕс	д	351

<210> 21 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <400> 21

саддгдсадс	гдсаддадгс	Еддассдддд	сЕЕдЕсаадс	сЕадЕдадас	ссЕдадссЕс	60
ассСдСассд	ЕдадсддсЕ Е	садсЕсЕасс	ааЕЕассаЕд	ЕдсасЕддаЕ	ЕсдЕсадсса	120
ссЕдддаадд	дссЕддадЕд	даЕдддЕдЕЕ	аергддддсд	асддсдагас	аЕссЕасаас	180
ЕссдЕссЕда	ададссдЕдЕ	сассаЕЕЕсс	сдЕдасассЕ	сааадааЕса	адЕЕ ЕсссЕс	240
аадЕЕдадсЕ	сЕдЕсассдс	адсддасаса	дсадЕсЕаЕЕ	асЕдЕдсасд	ЕсааСЕдасС	300
сасЕаЕЕасд	ЕЕЕЕддсадс	СЕддддгсаа	дддасЕсЕдд	ЕсасадЕсЕс	д	351

<210> 22 <211> 351 <212> ДНК

- 67 019636 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности; синтетический полинуклеотид <400> 22

даддСдсадс	ТддЬсдадсс	еддаддсддд	сССдСссадс	сТддСдддад	ссСдсдСсСс	60
СсССдТдсад	ОдадсддсТС	садсТсТасс	ааТгассагд	тдсастдддг	дсдссаддса	120
сс^дддаадд	дссЪддадСд	даЬдддТдЕЬ	аСССддддсд	асддсдаСас	аТссЬасаас	180
сссдсссида	ададссдТТО	сассаТТГсс	сдСдасассС	сааадааСас	сдС £ЬассСс	240
садаСдаасС	сСсЬссдсдс	ададдасаса	дсадСс£а£1:	ассдсдсасд	с.саасСдасс	300
сасТаТТасд	ССССддсадс	сСддддСсаа	дддасЛсТдд	ЬсасадСсИс	д	351

<210> 23 <211> 663 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <400> 23

даддД-Ьсадс	ЬддСсдадСс	Сддаддсддд сЬТдСссадс	сТддТдддад	ссТдсдСсТс	60
ДсССдСдсад	СдадеддсТГ	садсссгасс	аассассагд	С.дсассддд£	дсдСсаддса	120
ссгдддаадд	дсс^ддад^д	даЬдддСдТТ	аСССддддсд	асддсдаСас	аСссТасаас	180
ТссдсссСда	адздссдС ы:	сассаТССсс	сдСдасассС	сааадааСас	сдООСасссс	240
садаСдаасс	сСсТссдсдс	ададдасаса	д с а д Т с Д а С Ь	астдтдсасд	СсаасСдасс	300
сасиаг Саед	сссиддсадс	ссддддЬсаа	дддасСсСдд	ТсасадТсСс	дадсдсССсС	360
асааадддсс	са^сддСсС!;	сессссддса	ссссссСсса	ададсассСс	Сдддддсаса	420
дсддссосдд	досдсоеддс	сааддассас	ССссссдаас	сддТдасддС.	дГсдСддаас	480
ссаддсдссс	Тдассадсдд	сдСдсасасс	ССсссддсСд	СсстасадЬс	сесаддасЬе	540
сасТсссгса	дсадсдЬддЬ	дассдСдссс	СссадсадсЬ	Сдддсассса	дассСасаСс	600
сдсаасдСда	аСсасаадсс	садсаасасс	ааддссдаса	адааадСЛда	дсссааассЬ	660
еде						663

<210 24 <211> 687 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид

- 68 019636 <400> 24

даддССсадс	ЬддЬсдадгс	Гддаддсддд	сСЬдСссадс	сСддкдддад	ссСдсдосгс	60
ГсЫздЬдсад	ГдадсддсИ	садсГсСасс	ааььассасд	ГдсасСдддГ	дсдСсаддса	120
ссЬдддаадд	дссБддадСд	даГдддсдсе	аГССддддсд	асддсдагас	аСссБасаас	180
СссдГссЬда	ададссдгсс	сассаСЛДсс	сдбдасассГ	сааадаасас	сдпсгассьс	240
садагдаасс.	сСсиссдсдс	ададдасаса	дсадЬсГаСС	аскдгдсасд	Ссаассдасс	300
сассабЪасд	гссгддсадс	сбддддьсаа	дддасЬсСдд	ГсасадБсСс	дадсдс^С-СГ	360
асааадддсс	саЬсддСсГ!	сссссСддса	ссс<:ссгсса	ададсассБс	Гдддддсаса	420
дсддссскдд	дсЬдссСддС	сааддасГас	ЬГссссдаас	сддбдасддс	дгсдгддаас	480
Ссаддсдссс	Гдассадсдд	сдСдсасасс	ЬГсссддсБд	ГссГасадС-с	с^саддас1с	540
гасссссЕса	дсадсдГдд!	дассдГдссс	гссадсадсг.	гдддсассса	дассГасаЬс	600
сдсаасдЬда	ассасаадсс	садсаасасс	ааддссдаса	адааадсгда	дсссаааЬсд	660
СдБдасаааа	сСсасасаСд	сдссдсд				687

<210> 2Ъ <211> 384 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид

<400> 25 аГдааааада	садсСабсдс	ааСБдсадЬд	дссГСддсГд	дсгосдссас	сдСадсдсаа	60
дсбдаБабсс	адаГдассса	дад£ссаадс	адгсСссссд	ссадсдСадд	сдассдбдЬд	120
ассассассс	дСсдтдссад	ЬдаддассСс	ГаГГасаасс	ЬддссГддСа	БсадсдСааа	180
ссдддсааад	ссссдаадсг	дссеабссас	дабасдСасс	дсссддсбда	сддГд1;дсса	240
адссдг.ССса	доддсадсдд	садсддиасс	дасСасассс	СсасааЬГЁс	дБсГсБссад	300
ссддаадаГС	БсдссСсСба	ска 1ЬдДсад	сааЪаЬЬаса	адГЬсссБСО	сассе^сддс	360
садддсасба	аадСадаааЬ	сааа				384

<210> 26 <211> 726 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22 0>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <400> 26 асдаадаада сСдсбаБадс ааГСдсадОд дсдсГадсЬд дССГсдссас сдГддсдсаа 60 дсбдаддгОс адсГддИсда дОссддаддс дддсбс.дс.сс адссбддсдд дадссЬдсдЪ 120

- 69 019636

СЕсЕсИдСд	садСдадсдд	скЕсадсЬсс.	ассааСсасс	аьдьдсасбд	ддЬдсдЬсад	180
дсассСддда	адддсеГдда	дкддаСддд£	дСЛаСЛСддд	дсдасддсда	Еасасоссас	240
аасгссдгсс	Сдаададссд	ссссассаЧ;	ЬсссдСдаса	ссксааадаа	^ассдбсЪас	300
сЕссада Еда	асЕсЕсЕссд	сдсададдас	асадсадСсС	аСГасГдСдс	асдСсаасЬд	360
асссас^аее	асдкЕЕЕ.ддс	адссЬддддк	саадддасЕс	ТддЪсасад!;	сгсдадсдсс	420
СсЕасааадд	дсссагсддг	сЕЕсссссгд	дсасосЪссЬ	ссаададсас	сГсСдддддс	480
асадсддссс	ГдддсГдссС	ддЬсааддас	•Еас^гссссд	аассддгдас	ддгдгсдсдд	540
аасСсаддсд	сссЬдассад	сддсдЪдсас	ассСЛсссдд	сГд^ссбаса	д^ссГсадда	600
ссссасЪссс	ссадсадсдс.	ддсдассдтд	сссСосадса	дсГГдддсас	ссадассГас	660
аЬсЬдсаасд	ЬдааСсасаа	дсссадсаас	ассааддгсд	асаадааадЬ	Сдадсссааа	720

ЬсЬГд!: 726 <210> 27 <211> 750 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид

<400> 27
аедаадаада	спдссагадс	ааССдсад^д	дсдсСадскд	дГЬЬсдссас	сдСддсдсаа	60
дсгдаддГСс	адсЕдд^сда	дСсГддаддс	дддсСЕдксс	адссЕддГдд	дадссЬдсдЬ	120
с ЬсСсЕ. ί д 5 д	садЬдадсдд	скксадсСсГ	аосаассаес	а^дЬдсасЪд	ддедсдГсад	180
дсассгддда	адддссгдда	дсддасдддг	дссаггсддд	дсдасддсда	^асагссгас	240
аас^ссдЕсс	(здаададссд	ьъъсассагх	ссосдсдаса	ссгсааадаа	гассдсъеас	300
сСссадаГда	асссгсгссд	сдсададдас	асадсадСсс	аГ&аскдСдс	асдСсааскд	360
асссасГаП:	асдГкССддс	адссСддддЬ	саадддасСс	ЪддЕсасад£	сЕсдадсдсб	420
Сс^асааадд	дсссагсддг	сГСссссстд	дсасссСссГ	ссаададсас	сЬсЕдддддс	480
асадсддссс	СдддсС.дссЕ.	ддСсааддас	5асГЬссссд	аассддСдас	ддГдЬсдГдд	540
аасГсаддсд	сссЬдассад	сддсдЕдсас	ассЬГсссдд	сГдСсскаса	дкссСсадда	600
сЕсгасгссс	^садсадсдс	ддьдассдсд	сссЕссадса	дсссдддсас	ссадассСас	660
ассгдсаасд	Сдаассасаа	дсссадсаас	ассааддЕсд	асаадааадГ	1:дадсссааа	720
ЕсЕЕдЕдаса	аааСЕсасао	аьдсдссдсд				750

<210> 28 <211> 1438 <212> ДНК

- 70 019636 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид

<400> 28 аРдааааада	садсрассдс	ааррдсадрд	дссррддсрд	дРЬРсдсРас	сдсадсдсаа	60
дсРдагаЬсс	адаРдассса	дадРссаадс	адрсрсрссд	ссадсдрадд	сдаСсдрдрд	120
асРаЬЬассР	дРсдрдссад	Рдаддасссс	РаРРасаасс	рддссрддра	РсадсдРааа	180
ссдддсааад	ссссдаадсЬ	дсрсассбар	даРасдсасс	дссрддсРда	сддрдрдсса	240
адссдЬЬЬса	дЬддсадЬдд	садсддРасР	дасЬаЬассс	ЬсасааРЬрс	дЬсРсРссад	300
ссддаадаСР	ссдссрсрра	сРаььдссад	саараЬЬаса	адррсссррр	сассРРсддР	360
садддсасЬа	аадСадаааЬ	сааасдСасд	драдсддссс	саРсгдСссс	саоссссссд	420
ссарсгдард	адсадррдаа	аСсРддаасР	дссрсрдррд	сдрдсссдсь	даараассрс	480
РаРсссадад	аддссааадр	асадрддаад	дрддаРаасд	сссрссаарс	дддгаасгсс	540
саддададсд	Рсасададса	ддасадсаад	дасадсасср	асадссРсад	садсасссод	600
асдсодадса	аадсадасса	сдадааасас	ааадрсРасд	ссрдсдаадр	сасссаРсад	660
ддссЬдадсР	сассадЬаас	ааааадРРРР	ааРададддд	адРдРРаааа	Рдаадаадас	720
сдсРаЬадса	аРРдсадРдд	сдсрадсьдд	ЪРЬсдссасс	дрддсдсаад	сРдаддРРса	780
дсЬддЬсдад	РсРддаддсд	ддсРРдРсса	дссРддРддд	адссьдсдбс	рсрсрсдрдс	840
адЬдадсддС	ЬРсадсРСРа	ссаасгасса	РдРдсасРдд	дрдсдрсадд	сасссдддаа	900
дддсссддад	рддардддрд	рраргсдддд	сдасддсдаР	асарссраса	асРссдСссР	960
даададссдс	ЬРсассаРРР	сссдрдасас	сРсааадаас	ассдРРРасс	РссадаЬдаа	1020
сЬсЬсЬссдс	дсададдаса	садсадРсРа	ррасрдрдса	сдьсаасгда	сосассасра	1080
сдРЬЬРддса	дссРддддРс	аадддаоссс.	ддроасадрс	ьсдадсдсРР	соасаааддд	1140
сссаьсддгс	ррсссссрдд	сасссьссьс	саададсасс	рсрдддддса	садсддссср	1200
дддсрдссрд	дрсааддаср	ассрссссда	ассддрдасд	дрдссдрдда	асосаддсдс	1260
ссРдассадс	ддсдсдсаса	сссрсссддс	сдРссЬасад	РссРсаддас	ЬсРасРсссР	1320
садсадсдрд	дрдассдрдс	ссЬссадсад	сРЬдддсасс	садассРаса	РсРдсаасдР	1380
дааРсасаад	сссадсааса	ссааддЬСда	саадааадрр	дадоссааар	ссрдоСаа	1438

<210> 29 <211> 117 <212> РНТ <213> КаРРиз зр.

<400> 29

С1.П Уа1 С1п Ьеи Ьуа С1и $ег С1у Рго С1у Ьеи Уа1 С51п Рго 5ег С1и

10 15

- 71 019636

ТЬГ

Ьеи

Зег Ьеи 20

Ткг Суз

ТЬг Уа!

Зег С1у 25

Рке

Зег

Зег

Ткг 30

Азп

Туг

Н13

νβΐ

Н13

Тгр

Уа1

Агд

С1п

Рго

Рго

С1у

Ьуз

Зег

Ьеи

С1и

Тгр

Мек

35

40

45

<31у

Уа1

Не

Тгр

□1у

Азр

С1у

Азр

Ткг

Зег

Туг

Азп

Зег

Уа1

Ьеи

Ьуз

50

55

60

Зег

Агд

Ьеи

Зег

Не

Ткг

Агд

Азр

Ткг

Зег

Агд

Зег

С1п

Уа1

Рке

Ьеи

65

70

75

80

Ьуз

МеГ

Зег

Зег

Ьеи

С1п

Ткг

С1и

Азр

Ткг

А1а

Ткг

Туг

Туг

Суз

А1а

85

90

95

Агд

С1п

Ьеи

ТНг

Н13

Туг

Туг

Уа1

ьеи

А1а

А1а

Тгр

С1у

С1П

С1у

А1а

100

105

110

Зег

Уа!

ТНг

Уа!

Зег

115 <210> 30 <211> 107 <212> РНТ <213> КаЬЬиз зр

<400> 30

А1а

Зег 10

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Ьеи 15

С1у

Азр 1

Не

С1п

МеО

ткг 5

С1п

Зег

Рго

С1и

ТНг

Уа1

Ткг

Уа1

С1и

Суз

Агд

А1а

Зег

С1и

Азр

Ьеи

Туг

Туг

Азп

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

Агд

Ьуз

Рго

С1у

Азп

Зег

Рго

С1п

Ьеи

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

Азр

Ткг

Туг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РНе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

О1у

Ткг

С1п

Туг

Зег

Ьеи

Ьуз

Не

Азп

ТЬг

Ьеи

Рго

Зег

65

70

75

80

С1у

Азр

Уа1

А1а

Зег

Туг

РНе

Суз

С1п

С1п

Туг

Туг

Ьуз

Рке

Рго

Рке

85

90

95

Ткг

Рке

С1у

зег

С1у

ТНг

Ьуз

Ьеи

С1и

Ьеи

Ьуз

100

105

- 72 019636 <210> 31 <2и> 321 <212> ДНК <213> Ваксиз зр.

<400> 31

дасакссада	Бдасасад^с	сссадсИксс	сидьседсас	сксСдддада	аасСдксасс	60
дгсдаа^дьс	дадсаадкда	ддасскккас	СакаакССад	сдкддЬасса	дсддааасса	120
дддаасСскс	сЬсаассссс.	дакссаидаГ	асакагаддс	Сддсадасдд	ддксссасса	180
сддкксадсд	дсадСдддСс	Гддсасасад	саскссссаа	адакааасас	сскдссаксС.	240
ддадасдксд	саадсс-агсс.	скдСсааеад	каССасааак	Ькссакксас	дкСсддсСса	300
дддассаадс	СддаасЬдаа	а				321

<210> 32 <211> 351 <212> ДНК <213> Езьсиз зр.

<400> 32

саддсдсадс	СдааддадСс	аддасссддс	сСддкдсадс	ссссададас	сссдксксСс	60
ассИдсаскд	ссссе.дддсг	сксассаасс	ааккаксасд	СдсасСдддС	Ссдасадсск	120
ссаддааааа	дееккдадкд	дакдддадка	акачддддкд	акддадасас	а с с а к а С а а к	180
С.садС Секса	ааСсссдаск	дадсаСсасс	адддасассС	ссаддадсса	адссккссга	240
аааакдадса	дЬсСдсааас	ддаддасаск	дссасскасс	аССдЪдссад	дсааккдаСС	300
сассассакд	исскддскдс	ссддддссаа	ддадссссад	ссасСдЬскс	д	351

<210> 33 <211> 361 <212> ДНК <213> ВакСиз зр.

<400> 33 асдддсдкдс ссасксаСсс	сссддддссд	ссдскассдс	ддассасада	сдссасакдс	60
дасакссада	кдасасадкс	сссадссссс	скдкскдсаб	сксСдддада	аассдксасс	120
дСсдаакдкс	дадсаадкда	ддасскккас	какааккЬад	едбддеакса	дсддааасса	180
дддаасЬсСс	сксааскссС	дакскакдак	асакаЬаддк	кддсадакдд	ддксссакса	240
сддиссадкд	деадкдддке	сддсасасад	СаССсСскаа	адакааасас	сскдссакск	300
ддадакдбед	саадбкасск	седьсаасад	с.аскасааас	скссасссас	дкксддскса	360
дддассаадс	кддааеСдаа	а				381

<210> 34 <211> 408 <212> ДНК <213> ВабСиз зр.

- 73 019636 <т> 34

аЬддсРдРсс	РддРдсРдРР	дсРсРдссРд	аСдасаРРРс	саадсгдрдр	ссрдрсссад	60
дРдсадсСда	аддадОсадд	ассрддссРд	дрдсадсссР	сададассср	дрсРсРсасс	120
РдсасРдЬсЬ	срдддр СсРс	аРсаассааР	РаРсаРдРдс	асрдддррсд	асадссрсса	180
ддааааадрс	рРдадРддаР	дддадраага	рддддрдард	дадасасаРс	аРаРааРРса	240
дРРсРсаааР	сссдасРдад	сарсассадд	дасассРсса	ддадссаадр	рррсрсаааа	300
аРдадсадРс	рдсааасдда	ддасасРдсс	ассРасРаРР	дрдссаддса	аррдасрсар	360
РасРаРдРСс	РддсРдссРд	дддрсаадда	дсрРсадРса	сЬдссРсд		408

<210> 35 <211> 107 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 35

Азр 1

Не

С1п

МеР

ТЬг 5

СЬп

Зег

Рго

Зег

Зег 10

Ьеи

Зег

АЬа

Зег

УаЬ 15

СЬу

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Агд

АЬа

Зег

СЬп

Зег

Не

Зег

Зег

Туг

20

25

30

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

СЬп

СЬп

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

АЬа

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

А1а

А1а

Зег

Зег

Ьеи

СЬп

Зег

СЬу

УаЬ

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

СЬу

50

55

60

зег

31у

Зег

СЬу

ТЬг

Аэр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьеи

СЬп

Рго

65

70

75

80

31и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

СЬп

СЬп

Зег

Туг

Зег

ТЬг

Рго

Тгр

85

90

95

ТЬг

РЬе

С1у

СЬп

СЬу

ТЬг

Ьуз

УаЬ

СЬи

1Ье

Ьуз

100

105

<210> 36 <211> 321 <212> ДНК <213> Ното заргепз <400 36

даоасссада	рдасссадрс	РссаРссРсс	сьдрсрдсар	срдсаддада	сададрсасс	60
аРсасРРдос	дддсаадрса	дадсаРРадс	адсгаРРРаа	аррддрарса	дсадааасса	120
дддааадссс	сРаадсРссР	дарсрардср	дсарссадрр	рдсааадрдд	ддрсссаРса	190
аддРРсадид	дсадрддарс	рдддасадаР	РРсасРсРса	ссаРсадсад	ьсрдсаасст	240

- 74 019636 даадаРРРРд саасРРасРа сРдРсаасад адбрасадра

300

321

РддаааСсаа а дддассаадд

<210 >	зэ
<211 >	111
<212/	РРТ
<213>	Ното	заргепз
<400>	37
С1и Уа1 С1п	Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

С1у

РНе

ТНг

Уа1

Зег

Зег

Азп туг

Мег.

Зег тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

ЬуЗ

С1у

Ьеи

Уа1

Зег

Уа1

11е

Туг

Зег

С1у

С1у

Зег

ТНг

Туг

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

Ьуз

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

Пе

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

Ьеи

С1п

МеР

Азп

Зег

Ьеи

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

А1а

Агд

Туг

РЬе

Азр

100

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

105

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

110

Зег <210>

<211>

<212>

<213>

333

ДНК

Ното заргепз <400>

даддрдсадс	РддСддадРс	Рдддддаддс	СрддСссадс	срддддддрс	ссРдадасРс	60
РссРдРдсад	ссСсРддарр	сассдСсадР	адсаасРаса	рдадсрдддр	ссдссаддсР	120
ссадддаадд	ддсСддадЬд	ддбсрсадрр	аРРРаРадсд	дрддрадсас	аРзсРасдса	180
дасРссдРда	адддсадаРС	сассаРсРсс	ададасааРР	ссаадаасао	дсСдРарсРС	240
саааРдааса	дссРдададс	сдаддасасд	дсрдрдрарр	асрдрдсдад	арассррдас	300
СасГддддсс	адддаасссР	ддРсассдРс	Ссс			333

<210>

<211 >

<212>

<21 3>

111

РРТ

Ното заргепз

- 75 019636 <400> 39

С1п 1

Уа1

С1п

Ьеи С1п С1и 5

Зег

С1у

Рго С1у 10

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

Зег 15

С1и

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

νβΐ

Зег

С1у

С1у

Зег

11е

Зег

Зег

Туг

20

25

30

Туг

Тгр

Зег

Тгр

Не

Агд

С1п

Рго

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1ц

Тгр

Не

35

40

45

С1у

Туг

Не

Туг

Туг

Зег

С1у

Зег

ТЬг

Азп

Туг

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьуз

50

55

60

Зег

Агд

Уа1

ТЫ

Не

Зег

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

АЗП

01п

РЬе

Зег

Ьеи

65

70

75

80

Ьуз

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

А1а

Азр

ТНг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

85

90

95

Агд

Туг

РЬе

Азр

Туг

тгр

С1у

С1П

С1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

100

105

110

<210> 40 <211> 333 <212> ДНК <213> Ногпо зар1епз <400> 40

саддсдсадс	гдсаддадНс	дддсссадда	сЬддсдаадс	сЫсддадас	ссГдСсссйс	60
асссдсасбд	бсгстддсдд	сЬссаЬсадЬ		ддадсЬдда!:	ссддсадссс	120
ссадддаадд	дасбддадьд	даггдддгас	ассеаыаса	дтдддадсас	саасбасаас	180
сссгсссгса	ададгсдадб	сассабаЬса	д^адасасдб	ссаадаасса	дЫсЬсссЬд	240
аадсЬдадсЪ	сНдГдассдс	Ьдсддасасд	дссдбдГаЬ 5	асбдбдсдад	абасЬЫдас	300
ЬасЬддддсс	адддаасссГ	ддЬсассдТс	Ьсс			333

<210> 41 <211> 1459 <212> ДНК <21 3> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <400> 41

асдааааада садстаНсдс	ааЬЬдсадСд	дссЬЬддсбд	дСНгсдсбас	сдЬадсдсаа	60
дссдасассс	адаГдассса	дадЬссаадс	адгсбсСссд	ссадсдиадд	сдассдьдсд	120
асЬаЬСассЬ	дЬсдсдссад	ГдаддассСс	ЬаЫасаасс	ГддссЬддка	ГсадсдЬааа	180

- 76 019636

ссдддсааад	ссссдаадср	дсРсаРсРар	даРасдРасс	дссрддсрда	сддгдрдсса	240
адссдРРРса	дрддсадрдд	садсддРасР	дасРаРассс	РсасаагрРс	дрсрсрссад	300
ссддаадаРЕ	Ьсдссрсрга	ссаррдреад	сааРаРРаса	адСРсссРРР	сассРРсддР	360
садддсасРа	аадрадаааг	сааасдрасд	драдоддссс	саРсРдРсРО	саРсРРсссд	420
ссассрдард	адсадСРдаа	аРСРддаасР	дссгсрдррд	рдрдсердср	дааРаасРРс	480
РаРсссадад	аддссааадН	асадгддаад	дрддараасд	сссРссааРс	дддРаасРсс	540
саддададрд	Рсасададса	ддасадсаад	дасадсассР	асадссРсад	садсассоРд	600
асдсРдадса	аадсадасРа	сдадааасас	ааадрсрасд	ссрдсдаадр	сасссарсад	660
ддссбдадсб	сассадбаас	ааааадРРРР	ааРададддд	адсдрраааа	рдаадаадас	720
СдсРабадса	аРРдсадРдд	сдсРадсбдд	РРРсдссасс	дрддсдсаад	слдаддррса	780
дсбддРсдад	РсРддаддсд	ддсРРдРсса	дссРддРддд	адссРдсдРс	РсСсРРдгдс	840
адрдадсддс	РРсадсРсРа	ссааррасса	рдрдсасрдд	дрдсдРсадд	сассРдддаа	900
дддссРддад	рддардддрд	РРаРРРдддд	сдасддсдаР	асарссраса	асрссдрсср	960
даададссдр	ррсассаррр	сссдСдасас	сЕсааадаас	ассдРРсасс	РссадаРдаа	1020
сРсРсРссдс	дсададдаса	садсадРсРа	ррасрдрдса	сдрсаасрда	сссасРаРРа	1080
сдррргддса	дссрддддбс	аадддасРсР	ддРсасадРс	РсдадсдсРО	сРасаааддд	1140
сссаРсддсс	ррссссссдд	сасссРссРс	саададсасс	РсРдддддса	садсддсссР	1200
дддсбдссРд	дрсааддаср	асРРссссда	ассддРдасд	дрдрсдрдда	аерсаддодс	1260
ссрдассадс	ддсдрдсаса	ссснсссддс	рдрссрасад	рсстсаддас	РсРасРсссР	1320
садсадсдбд	дрдассдрдс	ссРссадсад	сррдддсасс	садассраса	рссдсаасдР	1380
дааРсасаад	сссадсааса	ссааддрсда	саадааадРР	дадсссаааР	сР РдРдасаа	1440
аасРсасаса	Рдсдссдсд					1459

<210> 42 <211> 10 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности; синтетический пептид <400> 42

С1у РЬе ТНг РЬе 5ег Азр Туг Туг Мер А1а

5 10 <210> 43 <211> 17 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

- 77 019636 <223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 43

Зег 11е Зег Туг С1и С1у Зег Зег ТЬг Туг Туг С1у Азр Зег Уа1 Ьуз 1 - - 10

С1у <2 10>

<2 11>

<212>

<2 13>

и

РКТ

Искусственная последовательность <220>

<223>

Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид < 4 00>

ΗΪ3 Азр Азр Зег Рго С1у Туг Туг РЬе Азр Туг

10 <210>

<2 11>

<212>

<213>

РКТ

Искусственная последовательность <220>

<223>

Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид <400> 45

Ьеи А1а С1у С1и Азр Не Зег Азп Уа1 Ьеи А1а 1 ' <210>

<211 >

<212>

<2 13 >

РЕТ

Искусственная последовательность <220>

<223>

Описание искусственной последовательности:

синтетический <4 00>

А1а А1а Азп Агд Ьеи С1п Азр 1 <210>

<211>

<212>

<213>

РКТ

Искусственная последовательность <220>

<223>

Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид

- 78 019636 <211> 10 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 48

С1у Рйе Зег Ьеи ТНг Зег Н13 Н1з Не Зег

10 <210> 49 <211> 16 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 49

Уа1 МеЬ Тгр Азп Азр С1у С1у ТЬг Ьеи Туг Азп Зег А1а Ьеи Ьуз Зег 15 10 15

РКТ

Искусственная последовательность <220>

<223>

Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид

<211>

РКТ усственная последовательность <220>

<22

Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид

<213>

РНТ кусственная последовательность

<220>

<22 3>

Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид <400> 52

Азр ТОг Азп Агд Ьеи А1а Азр

5

- 79 019636 <210> 53 <211> 9 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400 53

61п Η15 Туг Зег Азп РЬе Рго Тгр ТЬг

5 <210 54 <211> 107 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности; синтетический полипептид <400 54

Азр 1

11е

61п

Мег

ТЬг 5

61п

Зег

Рго ТЬг

Зег Ьеи 10

Зег

А1а

Зег

Ьеи 15

СТу

31н

ТЬг

УаТ

Зег

Не

СТи

Суз

Ьеи

АТа

СТу

СТи

Азр

Пе

Зег

Азп

УаТ

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

СТп

С1п

Ьуз

Зег

СТу

61у

Зег

Рго

С1п

Ьец

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

АТ а

АТа

Азп

Агд

Ьеи

СТп

Азр

СТу

УаТ

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

СТу

50

55

60

Зег

СТу

Зег

61у

ТЬг

Агд

Туг

Зег

Ьеи

Ьуз

Пе

Зег

61у

Мес

Агд

Рго

65

70

75

30

61ц

Азр

СТи

АТа

Азр

Туг

РЬе

Суз

СТп

61П

ТЬг

РЬе

Агд

Туг

Рго

Ьеи

85

90

95

ТЬг

РЬе

СТу

Зег

СТу

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

Ьеи

Ьуз

100

105

<210> 55 <211> 321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <400> 55 дасаСссада ЬдасасадСс ЬссаасЬЬсс сСдЬсСдсаС сСсСсддада аасСдСсСсс 60 ассдааьдсс садсаддсда адасаСССсс аагдьссг.ад сдсддсатса дсадаадсса 120

- 80 019636

ддддддЕстс	сЕсадсЕссЕ	дасссаЕдсг	дсааасаддЕ	сасаадасдд	ддСссссЕса	180
сддЕСсадЕд	дсадЕддаЕс	гддсасасдд	ЕаЕЕСЕСЕса	адаЕсадЕдд	сагдсдассс	240
даадаЕдаад	садаЕЕаЕЕЕ	сЕдтсаасад	асЕЕЕсаддЕ	аЕссдсЕсас	дСЕсддЕСсг	300
дддассаадс	ЕддааЕСдаа	а				321

<210>	5 6
<211 >	119
<212>	РРТ
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 56

С1и Уа1 1

Рго Деи

Уа1 5

С1и

Зег

С1у

С1у С1у Деи 10

Уа! 21п

Рго

61у 15

Агд

Зег

меЕ

1>у5

Деи

Зег

Суз

Уа!

А1а

Зег

С1у

РНе

ТНг

РНе

Зег

Азр

Туг

20

25

30

Туг

МеЕ

А1а

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

Дуз

Дуз

С1у

Деи

С1и

Тгр

Уа!

35

40

45

А1а

Зег

11е

Зег

Туг

С1и

С1у

Зег

Зег

ТЬг

Туг

Туг

С1у

Авр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

С51у

Агд

РНе

ТЬг

Уа1

Зег

Агд

Авр

Не

А1а

ДуЗ

Зег

ТНг

Деи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

С1п

МеЕ

ΗΪ8

Зег

Деи

Дув

Зег

С1и

Азр

ТНг

А1а

Не

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Н13

АЗр

Азр

Зег

Рго

С1у

Туг

Туг

РНе

Азр

Туг

Тгр

С1у

61п

100

105

ПО

С1у Уа! МеЕ Уа1 ТИг Уа1 Зег

115 <210> 57 <211> 357 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <400> 57 даддЕдссдс ЕддЕддадЕс Едддддаддс ЕЕадЕдсадс сбддааддЕс саЕдааасЕЕ 60

- 81 019636

ЬссйдСдРад	ссЬсаддаЫ:	сасЬЬЬсадь	дасСаССаса	^ддссРдддч:	ссдссаддсЬ	120
ссааадаадд	десьддадсд	ддссдсассс	аЬЬадСЛаЬд	адддЬадЬад	ЬасЬ ЬасСаЬ	180
ддадасСссд	сдаадддссд	асьсассдес	СссададаТа	РГдсааааад	сасссГаЬас	240
сггсааайдс	асадЬсйдаа	дСсЬдаддаЬ	асддссаЬГГ	айсагьдьдс	асдасардас	300
даЬадЬссад	даЬасСасСС	СдаЫгаССдд	ддссааддад	^сарддгсас	адъс^сд	357

<210> 58 <211> 107 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 58

Азр 1

Не

С1п

Меб

ТЬг 5

С1п

Зег

Рго А1а

5ег 10

Ьеи Зег

А1а

Зег

Ьеи 15

С1у

С1и

ТЬг

Уа1

ТЬг

Не

С1и

Суз

Агд

ТЬг

Зег

<31и

Азр

11е

Туг

Зег

Азп

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

Агд

С1п

Агд

Рго

С1у

Ьуз

Зег

Рго

С1п

Ьеи

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

АЗР

ТЫ

Азп

Агд

Ьеи

А1а

АЗР

01 у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

С1п

Туг

Зег

Ьеи

Ьуз

11е

АЗп

Зег

Ьеи

С1п

Зег

65

то

75

80

б1и

Авр

Уа1

А1а

Зег

Туг

РЬе

Суз

С1п

Ηίε

Туг

Зег

АЗП

РНе

Рго

Тгр

85

90

95

ТЬг

РЬе

О1у

С1у

АЗр

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

Ьеи

Ьуз

100

105

<210> 59 <211> 321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид

<400> 59 дасаГссада	ьдасасадс.0	Рссддсоосс	ссдссрдсаи	сгссдддада	аасЦдТсасс	60
аГсдаабдЬс	даасаадСда	ддасаССЛас	ад'Ьаасн ад	сдйддйагсд	дсададасса	120
дддаадтссс	сбсадсбссС	даЬсбакдаЬ	асааасадай	ГддсГдаСдд	ддрсссдбса	180

- 82 019636

сддЕЕсадГд	дсадСддаСС	Еддсасасаа	ЕаЕЕсЕсЕаа	адаЕааасад	ссЕдсааЕсЕ	240
даадаЕдЕсд	ссадсЕаЕЕЕ	сЕдЕсаасас	ЕаЕадсааЕЕ	ЕЕссдЕддас	сЕЕсддЕдда	300
дасассаадс	ЕддааЕЕдаа	а				321
<210>	60
<211 >	117
<212>	РКТ
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид <400> 60

61п 1

Уа1

С1п

Ьеи

ТЬг 5

С1и

Зег

С1у

Рго

С1у 10

Ьеи

Уа1

С1п

Рго

Зег 15

С1п

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТНг

Суз

ТЬг

Уа1

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

Н13

20

25

30

Н15

Не

Зег

Тгр

Уа1

Агд

С1п

Рго

РГО

СХу

Ьуз

СХу

Ьеи

С1и

Тгр

Уа1

35

40

45

С1у

Уа1

МеЕ

Тгр

Азп

Азр

С1у

С1у

ТЬг

Ьеи

Туг

Азп

Зег

А1а

Ьеи

Ьуз

50

55

60

Зег

Агд

Рго

Зег

11е

Зег

Агд

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Зег

СХп

Уа1

РЬе

Ьеи

65

70

75

80

Ьуз

МеЕ

Зег

Зег

Ьеи

С1п

ТЬг

С1и

Азр

ТЬг

АХа

ТЬг

Туг

Туг

Суз

АХа

85

90

95

Агд

С1у

Ьуз

МеЕ

Н1з

Туг

Туг

Уа1

Ьеи

АЗр

А1а

Тгр

С1у

С1п

С1у

А1а

100

105

но

Зег Уа1 ТЬг νβΐ Зег

115 <210> 61 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <400> 61 саддЕдсадс ЕдасддадЕс адддссЕддс сЕддЕдсадс ссгсасадас ссЕдЕсЕсЕс 60 асссдсасЕд ссЕсЕдддЕЕ сЕсаЕЕаасс адссаЕсаЕа ЕаЕссЕдддЕ ЕсдасадссЕ 120

- 83 019636

ссаддаааад	дЕсЕддадЕд	ддЬдддадЬс	аЕдЕддаагд	аЕддаддсас	ассаЕаЕааЕ	180
ЕсадсЕсЕса	адЕсЕсдасс	дадсаЕсадЕ	адддасассЕ	ссаададсса	ддССЕЕСЕЕа	240
ааааЕдадса	дЕсЕдсааас	Едаадасаса	дссасЕЕасЕ	асЕдЕдссад	дддсааааЕд	300
саЕЕасЕаЕд	ЕЕсЕддаЕдс	сЕддддЕсаа	ддадсЕЕсад	ЕсасЕдЕсЕс	9	351

<210> 62 <211> 238 <212> РНТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности; синтетический полипептид <400> 62

МеЕ 1

С1и

ТИг Азр

ТНг 5

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Тгр Уа1 10

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Тгр

Уа1 15

Рго

51у

Зег

ТИг

С1у

Азр

Не

Уа1

Ьеи

ТИг

С1П

Зег

Рго

А1а

ТИг

Ьеи

Зег

20

25

30

Уа1

Зег

Рго

С1у

С1и

Агд

А1а

ТЬг

Не

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

С1п

Агд

35

40

45

Уа1

Зег

Зег

Зег

ТИг

Туг

Зег

Туг

мес

Н13

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

50

55

60

С1у

01л

Рго

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Не

Ьуз

Туг

А1а

Зег

Азп

Ьеи

С1и

Зег

65

70

75

80

С1у

7а1

Рго

А1а

Агд

РНе

Зег

31у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТИг

Азр

РНе

ТНг

85

90

95

Ьеи

ТНг

11е

Зег

Зег

Уа1

С1и

Рго

С1и

Азр

РЬе

А1а

ТНг

Туг

Туг

Суз

100

105

но

С1п

Н13

Зес

Тгр

С1и

11е

Рго

Рго

ТИг

РНе

С1у

С1у

С1у

ТНг

Ьуз

Ьеи

115

120

125

С1и

Не

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа!

А1а

А1а

Рго

Зег

Уа1

РНе

Не

РЬе

Рго

Рго

130

135

140

Зег

Азр

С1и

О1п

Ьеи

Ьуз

Зег

С1у

ТИг

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

145

150

155

160

АЗП

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

С1и

А1а

Ьуз

Уа1

□1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

165

170

175

А1а

Ьеи

С1п

Зег

31у

Азп

Зег

С1П

61и

Зег

Уа1

ТНг

С1и

С1п

Азр

Зег

- 84 019636

180

185

190

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

ТЬг

Ьеи

ТНг

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

195

200

205

Азр

Туг

С1и

Ьуз

Н15

Ьуз

Уа1

Туг

А1а

Суз

С1и

Уа1

ТЬг

Н1з

С1 п

С1у

210

215

220

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

РНе

Азп

Агд

С1у

С1и

Суз

225

230

235

<210> 63 <211> 218 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 63

Азр 1

Пе

Уа1

Ьеи

ТЬг 5

01п

Зег

Рго

А1а

ТЬг 10

Ьеи

Зег

Уа1

Зег

Рго 15

С1у

С1и

Агд

А1а

ТЬг

11е

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

С1п

Агд

Уа1

Зег

Зег

Зег

20

25

30

ТЬг

Туг

Зег

Туг

МеЬ

Нхз

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

РГО

С1у

С1П

РГО

Рго

35

40

45

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

Ьуз

Туг

А1а

Зег

Азп

Ьеи

С1и

Зег

С1у

Уа1

Рго

А1а

50

55

60

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

31у

Зег

31у

ты

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

65

70

75

90

Зег

Уа1

С1и

Рго

С1и

А$р

₽Ье

А1а

ТЫ

Туг

Туг

Суз

С1П

Н13

Зег

Тгр

85

90

95

С1и

11е

Рго

Рго

ТЬг

РНе

С1у

С1у

01 у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

Не

Ьуз

Агд

100

105

110

ТЬг

7а1

А1а

А1а

Рго

Зег

Уа1

РЬе

11е

РЬе

Рго

Рго

Зег

АЗр

01и

ΰΐα

115

120

125

Ьеи

Ьуз

Зег

С1у

ТЬг

А1а

Зег

Уа1

7а1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг

130

135

140

РГО

Агд

С1и

А1а

Ьуз

Уа1

С1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Аэр

Азп

А1а

Ьеи

О1п

Зег

145

150

155

160

- 85 019636

С1у

АЗП

Зег

(31л

С1и 165

Зег

Уа1

ТЬг

С1и

С1п 170

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег 175

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

С1и

Ьуз

180

1Θ5

190

Н1 5

Ьуз

7а1

Туг

А1а

Суз

С1и

Уа1

ТЬг

ΗΪ5

С1п

С1у

Ьеи

8ет

Зег

Рго

195

200

205

Уа1

ТНг

Ьуз

Зег

РЬе

Азп

Агд

С1у

С1и

Суз

210

215

<210> 64 <211> 717 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <400 64

аЬддадасад	асасасСссС	дСЛакдддЬд	сЬдсСдсЬсС.	дддЬЬссадд	СЬссасЬддЬ	60
дасаССдЬас	СдасасадСс	СссЬдсЬасс	ОСаСсОдСаС.	сСссдддада	дадддссасс	120
аСсЬсаСдса	дддссадсса	асдЬдЬсадЬ	ЬсаЬсЬассС.	аЬадССаСаС	дсасСддСас	180
саасадааас	саддасадсс	асссаааскс	сссаЬсаадЬ	асдсадссаа	ссЬадаассЬ	240
ддддсссссд	ссаддсссад	тддсадтддд	ессдддасьд	ассгсасссЬ	сассаЬсс.сЬ	300
СсСдСддадс	сддаддаССС	ьдсаасаСаС	бассдосаде	асадссддда	дас СссСссд	3 60
асдС СсддСд	дадддасоаа	досддадасо	ааасдаассд	сддосдсасс	асссдссссс	420
аСсССессдс	са ί с Т д а ΐ д а	дсадссдааа	ОсОддаассд	сссссдслдс	дсдссбдсТд	480
аасаасссст	асссоадада	ддссааадба	садеддаадд	сддасаасдс	ссбссаассд	540
ддсаассссс	аддададсдс	сасададсад	дасадсаадд	асадсассТа	садссТсадс	600
адсасссСда	сдсСдадсаа	адсадасСас	дадааасаса	аадЬСЬасдс	сЬдсдаадС с	660
асссаСсадд	дссЬдадсЬс	дсссд^саса	аададсЬСса	асаддддада	дСдСЬад	717

<210> 65 <210 463 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 65

Мес Азр Тгр ТЬг Тгр Агд Уа1 РЬе Суз Ьеи Ьеи А1а Уа1 А1а Рго С1у

- 86 019636

10 15

АТа

Н15

Зег

С1п 20

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

С1п 25

Зег

С1у

АТа

СТи

Уа1 30

УаТ

Ьуз

Рго

С1у

АТа

Зег

Уа1

Ьуз

Ьеи

Зег

Су5

Ьуз

А1а

Зег

СТу

Туг

Не

Рке

35

40

45

ТЬг

Зег

Туг

Туг

МеЬ

Туг

Тгр

Уа1

Ьуз

□ 1п

А1а

Рго

С1у

СТп

С1у

Ьеи

50

55

60

С1и

Тгр

Не

СТу

СТи

Не

Азп

Рго

Зег

Азп

СТу

Азр

Ткг

Азп

РЬе

Азп

65

70

75

80

С1и

Ьуз

РЬе

Ьуз

Зег

Ьуз

АТа

Ткг

Ьеи

Ткг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

АТ а

Зег

85

90

95

ТНг

А1а

Туг

Мер

С1и

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

Агд

Зег

С1и

Азр

Ткг

А1а

Уа1

100

105

110

Туг

Туг

Суз

ТЬг

Агд

Зег

Азр

С1у

Агд

Азп

Азр

Мер

Авр

Зег

Тгр

31у

115

120

125

СТп

СТу

ткг

Ьеи

Уа1

Ткг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

ткг

Ьуз

С1у

РГО

Зег

130

135

140

Уа1

Рке

Рго

ьеи

А1а

Рго

Суз

Зег

Агд

Зег

Ткг

Зег

С1и

Зег

Ткг

АТа

145

150

155

1 60

АТа

Ьеи

С1 у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

Рке

Рго

СТи

Рго

Уа1

Ткг

Уа1

165

170

175

Зег

Тгр

Азп

5ег

С1у

А1а

Ьеи

Ткг

Зег

С1у

Уа1

Нгз

Ткг

Рке

Рго

АТа

180

185

190

Уа1

Ьеи

С1п

Зег

Зег

С1у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

5ег

УаТ

УаТ

Ткг

Уа1

195

200

205

Рго

Зег

Зег

Зег

Ьеи

СТу

Ткг

Ьуз

Ткг

Туг

Ткг

Суз

Азп

Уа1

Азр

Н15

210

215

220

Ьуз

Рго

Зег

Азп

Ткг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Агд

Уа1

СТи

Зег

Ьуз

Туг

СТу

225

230

235

240

Рго

Рго

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

АТа

Рго

СТи

Рке

Ьеи

СТу

СТу

Рго

Зег

245 250 255

- 87 019636

Уа1

РНе

Ьеи

РНе 260

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз 265

Азр

ТЬг

Ьеи

Мес

11е 270

Зег

Агд

ТИг

Рго

С1и

Уа1

ТИг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

С1п

С1и

Азр

Рго

275

280

285

С1и

Уа1

61п

РНе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

С1у

Уа1

С1и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

290

295

300

Ьуз

ТИг

Ьуз

Рго

Агд

С1и

С1и

ΰΐη

РНе

Азп

Зег

А1а

Туг

Агд

Уа1

Уа1

305

310

315

320

Зег

Уа1

Ьеи

ТИг

Уа1

Ьеи

Н15

С1п

Азр

ТГр

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

С1и

Туг

325

330

335

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

С1у

Ьеи

Рго

Зег

Зег

Не

С1и

Ьуз

ТИг

340

345

350

11е

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

С1п

Рго

Агд

61и

Рго

С1п

Уа1

Туг

ТНг

Ьеи

355

360

365

Рго

Рго

Зег

С1п

С1и

С1и

МеР

ТЬг

Ьуз

Азп

С1п

УаЬ

Зег

Ьеи

ТИг

Суз

370

375

390

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РНе

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

385

390

395

400

АЗП

С1у

С1п

Рго

61и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

405

410

415

Зег

Азр

<Яу

Зег

РЬе

РНе

Ьеи

Туг

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

420

425

430

Агд

Тгр

21п

С1и

С1у

Азп

Уа1

РНе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеС

Нгз

С1и

А1а

435

440

445

Ьеи

Н15

АзП

Н1 3

Туг

ТНг

С1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

С1у

450

455

460

<210> 66 <211> 444 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 66

С1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1п Зег С1у А1а С1и Уа1 Уа1 Ьуз Рго С1у А1а

10 15

- 88 019636

5ег

Уа!

Ьуз

Ьеи 20

Зег

Суз

Ьуз

АЬа

Зег 25

СЬу

Туг

Не

РЬе

ТЬг 30

Зег

Туг

Туг

Меб

Туг

Тгр

УаЬ

Ьуз

СЬп

АЬа

Рго

СЬу

С1п

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

1Ье

35

40

45

С1у

СЬи

Не

Азп

Рго

Зег

Азп

СЬу

Азр

ТЬг

Азп

РЬе

Азп

СЬи

Ьуз

РЬе

50

55

60

Ьуз

Бег

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

УаЬ

Агр

Ьуз

Зег

АЬа

Зег

ТЬг

АЬа

Туг

65

70

75

80

МеР

СЬи

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

Агд

Зег

СЬи

Азр

ТЬг

АЬа

УаЬ

Туг

Туг

Суз

85

90

95

ТЬг

Агд

Зег

Азр

СЬу

Агд

Азп

Азр

МеР

Азр

Зег

Тгр

СЬу

СЬп

СЬу

ТЬг

100

105

110

Ьеи

УаЬ

ТЬг

УаЬ

Зег

Зег

АЬа

Зег-

ТЬг

Ьуз

СЬу

Рго

Зег

УаЬ

РЬе

Рго

115

120

125

Ьеи

АЬа

Рго

Суз

Зег

Агд

Бег

ТЬг

Зег

С1и

Зег

ТЬг

АЬа

АЬа

Ьеи

СЬу

130

135

140

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

С1и

Рго

УаЬ

ТЬг

УаЬ

Зег

Тгр

Азп

145

150

155

160

Зег

СЬу

АЬа

Ьеи

ТЬг

Зег

СЬу

УаЬ

Н13

ТЬг

РЬе

Рго

АЬа

УаЬ

Ьеи

СЬп

165

170

175

Зег

Зег

СЬу

ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

УаЬ

УаЬ

ТЬг

УаЬ

Рго

Зег

Зег

180

185

190

Зег

Ьеи

СЬу

ТЬг

Ьуз

ТЬг

Туг

ТЬг

Суз

Азп

УаЬ

Азр

Н13

Ьуз

Рго

Зег

195

200

205

Азп

ТЬг

Ьуз

УаЬ

Азр

Ьуз

Агд

Уа1

СЬи

Зег

Ьуз

Туг

СЬу

Рго

Рго

Суз

210

215

220

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

СЬи

РЬе

Ьеи

СЬу

СЬу

Рго

Зег

УаЬ

РЬе

Ьеи

225

230

235

240

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Агр

ТЬг

Ьеи

Мер

Не

Зег

Агд

ТЬг

Рго

СЬи

245

250

255

Уа 1

ТЬг

Суз

Уа1

УаЬ

УаЬ

Азр

УаЬ

Зег

СЬп

СЬи

Азр

рго

СЬи

УаЬ

СЬп

260

2 65

270

- 89 019636

РЬе

Азп

Тгр 275

Туг

Уа1

Азр

С1у

Уа1 280

01 и

Уа1

Н15

Азп

А1а 285

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

С1и

Οΐυ

<31П

РЬе

Азп

Зег

А1а

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

290

295

300

ТЬг

Уа1

Ьеи

Н15

С1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

С1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

305

310

315

320

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

С1у

Ьеи

Рго

Зег

Зег

11е

Б1и

Ьуз

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

325

330

335

А1а

Ьуз

С1у

С1п

Рго

Агд

61и

Рго

С1п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

340

345

350

С1п

С1и

С1и

Ме!

ТЬг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

355

3 60

365

51у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

5ег

Азп

С1у

С1п

370

375

380

Рго

С1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

С1у

385

390

395

400

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

С1п

405

410

415

С1и

С1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

нес

Н13

С1и

А1а

Ьеи

Н13

Азп

420

425

430

Н15

Туг

ТЬг

С1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

С1у

435

440

<210> 67 <211> 1392 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <400> 67

асддаогдда	ссСддадддг	сССсЬдсСЬд	сЬддсСдСад	сассаддГдс	ссасГсссад	60
дЬссаасгдд	ГдсадГсадд	ддссдаадсд	дгдаадссгд	дддссссадС	даадГ СдСсс	120
СдсааддсСС.	сСддсГасаС	сССсассадЬ	ГаЬЬаЬаЬд!:	асСдддСдаа	дсаддсдссс	180
ддасааддсс	ссдадиддаг	сддададасс	аагссгадса	агддсдапас	гаасгСсааЬ	240

- 90 019636

дадаадРРса	ададРааддс	сасасодасР	драдасааар	ссдссадсас	адсаРасабд	300
дадсРсадса	дссрдаддрс	РдаддасасР	дсддРсРаРР	асРдРасаад	дрсддасддР	3 60
адааабдаса	РддасбссРд	дддссааддд	асссРддРса	ссдЬсРссРс	адсррссасс	420
аадддсссаС	ссдРсРРссс	ссРддсдссс	РдсРссадар	ссассбссда	дадсасадсс	480
дсссРдддсЬ	дссСддРсаа	ддассасРРс	сссдаассдд	СдасддСдСс	дрддаассса	540
ддсдсссРда	ссадсддсдр	дсасассСРс	ссддсрдрсс	РасадсссРс	аддасгсрас	600
рсссрсадса	дсдрддрдас	сдрдсссрсс	адсадсР рдд	дсасдаадас	сРасассРдс	660
аасдрадасс	асаадсссад	саасассаад	дрддасаада	да д 6 6 д а д С с	саааРарддр	020
сссссардсс	сассдрдссс	адсасебдад	ЬРСсРддддд	дассаРсадР	сРРссРдРРс	280
сссссааазс	ссааддасас	РсРсаРдаРс	Рсссддассс	сРдаддРсас	дрдсдрддрд	840
дрддасдрда	дссаддаада	ссссдаддрс	садРРсааср	ддрасдрдда	РддсдРддад	900
дРдсаРааРд	ссаадасааа	дссдсдддад	дадсадРРса	асадсдсдРа	ссдРдРддРс	960
адсдРссРса	ссдРссРдса	ссаддасРдд	сРдаасддса	аддадРасаа	дрдсааддРс	1020
Рссаасааад	дссРсссдРс	сРссаРсдад	аааассаРсР	ссааадссаа	адддсадссс	1080
сдададссас	аадРдРасас	ссРдссссса	Рсссаддадд	адаРдассаа	даассаддРс	1140
адссрдаесР	дссЬддрсаа	аддсРРсРас	сссадсдаса	РсдссдРдда	дрдддададс	1200
аардддсаде	сддадаасаа	сгасаадасс	асдссРсссд	РссРсдаРСс	сдасддсбсс	1260
РРСРРССРСР	асадсаддсб	аассдрддас	аададсаддс	ддсаддаддд	дааРдРсРРс	1320
РсаОдсРссд	рдабдсасда	ддсРсРдсас	аассассаса	сасадаадад	ссбсРсссРд	1380
РсРсРдддРР	да					1392

<210> 68 <211> 236 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 68

мер 1

А5р

Меб

Агд

Уа! 5

Рго

А1а

С1п

Ьеи

Ьеи 10

С1у

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Ьеи 15

Тгр

Ьеи

Агд

С1у

А1а 20

Агд

Суз

Азр

Не

61л 25

Мер

ТЬг

С1п

Зег

Рго 30

Зег

Зег

Ьеи

Зег

А1а 35

Зег

Уа1

С1у

Азр

Агд 40

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз 45

Агд

А1а

Зег

С1и

Азр

Ьеи

Туг

Туг

Азп

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

51п

Агд

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

- 91 019636

50

55

60

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Пе

Туг

Азр

ТЬг

Туг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

С1у

Уа1

65

70

75

80

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

01у

Зег

<31 у

ТЬг

А5р

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

85

90

95

Не

Зег

Зег

Ьеи

О1п

Рго

С1и

Азр

РЬе

А1а

Зег

Туг

Туг

Суз

С1п

С1п

100

105

110

Туг

Туг

Ьуз

РЬе

Рго

РЬе

ТЬг

РЬе

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Ьуз

УаЬ

С1и

11е

115

120

125

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

А1а

Рго

Зег

Уа1

РЬе

11е

РЬе

Рго

Рго

Зег

Азр

130

135

140

С1и

С1п

Ьеи

Ьуз

Зег

С1у

ТЬг

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

145

150

155

160

РЬе

Туг

Рго

Агд

С1и

А1а

Ьуз

Уа1

С1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

А5П

А1а

Ьеи

165

170

175

С1п

Зег

С1у

Азп

Зег

Б1п

С1и

Зег

Уа1

ТЬг

С1и

С1п

Азр

Зег-

Ьуз

Азр

180

185

190

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

195

200

205

С1и

Ьуз

Н15

Ьуз

Уа1

Туг

А1а

Суз

С1и

Уа1

ТЬг?

ΗΪ3

С1п

С1у

Ьеи

Зег

210

215

220

Зег-

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

5ег

РЬе

Азп

Агд

С1у

С1и

Суз

225

230

235

<210> 69 <2П> 214 <212> РКТ <21 3> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 69
Азр Не С1п	МеС ТЬг С1п	Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а	Зег Уа1 С1у
1	5	10	15

Азр Агд Уа1 ТОг 11е ТЬг Суз Агд А1а	Зег С1и Азр Ьеи Туг Туг Азп
20	25	30

- 92 019636

Ьеи

А1а

Тгр 35

Туг

С1п

Агд

Ьуз

Рго 40

С1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз 45

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Азр

ТЬг

Туг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РНе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

С1п

Рго

65

70

75

80

С1и

Азр

РЬе

А1а

Зег

Туг

ТуГ

Суз

С1п

С1п

Туг

Туг

Ьуз

РЬе

Рго

РНе

85

90

95

ТИг

РНе

С1у

С1п

С1у

ТЫ

Ьуз

Уа1

С1и

Не

Ьуз

Агд

ТНг

Уа1

А1а

А1а

100

105

110

Рго

Зег

Уа1

РНе

11е

РЬе

Рго

Рго

Зег

Азр

С1и

С1п

Ьеи

Ьуз

Зег

С1у

115

120

125

ТНг

А1а

Зег

Уа1

7а1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

С1и

А1а

130

135

140

Ьуз

Уа1

С1п

Тгр

Ьуз

Оа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

31п

Зег

С1у

АЗп

Зег

С1п

145

150

155

160

О1и

Зег

Уа1

ТНг

С1и

С1п

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

165

170

175

Зег

ТНг

Ьеи

ТНг

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

С1и

Ьуз

Н15

Ьуз

Уа1

Туг

180

185

190

А1а

Суз

С1и

Уа1

ТНг

Н1 з

С1п

С1у

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Уа1

ТНг

Ьуз

Зег

195

200

205

РЬе Азп Агд С1у С1и Суз

210 <210> 70 <211> 711 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <400> 70 аьддаса(:да дддЬссссдс ГсадсГссгд дддсЬссЬдс ГасСсСддсЬ ссдаддГдсс 60 адаГдбдаба тссадаГдас ссададЬсса адсадЬсГсЬ ссдссадсдЬ аддсдаЬсдС 120

- 93 019636

дРдаскаРРа	сскдксдкдс	садСдаддас	скскаккаса	асскддсскд	дкаксадсдР	180
ааассдддса	аадссссдаа	дскдсксакс	какдакаедк	ассдсскддс	тдаеддкдкд	240
ссаадссдОк	ксадкддсад	кддсадсддс	аскдаскака	сссксасаак	Рксдкскскс	300
садссддаад	аСкРедеете	ккаскаккдк	садсаакаьк	аеаадккссс	Лкксассккс	360
ддссадддса	скааадкада	ааксааасдк	асддкддскд	сассакскдк	скксаРсРРс	420
ссдссаксрд	аРдадсадкР	даааРсРдда	аскдссЬскд	ррдрдрдсск	дсРдаакаас	480
С РсРаРссса	дададдссаа	адкасадкдд	ааддкддака	асдсссксса	аксдддкаас	540
Ьсссаддада	дкдрсасада	дсаддасадс	ааддасадса	ссРасадсск	садсадсасс	600
скдасдскда	дсааадсада	скасдадааа	сасааадкск	асдсскдсда	адОсасссаР	660
садддсскда	дсксдсссдк	сасааададс	кксаасаддд	дададкдк-ка	9	711

<210> 71 <211> 463 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 71

Мер 1

Азр

Тгр

Ткг

Тгр 5

Агд

Уа1

Рке

Суз

Ьеи 10

Ьеи

А1а

Уа1

А1а

Рго 15

С1у

А1а

Н1з

Зег

С1и

Уа 1

С1п

Ьеи

Уа1

С1и

Зег

С1у

С1у

С1у

Ьеи

Уа1

С1п

20

25

30

Рго

С1у

С1у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

Уа1

Зег

С1у

Рке

Зег

Зег

35

40

45

Ткг

Азп

Туг

ΗΪ5

Уа1

Н13

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуэ

С1у

Ьеи

50

55

60

С1и

Тгр

Мер

С1у

Уа1

Не

Тгр

С1у

Аэр

С1у

Азр

Ткг

Зег

Туг

Азп

Зег

65

70

75

80

Уа1

ьеи

Ьуз

5ег

Агд

Рке

Ткг

Не

Зег

Агд

Азр

Ткг

Зег

Ьуз

Азп

Ткг

85

90

95

Уа1

Туг

Ьеи

С1п

Мек

Азп

Зет

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

Ткг

А1а

Уа1

Туг

100

105

110

Туг

Суз

А1а

Агд

С1п

Ьеи

Ткг

Н1з

Туг

Туг

Уа1

Ьеи

А1а

А1а

Тгр

С1у

115

120

125

С1п

С1у

Ткг

Ьеи

Уа1

Ткг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

Ткг

Ьуз

С1у

Рго

Зег

- 94 019636

130 135 140

Уа1 145

РИе

Рго

Ьеи А1а

Рго 150

Суз

Зег

Агд

Зег

ТИг 155

Зег

С1и

Зег

ТНг

А1а 160

А1а

Ьеи

С1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РНе

Рго

С1и

Рго

Уа1

ТНг

Уа1

165

170

175

Зег

Тгр

Азп

Зег

С1у

А1а

Ьеи

ТНг

Зег

С1у

Уа1

Н15

ТНг

РНе

РГО

А1а

180

185

190

Уа1

Ьеи

С1п

Зег

Зег

С1у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

УаЬ

Уа1

ТИг

Уа1

195

200

205

Рго

Зег

Зег

Зег

Ьеи

Й1у

ТНг

Ьуз

ТНг

Туг

ТИг

Суз

Азп

Уа1

Азр

Н15

210

215

220

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТНг

ьуз

Уа!

Азр

Ьуз

Агд

Уа1

С1и

Зег

Ьуз

Туг

С1у

225

230

235

240

Рго

Рго

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

С1и

РЬе

Ьеи

С1у

С1у

Рго

Зег

245

250

255

Уа1

РНе

Ьеи

РНе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТНг

Ьеи

МеЕ

11е

Зег

Агд

260

265

270

ТНг

Рго

С1и

Уа1

ТНг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

С1п

СЬи

Азр

Рго

275

280

285

С1и

Уа1

С1п

РНе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

С1у

Уа1

С1и

Уа1

Нхд

Азп

А1а

290

295

300

Ьуз

ТИг

Ьуз

Рго

Агд

С1и

С1и

С1п

РЬе

Азп

Зег

А1а

Туг

Агд

Уа1

Уа1

305

310

315

320

5ес

Уа1

Ьеи

ТНг

Уа1

Ьеи

Н1з

С1П

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

С1у

Ьув

С1и

Туг

325

330

335

Ьуз

Суз

ЬуЗ

Уа1

Зег

АЗП

Ьуз

61у

Ьеи

Рго

Зег

Зег

11е

С1и

Ьуз

ТНг

340

345

350

Не

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

С1П

Рго

Агд

(31и

Рго

С1п

Уа1

Туг

ТНг

Ьеи

355

360

365

Рго

Рго

Зег

С1п

С1и

С1и

МеЕ

ТНг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТИг

Суз

370

375

380

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РНе

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

- 95 019636

385

390

395

400

Азп

С1у

С1п

Рго

С1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

405

410

415

Зег

Азр

С1у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

420

425

430

Агд

Тгр

С1п

31и

С1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

МеЕ

Н15

СЬи

А1а

435

440

445

Ьеи

Н13

Азп

Н13

Туг

ТНг

С1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Бег

Ьеи

О1у

450

455

4 60

<210> 72 <211> 444 <212> ΡΚΤ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 72

С1и 1

Уа!

01п

Ьеи

Уа1 5

С1и

Зег

СЬу С1у

01у 10

Ьеи

Уа1

С1п

Рго

С1у 15

СХу

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

Уа1

Зег

С1у

РНе

Зег

Зег

ТНг

Азп

Туг

20

25

30

Η 1 5

Уа1

Н15

Тгр

Уа1

Агд

С1п

АХа

Рго

СЬу

Ьуз

СХу

Ьеи

СХи

Тгр

МеЕ

35

40

45

С1у

Уа 1

Не

Тгр

С1у

Азр

С1у

АЗр

ТЬг

зег

Туг

Азп

Зег

Уа1

Ьеи

Ьуз

50

55

60

Зег

Агд

РЬе

ТЬг

Пе

Зег

Агд

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Уа1

Туг

Ьеи

65

70

75

80

ΰΐη

МеЕ

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

УаХ

Туг

Туг

Суз

А1а

85

90

95

Агд

С1п

Ьеи

ТЬг

Н13

Туг

Туг

Уа1

Ьеи

А1а

А1а

Тгр

СХу

С1п

С1у

ТЬг

100

105

НО

Ьеи

Уа1

ты

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

ТНг

Ьуз

С1у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Рго

115

120

125

Ьеи

А1а

Рго

Суз

Зег

Агд

Зег

ТНг

Зег

С1и

Зег

ТНг

А1а

А1а

Ьеи

31у

130

135

140

- 96 019636

Суз 145

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг 150

РЬе

Рго

С1и

Рго

Уа1 155

ТЙГ

Уа!

Зег

Тгр

Азп 160

Зег

С1у

А1а

Ьеи

ТЙГ

Зег

С1у

Уа1

Н1з

ТНг

Рйе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

С1п

165

170

175

Зег

Зег

31у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

Уа1

ТНг

Уа1

Рго

Зег

Зег

180

185

190

Зег

Ьеи

С1у

ТЙГ

Ьуз

Тйг

Туг

Тйг

Суз

А5П

Уа1

Азр

Н13

Ьуз

Рго

Зег

195

200

205

Азп

Тйг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Агд

Уа1

С1и

Зег

Ьуз

Туг

С1у

Рго

Рго

Суз

210

215

220

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

С1и

Рйе

Ьеи

С1у

С1у

Рго

Зег

Уа1

Рйе

Ьеи

225

230

235

240

Рйе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТНг

Ьеи

Мес.

11е

Зег

Агд

ТЬг

Рго

61и

245

250

255

Уа1

ТЙГ

Суз

Уз 1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

С1п

С1и

Азр

Рго

С1и

Уа1

С1П

260

265

270

Рйе

А5П

Тгр

Туг

Уа1

Азр

С1у

Уа1

С1и

Уа1

Н13

Азп

А1а

Ьуз

Тйг

Ьуз

275

280

285

Рго

Агд

С1и

С1и

С1п

РЬе

Азп

Зег

А1а

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

290

295

300

ТНг

Уа!

Ьеи

Н1з

С1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

61и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

305

310

315

320

Уа!

Зег

АЗП

Ьуз

С1у

Ьеи

Рго

Зег

Зег

Не

С1и

Ьуэ

ТНг

Не

Зег

Ьуз

325

330

335

А1а

Ьуз

С!у

С1п

Рго

Агд

С1и

Рго

С1п

Уа1

Туг

Тйг

ьеи

Рго

Рго

Зег

340

345

350

31П

С1и

С1и

МеГ

Тйг

Ьуз

АЗП

61п

Уа1

Зег

Ьеи

Тйг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

355

360

365

С1у

₽йе

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

С1у

С1п

370

375

380

Рго

С1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЙг

ТЙГ

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

С!у

385

390

395

400

- 97 019636

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи Туг 405

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

7а1 Азр 410

Буз

Зег

Агд

Тгр 415

С1п

01и

С1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

Мег

Н13

С1и

А1а

Беи

Н15

Азп

420

425

430

Нгз

Туг

ТЬг

С1п

Ьу5

Зег

Беи

Зег

Беи

Зег

Беи

С1у

436

440

<210> 73 <211> 1392 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <400> 73

аГддасСдда	ссБддадддг	сББсГдсСГд	осддссдсад	сассаддьдс	СсасЕСсдаа	60
дБасааЬЬдд	БсдадБсОдд	аддсдддсББ	дбссадсстд	дьдддадссБ	дсдЬсЕсБсг	120
ЕдгдсадБда	дсддсССсад	сссгассаан	сассасдсдс	асЕдддПдсд	БсаддсассБ	180
дддаадддсс	СддадБддаС	дддбдГСаББ	Сддддсдасд	дсдабасаСс	сБасаасБсс	240
дЕссСдаада	дссдгсг-сас	сасхгсссдг	дасассБсаа	адаапассдс	ЬСассБссад	300
аС.даасБссс	Бссдсдсада	ддасасадса	дБсЬаБОасБ	дСдсасдГса	асЕдасссас	360
сагпасдБСЬ	сддсадсссд	дддСсааддд	асБссддиса	садьсесдад	сдссьсаасс	420
аадддсссас	ссдчсБЕссс	ссСддсдссс	СдсБссадаБ	сБассБссда	дадсасадсс	480
дсссСдддсс	дсссддссаа	ддасСасСЬс	сссдаассдд	БдасддСдгс	дсддаасСса	540
ддсдсссЕда	ссадсддсдЬ	дсасассББс	ссддсЬдксс	Басадьсспс	аддасБссас	600
ссссПсадса	дсдпддгдас	сдидсссссс	адсадсгедд	дсасдаадас	сЕасассБдс	660
аасдБадабс	асаадсссад	саасассаад	деддасаада	дадССдадБс	сааасасддп	720
сссссагдсс	сассдсдссс	адсассСдад	СЬссСддддд	дассассадС	сЕЬссБдБЬс	780
сссссаааас	ссааддасас	ссссаБдагс	Ьсссддассс	седаддБсас	дГдсдСддЕд	840
дБддасдСда	дссаддаада	ссссдаддгс	садЕссаасБ	ддБасдьдда	ьддсдСддад	900
дГдсаг.ааед	ссаадасааа	дссдсдддад	дадсадСБса	асадсдсдБа	ссдьдсддгс	960
адсдБссБса	ссдЬссЬдса	ссаддасидд	сьдаасддса	аддадЕасаа	дБдсааддЬс	1020
Сссаасааад	дссБсссдкс	сБСсаксдад	аааассаьсС	ссааадссаа	адддсадссс	1080
сдададссас	аадгдсасас	сссдссссса	асссаддадд	адасдассаа	даассаддтс	1140
адсседассБ	дсскддСсаа	аддсЕбссас	сссадсдаса	Бсдссдс.дда	дсдддададс	1200
ааидддсадс	сддадаасаа	ссасаадасс	асдссСсссд	СссСсдаььс	сдасддсьсс	1260

- 98 019636

СССССССССБ асадсаддсС аассдТддас аададсаддр ддсаддаддд даабдрсССс 1320 тсаРдсСссд ЬдаТдсаЬда ддсСсРдсас аассасСаса сасадаадад ссРсСсссбд 1380 ЬсЬсГдддЬЬ да 1392 <210> 74 <211> 117 <212> РРТ <2135> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 74

С1и 1

Уа1

С1п

Ьеи

С1п 5

С1и

Зег

С1у

Рго

С1у Ьеи 10

Уа1

Ьуз

Рго

Зег 15

С1и

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТИг

Уа1

Зег

С1у

РЬе

Зег

Зег

ТЬг

Азп

Туг

20

25

30

ΗΪ5

Уа1

ΗΪ5

Тгр

Не

Агд

С1п

Рго

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

(Пи

Тгр

11е

35

40

45

С1у

Уа1

11е

Тгр

31у

Азр

С1у

Азр

ТЬг

Зег

Туг

Азп

Зег

Уа1

Ьеи

Ьуз

50

55

60

Зег

Агд

ν«1

ТЬг

11е

Зег

Уа!

Азр

ТЬг

5ег

Ьуз

Азп

31п

РЬе

Зег

Ьеи

65

70

75

80

Ьуз

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

А1а

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

85

90

95

Агд

С1п

Ьеи

ТИг

ΗΪ5

Туг

Туг

Уа1

Ьеи

А1а

А1а

Тгр

&1у

С1П

С1у

ТНг

100

105

но

Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег

115 <210> 75 <211> 117 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 75

С1и Уа1 С1п Ьеи С1п С1и Зег С1у Рго С1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго Зег С1и

10 15

- 99 019636

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи Ткг 20

Суз

Ткг

УаТ

Зег 25

СТу

Рке

Зег

Зег

Ткг 30

АЗП

Туг

Н15

УаТ

Н13

Тгр

Не

Агд

С1п

Рго

Рго

С1у

Ьуз

61у

Ьеи

СТи

Тгр

Ме£

35

40

45

С1у

Уа1

Не

Тгр

С1у

Азр

С1у

Азр

Ткг

Зег

Туг

Азп

Зех

УаТ

Ьеи

Ьуз

50

55

60

Зег

Агд

УаТ

Ткг

Не

Зег

Агд

Азр

Ткг

Зег

Ьуз

Азп

СТп

УаТ

Зег

Ьеи

65

70

75

80

Ьуз

Ьеи

Зег

Зег

УаТ

Ткг

АТа

АТа

Азр

Ткг

АТа

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

85

90

95

Агд

С1п

Ьеи

Ткг

Н1з

Туг

Туг

УаТ

Ьеи

АТа

АТа

Тгр

СТу

С1п

СТу

Ткг

100

105

но

Ьеи

УаТ

Ткг

Уа1

Зег

115 <210> 76 <211> 146 <212> РР.Т <213> Ното зар1епз <400> 76

СТу 1

А$р

СТп

Азп

Рго 5

С1п

1Те АТа

АТа

Нгз 10

УаТ

Не

Зег

СТи

А1а Т5

Зег

Зег

Ьуз

Ткг

Ткг

Зег

Уа1

Ьеи

С1п

Тгр

А1а

С1и

ьуз

СТу

Туг

Туг

Ткг

20

25

30

Мет:

Зег

Азл

Азп

Ьеи

Уа1

Ткг

Ьеи

С1и

Азп

СТу

Ьуз

С1п

Ьеи

Ткг

Уа1

35

40

45

Ьуз

Агд

С1п

СТу

Ьеи

Туг

Туг

Не

Туг

АТа

СТп

УаТ

Ткг

Рке

Суз

Зег

50

55

60

Азп

Агд

С1и

АТа

Зег

Зег

С1п

АТа

Рго

Рке

Не

АТа

Зег

Ьеи

Суз

Ьеи

65

70

75

80

Ьуз

Зег

Рго

СТу

Агд

Рке

С1и

Агд

11е

Ьеи

Ьеи

Агд

АТа

А1а

Азп

Ткг

85

90

95

Н13

Зег

Зег

А1а

Ьуз

Рго

Суз

СТу

СТп

СТп

Зег

Не

Н13

Ьеи

СТу

С1у

100

105

110

УаТ

Рке

СТи

Ьеи

СТп

Рго

СТу

АТа

Зег

УаТ

Рке

УаТ

АЗП

УаТ

Ткг

Азр

115

120

125

- 100 019636

Рго Зег С1п Уа1 Зег Н13 С1у ТНг £31 у РНе ТЬг Зег РНе С1у Ьеи Ьеи 130 135 140

Ьуз Ьеи

145 <210> 77 <2П> 146 <212> РКТ <213> Миз 1лизси1из <400> 77

С1у Азр С1и 1

Азр

Рго 5

С1п

Т1е

А1а

А1а

Н13 10

Уа1

Уа1

Зег

31и

А1а 15

Азп

Зег

Азп

А1а

А1а

Зег

νβΐ

Ьеи

С1п

Тгр

А1а

Ьуз

Ьу5

С1у

Туг

Туг

ТНг

20

25

30

Мес

Ьуз

Зег

Азп

Ьеи

Уа1

мес

Ьеи

ΰΐυ

Азп

С1у

Ьуз

61п

Ьеи

ТИг

Уа1

35

40

45

Ьуз

Агд

С1и

С1у

Ьеи

Туг

Туг

Уа1

Туг

ТИг

С1п

Уа1

ТНг

РНе

Суз

Зег

50

55

60

Азп

Агд

С1и

Рго

5ег

Зег

С1п

Агд

Рго

РНе

11е

7а1

С1у

Ьеи

Тгр

Ьеи

65

70

75

60

Ьуз

Рго

Зег

Зег

С1у

Зег

31и

Агд

Не

Ьеи

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

Азп

ТНг

65

90

95

Н1з

Зег

Зег

Зег

С1П

Ьеи

Суз

С1и

С1п

С1п

Зег

Уа1

Н12

Ьеи

С1у

С1у

100

105

110

Уа1

РНе

С1и

Ьеи

С1п

А1а

С1у

А1а

Зег

Уа1

РНе

Уа1

Азп

Уа1

ТИг

61и

115

120

125

А1а

Зег

С1п

Уа1

Не

Н13

Агд

Уа1

С1у

РНе

Зег

Зег

РНе

С1у

Ьеи

Ьеи

130

135

140

Ьуз Ьеи

Claims (38)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. СИ154-связывающий белок, содержащий последовательности СИК1, СИК2 и СИК3 тяжелой цепи, выбранные из:

   (a) 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 5 соответственно;

   (b) 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 42, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 43 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 44 соответственно;

   (c) 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 48, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 49 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 50 соответственно;

   или содержащий последовательности СИК1, СИК2 и СИК3 легкой цепи, выбранные из:

   (a) 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 7 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 8 соответственно;

   (b) 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 45, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 46 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 47 соответственно;

   (c) 8 ЕС) ΙΌ ΝΟ: 51, 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 52 и 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 53 соответственно.
2. 2. СИ154-связывающий белок по п.1, содержащий последовательности СИК1, СИК2 и СИК3 тяжелой цепи и СИК1, СИК2 и СИК3 легкой цепи, выбранные из:

   (a) 8 ЕС) ΙΌ ΝΟ: 3, 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 4, 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 5, 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 6, 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 7 и 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 8 соответственно;

   (b) 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 42, 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 43, 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 44, 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 45, 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 46 и 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 47 соответственно;

   (c) 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 48, 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 49, 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 50, 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 51, 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 52 и 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 53 соответственно.
3. 3. СИ154-связывающий белок, содержащий:

   (а) последовательность домена У_Н, выбранную из 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 9, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 11, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 29, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 56, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 60 и аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична любой из 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 1, 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 9, 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 10, 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 11, 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 29, 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 56, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 60; или

   - 101 019636 (Ь) последовательность домена У_ь, выбранную из 8ЕР ΙΌ N0: 2, 8ЕР ΙΌ N0: 14, 8ЕР ΙΌ N0: 30, 8ЕР ΙΌ N0: 54, 8ЕР ΙΌ N0: 58 и аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична любой из 8ЕР ΙΌ N0: 2, 8ЕР ΙΌ N0: 14, 8Е0 ΙΌ N0: 30, 8Е0 ΙΌ N0: 54, 8Е0 ΙΌ N0: 58.
4. 4. СО154-связывающий белок по п.3, содержащий последовательности доменов У_Н и У_ь, выбранные из:

   (a) 8 Ер ΙΌ N0: 1 или аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична 8ЕР ΙΌ N0: 1, и 8ЕР ΙΌ N0: 2 или аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична 8ЕР ΙΌ N0: 2 соответственно;

   (b) 8 Ер ΙΌ N0: 11 или аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична 8Ер ΙΌ N0: 11, и 8Ер ΙΌ N0: 2 или аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична 8Ер ΙΌ N0: 2 соответственно;

   (c) 8Ер ΙΌ N0: 9 или аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична 8Ер ΙΌ N0: 9, и 8Ер ΙΌ N0: 14 или аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична 8Ер ΙΌ N0: 14 соответственно;

   (б) 8Ер ΙΌ N0: 10 или аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична 8Ер ΙΌ N0: 10, и 8Ер ΙΌ N0: 14 или аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична 8Ер ΙΌ N0: 14 соответственно;

   (е) 8Ер ΙΌ N0: 29 или аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична 8Ер ΙΌ N0: 29, и 8Ер ΙΌ N0: 30 или аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична 8Ер ΙΌ N0: 30 соответственно;

   (1) 8Ер ΙΌ N0: 56 или аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична 8Ер ΙΌ N0: 56, и 8Ер ΙΌ N0: 54 или аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична 8Ер ΙΌ N0: 54 соответственно; и (д) 8Ер ΙΌ N0: 60 или аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична 8Ер ΙΌ N0: 60, и 8Ер ΙΌ N0: 58 или аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична 8Ер ΙΌ N0: 58 соответственно.
5. 5. СО154-связывающий белок, содержащий:

   (a) последовательность тяжелой цепи, выбранную из 8Ер ΙΌ N0: 12, 8Ер ΙΌ N0: 13, 8Ер ΙΌ N0: 72 и аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична любой из 8Ер ΙΌ N0: 12, 8Ер ΙΌ N0: 13 и 8Ер ΙΌ N0: 72; или (b) последовательность легкой цепи, выбранную из 8Ер ΙΌ N0: 15, 8Ер ΙΌ N0: 69 и аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична 8Ер ΙΌ N0: 15 или 8Ер ΙΌ N0: 69.
6. 6. СО154-связывающий белок по п.5, содержащий последовательности тяжелой и легкой цепи, выбранные из:

   (a) 8Ер ΙΌ N0: 12 или аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична 8Ер ΙΌ N0: 12, и 8Ер ΙΌ N0: 15 или аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична 8Ер ΙΌ N0: 15 соответственно;

   (b) 8Ер ΙΌ N0: 13 или аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична 8Ер ΙΌ N0: 13, и 8Ер ΙΌ N0: 15 или аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична 8Ер ΙΌ N0: 15 соответственно; и (c) 8Ер ΙΌ N0: 72 или аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична 8Ер ΙΌ N0: 72, и 8Ер ΙΌ N0: 69 или аминокислотной последовательности, содержащей одну или несколько консервативных замен, которая по меньшей мере на 90% идентична 8Ер ΙΌ N0:69 соответственно.
7. 7. СО154-связывающий белок по любому из пп.3-6, в котором консервативная замена находится не в областях СОЯ.
8. 8. СО154-связывающий белок, содержащий последовательности тяжелой и легкой цепи 8Ер ΙΌ N0: 13 и 8Ер ΙΌ N0: 15 соответственно.
9. 9. СО154-связывающий белок по любому из пп.1-8, где связывающий белок представляет собой анти-СО154-антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

   - 102 019636
10. 10. Аити-С^154-антитело по п.9, выбранное из моноклонального антитела, химерного антитела, приматизированного антитела и гуманизированного антитела.
11. 11. Анти-С^154-аититело по п.9, выбранное из мультимерного антитела, гетеродимерного антитела, гемидимерного антитела, тетравалентного антитела, биспецифического антитела и одноцепочечного антитела и их производных.
12. 12. Антигенсвязывающий фрагмент по п.9, выбранный из РаЬ, Р(аЬ)₂, РаЬ', Р(аЬ')₂, Р(аЬ')₃, Рб, Ρν и однодоменного антитела.
13. 13. Анти-СП154-антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.9-12, которые модифицированы ковалентным присоединением функциональной группы.
14. 14. Анти-С^154-аититело или антигенсвязывающий фрагмент по п.13, в которых функциональная группа представляет собой полиэтиленгликоль или его производное.
15. 15. Аити-С^154-антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.14, где антигенсвязывающий фрагмент представляет собой РаЬ', где тиольная группа в модифицированной шарнирной области ковалентно связана с малеимидной группой, которая ковалентно связана с остатком лизина, где полимер метоксиполиэтиленгликоля, имеющий молекулярную массу примерно 20000 Да, присоединен к каждой из аминогрупп лизина.
16. 16. СО154-связывающий белок по п.1 или 2, содержащий белковый остов, отличный от иммуноглобулиновых доменов.
17. 17. СО154-связывающий белок по п.16, где белковый остов, отличный от иммуноглобулинового домена, содержит домен фибронектина, домен анкирина, домен липокалина, домен неокарзиностатина, домен цитохрома Ь, домен СР1 цинкового пальца, Р8Т1 домен, домен закрученной спирали, ЬАС1-Э1 домен, Ζ-домен и домен тендамистата.
18. 18. СО154-связывающий белок по п.1 или 2, в котором отсутствует Рс-область иммуноглобулина.
19. 19. СО154-связывающий белок по п.1 или 2, который дополнительно содержит Рс-область иммуноглобулина, выбранную из Рс-областей !дС1, 1дС2, Юд3 и 1дС4 или полученную из Рс-областей 1дС1, 1дС2, Юд3 или 1д64.
20. 20. СО154-связывающий белок по п.1 или 2, который дополнительно содержит вариантную Рсобласть, которая обладает пониженной эффекторной функцией по сравнению с нативной или исходной Рс-областью.
21. 21. СО154-связывающий белок по п.20, где вариантная Рс-область представляет собой гибридную Рс-область, содержащую последовательности из Рс-домена 1д более чем одного типа.
22. 22. СО154-связывающий белок по любому из пп.1-21, который не гликозилирован.
23. 23. СО154-связывающий белок по п.20 или 21, где пониженная эффекторная функция представляет собой пониженное связывание с Рс-рецептором (РсК).
24. 24. СО154-связывающий белок по п.20 или 21, где пониженная эффекторная функция представляет собой пониженное связывание с белком комплемента.
25. 25. СО154-связывающий белок, аити-С^154-аититело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8, 16-24, которые связаны с функциональной группой.
26. 26. СО154-связывающий белок по п.25, в котором функциональной группой является цистеиновый аддукт, смешанный дисульфид, полиэтиленгликоль, полиэтиленгликоль-малеимид, флуоресцентная группа, люминесцентная группа, изотопная группа, противовоспалительное средство, противоопухолевое средство, средство для лечения нейродегенеративного заболевания, противоинфекционное средство, антитело, которое является селективным для молекулы, отличной от СЭ154, или их комбинация.
27. 27. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая СО154-связывающий белок, анти-СО154антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-25.
28. 28. Молекула ДНК, которая кодирует СЭ154-связывающий белок по п.1, содержащая последовательность, выбранную из 8ЕЕ) ГО N0: 16, 8ЕО ГО N0: 17, 8ЕО ГО N0: 18, 8ЕЕ) ГО N0: 19, 8ЕЕ) ГО N0: 20, 8 ЕЕ) ГО N0: 21, 8ЕЕ) ГО N0: 22, 8ЕЕ) ГО N0: 23, 8ЕЕ) ГО N0: 24, 8ЕЕ) ГО N0: 25, 8ЕЕ) ГО N0: 26, 8ЕЕ) ГО N0: 27, 8ЕЕ) ГО N0: 28, 8ЕЕ) ГО N0: 31, 8ЕЕ) ГО N0: 32, 8ЕЕ) ГО N0: 33, 8ЕЕ) ГО N0: 34, 8ЕЕ) ГО N0: 41, 8ЕЕ) ГО N0: 55, 8ЕЕ) ГО N0: 57, 8ЕЕ) ГО N0: 59, 8ЕЕ) ГО N0: 61, 8ЕЕ) ГО N0: 70, 8ЕЕ) ГО N0: 73, или содержащая последовательность, выбранную из последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной 8ЕЕ) ГО N0: 16, 8ЕЕ) ГО N0: 17, 8ЕЕ) ГО N0: 18, 8ЕЕ) ГО N0: 19, 8ЕЕ) ГО N0: 20, 8ЕЕ) ГО N0: 21, 8ЕЕ) ГО N0: 22, 8ЕЕ) ГО N0: 23, 8ЕЕ) ГО N0: 24, 8ЕЕ) ГО N0: 25, 8ЕЕ) ГО N0: 26, 8ЕЕ) ГО N0: 27, 8ЕЕ) ГО N0: 28, 8 ЕЕ) ГО N0: 31, 8ЕЕ) ГО N0: 32, 8ЕЕ) ГО N0: 33, 8ЕЕ) ГО N0: 34, 8ЕЕ) ГО N0: 41, 8ЕЕ) ГО N0: 55, 8ЕЕ) ГО N0: 57, 8ЕЕ) ГО N0: 59, 8ЕЕ) ГО N0: 61, 8ЕЕ) ГО N0: 70 или 8ЕЕ) ГО N0: 73.
29. 29. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.27 или молекулу ДНК по п.28.
30. 30. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.29.
31. 31. Способ получения СО154-связывающего белка по п.1, включающий стадии:

    (a) культивирования клетки-хозяина по п.30 в условиях, подходящих для экспрессии СГО154связывающего белка клеткой-хозяином; и (b) выделения СО154-связывающего белка.
32. 32. Способ по п.31, в котором клетка-хозяин является прокариотической или эукариотической клет

    - 103 019636 кой.
33. 33. Композиция, содержащая эффективное количество СО154-связывающего белка, анти-СЭ154антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-25 и подходящий фармацевтический носитель, для применения в лечении или профилактике состояния, нарушения или заболевания у человека, опосредованного в целом или частично сигнальным путем с участием СЭ40, или симптома указанного выше состояния, нарушения или заболевания.
34. 34. Композиция по п.33, дополнительно содержащая дополнительное иммуносупрессивное или иммуномодулирующее соединение или средство.
35. 35. Применение СО154-связывающего белка, анти-СП154-антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-25 в приготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики состояния, нарушения или заболевания человека, опосредованного в целом или частично сигнальным путем с участием СЭ40, или симптома указанного выше состояния, нарушения или заболевания.
36. 36. Применение по п.35, где состояние, нарушение или заболевание представляет собой воспалительную или аутоиммунную ответную реакцию или фиброз.
37. 37. Применение по п.36, где воспалительная или аутоиммунная ответная реакция или фиброз выбраны из ревматоидного артрита, системной красной волчанки, спондилоартрита, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, псориаза и рассеянного склероза.
38. 38. Применение композиции по п.33 в приготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики состояния, нарушения или заболевания человека, опосредованного в целом или частично сигнальным путем с участием СЭ40, или симптома указанного выше состояния, нарушения или заболевания.