EA017611B1 - Способ получения связывающей молекулы, специфичной к белку, ассоциированному с расстройством, или антитела или его связывающего фрагмента или по меньшей мере одной цепи иммуноглобулина, связывающих вышеуказанный белок (варианты), связывающая молекула, антитело, цепь иммуноглобулина или их связывающий фрагмент (варианты), антиген, полинуклеотид, вектор и клетка-хозяин, их включающие композиция и набор и способ диагностики или лечения неврологических расстройств посредством - Google Patents

Abstract

Предусмотрены новые специфичные связывающие молекулы, в особенности антитела человека, а также их фрагменты, производные и варианты, которые распознают неоэпитопы связанных с заболеванием белков, которые происходят из нативных эндогенных белков, но преобладают в организме пациента в измененной форме и/или вне рамок их нормального физиологического состояния. Кроме того, описаны фармацевтические композиции, включающие такие связывающие молекулы, антитела и их мимики, и способы обнаружения новых связывающих молекул, которые могут быть или не быть антителами, а также мишени при лечении неврологических расстройств, таких как болезнь Альцгеймера.

Description

Изобретение относится к новым специфичным связывающим молекулам, в особенности к антителам человека, а также к их фрагментам, производным и вариантам, которые узнают связанные с заболеванием эпитопы, включая неоэпитопы, белков, которые происходят от нативных эндогенных белков и которые преобладают в организме пациента в измененной форме и/или вне рамок их нормального физиологического контекста. Вдобавок, изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим такие связывающие молекулы, антитела и имитирующие их молекулы (мимики), и к способам обнаружения (скрининга) новых связывающих молекул, которые могут быть или не быть антителами, мишенями и лекарственными препаратами, для лечения различных расстройств, в частности неврологических расстройств, таких как болезнь Альцгеймера, амилоидоз и бета-амилоидная патология.

Сведения о предшествующем уровне техники

Успешность получения моноклональных антител основывается на эффективном и избирательном (селективном) слиянии стимулированных антигеном В-клеток с линией клеток миеломы мыши с последующим отбором (селекцией) стабильных продуцирующих антитела гибридов, что первоначально было описано у КбЫет и М1к1еш, Иа1иге 256 (1975), 495-497. Тем не менее, терапевтической полезности для человека антител мышиного происхождения препятствует отклик антител человека против антител мыши (ΗΑΜΑ) ввиду их нечеловеческого происхождения. Подходы для получения человеческих, или подобных человеческим, моноклональных антител стали доступными благодаря генетической инженерии. Тем не менее, способы, доступные до настоящего времени, имеют недостаток, состоящий в том, что они не подходят для получения антител со свойствами (характеристиками) таковых, продуцируемых в ходе физиологического иммунного ответа человека. Более того, такие антитела могут быть недостаточно специфичными вследствие перекрестной реакции с другими белками и/или целевым белком в условиях нормальной физиологической функции. В случае болезни Альцгеймера или Паркинсона, например, антитела, которые также вступают в перекрестную реакцию с высоким сродством (аффинностью) с физиологическими производными белка-предшественника амилоида (АРР) или альфа-синуклеина, рассматриваются как проявляющие побочные эффекты по отношению к нормальным функциям физиологических целевых структур. В этом отношении нежелательное аутоиммунное заболевание, очевидно, будет индуцировано - с трудом предвидимый риск при разработке концепции экспериментов активной иммунизации с участием белковых структур, которые в измененной форме также встречаются физиологически. Побочными эффектами, не связанными со структурой мишени, являются, например, анафилактические реакции, которые ожидаются как нежелательные и опасные побочные эффекты при системном введении экзогенных белков. Согласно недавним открытиям это также может происходить в случае так называемых гуманизированных антител, которые первоначально были разработаны на основе не принадлежащих к человеческому роду организмов, обычно мышей. С другой стороны, активная иммунизация соответствующими патологическими антигенами вызывает значительный риск выработки у пациентов антител и развития Т-клеточных ответов, которые также узнают физиологические варианты таких белков и в результате приводят к опасному и неконтролируемому аутоиммунному ответу.

Таким образом, существует необходимость обеспечения агентов, которые специфичны к мишени, участвующей в расстройстве, и которые не отторгаются организмом человека.

Сущность изобретения

Объектом изобретения является способ идентификации, проверки и получения диагностически и терапевтически полезных связывающих молекул, в особенности антител, которые направлены против патологических вариантов эндогенных белков. В частности, изобретение относится к способу выделения специфичной к связанному с заболеванием белку связывающей молекулы, согласно которому происходит:

(a) приведение во взаимодействие образца, полученного от пациента, у которого отсутствуют симптомы, или который клинически необычно стабилен, но который страдает или подвержен риску развития расстройства, с препаратом патологически измененных клеток или тканей с заранее определенными патологическими характеристиками; и (b) идентификация и, возможно, выделение связывающей молекулы, которая связывается с указанным препаратом, но не связывается с соответствующими клетками или тканями без таких патологических характеристик, которые могут быть выделены из здорового субъекта.

Известен факт, что, в случае аутоиммунных заболеваний, антитела направлены против аутологических клеток и белков или других соединений, таких как гликолипиды, экспрессируемых указанными клетками, обходя известные механизмы толерантности. Также известен факт, что, в случае эндогенного развития новообразований, может развиться клеточный и гуморальный иммунитет к неопластическим клеткам, и он может таким образом повлиять на эндогенный иммунологический механизм защиты против дегенерации неопластической ткани.

В основе создания изобретения лежит неожиданно обнаруженный факт, что антитела могут также быть направлены против патофизиологически значимых вариантов эндогенных белков, в частности против неоэпитопов, которые образуются в процессе патологически измененной транскрипции, трансляции или посттранскрипционной или посттрансляционной модификации, или протеолитического процессинга,

- 1 017611 или агрегации. Такие антитела направлены против эндогенных белков, которые вследствие их новой структуры, которая отклоняется от нормальной физиологии, становятся патофизиологически значимыми посредством развития патологических эффектов. Ввиду иммунологической толерантности, антитела, связанные с соответствующим иммунным ответом на неоэпитопы в таких патологических вариантах, обычно не вступают в какие-либо перекрестные реакции с физиологически функциональными белками, тем не менее, это противоположно случаю аутоиммунных заболеваний. Это происходит вследствие того, что образование потенциально вступающих в перекрестную реакцию антител специфично подавляется известными механизмами толерантности, тогда как развитие иммунного ответа на патологические неоэпитопы может избежать толерантности.

Следовательно, изобретение относится к новому подходу идентификации диагностически, терапевтически и превентивно активных связывающих молекул, особенно антител и фрагментов антител, выделенных из заранее выбранных по симптоматике людей посредством взаимодействия с идентифицируемыми патологическими структурами.

Изобретение, таким образом, направлено на антитела или антигенсвязывающие фрагменты и сходные антигенсвязывающие молекулы, которые способны распознавать эпитопы, включая неоэпитопы, связанных с заболеванием белков, которые происходят из нативных эндогенных белков и преобладают в организме пациента в измененной форме, например в виде патологического белка и/или вне рамок их нормального физиологического состояния. Более того, изобретение относится к композициям, включающим указанные антитела, и к иммунотерапевтическим и иммунодиагностическим способам применения таких композиций.

Более того, при идентификации антител способ согласно изобретению можно применять без учета предшествующей гипотезы об идентичности молекулярных целевых структур для антител, учитывая исключительно связи этих антител с патологически значимыми структурами.

Помимо возможности, таким образом, выявить молекулярные целевые структуры, до настоящего времени неизвестные, для конкретных заболеваний, дополнительное преимущество антител, которые исключительно направлены против патологических структур, заключается в том, что на их фармакодинамическую доступность не оказывает негативного влияния связывание с не подвергшимися заболеванию тканями таким образом, чтобы антитело оказывалось забуференным в отношении его концентрации и эффектов разбавления, препятствуя, таким образом, определению терапевтически эффективных концентраций. Более того, антитело и связывающие молекулы согласно изобретению предпочтительно характеризуются тем, что они реагируют с измененной формой связанного с заболеванием белка ίη νίνο или с клеткой или клеточной мембраной и на срезе пораженной болезнью ткани с патологическими характеристиками соответственно, но не реагируют или в значительно меньшей степени реагируют с физиологическим вариантом родственного белка; см. также, например, пример 2.

Поскольку изобретение позволяет идентификацию и выделение молекулярных целевых структур из пораженных болезнью клеток и тканей, дополнительный вариант реализации относится к антигену и патологическому белку, т.е. связанному с заболеванием белку соответственно, который связывается специфичным к неоэпитопу антителом согласно изобретению.

Особенно предпочтительным вариантом реализации является антитело человека, или его антигенсвязывающий фрагмент, которое проявляет свойства иммунологического связывания любого из антител, характеризуемых вариабельными областями ΥΗ и/или УБ, описанными ниже в табл. 2 и 3. В качестве альтернативы указанное антитело представляет собой гуманизированное, ксеногенное или химерное антитело человека и мыши, последнее из перечисленных особенно полезно для диагностических способов и исследований, проводимых на животных. Изобретение также охватывает терапевтические композиции, включающие указанное антитело или его активные фрагменты, или агонисты и родственные молекулы, или наоборот, антагонисты указанного антитела, и способы применения таких композиций для предотвращения, диагностики или лечения заболевания с применением этих композиций, характеризующиеся тем, что эффективное количество указанной композиции вводят пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

Антигенсвязывающим фрагментом антитела может быть одноцепочечный Ρν фрагмент, Р(аЬ') фрагмент, Р(аЬ) фрагмент и Р(аЬ')₂ фрагмент, или любой другой антигенсвязывающий фрагмент. В конкретном варианте реализации, описанном ниже, антитело или его фрагмент представляет собой антитело человека изотипа 1дС.

Разумеется, изобретение распространяется на иммортализованные В-лимфоцит памяти и В-клетку человека соответственно, которые продуцируют указанное антитело, имеющее различные и уникальные характеристики, как определено ниже.

Изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим, по меньшей мере, вариабельную область цепи иммуноглобулина антитела согласно изобретению. Предпочтительно указанная вариабельная область включает по меньшей мере один гипервариабельный участок (СОВ) УН и/или УБ вариабельной области, описанных ниже в табл. 2 и 3. Соответствующий набор СЭК. приведен в табл. 4 ниже.

Соответственно в объем изобретения также входят векторы, включающие указанные полинуклеотиды, и клетки-хозяева, трансформированные ими, а также их применение для получения антитела и эк

- 2 017611 вивалентных связывающих молекул, которые специфичны к неоэпитопам, которые являются характерными и/или вызывающими расстройство, в частности для расстройства мозга, такого как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.

Антитело, цепь (цепи) иммуноглобулина, их связывающие фрагменты и антиген, связывающийся с указанным антителом, можно применять в фармацевтических и диагностических композициях для иммунотерапии и диагностики соответственно. Применение вышеупомянутых композиций для получения медикамента, тем не менее, является предпочтительным.

Следовательно, конкретным объектом изобретения является обеспечение способов лечения или предотвращения неврологического расстройства, описываемого аномальным накоплением и/или отложением белка в центральной нервной системе, без нарушения природной функции соответствующего белка. Указанные способы включают введение эффективной концентрации антитела или производного антитела субъекту, в котором антитело связывается с патологической формой белка или с отложением белка с существенно более высокой аффинностью, чем с нормальной физиологической формой указанного белка. В предпочтительном варианте реализации изобретение обеспечивает способы лечения или предотвращения или замедления начала заболеваний, связанных с накоплением и отложением бетаамилоидного пептида у субъекта, таких как болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, умеренное когнитивное нарушение, церебральная амилоидная ангиопатия, сосудистая деменция, мультиинфарктная деменция. Указанные способы включают введение эффективной концентрации антитела или производного антитела субъекту, в котором антитело связывается с патологической формой белка или отложением белка с более высокой аффинностью, чем с нормальной физиологической формой белка. Подобные терапевтические подходы предусмотрены для лечения болезни Паркинсона, болезни Хантингтона, болезни Крейцфельда-Якоба, кистозного фиброза, болезни Гоше и т.п.

Дополнительные варианты реализации изобретения будут очевидны из следующего описания.

Перечень чертежей и иных материалов

На фиг. 1 показано антитело против бета-амилоида. А: антитела человека. В: контрольное окрашивание известным антителом против бета-амилоида человека. Клинически необычно стабильные пациенты с болезнью Альцгеймера имеют антитела к бета-амилоидным бляшкам. Иммуногистохимическое окрашивание антителами из клинически необычно стабильных пациентов срезов мозга, полученных от пациентов с патологически подтвержденной болезнью Альцгеймера, позволяет обнаружить антитела, которые связываются с бета-амилоидными бляшками, что подтверждается известным антителом против бетаамилоида человека.

Фиг. 2 - антитело против нейрофибриллярных клубков. А: антитела человека. В: контрольное окрашивание известным антителом против тау-протеина человека. Здоровые люди имеют антитела к нейрофибриллярным клубкам. Иммуногистохимическое окрашивание антителами из здоровых субъектов срезов мозга, полученных от пациентов с патологически подтвержденной болезнью Альцгеймера, позволяет обнаружить антитела, которые связываются с нейрофибриллярными клубками, что подтверждается известным антителом против тау-протеина человека.

Фиг. 3 - антитело против дистрофичных нейритов. А: антитела человека. В: контрольное окрашивание известным антителом против тау-протеина человека. Здоровые люди имеют антитела к дистрофичным нейритам. Иммуногистохимическое окрашивание антителами из здоровых субъектов срезов мозга, полученных от пациентов с патологически подтвержденной болезнью Альцгеймера, позволяет обнаружить антитела, которые связываются с дистрофичными нейритами.

Фиг. 4 - антитело против бета-амилоида. На чертеже показано специфичное связывание рекомбинантного антитела человека N1-101.11, которое было выделено из клинически необычно стабильного пациента с болезнью Альцгеймера, с мозговыми бета-амилоидными бляшками. Срезы мозга, полученные от пациента с нейропатологически подтвержденной болезнью Альцгеймера, окрашивали рекомбинантным антителом человека в указанных концентрациях. Связывание антитела с бета-амилоидными бляшками в концентрациях, равных 50 пМ, позволяет предположить высокую аффинность связывания.

Фиг. 5 - со связыванием рекомбинантного антитела человека N1-101.11 с бета-амилоидными бляшками не конкурируют линейные синтетические Ν-концевые бета-амилоидные полипептиды. Со связыванием рекомбинантного антитела против мозгового бета-амилоида (0.5 нМ) не конкурирует полипептид, полученный из Ν-концевого бета-амилоида, представляющий собой положения с 1 по 16, в концентрации вплоть до 1 мкМ.

Фиг. 6 - рекомбинантное антитело человека N1-101.11 распознает конформационный бетаамилоидный эпитоп, который отсутствует в мономерном бета-амилоиде. Со связыванием N1-101.11 с бета-амилоидными бляшками на срезах мозга могут конкурировать бета-амилоидные фибриллы 1-42 (аминокислоты с 1 по 42), но не линейные синтетические бета-амилоидные мономеры 1-42.

Фиг. 7 - рекомбинантное антитело человека N1-101.11 не связывается с линейным, мономерным синтетическим бета-амилоидом на вестерн-блотах. Препараты мономерного бета-амилоида разделяли на неденатурирующем электрофорезе в полиакриламидном геле (ПААГ). Перенесенный на мембрану белок инкубировали с рекомбинантным антителом человека против бета-амилоида и контрольными антителами против ^концевых линейных последовательностей бета-амилоида (6Е10). Не было обнаружено свя

- 3 017611 зывания N1-101.11 с мономерным бета-амилоидом. Это наблюдение позволяет предположить, что указанное антитело узнает конформационный бета-амилоидный эпитоп.

Фиг. 8 - антитело человека N1-101.11 связывает искусственные амилоидные фибриллы, полученные из синтетических бета-амилоидных пептидов 1-42. Синтетические бета-амилоидные фибриллы или мономерный синтетический бета-амилоид, нанесенные на поверхность планшетов для твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЬ18А) при равных плотностях покрытия, инкубировали с рекомбинантными антителами человека против мозгового бета-амилоида в указанных концентрациях. Активность связывания антитела человека против мозгового бета-амилоида с искусственными амилоидными фибриллами (пустые квадраты) более чем в 100 раз выше по сравнению с мономерным бета-амилоидом (залитые квадраты). Контрольное антитело 22С4 предпочтительно связывается с мономерным бета-амилоидом (залитые круги) и в меньшей степени с фибриллами (пустые круги). Это позволяет предположить, что N1-101.11 узнает конформационный эпитоп, который также присутствует на искусственных амилоидных фибриллах, полученных из синтетических бета-амилоидных пептидов.

Фиг. 9 - отсутствие перекрестной реакции рекомбинантного антитела человека N1-101.11 с клеточным полноразмерным белком-предшественником амилоида (АРР) или с любой из его физиологических производных, встречающихся в культивируемых клетках. В противоположность контрольному антителу (6Е10), которое связывается с АРР на клеточной поверхности, связывание N1-101.11 с полноразмерным АРР, присутствующим на клеточных поверхностях, отсутствует. Эти результаты показывают отсутствие перекрестной реакции N1-101.11 с физиологическим клеточным полноразмерным АРР.

Фиг. 10 - отсутствие связывания N1-101.11 с мономерным бета-амилоидом показывали с помощью гель-хроматографии. На графиках А и В показано отсутствие связывания N1-101.11 или неродственного контрольного антитела с мономерным МТС-меченым бета-амилоидом 1-42, тогда как на графике С показано значительное связывание антитела 22С4, которое распознает линейный эпитоп, присутствующий на С-конце бета-амилоида.

Фиг. 11 - конкурентный ЕЫ8А, который показал, что связывание антитела 6Е10, антитела, направленного против линейного эпитопа на №конце бета-амилоида, может быть полностью блокировано в результате предварительной инкубации с избыточными концентрациями мономерных бета-амилоидных пептидов, тогда как предварительная инкубация с избыточными концентрациями этих препаратов мономерных бета-амилоидных пептидов не нарушала связывания N1-101.11.

Фиг. 12 - связывание №-101.13А и М-101.13В со срезами мозга, полученными из трансгенной модели болезни Альцгеймера на мышах Тд2676.

Фиг. 13 - ЕЫ8А, который показал предпочтительное связывание М-101.13А и М-101.13В с искусственными амилоидными фибриллами по сравнению с мономерным бета-амилоидом.

Фиг. 14 - на диаграмме А методом ЕЫ8А показано связывание рекомбинантного N1-101.12 с синтетическим бета-амилоидным пептидом 1-42. На диаграмме В показано, что связыванию N1-101.12 составлял конкуренцию избыточный бета-амилоидный пептид 1-42.

Фиг. 15 - рекомбинантное антитело человека N1-101.11 против мозгового бета-амилоида пересекает гематоэнцефалический барьер в трансгенной модели болезни Альцгеймера на мышах и связывается с мозговыми бета-амилоидными бляшками ίη νίνο.

Фиг. 16 - рекомбинантное антитело человека N1-101.11 улучшает аномальное познавательное поведение в трансгенной модели болезни Альцгеймера на мышах. Мышам агсАЬс1а в возрасте 24 месяца вводили еженедельно интраперитонеально 3 мг/кг антитела в течение 2 месяцев. Поведенческое тестирование в У-образном лабиринте выполняли до и после завершения лечения.

Фиг. 17 - прохождение гематоэнцефалического барьера и окрашивание амилоидных бляшек с помощью периферического введения N1-101.11. N1-101.11 может пересекать гематоэнцефалический барьер и связываться с бета-амилоидными отложениями у мышей, которым вводили N1-101.11 (левая часть), тогда как такого окрашивания не видно у животных, которым вводили контрольное антитело человека (правая часть). Рекомбинантное антитело человека N1-101.11 уменьшает содержание бета-амилоидных бляшек в мозге после системной терапии в течение двух месяцев.

Фиг. 18 - пассивная иммунизация N1-101.11 уменьшает содержание бета-амилоида у агсАЬс1а мышей. (А, В) Анализы на содержание бляшек с помощью красителей тиофлавина 8 (Тио-8) и конго красного показали значительное их уменьшение более чем на 50% по сравнению с животными, которым вводили контрольное антитело (ϋ-критерий Манна-Уитни; р=0.02 для коры головного мозга, р=0.009 для гиппокампа для анализа с помощью Тио-8 и р=0.009 для коры головного мозга и р=0.04 для гиппокампа для анализа с помощью конго красного). Измерительная линейка: 200 мкм (С-Е). Анализ с помощью тиофлавина 8 показал значительное снижение бета-амилоидной нагрузки (С), числа бета-амилоидных бляшек (Ό) и среднего размера бляшек (Е) у агсАЬс1а мышей, которым вводили N1-101.11, по сравнению с животными, подвергшимися контрольной обработке. ϋ-критерий Манна-Уитни: р=0.02 для площади бляшек в коре головного мозга; р=0.009 для площади бляшек в гиппокампе; р=0.047 для числа бляшек в коре головного мозга; р=0.047 для числа бляшек в гиппокампе; р=0.009 для размера бляшек в коре головного мозга; р=0.009 для размера бляшек в гиппокампе.

Фиг. 19 - уменьшение содержания бета-амилоида сопровождается пониженным астроцитозом и

- 4 017611 микроглиозом. На диаграмме А видно, что количественный анализ анти-СЕАР окрашивания выявил значительное уменьшение числа реактивных астроцитов в коре головного мозга мышей агсАЬе1а. которым вводили N1-101.11, по сравнению с трансгенными животными. подвергшимися контрольной обработке. На диаграмме В видно. что количественный анализ окрашивания ГЬа-1 показал тенденцию к уменьшению числа активированной микроглии у мышей. которым вводили ΝΓ-101.11. в коре головного мозга и гиппокампе. Измерительная линейка: 200 мкм.

Фиг. 20 - не было выявлено увеличения количества мозговых микрокровоизлияний после двух месяцев лечения рекомбинантным антителом человека ΝΓ-101.11. Мышам агсАЬс1а в возрасте 24 месяцев с подтвержденной массивной конгофильной амилоидной ангиопатией вводили еженедельно интраперитонеально 3 мг/кг антитела в течение 2 месяцев. Типичная картина мозгового микрокровоизлияния у агсАЬс1а мышей. выявленная с помощью окрашивания берлинской лазурью (слева). Количественный анализ показал значительно повышенную частоту микрокровоизлияний у атеАЬе1а трансгенных мышей по сравнению с однопометными мышами дикого типа. Длительное лечение ΝΓ-101.11 не приводило к повышенной частоте микрокровоизлияний. Измерительная линейка: 20 мкм.

Фиг. 21 - рекомбинантное антитело человека ΝΓ-101.11 ингибирует образование синтетических бета-амилоидных фибрилл ίη νίίτο. Эффект рекомбинантного антитела человека ΝΓ-101.11 на образование бета-амилоидных фибрилл анализировали путем измерения тиофлавина 8. связанного с агрегированным бета-амилоидом. с помощью флуоресцентного анализа.

Фиг. 22 - опосредованный антителом зависимый от дозы фагоцитоз ЕГТС-бета-амилоидных фибрилл 1-42 ВУ-2 микроглиальными клетками измеряли при ингибировании системы фагоцитарного рецептора. ΝΓ-101.11 инициирует эффективный зависимый от дозы фагоцитоз бета-амилоидных фибрилл. опосредованный Ес-гамма рецептором.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Г. Определения.

Стоит заметить. что употребление неопределенного артикля относится к единственному или множественному числу; например. антитело следует понимать представляющим одно или более антител. В силу этого. термины с неопределенным артиклем. один или более и по меньшей мере один можно применять взаимозаменяемо в данной заявке.

В данной заявке термин полипептид следует понимать охватывающим единственный полипептид. а также множество полипептидов. и он относится к молекуле. состоящей из мономеров (аминокислот). линейно связанных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин полипептид относится к любой цепи или цепям из двух или более аминокислот и не указывает на конкретную длину продукта. Таким образом. пептиды. дипептиды. трипептиды. олигопептиды. белок. цепь аминокислот или любой другой термин. применяемый для обозначения цепи или цепей из двух или более аминокислот. включены в определение полипептида. и термин полипептид можно применять вместо или взаимозаменяемо с любым из этих терминов.

Термин полипептид также подразумевается относящимся к продуктам постэкспрессионных модификаций полипептида. включая без ограничения гликозилирование. ацетилирование. фосфорилирование. амидирование. получения производных с помощью известных защитных/блокирующих групп. протеолитического расщепления или модификации не встречающимися в природе аминокислотами. Полипептид можно получить из природного биологического источника или получить с помощью рекомбинантной технологии. но он не обязательно должен быть транслирован из соответствующей последовательности нуклеиновых кислот. Его можно получить любым способом. включая химический синтез.

Полипептид согласно изобретению может иметь размер. составляющий приблизительно 3 или более. 5 или более. 10 или более. 20 или более. 25 или более. 50 или более. 75 или более. 100 или более. 200 или более. 500 или более. 1000 или более. или 2000 или более аминокислот. Полипептиды могут иметь определенную трехмерную структуру. хотя они не обязательно имеют подобную структуру. Полипептиды с определенной трехмерной структурой называют уложенными. и полипептиды. которые не обладают определенной трехмерной структурой. но предпочтительнее могут принимать большое число различных конформаций. называют развернутыми.

В данной заявке термин гликопротеин относится к белку. соединенному по меньшей мере с одной молекулой углевода. которая присоединена к белку с помощью боковой цепи аминокислотного остатка. содержащей атом кислорода или азота. например остаток серина или остаток аспарагина.

Под термином выделенный (изолированный) полипептид или его фрагмент. вариант или производное подразумевают полипептид. который более не находится в своем природном окружении. Не требуется определенный уровень очистки. Например. выделенный полипептид можно удалить из его нативной или природной среды. Полученные рекомбинантным способом полипептиды и белки. экспрессируемые в клетках-хозяевах. рассматриваются как выделенные для целей изобретения. так же. как и нативные или рекомбинантные полипептиды. которые были разделены. фракционированы или частично или. по существу. очищены с помощью любой подходящей методики.

Также включены в качестве полипептидов согласно изобретению фрагменты. производные. аналоги или варианты вышеупомянутых полипептидов и любая их комбинация. Термины фрагмент. вариант.

- 5 017611 производное и аналог, когда они употребляются по отношению к антителам или полипептидам антител согласно изобретению, включают любые полипептиды, которые сохраняют, по меньшей мере, некоторые из антигенсвязывающих свойств соответствующей нативной связывающей молекулы, антитела или полипептида. Фрагменты полипептидов согласно изобретению включают протеолитические фрагменты, а также делеционные фрагменты, вдобавок к специфичным фрагментам антител, описанным гделибо еще в данной заявке. Варианты антител и полипептидов антител согласно изобретению включают фрагменты, описанные выше, а также полипептиды с измененными последовательностями аминокислот вследствие замен, делеций или вставок аминокислот. Варианты могут встречаться в природе или могут быть не встречающимися в природе. Не встречающиеся в природе варианты можно получить, применяя известные в данной области методики мутагенеза. Измененные полипептиды могут включать консервативные или неконсервативные замены, делеции или вставки аминокислот. Производные от специфичных к неоэпитопам связывающих молекул, например антител и полипептидов антител согласно изобретению, представляют собой полипептиды, которые были изменены таким образом, что они проявляют дополнительные свойства, не обнаруживаемые у нативного полипептида. Примеры включают слитые белки. Измененные полипептиды также могут быть названы в данной заявке аналогами полипептидов. В данной заявке термин производное связывающей молекулы или ее фрагмента, антитела или полипептида антитела относится к указанному полипептиду, имеющему один или более остатков, химически измененных с помощью реакции функциональной боковой группы. Также включены в термин производные такие пептиды, которые содержат одно или более встречающихся в природе производных двадцати стандартных аминокислот. Например, 4-гидроксипролин может замещать пролин; 5-гидроксилизин может замещать лизин; 3-метилгистидин может замещать гистидин; гомосерин может замещать серин и орнитин может замещать лизин.

Термин полинуклеотид следует понимать охватывающим единственную нуклеиновую кислоту, а также множество нуклеиновых кислот, и относящимся к выделенной молекуле или конструкции нуклеиновой кислоты, например матричной РНК (мРНК) или плазмидной ДНК (пДНК). Полинуклеотид может включать обычную фосфодиэфирную связь или необычную связь (например, амидную связь, такую как обнаруженная в пептид-нуклеиновых кислотах (ПНК)). Термин нуклеиновая кислота относится к любому одному или более сегментам нуклеиновых кислот, например фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в полинуклеотиде. Под выделенной (изолированной) нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом подразумевается молекула нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, которая была удалена из природной среды. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий антитело, содержащийся в векторе, рассматривается как выделенный для целей изобретения. Дополнительные примеры выделенного полинуклеотида включают рекомбинантные полинуклеотиды, поддерживаемые в гетерологичных клеткаххозяевах, или очищенные (частично или по существу) полинуклеотиды в растворе. Выделенные молекулы РНК включают ίη νίνο или ίη νίΐτο РНК-транскрипты полинуклеотидов согласно изобретению. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты согласно изобретению дополнительно включают подобные молекулы, полученные синтетически. Вдобавок, полинуклеотид или нуклеиновая кислота могут представлять собой или могут включать регуляторный элемент, такой как промотор, сайт связывания рибосом или терминатор транскрипции.

В данной заявке термин кодирующий участок обозначает часть нуклеиновой кислоты, которая состоит из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя стоп-кодон (ТАС, ТСА или ТАА) не транслируется в аминокислоту, его можно рассматривать как часть кодирующего участка, но любые фланкирующие последовательности, например промоторы, сайты связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны и т.п., не являются частью кодирующего участка. Два или более кодирующих участков согласно изобретению могут присутствовать в одной полинуклеотидной конструкции, например на одном векторе, или в отдельных полинуклеотидных конструкциях, например на отдельных (различных) векторах. Более того, любой вектор может включать один кодирующий участок или может включать два или более кодирующих участков, например один вектор может отдельно кодировать вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина. Вдобавок, вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота согласно изобретению может кодировать гетерологичные кодирующие участки, либо слитые, либо неслитые с нуклеиновой кислотой, кодирующей связывающую молекулу, антитело, или его фрагмент, вариант или производное. Гетерологичные кодирующие участки включают, без ограничения, специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен.

В некоторых вариантах реализации указанный полинуклеотид или нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. В случае ДНК, полинуклеотид, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, обычно может включать промотор и/или другие регуляторные элементы транскрипции или трансляции, функционально связанные с одним или более кодирующими участками. Функциональная связь означает, что кодирующий участок для продукта гена, например полипептида, связан с одной или более регуляторными последовательностями таким образом, что экспрессия продукта гена находится под влиянием или контролем регуляторной последовательности(ей). Два фрагмента ДНК (такие как участок, кодирующий полипептид, и промотор, связанный с ним) являются функционально связанными, если

- 6 017611 индукция функции промотора приводит к транскрипции мРНК, кодирующей желаемый продукт гена, и если природа связи между двумя указанными фрагментами ДНК не препятствует способности экспрессионных регуляторных последовательностей направлять экспрессию продукта гена или не препятствует способности ДНК-матрицы транскрибироваться. Таким образом, промоторная область будет функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если промотор способен влиять на транскрипцию этой нуклеиновой кислоты. Промотором может быть специфичный для определенного типа клеток промотор, который направляет значительную транскрипцию ДНК лишь в определенных клетках. Другие транскрипционные регуляторные элементы, кроме промотора, например энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, могут быть функционально связаны с полинуклеотидом, чтобы направлять специфичную для определенного типа клеток транскрипцию. Подходящие промоторы и другие контролирующие транскрипцию участки описаны в данной заявке.

Множество участков, контролирующих транскрипцию, известно специалистам в данной области. Они включают, без ограничения, участки, контролирующие транскрипцию, которые функционируют в клетках позвоночных, таких как, но не ограниченных перечисленными, промоторные и энхансерные сегменты из цитомегаловирусов (предранний промотор, совместно с интроном-А), вируса обезьян 40 (ранний промотор) и ретровирусов (таких как вирус саркомы Рауса). Другие участки, контролирующие транскрипцию, включают участки, полученные из генов позвоночных, таких как гены актина, белка теплового шока, гормона роста крупного рогатого скота и β-глобина кролика, а также другие последовательности, способные контролировать экспрессию генов в эукариотических клетках. Дополнительные подходящие участки, контролирующие транскрипцию, включают тканеспецифичные промоторы и энхансеры, а также индуцируемые лимфокинами промоторы (например, промоторы, индуцируемые интерферонами или интерлейкинами).

Аналогично, множество трансляционных регуляторных элементов известно средним специалистам в данной области. Такие элементы включают, но не ограничены перечисленными, сайты связывания рибосом, кодоны инициации и терминации трансляции и элементы, полученные из пикорнавирусов (в частности, участок внутренней посадки рибосомы, или ΙΚΕ8, также называемый С1ТЕ последовательностью).

В других вариантах реализации полинуклеотид согласно изобретению представляет собой РНК, например, в виде матричной РНК (мРНК).

Кодирующие участки полинуклеотидов и нуклеиновых кислот согласно изобретению могут быть связаны с дополнительными кодирующими участками, которые кодируют секреторные или сигнальные пептиды, направляющие секрецию полипептида, кодируемого полинуклеотидом согласно изобретению. Согласно гипотезе сигнальной последовательности белки, секретируемые клетками млекопитающих, имеют сигнальный пептид или секреторную лидерную последовательность, которые отщепляются от зрелого белка сразу после инициации экспорта растущей белковой цепи через шероховатый эндоплазматический ретикулум. Для рядовых специалистов в данной области будет очевидно, что полипептиды, секретируемые клетками позвоночных, как правило, имеют сигнальный пептид, слитый с Ν-концом полипептида, который отщепляется от целого или полноразмерного полипептида и дает секретируемую или зрелую форму этого полипептида. В некоторых вариантах реализации применяют нативный сигнальный пептид, например сигнальный пептид тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, или функциональное производное этой последовательности, которое сохраняет способность направлять секрецию функционально связанного с ним полипептида. В качестве альтернативы можно применять гетерологичный сигнальный пептид млекопитающего или его функциональное производное. Например, лидерная последовательность дикого типа может быть замещена на лидерную последовательность тканевого активатора плазминогена (ТРА) человека или β-глюкуронидазы мыши.

Если не указано иначе, термины расстройство и заболевание используются взаимозаменяемо в данной заявке. Термин связывающая молекула в контексте изобретения относится в первую очередь к антителам и их фрагментам, но может также относиться к отличным от антител молекулам, которые связываются с неоэпитопом, включая, но не ограничиваясь перечисленными, гормоны, рецепторы, лиганды, молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС), шапероны, такие как белки теплового шока (БТШ), а также молекулы межклеточной адгезии, такие как члены суперсемейств кадгеринов, интегринов, лектинов С-типа и иммуноглобулинов (1д). Таким образом, исключительно с целью ясности и без ограничения объема изобретения, большинство из следующих вариантов реализации обсуждается в отношении антител и подобных антителам молекул, которые представляют собой предпочтительные связывающие молекулы для разработки терапевтических и диагностических агентов.

Термины антитело и иммуноглобулин используются взаимозаменяемо в данной заявке. Антитело или иммуноглобулин представляет собой антигенсвязывающую молекулу, которая включает, по меньшей мере, вариабельный домен тяжелой цепи и обычно включает, по меньшей мере, вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи. Основные структуры иммуноглобулинов у позвоночных относительно хорошо известны, см., например, Наг1о\с и др., АпйЬоФек: А ЬаЬога1огу Мапиа1 (Со1б 8рппд НагЬот ЬаЬога1огу Рге55. 2-е изд. 1988).

- 7 017611

Как более подробно описано ниже, термин иммуноглобулин включает различные обширные классы полипептидов, которые можно различить биохимически. Для специалиста в данной области будет очевидно, что тяжелые цепи классифицированы как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон (γ, μ, α, δ, ε) с некоторыми подклассами среди них (например, γ1-γ4). Именно природа этой цепи определяет класс антитела как 1дС, 1дМ, 1дА 1дС или 1дЕ соответственно. Подклассы иммуноглобулинов (изотипы), например 1дО1, 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дА1 и т.д. подробно описаны, и известно, что они определяют функциональную специализацию. Измененные варианты каждого из этих классов и изотипов хорошо различимы для специалиста в данной области ввиду настоящего описания и соответственно входят в объем изобретения. Все классы иммуноглобулинов явно входят в объем изобретения, последующее описание будет в основном направлено на класс 1дО молекул иммуноглобулинов. В отношении 1дС стандартная молекула иммуноглобулина включает два идентичных полипептида легких цепей, имеющих молекулярный вес приблизительно 23000 Да, и два идентичных полипептида тяжелых цепей, имеющих молекулярный вес 53000-70000. Четыре указанные цепи обычно соединены дисульфидными связями в Υ конфигурации, при этом легкие цепи захватывают в вилку тяжелые цепи, начиная с расхождения Υ и продолжаясь до конца вариабельной области.

Легкие цепи классифицируют как каппа, либо лямбда (к, λ). Каждый класс тяжелой цепи может быть связан либо с каппа, либо с лямбда легкой цепью. Как правило, легкие и тяжелые цепи ковалентно связаны друг с другом, и хвостовые части двух тяжелых цепей связаны друг с другом с помощью ковалентных дисульфидных связей или нековалентных связей, когда иммуноглобулины получены с помощью либо гибридом, либо В-клеток, либо генетически измененных клеток-хозяев. В тяжелой цепи последовательности аминокислот начинаются с Ν-конца на вилкообразном конце Υ конфигурации и заканчиваются С-концом внизу каждой цепи.

Как легкая, так и тяжелая цепи делятся на области структурной и функциональной гомологии. Термины константная и вариабельная применяют в зависимости от функции. В этом отношении должно быть очевидно, что вариабельные домены участков как легкой (УБ), так и тяжелой (УН) цепи определяют распознавание антигена и специфичность. Наоборот, константные домены легкой цепи (СЬ) и тяжелой цепи (СН1, СН2 или СН3) обеспечивают важные биологические свойства, такие как секреция, способность проходить через плаценту, связывание Ре-рецептора, связывание комплемента и т.п. По соглашению нумерация доменов константной области возрастает с удалением от сайта связывания антигена или от аминоконца антитела. Ν-концевая часть представляет собой вариабельную область и С-концевая часть представляет собой константную область; СН3 и СЬ домены фактически составляют карбоксильный конец тяжелой и легкой цепи соответственно.

Как указано выше, вариабельная область позволяет антителу селективно узнавать и специфично связывать эпитопы на антигенах. А именно, УБ домен и УН домен, или совокупность гипервариабельных участков (СИЯ), антитела объединяются с образованием вариабельной области, которая определяет трехмерный сайт связывания антигена. Эта четвертичная структура антитела образует сайт связывания антигена, присутствующий на конце каждого плеча Υ. В частности, сайт связывания антигена определяется тремя СЭК. на каждой из УН и УБ цепей. Любой фрагмент антитела или иммуноглобулина, который содержит структуру, достаточную для специфичного связывания с антигеном, именуется в данной заявке взаимозаменяемо как антигенсвязывающий фрагмент или иммуноспецифичный фрагмент.

Во встречающихся в природе антителах, шесть гипервариабельных участков или СЭЯ, присутствующих в каждом антигенсвязывающем домене, представляют собой короткие, не непрерывные последовательности аминокислот, которые специфично располагаются с образованием антигенсвязывающего домена, по мере того, как антитело принимает трехмерную конфигурацию в водной среде. Остальные аминокислоты в антигенсвязывающих доменах, называемые каркасными областями, проявляют меньшую межмолекулярную вариабельность. Каркасные области в значительной степени принимают βскладчатую конформацию и СЭЯ образуют петли, которые соединяются с ней, и в некоторых случаях формируют часть β-складчатой структуры. Таким образом, каркасные области образуют каркас, который обеспечивает позиционирование СЭЯ в правильной ориентации, посредством межцепочечных, нековалентных взаимодействий. Антигенсвязывающий домен, образованный позиционированными СЭЯ, определяет поверхность, комплементарную к эпитопу на иммунореактивном антигене. Эта комплементарная поверхность способствует нековалентному связыванию антитела с родственным эпитопом. Аминокислоты, составляющие СЭЯ и каркасные области, соответственно может легко идентифицировать рядовой специалист в данной области для любой данной вариабельной области тяжелой или легкой цепи, поскольку они были точно определены (см., Зесщепсек οί РгсИснъ οί 1ттипо1од1са1 1п1сгс51. КаЬа!, Е. и др., и.8. ИераПтеп! οί Неайй апб Нитап 8егу1сек (1983) и Οιοίΐιίη и Бекк, 1. Мо1. Βίο1., 196:901-917 (1987), которые полностью включены в данную заявку посредством ссылки).

В случае, когда существует два или более определений термина, который используется и/или принят в данной области, определение термина, используемого в данной заявке, следует понимать включающим все такие значения, за исключением случаев, когда четко указано противоположное. Конкретным примером является использование термина гипервариабельный участок (СЭЯ) для описания не

- 8 017611 непрерывных антигенсвязывающих центров, обнаруживаемых в вариабельной области полипептидов как тяжелой, так и легкой цепи. Эта конкретная область была описана у КаЬа! и др., И.8. Эср1. οί Нса1111 апб Нитап 8ету1се5, 8сс.|испсс5 οί РгсИспъ οί 1ттипо1од1са1 БИсгсй (1983) и у С1ю11иа и др., ί. Μοί. ΒίοΙ. 196:901-917 (1987), которые включены в данную заявку посредством ссылки, в которых определения включают перекрывающиеся аминокислотные остатки или их совокупность, если сравнивать эти определения друг с другом. Тем не менее, применение любого из определений по отношению к СЭВ антитела или его вариантам следует понимать входящим в объем термина, определенного и используемого в данной заявке. Подходящие аминокислотные остатки, которые охватывают СЭВ, определенные в каждой из цитированных выше ссылок, приведены ниже в табл. 1 для сравнения. Точное количество остатков, которые охватывает конкретный СЭВ, будет изменяться в зависимости от последовательности и размера СЭВ. Специалисты в данной области могут легко определить, какие остатки включены в конкретный СЭВ, образуя последовательность аминокислот вариабельной области антитела.

Таблица 1

Определения СЭВ1

нумерации, описанным у КаЬа! и др. (см. ниже).

КаЬа! и др. также определили систему нумерации для последовательностей вариабельного домена, которая применима для любого антитела. Рядовой специалист в данной области может однозначно применить эту систему нумерации по КаЬа! к любой последовательности вариабельного домена, без опоры на какие-либо экспериментальные данные, кроме самой последовательности. В данной заявке нумерация по КаЬа! относится к системе нумерации, предложенной КаЬа! и др., И.8. Эср1. οί НсаИй апб Нитап 8сгу1сс5, 8сс.|испсс5 οί Рго1сш5 οί Iттипο1οд^са1 1п1сгс51 (1983). Если не указано иначе, ссылки на нумерацию конкретных положений аминокислотных остатков в молекуле антитела или его антигенсвязывающем фрагменте, варианте или производном согласно изобретению даны согласно системе нумерации по КаЬаР

Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, иммуноспецифичные фрагменты, варианты или производные согласно изобретению включают, но не ограничены перечисленными, поликлональные, моноклональные, мультиспецифичные, человеческие, гуманизированные, приматизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, эпитопсвязывающие фрагменты, например РаЬ, РаЬ' и Р(аЬ')₂, Рб, Ρνβ, одноцепочечные Ρνβ (всРу), одноцепочечные антитела, связанные дисульфидными связями Ρνβ (β6Ρν), фрагменты, включающие либо УЪ, либо УН домен, фрагменты, полученные с помощью экспрессионной библиотеки РаЬ, и антиидиотипические (анти-1б) антитела (включая, например, анти-1б антитела к антителам, описанным в данной заявке). Молекулы 5сΡν известны в данной области и описаны, например, в патенте США № 5892019. Молекулы иммуноглобулинов или антител согласно изобретению могут быть любого типа (например, ЦС. 1дЕ, Ι§Μ, Ι§Ό, 1дА и Ι§Υ), класса (например, 1дС1, 1дС2, 1дС3. 1дС4, 1дА1 и 1дА2) или подкласса молекулы иммуноглобулина.

В одном варианте реализации антитело согласно изобретению не является 1дМ или его производным с пятивалентной структурой. В частности, в конкретных применениях согласно изобретению, особенно при терапевтическом применении, 1дМ являются менее полезными, чем 1дС и другие бивалентные антитела или соответствующие связывающие молекулы, поскольку 1дМ вследствие их пятивалентной структуры и отсутствия созревания аффинности часто вступают в неспецифичные перекрестные реакции и проявляют очень низкую аффинность.

Фрагменты антител, включая одноцепочечные антитела, могут включать вариабельную область(и) отдельно или в комбинации с целой или частью следующих областей: шарнирная область, СН1, СН2 и СН3 домены. Также включены в изобретение антигенсвязывающие фрагменты, также включающие лю

- 9 017611 бую комбинацию вариабельной области(ей) с шарнирной областью, СН1, СН2 и СН3 доменами. Антитела или их иммуноспецифичные фрагменты согласно изобретению могут иметь любое животное происхождение, включая птиц и млекопитающих. Предпочтительно антитела представляют собой антитела человека, мыши, осла, кролика, козы, морской свинки, верблюда, ламы, лошади или цыпленка. В другом варианте реализации вариабельная область может происходить из хрящевых рыб (например, из акул). В данной заявке антитела человека включают антитела, имеющие последовательность аминокислот иммуноглобулина человека и включают антитела, выделенные из людей-пациентов, библиотек иммуноглобулинов человека или из животных, трансгенных по одному или более иммуноглобулинам человека и которые не экспрессируют эндогенные иммуноглобулины, как описано ниже и, например, в патенте США № 5939598 у Кисйег1арай и др. Антитело человека все еще является человеческим, даже если сделаны замены аминокислот в указанном антителе, например, для улучшения характеристик связывания.

В данной заявке термин часть тяжелой цепи включает последовательности аминокислот, полученные из тяжелой цепи иммуноглобулина. Полипептид, включающий часть тяжелой цепи, включает по меньшей мере один из перечисленных: СН1 домен, шарнирный домен (например, верхнюю, среднюю и/или нижнюю шарнирную области), СН2 домен, СН3 домен или их вариант или фрагмент. Например, связывающий полипептид для применения в настоящем изобретении может включать полипептидную цепь, включающую СН1 домен; полипептидную цепь, включающую СН1 домен, по меньшей мере часть шарнирного домена и СН2 домен; полипептидную цепь, включающую СН1 домен и СН3 домен; полипептидную цепь, включающую СН1 домен, по меньшей мере часть шарнирного домена и СН3 домен, или полипептидную цепь, включающую СН1 домен по меньшей мере часть шарнирного домена, СН2 домен и СН3 домен. В другом варианте реализации полипептид согласно изобретению включает полипептидную цепь, включающую СН3 домен. Дополнительно, в связывающем полипептиде для применения в настоящем изобретении может отсутствовать по меньшей мере часть СН2 домена (например, весь или часть СН2 домена). Как указано выше, для рядового специалиста в данной области будет очевидно, что эти домены (например, части тяжелой цепи) можно модифицировать таким образом, что они будут отличаться по последовательности аминокислот от встречающейся в природе молекулы иммуноглобулина.

В некоторых антителах или их антигенсвязывающих фрагментах, вариантах или производных, описанных в данной заявке, части тяжелой цепи одной полипептидной цепи мультимера идентичны таковым на второй полипептидной цепи мультимера. В качестве альтернативы мономеры, содержащие части тяжелой цепи согласно изобретению, не идентичны. Например, каждый мономер может включать различный сайт связывания мишени, образуя, например, биспецифичное антитело.

Части тяжелой цепи связывающего полипептида для применения в способах диагностики и лечения, описанных в данной заявке, можно получить из различных молекул иммуноглобулинов. Например, часть тяжелой цепи полипептида может включать СН1 домен, полученный из молекулы 1дС1, и шарнирную область, полученную из молекулы 1дС3. В другом примере часть тяжелой цепи может включать шарнирную область, полученную частично из молекулы 1дС1 и частично из молекулы 1дС3. В другом примере часть тяжелой цепи может включать химерный шарнир, полученный частично из молекулы 1дС1 и частично из молекулы 1дС4.

В данной заявке термин часть легкой цепи включает последовательности аминокислот, полученные из легкой цепи иммуноглобулина. Предпочтительно часть легкой цепи включает по меньшей мере один из УЪ или СЬ доменов.

Минимальным размером пептидного или полипептидного эпитопа для антитела считают приблизительно четыре-пять аминокислот. Пептидные или полипептидные эпитопы предпочтительно содержат по меньшей мере 7, более предпочтительно по меньшей мере 9 и наиболее предпочтительно между по меньшей мере приблизительно 15 и приблизительно 30 аминокислотами. Поскольку СЭЯ может узнавать антигенный пептид или полипептид в его третичной структуре, аминокислоты, составляющие эпитоп, не должны располагаться непрерывно, и, в некоторых случаях, могут даже не быть на одной и той же пептидной цепи. В настоящем изобретении пептидный или полипептидный эпитоп, узнаваемый антителами согласно изобретению, содержит последовательность из по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, более предпочтительно по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или между приблизительно 15 и приблизительно 30 непрерывных или не непрерывных аминокислот β-амилоида (Αβ).

Термин неоэпитоп в соответствии с настоящим изобретением обозначает эпитоп, который уникален для клинической картины болезни и содержится или образован белком, связанным с расстройством, который представляет собой патологический вариант в противном случае непатологического белка и/или отклоняется от физиологии здорового состояния. Указанные патофизиологические варианты могут образовываться в результате патологически измененной транскрипции, патологически измененной трансляции, посттрансляционной модификации, патологически измененного протеолитического процессинга, патологически измененного образования комплекса с физиологическими или патофизиологическими взаимодействующими партнерами или клеточными структурами в смысле измененной колокализации,

- 10 017611 или в результате патологически измененной структурной конформации - как, например, агрегация, олигомеризация или фибриллообразование, в которой трех- или четырехмерная структура отличается от структуры физиологически активной молекулы. Более того, патофизиологический вариант может также характеризоваться тем, что он не находится в обычной физиологической среде или компартменте клетки. В качестве примера неоэпитопы могут быть расположены в явно патологических структурах в областях тканей мозга, которые очевидно претерпевают или уже перенесли функциональное повреждение. Имеет ли данная структура, например клетка или ткань либо белок, неоэпитоп, можно проверить путем реверсирования способа, описанного ниже для выделения и характеристики специфичной молекулы, связывающей белок, связанный с расстройством, в котором связывающая молекула, например антитело, идентифицированное с помощью указанного способа, применяется для скрининга образца на связывание с указанным антителом, тем самым позволяя определить присутствие неоэпитопа.

Фразы специфичный к белку, связанному с заболеванием и специфичный к неоэпитопу используются взаимозаменяемо в данной заявке с термином специфично распознающий неоэпитоп. В данной заявке термины, такие как отсутствие перекрестной реакции, специфичный, специфично распознающий, специфично связывающий, предпочтительно связывающий и т.п., относятся к способности связывающей молекулы проводить различие между неоэпитопом белка, связанного с расстройством, и нативным белком дикого типа и природной среде. Таким образом, связывающая молекула согласно изобретению имеет предпочтительную аффинность связывания с неоэпитопом, чем с нативным белковым антигеном, большую по меньшей мере в два раза, предпочтительно по меньшей мере в 5 раз, обычно более чем в 10 раз, особенно предпочтительно в 50 раз и еще более предпочтительно больше чем в 100 раз. Более того, относительная К_с связывающей молекулы, например антитела, для специфичного целевого эпитопа, например неоэпитопа, предпочтительно по меньшей мере в 10 раз меньше, более предпочтительно по меньшей мере в 100 раз меньше или больше, чем К_с связывания этого антитела с другими лигандами или с нативным аналогом связанного с заболеванием белка.

Под терминами специфично связывает или специфично распознает, используемыми взаимозаменяемо в данной заявке, обычно подразумевают, что связывающая молекула, например антитело, связывается с эпитопом посредством своего антигенсвязывающего домена, и что связывание включает некоторую комплементарность между антигенсвязывающим доменом и эпитопом. Согласно этому определению, говорят, что антитело специфично связывается с эпитопом, когда оно связывается с этим эпитопом, посредством своего антигенсвязывающего домена, лучше, чем оно бы связывалось с произвольным неродственным эпитопом. Термин специфичность используется в данной заявке, чтобы определить относительную аффинность, с которой некоторое антитело связывается с некоторым эпитопом. Например, антитело А может считаться имеющим более высокую специфичность к данному эпитопу, чем антитело В, или можно сказать, что антитело А связывается с эпитопом С с более высокой специфичностью, чем оно имеет по отношению к родственному эпитопу Ό.

Под предпочтительно связывает подразумевается, что связывающая молекула, например антитело, специфично связывается с эпитопом лучше, чем оно бы связывалось с родственным, подобным, гомологичным или аналогичным эпитопом. Таким образом, антитело, которое предпочтительно связывается с данным эпитопом, будет скорее связываться с этим эпитопом, чем с родственным эпитопом, даже если такое антитело может вступать в перекрестную реакцию с родственным эпитопом.

В качестве неограничивающего примера может считаться, что связывающая молекула, например антитело, предпочтительно связывает первый эпитоп, если она связывает указанный первый эпитоп с константой диссоциации (К_с), которая меньше, чем К_с указанного антитела для второго эпитопа. В другом неограничивающем примере может считаться, что антитело предпочтительно связывает первый антиген, если оно связывает указанный первый эпитоп с аффинностью, которая по меньшей мере на один порядок меньше, чем К_с указанного антитела для второго эпитопа. В другом неограничивающем примере может считаться, что антитело предпочтительно связывает первый эпитоп, если оно связывает указанный первый эпитоп с аффинностью, которая по меньшей мере на два порядка меньше, чем К_с указанного антитела для второго эпитопа.

В другом неограничивающем примере может считаться, что связывающая молекула, например антитело, предпочтительно связывает первый эпитоп, если она связывает указанный первый эпитоп со скоростью диссоциации (к(оГГ)), которая меньше, чем к(оГГ) указанного антитела для второго эпитопа. В другом неограничивающем примере, может считаться, что антитело предпочтительно связывает первый эпитоп, если оно связывает указанный первый эпитоп с аффинностью, которая по меньшей мере на один порядок меньше, чем к(оГГ) указанного антитела для второго эпитопа. В другом неограничивающем примере может считаться, что антитело предпочтительно связывает первый эпитоп, если оно связывает указанный первый эпитоп с аффинностью, которая по меньшей мере на два порядка меньше чем к(оГГ) указанного антитела для второго эпитопа.

Можно сказать, что связывающая молекула, например антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, описанные в данной заявке, связывает целевой полипептид, описанный в данной заявке, или его фрагмент либо вариант, со скоростью диссоциации (к(оГГ)), меньшей или равной 5х10^- с^-, 10^- с^- , 5х10^- с^- или 10^- с^- . Более предпочтительно можно сказать, что антитело согласно

- 11 017611 изобретению связывает целевой полипептид, описанный в данной заявке, или его фрагмент либо вариант со скоростью диссоциации (к(оГГ)). меньшей или равной 5х10^-4 с^-1, 10^-4с^-1, 5х10^-5с^-1 или

10^-5с^-1, 5х10^-6с^-1, 10^-6 с^-1, 5х10^-7 с^-1 или 10^-7 с^-1.

Можно сказать, что связывающая молекула, например антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, описанные в данной заявке, связывает целевой полипептид, описанный в данной заявке, или его фрагмент либо вариант со скоростью ассоциации (к(оп)), большей или равной 10³ М^-1 с^-1, 5х10³ М^-1 с^-1, 10⁴ М^-1 с^-1 или 5х10⁴ М^-1 с^-1. Более предпочтительно можно сказать, что антитело согласно изобретению связывает целевой полипептид, описанный в данной заявке, или его фрагмент либо вариант со скоростью ассоциации (к(оп)), большей или равной 10⁵ М^-1 с^-1, 5х10⁵ М^-1 с^-1, 10⁶ М^-1 с^-1, или 5х10⁶ М^-1 с^-1, или 10⁷ М^-1 с^-1.

Говорят, что связывающая молекула, например антитело, конкурентно ингибирует связывание ан титела для сравнения с данным эпитопом, если оно предпочтительно связывается с этим эпитопом в такой мере, что оно блокирует, до некоторой степени, связывание антитела для сравнения с эпитопом. Конкурентное ингибирование можно определить любым способом, известным в данной области, например с помощью конкурентных тестов ЕЫ8А. Можно сказать, что антитело конкурентно ингибирует связывание антитела для сравнения с данным эпитопом на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 50%.

В данной заявке термин аффинность относится к мере силы связывания отдельного эпитопа с СОВ связывающей молекулы, например молекулы иммуноглобулина, см., например, Наг1оте и др., ΆηΐίЬоШсх: А ЬаЬога1огу Мапиа1 (СоИ 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Рге55, 2-е изд. 1988) на с. 27, 28. В данной заявке термин авидность относится к суммарной стабильности комплекса между популяцией иммуноглобулинов и антигеном, а именно к силе функционального объединения смеси иммуноглобулинов с антигеном, см., например, Наг1оте на с. 29-34. Авидность относится как к аффинности отдельных молекул иммуноглобулинов в популяции к конкретным эпитопам, так и к валентностям иммуноглобулинов и антигена. Например, взаимодействие между бивалентным моноклональным антителом и антигеном с многократно повторяющейся структурой эпитопа, таким как полимер, будет иметь высокую авидность.

Связывающие молекулы, например антитела, или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные согласно изобретению, можно также описать или определить в контексте их способности вступать в перекрестные реакции. В данной заявке термин способность вступать в перекрестные реакции относится к способности антитела, специфичного к одному антигену, реагировать со вторым антигеном; мера родства между двумя различными антигенными веществами. Таким образом, антитело вступает в перекрестные реакции, если оно связывается с эпитопом, отличным от того, который индуцировал образование этого антитела. Вступающий в перекрестные реакции эпитоп, как правило, содержит многие из тех же комплементарных структурных особенностей, что и индуцирующий эпитоп, и, в некоторых случаях, возможно фактически лучше подходит, чем исходный.

Например, некоторые антитела имеют некоторую степень способности вступать в перекрестные ре акции, заключающуюся в том, что они связывают родственные, но не идентичные эпитопы, например эпитопы с по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 55% и с по меньшей мере 50% идентичностью (рассчитывали, применяя способы, известные в данной области и описанные в данной заявке) с эпитопом для сравнения. Можно сказать, что антитело имеет небольшую или не имеет вовсе способности вступать в перекрестные реакции, если оно не связывает эпитопы с менее чем 95%, менее чем 90%, менее чем 85%, менее чем 80%, менее чем 75%, менее чем 70%, менее чем 65%, менее чем 60%, менее чем 55% и менее чем 50% идентичностью (рассчитывали, применяя способы, известные в данной области и описанные в данной заявке) с эпитопом для сравнения. Антитело может считаться высокоспецифичным к некоторому эпитопу, если оно не связывает любой другой аналог, ортолог или гомолог этого эпитопа.

Связывающие молекулы, например антитела, или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные согласно изобретению, можно также описать или определить в контексте их аффинности связывания с полипептидом согласно изобретению. Предпочтительные аффинности связывания включают такие, которые имеют константу диссоциации или Κά меньше чем 5х10^-2 М, 10^-2 М, 5х10^-3 М, 10^-3 М, 5х10^-4 М, 10^-4 М, 5х10^-5 М, 10^-5 М, 5х10^-6 М, 10^-6 М, 5х10^-7 М, 10^-7 М, 5х10^-8 М, 10^-8 М, 5х10^-9 М, 10^-9 М, 5х10^-10 М, 10^-10 М, 5х10^-11 М, 10^-11 М, 5х10^-12 М, 10^-12 М, 5х10^-13 М, 10^-13 М, 5х10^-14 М, 10^-14 М, 5х10^-15 М или 10^-15 М.

Как было указано ранее, субъединичные структуры и трехмерная конфигурация константных областей иммуноглобулинов различных классов хорошо известны. В данной заявке термин УН домен включает аминоконцевой вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина и термин СН1 домен включает первый (наиболее аминоконцевой) домен константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. СН1 домен расположен рядом с УН доменом и находится с аминоконцевой стороны от шарнирной области тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина.

В данной заявке термин СН2 домен включает часть молекулы тяжелой цепи, которая продолжает

- 12 017611 ся, например, от приблизительно остатка 244 до остатка 360 антитела, если использовать обычные схемы нумерации (остатки с 244 по 360, система нумерации по КаЬа1; и остатки 231-340, европейская система нумерации; см. КаЬа1 Е.А. и др. в цитируемой работе). СН2 домен уникален тем, что он не спарен тесно с другим доменом. Скорее, две связанные по Ν-концам разветвленные углеводные цепи находятся между двумя СН2 доменами интактной нативной молекулы 1дС. Также доказано, что СН3 домен продолжается от СН2 домена к С-концу молекулы 1дС и включает приблизительно 108 остатков.

В данной заявке термин шарнирная область включает часть молекулы тяжелой цепи, соединяет СН1 домен с СН2 доменом. Эта шарнирная область включает приблизительно 25 остатков и является гибкой, таким образом позволяя двум Ν-концевым антигенсвязывающим областям перемещаться независимо. Шарнирные области можно подразделить на три отдельных домена: верхний, средний и нижний шарнирные домены (Яоих и др., 1. 1ттипо1. 161:4083 (1998)).

В данной заявке термин дисульфидная связь включает ковалентную связь, образованную между двумя атомами серы. Аминокислота цистеин включает тиольную группу, которая может образовывать дисульфидную связь или мостик со второй тиольной группой. В большинстве встречающихся в природе молекул 1дО, СН1 и СЬ области связаны дисульфидной связью и две тяжелые цепи связаны двумя дисульфидными связями в положениях, соответствующих 239 и 242 в системе нумерации по КаЬа1 (положение 226 или 229, европейская система нумерации).

В данной заявке термин сконструированное антитело относится к антителу, в котором вариабельный домен либо в тяжелой, либо в легкой цепи, либо в обеих изменен с помощью, по меньшей мере, частичного замещения одного или более СЭЯ от антитела с известной специфичностью и, если это необходимо, с помощью частичного замещения каркасной области и изменения последовательности. Хотя СЭЯ можно получить от антитела того же класса или даже подкласса, что и антитело, от которого происходят каркасные области, предусмотрено, что СЭЯ будут получены от антитела другого класса и предпочтительно от антитела из другого вида. Сконструированное антитело, в котором один или более донорных СЭЯ из не принадлежащего человеку антитела с известной специфичностью привит на каркасную область тяжелой или легкой цепи антитела человека, называется в данной заявке гуманизированным антителом. Замещение всех СЭЯ на целые СЭЯ из донорной вариабельной области для переноса антигенсвязывающей способности от одного вариабельного домена на другой необязательно. Предпочтительнее может быть необходимым только перенос таких остатков, которые необходимы для поддержания активности сайта связывания мишени. Учитывая объяснения, приведенные, например, в патентах США №№ 5585089, 5693761, 5693762 и 6180370, будет вполне в рамках компетенции специалистов в данной области, либо путем проведения обычных экспериментов, либо методом проб и ошибок, получить функциональное сконструированное или гуманизированное антитело.

В данной заявке термин правильно уложенный полипептид включает полипептиды, в которых все функциональные домены, составляющие полипептид, являются отдельно активными. В данной заявке термин неправильно уложенный полипептид включает полипептиды, в которых по меньшей мере один из функциональных доменов полипептида не активен. В одном варианте реализации правильно уложенный полипептид включает полипептидные цепи, связанные с помощью по меньшей мере одной дисульфидной связи, и, наоборот, неправильно уложенный полипептид включает полипептидные цепи, не связанные по меньшей мере одной дисульфидной связью.

В данной заявке термин сконструированное включает манипулирование над молекулами нуклеиновых кислот или полипептидов с помощью средств синтеза (например, с помощью рекомбинантных методик, пептидного синтеза ίη νίΐτο, путем ферментативного или химического сшивания пептидов или с помощью некоторой комбинации этих методик).

В данной заявке термины связанные, слитые или слияние используются взаимозаменяемо. Эти термины относятся к соединению двух или более элементов или компонентов с помощью любых средств, включая химическое сопряжение или рекомбинантные средства. Слияние с сохранением рамки считывания относится к соединению двух или более открытых рамок считывания (ОРС) полинуклеотидов с образованием непрерывной более длинной ОРС таким образом, что сохраняется правильная трансляционная рамка считывания исходных ОРС. Таким образом, рекомбинантный слитый белок представляет собой один белок, содержащий два или более сегмента, которые соответствуют полипептидам, кодируемым исходными ОРС (эти сегменты обычно не соединены подобным образом в природе). Хотя рамка считывания, таким образом, сделана непрерывной на протяжении всех слитых сегментов, сегменты могут быть физически или пространственно разделены, например, с помощью линкерной последовательности, сохраняющей рамку считывания. Например, полинуклеотиды, кодирующие СЭЯ вариабельной области иммуноглобулина могут быть слиты с сохранением рамки считывания, но разделены полинуклеотидом, кодирующим по меньшей мере одну каркасную область иммуноглобулина или дополнительные СЭЯ области при условии, что слитые СЭЯ совместно транслируются как часть непрерывного полипептида.

В контексте полипептидов, линейная последовательность или последовательность представляет собой порядок аминокислот в полипептиде в направлении от аминоконца к карбоксильному концу, в котором остатки, находящиеся рядом друг с другом в последовательности, расположены непрерывно в

- 13 017611 первичной структуре полипептида.

Термин экспрессия в данной заявке относится к процессу, с помощью которого ген продуцирует биохимическую молекулу, например РНК или полипептид. Указанный процесс включает любое проявление функционального присутствия гена внутри клетки, включая, без ограничения, нокдаун гена, а также как временную экспрессию, так и стабильную экспрессию. Он включает, без ограничения, транскрипцию гена в матричную РНК (мРНК), транспортную РНК (тРНК), малую шпилечную РНК (мшРНК), малую интерферирующую РНК (миРНК) или любой другой РНК-продукт, и трансляцию таких мРНК в полипептид(ы). Если конечный желаемый продукт представляет собой биохимическую молекулу, экспрессия включает создание этой биохимической молекулы и любых предшественников. Экспрессия гена дает генетический продукт. В данной заявке термин генетический продукт может обозначать либо нуклеиновую кислоту, например матричную РНК, полученную путем транскрипции гена, либо полипептид, который транслирован из транскрипта. Генетические продукты, описанные в данной заявке, дополнительно включают нуклеиновые кислоты с посттранскрипционными модификациями, например полиаденилирование, или полипептиды с посттрансляционными модификациями, например метилирование, гликозилирование, добавление липидов, связывание с другими субъединицами белка, протеолитическое расщепление и т.п.

В данной заявке термины лечить или лечение относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или предупредительным мерам, целью которых является предотвратить или замедлить (уменьшить) нежелательное физиологическое изменение или расстройство, такое как развитие или распространение рака. Полезные или желаемые клинические результаты включают, но не ограничены перечисленными: купирование симптомов, сокращение продолжительности заболевания, стабилизирование (т.е. отсутствие ухудшения) состояния болезни, приостановку или замедление прогрессирования заболевания, снижение выраженности или временное облегчение болезненного состояния, и ремиссию (частичную либо полную), либо детектируемые, либо недетектируемые. Лечение может также означать продление выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью в отсутствии данного лечения. Нуждающиеся в лечении включают тех, кто уже находится в патологическом состоянии или имеет расстройство, а также тех, кто подвержен патологическому состоянию или расстройству, или тех, у которых надо предотвратить проявление патологического состояния или расстройства.

Под субъектом, или индивидуумом, или животным, или пациентом, или млекопитающим подразумевается любой субъект, в особенности млекопитающий, например пациент-человек, которому требуется диагностика, прогноз, предотвращение патологического состояния или терапия.

II. Способы идентификации связывающих молекул.

Изобретение в целом относится к средствам и способам обнаружения терапевтически эффективных антител в заранее выбранных по симптоматике людях. Как показано в примерах, антитела человека против аномальных структур при заболеваниях мозга человека можно выделить из фенотипически здоровых, или клинически необычно стабильных, пациентов и соответствующие рекомбинантные антитела можно успешно применять для лечения, снижения выраженности патологии и предотвращения нарушения мозговой функции без значительных побочных эффектов. Клиническую стабильность или отсутствие прогрессирования заболевания можно определить в качестве примера с помощью измерения в динамике по времени клинического, например когнитивного, статуса (путем нейропсихологического тестирования, например); установления общего функционального уровня; оценки способностей к самообслуживанию или расстройств поведения; объемного (волюметрического) анализа структур мозга; измерения ίη νίνο патологических отложений аномальных белков в мозге (например, визуализации бета-амилоида с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ)) или биохимических изменений в биологических жидкостях (например, тау-протеины или бета-амилоидные пептиды) и путем сравнения с естественным течением/историей болезни. Таким образом, изобретение обеспечивает антитела и связывающие молекулы, которые способны узнавать неоэпитопы связанных с заболеванием белков, которые происходят из нативных эндогенных белков и преобладают в организме пациента в измененной форме, например в виде патологического белка и/или вне рамок их нормального физиологического состояния. В частности, обеспечены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые проявляют свойства иммунологического связывания и/или биологические свойства, которые перечислены для антитела, описанного в примерах. Когда встречается термин свойства иммунологического связывания или другие характеристики связывания антитела с антигеном, во всех грамматических формах, он относится к специфичности, аффинности, способности вступать в перекрестные реакции и другим характеристикам связывания антитела. Разумеется, изобретение распространяется на продуцирующие антитела линии клеток, а также на рекомбинантные клетки. Изобретение дополнительно относится к диагностическим тестам и наборам, которые включают связывающую молекулу согласно изобретению, и к терапевтическим способам и терапевтическим оценкам, основанным на них. Изобретение основывается на наблюдении, что у людей и пациентов, заранее выбранных согласно особым клиническим критериям, которые несут риск развития неврологического расстройства, такого как старческая болезнь Альцгеймера, что относится к гуморальной защите, могут также обнаруживаться антитела к эндогенным патофизиологическим вариантам, таким как агрегаты бета-амилоидных пептидов, нейрофибриллярные клубки, дистрофичные нейриты и

- 14 017611 дополнительные клеточные структуры, которые являются нейропатологической характерной особенностью для данного расстройства. Эти структуры можно обнаружить отдельно или в комбинации с другими патологическими структурами, и они могут, как в случае агрегатов бета-амилоида и предшественников нейрофибриллярных клубков, привести к развитию патологических эффектов. Тем не менее, те антитела, которые специфично узнают указанные структуры, не проявляют или проявляют значительно меньшую способность вступать в перекрестные реакции с нормальными физиологически функциональными формами белков, лежащих в основе патологических структур, в противоположность известному случаю аутоиммунного ответа.

Без привязки к теории, на основании экспериментов, выполненных в соответствии с настоящим изобретением, можно предположить, что расстройство не обязательно очевидно и заметно фенотипически, как в случае инфекции, чтобы привести к экспериментально измеримой активности гуморальной иммунной системы, как, например, продукция или активация специфичных В-клеток или В-клеток памяти. В случае опухолевых клеток или дифференцированных клеток, которые должны быть физиологически утилизированы, уже известны механизмы, в которых партнеры, такие как Т4-хелперные клетки, цитотоксические Т-клетки и естественные клетки-киллеры клеточной иммунной системы, действуют совместно, чтобы индуцировать апоптоз. Следует предположить, что, также у здорового человека, опухолевые клетки или их предшественники образуются ежедневно путем мутации. Тем не менее, они незамедлительно подвергаются апоптозу посредством гуморальных и клеточных механизмов таким образом, что опухоль не детектируется. В этом смысле термин здоровый, или клинически необычно стабильный, пациент не должен пониматься обозначающим индивидуума, у которого не происходят приводящие к заболеванию события, но обозначает индивидуума, у которого разнообразные приводящие к заболеванию события контролируются с помощью механизмов блокирования или защиты перед тем, как они смогли бы фенотипически проявиться.

Ввиду сказанного выше, была выдвинута гипотеза в соответствии с настоящим изобретением, что должно оказаться возможным выявить антитело или продуцирующую антитело клетку у особых групп пациентов или здоровых субъектов, которые были заранее выбраны согласно клиническим критериям, без предварительного изучения молекулярной природы эпитопа целевой структуры, например неоэпитопа, при этом указанное антитело в случае уже преобладающей толерантности у донорного организма, что, например, доказано отсутствием аутоиммунных реакций, можно успешно применять против заболевания в виде полученного рекомбинантным способом агента. Идентификацию такого антитела можно, таким образом, осуществить без предварительного изучения молекулярного эпитопа целевой структуры, но скорее лишь с помощью его связывания с неоэпитопами очевидных патологических структур в хорошо клинико-патологически описанных срезах тканей, полученных из пациентов-людей или из моделей соответствующего заболевания на животных.

Соответственно в первом аспекте изобретение относится к способу выделения связывающей молекулы, специфичной к белку, связанному с расстройством, включающему:

(a) приведение во взаимодействие образца, полученного от пациента, у которого отсутствуют симптомы, или который клинически необычно стабилен, но который страдает или подвержен риску развития расстройства или эффективно подавляет проявление или вспышку расстройства, с препаратом патологически или физиологически измененных клеток или ткани с заранее определенными клиническими характеристиками; и (b) идентификацию и возможно выделение связывающей молекулы, которая предпочтительно связывается с указанным препаратом, и не связывается или связывается со значительно более низкой аффинностью с соответствующими клетками или тканями без подобных патологических характеристик, которые можно получить из здорового субъекта.

Способ согласно изобретению можно осуществить, как описано в разделе Примеры, используя средства, хорошо известные специалисту в данной области. Например, образец в жидком агрегатном состоянии, полученный от пациента, можно пропустить через первое отверстие трубки, которая контактирует с препаратом с целевой структурой, прочно закрепленным в камере для препарата, позволяя, тем самым, предполагаемым связывающим молекулам, присутствующим в образце, либо в растворимой форме, либо экспрессируемым на поверхности и мембране клетки, соответственно связываться с указанной целевой структурой. Образец в жидком агрегатном состоянии может содержать, например, лимфоциты и/или антитела, тогда как препаратом может быть срез ткани или мембрана, покрытая молекулами или комбинациями молекул, которые являются отличительными для патологической целевой структуры.

Любую несвязавшуюся субстанцию можно удалить через второе отверстие трубки. В то же время, температуру камеры для препарата можно контролировать с помощью термостата для камеры для препарата, например, на таком уровне температуры, при котором происходит естественное связывание предполагаемой связывающей молекулы с неоэпитопом антигена, специфичным к препарату, в организме человека. С помощью движения потока, например пропускания образца в жидком агрегатном состоянии, содержащего связывающие молекулы, предпочтительно при температуре тела, через целевую структуру, можно стимулировать природные системы связывающих взаимодействий. Тем не менее, другие способы инкубации образца с препаратом, такие как с помощью шейкера или вращающейся платформы, можно

- 15 017611 также успешно применять. В частности, преимущество вышеупомянутой системы состоит в том, что она позволяет прерывание метаболических процессов в любое время путем повышения температуры камеры для препарата с помощью термостата камеры для препарата. При этом температуру камеры для препарата можно снизить, например, до 2-10°С, в частности до 4°С. Соответствующий прибор, который можно применять в соответствии со способом изобретения, описан в европейской заявке на патент ЕР 1069431 А2. Следовательно, способ согласно изобретению позволит идентификацию и характеристику сливающихся клеток, а также одновременную идентификацию и характеристику молекулярных классов, молекулярных групп и/или молекулярных частей, требующихся для процесса связывания, т.е. целевых структур препарата, которые до настоящего времени могли оставаться неизвестными. Это не только позволит открыть новые возможные способы диагностики, но также обеспечит новую тест-систему для терапевтических подходов на молекулярном уровне.

В качестве пациента можно определить в соответствии с настоящим изобретением группу здоровых добровольцев, если специфичные суррогатные маркеры предсказывают высокую вероятность статуса заболевания, которое, на удивление - и возможно вследствие специфичного эндогенного иммунного ответа, - тем не менее, не проявилось клинически. В этом смысле, как подверженный различным заболеваниям, здоровый пожилой человек будет индивидуумом, у которого еще не проявилось нейродегенеративное заболевание, как, например, болезнь Альцгеймера или болезнь Паркинсона, но у которого доклиническое развитие патофизиологических вариантов белка, т. е. белков, связанных с расстройством, и в вышеупомянутом смысле посредством раннего вмешательства гуморальной иммунной системы с вовлечением или без клеточных компонентов иммунной системы, было ограничено или отсрочено до такой степени, что, к моменту участия здоровых, но не доклинических пациентов, в данном исследовании, клиническое проявление заболевания еще не произошло. Предпочтительно не привлекающих внимания добровольцев, у которых ни не было диагностировано аутоиммунологических процессов, ни возникало в качестве побочных эффектов других возможных патологических состояний, привлекали в качестве доноров образцов в первом примере.

В принципе, можно использовать образцы от пациентов, которых подвергли активной иммунизации вариантами физиологических белков или пептидов, у которых выработка антител была форсирована иммунизацией.

Антитела, например, можно идентифицировать и выделить из пациентов с болезнью Альцгеймера, которых вакцинировали бета-амилоидным пептидом, см., например, Носк и др., Ыа!иге Мебюше 8:12801275 (2002), Носк и др., Ыеигоп 38:547-554 (2003) и \УО 2004/095031, каждая полностью включена в данную заявку посредством ссылки. Тем не менее, может оказаться предпочтительным применение образцов из добровольцев, которые не получали такую иммунизацию или соответствующее лечение, относящееся к расстройству, связанному и/или вызванному измененным патологическим белком.

Согласно изобретению образцы пациента, например индивидуумов, которые были заранее выбраны по симптоматике, анализируют на присутствие связывающих молекул, специфично узнающих препарат очевидной патологической структуры, например, ех νίνο в ткани из клинико-патологически описываемых пациентов-людей или в моделях на животных, как, например, трансгенные мыши, или ίη νίίτο в клеточных структурах, или в патологической аллогенной или ксеногенной ткани. Предпочтительно указанным пациентом и/или в качестве указанного субъекта, из которого получают препарат, выступает человек, наиболее предпочтительно оба - люди.

Характерный препарат патологически или физиологически измененного образца, клетки или ткани предпочтительно обнаруживают оптическими методами после реакции со связывающей молекулой, например антителом согласно изобретению. Препарат можно получить в качестве/из образца клеток, среза ткани, клеточного мазка, образца клеток или ткани из модели заболевания человека на животном или культивированных ίη νίίτο клеток и ткани. Предпочтительно по меньшей мере один из указанных препаратов присутствует в камере для препарата в положениях для сканирования, при этом каждое положение для сканирования соответствует конкретной патологической структуре и по меньшей мере два положения для сканирования параллельно подвергают детектированию реакции с антителом. В качестве примера антитела к нейропатологическим отличительным признакам таких нейродегенеративных заболеваний, как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона или тауопатии - включая бета-амилоидные бляшки, тельца Леви, нейрофибриллярные клубки и дистрофичный нейрит, можно обнаружить на срезах, полученных из мозговой ткани человека после смерти с клинико-патологически подтвержденным диагнозом, соответствующих связанных с заболеванием структур. Это осуществляют путем наклеивания небольших палочек залитой в парафин ткани на предметные стекла, которые затем инкубируют с образцами из пациента или здорового донора. Детектирование реакции с антителом осуществляют, следуя стандартным процедурам иммуногистохимии и сканирования с помощью микроскопа.

На предметном стекле можно собрать множество микросрезов тканей, составляющих пораженные различными болезнями человека ткани, чтобы получить микрочип с множеством тканей. Аналогично, дополнительные препараты образцов тканей из моделей заболеваний человека на животных, клеточного мазка или клеток могут быть залиты в парафин и приклеены на предметные стекла отдельно или в комбинации с описанной выше мозговой тканью или рядом тканей, полученных из человека с болезнью

- 16 017611

Альцгеймера после его смерти. Таким образом, одно исследуемое положение на предметном стекле может включать смешанный ряд тканей и других препаратов, включающих очевидные патологические структуры.

Чтобы повысить пропускную способность теста, на предметное стекло приклеивают препараты более чем в одном исследуемом положении. Предпочтительно препараты приклеивают на предметные стекла в восьми исследуемых положениях в формате два на четыре, подходящем для 96-луночного или микротитровального формата. Более подробное описание этого совместимого с микротитровальным форматом тканевого микрочипа можно найти ниже в дополнительном разделе методов.

Как уже упоминалось, образец, который нужно проанализировать, может включать биологическую жидкость, образец клеток или супернатант образца клеток или его производное. Биологические жидкости, такие как люмбальная спинно-мозговая жидкость (С8Е), плазма или моча, можно собрать, следуя стандартным клиническим процедурам после получения информированного согласия пациентов. Наиболее предпочтительно образец включает или получен из В-клеток или В-клеток памяти и/или включает антитела.

Предпочтительно указанный пациент был определен как пораженный еще не проявляющимся расстройством или подвержен риску развития этого расстройства с помощью выявления присутствия или отсутствия суррогатного маркера, или путем установления необычно стабильного течения заболевания. Клинические критерии должны рассматриваться совместно с суррогатными маркерами, показывающими либо повышенную вероятность возникновения или проявления заболевания согласно изобретению в смысле доклинического состояния, либо, наоборот, доказывающими невозможность такого заболевания, уже случившегося, например, так как существует совокупность генетических факторов, вызывающих заболевание, или подвергание экстремальному воздействию или образ жизни делает фенотипическое развитие заболевания вероятным. В случае болезни Альцгеймера это означает, что согласно изобретению у таких волонтеров-людей ищут В-клетки или В-клетки памяти против белковых комплексов, связанных с нейропатологией, таких как агрегаты бета-амилоида, олигомерные виды бета-амилоида и бетаамилоидные фибриллы в бета-амилоидных бляшках, ищут филаменты из тау-протеина в нейрофибриллярных клубках, альфа-синуклеин в тельцах Леви или компоненты, до настоящего времени не идентифицированные на молекулярном уровне, эти добровольцы, в зависимости от возраста, принадлежат к группе индивидуумов, для которых либо частота заболевания болезнью Альцгеймера особенно высока, либо которые происходят генетически из популяции, несущей высокий риск болезни Альцгеймера. Это, например, люди старше 75 лет, не имеющие вовсе или имеющие лишь незначительные нейропсихологически измеримые когнитивные нарушения, или в случае выявления опухоли, люди, имеющие высоко показательные опухолевые маркеры, например генетические опухолевые маркеры, но не страдающие от заболевания (А11ои1 и др., Агс11. Сегоп1о1о§у Сепа1пс5 27 (1998), 189; Эипп и др., 1ттиш1у 21 (2004) 137148). В случае умеренного когнитивного нарушения это пациенты, которые оставались клинически, нейропсихологически или когнитивно стабильными в течение многих лет, несмотря на ежегодный статистический риск, составляющий более чем 20% для развития нейродегенеративного заболевания, которое проявляется клинически и прогрессирует при дальнейшем течении. Таким образом, в одном варианте реализации указанный суррогатный маркер выбирают из группы, состоящей из пожилого возраста, мозговой амилоидной нагрузки, генотипа АроЕ, генотипа АРР, генотипа Р81, уровня бета-амилоидного пептида в биологических жидкостях, изопростанов, тау-протеина и фосфорилированного тау-протеина.

Особенным подходом для применения способа согласно изобретению является исследование образцов В-клеток и В-клеток памяти из заранее выбранных по симптоматике добровольцев на чипах с препаратами очевидно патологических тканей, полученных от субъектов с совершенно различными или родственными первичными заболеваниями. В частности, такие патологические ткани получены из пациентов-людей, страдающих от нейродегенеративных заболеваний, заболеваний, связанных с неправильной укладкой белка, амилоидоза ткани и других заболеваний, связанных с патологическими отложениями, аутоиммунных расстройств, воспалительных заболеваний, гиперпролиферативных и неопластических заболеваний, например опухолей, болезней накопления и инклюзионных болезней, а также из моделей заболеваний человека на животных, в частности из мышей, генетически измененных патологически значимыми генами человека.

Водном особенно предпочтительном варианте реализации изобретение фокусируется на болезни Альцгеймера. В этом варианте реализации образец получают из субъекта, предпочтительно удовлетворяющего следующим критериям:

a) возраст 65, предпочтительно 70 и более предпочтительно 75 лет или больше;

b) имеет все когнитивные способности и хорошее здоровье;

c) не имеет клинических признаков деменции; или

б) имеет необычно низкую скорость прогрессирования заболевания, несмотря на присутствие установленного клинического диагноза вероятной болезни Альцгеймера; или

е) имеет необычно низкую скорость перехода от умеренного когнитивного нарушения (УКН) к болезни Альцгеймера с развернутой клинической картиной.

В дополнительном варианте реализации способ согласно изобретению дополнительно включает

- 17 017611 этапы:

a) очистки В-клеток или В-клеток памяти из образца. который был определен как содержащий связывающие молекулы. например антитела. которые предпочтительно связываются с указанным препаратом. но не связываются или связываются со значительно более низкой аффинностью с соответствующими клетками или тканью здорового субъекта;

b) получения репертуара генов иммуноглобулинов. кодирующих указанные антитела из указанных В-клеток или В-клеток памяти; и

c) применения указанного репертуара для экспрессирования указанных антител. и возможно при этом этап (Ь) включает этапы:

б) получения мРНК из указанных В-клеток или В-клеток памяти;

е) получения кДНК из мРНК этапа (ίν);

ί) применения реакции удлинения праймера для амплификации по указанной кДНК фрагментов. соответствующих тяжелым цепям (НС) и каппа/лямбда легким цепям (ЬС) указанных антител.

Способы получения клонов иммортализованных В-клеток и В-лимфоцитов памяти человека. включающие этап трансформации В-лимфоцитов памяти человека с помощью вируса Эпштейн-Барр (ЕВУ) в присутствии поликлонального активатора В-клеток. суммированы в международной заявке XVО 2004/076677. Эта международная заявка также описывает способы получения последовательности нуклеиновых кислот. которая кодирует интересующее антитело. включающее этапы получения иммортализованного клона В-клетки и получения/секвенирования нуклеиновой кислоты из клона В-клетки. которая кодирует интересующее антитело. а затем вставки нуклеиновой кислоты в хозяина или применения нуклеиновой кислоты для получения хозяина для экспрессии. который может экспрессировать интересующее антитело. культивирования или субкультивирования хозяина для экспрессии в условиях. когда интересующее антитело экспрессируется. и возможно очистки интересующего антитела. В этой заявке не упоминается. что над нуклеиновой кислотой можно совершать дополнительные манипуляции. чтобы ввести сайты рестрикции. изменить использование кодона и/или ввести или оптимизировать регуляторные последовательности транскрипции и/или трансляции. Например. последовательности нуклеиновых кислот можно получить с помощью обратной трансляции полипептидной последовательности согласно изобретению. применяя программное обеспечение. такое как программное обеспечение УесЮг ΝΤΓ. для получения последовательностей нуклеиновых кислот. которые оптимизированы по использованию кодона и оптимизированы по стабильности РНК. Все эти методики соответствуют существующему уровню техники. и их может осуществить специалист в данной области без чрезмерных усилий. Дополнительные способы иммортализации В-клеток человека хорошо известны в данной области. например конструирование человеческих гибридом или химерных гибридом человека и мыши.

В дополнительном аспекте изобретение относится к связывающей молекуле. которая способна селективно распознавать эпитоп связанного с заболеванием белка. включая неоэпитоп связанного с заболеванием белка. который предпочтительно можно получить или подтвердить с помощью способа согласно изобретению. описанного в данной заявке ранее и описанного в примерах. Преимущественно связывающая молекула согласно изобретению. по существу. не узнает указанный белок в не связанной с расстройством форме; см. также выше.

Средства и способы рекомбинантного получения связывающих молекул. в частности антител и их мимиков. а также способы скрининга на конкурирующие связывающие молекулы. которые могут быть или могут не быть антителами. известны в данной области и суммированы. например. в международной заявке νθ 2006/103116 в отношении антител против бета-амилоида и лечения/диагностики болезни Альцгеймера. содержание описания которой включено в данную заявку посредством ссылки в рамках конструирования антител и введения для терапевтических или диагностических применений.

Тем не менее. в данной заявке. в частности. в отношении терапевтического применения у человека антитело согласно изобретению представляет собой антитело человека. В этом контексте измененный патологический белок. распознаваемый антителом. предпочтительно является связанным с неврологическим расстройством. предпочтительно мозговым расстройством.

Более того. как показано в примерах 3-5. связывающая молекула согласно изобретению. в частности антитело. имеет некоторые преимущественные биологические свойства. одно или большее количество которых достигнуто настоящим изобретением впервые. например. она способна:

(ί) пересекать гематоэнцефалический барьер. например. в месте патологического события;

(ίί) связывать бета-амилоидные бляшки. цереброваскулярный амилоид. диффузные бетаамилоидные отложения. нейрофибриллярные клубки. гиперфосфорилированный тау-протеин. положительные на альфа-синуклеин тельца Леви или белковые агрегаты. связанные с дистрофичными нейритами;

(ш) удалять бета-амилоидные бляшки из мозга и/или предотвращать образование амилоидных бляшек в мозге;

(ίν) по существу. восстанавливать нормальное поведение и/или (ν) не вызывать микрокровоизлияний.

В особенно предпочтительном варианте реализации антитело или эквивалентную связывающую

- 18 017611 молекулу согласно изобретению можно отличить от других антител по одному или более из следующих свойств, например, она способна:

1) пересекать, по меньшей мере, в небольших количествах гематоэнцефалический барьер в местах патологических событий;

2) связываться с одной или большим количеством патофизиологически значимых внеклеточных или клеточных структур;

3) приводить к уменьшению патофизиологически значимой структуры ίη νίίτο или ίη νίνο;

4) приводить к уменьшению патофизиологически значимой структуры и к снижению связанной с ней токсичности;

5) приводить к блокированию или задержке процесса заболевания;

6) приводить к восстановлению клеточных, органоспецифичных и организменных функций и, возможно, к вторичному предотвращению рецидива исходной патофизиологии после ликвидации токсичности, связанной с патофизиологически значимыми структурами и/или

7) не связана с повышением числа микрокровоизлияний.

Более того, отсутствие перекрестной реакции с физиологическими предшественниками или производными приводит к таким результатам, что, во-первых, концентрации можно предсказать, так как эффекты разбавления в здоровых тканевых структурах устранены, и, во-вторых, что аутоиммунные ответы в смысле нежелательных побочных эффектов, по существу, отсутствуют. Вдобавок, в предыдущих сообщениях предположили связь церебральной амилоидной ангиопатии (САА) с аномальной сосудистой реактивностью в трансгенной модели на мышах с САА (Миедд1ег и др., I №ιιΐΌ5θί 22 (2002), 7218-24.). При тяжелой САА, обнаруживаемой у старых агсАЗ мышей (КпоЫосй и др., №игоЬю1. Адтд 28:12971306 (2007) электронная публикация от 31 июля, 2006), может, таким образом, ограничиваться приводящая к расширению сосудов гибкость поврежденных кровеносных сосудов. В соответствии с настоящим изобретением разумно ожидать, что лечение антителами согласно изобретению может улучшить вазореактивность и мозговой кровоток у старых АРР-трансгенных мышей. Это можно подтвердить, используя агсАЗ модель на мышах, описанную у КпоЫосй и др. (2006), выше, и описанную в заявке на патент США Тгапкдешс ашша1 шобе1 Гог АЫеппег'х бЬеахе. Спшш и др., серийный номер 60/934291, поданной 11 июня, 2007, содержание описания которой включено в данную заявку посредством ссылки.

III. Антитела.

Изобретение дополнительно направлено на связывающие молекулы, например антитела и их связывающие фрагменты, варианты и производные, показанные в табл. 2 и 3. Изобретение особенно направлено на антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производные, при этом указанное антитело специфично связывается с тем же неоэпитопом белка, связанного с расстройством, что и эталонное антитело, выбранное из группы, состоящей из N1-101.10, N1-101.11, N1-101.12, N1-101.13, N1101.12Р6А, И1-101.13А и И1-101.13В.

Изобретение дополнительно направлено на антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производные, при этом указанное антитело конкурентно ингибирует связывание эталонного антитела, выбранного из группы, состоящей из N1-101.10, N1-101.11, N1-101.12, N1-101.13, Ш-101.12Р6А, М-101.13А и Ш-101.13В, с неоэпитопом белка, связанного с расстройством.

Изобретение также направлено на антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производные, при этом указанное антитело включает антигенсвязывающий домен, идентичный таковому для антитела, выбранного из группы, состоящей из N1-101.10, N1-101.11, N1-101.12, N1-101.13, N1101.12Р6А, И1-101.13А и И1-101.13В.

Изобретение дополнительно служит примером некоторых таких связывающих молекул, например антител и их связывающих фрагментов, которые можно охарактеризовать тем, что в их вариабельную область, например в связывающий домен, включен по меньшей мере один гипервариабельный участок (СЭВ) УН и/или УЪ вариабельной области, включающей любую из последовательностей аминокислот, представленных в табл. 2 (УН) и табл. 3 (УЬ).

- 19 017611

Таблица 2

Последовательности аминокислот УН области специфичных к неоэпитопу антител

Антитело	Последовательность вариабельной области тяжелой цепи
N1-101.10	Εν0ΐναδ006ννθΡ0Κ51Ρ150ΑΑ50ΡΑΡ35ΥαΐΗνννΡΙ0ΑΡΘΚ61ΕνννΑνΐνΐ/Ρ0αΤΚΚΥ ΥΤ08νΚΟΚΡΤΙ8ΗΟΝ8ΚΝΤΙΥίΟΜΝΤΙΑΑΕΟΤΑνΥΥΟΑΗΟΗΟΙΟΑΑΑ3ΡΥΥΜθνννθΚΘΤΤ УГУ38 (8ΕΟΙΟΝΟ: 4)
N1-101.11	Εναΐνα80Ο0νναΡαΡ8ί«150ΑΑ80ΕΑΡ33Υ0ΜΗνννΑΟΑΡ<3Κ01ΕνΑ/ΑνΐννΡ0αΤΚΚ ΥΥΤΟδνΚΟΗΡΤΙδΒΟΝεΚΝΤΙΥίαΜΝΤίΗΑΕΟΤΑνΥΥΟΑΗΠΑΟΙΟΑΗΗβΡΥΥΜΟνννΟΚβΤ ΤνΤν55 (3Εϋ ΙΟ ΝΟ: 6)
N1-101.12	ΕνθΐνΕεβΡΟΐνΚΡΑΕη.3υ·ΟΤν3<308ΙΡ8Ο8Ι0\νΥ\νΐΡΟΡΡ6ΚΟΙΕννΐαΥΡ0Υ5ΟΑΤΡΥ ΤΡ81Α0ΑΙΤΙ8ν0Α5ΚΝαΐ518158νΤΑΑΡΤΑνΥΥ0ΑΑΑΑ6ΕΝ80βΙΕΡΥΥ6Μ0ννν000Τ Τ\ΓΓνδ8 (8ΕΟ ΙΟ ΝΟ: 10)
N1-101.13	0νθΐαΕ8ΟΡβίνΚΡ8ΕΤί51Τϋΐν$608Ι8ΒΡ$ΥΥνν0ννΐΑα8Ρ6Κ01Ενν538ΙΗΥ3081Ύ ΥΝΡ81Κ5ΑνΠ8ν0Τ5ΚΝ0Ρ81Κ158νΤΑΑ0ΤΑνΥΥϋΑΑ8Ανν088ν(/νΡϋΥνν0ΟβΤΐντν8 5 (5ΕΟ Ю ΝΟ: 14}
N1-101.12Р6А	0У0ЬУЕ8О00УУ0РОА81АЪЗСАА80ЕАР38У0МН\ЛЛ/РС)АР0К<ЭЪЕиУ7АУ1У/Р0вТКК ΥΥΤυ3νΚ©Απΐ3ΒΟΝ8ΚΝΤΙΥΐαΜΝΤυ4ΑΕΟΤΑνΥΥΟΑΡΟΗΟΙβΑΒΑΟΡΥΤΜθνννθΚθτ τντνδδ (5Ε0 ΙΟ ΝΟ: 39}
N1-101.13А	αναί0Ε50ΡΟίνΚΡ8ΕΤί51ΤΟ'Τν5β08Ι$ΑΑ3Υνν^θννΐΑΟ8Ρ0Κ01Βν808ΙΗΥ305ΤΥΥΝΡ8ί Κ8ΗνΤΙ8νθΤ3ΚΝΟΕ81ΚΐεδνΤΑΑΟΤΑνΥΥ€ΑΑ8Ρ1ΛίΘ88νννΡΟΥννθΟΟΤίντν88 (8ΕΟ Ю ΝΟ: 42)
N1-101.13В	0ναΐ0Ε80Ρ6ΐνΚΡ5ΕΠ^ΙΤ€Τν5065Ι5ΡΑ3Υ№0ννΐΑ05Ρ0Κ6ΐην503ΙΗΥ305ΤΥΥΝΡ81. Κ3ΡνΤ15ν0Τ5ΚΝ0Ρ51Κ185νΤΑΑ0ΤΑνΥΥ0ΑΑ3Ανν085\ννΡ0Υνν©00Τΐντν53 (5ΕΟ 10 ΝΟ: 43)

Таблица 3

Последовательности аминокислот УЪ области специфичных к неоэпитопу антител

Антитело	Последовательность вариабельной области легкой цепи (каппа или лямбда)
N1-101.10	ΕΐνΐΤΟ5Ρ8815Α5νθ0ΡνΤΓΤ0ΡΑ3Ο8ΙδδΥΙ-ΝννΥΟΟΚΡβΚΑΡΚΙ-ΙΓΥΑΑ88Ι_αδ0νΡ8ΑΡ 5Ο8β8ΟΤ0ΡΤΙ_ΤΙ88Ι_ΟΡΕ0ΕΑΤΥΥΟ€)Ο8Υ8ΤΡΙ-ΤΕΟ6ΟΤΚΙ.ΕΙΚΡ (ЗЕОΙ0 ΝΟ: 8)
N1-101.11	ΕΐνίΤΟ5Ρ5515Α5νθ0ΡνΤΓΓϋΒΑ5Ο8Ι53ΥΙΝ’Λ/ΥΟΟΚΡβΚΑΡΚΙΙΙΥΑΑ3δίΟ5θνΡ5ΑΡ 503θ56ΤΟΡΤΐΤΐ53ΐαΡΕθΡΑΤΥΥθΟΟδΥ8ΤΡΐΤΡΟΟθΤΚΙΕΐΚΑ (3ΕΟ ΙΟ ΝΟ: 8}
N1-101.12	ΟΕΐνΐΤΟ5Ρδδ18Α5ΙΟΟΑνπΤΟΑΑ8Ε8ΙΝΚΥνΝ\νΥΟΟΚΡΟΚΑΡΚίίΙΥΑΑ85ΐαδ<5ΑΡ8Αν 8θ8ΟΡΘΗ0Ε51ΤΙ5ΟΕΟΑΕ0ΕΟΑΥΡΟΟ06ΥδΑΡΥΤΕΟΟ6ΤΚνΕΙΚΡΤ (8ΕΟ ΙΟ ΝΟ. 12)
ΝΙ-101.13	05νΐΤ0ΡΡδΑ8βΤΡ00ΡνΤΙ80δ0888ΝΙΟ8ΝΥνΥν/Υ0ΟΡΡ0ΤΑΡΚΙΙΙΥΑΝΝ0ΑΡδονΡ □ΡΡδ0δΚ8βΤ8Α8ίΛΙ80ΕΑ5Ε0ΕΑ0ΤΎ0ΑΑ\ν00813ΘΎνΕ0ΤΘΤΚντνί0 (8ΕΟ ΙΟ ΝΟ; 16}
N1-101.12Ε6Α	0ΙΟΜΤΟ5Ρ3813Α3νβ0ΗνΤΙΤΟΑΑ3Ο3Ι33ΥΙΝννΥΟΟΚΡΘΚΑΡΚίίΓίΑΑ331Ο8©νΡ3ΡΡ 80305(3ΤΟΡΤΙΤΙδδΙΟΡΕΟΡΑΤΥϊΌΟΟδΥδΤΡΙΤΡΟΟΟΤΚνΕΙΚΡ (3ΕΟ ΙΟ ΝΟ. 41)
ΝΙ-101.13Α	□ΙΟΙΤ0δΡ3315ΑδνβΟΡνΤΠΌΗΑ3Ο3Ι85ΥΙ_ΝννΥθαΚΡ0ΚΑΡΚΙ.Ι.ΓίΑΑ58Ι-08θνΡ8ΡΡ3Ο303 0ΤΟΕΤΙΤΙ88ίΟΡΕΟΕΑΤΥΥΟθα$Υ8ΤΒΤΡ<3α©ΤΚνΕΙΚΑ (8ΕΟ ΙΟ ΝΟ 44)
N1-101.13Β	□Ι01Τ0δΡ3Τ13Α3νθ0Β\σΐΤ0ΒΑ808Ι8δννΐΑ.1ΛΓϊΌ0ΙΡΟΚΑΡΚΐυΥΚΑ83ΕΕ3ΘνΡδΚΡ8Ο3θ5 ΟΤΕΕΤΙΤΙ55Ι-ΟΡΟΟΡΑΤΥΥΟΟΟΥΝ8Υ5ΑΤΕΟΟΟΤΚΙ_ΕΙΚΑ (8ΕΟ ΙΟ ΝΟ 45)

Соответствующие последовательности нуклеотидов, кодирующие идентифицированные выше вариабельные области, приведены в приложенном списке последовательностей. Типичный набор СЭЯ вышеуказанных последовательностей аминокислот УН и/или УЪ области, представленных в табл. 2 и 3, дан в табл. 4. Тем не менее, как описано далее, специалисту в данной области понятно, что в качестве дополнения или альтернативы можно применять СЭЯ, которые отличаются по своей последовательности аминокислот от приведенных в табл. 4 по одной, двум, трем или даже большему количеству аминокислот в случае СЭЯ2 и СЭЯ3.

- 20 017611

Таблица 4

Обозначение белковых последовательностей СИЯ по номенклатуре по КаЬа1 УН и УЪ областей специфичных к неоэпитопу антител

Антитело	Вариабельная область тяжелой цепи	Вариабельная область легкой цепи
N1*101.10
С0Р1	8ΥΟΙΗ (8Е0 Ю N0: 17)	ΡΑ8Ο5Ι3δΥΙ_Ν (8Е0 Ю N0: 23)
С0Р2	νίννΓΟΘΤΚΚΥΥΤΟδνΚΟ (δΕΟ 10 N0: 18)	ААЗЗЮЗ ($Е0 10 N0: 24)
СОДЗ	ΟΒΟΙΟΑΒΠβΡΥΥΜΟν (δΕΟ ГО N0:19)	ΟΟδΥδΤΡΙΤ (5Е0 ГО N0: 25)
N1*101.11
СОРИ	5Υ0ΜΗ ($Е0 ίϋ N0: 20)	ΑΑδΟδΙδδΥΙΝ (5Е0 10 N0: 23)
С0Р2	νίννΡΟΒΤΚΚϊΥΤΟδνΚΟ (ЗЕО Ю N0: 21)	АА55Ю5 (δΕΟ Ю N0: 24)
СОРЗ	ΟΡΟΙΩΑΗΡβΡΥΥΜΟν (3Ε0 10 ΝΟ: 22}	ααδΥδΤΡΙ-Τ (5Е0 ГО ΝΟ: 25)
N1-101.12
СОРМ	3031С (δΕΟ 10 ΝΟ: 26)	ΗΑ3Ε8ΙΝΚΥνΝ (ЗЕО 10 N0: 29)
С0Р2	νι/Ι0ΥΡ0ΥδβΑΤΡΥΤΡ51Ρβ (6Ε0 10 N0: 27)	АА55Ю5 (δΕΟ 10 N0: 30)
сояз	ΒΑΟΕΝδΟΟΙΕΡΥΥΟΜΟν (6Ε0 10 N0: 28)	ΟΟδΥδΑΡΥΤ (5Ε0 10 N0: 31)
N1-101.13
С0Я1	ΡΑδΥΥνίίΟ (5Εα 10 ΝΟ: 32)	50δδδΝΙ05ΝΥνΥ ($Ε0 ΙΟ N0: 35)
С0Я2	δΉΥδΟδΤΥΥΝΡδίΚδ (δΕΟ ΙΟ ΝΟ: 33)	ΑΝΝ0ΡΡ5 (5ΕΟΙΟΝΟ: 36)
СОРЗ	ЗРМ358\¥УРОУ (5Ε0 ΙΟ N0: 34)	ΑΑννΟΟδΙδΟΥν (8Ε0 ΙΟ N0: 37)
N1-101.12Р6А
СОШ	5Υ0ΜΗ {5Ε0 10 N0: 20)	ΑΑ808Ι5δΥΙ_Ν (5Ε0 ΙΟ N0: 23)
С0Р2	νΐν/ΡΟΟΤΚΚΥΥΓΟδνΚΘ (8Ε0 Ю N0. 21)	АА88Ю8 (8Ε0 Ю N0. 24)
СОЯЗ	0Ραΐ<3ΑΡΡ6ΡνΥΜθν (3Ε0 10 N0: 22)	ΟΟδΥδΤΡί-Τ (8Ε0 10 N0: 25)
N1-101.13А
С0Р1	ΡΗδΥΥννο (δΕΟ 10 N0: 32)	ΡΑ303Ι33ΥΙ-Ν (3Ε0 10 N0: 46)
С0Я2	5ΉΥ303ΤΥΥΝΡδίΚ3 (3Ε0 10 N0: 33)	ΑΑδδΙ.08 (3Ε0 10 N0: 47}
СОЯЗ	3Ρ\ν03δνννΡ0Υ (3Ε0 10 N0: 34)	ΟΟ3Υ8ΤΡΤ (8Ε0 10 N0: 48)

Антитело	Вариабельная область тяжелой цепи	Вариабельная область легкой цепи
N1*101.13Β
С0Р1	ΗΡδΥΥννβ (ЗЕО Ю N0: 32)	РА3081381ЛЛ_А (8Е0 10 ΝΟ: 49}
С0А2	εΐΗΥεοδΤΥΥΝΡδίκε (δΕΟ ιο νο: зз)	КА88ЬЕЗ (8Е0 10 N0: 50)
СОРЗ	8Ρνν03δνννΡ0Υ(8Ε0 ΙΟ ΝΟ 34)	ΟΟΥΝδΥδΗΤ($ΕΟ 10 N0: 51)

В одном варианте реализации антитело согласно изобретению представляет собой любое из антител, включающих последовательность аминокислот УН и/или УЬ области, представленную в табл. 2 и 3. В качестве альтернативы антитело согласно изобретению представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое конкурирует за связывание с неоэпитопом по меньшей мере с одним из антител, имеющих УН и/или УЬ области, такие как показано в табл. 2 и 3. Эти антитела могут быть мы шиными, а также, тем не менее, предпочтительно гуманизированными, ксеногенными или химерными антителами человека и мыши, в частности, для терапевтических применений. Антигенсвязывающим фрагментом указанного антитела может быть, например, одноцепочечный Ρν фрагмент (5сЕу). Р(аЬ') фрагмент, Р(аЬ) фрагмент и Р(аЬ')₂ фрагмент. Для некоторых применений требуются только вариабельные области антитела, которые можно получить путем обработки указанного антитела подходящими реактивами, чтобы получить РаЬ', РаЬ, или Р(аЬ)₂ части. Такие фрагменты достаточны для применения, например, в иммунодиагностических процедурах, включающих связывание иммуноспецифичных частей иммуноглобулинов с детектируемыми реактивами, такими как радиоактивные изотопы.

Изобретение дополнительно направлено на выделенные полипептиды, которые составляют антитела согласно изобретению. Антитела согласно изобретению включают полипептиды, например последовательности аминокислот, составляющие специфичные антигенсвязывающие области, полученные из молекул иммуноглобулинов. Полипептид или последовательность аминокислот, полученные из указанного белка, относится к происхождению полипептида, имеющего некоторую последовательность

- 21 017611 аминокислот. В некоторых случаях полипептид или последовательность аминокислот, которая получена из конкретного изначального полипептида или последовательности аминокислот, имеет последовательность аминокислот, которая, по существу, идентична изначальной последовательности, или ее части, при этом указанная часть состоит по меньшей мере из 10-20 аминокислот, по меньшей мере 20-30 аминокислот, по меньшей мере 30-50 аминокислот, или которая любым другим способом может быть идентифицирована рядовым специалистом в данной области как происходящая от изначальной последовательности.

В другом варианте реализации изобретение обеспечивает выделенный полипептид, включающий, состоящий по существу из или состоящий из вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (УН), при этом по меньшей мере один УН-СПК вариабельной области тяжелой цепи или по меньшей мере два УН-СПК вариабельной области тяжелой цепи по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичны последовательностям аминокислот для сравнения УН-СЛК1, УН-СЛК2 или УН-СЛК3 тяжелой цепи из антител, описанных в данной заявке. В качестве альтернативы УН-СЛК1, УН-СЛК2 и УН-СЛК3 области УН по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичны последовательностям аминокислот для сравнения УН-СПК 1, УН-СЛК2 и УН-СЛК3 тяжелой цепи из антител, описанных в данной заявке. Таким образом, согласно этому варианту реализации вариабельная область тяжелой цепи согласно изобретению имеет полипептидные последовательности УН-СЛК1, УН-СЛК2 и УН-СЛК3, родственные группам последовательностей, представленных в табл. 4 выше. Хотя в табл. 4 представлены УН-СПК, определенные по системе КаЬаР другие определения СПК, например УН-СПК, определенные по системе С1ю11иа. также включены в изобретение и их может легко определить рядовой специалист в данной области, используя данные, представленные в табл. 2 и 3.

В другом варианте реализации изобретение обеспечивает выделенный полипептид, включающий, состоящий по существу из или состоящий из вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (УН), в которой УН-СПК1, УН-СПК2 и УН-СПК3 области имеют полипептидные последовательности, которые идентичны группам последовательностей УН-СПК1, УН-СПК2 и УН-СПК3, представленных в табл. 4.

В другом варианте реализации изобретение обеспечивает выделенный полипептид, включающий, состоящий по существу из или состоящий из вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (УН), в которой УН-СПК1, УН-СПК2 и УН-СПК3 области имеют полипептидные последовательности, которые идентичны группам последовательностей УН-СПК1, УН-СПК2 и УН-СПК3, представленных в табл. 4, за исключением одной, двух, трех, четырех, пяти или шести замен аминокислот в любом из УНСПК. В некоторых вариантах реализации указанные замены аминокислот являются консервативными.

В другом варианте реализации изобретение обеспечивает выделенный полипептид, включающий, состоящий по существу из или состоящий из вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (УЪ), при этом по меньшей мере один УЪ-СЛК вариабельной области легкой цепи или по меньшей мере два из УЪ-СЛК вариабельной области легкой цепи по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичны последовательностям аминокислот для сравнения легкой цепи УЪ-СЛК1, УЪ-СЛК2 или УЪ-СЛК3 из антител, описанных в данной заявке. В качестве альтернативы УЪ-СЛК1, УЪ-СЛК2 и УЪ-СЛК3 области УЪ по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичны последовательностям аминокислот легкой цепи для сравнения УЪ-СЛК1, УЪ-СЛК2 и УЪ-СЛК3 из антител, описанных в данной заявке. Таким образом, согласно этому варианту реализации вариабельная область легкой цепи согласно изобретению имеет полипептидные последовательности УЪ-СЛК1, УЪ-СЛК2 и УЪ-СЛК3, родственные полипептидам, представленным в табл. 4 выше. Хотя в табл. 4 представлены УЪ-СПК, определенные по системе КаЬак другие определения СПК, например УЪ-СПК, определенные по системе Скобиа, также включены в изобретение.

В другом варианте реализации изобретение обеспечивает выделенный полипептид, включающий, состоящий по существу из или состоящий из вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (УЪ), в которой УЪ-СЛК1, УЪ-СПК2 и УЪ-СПК3 области имеют полипептидные последовательности, которые идентичны группам последовательностей УЪ-СЛК1, УЪ-СПК2 и УЪ-СЛК3, представленным в табл. 4.

В другом варианте реализации изобретение обеспечивает выделенный полипептид, включающий, состоящий по существу из или состоящий из вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (УЪ), в которой УЪ-СЛК1, УЪ-СПК2 и УЪ-СПК3 области имеют полипептидные последовательности, идентичные группам последовательностей УЪ-СЛК1, УЪ-СПК2 и УЪ-СПК3, представленным в табл. 4, за исключением одной, двух, трех, четырех, пяти или шести замен аминокислот в любом из УЪ-СЛК. В некоторых вариантах реализации указанные замены аминокислот являются консервативными.

Иммуноглобулин или кодирующие его кДНК могут быть дополнительно модифицированы. Таким образом, в дополнительном варианте реализации способ согласно изобретению включает любой этап(ы) получения химерного антитела, гуманизированного антитела, одноцепочечного антитела, ЕаЬ-фрагмента, биспецифичного антитела, слитого антитела, меченого антитела или некоторого аналога любого из перечисленных. Соответствующие способы известны специалисту в данной области и описаны, например, у Наг1о\у и Ъапе АпкЬоФез, А ЪаЬогаФгу Мапиа1, С8Н Ргезз, Со1б 8рппд НагЬог, 1988. Если производные указанных антител получали с помощью методики фагового дисплея, поверхностный плазмонный резонанс, который используется в системе В1Асоге, можно применять для повышения эффективности фаго

- 22 017611 вых антител, которые связываются с тем же эпитопом, что и любое из антител, описанных в данной заявке (8сЫег, Нитап АпбЬоб1е8 НуЬпботак 7 (1996), 97-105; Ма1тЬогд, 1. 1ттипо1. МеШобк 183 (1995), 713). Получение химерных антител описано, например, в международной заявке νθ 89/09622. Способы получения гуманизированных антител описаны, например, в европейской заявке ЕР-А1 0239400 и международной заявке νθ 90/07861. Дополнительным источником антител, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, являются так называемые ксеногенные антитела. Основной принцип получения ксеногенных антител, таких как антитела человека в мышах, описан, например, в международных заявках νθ 91/10741, νθ 94/02602, νθ 96/34096 и νθ 96/33735. Как обсуждалось выше, антитело согласно изобретению может существовать во множестве форм помимо целых антител; включая, например, Εν, ЕаЬ и Е(аЬ)₂, а также в виде отдельных цепей; см., например, международную заявку νθ 88/09344.

Антитела согласно изобретению или соответствующую их иммуноглобулиновую цепь (цепи) можно дополнительно модифицировать, применяя обычные методики, известные в данной области, например с помощью делеции (делеций), вставки (вставок), замены (замен), добавления (добавлений) и/или рекомбинации (рекомбинаций) аминокислот и/или любой другой модификации(й), известных в данной области, либо отдельно, либо в комбинации. Способы введения таких модификаций в последовательность ДНК, лежащую в основе последовательности аминокислот цепи иммуноглобулина, хорошо известны специалисту в данной области; см., например, 8атЬгоок, Мо1еси1аг С1ошпд А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу (1989) Ν.Υ. и Аи8иЬе1, Сиггей Рго1осок т Мо1еси1аг Вю1оду, Огееп РиЬйкктд А55оаа1е5 и \νί®\' 1йегкс1епсе, Ν.Υ. (1994). Модификации антитела согласно изобретению включают химическое и/или ферментативное получение производных по одной или большему количеству составляющих аминокислот, включая модификации боковой цепи, модификации остова и Ν- и С-концевые модификации, включая ацетилирование, гидроксилирование, метилирование, амидирование и присоединение молекул углеводов или липидов, кофакторов и т.п. Подобным образом, в объем изобретения входит получение химерных белков, которые включают описанное антитело или некоторый его фрагмент, слитый по аминоконцу с гетерологичной молекулой, такой как иммуностимулирующий лиганд на карбоксильном конце; см., например, международную заявку νθ 00/30680 для соответствующих технических подробностей.

Дополнительно, в объем изобретения входят небольшие пептиды, включая такие, которые содержат связывающую молекулу, как описано выше, например содержат СОК3 область вариабельной области любого из упомянутых антител, в частности СОК3 тяжелой цепи, поскольку часто наблюдали, что СЭР3 тяжелой цепи (НСОК3) представляет собой область, имеющую большую степень вариабельности и доминирующее участие во взаимодействии антиген-антитело. Такие пептиды можно легко синтезировать или получить рекомбинантными способами, чтобы получить связывающий агент, полезный согласно изобретению. Такие способы хорошо известны рядовым специалистам в данной области. Пептиды можно синтезировать, например, применяя автоматизированные синтезаторы пептидов, которые доступны для приобретения. Пептиды можно получить с помощью рекомбинантных методик путем введения ДНК, кодирующей указанный пептид, в вектор экспрессии и трансформации клеток вектором экспрессии, чтобы получить пептид.

Следовательно, изобретение относится к любой связывающей молекуле, например антителу или связывающему фрагменту, которую можно получить в соответствии с вышеописанными способами и которая проявляет упомянутые свойства, т. е. которая специфично узнает неоэпитоп. Такие антитела и связывающие молекулы можно подвергнуть тестам на их специфичность связывания и аффинность, например, применяя способ выделения специфичных к неоэпитопу связывающих молекул, описанный ранее в данной заявке.

В качестве альтернативы получению иммуноглобулинов непосредственно из культуры иммортализованных В-клеток или В-клеток памяти иммортализованные клетки можно использовать в качестве источника перестроенных локусов тяжелой цепи и легкой цепи для последующей экспрессии и/или генетического манипулирования. Перестроенные гены антитела можно подвергнуть обратной транскрипции из соответствующих мРНК с получением кДНК. Если это необходимо, константную область тяжелой цепи можно заменить на таковую из отличного изотипа или вовсе удалить их все. Вариабельные области могут быть связаны так, чтобы они кодировали одноцепочечные Εν области. Множество Εν областей можно связать, чтобы придать способность связывания более чем с одной мишенью, или можно использовать химерные комбинации тяжелой и легкой цепей. Как только генетический материал стал доступен, разработка аналогов, описанных выше, которые сохраняют способность связываться с желаемой мишенью, не вызывает затруднений. Способы клонирования вариабельных областей антитела и получения рекомбинантных антител известны специалисту в данной области и описаны, например, у ОбШапб и др., Т188ие Апбдепк 47 (1996), 1-20; Эоепеске и др., Ьеикет1а 11 (1997), 1787-1792.

Как только получен подходящий генетический материал и, если это необходимо, модифицирован таким образом, чтобы он кодировал аналог, кодирующие последовательности, включая такие, которые кодируют, как минимум, вариабельные области тяжелой и легкой цепи, можно вставить в системы экспрессии, содержащиеся на векторах, которыми можно трансфецировать стандартные рекомбинантные

- 23 017611 клетки-хозяева. Можно применять множество таких клеток-хозяев; для эффективного процессинга, тем не менее, клетки млекопитающих являются предпочтительными. Типичные линии клеток млекопитающего, полезные для этой цели, включают, но не ограничены перечисленными, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки почки эмбриона человека (НЕК 293) или клетки мышиной миеломы (N80).

Получение антитела или аналога затем осуществляют путем культивирования модифицированного рекомбинантного хозяина при условиях культивирования, подходящих для роста клеток-хозяев и экспрессии кодирующих последовательностей. Антитела затем получали путем выделения из культуры. Системы экспрессии предпочтительно разработаны таким образом, что они включают сигнальные пептиды, так что полученные антитела секретируются в среду; тем не менее, внутриклеточное получение также возможно.

Как только целевая структура, например связанный с заболеванием белок, была помечена при взаимодействии с образцом соответствующей связывающей молекулой, содержащейся в нем, ее можно идентифицировать средствами и способами, хорошо известными в данной области, например, применяя масс-спектрометрические (М8) методики, такие как описанные в международной заявке νΟ 00/11208 и особенно описанные у ^ск и др., №11 Меб 8 (2002), 1270-1275; ^ск и др., №игоп 38 (2003), 547-554. Таким образом, в случае если антитело, идентифицированное в соответствии с настоящим изобретением, полученное ΐπ νίίτο, связывается с патологическими структурами, например с бета-амилоидными бляшками, в срезах пораженной патологией области мозга, но не связываются значительно со здоровыми тканями, тогда идентифицировано перспективное антитело-кандидат, молекулярную целевую структуру которого можно затем выделить в достаточном количестве и очистить за счет ее свойства связывания с антителом из патологических тканей и, в итоге, можно идентифицировать и описать посредством аналитических белковых и масс-спектрометрических способов, как, например, ΜΑΣΌΙ/ΤΟΡ (^1Шатк, Мебюбк Се11. Βίο1. 62 (2000), 449-453; Υаίек, 1. Макк. 8рес!гот. 33 (1998), 1-19).

Соответственно в другом варианте реализации изобретение относится к антигену, который узнается связывающей молекулой, особенно антителом согласно изобретению, ранее описанным в данной заявке, и который предпочтительно представляет собой по меньшей мере часть белка, связанного с расстройством.

В соответствии с вышесказанным изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему антиген или связывающую молекулу согласно изобретению, в случае антитела, предпочтительно, по меньшей мере, вариабельную область цепи иммуноглобулина антитела, описанного выше. Обычно указанная вариабельная область, кодируемая полинуклеотидом, включает по меньшей мере один гипервариабельный участок (СЭЯ) УН и/или УЪ вариабельной области указанного антитела. Для специалиста в данной области очевидно, что каждый вариабельный домен (тяжелая цепь УН и легкая цепь УЪ) антитела включает три гипервариабельные области, иногда называемые областями, определяющими комплементарность, или СЭЯ, окруженные (фланкированные) четырьмя относительно консервативными каркасными областями или РЯ, и относятся к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельные области или СЭЯ антитела человека 1дО подтипа включают аминокислотные остатки из остатков 24-34 (Ь1), 50-56 (Ь2) и 89-97 (Ь3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи, что было описано у КаЬа! и др., 8ес.|иепсек οί Рго!етк οί Iттиπο1οд^са1 1п!егек!, 5-е изд. РиЫю НеаНН 8еМсе, №июпа1 1пкй!и!ек οί НеаИй, Бетесда, Мэриленд (1991), и/или остатки из гипервариабельной петли, например остатки 26-32 (Ъ1), 50-52 (Ь2) и 91-96 (Ъ3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи, что было описано у С1ю11на и др., 1. Μο1. Βίο1. 196 (1987), 901-917. Каркасные или РЯ остатки представляют собой такие остатки в вариабельном домене, которые отличны от захватывающих в вилку остатков гипервариабельной области. Термин специфичное связывание относится к связыванию антител с заранее определенным антигеном. Обычно, антитело связывается с константой диссоциации (К_с), равной 10^-7 М или менее, и связывается с заранее определенным антигеном с К_с, которая по меньшей мере в два раза меньше, чем его К_с для связывания с неспецифичным антигеном (например, бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин или любой другой известный полипептид), отличным от заранее определенного антигена. Формулировки антитело, распознающее антиген и антитело, специфичное к антигену используются взаимозаменяемо в данной заявке с термином антитело, которое специфично связывается с антигеном. В данной заявке высокоспецифичное связывание обозначает, что относительная К_с указанного антитела к определенному целевому эпитопу, например неоэпитопу, по меньшей мере в 10 раз меньше, чем К_с связывания этого антитела с другими лигандами или с нативным аналогом связанного с заболеванием белка.

Аффинность или авидность антитела к антигену можно определить экспериментально, применяя любой подходящий способ; см., например, Вега^ку и др., Απί^Ьοбу-Απΐ^деπ 1п!егас!юпк в Рипбатеп!а1 Iттиπο1οду, Раи1, ^.Е., изд., Яаνеπ Ргекк Нью-Йорк, Нью-Йорк (1984), КиЬу, бап1к Iттиπο1οду, XV. Н. Ргеетап апб ^трапу, Нью-Йорк, Нью-Йорк (1992), и способы, описанные в данной заявке. Основные методики измерения аффинности антитела к антигену включают твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А), радиоиммуноанализ (Я1А) и поверхностный плазмонный резонанс. Измеренная аффинность конкретного взаимодействия антитело-антиген может изменяться, если измерения проводились при раз

- 24 017611 личных условиях, например концентрации соли, рН. Таким образом, измерения аффинности и других параметров связывания антигена, например К_с, 1С₅₀, предпочтительно осуществляют в стандартизованных растворах антитела и антигена и в стандартизованном буфере.

Для специалиста в данной области должно быть очевидно, что вариабельный домен антитела, имеющего вышеописанный вариабельный домен, можно применять для конструирования других полипептидов или антител с желаемой специфичностью и биологической функцией. Таким образом, в объем изобретения также входят полипептиды и антитела, включающие по меньшей мере один СОР из вышеописанного вариабельного домена, и который преимущественно имеет, по существу, такие же или подобные свойства связывания, что и антитело, описанное в прилагаемых примерах. Для специалиста в данной области должно быть очевидно, что, используя вариабельные домены или СОР, описанные в данной заявке, можно сконструировать антитела согласно способам, известным в данной области, например описанным в европейских заявках на патент ЕР 0451216 А1 и ЕР 0549581 А1. Более того, для специалиста в данной области очевидно, что аффинность связывания можно усилить, осуществляя замены аминокислот внутри СОР или внутри гипервариабельных петель (СйоГЫа и Ьезк, 1. Μοί. ΒίοΙ. 196 (1987), 901-917), которые частично перекрываются с СОР, определенными у КаЬаГ. Таким образом, изобретение также относится к антителам, в которых один или более из упомянутых СОР включает одну или более, предпочтительно не более чем две, замены аминокислот. Предпочтительно антитело согласно изобретению включает в одной или обеих цепях иммуноглобулина два или все три СОР вариабельных областей, описанных в табл. 4.

Связывающие молекулы, например антитела, или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты, или производные согласно изобретению, что известно рядовым специалистам в данной области, могут включать константную область, которая опосредует одну или более эффекторных функций. Например, связывание С1 компонента системы комплемента с константной областью антитела может активировать систему комплемента. Активация комплемента важна для опсонизации и разрушения (лизиса) клеточных патогенов. Активация комплемента также стимулирует воспалительный ответ и может также участвовать в аутоиммунной гиперчувствительности. Дополнительно, антитела связываются с рецепторами на различных клетках посредством Ес области, при этом сайт связывания Ес-рецептора на Ес-области антитела связывается с Ес-рецептором (ЕсР) на клетке. Существует ряд Ес-рецепторов, которые специфичны к различным классам антител, включая 1дС (гамма-рецепторы), 1дЕ (эпсилон-рецепторы), 1дА (альфарецепторы) и 1дМ (мю-рецепторы). Связывание антитела с Ес-рецепторами на поверхностях клеток инициирует ряд важных и разнообразных биологических ответов, включая поглощение и разрушение покрытых антителами частиц, очищение (клиренс) от иммунных комплексов, лизис покрытых антителами целевых клеток клетками-киллерами (называемый антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичностью, или АЭСС), высвобождение воспалительных медиаторов, передачу через плаценту и контроль продукции иммуноглобулинов.

Соответственно некоторые варианты реализации изобретения включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, в котором, по меньшей мере, фракция одного или более доменов константной области была удалена или другим способом изменена таким образом, чтобы обеспечить желаемые биохимические характеристики, такие как пониженные эффекторные функции, способность к нековалентной димеризации, повышенная способность сосредотачиваться в месте возникновения опухоли, пониженное время полужизни в сыворотке, или повышенное время полужизни в сыворотке по сравнению с целым, неизмененным антителом с приблизительно такой же иммуногенностью. Например, некоторые антитела для диагностического и лечебного применения в способах, описанных в данной заявке, представляют собой антитела с удаленными доменами, которые включают полипептидную цепь, подобную тяжелой цепи иммуноглобулина, но в которой отсутствует по меньшей мере часть одного или более доменов тяжелой цепи. Например, в некоторых антителах один домен константной области модифицированного антитела будет полностью удален, например весь или часть СН2 домена будет удалена. В других вариантах реализации некоторые антитела для диагностического и лечебного применения в способах, описанных в данной заявке, имеют константную область, например константную область тяжелой цепи 1дС. которая изменена, чтобы исключить гликозилирование, такие антитела называют где-либо в данной заявке агликозилированными или агли-антителами. Такие агли-антитела можно получить ферментативно, а также путем конструирования консенсусного сайта(ов) гликозилирования в константной области. Без привязки к теории, полагают, что агли-антитела могут иметь улучшенный профиль безопасности и стабильности ίη νίνο. Способы получения агликозилированных антител, имеющих желаемую эффекторную функцию, можно найти, например, в XVО 2005/018572, которая полностью включена посредством ссылки.

В некоторых антителах или их антигенсвязывающих фрагментах, вариантах или производных, описанных в данной заявке, Ес часть можно мутировать, чтобы снизить эффекторную функцию, применяя методики, известные в данной области. Например, делеция или инактивация (посредством точечных мутаций или других способов) домена константной области может уменьшить связывание с Ес-рецептором циркулирующего модифицированного антитела, тем самым повышая опухолевую локализацию. В других случаях может быть, что модификации константной области в соответствии с настоящим изобрете

- 25 017611 нием уменьшают связывание комплемента и. таким образом. уменьшают время полужизни в сыворотке и неспецифичное связывание сопряженного цитотоксина. Еще другие модификации константной области можно применять для модификации дисульфидных связей или молекул олигосахаридов. что позволит усилить локализацию вследствие повышенной антигенной специфичности или гибкости антитела. Полученный физиологический профиль. биодоступность и другие биохимические эффекты модификаций. такие как опухолевая локализация. биораспределение и время полужизни в сыворотке. можно легко измерить и определить количественно. применяя хорошо известные иммунологические методики без проведения лишних экспериментов.

Модифицированные формы антител или их антигенсвязывающих фрагментов. вариантов или производных согласно изобретению можно получить из целых предшественников или родительских антител. применяя методики. известные в данной области. Типичные методики обсуждаются более подробно в данной заявке.

В некоторых вариантах реализации как вариабельные. так и константные области антител или их антигенсвязывающих фрагментов. вариантов или производных согласно изобретению являются полностью человеческими. Полностью человеческие антитела можно получить. применяя методики. которые известны в данной области и описаны в данной заявке. Например. полностью человеческие антитела против конкретного антигена можно получить путем введения антигена трансгенному животному. которое было изменено таким образом. что оно продуцирует такие антитела в ответ на антигенный стимул. но чьи эндогенные локусы были отключены. Типичные методики. которые можно применять для получения таких антител. описаны в патентах США №№ 6150584; 6458592; 6420140. Другие методики известны в данной области. Полностью человеческие антитела можно подобным образом получить с помощью различных методик дисплея. например с помощью фагового дисплея или других вирусных систем дисплея. описанных более подробно где-либо еще в данной заявке.

Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. варианты. или производные согласно изобретению можно получить или производить. применяя методики. которые известны в данной области. В некоторых вариантах реализации молекулы антител или их фрагменты получены рекомбинантным способом. т.е. получены с применением технологии рекомбинантных ДНК. Типичные методики для получения молекул антител или их фрагментов обсуждаются более подробно где-либо еще в данной заявке.

Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. варианты или производные согласно изобретению также включают производные. которые модифицированы. например. путем ковалентного присоединения молекулы любого типа к антителу таким образом. что ковалентное присоединение не предотвращает специфичное связывание антитела с родственным эпитопом. Например. но не с целью ограничения. производные антител включают антитела. которые были модифицированы. например. путем гликозилирования. ацетилирования. пегилирования. фосфорилирования. амидирования. получения производных с помощью известных защитных/блокирующих групп. протеолитического расщепления. связи с клеточным лигандом или другим белком и т.д. Любые из многочисленных химических модификаций можно осуществить с помощью известных методик. включая. но не ограничиваясь перечисленными. специфичное химическое расщепление. ацетилирование. формилирование. метаболический синтез туникамицина и т.д. Дополнительно. указанное производное может содержать одну или более неклассических аминокислот.

В некоторых вариантах реализации антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. варианты или производные согласно изобретению не будут вызвать опасный иммунный ответ у животного. которого нужно лечить. например у человека. В некоторых вариантах реализации связывающие молекулы. например антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно изобретению получают из пациента. например пациента-человека. и затем используют в том же виде организма. из которого они были получены. например человека. уменьшая или минимизируя возникновение опасных иммунных ответов.

Деиммунизацию можно также применять для снижения иммуногенности антитела. В данной заявке термин деиммунизация включает изменение антитела для модификации Т-клеточных эпитопов (см.. например. νθ 9852976А1. νθ 0034317А2). Например. анализировали УН и УЪ последовательности из изначального антитела и карта Т-клеточных эпитопов человека для каждой У области показывала расположение эпитопов по отношению к гипервариабельным областям (СОЯ) и другим ключевым остаткам внутри последовательности. Отдельные Т-клеточные эпитопы из карты Т-клеточных эпитопов анализировали. чтобы идентифицировать альтернативные замены аминокислот с низким риском изменения активности конечного антитела. Был разработан диапазон альтернативных последовательностей УН и УЪ. включающих комбинации замен аминокислот. и эти последовательности затем были включены в диапазон связывающих полипептидов. например неоэпитопспецифичных антител или их иммуноспецифичных фрагментов. для диагностического и лечебного применения в способах. описанных в данной заявке. которые затем тестировали на функционирование. Обычно получали и тестировали от 12 до 24 вариантов антител. Целые гены тяжелой и легкой цепи. включающие модифицированные У и человеческие С области. затем клонировали в векторы экспрессии и полученные плазмиды вводили в линии клеток для получения целого антитела. Антитела затем сравнивали в подходящих биохимических и биологических анализах. и идентифицировали оптимальный вариант.

- 26 017611

Моноклональные антитела можно получить, применяя большое разнообразие методик, известных в данной области, включая применение гибридомных, рекомбинантных методик и методик фагового дисплея, или их комбинации. Например, моноклональные антитела можно получить, применяя гибридомные методики, включая известные в данной области и описанные, например, у Наг1оте и др., АпбЬоб1ек: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8рбпд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, 2-е изд. (1988); Наттегбпд и др., в Мопос1опа1 АпбЬоб1ек апб Т-Се11 НуЬбботак Е1кеу1ег, Ν.Υ., 563-681 (1981) (указанные ссылки полностью включены в данную заявку посредством ссылки). Термин моноклональное антитело в данной заявке не ограничивается антителами, полученными с помощью гибридомной технологии. Термин моноклональное антитело относится к антителу, которое получено от одного клона, включая любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, но не к способу, которым оно было получено. Таким образом, термин моноклональное антитело не ограничивается антителами, полученными с помощью гибридомной технологии. Моноклональные антитела можно получить, применяя большое разнообразие методик, известных в данной области. В некоторых вариантах реализации антитела согласно изобретению получали из В-клеток человека, которые были иммортализованы путем трансформации вирусом Эпштейн-Барр, как описано в данной заявке.

В хорошо известном процессе получения гибридом (КоЫег и др., №-11иге 256:495 (1975)) относительно короткоживущие, или смертные, лимфоциты из млекопитающего, например В-клетки, полученные из человека, как описано в данной заявке, сливают с бессмертной опухолевой линией клеток (например, миеломной линией клеток), таким образом получают гибридные клетки или гибридомы, которые как бессмертны, так и способны продуцировать генетически кодированное антитело из В-клетки. Полученные гибриды сортируют на отдельные генетические штаммы с помощью селекции, разведения и повторного выращивания, при этом каждый отдельный штамм включает определенные гены для получения одного антитела. Они продуцируют антитела, которые являются гомогенными против желаемого антигена и, в отношении их генетически чистого происхождения, называются моноклональными.

Клетки гибридомы, полученные таким образом, высевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или более веществ, ингибирующих рост или выживаемость неслитых, родительских клеток миеломы. Для специалиста в данной области должно быть очевидно, что реактивы, линии клеток и среды для получения, селекции и выращивания гибридом доступны для приобретения из ряда источников и стандартизованные протоколы являются общепринятыми. Как правило, культуральную среду, в которой растут клетки гибридомы, анализируют для получения моноклональных антител против желаемого антигена. Специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых клетками гибридомы, определяют с помощью ш νίΙΐΌ тестов, таких как иммунопреципитация, радиоиммуноанализ (К1А) или твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А), или тесты на связывание неоэпитопа, описанные в данной заявке. После того как клетки гибридомы, которые продуцируют антитела с желаемой специфичностью, аффинностью и/или активностью, были идентифицированы, указанные клоны можно субклонировать с помощью процедур лимитирующих разведений и выращивать стандартными способами (Собтд, Мопос1опа1 АпбЬоб1ек: Рбпар1е8 апб Ргасбсе, Асабетю Ргекк, с. 59-103 (1986)). Дополнительно должно быть очевидно, что моноклональные антитела, секретируемые субклонами, можно отделить от культуральной среды, перитонеальной жидкости или сыворотки с помощью обычных процедур очистки, таких как, например, протеин-А, гидроксилапатитная хроматография, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

Фрагменты антител, которые узнают специфичные эпитопы, можно получить известными методиками. Например, РаЬ и Р(аЬ')₂ фрагменты можно получить рекомбинантным способом или путем протеолитического расщепления молекул иммуноглобулинов, применяя ферменты, такие как папаин (для получения РаЬ фрагментов) или пепсин (для получения Р(аЬ')₂ фрагментов). Р(аЬ')₂ фрагменты содержат вариабельную область, константную область легкой цепи и СН1 домен тяжелой цепи.

Полностью человеческие антитела, такие как описанные в данной заявке, являются особенно подходящими для терапевтического лечения пациентов-людей. Антитела человека можно получить с помощью множества способов, известных в данной области, включая способы фагового дисплея, описанные выше, применяя библиотеки антител, полученные из последовательностей иммуноглобулинов человека, см. также, патенты США №№ 4444887 и 4716111 и публикации РСТ XVО 98/46645, XVО 98/50433, XVО 98/24893, ΧΧΌ 98/16654, ΧΧΌ 96/34096, ΧΧΌ 96/33735 и ΧΧΌ 91/10741; каждая из которых полностью включена в данную заявку посредством ссылки. Антитела человека согласно изобретению выделяют, например, из пациентов, которые не проявляют симптомов, но подвержены риску развития расстройства, например болезни Альцгеймера, или из пациента с расстройством, но с необычно стабильным течением заболевания.

В другом варианте реализации ДНК, кодирующую желаемые моноклональные антитела, можно легко выделить и секвенировать, применяя обычные процедуры (например, с помощью применения олигонуклеотидных зондов, которые способны специфично связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антител мыши). Выделенные и субклонированные клетки гибридом служат предпочтительным источником таких ДНК. Сразу после выделения ДНК можно ввести в векторы экспрессии, которыми затем трансфецируют прокариотические или эукариотические клетки-хозяева, такие как, но не огра

- 27 017611 ниченные перечисленными, клетки Е. отк клетки африканской зеленой мартышки (СО8), клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые иначе не продуцируют иммуноглобулины. А именно, выделенную ДНК (которая может быть синтетической, как описано в данной заявке) можно применять, чтобы клонировать последовательности константной и вариабельной областей для производства антител, как описано у Ыстетап и др., патент США № 5658570, поданный 25 января, 1995, который включен в данную заявку посредством ссылки. По существу, эта процедура включает экстрагирование РНК из выбранных клеток, перевод в кДНК и амплификацию с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), с применением [д-специфичных праймеров. Подходящие для этой цели праймеры также описаны в патенте США № 5658570. Как более подробно описано ниже, трансформированные клетки, экспрессирующие желаемое антитело, можно выращивать в относительно больших количествах, чтобы обеспечить клинические и коммерческие поставки указанного иммуноглобулина.

В одном варианте реализации антитело согласно изобретению включает по меньшей мере один СЭР тяжелой или легкой цепи молекулы антитела. В другом варианте реализации антитело согласно изобретению включает по меньшей мере два СОВ из одной или более молекул антител. В другом варианте реализации антитело согласно изобретению включает по меньшей мере три СОВ из одной или более молекул антител. В другом варианте реализации антитело согласно изобретению включает по меньшей мере четыре СОВ из одной или более молекул антител. В другом варианте реализации антитело согласно изобретению включает по меньшей мере пять СОВ из одной или более молекул антител. В другом варианте реализации антитело согласно изобретению включает по меньшей мере шесть СОВ из одной или более молекул антител. Типичные молекулы антител, включающие по меньшей мере один СОВ, которые могут быть включены в антитела согласно изобретению, описаны в данной заявке.

В конкретном варианте реализации, последовательность аминокислот вариабельных доменов тяжелых и/или легких цепей можно тщательно изучить, чтобы выявить последовательности гипервариабельных участков (СОВ) с помощью способов, которые хорошо известны в данной области, например путем сравнения с известными последовательностями аминокислот других вариабельных областей тяжелых и легких цепей, чтобы определить области гипервариабельности последовательности. Применяя обычные методики рекомбинантной ДНК, один или более СОВ можно ввести в каркасные области, например в каркасные области человека. Каркасные области могут быть встречающимися в природе или консенсусными каркасными областями и предпочтительно каркасными областями человека (см., например, Οιοίΐιίη и др., 1. Μο1. Βίο1. 278:457-479 (1998) для списка каркасных областей человека). В некоторых вариантах реализации полинуклеотид, полученный путем комбинирования каркасных областей и СОВ, кодирует антитело, которое специфично связывается по меньшей мере с одним эпитопом желаемого полипептида. В некоторых вариантах реализации можно сделать одну или более замен аминокислот внутри каркасной области, чтобы, например, улучшить связывание антитела с его антигеном. Дополнительно, такие способы можно применять для совершения аминокислотных замен или делеций одного или более цистеиновых остатков вариабельной области, участвующих во внутрицепочечных дисульфидных связях, чтобы получить молекулы антител, в которых отсутствует одна или более внутрицепочечных дисульфидных связей. Другие изменения полинуклеотида предусмотрены настоящим изобретением и находятся в рамках компетентности в данной области.

В качестве альтернативы методики, описанные для получения одноцепочечных антител (патент США № 4694778; В1гб, 8сюпсс 242:423-442 (1988); НивЮп и др., Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8сБ И8А 85:5879-5883 (1988) и Уагб и др., ЫаШгс 334:544-554 (1989)) можно адаптировать для получения одноцепочечных антител. Одноцепочечные антитела получают путем сшивки фрагментов Ρν области тяжелой и легкой цепи посредством аминокислотного мостика, что дает одноцепочечное антитело. Методики сборки функциональных Ρν фрагментов в Е. то! также можно применять (8ксгга и др., 8сюпсс 242:1038-1041 (1988)).

В другом варианте реализации с помощью микроманипуляций можно отобрать лимфоциты и изолировать вариабельные гены. Например, мононуклеары периферической крови можно выделить из иммунизированного или естественно иммунного млекопитающего, например человека, и культивировать в течение приблизительно 7 дней ш νίΐτο. Культуры можно подвергнуть скринингу на специфичные 1дС, которые удовлетворяют критериям скрининга. Клетки из положительных лунок можно выделить. Отдельные [д-продуцирующие В-клетки можно выделить с помощью сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (РАС8) или путем их идентификации в тесте на опосредованное комплементом образование гемолитических бляшек. Можно проводить микроманипуляции в пробирке над В-клетками, продуцирующими 1д, и УН и УБ гены можно амплифицировать, применяя, например, полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). УН и УБ гены можно клонировать в вектор экспрессии антител и трансфецировать им клетки (например, эукариотические или прокариотические клетки) для экспрессии.

В качестве альтернативы продуцирующие антитело линии клеток можно подвергнуть селекции и культивировать, применяя методики, хорошо известные специалисту в данной области. Такие методики описаны во множестве практикумов и первичных публикаций. В этом отношении, методики, подходящие для применения в настоящем изобретении, как описано ниже, описаны в Сиггсп! Ργοϊο^Η т 1ттиадЦду, С'о1|дап и др., ред., Сгссп РиЬНвЫпд А55οс^аΐс5 и Уйсу-Шсгвсюпсс, 1ο1ιπ УПсу апб δο^, Ысте Υογ1<

- 28 017611 (1991), которые полностью включены в данную заявку посредством ссылки, включая дополнительные материалы.

Антитела согласно изобретению можно получить с помощью любого способа, известного в данной области для синтеза антител, в частности с помощью химического синтеза или предпочтительно с помощью методик рекомбинантной экспрессии, описанных в данной заявке.

В одном варианте реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное согласно изобретению включает синтетическую константную область, в которой один или более доменов частично или полностью удалены (антитела с удаленными доменами). В некоторых вариантах реализации совместимые модифицированные антитела будут включать конструкции с удаленным доменом или варианты, в которых весь СН2 домен был удален (ДСН2 конструкции). Для других вариантов реализации короткий соединяющий пептид может замещать удаленный домен, чтобы обеспечить гибкость и свободу движения вариабельной области. Для специалиста в данной области должно быть очевидно, что такие конструкции особенно предпочтительны вследствие регуляторных свойств СН2 домена, влияющих на скорость катаболизма антитела. Конструкции с удаленным доменом можно получить, используя вектор, кодирующий константный домен 1дС| человека (см., например, \¥О 02/060955 А2 и \УО 02/096948 А2). Этот вектор сконструирован, чтобы удалить СН2 домен и обеспечить синтетический вектор, с которого экспрессируется константная область ЦО с удаленным доменом.

В некоторых вариантах реализации антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные согласно изобретению представляют собой миниантитела. Миниантитела можно получить, применяя способы, описанные в данной области (см., например, патент США № 5837821 или \УО 94/09817 А1).

В одном варианте реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное согласно изобретению включает тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую делецию или замену нескольких или даже одной аминокислоты при условии, что это не нарушает связь между мономерными субъединицами. Например, мутации одной аминокислоты в выбранных областях СН2 домена может быть достаточно, чтобы существенно уменьшить связывание Ес и тем самым повысить опухолевую локализацию. Аналогично, может оказаться желательным просто удалить ту часть одного или более доменов константной области, которая контролирует эффекторную функцию (например, связывание комплемента). Такие частичные делеции константных областей могут улучшить выбранные характеристики антитела (время полужизни в сыворотке), при этом оставляя другие требуемые функции, связанные с описываемым доменом константной области, интактными. Более того, как упоминалось выше, константные области описанных антител могут быть синтетическими, вследствие мутации или замены одной или более аминокислот, которая усиливает профиль итоговой конструкции. В этом отношении может оказаться возможным нарушение активности, обеспеченной консервативным сайтом связывания (например, связывания Ес), при, по существу, неизменной конфигурации и иммуногенном профиле модифицированного антитела. Еще другие варианты реализации включают добавление одной или более аминокислот к константной области, чтобы усилить желаемые характеристики, такие как эффекторная функция, или обеспечить присоединение большего количества цитотоксинов или углеводов. В таких вариантах реализации может оказаться желаемым вставить или реплицировать отдельные последовательности, полученные из выбранных доменов константной области.

Изобретение также обеспечивает антитела, которые включают, по существу состоят или состоят из вариантов (включая производные) молекул антител (например, УН областей и/или УБ областей), описанных в данной заявке, такие антитела или их фрагменты иммуноспецифично связываются с полипептидом, связанным с расстройством, или его фрагментом или вариантом. Стандартные методики, известные специалистам в данной области, можно применять для введения мутаций в последовательность нуклеотидов, кодирующую антитело, включая, но не ограничиваясь перечисленными, сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез, которые приводят к заменам аминокислот. Предпочтительно указанные варианты (включая производные) кодируют менее чем 50 замен аминокислот, менее чем 40 замен аминокислот, менее чем 30 замен аминокислот, менее чем 25 замен аминокислот, менее чем 20 замен аминокислот, менее чем 15 замен аминокислот, менее чем 10 замен аминокислот, менее чем 5 замен аминокислот, менее чем 4 замены аминокислот, менее чем 3 замены аминокислот или менее чем 2 замены аминокислот относительно эталонной УН области, УН-СЭМ, УН-СЭЯ2, УН-СЭЯ3, УЪ область, УБ-СЭЯ1, УБ-СЭЕ2 или УБ-СЭЕ3. Консервативная замена аминокислоты представляет собой такую замену, при которой аминокислотный остаток замещается на аминокислотный остаток, имеющий боковую цепь с аналогичным зарядом. Семейства аминокислотных остатков, имеющие боковые цепи с аналогичными зарядами, были определены в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). В качестве альтернативы мутации

- 29 017611 можно ввести произвольно вдоль всей или части кодирующей последовательности, например, с помощью насыщающего мутагенеза и полученных мутантов подвергнуть скринингу на биологическую активность, чтобы идентифицировать мутантов, которые сохраняют активность (например, способность связывать полипептид, связанный с расстройством).

Например, можно ввести мутации только в каркасные области или только в СОЯ области молекулы антитела. Введенные мутации могут быть молчащими или нейтральными миссенс-мутациями, например, не влияющими или немного влияющими на способность антитела связывать антиген, в действительности, некоторые такие мутации вообще не изменяют последовательность аминокислот. Эти типы мутаций можно использовать для оптимизации использования кодона или улучшения продукции антитела гибридомой. Оптимизированные по кодону кодирующие участки, кодирующие антитела согласно изобретению, описаны в других местах в данной заявке. В качестве альтернативы не-нейтральные миссенсмутации могут изменять способность антитела связывать антиген. Большинство молчащих и нейтральных миссенс-мутаций вероятно расположено в каркасных областях, тогда как большинство ненейтральных миссенс-мутаций, вероятно, расположено в СОЯ, хотя это не является неопровержимым требованием. Специалист в данной области сможет разработать и протестировать мутантные молекулы с желаемыми свойствами, такими как отсутствие изменения в активности связывания антигена или изменение в активности связывания (например, улучшение активности связывания антигена или изменение специфичности антитела). После мутагенеза кодируемый белок можно обычным способом экспрессировать и можно определить функциональную и/или биологическую активность кодируемого белка (например, способность иммуноспецифично связывать по меньшей мере один эпитоп полипептида, связанного с расстройством), применяя методики, описанные в данной заявке, или с помощью обычных методик модификации, известных в данной области.

IV. Полинуклеотиды, кодирующие антитела.

В соответствии с вышесказанным изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему связывающую молекулу согласно изобретению, например антитело. В случае антитела указанный полинуклеотид может кодировать, по меньшей мере, вариабельную область цепи иммуноглобулина антитела, описанного выше. Полинуклеотид согласно изобретению, кодирующий описанное выше антитело, может представлять собой, например, ДНК, кДНК, РНК или синтетически полученные ДНК или РНК, или полученную рекомбинантным способом химерную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую любой из этих полинуклеотидов, либо отдельно, либо в комбинации. Предпочтительно указанный полинуклеотид является частью вектора. Такие векторы могут включать дополнительные гены, такие как маркерные гены, которые позволяют селекцию указанного вектора в подходящей клетке-хозяине и при подходящих условиях. Предпочтительно полинуклеотид согласно изобретению функционально связан с контролирующими экспрессию последовательностями, позволяющими экспрессию в прокариотических или эукариотических клетках. Экспрессия указанного полинуклеотида включает транскрипцию полинуклеотида в транслируемую мРНК. Регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию в эукариотических клетках, предпочтительно клетках млекопитающих, хорошо известны специалистам в данной области. Они обычно включают регуляторные последовательности, обеспечивающие инициацию транскрипции, и возможно поли-А сигналы, обеспечивающие терминацию транскрипции и стабилизацию транскрипта. Дополнительные регуляторные элементы могут включать транскрипционные, а также трансляционные энхансеры, и/или естественно связанные или гетерологичные промоторные области.

Полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, может состоять из любого полирибонуклеотида или полидезоксирибонуклеотида, который может быть немодифицированной РНК или ДНК или модифицированной РНК или ДНК. Например, полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, может состоять из одно- и двунитевой ДНК, ДНК, которая представляет собой смесь одно- и двунитевых участков, одно- и двунитевой РНК, и РНК, которая представляет собой смесь одно- и двунитевых участков, гибридных молекул, включающих ДНК и РНК, которые могут быть однонитевыми или, чаще, двунитевыми или смесью одно- и двунитевых участков. Кроме того, полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, может состоять из тринитевых участков, включающих РНК или ДНК или как РНК, так и ДНК. Полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, может также содержать одно или более модифицированных оснований или ДНК или РНК остовов, модифицированных для стабильности или с другой целью. Модифицированные основания включают, например, тритилированные основания и необычные основания, такие как инозин. Множество модификаций можно совершить над ДНК и РНК; таким образом полинуклеотид принимает химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы.

Выделенный полинуклеотид, кодирующий неприродный вариант полипептида, полученного из иммуноглобулина (например, части тяжелой цепи или части легкой цепи иммуноглобулина), можно создать путем введения одной или более нуклеотидных замен, вставок или делеций в нуклеотидную последовательность иммуноглобулина, таким образом, что одна или более замен, вставок или делеций аминокислот оказываются включены в кодируемый белок. Мутации можно ввести с помощью стандартных мето

- 30 017611 дик, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Предпочтительно консервативные замены аминокислот совершают в одном или более остатках заменимых аминокислот.

Что хорошо известно, РНК можно выделить из исходных клеток гибридомы или из других трансформированных клеток с помощью стандартных методик, таких как экстракция изотиоцианатом гуанидиния и преципитация с последующим центрифугированием или хроматографией. При желании, мРНК можно выделить из суммарной РНК с помощью стандартных методик, таких как хроматография на олиго(бТ)-целлюлозе. Подходящие методики известны в данной области.

В одном варианте реализации кДНК, которые кодируют легкую и тяжелую цепи антитела, можно получить либо одновременно, либо отдельно, применяя обратную транскриптазу и ДНК-полимеразу, в соответствии с хорошо известными способами. ПЦР можно инициировать с помощью консенсусных праймеров к константной области или с помощью более специфичных праймеров, основанных на опубликованных последовательностях ДНК и аминокислот тяжелой и легкой цепи. Как обсуждалось выше, ПЦР также можно применять для выделения ДНК клонов, кодирующих легкую и тяжелую цепи антитела. В этом случае, библиотеку можно подвергнуть скринингу на консенсусные праймеры или более длинные гомологичные зонды, такие как зонды константных областей мыши.

ДНК, обычно плазмидную ДНК, можно выделить из клеток, применяя методики, известные в данной области, осуществить рестрикционное картирование и секвенировать в соответствии со стандартными, хорошо известными методиками, подробно описанными, например, в вышеупомянутых ссылках, касающихся методик рекомбинантных ДНК. Конечно, ДНК может быть синтетической согласно изобретению на любом этапе в процессе выделения или последующего анализа.

В одном варианте реализации изобретение обеспечивает выделенный полинуклеотид, включающий, состоящий по существу из или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (УН), в которой по меньшей мере один из СИВ вариабельной области тяжелой цепи или по меньшей мере два из УН-СОВ вариабельной области тяжелой цепи по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичны последовательностям аминокислот для сравнения УН-СИВ1, УНСИВ2 или УН-СИВ3 тяжелой цепи из антител, описанных в данной заявке. В качестве альтернативы УНСИВ1, УН-СИВ2 и УН-СИВ3 области УН по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичны последовательностям аминокислот для сравнения УН-СОВ1, УН-СЭВ2 и УН-СЭВ3 тяжелой цепи из антител, описанных в данной заявке. Таким образом, согласно этому варианту реализации вариабельная область тяжелой цепи согласно изобретению имеет полипептидные последовательности УН-СЭЯ1. УН-СЭВ2 или УН-СОВ3, родственные полипептидным последовательностям, представленным в табл. 4.

В другом варианте реализации изобретение обеспечивает выделенный полинуклеотид, включающий, состоящий по существу из или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина (УЪ), в которой по меньшей мере один из УЪ-СОВ вариабельной области легкой цепи или по меньшей мере два из УБ-СОВ вариабельной области легкой цепи по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичны последовательностям аминокислот для сравнения УБ-СОВ1, УБ-СОВ2 или УБ-СОВ3 легкой цепи из антител, описанных в данной заявке. В качестве альтернативы УБ-СОВ1, УБ-СОВ2 и УБ-СОВ3 области УБ по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичны последовательностям аминокислот для сравнения УБ-СОВ1, УБ-СОВ2 и УБ-СОВ3 легкой цепи из антител, описанных в данной заявке. Таким образом, согласно этому варианту реализации вариабельная область легкой цепи согласно изобретению имеет полипептидные последовательности УБ-СОВ1, УБ-СОВ2 или УБ-СОВ3, родственные полипептидным последовательностям, представленным в табл. 4.

В другом варианте реализации изобретение обеспечивает выделенный полинуклеотид, включающий, состоящий по существу из или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (УН), в которой УН-СОВЕ УН-СОВ2 и УН-СОВ3 области имеют полипептидные последовательности, которые идентичны УН-СОВ1, УН-СОВ2 и УН-СОВ3 группам, представленным в табл. 4.

Как известно в данной области, идентичность последовательностей между двумя полипептидами или двумя полинуклеотидами определяют путем сравнения последовательности аминокислот или нуклеиновых кислот одного полипептида или полинуклеотида с последовательностью второго полипептида или полинуклеотида. В данной заявке описано, является ли любой отдельный полипептид по меньшей мере на приблизительно 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% идентичным другому полипептиду, можно определить, применяя способы и компьютерные программы/программное обеспечение, известные в данной области, такие как, но не ограничиваясь перечисленными, ВЕ8ТР1Т с (\У15сопвт 8ециепсе Αηαΐνβίβ Раскаде, версия 8 для Ишх, Семексе СотрШег Сгоир, ишуегвйу Вевеагск Рагк, 575 8аепсе Опте, Мэдисон, Винсконсин 53711). В ВЕ8ТР1Т применяется алгоритм локального выравнивания Смита и Ватермана, Абгапсее ш АррНеб Макюшаксе 2:482-489 (1981), чтобы найти наилучший сегмент гомологии между двумя последовательностями. При применении ВЕ8ТР1Т или любой другой программы выравнивания последовательностей, чтобы определить, является ли отдельная последовательность, например, на 95% идентичной эталонной последовательности согласно изобретению, параметры устанавливают, конечно, таким образом, что процент идентичности рассчитывается по всей длине полипептидной последовательности для сравнения и что гэпы в гомологии вплоть до 5% от общего числа амино

- 31 017611 кислот в эталонной последовательности являются допустимыми.

Таблица 5 Полинуклеотидные последовательности УН области специфичных к неоэпитопу антител

Антитело	Последовательность вариабельной области тяжелой цепи
N1-101.10 (ЗЕО 10 N0:3)	ОАоетесАестАотосАотстббОбСАеосетостссАбсстебеАботссстелбАстстсс ТОТССАОСОТСТООАИСвССТТСАОТАОСТАТббСАТАСАСТОС&ТССОССАООСТССАООСА АебевСТ0<ЗАОТО6ОТаОСА(ЗТТАТАТСаТТТОАТО<ЗААСТААААААТАСТАТАСА(ЗАСТССеТ(Э ААОббСАбАЛСАССАТСТССАОАбАСААТТССААОААСАСАСТОТАТСТбСАААТбААСАСССТ САОАбССбАбОАСАСООСТвТвТАТТАСТбТСС6АОАОАТАбСбСТАТАббА6СТС6вССОСб ОССбТАСТАСАТеОАСетСТСбООСАААООСАССАСеСТСАСССТСТССТСА
N1-101.11 (ЗЕО Ю N0:56)	ОАОбтосАестеатасАотстеебебАовсотоотссАесстосюАоетссстоАОАстстсс ТбТОСАбСбТСТббАТТСбССТГСАбТАбСТАТббСАТОСАСТОбОТССОССАббСТССАббСА АООООСТОСАвТвООТООСАОТГАТАТОСПТГбАТвОААСТААААААТАСТАТАСАОАСТССвТе АА00еСА0АТТСАССАТСТССА0АСАСААПССАА0ААСАСАСТ6ТАТСТ0САААТ6ААСАСССТ САбАбССОАОбАСАСбОСТОТбТАТТАСТОТОСйАОАбАТАбббОТАТАОбАбСТООбСбббй СССОТАСТАСАТООАСОТСТОСООСАААОСОАОСАСООТСАОСОТСТССТСА
N1-101.11 (6ΕΟΙΟ N0:5) (Кодоноптимизированное)	ОАбСТОСАбСТСйТОСАОАОСОбСООСйССОТООТОСАОСССООССОСЛйССТбСООСТбАб стосоос(зссАбс<зссттсвссттсАбСАбстАсоссАТ8САстееотсооесАоесссссоо СААаб6ССТббАвТб6бТб6ССбТбАТСТббТТСбАС6бСАССААбААбТАСТАСАССбАСАбС ОТбААбООССООТТСАССАТСАбСССббАСААСАбСААОААСАСССТОТАССТОСАбАТОААСА СССТЭСббБССбАббАСАССООСбТОТАСТАСТССбСССвбОАССбОбОСАТСбОСбСССбб СОбббССССТАСТАСАТббАСбТбТОбббСААбббСАССАССбТбАССОТбАбСАбС
N1-101.12 (@ЕО Ю N0:9)	бАбеТОСАбСТбОТббА6АбСбОССССбОССТбОТвААвСССЭССбАвАСССТбАбССТ6АСС ТеСАССОТбАОСОбСОбСАбСАТССбОАбСбОСАбСАТСТОСТббТАСТОбАТССбОСАОССС ССССбСААСббССТвСАОТСвАТССССТАСТТСТССТАСАОСОССОССАССПСТАСАСССССА СССТ6С6б0еССб6СТбАССАТСАбС6Т6ЭАСбССА6САА6ААССАбСТ0А6ССТбА6ССТ6А бСАбСйТбАССбССбССОАСАССбССЗТаТАСТАСТбСОСССббСООбССООСбАбААСАОС ОбСббСАТСбАесССТАСТАСебСАТОаАСбТбТбббвССАаоеСАССАССбТбАССбТбАбС ДОС
N1-101.13 (ЗЕО 10 N0.13)	САббТАСАбСТбСАбЗАбТСАббСССАбаАСтабТбААбССТТСбОАОАСССТОТСССТСАССТ ОСАСТбТСТСТббТОбСТССАТСАбСАбААбААбТТАСТАСТббббСТббАТССбССАбТСССС АбОбААббСбСТбОАОТОбАОТОСААеТАТССАТГАТАбСОббАбСАССТАСТАСААСССОТСС СТСААбАвТСбАбТСАССАТАТСТбТАвАСАСвТССААбААССАбТТСТСССТвАААСТбАОСТС ТбТГАССбССаСАбАСАСбОСТОТСТАТТАСТбТОСбАаАТСАСОТТббббСАеСАбСТббеТА ПТОАСТАСТСОбОССАвббСАСАСТбОТСАССОТСТСТТСО
N1-101.12Е6А (ЗЕО 10 N0:38)	САббТОСАОСТОбТбЭАОТСТббСббАббСбТббТССАОССТОбСАбеТСССТбАЗАСТСТСС ТбТаСАбСОТСТСОАТТСбССТТСАвТАбСТАТбССАТОСАСТбббТССОССАОССТССАбОСА АбббОСТбаАОТббОТвбСАбТТАТАТббТТТбАТОбААСТААААААТАСТАТАСАбАСТССбТб ААббОСА&АТГСАССАТСТССАЭАОАСААТТССААОААСАСАСТЗТАТСТбСАААТОААСАСССТ САОАеССОАСбАСАСОбСТСТСТАТТАСТбТеСбАбАОАТАбабОТАТАебАбСТСбСССЭбб бССбТАСТАСАТббАСбТСТббббСАААбООАССАСббТСАССбТСТССТСА
ΝΙ-101.13Α (ЗЕО 10 N0’52)	САббТаСАеСТбСАОбАбТСббОСССАббАСТббТбААОССТТСббАбАСССТбТСССТСАССТ 6САСТ6ТСТСТ66Т66СТССАТСА6СА6АА6АА6ТТАСТАСТ666ОСТ66АТСС6ССАОТСССС АаебААб&ббСТббАвТбОАбТббААвТАТССАТТАТАбСаааАЗСАССТАСТАСААСССбТСС СТСААаАбТСбАОТСАССАТАТСТбТАОАСАСбТССААОААССАОТТСТСССТСАААСТбАОСТС ТбПАССбССОСАбАСАСбеСТбТСТАГГАСТетаСОАОАТСАСбТТвбОбСАбСАбСТбббТА ТТТбАСТАСТОООСССАООбААСССТООТСАССбТСТССТСб
N1-101.13В (ЗЕО Ю N0:53)	САбЭТОСАОСТОСАбОАОТСОбОСССАОбАСТСеТбААСССЛСвОАОАСССТОТСССТСАССТ ССАСТеТСТСТбСТОбСТССАТСАбСАбААбААСТТАСТАСТОебОСТСОАТССОССАеТСССС АбОбААбОббСТООАОТббАбТОбААбТАТССАТТАТАбСОббАОСАССТАСТАСААСССбТСС СТСААбАбТСОАбТСАССАТАТСТбТАОАСАСбТССААЗААССАеТТСТСССТбАААСТбА&СТС ТбТТАССбССОСАбАСАСбеСТОТСТАТТАСТбТбСбАбАТСАСбТТббббСАбСАбСТббаТА ТГТОАСТАСТббОСССАОббААСССТСОТСАССбТСТССТСб

- 32 017611

Таблица 6

Полинуклеотидные последовательности УЪ области специфичных к неоэпитопу антител

Антитело	Последовательность вариабельной области легкой цепи (каппа или лямбда)
N1-101.Юи N1- 101.11 (ЗЕО Ю N0:7)	ОАААТТОТОСТСАСТСАСТСТССАТССТСССТСТСТССАТСТОТАСОАОАСАСАС.ТСАССАТСАСТ ТОССООеСААОТСАеАеСАТТАССАОСТАТТТАААТГОеТАТСААСАОАААССАООвАААОСССС ТААЙСТССТСАТСТАТССТОСАТССАОТТГССААЛОТООООТСССАТСААОвТТСАеТООСАОТО ЗАТСТОООАСАСАТТТСАСТСТСАССАТСАОСАОТСТеСААССТОААОАТТТТССААСТТАТТАСТ ЗТСАбСАОАОТГАСАОТАССССТСТСАСТТГСбОСООАОееАССААОСТСвАОАТСАААСОТАС 0
N1-101.12 (ЗЕО ΙΒ N0:11)	САСОАСАТССТССТОАСССАСА1ЭССССАОСАОССТвАОООССА6САТСО©С<>АСССОеТаАСС АТСАССТССССеСССА6СОА©АОСАТСААСААбТАСОТ6ААСТСОТАССАаСА(ЗААОССС©еСА АООСССССААОСТССТОАТСТАСеССвССАОСАОССТОСАеАвСОеСОСССССАаССОООТОА ОСйвСАбСОаСТТСйвССаООАСТТСАОССТОАССАТСАеСОаССТвСАООСССАвОАСТТСС ©СОССТАСТТСТОССАОСАОАОСТАСАйС(яСССССТАСАССТТСйСССАОСйСАССАА<3©ТО<ЗА 0АТСАА0С06АСС
N1-101.13 (ЗЕО 10 N0:15)	САОАеСОТССТбАСССАОССОСССАОСбСОАбССОСАССССаООССАОСвСОТОАССАКАОС ТОСАССвОСАОСАйСАОСААСАГГЗОСАвСААСТАТетвТАТТОСТАТСАОСАСССССССООСА ССесеСС0АААСТССТ0АТТТАТС0СААСААССАСС0ССС0А6С6СС6ТСССе0АТСеСТТТАе С©ССА0САААА6Се0САССА©СССвА0ССТ6СС©АТГА6С06ССТ©С0СА©СвАА0АТС|ААаС обАттАттАттссесбесбТбейАТ©АТАбсстоАбсеестАтотетттбесАСсаосАССААА ОТЭАСССТССТО
N1-101.12Р6А (ЗЕО Ю N0:40)	ОАСАТСОАОАТОАСССАОТСТССАТССТСССТеТСТОСАТСТЭТАЭОАОАСАОАбТСАССАТСАС ТТОСССООСААЗТСАОАССАТТА&САССТАТТТАААТТОСТАТСААСАОАМССАСООАМбССС стААестсствдтсТАтастесАтссАстттасАААетеезотсссАтСААейТтсАетоосАбт ООАТСТвбОАСАОАТТТСАСТСТСАССАТСАОСАОТСТССААССТОААСАТТТТвСААСТТАТТАС ТеТСАеСАОАОТТАСАОТАССССТСТСАСТТТССОСйеАОйСЛССААС&ТаСАеАТСАААСаТ
N1-101.13А (ЗЕО Ю N0:54)	вАСАТССАСТТСАСССАСТСТССАТССТСССТОТСТВСАТСТСТАСОАОАСАСАОТСАССАТСАС ТТасСбОасААаТСАОАОСАТТАеСАОСТАТГТАААТТейТАТСАОСАОАААССАОеОАААОССО СТААОСТССТОАТСТАТССТОСАТССАСТТТОСАААОТООООТСССАТСААОСТТСАСТСОСАОТ ©βΑΤΟΤΟΟί^ΑΟΑβΑΤΠΌΑΟΪΌΤΟΑΟΟΑΤΟΑβΟΑΟΤΟΤΟΟΑΑΌΟΤΟΑΑΘΑΤΤΠΌΟΑΑΟπΑΟΤΑΟ ТОТСААСАОАОКАСАОТАССАСААСОКССЭССААвООАССААООТООАОАТСАААСОТАСО
N1-101.13В (ЗЕО Ю N0:55)	ОАСАТССАОТТОАСССАОТСТССТГССАСССТОТСТОСАТСТОТАООАбАСАОАОТСАССАТСАС ТтаСССбСССАбТСАбАСТАТТАСТАбСТСОТТСОССТООТАТСАОСАОАТТССАСЮБАААССС ССТААОСТССТОАТСТАТААООСОТСТАОТТТАОАААбТООеоТСССАТСААООТТСАеСвССАО ТОвАТСТСООАСАОААТТСАСТСТСАССАТСАОСАОССТОСАОССТОАТОАТТТТОСААСКАТТА СТОССААСАОТАТМТАОТТАПСТССААСОТТС&ОССААОООАССААОСТбСАОАТСАААСОТА со

В связи с этим, для специалиста в данной области должно быть очевидно, что полинуклеотиды, кодирующие, по меньшей мере, вариабельный домен легкой и/или тяжелой цепи, могут кодировать вариабельные домены обеих цепей иммуноглобулина или только одной. Подобным образом, указанные полинуклеотиды могут находиться под контролем одного и того же промотора или могут отдельно контролироваться для экспрессии. Возможные регуляторные элементы, позволяющие экспрессию в прокариотических клетках-хозяевах, включают, например, РЬ, 1ас, 1гр или 1ас промотор в Е. со11, и примерами регуляторных элементов, позволяющих экспрессию в эукариотических клетках-хозяевах, являются АОХ1 или САЬ1 промотор в дрожжах или СМУ-, 8У40-, В8У-промотор, СМУ-энхансер, 8У40-энхансер или глобиновый интрон в клетках млекопитающего и другого животного. Помимо элементов, которые ответственны за инициацию транскрипции, такие регуляторные элементы могут также включать сигналы терминации транскрипции, такие как 8К40-поли-А сайт или 1к-поли-А сайт, расположенные по ходу транскрипции полинуклеотида. Более того, в зависимости от используемой системы экспрессии лидерные последовательности, способные направлять полипептид в клеточный компартмент или на секрецию в среду, можно добавить к кодирующей последовательности полинуклеотида согласно изобретению, и они хорошо известны в данной области. Лидерная последовательность(и) собирается(ются) в подходящей фазе с последовательностями трансляции, инициации и терминации, и предпочтительно лидерная последовательность способна направлять секрецию транслированного белка, или его части, в периплазматическое пространство или во внеклеточную среду. Возможно, гетерологичная последовательность может кодировать слитый белок, включающий С- или Кконцевой идентификационный пептид, придающий желаемые свойства, например стабилизацию или упрощенную очистку экспрессируемого рекомбинантного продукта. В этом контексте подходящие векторы экспрессии известны в данной области, такие как Окауата-Вегд кДНК-вектор экспрессии рсЭУ1 (Рйагтааа), рСЭМ8, рВс/СМУ, рсЭХАк рсЭХА3 (Ιηνί(годеп) или р8РОКТ1 (С1ВСО ВНЬ). Предпочтительно контролирующие экспрессию последовательности будут представлять собой эукариотические промоторные системы в векторах, способных трансформировать или трансфецировать эукариотические клетки-хозяева, но также можно применять контрольные последовательности для прокариотических хозяев. Как только вектор был введен в подходящего хозяина, хозяина поддерживают при условиях, подходящих для высокого уровня экспрессии последовательностей нуклеотидов, и, при желании, может последовать сбор и очистка легких цепей, тяжелых цепей, димеров легкой/тяжелой цепи иммуноглобулинов или интактных антител, связывающих фрагментов или других форм иммуноглобулинов; см., Веусйок, Се1к оГ 1ттипод1оЬи1т 8уп(йе515, Асайетю Рге§8, КУ. (1979).

Изобретение также включает фрагменты полинуклеотидов согласно изобретению, как описано в где-либо еще. Дополнительно, полинуклеотиды, которые кодируют слитые полинуклеотиды, ЕаЬ фрагменты и другие производные, описанные в данной заявке, также предполагаются настоящим изобретением.

- 33 017611

Полинуклеотиды можно получать или производить с помощью любого способа. известного в данной области. Например. если известна нуклеотидная последовательность антитела. полинуклеотид. кодирующий антитело. можно собрать из химически синтезированных олигонуклеотидов (например. как описано у Ки1те1ег и др.. ВюТес11шс.|ие5 17:242 (1994)). что. вкратце. включает синтез перекрывающихся олигонуклеотидов. содержащих части последовательности. кодирующей антитело. отжиг и лигирование таких олигонуклеотидов. а затем амплификацию лигированных олигонуклеотидов с помощью ПЦР.

В качестве альтернативы полинуклеотид. кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. вариант или производное. можно получить из нуклеиновой кислоты из подходящего источника. Если клон. содержащий нуклеиновую кислоту. кодирующую конкретное антитело. не доступен. но последовательность молекулы антитела известна. нуклеиновую кислоту. кодирующую антитело. можно химически синтезировать или получить из подходящего источника (например. кДНК библиотеки антител или кДНК библиотеки. полученной из или нуклеиновой кислоты. предпочтительно поли-А+ РНК. выделенной из любой ткани или клеток. экспрессирующих антитело. специфичное к неоантигену. таких как клетки гибридомы. отобранный для экспрессирования антитела) путем ПЦР-амплификации. применяя синтетические праймеры. гибридизируемые с 3'- и 5'-концами последовательности. или с помощью клонирования. применяя олигонуклеотидный зонд. специфичный к определенной последовательности гена. который нужно идентифицировать. например к кДНК клону из кДНК библиотеки. который кодирует антитело. Амплифицированные нуклеиновые кислоты. полученные с помощью ПЦР. можно затем клонировать в реплицируемые клонирующие векторы. применяя любой способ. хорошо известный в данной области.

Как только нуклеотидная последовательность и соответствующая последовательность аминокислот антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. варианта или производного определена. над его нуклеотидной последовательностью можно совершать манипуляции. применяя способы. хорошо известные в данной области. для манипулирования над последовательностями нуклеотидов. например методики рекомбинантных ДНК. сайт-направленный мутагенез. ПЦР и т.д. (см.. например. методики. описанные у 8атЬгоок и др.. Мо1еси1аг С1ошпд. А каЬогаЮгу Мапиа1. 2-е изд.. Со1б 8ргтд НагЬог каЬогаЮгу. КолдСпрингХарбор. Нью-Йорк (1990) и Аи8иЪе1 и др.. ред.. С’иггеШ РгоФсок ίη Мо1еси1аг Вю1оду. 1о1т \νίΚ\· & 8оп§. ΝΥ (1998). оба из которых полностью включены в данную заявку посредством ссылки). для получения антител. имеющих отличную последовательность аминокислот. например. для введения замен. делеций и/или вставок аминокислот.

У. Экспрессия полипептидов антител.

Изобретение также включает способ получения клеток. способных экспрессировать антитело согласно изобретению или соответствующую цепь (цепи) иммуноглобулина. включающий генетическое конструирование клеток с полинуклеотидом или с вектором согласно изобретению. Клетки. которые можно получить с помощью способа согласно изобретению. можно применять. например. для исследования взаимодействия антитела согласно изобретению с его антигеном.

После проведения манипуляций над выделенным генетическим материалом. чтобы получить антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. варианты или производные согласно изобретению. полинуклеотиды. кодирующие антитела. обычно вставляют в вектор экспрессии для введения в клеткихозяева. которые можно использовать для получения желаемого количества антитела.

Рекомбинантная экспрессия антитела или его фрагмента. производного или аналога. например тяжелой или легкой цепи антитела. которое связывается с целевой молекулой. описана в данной заявке. Как только был получен полинуклеотид. кодирующий молекулу антитела или тяжелую или легкую цепь антитела. или ее часть (предпочтительно содержащую вариабельный домен тяжелой или легкой цепи). согласно изобретению можно получить вектор для получения молекулы антитела с помощью технологии рекомбинантной ДНК. применяя методики. хорошо известные в данной области. Таким образом. способы получения белка путем экспрессирования полинуклеотида. содержащего нуклеотидную последовательность. кодирующую антитело. описаны в данной заявке. Способы. которые хорошо известны специалистам в данной области. можно применять для конструирования векторов экспрессии. содержащих последовательности. кодирующие антитела. и подходящие транскрипционные и трансляционные контролирующие сигналы. Эти способы включают. например. ίη νίίΓΌ методики рекомбинантных ДНК. синтетические методики и ίη νί\Ό генетическую рекомбинацию. Изобретение. таким образом. обеспечивает реплицируемые векторы. включающие последовательность нуклеотидов. кодирующую молекулу антитела согласно изобретению. или ее тяжелую или легкую цепь. или вариабельный домен тяжелой или легкой цепи. функционально связанные с промотором. Такие векторы могут включать нуклеотидную последовательность. кодирующую константную область молекулы антитела (см.. например. публикацию РСТ νθ 86/05807; публикацию РСТ νθ 89/01036 и патент США 5122464). и вариабельный домен антитела можно клонировать в такой вектор для экспрессии целой тяжелой или легкой цепи.

Изобретение относится к векторам. особенно плазмидам. космидам. вирусам и бактериофагам. которые традиционно используются в генетической инженерии. которые включают полинуклеотид. кодирующий антиген или предпочтительно вариабельный домен цепи иммуноглобулина антитела согласно изобретению; возможно в комбинации с полинуклеотидом согласно изобретению. который кодирует ва

- 34 017611 риабельный домен другой цепи иммуноглобулина антитела согласно изобретению. Предпочтительно указанный вектор представляет собой вектор экспрессии и/или вектор переноса генов или направленной доставки. Векторы экспрессии, полученные из вирусов, таких как ретровирусы, вирус осповакцины, аденоассоциированный вирус, вирусы герпеса или вирус папилломы крупного рогатого скота, можно применять для доставки полинуклеотидов или вектора согласно изобретению в целевые популяции клеток. Способы, которые хорошо известны специалистам в данной области, можно применять для конструирования рекомбинантных вирусных векторов; см., например, методики, описанные у 8атЬгоок, Мо1еси1аг С1ошпд А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу (1989) Ν.Υ. и Аи8иЬе1, Сштеп! Рго!осо1§ ίη Мо1еси1аг Вю1о§у, Сгееп РиЬШЫпд А55оаа1е5 и ^11еу 1п!ег§с1епсе, Ν.Υ. (1994). В качестве альтернативы полинуклеотиды и векторы согласно изобретению можно затем заключить в липосомы для доставки к целевым клеткам. Векторы, содержащие полинуклеотиды согласно изобретению (например, последовательности, кодирующие вариабельный домен(ы) тяжелой и/или легкой цепей иммуноглобулина, и последовательности, контролирующие экспрессию) можно перенести в клетку-хозяина с помощью хорошо известных способов, которые можно варьировать в зависимости от типа клеточного хозяина. Например, трансфекция хлористым кальцием широко применяется для прокариотических клеток, тогда как обработку фосфатом кальция или электропорацию можно применять для других клеточных хозяев; см. 8атЬгоок, выше.

Термин вектор или вектор экспрессии используется в данной заявке для обозначения векторов, применяемых в соответствии с настоящим изобретением в качестве носителя для введения и экспрессии желаемого гена в клетке-хозяине. Как известно специалистам в данной области, такие векторы можно легко выбрать из группы, состоящей из плазмид, фагов, вирусов и ретровирусов. Как правило, векторы, согласующиеся с настоящим изобретением, включают селекционный маркер, подходящие сайты рестрикции для облегчения клонирования желаемого гена и способность проникать и/или реплицироваться в эукариотических или прокариотических клетках.

Для целей изобретения можно использовать многочисленные векторные системы экспрессии. Например, в одном классе вектора используются элементы ДНК, которые получены из вирусов животных, таких как вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус полиомы, аденовирус, вирус осповакцины, бакуловирус, ретровирусы (Κδν, ΜΜΤν или ΜΟΜΕν) или вирус δν40. В других применяются полицистронные системы со встроенным сайтом связывания рибосом. Дополнительно, клетки, в хромосомы которых встроилась указанная ДНК, можно подвергнуть селекции путем введения одного или более маркеров, которые позволяют селекцию трансфецированных клеток-хозяев. Маркер может обеспечить прототрофией ауксотрофного хозяина, устойчивость к биоциду (например, антибиотикам) или устойчивость к тяжелым металлам, таким как медь. Ген селектируемого маркера может быть либо непосредственно связанным с последовательностями ДНК, которые нужно экспрессировать, либо введен в ту же клетку путем совместной трансформации. Для оптимального синтеза мРНК могут также потребоваться дополнительные элементы. Эти элементы могут включать сигнальные последовательности, сигналы сплайсинга, а также транскрипционные промоторы, энхансеры и сигналы терминации.

В особенно предпочтительных вариантах реализации клонированные гены вариабельной области вставляли в вектор экспрессии наряду с генами константных областей тяжелой и легкой цепи (предпочтительно человека), синтезированные, как описано выше. В одном варианте реализации это осуществляли, применяя запатентованный вектор экспрессии от Вюдеп ШЕС, 1пс., называемый ΝΕΟδΡΕ-А (описанный в патенте США № 6159730). Этот вектор содержит цитомегаловирусный промотор/энхансер, главный промотор бета-глобина мыши, точку начала репликации δν40, последовательность полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота, экзон 1 и экзон 2 неомицин-фосфотрансферазы, ген дигидрофолатредуктазы и лидерную последовательность. Было обнаружено, что применение этого вектора приводит к очень высокому уровню экспрессии антител при введении генов вариабельной и константной областей, при трансфекции клеток СНО, с последующей селекцией в среде, содержащей С418, и амплификацией с метотрексатом. Конечно, любой вектор экспрессии, который способен вызывать экспрессию в эукариотических клетках, можно применять в настоящем изобретении. Примеры подходящих векторов включают, но не ограничены перечисленными, плазмиды ρс^NА3, рНСМ^2ео, рСЯ3.1, рЕЕ1/Нщ, рПМБ/СЗ, рЯс/Ι ΚΊνίνΐ, ρδν40^2, рТЯАСЕК-НСМУ рЕВ6А’5-| Пу рVАX1 и рΖеοδV2 (доступные от 1пуЦгодеп. Сан-Диего, Калифорния) и плазмиду рС1 (доступная от Рготеда, Мэдисон, Винсконсин). Как правило, скрининг большого числа трансформированных клеток для обнаружения таких, которые экспрессируют достаточно высокие уровни тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, подразумевает проведение обычных экспериментов, которые можно осуществить, например, с помощью роботизированных систем. Векторные системы также описаны в патентах США №№ 5736137 и 5658570, каждый из которых полностью включен в данную заявку посредством ссылки. Эта система обеспечивает высокие уровни экспрессии, например > 30 пг/клетку/день. Другие типичные векторные системы описаны, например, в патенте США № 6413777.

В других предпочтительных вариантах реализации антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные согласно изобретению можно экспрессировать, применяя полицистронные конструкции, такие как описанные в заявке на патент США № 2003-0157641 А1, поданной 18 нояб

- 35 017611 ря, 2002 и полностью включенной в данную заявку. В этих новых системах экспрессии множество интересующих генетических продуктов, таких как тяжелые и легкие цепи антител, можно получить из одной полицистронной конструкции. В этих системах успешно используется участок внутренней посадки рибосомы (1РЕ8), чтобы обеспечить относительно высокие уровни антител. Подходящие 1РЕ8 последовательности описаны в патенте США № 6193980, который также включен в данную заявку. Для специалиста в данной области должно быть очевидно, что такие системы экспрессии можно применять, чтобы эффективно получать полный диапазон антител, описанных в настоящей заявке.

В более общем смысле, как только был получен вектор или последовательность ДНК, кодирующая мономерную субъединицу, вектор экспрессии можно вводить в подходящую клетку-хозяина. Введение плазмиды в клетку-хозяина можно совершить с помощью различных методик, хорошо известных специалистам в данной области. Эти методики включают, но не ограничены перечисленными, трансфекцию (включая электрофорез и электропорацию), слияние протопластов, преципитацию фосфатом кальция, слияние клетки с ДНК в оболочке, микроинъекцию и инфекцию интактным вирусом, см., Р1бдгау, А.А.6. Маттайап Ехргеззюп УесГогз УесГогз, йобпдие/ и ЭепйагбГ, ред., Вийег^оййз, Бостон, Массачуссетс, глава 24.2, с. 470-472 (1988). Обычно введение плазмиды в хозяина осуществляют путем электропорации. Клетки-хозяева, несущие экспрессионную конструкцию, растили при условиях, подходящих для получения легких цепей и тяжелых цепей, и анализировали на белковый синтез тяжелой и/или легкой цепи. Типичные методики анализа включают твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А), радиоиммуноанализ (Р1А) или анализ методом сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (ЕАС8), иммуногистохимию и т.п.

Вектор экспрессии переносят в клетку-хозяина с помощью обычных методик и трансфецированные клетки затем культивируют с помощью обычных методик, чтобы получить антитело для применения в способах, описанных в данной заявке. Таким образом, изобретение включает клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид, кодирующий антитело согласно изобретению, или его тяжелую или легкую цепь, функционально связанные с гетерологичным промотором. В предпочтительных вариантах реализации для экспрессии двухцепочечных антител векторы, кодирующие обе тяжелую и легкую цепи, можно совместно экспрессировать в клетке-хозяине для экспрессии целой молекулы иммуноглобулина, как подробно описано ниже.

Изобретение более того относится к клеткам-хозяевам, трансформированным полинуклеотидом или вектором согласно изобретению. Указанная клетка-хозяин может быть прокариотической или эукариотической клеткой. Полинуклеотид или вектор согласно изобретению, который присутствует в клеткехозяине, либо может быть встроенным в геном клетки-хозяина, либо может поддерживаться внехромосомно. Клеткой-хозяином может быть любая прокариотическая или эукариотическая клетка, такая как бактериальная, насекомая, грибковая, растительная, животная или клетка человека. Предпочтительные грибковые клетки представляют собой, например, клетки рода 8ассйаготусез, в частности, из вида 8. сеге\'Ыае. Термин прокариотический считают включающим все бактерии, которые можно трансформировать или трансфецировать молекулами ДНК или РНК для экспрессии антитела согласно изобретению или соответствующих цепей иммуноглобулинов. Прокариотические хозяева могут включать грамотрицательные, а также грамположительные бактерии, такие как, например, Е. сой, 8. 1урЫтцгшт, 8еггайа тагсезсепз и ВасШиз зиЬГШз. Термин эукариотический считают включающим клетки дрожжей, высших растений, насекомых и предпочтительно млекопитающих, наиболее предпочтительно клетки НЕК 293, N80 и СНО. В зависимости от используемого хозяина в процедурах рекомбинантного получения антитела или цепи иммуноглобулина, кодируемого полинуклеотидом согласно изобретению, могут быть гликозилированными или негликозилированными. Антитела согласно изобретению или соответствующие цепи иммуноглобулина могут также включать инициирующий аминокислотный остаток метионина. Полинуклеотид согласно изобретению можно применять для трансформации или трансфекции хозяина, применяя любые методики, широко известные средним специалистам в данной области. Более того, способы получения слитых, функционально связанных генов и их экспрессирования, например, в клетках млекопитающих и бактериях хорошо известны в данной области (8атЬгоок, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаГогу Мапиа1, Со1б 8рпп§ НагЬог ЬаЬогаГогу, Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк, 1989). Генетические конструкции и способы, описанные в указанных источниках, можно применять для экспрессирования антитела согласно изобретению или соответствующих цепей иммуноглобулинов в эукариотических или прокариотических хозяевах. Как правило, векторы экспрессии, содержащие промоторные последовательности, которые облегчают эффективную транскрипцию вставленных полинуклеотидов, применяются в связи с хозяином. Вектор экспрессии обычно содержит точку начала репликации, промотор и терминатор, а также специфичные гены, которые способны обеспечивать фенотипическую селекцию трансформированных клеток. Подходящие исходные клетки для последовательностей ДНК и клетки-хозяева для экспрессии иммуноглобулина и секреции можно получить из ряда источников, таких как Американская коллекция типовых культур (Атепсап Туре СиЙиге Сойесйоп) (СаГа1одие оГ Се11 Ьтез апб НуЬпботаз, 5-е изд. (1985), Роквиль, Мэриленд, США, которые включены в данную заявку посредством ссылки). Более того, трансгенные животные, предпочтительно млекопитающие, включающие клетки согласно изобретению, могут применяться для крупномасштабного получения антитела согласно изобре

- 36 017611 тению. Таким образом, в дополнительном варианте реализации изобретение относится к способу получения связывающей молекулы, специфичной к белку, связанному с расстройством, например антитела или его связывающего фрагмента либо цепи (цепей) иммуноглобулина, указанный способ включает:

(a) культивирование клетки, как описано выше; и (b) выделение указанного антигена, связывающей молекулы, антитела или его связывающего фрагмента либо цепи (цепей) иммуноглобулина из культуры.

Трансформированных хозяев можно растить в ферментерах и культивировать согласно методикам, известным в данной области, чтобы достигнуть оптимального роста клеток. Как только экспрессированы целые антитела, их димеры, отдельные легкие и тяжелые цепи или другие формы иммуноглобулинов согласно изобретению, их можно очистить согласно стандартным процедурам в данной области, включая преципитацию сульфатом аммония, колонки для аффинной хроматографии, колоночную хроматографию, гель-электрофорез и т.п.; см., 8соре§, Рго1ет Рипйсабоп, Зрйпдег Уег1ад, Ν.Υ. (1982). Антитело или соответствующую цепь (цепи) иммуноглобулина согласно изобретению можно затем выделить из ростовой среды, клеточных лизатов или фракций клеточных мембран. Выделение и очистку, например, рекомбинантно экспрессированных антител или цепей иммуноглобулина согласно изобретению можно осуществить с помощью любых обычных средств, таких как, например, препаративные хроматографические разделения и иммунологические разделения, такие как включающие применение моноклональных или поликлональных антител, направленных, например, против константной области антитела согласно изобретению. Для специалистов в данной области должно быть очевидно, что антитела согласно изобретению можно дополнительно соединить с другими молекулами, например, для применений с нацеливанием лекарственного препарата и визуализацией. Такое соединение можно совершить химически, после экспрессии антитела или антигена, к месту присоединения, или продукт соединения можно сконструировать внутри антитела или антигена согласно изобретению на уровне ДНК. ДНК затем экспрессируют в подходящей системе хозяина, и экспрессированные белки собирают и ренатурируют, если это необходимо. По существу, чистые иммуноглобулины по меньшей мере с приблизительно от 90 до 95% гомогенности являются предпочтительными и от 98 до 99% или большим процентом гомогенности являются наиболее предпочтительными для фармацевтических применений. Как только антитела были очищены, частично или до гомогенности, как это необходимо, указанные антитела можно затем применять терапевтически (включая экстракорпоральное применение) или при разработке и выполнении процедур тестирования.

Клетку-хозяина можно совместно трансфецировать двумя векторами экспрессии согласно изобретению, первым вектором, кодирующим полипептид, полученный из тяжелой цепи, и вторым вектором, кодирующим полипептид, полученный из легкой цепи. Два указанных вектора могут содержать идентичные селектируемые маркеры, которые позволяют одинаковую экспрессию полипептидов тяжелой и легкой цепи. В качестве альтернативы можно применять один вектор, который кодирует оба полипептида тяжелой и легкой цепи. В этом случае, легкую цепь преимущественно помещают перед тяжелой цепью, чтобы избежать избытка токсичной свободной тяжелой цепи (РгоибГоо!, №11иге 322:52 (1986); КоН1ег, Ргос. №Й. Асаб. 8ск И8А 77:2197 (1980)). Кодирующие последовательности тяжелых и легких цепей могут включать кДНК или геномную ДНК.

В данной заявке термин клетки-хозяева относится к клеткам, которые несут векторы, сконструированные с применением методик рекомбинантных ДНК и кодирующие по меньшей мере один гетерологичный ген. При описаниях процессов выделения антител из рекомбинантных хозяев термины клетка и культура клеток используются взаимозаменяемо для обозначения источника антитела, если явно не указано иначе. Другими словами, выделение полипептида из клеток может означать выделение либо из осажденных целых клеток, либо из культуры клеток, содержащей как среду, так и суспендированные клетки.

Множество систем хозяин-вектор экспрессии можно использовать для экспрессирования молекул антител для применения в способах, описанных в данной заявке. Такие системы хозяин-вектор экспрессии представляют средства доставки, с помощью которых можно получить и затем очистить интересующие кодирующие последовательности, но также представляют клетки, которые могут, после того, как они были трансформированы или трансфецированы подходящими нуклеотидными кодирующими последовательностями, экспрессировать молекулу антитела согласно изобретению ίη δίΐιι. Они включают, но не ограничены перечисленными, такие микроорганизмы, как бактерии (например, Е. сой, В. 8иЫ1118), трансформированные рекомбинантными векторами экспрессии ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или космидной ДНК, содержащими последовательности, кодирующие антитела; дрожжи (например, 8ассйаготусек, РюЫа), трансформированные рекомбинантными дрожжевыми векторами экспрессии, содержащими последовательности, кодирующие антитела; системы клеток насекомых, инфицированных рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, бакуловирусными), содержащими последовательности, кодирующие антитела; системы растительных клеток, инфицированных рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, вирус мозаики цветной капусты, СаМУ; вирус табачной мозаики, ТМУ) или трансформированных рекомбинантными плазмидными векторами экспрессии (например, плазмидой Т1), содержащими последовательности, кодирующие антитела; или системы клеток

- 37 017611 млекопитающих (например, клеток СО8, СНО, ВЬК, 293, 3Т3), несущих рекомбинантные экспрессионные конструкции, содержащие промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих (например, металлотионеиновый промотор) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; 7.5К промотор вируса осповакцины). Предпочтительно для экспрессии рекомбинантной молекулы антитела используют бактериальные клетки, такие как ЕксйепсШа сой, и более предпочтительно эукариотические клетки, особенно для экспрессии целой рекомбинантной молекулы антитела. Например, клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО), совместно с вектором, таким как главный промоторный элемент промежуточно-ранних генов из цитомегаловируса человека, представляют собой эффективную систему экспрессии для антител (Еоескшд и др., Сепе 45:101 (1986); Соскей и др., Вю Тесйио1оду 8:2 (1990)).

Линия клеток-хозяев, используемая для экспрессии белка, часто является линией млекопитающего происхождения; специалисты в данной области обладают способностью предпочтительно определять конкретные линии клеток-хозяев, которые лучше всего подходят для экспрессирования в них желаемого продукта гена. Типичные линии клеток-хозяев включают, но не ограничены перечисленными, СНО (клетки яичника китайского хомячка), ЭС44 и ЭиХВ 11 (линии клеток яичника китайского хомячка, лишенные дигидрофолатредуктазы (ЭНЕЙ)). НЕЬА (клетки рака шейки матки человека), СУ1 (линия клеток почек мартышки), СО8 (производное от СУ1 с Т-антигеном 8У40), УЕКУ, ВНК (клетки почек хомячков), МОСК, 293, νΐ38, Я1610 (фибробласты китайского хомячка) ВАЙВС/3Т3 (фибробласты мыши), НАК (линия клеток почек хомячка), 8Р2/О (миелома мыши), Р3х63-Ад3.653 (миелома мыши), ВЕА1с1ВРТ (эндотелиальные клетки быка), НАЛ (лимфоциты человека) и 293 (клетки почек человека). Клетки СНО являются особенно предпочтительными. Линии клеток-хозяев обычно доступны от организаций по оказанию коммерческих услуг, Атепсап Тщкие СиЙиге С'о11ес(1оп, или из опубликованной литературы.

Кроме того, можно выбрать линию клеток-хозяев, которая модулирует экспрессию вставленных последовательностей или модифицирует и подвергает процессингу генетический продукт особенным желаемым образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) белковых продуктов могут быть важны для функции белка. Различные клетки-хозяева имеют характерную особенность и особенные механизмы посттрансляционного процессинга и модификации белков и продуктов генов. Можно выбрать подходящие линии клеток или системы хозяина, чтобы обеспечить правильные модификации и процессинг чужеродного экспрессируемого белка. В этих целях можно использовать эукариотические клетки-хозяева, которые обладают клеточной машинерией для правильного процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генетического продукта.

Для постоянного, высокопродуктивного получения рекомбинантных белков стабильная экспрессия является предпочтительной. Например, можно сконструировать линии клеток, которые стабильно экспрессируют молекулу антитела. Вместо того чтобы применять векторы экспрессии, которые содержат вирусные точки начала репликации, клетки-хозяева можно трансформировать ДНК, контролируемой подходящими экспрессионными регуляторными элементами (например, промоторными, энхансерными последовательностями, терминаторами транскрипции, сайтами полиаденилирования и т. д.) и селектируемым маркером. После введения чужеродной ДНК сконструированным клеткам можно позволить расти в течение 1-2 дней в обогащенных средах, а затем переключить на селективные среды. Селектируемый маркер в рекомбинантной плазмиде придает устойчивость к селекции и позволяет клеткам стабильно встраивать плазмиду в их хромосомы и расти с образованием колонии, которую, в свою очередь, можно клонировать и нарастить в линиях клеток. Этот способ можно успешно применять для конструирования линий клеток, которые стабильно экспрессируют молекулу антитела.

Можно применять ряд систем селекции, включая, но не ограничиваясь перечисленными, гены тимидинкиназы вируса простого герпеса ^1д1ег и др., Се11 11:223 (1977)), гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (8хуЬа1кка & 8хуЬа18кг Ргос. №И. Асаб. 8ск и8А 48:202 (1992)) и аденинфосфорибозилтрансферазы (Ьо^у и др., Се11 22:817 1980), используемые в !к-, йдрй- или арй-клетках соответственно. Также, устойчивость к антиметаболитам можно применять как основу селекции для следующих генов: бШг, который придает устойчивость к метотрексату ^1д1ег и др., №И. Асаб. 8сг и8А 77:357 (1980); О'Наге и др., Ргос. №И. Асаб. 8ск и8А 78:1527 (1981)); др!, который придает устойчивость к микофеноловой кислоте (МиШдап & Вегд, Ргос. №!1. Асаб. 8ск и8А 78:2072 (1981)); пео, который придает устойчивость к аминогликозиду С-418, Сйшса1 Рйагтасу 12:488-505; νυ и νυ, ВюШегару 3:87-95 (1991); ^Η^κ^ν, Апп. йет. Рйагтасо1. Тохюо1. 32:573-596 (1993); МиШдап, 8с1епсе 260:926-932 (1993); Могдап и Апбегкоп, Апп. Нет. Вюсйет. 62:191-217 (1993); Т1В ТЕСН 11(5): 155-215 (май, 1993) и йудго, который придает устойчивость к гигромицину (8айегге и др., Сепе 30:147 (1984)). Способы технологии рекомбинантной ДНК, широко известные в данной области, которые можно применять, описаны у АикиЬе1 и др. (ред.), Сиггей Рго!осок ш Мо1еси1аг Вю1оду, ЛоНп νίΕν & 8опк, ΝΥ (1993); Кпед1ег, Сепе ТгапкГег апб Ехргеккюп, А ЬаЬога!огу Мапиа1, 8Юск1оп Ргекк, ΝΥ (1990) и в главах 12 и 13, Эгасорой и др. (ред.), Сиггей Рго!осок ш Нитап Сепейск, ЛоНп \νί®ν & 8опк, ΝΥ (1994); Со1Ьегге-Сагарш и др., 1. Мо1. Вю1. 150:1 (1981), которые полностью включены в данную заявку посредством ссылки.

Уровни экспрессии молекулы антитела можно повысить с помощью амплификации вектора (для

- 38 017611 обзора см. ВеЬЬтд1оп и Неп1ксйе1, ТНе ике о£ уесЮгк Ьакеб оп депе атрИйсабоп £ог Ше ехргеккюп о£ с1опеб депек т таттабап се11к т ΩΝΛ с1ошпд, Асабепис Ргекк, №те Υо^к, том 3. (1987)). Когда маркер в векторной системе, экспрессирующей антитело, является амплифицируемым, повышение уровня ингибитора, присутствующего в культуре клеток-хозяев, приведет к увеличению числа копий маркерного гена. Поскольку амплифицированная область связана с геном антитела, выработка антитела также возрастет (Сгоике и др., Мо1. Се11. Вю1. 3:257 (1983)).

Продуцирование ш уйго позволяет масштабирование для получения больших количеств желаемых полипептидов. Методики культивирования клеток млекопитающих в условиях искусственного выращивания известны в данной области и включают гомогенную суспензионную культуру, например, в аэролифтном реакторе или в реакторе с непрерывным перемешиванием, или иммобилизованную или инкапсулированную культуру клеток, например, в полых волокнах, микрокапсулах, на агарозных микрогранулах или керамических картриджах. При необходимости и/или желании растворы полипептидов можно очистить с помощью обычных хроматографических способов, например гель-фильтрации, ионообменной хроматографии, хроматографии на диэтиламиноэтил-целлюлозе (ОЕАБ-целлюлозе) или (иммуно-)аффинной хроматографии, например, после избирательного биосинтеза синтетического полипептида шарнирной области или перед либо после этапа хроматографии гидрофобного взаимодействия, описанных в данной заявке.

Гены, кодирующие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные согласно изобретению, можно также экспрессировать в клетках, не принадлежащих млекопитающим, таких как клетки бактерий или насекомых, или дрожжей, или растений. Бактерии, которые легко поглощают нуклеиновые кислоты, включают членов семейства энтеробактерий, таких как штаммы ЕксйепсЫа со11 или 8а1топе11а; ВасШасеае, таких как ВасШик киЫШк; Рпеитососсик; 81гер1ососсик и НаеторЫ1ик тПиепхае. Кроме того, должно быть очевидно, что при экспрессии в бактериях гетерологичные полипептиды обычно становятся частью внутриклеточных телец включений. Гетерологичные полипептиды должны быть выделены, очищены и затем собраны в функциональные молекулы. Когда нужны тетравалентные формы антител, субъединицы затем подлежат самосборке в тетравалентные антитела (Χ О 02/096948 А2).

В бактериальных системах число векторов экспрессии можно успешно выбирать в зависимости от применения, для которого предназначена экспрессируемая молекула антитела. Например, когда необходимо получить большое количество такого белка, для получения фармацевтических композиций с молекулой антитела могут быть желательны векторы, которые направляют экспрессию высоких уровней слитых белковых продуктов, которые легко поддаются очистке. Такие векторы включают, но не ограничены перечисленными, Е. со11 вектор экспрессии рИК278 (КиШег и др., ЕМВО б. 2:1791 (1983)), в котором последовательность, кодирующая антитело, может быть лигирована отдельно в вектор в одной рамке считывания с участком, кодирующим 1ас2, таким образом, что продуцируется слитый белок; μΙΝ векторы (1поиуе & 1поиуе, №.1с1ею Ас1бк Кек. 13:3101-3109 (1985); Уап Нееке & 8сйик1ег, б. Вю1. Сйет. 24:55035509 (1989)) и т.п. Векторы рСЕХ можно также применять для экспрессирования чужеродных полипептидов в виде слитых белков с глутатион-8-трансферазой (С8Т). Как правило, такие слитые белки являются растворимыми и их можно легко очистить из лизированных клеток путем адсорбции и связывания с матричными глутатион-агарозными гранулами с последующим элюированием в присутствии свободного глутатиона. Векторы рСЕХ разработаны таким образом, что они включают сайты расщепления протеазами тромбином или фактором Ха, так что клонированный целевой продукт гена можно высвободить из молекулы С8Т.

Кроме прокариотических, можно также использовать эукариотические микробы. 8ассйаготусек сегеуЩае, или обычные пекарские дрожжи, наиболее широко используются среди эукариотических микроорганизмов, хотя широко доступен и ряд других штаммов, например РюЫа ракЮпк.

Для экспрессии в 8ассйаготусек широко используется, например, плазмида Υ^7 (8бпсйсотЬ и др., №1иге 282:39 (1979); Ктдктап и др., Сепе 7:141 (1979); Тксйетрег и др., Сепе 10:157 (1980)). Эта плазмида уже содержит ген ТКР1, который обеспечивает селекционный маркер для мутантного штамма дрожжей, лишенного способности расти на триптофане, например, номер в АТСС 44076, или РЕР4-1 (бопек, Сепейск 85:12 (1977)). Наличие нарушения 1гр1, как характерная особенность генома дрожжевых клеток-хозяев, затем обеспечивает эффективное окружение для обнаружения трансформации по росту в отсутствии триптофана.

В системе насекомых вирус ядерного полиэдроза (Ас№У) Аи1одгарйа сайбогшса обычно применяют в качестве вектора для экспрессирования чужеродных генов. Вирус растет в клетках 8робор1ега бгид1регба. Последовательность, кодирующую антитело, можно клонировать отдельно в несущественные области вируса (например, ген полиэдрина) и поместить под контроль Ас№У промотора (например, полиэдринового промотора).

Как только молекула антитела согласно изобретению была рекомбинантно экспрессирована, ее можно очистить с помощью любого способа, известного в данной области для очистки молекулы иммуноглобулина, например с помощью хроматографии (например, ионообменной, аффинной, в частности, посредством аффинности белка А к определенному антигену и колоночной хроматографии с распреде

- 39 017611 лением по размерам), центрифугирования, дифференциальной растворимости или с помощью любой другой стандартной методики очистки белков. В качестве альтернативы предпочтительный способ повышения аффинности антител согласно изобретению описан в заявке И8 20020123057 А1.

VI. Слитые белки и конъюгаты.

Антитела согласно изобретению могут включать дополнительный домен, указанный домен связан посредством ковалентных или нековалентных связей. Связь может быть основана на генетическом слиянии согласно способам, известным в данной области и описанным выше, или может быть выполнена с помощью, например, химического перекрестного сшивания, как описано, например, в международной заявке \¥О 94/04686. Указанный дополнительный домен, присутствующий в слитом белке, включающем антитело согласно изобретению, может предпочтительно быть связан с помощью гибкого линкера, преимущественно полипептидного линкера, при этом указанный полипептидный линкер включает множество гидрофильных, связанных пептидными связями аминокислот и имеет длину, достаточную, чтобы обеспечить небольшое расстояние между С-концом указанного дополнительного домена и Ν-концом антитела согласно изобретению, или наоборот. Терапевтически или диагностически активный агент может быть соединен с антителом согласно изобретению или его антигенсвязывающим фрагментом с помощью различных средств. Такой агент включает, например, одноцепочечные слитые белки, включающие вариабельные области антитела согласно изобретению, соединенные ковалентными способами, такими как с помощью пептидных связей, с терапевтически или диагностически активным агентом. Дополнительные примеры включают молекулы, которые включают, по меньшей мере, антигенсвязывающий фрагмент, соединенный с дополнительными молекулами, ковалентно или нековалентно, включая такие, которые описаны в следующем неограничивающем иллюстративном перечне. Тгаипескег, Ιηΐ. 1. Сапсег 8игр. 8иЭР 7 (1992), 51-52 описывают биспецифичный реагент янусин (ίαηυδίη). в котором Ρν область, направленная на СЭ3, соединена с растворимым СЭ4 или с другими лигандами, такими как ОVСΑ и 1Ь-7. Аналогично, вариабельные области антитела согласно изобретению можно сконструировать в составе Ρν молекул и соединить с альтернативными лигандами, такими как показанные в цитируемой статье. Нщщпу 1. !пГес( Элеа^е 166 (1992), 198-202 описал гетероконъюгированное антитело, состоящее из ОКТ3, связанного перекрестными связями с антителом, направленным на специфичную последовательность в ν3 области СР120. Такие гетероконъюгированные антитела можно также сконструировать, используя, по меньшей мере, вариабельные области, содержащиеся в антителе согласно способам изобретения. Дополнительные примеры специфичных антител включают описанные в Рапдег, Сапсег Тгеа!. Ке8. 68 (1993), 181-194 и в Рап§ег, Си1. Кеу. 1ттипо1. 12 (1992), 101-124.

В дополнительном варианте реализации изобретения указанная связывающая молекула, антитело, цепь иммуноглобулина или его связывающий фрагмент, или антиген помечены детектируемой меткой. Вводящие метку агенты могут быть связаны либо непосредственно, либо опосредованно с антителами или антигенами согласно изобретению. Одним примером ненаправленного связывания является применение спейсерной молекулы.

Следовательно, биологическая активность связывающих молекул, например антител, определенных в данной заявке, позволяет предположить, что они имеют достаточную аффинность, чтобы считать их потенциальными кандидатами для направленной доставки лекарственных препаратов к клеткам, экспрессирующим подходящие поверхностные структуры на пораженной болезнью клетке и ткани соответственно. Это нацеливание и связывание с клетками может быть полезно для доставки терапевтически или диагностически активных агентов и генной терапии/ доставки гена. Молекулы/частицы с антителом согласно изобретению будут специфично связываться с клетками/тканями, экспрессирующими измененную форму патологического белка, и, следовательно, могут иметь диагностическое и терапевтическое применение. Таким образом, связывающая молекула, например антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению, может быть меченой (например, флуоресцентно, радиоактивно, ферментативно меченой, меченой для ядерно-магнитных методов, меченной тяжелым металлом) и применяться для обнаружения определенных мишеней ш νίνο или ш νίίτο, включая исследования ш νίίτο, подобные иммунохимическим исследованиям. 1п νίνο их можно применять способом, подобным методикам визуализации в радиационной медицине, для обнаружения тканей, клеток или другого материала, экспрессирующего указанный неоэпитоп. Таким образом, в дополнительном варианте реализации изобретение относится к применению связывающей молекулы или антитела согласно изобретению или его связывающего фрагмента для получения композиции для ш νίνο детектирования или нацеливания терапевтического и/или диагностического агента на белок, связанный с расстройством в мозге, обнаружения, подавления образования или уменьшения патологических белковых агрегатов или конформаций у субъекта, для улучшения познавательной способности или замедления или обращения спада познавательных способностей, связанного с заболеваниями, или для экстракорпоральной экстракции патологических соединений или их предшественников из биологических жидкостей.

В некоторых вариантах реализации полипептид антитела включает последовательность аминокислот или одну или более молекул, обычно не связанных с антителом. Типичные модификации описаны более подробно ниже. Например, одноцепочечный фрагмент антитела Ρν согласно изобретению может включать последовательность гибкого линкера или может быть модифицирован, чтобы добавить функ

- 40 017611 циональную молекулу (например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), лекарственный препарат, токсин или метку).

Полипептид антитела согласно изобретению может включать, по существу состоять или состоять из слитого белка. Слитые белки представляют собой химерные молекулы, которые включают, например, антигенсвязывающий домен иммуноглобулина по меньшей мере с одним сайтом связывания мишени и по меньшей мере одной гетерологичной частью, т. е. частью, с которой он обычно не связан в природе. Указанные последовательности аминокислот могут присутствовать в нормальных условиях в отдельных белках, которые соединены в слитом полипептиде, или они могут присутствовать в нормальных условиях в том же белке, но помещены в новое положение в слитом полипептиде. Слитые белки можно получить, например, путем химического синтеза или путем создания и трансляции полинуклеотида, в котором участки пептидов кодируются в нужной взаимозависимости.

Термин гетерологичный, применительно к полинуклеотиду или полипептиду, обозначает, что полинуклеотид или полипептид получен из молекулы, отличной от остальной части молекулы, с которой его сравнивают. Например, в данной заявке термин гетерологичный полипептид, который нужно слить с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или аналогом, получают из полипептида, отличного от иммуноглобулина, из того же вида, или из иммуноглобулина или полипептида, отличного от иммуноглобулина, из отличного вида.

Как более подробно было описано в других частях данной заявки, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные согласно изобретению могут быть дополнительно рекомбинантно слиты с гетерологичным полипептидом по Ν- или С-концу или химически конъюгированы (включая ковалентное и нековалентное соединение) с полипептидами или другими соединениями. Например, антитела могут быть рекомбинантно слиты или конъюгированы с молекулами, применимыми в качестве меток в анализах с детектированием, и эффекторными молекулами, такими как гетерологичные полипептиды, лекарственные препараты, радионуклиды или токсины, см., например, публикации РСТ УО 92/08495; УО 91/14438; УО 89/12624; патент США № 5314995 и ЕР 396387.

Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные согласно изобретению могут состоять из аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т. е. быть изостерами пептидов, и могут содержать аминокислоты, отличные от 20 кодируемых генами аминокислот. Антитела можно модифицировать с помощью природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, или с помощью методик химической модификации, которые хорошо известны в данной области. Такие модификации подробно описаны в основных текстах и более подробных монографиях, а также в многотомной научно-исследовательской литературе. Модификации могут встречаться в любом месте в молекуле антитела, включая пептидный остов, боковые цепи аминокислот и амино- или карбоксильные концы, или на молекулах, таких как углеводы. Должно быть очевидно, что один и тот же тип модификации может присутствовать в той же или различных степенях в различных сайтах в данном антителе. Также, данное антитело может содержать множество типов модификаций. Антитела могут быть разветвленными, например, в результате убиквитинилирования, и они могут быть циклическими, с разветвлениями или без. Циклические, разветвленные и разветвленные циклические антитела могут образовываться в результате посттрансляционных природных процессов или могут быть получены синтетическими способами. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение молекулы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, перекрестное сшивание, циклизацию, образование дисульфидных связей, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование СР1-якорей, гидроксилирование, иодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатирование, добавление аминокислоты к белкам, опосредованное транспортной РНК, такое как аргинилирование и убиквитинилирование (см., например, РгсИетк - 8!гис!иге Апб Μο1еси1а^ Ргорегйек, Т.Е. СгегдйЮп, У.Н. Ргеетап апб ^трапу, №\ν Υογ1< 2-е изд. (1993); Рοкΐΐ^аπк1аΐ^οπа1 Сονа1еπΐ Μοб^ίϊсаΐ^οπ Οί Рго!етк, В.С. ^οНπкοπ. ред., Асабетю Ргекк, №\ν ΥογΚ с. 1-12 (1983); 8е1йег и др., Ме111 Еηζутο1 182:626-646 (1990); Яайап и др., Апп ΝΥ Асаб 8с1 663:48-62 (1992)).

Изобретение также предусматривает слитые белки, включающие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, и гетерологичный полипептид. В одном варианте реализации слитый белок согласно изобретению включает, состоит по существу или состоит из полипептида, имеющего последовательность аминокислот любой одной или более УН областей антитела согласно изобретению или последовательность аминокислот любой одной или более УЪ областей антитела согласно изобретению, или его фрагментов или вариантов, и гетерологичной полипептидной последовательности. В другом варианте реализации слитый белок для диагностического и лечебного применения в способах, описанных в данной заявке, включает, состоит по существу или состоит из полипептида, имеющего последовательность аминокислот любого одного, двух, трех УН-СЭР антитела, или его фраг

- 41 017611 ментов, вариантов или производных, или имеющего последовательность аминокислот любого одного, двух, трех УЪ-СЛК антитела, его фрагментов, вариантов или производных, и гетерологичной полипептидной последовательности. В одном варианте реализации слитый белок включает полипептид, имеющий последовательность аминокислот УН-СЛК3 антитела согласно изобретению, или его фрагмент, производное или вариант, и гетерологичную полипептидную последовательность, при этом слитый белок специфично связывается по меньшей мере с одним неоэпитопом белка, связанного с расстройством. В другом варианте реализации слитый белок включает полипептид, имеющий последовательность аминокислот по меньшей мере одной УН области антитела согласно изобретению и последовательность аминокислот по меньшей мере одной УЪ области антитела согласно изобретению, или его фрагменты, производные или варианты, и гетерологичную полипептидную последовательность. Предпочтительно УН и УЪ области слитого белка соответствуют одному исходному антителу (или зсЕт или ЕаЬ фрагменту), которое специфично связывает по меньшей мере один неоэпитоп белка, связанного с расстройством. В другом варианте реализации слитый белок для диагностического и лечебного применения в способах, описанных в данной заявке, включает полипептид, имеющий последовательность аминокислот любого одного, двух, трех или более УН СЛК антитела и последовательность аминокислот любого одного, двух, трех или более УЪСЛК антитела, или его фрагменты или варианты, и гетерологичную полипептидную последовательность. Предпочтительно два, три, четыре, пять, шесть или более УН-СЛК или УЪ-СЛК соответствуют одному исходному антителу (или зсЕт или ЕаЬ фрагменту) согласно изобретению. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие эти слитые белки, также входят в объем изобретения.

Типичные слитые белки, о которых сообщается в литературе, включают слияние с Т-клеточным рецептором (Сазсо1дпе и др., Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А 84:2936-2940 (1987)); СЛ4 (Сароп и др., №11иге 337:525-531 (1989); Тгаипескег и др., №1иге 339:68-70 (1989); /еИтехк и др., С\А Се11 Вю1. И8А 9:347353 (1990) и Вут и др., №11иге 344:667-670 (1990)); Ъ-селектин (хоминг-рецептор) (ХУайоп и др., I. Се11. Вю1. 110:2221-2229 (1990) и \\айоп и др., №Ше 349:164-167(1991)); СЛ44 (АгиЕГо и др., Се11 61:13031313(1990)); СЛ28 и В7 (Ътз1еу и др., I. Ехр. Меб. 173:721-730 (1991)); СТЪА-4 (Ъ1з1еу и др., I. Ехр. Меб. 174:561-569 (1991)); СЛ22 (81атепкот1с и др., Се11 66:1133-1144 (1991)); рецептор фактора некроза опухоли (ФНО) (Азккепах, и др., Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 88:10535-10539 (1991); Ъезз1аиег и др., Еиг. I. 1ттипо1. 27:2883-2886 (1991) и Рерре1 и др., I. Ехр. Меб. 174:1483-1489 (1991)); и субъединица рецептора 1дЕ (К1бд^ау и Согтап, I. Се11. Вю1. т. 115, реферат № 1448 (1991)).

Как было описано в других частях данной заявки, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные согласно изобретению можно слить с гетерологичными полипептидами для увеличения времени полужизни полипептидов ш νί\Ό или для применения в иммуноанализах, применяя способы, известные в данной области. Например, в одном варианте реализации ПЭГ можно конъюгировать с антителами согласно изобретению для увеличения их времени полужизни ш тйо; Ъеопд, 8.К., и др., СуФкте 16:106 (2001); Абν. ш Лгид Ле1й. Кет. 54:531 (2002) или \еп и др., Вюскет. 8ос. Тгапзасйопз 30:512 (2002).

Более того, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные согласно изобретению можно слить с маркерными последовательностями, такими как пептид для облегчения очистки или детектирования. В предпочтительных вариантах реализации маркерная последовательность аминокислот представляет собой гексагистидиновый пептид, такой как метка, предусмотренная в рОЕ векторе (О1АСЕ№ 1пс., 9259 ЕЮп Атепие, Чатсворт, Калифорния, 91311), наряду с прочими, многие из которых доступны для приобретения. Как описано у Сеп1х и др., Ргос. №И. Асаб. 8ск И8А 86:821-824 (1989), например, гексагистидин обеспечивает удобную очистку слитого белка. Другие пептидные метки, пригодные для очистки, включают, но не ограничены перечисленными, НА метку, которая соответствует эпитопу, полученному из гемагглютининового белка вируса гриппа (\11зоп и др., Се11 37:767 (1984)), и Над метку.

Слитые белки можно получить, применяя способы, которые хорошо известны в данной области (см., например, патенты США №№ 5116964 и 5225538). Точное место, в котором осуществляют слияние, можно выбрать опытным путем, чтобы оптимизировать характеристики секреции или связывания слитого белка. ДНК, кодирующей слитый белок, затем трансфецировали клетку-хозяина для последующей экспрессии.

Антитела согласно изобретению можно применять в неконъюгированной форме или можно конъюгировать по меньшей мере с одной из множества молекул, например, чтобы улучшить терапевтические свойства молекулы, чтобы облегчить определение мишени или для визуализации, или терапии пациента. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные согласно изобретению можно пометить или конъюгировать либо до, либо после очистки, когда очистка уже выполнена.

В частности, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные согласно изобретению можно конъюгировать с терапевтическими агентами, пролекарствами, пептидами, белками, ферментами, вирусами, липидами, модификаторами биологического отклика, фармацевтическими агентами или ПЭГ.

Конъюгаты, которые представляют собой иммунотоксины, включая обычные антитела, были широко описаны в данной области. Токсины можно соединить с антителами с помощью обычных методик

- 42 017611 соединения или иммунотоксины, содержащие части белкового токсина, можно получить в виде слитых белков. Антитела согласно изобретению можно применять соответствующим образом для получения таких иммунотоксинов. Типичные такие иммунотоксины описаны у Вусгв, Зстшагв Сс11. Βίο1. 2 (1991), 59-70 и у Рапдсг, [ιηιηιιπο1. Тобау 12 (1991), 51-54.

Вышеописанный слитый белок может дополнительно включать отщепляемый линкер или сайт расщепления для протеазы. Эти спейсерные молекулы, в свою очередь, могут быть либо нерастворимыми, либо растворимыми (Отепсг и др., 8с1спсс 231 (1986), 148), и их можно выбрать, чтобы позволить высвобождение лекарственного препарата от антигена в целевом сайте. Примерами терапевтических агентов, которые можно соединить с антителами и антигенами согласно изобретению, для иммунотерапии являются лекарственные препараты, радиоактивные изотопы, лектины и токсины. Лекарственные препараты, которые можно конъюгировать с антителами и антигенами согласно изобретению, включают соединения, которые классически называют лекарственными препаратами, такие как митомицин С, даунорубицин и винбластин. Для применения антител или антигенов согласно изобретению, конъюгированных с радиоактивными изотопами, например, для иммунотерапии, некоторые изотопы могут быть более предпочтительными, чем другие, в зависимости от таких факторов, как распределение в лейкоцитах, а также стабильность и излучение. В зависимости от аутоиммунного ответа некоторые излучатели могут быть более предпочтительными, чем другие. Как правило, радиоактивные изотопы, излучающие а- и βчастицы, являются предпочтительными для иммунотерапии. Предпочтительными являются аизлучатели с малой дальностью и высокой энергией, такие как ²¹²Βί. Примеры радиоактивных изотопов, которые можно связать с антителами или антигенами согласно изобретению, для терапевтических целей

¹⁸⁸Вс. Другие терапевтический агенты, которые можно соединить со связывающей молекулой, например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом согласно изобретению, а также сх νίνο и т νίνο терапевтические протоколы известны или могут быть легко установлены рядовыми специалистами в данной области. Всегда, когда это уместно, специалист в данной области может применять полинуклеотид согласно изобретению, кодирующий любые из вышеописанных антител, антигенов или соответствующих векторов вместо самого белкового материала.

Специалисту в данной области будет понятно, что конъюгаты можно также соединить, применяя множество методик, в зависимости от выбранного агента, с которым нужно конъюгировать. Например, конъюгаты с биотином получают, например, путем осуществления реакции связывающего полипептида с активированным эфиром биотина, таким как Ν-гидроксисукцинимидовый эфир биотина. Аналогично, конъюгаты с флуоресцентным маркером можно получить в присутствии связывающего агента, например агентов, перечисленных в данной заявке, или с помощью реакции с изотиоцианатом, предпочтительно с изотиоцианатом флуоресцеина. Конъюгаты антител или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных согласно изобретению получают аналогичным способом.

В объем изобретения дополнительно входят антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные согласно изобретению, конъюгированные с диагностическим или терапевтическим агентом. Указанные антитела можно применять диагностически, например, для отслеживания развития или прогрессирования неврологического заболевания в рамках клинической процедуры тестирования, например, чтобы определить эффективность данного лечения и/или профилактическую схему лечения. Детектирование можно облегчить с помощью соединения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного с детектируемым веществом. Примеры детектируемых веществ включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, радиоактивные материалы, позитронно-активные металлы, с применением различных позитронно-эмиссионных томографий, и нерадиоактивные ионы парамагнитных металлов, см., например, патент США № 4741900 для обзора ионов металлов, которые можно конъюгировать с антителами для применения в качестве диагностических средств согласно изобретению. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазухрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов, содержащих простетические группы, включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, данзилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает люминол; примеры биолюминесцентных материалов включают люциферазу, люциферин и экворин и примеры подходящих радиоактивных материалов включают ¹²⁵Ι, ¹³¹Ι, '[п или ⁹⁹Тс.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное также можно пометить детектируемой меткой путем соединения с хемилюминесцентным соединением. Присутствие хемилюминесцентно-меченного антитела затем определяют по обнаружению люминесценции, которая возникает в ходе химической реакции. Примерами особенно полезных хемилюминесцентных метящих соединений являются люминол, изолюминол, тероматический (ШсготаБс) сложный эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и эфир щавелевой кислоты.

Одним из способов, которыми антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или про

- 43 017611 изводное можно пометить детектируемой меткой. является его соединение с ферментом и использование связанного продукта в ферментативном иммуноанализе (Е! А) (Уо11ег. А.. ТЬе Еηζуте Ьшкеб ΓттинохорЬеШ Аккау (ЕЫ8А) М1сгоЫо1од1са1 Аккос1йек Оиайебу РиЫюйюп. Уолкерсвиль. Мэриленд. Э|адпокйс Ноп/опк 2:1-7 (1978)); Уо11ег и др.. 1. С1ш. Рабю1. 31:507-520 (1978); Вийег. 1.Е.. МеШ. Еηζутο1. 73:482-523 (1981); Маддю. Е. (ред.). Еηζуте Γттиηοаккау. СЯС Ргекк. Бока-Ратон. Флорида (1980); Шика\га. Е. и др. (ред.). Еηζуте Γттиηοаккау. Кдаки 8Ьош. Токио (1981). Фермент. который связан с антителом. будет реагировать с подходящим субстратом. предпочтительно хромогенным субстратом. таким образом. чтобы образовалась химическая молекула. которую можно обнаружить. например. с помощью спектрофотометрических. флюориметрических или визуальных средств. Ферменты. которые можно применять. чтобы детектируемо пометить антитело. включают. но не ограничены перечисленными. малатдегидрогеназу. стафилококковую нуклеазу. дельта-5-стероидную изомеразу. алкогольдегидрогеназу дрожжей. альфа-глицерофосфат. дегидрогеназу. триозофосфатизомеразу. пероксидазу хрена. щелочную фосфатазу. аспарагиназу. глюкозооксидазу. бета-галактозидазу. рибонуклеазу. уреазу. каталазу. глюкозо6-фосфат-дегидрогеназу. глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу. Кроме того. детектирование можно осуществить с помощью колориметрических способов. в которых используется хромогенный субстрат для фермента. Детектирование можно также осуществить путем визуального сравнения степени ферментативной реакции субстрата по сравнению с аналогично обработанными стандартами.

Детектирование можно также осуществить. применяя любой из множества других иммуноанализов. Например. с помощью радиоактивного мечения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. варианта или производного. можно обнаружить антитело посредством радиоиммуноанализа (К1А) (см.. например. Vе^ηί^аиЪ. В.. Ргтс1р1ек о£ Яаб^ο^ттиηοаккаук. 8еνеηίЬ Тгаштд Соигке оп КабюНдаиб Аккау ТесЬтдиек. ТЬе Епйосппе 8ос1е1у (март. 1986)). которая включена в данную заявку посредством ссылки). Радиоактивный изотоп можно обнаружить с помощью средств. включающих. но не ограниченных перечисленными. гамма-счетчик. сцинтилляционный счетчик или авторадиографию.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. вариант или производное можно также пометить детектируемой меткой. применяя испускающие флуоресценцию металлы. такие как 152Еи. или другие из ряда лантаноидов. Эти металлы можно присоединить к антителу. применяя такие металлохелатирующие группы. как диэтилентриаминпентауксусная кислота (ЭТРА) или этилендиаминтетрауксусная кислота (ЕБТА).

Методики для присоединения различных молекул к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту. варианту или производному. хорошо известны. см.. например. Агпоп и др.. Мопос1опэ1 Ай1Ьоб1ек Еог Γттиηοίа^деί^ηд Οί Эгидк Γη Саг1сег ТЬегару. в Мопос1опи1 Ай1Ьоб1ек Ап6 Саг1сег ТЬегару. Яе1к£е1б и др. (ред.). с. 243-56 (Акт Я. Ыкк. Шс. (1985); Не11к1гот и др.. Ай|Ьоб1ек Еог Эгид Пе1Яегу. в Сойго11еб Огид Оекуегу (2-е изд.). ЯоЫпкоп и др. (ред.). Магсе1 Эеккег. Шс.. с. 623-53 (1987); ТЬогре. АибЬобу Сагпегк Οί Су1о1о\1с Адейк Γη Сажег ТЬегару: А Кеу1е\у. в Мопос1опи1 Ай1Ьоб1ек '84: Вю1одюа1 Ап6 Сйшса1 Арр11са1юг1к. РтсЬега и др. (ред.). с. 475-506 (1985); Аг1а1ук1к. ЯекиЙк. Ап6 Еи1иге Ргокресбуе Οί ТЬе ТЬегареийс Ике Οί Яабю1аЬе1еб Ай1Ьобу Γη Сажег ТЬегару. в Мопос1опи1 Ай1Ьоб1ек Еог Сажег ^еίесί^οη Ап6 ТЬегару. Ви16^1п и др. (ред.). Асабетю Ргекк. с. 303-16 (1985). и ТЬогре и др.. ТЬе Ршрящ^й Ап6 СуЮохю Ргорегйек Οί Ай1Ьобу-Тохт Γттиηο1. Яеν. 62:119-58 (1982).

В некоторых вариантах реализации можно конъюгировать молекулу. которая повышает стабильность или эффективность связывающей молекулы. например связывающего полипептида. например антитела или его иммуноспецифичного фрагмента. Например. в одном варианте реализации ПЭГ можно конъюгировать со связывающими молекулами согласно изобретению. чтобы увеличить их время полужизни ίη υπό; Ьео^. 8.Я.. и др.. СуФкше 16:106 (2001); Абν. ίη Эгид Эеку. Яеν. 54:531 (2002) или Vе^^ и др.. ВюсЬет. 8ос. Тгзпкнсйопк 30:512 (2002).

УП. Композиции и способы применения.

Более того. изобретение относится к композициям. включающим ранее упомянутую связывающую молекулу. например антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению или его химические производные. или полинуклеотид. вектор или клетку согласно изобретению. Композиция согласно изобретению может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель. Термин химическое производное описывает молекулу. которая содержит дополнительные химические молекулы. которые обычно не являются частью основной молекулы. Такие молекулы могут улучшать растворимость. время полужизни. абсорбцию и т. д. основной молекулы. В качестве альтернативы указанные молекулы могут снижать нежелательные побочные эффекты основной молекулы или снижать токсичность основной молекулы. Более того. фармацевтическая композиция согласно изобретению может включать дополнительные агенты. такие как интерлейкины или интерфероны. в зависимости от предполагаемого использования указанной фармацевтической композиции. Например. для применения для лечения болезни Альцгеймера дополнительный агент может быть выбран из группы. состоящей из малых органических молекул. анти-бета-амилоидных антител и их комбинаций. Следовательно. в особенно предпочтительном варианте реализации изобретение относится к применению связывающей молекулы. например антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению. или связывающей молекулы. имеющей. по существу. такие же специфичности связывания. как у любой из перечисленных.

- 44 017611 полинуклеотида, вектора или клетки согласно изобретению для получения фармацевтической или диагностической композиции для лечения или предотвращения прогрессирования болезни Альцгеймера; для снижения выраженности симптомов, связанных с болезнью Альцгеймера; для диагностирования или проверки субъекта на присутствие болезни Альцгеймера или для определения риска развития у субъекта болезни Альцгеймера. Указанная фармацевтическая композиция может быть разработана таким образом, чтобы ее можно было вводить внутривенно, внутримышечно, подкожно, интраперитонеально, интраназально, парентерально или в виде аэрозоля; см. также ниже.

Следовательно, в одном варианте реализации изобретение относится к способу лечения неврологического расстройства, характеризуемого аномальным накоплением и/или отложением белка в центральной нервной системе, указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества любых из описанных ранее связывающих молекул, антител, антигенов, полинуклеотидов, векторов или клеток согласно изобретению. Термин неврологическое расстройство включает, но не ограничивается перечисленными, болезнь Альцгеймера, умеренное когнитивное нарушение, лобно-височную деменцию, болезнь телец Леви, болезнь Паркинсона, болезнь Пика, болезнь Бинсвангера; конгофильную амилоидную ангиопатию, церебральную амилоидную ангиопатию, синдром Дауна, мультиинфарктную деменцию, болезнь Хантингтона, болезнь Крейцфельда-Якоба, комплекс СПИД-деменцию, депрессивный синдром, тревожное расстройство, фобию, паралич Белла, эпилепсию, энцефалит, множественный склероз; нейромышечные расстройства, нейроонкологические расстройства, опухоли мозга, нейроваскулярные расстройства, включая инсульт, нейроиммунологические расстройства, нейроотологическое заболевание, травму нервной системы, включая повреждение спинного мозга, боль, включая невропатическую боль, педиатрические неврологические и психоневрологические расстройства, расстройства сна, синдром Туретта, умеренное когнитивное нарушение, сосудистую деменцию, мультиинфарктную деменцию, кистозный фиброз, болезнь Гоше, другие нарушения движений и заболевания центральной нервной системы (ЦНС) в целом. Если не указано иначе, термины нейродегенеративный, неврологический или психоневрологический используются взаимозаменяемо в данной заявке.

Согласно изобретению описан способ характеристики антител человека для большого числа заболеваний, а также способ последующего получения указанных антител для того, чтобы использовать их в диагностических, терапевтических или превентивных целях у таких пациентов, чья иммунная система не реагирует соответствующим иммунным ответом на развитие патологии заболевания. В частности, это должно ожидаться при заболеваниях, наступающих в преклонном возрасте, потому что, как известно, с возрастом реактивность иммунной системы постоянно и значительно снижается. В этих случаях, терапевтически или превентивно активные антитела могут компенсировать связанные с возрастом ограничения иммунной системы в отношении блокирования накопления эндогенных патофизиологических вариантов белков и могут, таким образом, способствовать лучшему состоянию здоровья в преклонном возрасте. Таким образом, медицинские применения согласно изобретению являются особенно пригодными для вышеописанной группы пациентов, например, в возрасте 60, 65, 70, 75, 80 или старше, и в принципе касаются всех заболеваний, проявляющихся в форме нарушения любого вида, как, например, эндопротеолиз, изменения конформации, изменения посттрансляционных модификаций, соматические мутации или их комбинации, фенотипически посредством развития патофизиологических вариантов эндогенных белков. Согласно изобретению патофизиологические варианты рассматриваются как варианты, содержащие патологические неоэпитопы, которые отклоняются от нормальной физиологии, см. выше.

В частности, терапевтические применения включают опухолевые заболевания, воспалительные заболевания и заболевания центральной нервной системы, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Пика, деменция с тельцами Леви, прионные заболевания, включая болезнь Крейцфельда-Якоба, прогрессирующий супрануклеарный паралич, множественная системная атрофия, кортикобазальная дегенерация, лобно-височная дегенерация с паркинсонизмом, связанная с хромосомой 17, болезнь Хантингтона, лобно-височная деменция, церебральная амилоидная ангиопатия, умеренное когнитивное нарушение, синдром Дауна, наследственное внутримозговое кровоизлияние с амилоидозом голландского типа и исландского типа, спинально-церебеллярная атаксия и боковой амиотрофический склероз, а также глаукома, миозит с включенными тельцами, семейная амилоидная полиневропатия и амилоидоз, включающие фибриллярные белки, происходящие по меньшей мере из одного из следующих белков-предшественников: 8АА (сывороточный амилоидный белок А), АЬ (к- или 1-легкие цепи иммуноглобулинов), АН (д1 1д-тяжелые цепи иммуноглобулинов), АТТВ (транстиретин, сывороточный преальбумин), ААро-А-1 (аполипопротеин А1), ААроА2 (аполипопротеин А2), АСе1 (гельсолин), АСуе (цистатин С), АЕув (лизоцим), АР1Ь (фибриноген), бета-амилоид (белок-предшественник амилоида), бета-амилоид 2М (бета-2-микроглобулин), АргР (прионный белок), Аса1 (прокальцитонин), А1АРР (островковый амилоидный полипептид), АРго (пролактин), А1пе (инсулин); АМеб (лактадгерин); Акег (кератоэпителин); АЬас (лактоферрин), АЬп (АЬпРР), АЭап (АЭапРР) или ААИР (атриальный натрийуретический пептид), (8коггопеку и др., Аппи. Веν. Ра11ю1. Меск. Όίβ. 2006; 1:151-70; ВихЬаит, Сигг Орш Вкеита!о1., 2003; 16: 67-75.

Особенным преимуществом терапевтического подхода согласно изобретению является тот факт,

- 45 017611 что антитела, полученные из В-клеток или В-клеток памяти из здорового доклинического или клинически необычно стабильного организма, способны, с некоторой вероятностью, предотвратить клинически выраженное заболевание, или уменьшить риск возникновения клинически выраженного заболевания, или отложить момент возникновения клинически выраженного заболевания. Обычно такие антитела также уже успешно прошли через соматическое созревание, т. е. оптимизацию в отношении избирательности и эффективности высокоаффинного связывания с целевой молекулой, посредством соматической вариации вариабельных областей антитела.

Понимание того, что такие клетки ίη νίνΌ, например, в человеке не активируются родственными или другими физиологическими белками или клеточными структурами в смысле аутоиммунологической или аллергической реакции, также имеет огромное медицинское значение, поскольку это указывает на значительно более высокий шанс успешно пройти фазы клинических испытаний. Так сказать, эффективность, приемлемость и переносимость уже были продемонстрированы перед доклинической разработкой профилактического или терапевтического антитела по меньшей мере для одного человека. Таким образом, можно ожидать, что, благодаря процедуре согласно изобретению, как эффективность антитела, специфичного по отношению к целевой структуре, в качестве терапевтического агента и пониженная вероятность побочных эффектов значительно повышает клиническую вероятность успеха указанного антитела.

Из упомянутого выше очевидно, что в объем изобретения входит любое применение специфичной к заболеванию связывающей молекулы, включающей по меньшей мере один СЭЯ из описанного выше антитела, в частности, для диагностирования и/или лечения расстройства, родственного с болезнью Альцгеймера, и бета-амилоидное отложение соответственно. Предпочтительно указанная связывающая молекула представляет собой антитело согласно изобретению или его цепь иммуноглобулина. Вдобавок, изобретение относится к антиидиотипическим антителам любых из упомянутых антител, описанных ранее в данной заявке. Они представляют собой антитела или другие связывающие молекулы, которые связываются с уникальной антигенной пептидной последовательностью, расположенной на вариабельной области антитела, рядом с сайтом связывания антигена.

В другом варианте реализации изобретение относится к диагностической композиции, включающей любые из описанных выше связывающих молекул, антител, антигенсвязывающих фрагментов, полинуклеотидов, векторов или клеток согласно изобретению и возможно подходящие средства для детектирования, такие как реактивы, обычно применяемые в иммунологических или основанных на нуклеиновых кислотах диагностических способах. Антитела согласно изобретению, например, пригодны для применения в иммуноанализах, в которых они могут использоваться в жидкой фазе или будучи связанными с твердофазным носителем. Примерами иммуноанализов, в которых может использоваться антитело согласно изобретению, являются конкурентные и неконкурентные иммунотесты либо в направленном, либо в ненаправленном формате. Примерами таких иммунотестов являются радиоиммуноанализ (Я1А), сэндвич-анализ (иммунометрический тест), проточная цитометрия и вестерн-блот анализ. Антигены и антитела согласно изобретению могут быть связаны с множеством различных носителей и могут применяться для выделения клеток, специфично связанных с ними. Примеры хорошо известных носителей включают стекло, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, декстран, нейлон, амилозы, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, агарозы и магнетит. Природа носителя, используемого в данном изобретении, может быть либо растворимой, либо нерастворимой. Существует множество различных меток и способов мечения, известных рядовым специалистам в данной области. Примеры различных типов меток, которые можно применять в настоящем изобретении, включают ферменты, радиоактивные изотопы, коллоидные металлы, флуоресцентные соединения, хемилюминесцентные соединения и биолюминесцентные соединения; см. также варианты реализации, описанные выше в данной заявке.

В качестве дополнительного варианта реализации связывающие молекулы, особенно антитела согласно изобретению, можно также применять в способе диагностики расстройства у индивидуума путем получения образца биологической жидкости из исследуемого индивидуума, образец может представлять собой образец крови, образец лимфы или любой другой образец биологической жидкости, и приведения во взаимодействие образца биологической жидкости с антителом согласно изобретению при условиях, позволяющих образование комплексов антитело-антиген. Уровень таких комплексов затем определяют способами, известными в данной области, если уровень значительно больше, чем таковой, образованный в контрольном образце, это указывает на наличие заболевания у исследуемого индивидуума. Аналогичным образом, можно также применять специфичный антиген, связанный антителами согласно изобретению. Таким образом, изобретение относится к ίη νίΙΐΌ иммунотесту, включающему связывающую молекулу, например антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению.

В этом контексте изобретение также относится к средствам, в частности, разработанным для этих целей. Например, можно применять матрицу, основанную на белке или антителе, которая, например, нагружается либо антигенами, полученными из упомянутого белка, связанного с расстройством и содержащего неоэпитоп, для того, чтобы обнаружить аутоантитела, которые могут присутствовать у пациентов, страдающих, например, от неврологического расстройства, в частности от болезни Альцгеймера,

- 46 017611 либо антителами или эквивалентными антигенсвязывающими молекулами согласно изобретению, которые специфично узнают любой из этих белков. Например, анализ профиля аутоантител с помощью антигенного микрочипа при ревматоидном артрите был описан у НиеЬег и др., Лг111гШ5 Рйеит. 52 (2005), 2645-2655. Разработка иммунотестов на микрочипах описана у Ки5пехо\\· и др., Мо1. Се11 Рго!еот1с§ 5 (2006), 1681-1696. Соответственно изобретение также относится к микрочипам, нагруженным связывающими молекулами или антигенами, идентифицированными в соответствии с настоящим изобретением.

Изобретение также обеспечивает фармацевтический и диагностический соответственно пакет или набор, включающий один или более контейнеров, наполненных одним или более описанных выше ингредиентов, например связывающей молекулой, антителом или его связывающим фрагментом, антигеном, полинуклеотидом, вектором или клеткой согласно изобретению. К такому контейнеру(ам) может прилагаться уведомление в форме, установленной правительственным органом, контролирующим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, это уведомление отражает одобрение указанным органом производства, применения или продажу для введения человеку. В качестве дополнения или альтернативы указанный набор включает реактивы и/или инструкции для применения в подходящих диагностических тестах. Композиция, например набор согласно изобретению, конечно, является особенно подходящей для диагностики, предотвращения и лечения расстройства, которое сопровождается присутствием белка, связанного с расстройством, определенным выше, особенно амилоидозом, и, в частности, пригодной для лечения болезни Альцгеймера (БА).

Термины лечение, лечить и т.п. в данной заявке, как правило, означают получение желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Указанный эффект может быть профилактическим в контексте полного или частичного предотвращения заболевания или его симптома и/или может быть терапевтическим в контексте частичного или полного излечения от заболевания и/или нежелательного действия, относящегося к заболеванию. Термин лечение в данной заявке охватывает любое лечение заболевания у млекопитающего, в особенности у человека, и включает: (а) предотвращение возникновения заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к указанному заболеванию, но который еще не был диагностирован, как имеющий это заболевание; (Ь) ингибирование заболевания, например подавление его развития; или (с) облегчение заболевания, например, приводящее к ослаблению симптомов заболевания.

Более того, термин субъект или пациент относится к млекопитающему, предпочтительно человеку, нуждающемуся в лечении от патологического состояния, расстройства или заболевания.

Фармацевтические композиции согласно изобретению могут входить в состав лекарственной формы согласно способам, хорошо известным в данной области; см., например, РештЦоп: Т11е §аепсе апб Ргасбсе о£ Рйагтасу (2000) от Университета наук в Филадельфии, Ι8ΕΝ 0-683-306472. Примеры подходящих фармацевтических носителей хорошо известны в данной области и включают фосфатно-солевые буферные растворы, воду, эмульсии, такие как эмульсии масло в воде, различные типы смачивающих агентов, стерильные растворы и т. д. Композиции, включающие такие носители, могут быть включены в состав лекарственной формы с помощью обычных хорошо известных способов. Эти фармацевтические композиции можно вводить субъекту в подходящей дозе. Введение подходящих композиций можно осуществить различными путями, например внутривенным, интраперитонеальным, подкожным, внутримышечным, топическим или внутрикожным введением. Аэрозольные лекарственные формы, такие как формы назального спрея, включают очищенные водные или другие растворы активного агента с консервирующими средствами и изотоническими агентами. Такие лекарственные формы предпочтительно доводят до уровня рН и изотонического состояния, совместимого с назальными мембранами слизистой оболочки. Лекарственные формы для ректального или вагинального введения могут быть в виде суппозитория с подходящим носителем.

Более того, несмотря на то что изобретение включает ныне стандартную (хотя, к счастью, не частую) процедуру просверливания небольшой дырки в черепе для введения лекарственного препарата согласно изобретению, в предпочтительном аспекте связывающая молекула, особенно антитело или основанный на антителе лекарственный препарат согласно изобретению, может пересекать гематоэнцефалический барьер, что позволяет внутривенное или пероральное введение.

Схему приема будет определять лечащий врач и клинические факторы. Что хорошо известно в областях медицины, дозировки для любого пациента зависят от множества факторов, включая размер пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное соединение, которое нужно вводить, пол, время и путь введения, общее состояние здоровья и другие лекарственные препараты, которые вводят одновременно. Обычная доза может лежать, например, в диапазоне от 0.001 до 1000 мкг (или нуклеиновой кислоты для экспрессии или для ингибирования экспрессии в этом диапазоне); тем не менее, дозы ниже или выше этого обычного диапазона также предусмотрены, особенно учитывая ранее упомянутые факторы. Как правило, дозировка может варьироваться, например, от приблизительно 0.0001 до 100 мг/кг и чаще от 0,01 до 5 мг/кг (например, 0,02, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2 мг/кг и т.д.) веса тела хозяина. Например, дозировки могут составлять 1 или 10 мг/кг веса тела или лежать в диапазоне 1-10 мг/кг, предпочтительно по меньшей мере 1 мг/кг. Промежуточные дозы в указанных выше диапазонах также предполагаются

- 47 017611 входящими в объем изобретения. Субъектам можно вводить такие дозы ежедневно, через день, еженедельно или согласно любому другому расписанию, определенному эмпирическим путем. Типичное лечение включает введение множества дозировок в течение длительного периода, например, составляющего по меньшей мере шесть месяцев. Дополнительные типичные схемы лечения включают введение раз в две недели, или раз в месяц, или раз в каждые 3-6 месяцев. Типичные расписания введения дозировки включают 1-10 или 15 мг/кг каждый день, 30 мг/кг через день или 60 мг/кг еженедельно. В некоторых способах два или более моноклональных антител с различными специфичностями связывания вводят одновременно, в этом случае дозировка каждого из вводимых антител находится в пределах указанных диапазонов. За прогрессом можно наблюдать с помощью периодической оценки. Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или безводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами безводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая солевой раствор и забуференные среды. Среды для парентерального введения включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, раствор Рингера с лактатом или нелетучие масла. Среды для внутривенного введения включают жидкие и питательные добавки, добавки электролитов (такие как основанные на декстрозе Рингера) и т. п. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные препараты, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы и т.п. Более того, фармацевтическая композиция согласно изобретению может включать дополнительные агенты, такие как дофамин или психофармакологические лекарственные препараты, в зависимости от предполагаемого использования указанной фармацевтической композиции. Более того, фармацевтическая композиция может также входить в состав лекарственной формы в виде вакцины, например, если фармацевтическая композиция согласно изобретению включает анти-АЗ антитело для пассивной иммунизации.

Кроме того, может оказаться желаемым совместное введение или последовательное введение других агентов. Терапевтически эффективная доза или количество относится к такому количеству активного ингредиента, достаточному для снижения выраженности симптомов или патологического состояния. Терапевтическую эффективность и токсичность таких соединений можно определить с помощью стандартных фармацевтических процедур в культурах клеток или на экспериментальных животных, например ЕЭ₅₀ (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции) и ЬП₅₀ (доза, летальная для 50% популяции). Соотношение доз между терапевтическим и токсичным действиями представляет собой терапевтический индекс, и его можно выразить в виде отношения БО₅₀/ЕО₅₀. Предпочтительно терапевтический агент в указанной композиции присутствует в количестве, достаточном для восстановления нормального поведения и/или когнитивных свойств в случае болезни Альцгеймера.

Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением можно предпочтительно применять для лечения неврологических расстройств, включая, но не ограничиваясь перечисленными: болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Пика, деменцию с тельцами Леви, прионные заболевания, включая болезнь Крейцфельда-Якоба, прогрессирующий супрануклеарный паралич, множественную системную атрофию, кортикобазальную дегенерацию, лобно-височную дегенерацию с паркинсонизмом, связанным с хромосомой 17, болезнь Хантингтона, лобно-височную деменцию, церебральную амилоидную ангиопатию, умеренное когнитивное нарушение, синдром Дауна, наследственное внутримозговое кровоизлияние с амилоидозом голландского типа и исландского типа, спинальноцеребеллярную атаксию, боковой амиотрофический склероз, паралич Белла, эпилепсию, энцефалит, нейромышечные расстройства, глаукому, миозит с включенными тельцами, семейную амилоидную полиневропатию, амилоидоз, включающие фибриллярные белки, происходящие по меньшей мере из одного из следующих белков-предшественников: 8АА (сывороточный амилоидный белок А), АЬ (к- или 1легкие цепи иммуноглобулинов), АН (д1 1д-тяжелые цепи иммуноглобулинов), АТТР (транстиретин, сывороточный преальбумин), ААро-А-1 (аполипопротеин А1), ААроА2 (аполипопротеин А2), А6е1 (гельсолин), АСуз (цистатин С), АЬуз (лизоцим), АЕ1Ь (фибриноген), бета-амилоид (белокпредшественник амилоида), бета-амилоид 2М (бета-2-микроглобулин), АргР (прионный белок), Аса1 (прокальцитонин), А1АРР (островковый амилоидный полипептид); АРго (пролактин), А1пз(инсулин); АМеб (лактадгерин); Акег (кератоэпителин); АЬас (лактоферрин), АЬп (АЬпРР), АЭап (АЭапРР) или АА№ (атриальный натрийуретический пептид), (8кον^οηзку и др., Аппи. Реν. Ра11ю1. Месй. Э|з. 2006; 1:151-70; ВихЬаит, Сигг Орт РйеитаГо1 2003; 16: 67-75; нейроонкологию, нейроиммунологию, нейроотологическую боль, педиатрическую нейрологию, фобию, аффективные расстройства, расстройства сна, синдром Туретта, другие нарушения движений и заболевания центральной нервной системы (ЦНС) в целом.

Эти и другие варианты реализации описаны и охвачены описанием и примерами изобретения. Дополнительную литературу, касающуюся любого из материалов, способов, применений и соединений, которые нужно использовать в соответствии с настоящим изобретением, можно получить из публичных библиотек и баз данных, применяя, например, электронные приборы. Например, можно использовать общедоступную базу данных Меб1ше, которая размещается в Национальном центре биотехнологиче

- 48 017611 ской информации и/или в Национальной библиотеке медицины на сайте Национальных институтов здравоохранения. Дополнительные базы данных и тесЬ-адреса, такие как у Европейского института биинформатики (ΕΒΙ), который является частью Европейской лаборатории молекулярной биологии (ΕΜΒΩ), известны специалисту в данной области и их также можно найти, применяя поисковые службы Интернет. Обзор патентной информации по биотехнологии и обзор важных источников патентной информации, полезных для ретроспективного поиска и для текущей осведомленности, дан у Β^Κδ, ТЕТЕСН 12 (1994), 352-364.

Приведенное выше описание в общих чертах описывает изобретение. Если не указано иначе, термину в данной заявке дается определение, приведенное в Оксфордском словаре по биохимии и молекулярной биологии, Охйэгб Ьшхсгвйу Ргсвв, 1997, проверенном в 2000 г. и переизданном в 2003 г., ΙδΒΝ 0198506732. Несколько документальных источников цитировано в тексте настоящего описания. Полный список библиографических ссылок можно найти в конце настоящего описания, непосредственно перед формулой изобретения. Содержания всех цитированных ссылок (включая ссылки на литературу, изданные патенты, опубликованные заявки на патент, которые цитируются на всем протяжении настоящей заявки, и описания, инструкции от производителей и т.д.) настоящим явно включены посредством ссылки; тем не менее, нет допущения, что любой цитированный документ действительно представляет собой уровень техники в отношении изобретения.

Более полное понимание можно получить с помощью рассмотрения следующих конкретных примеров, которые приведены в данной заявке исключительно с целью иллюстрирования и не предполагаются ограничивающими объем изобретения.

Примеры

Следующие примеры дополнительно поясняют изобретение, но не должны толковаться как ограничивающие любым образом объем изобретения. Подробные описания обычных способов, таких как используемые в данной заявке, можно найти в цитируемой литературе; см. также Т1с Мсгск Мапиа1 οί Пхадшвхв апб Тйсгару, семнадцатое изд., ред. Β^Γβ и Β^1<ο\ν (Мсгск & Οο., Шс. 2003).

При осуществлении изобретения будут использоваться, если не указано иначе, обычные методики клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, которые находятся в рамках компетентности в данной области. Для дополнительного совершенствования основных методик, полезных при осуществлении изобретения, практикующий врач может обратиться к стандартным руководствам и обзорам по клеточной биологии и культуре тканей; см. также ссылки, цитированные в примерах. Основные способы в молекулярной и клеточной биохимии можно найти в таких стандартных руководствах, как Μο1^ι.ι13γ Скп1пд: А Ьа^гайгу Μапиа1, 3-е изд. (8атЬ^οοк и др., ΚιγΙογ ^аЬο^аΐο^у Ргсвв 2001); 81юг1 Рюк^к ш Μο1сси1аг Β^ο1οду, 4-с изд. (АивиЬс1 и др. ред., к11п Уйсу & δοιίδ 1999); ΩΝΛ Скшпд, тома Ι и ΙΙ (Скхсг ред., 1985); Ο1^дοпис1сοΐ^бс 8уп1йс515 (Сай ред., 1984); Шскк Ас1б НуЬпб17а1юп (Натсв и Шддтв ред. 1984); Тгап5спр1юп Апб Тгапв1а1кп (Наике и Шддшв ред. 1984); СиЙигс Οί Ашта1 Сс11в (Ргсвйпсу и А1ап, Ь155, Шс., 1987); Сспс Тгапвкг Усскгв ίοΓ Μатта1^ап Сс11в (Μί11^ и Саке, ред.); Сиггсп! Рюк^к т Μο1сси1аг Βίο1ο§ν и 81юг1 Рюк^к т ΜοΒα-ΐΕ-π Βίο1ο^, 3-с изд. (АивиЬс1 и др., ред.); и Ебйкп (Уи, ред., Асабстк Ргсвв); Сспс ТгапвРгг Усскгв Εογ Μатта1^ап Сс1к (Μί11^ и Саке, ред., 1987, СоН 8рппд Наг^г Ьа^гайгу); [Нс^юбв Ш Εпζутο1οду, т. 154 и 155 (Уи и др., ред.); IттοЬ^1^ζсб Сс11в Апб Εпζутс5 (ШЬ Ргсвв, 1986); РсгЬа1, А Ргасйса1 Сшбс Το Μο1сси1а^ Скшпд (1984); монография, Μ^1ο65 1'1 Εпζутο1οду (Асабстк Ргсвв, Пчс., Ν.Υ.); Iттипοсйстка1 [Нс^юбв Б1 Сс11 Апб Μο1сси1а^ Βίο1ομν (Уаусг и Уа1ксг, ред., Асабстк Ргсвв, Лондон, 1987); НапбЬοοк Οί ЕхрсптспЫ Iттипο1οду, т. НУ (Усй и ΒΙ-κΙ^νΟΙ ред., 1986); Рго1ст Μ^1ιο65 (Βο113β и др., к11п Уйсу & δοιίδ 1996); №п-уйз1 Усскгв йэг Сспс Тйсгару (Уадпсг и др. ред., Асабстк Ргсвв 1999); У1га1 Усскгв (Карйй & Ρο^νν ред., Асабстк Ргсвв 1995); Iттипο1οду [Нс^юбв Μапиа1 (Ω^ονίΐβ ред., Асабстк Ргсвв 1997) и Сс11 апб Т15вис СиЙигс: ^аЬο^аΐο^у Ргоссбигсв т Βίο1^1ιι·ιο1οβν (^οу1с & Спйййв, кБп Уйсу & δοιίδ 1998). Реактивы, векторы для клонирования и наборы для генетического манипулирования, на которые ссылается настоящее описание, доступны от коммерческих поставщиков, таких как Β^οВаб, 81га1адспс, ^ктод^, 81дта-А1бгкй и СкпТссН. Основные методики культивирования клеток и сбора сред изложены в Ьагдс 8са1с 1^1111111311311 Сс11 СиЙигс (Ни и др., Сигг. Орш. Βίο1^1Ηΐο1. 8 (1997), 148); Зсгит-Бсс Μсб^а (Кйаю, Β^οΐссйпο1οду 17 (1991), 73); Ьагдс 8са1с Μιιтайап Сс11 СиЙигс (Сигг. Орш. Βίο1^1ιΐ'ΐο1. 2 (1991), 375); и Зиврспвкп СиЙигс οί Μзттз1^зп Сс1к (Βίΐΐΐι и др., Β^οргοсс88 ТсскюР 19 (1990), 251); Ехйасйпд πίοι··^^·! Ггош с^NА аггаув, Нсгхс1 и др., СНАО8 11 (2001), 98-107.

Следующие эксперименты проиллюстрированы и описаны в отношении антитела ΝΙ-101.11. Тем не менее, другие антитела серии ΝΙ 101, в частности ΝΙ 101.10, имеют похожую структуру и, таким образом, можно ожидать, что они обеспечат сравнимые результаты.

Дополнительные способы.

Дисплей Β-клеток памяти.

Клинически тщательно отобранных людей, у которых наблюдалось необычно положительное клиническое течение болезни, например отсутствие клинических признаков заболевания в присутствии факторов риска, или стабильное течение с умеренными или продромальными признаками без развития забо

- 49 017611 левания, или пациентов с длительным отсутствием прогрессирования заболевания привлекали для отбора лимфоцитов периферической крови как начального материала для выделения В-клеток памяти. Стратегия основывается на общем представлении, установленном в инфекционной иммунологии, состоящем в том, что пул В-клеток памяти субъекта сохраняет специфичности антител и, возможно, также встречаемость антител, образованных во время предыдущего столкновения с антигеном (МсНеухег-УПКатк и АНтеб Сигг. Орт. 1ттипо1. 11 (1999), 172-179; Ветаксош и др., 8с1епсе 298 (2002), 2199-202; Тгадд1а1 и др., №а. Меб. 10 (2004), 871-875). Это представление было разработано, чтобы объяснить приобретенный иммунитет против инфекционных агентов, а также для описания иммунитета, обусловленного антителами, после первичной инфекции. Согласно этой теории полный комплект антител против всех антигенов, которые когда-либо индуцировали образование антител в истории болезни субъекта либо естественным путем, либо при вакцинации, должны быть полностью представлены в пуле В-клеток памяти. В соответствии с настоящим изобретением эта теория применяется к эндогенным антигенам, образовавшимся в результате аномальной агрегации или конформации в противном случае физиологически значимого белка, и которые, сами по себе, не являются предметом физиологической иммунологической толерантности и таким образом могут приобрести антигенные свойства и вызвать иммунный ответ против конформационных нео-эпитопов (неоэпитопов).

В-клетки памяти выделяют с помощью маркеров поверхности, включая общий маркер В-клеток СЭ22, совместно с отрицательной селекцией не встречавшихся с антигеном В-клеток, которые экспрессируют 1дМ, 1дЭ, 1дЕ и 1дА. С помощью этой методики можно получить приблизительно от 10.000 до 150.000 В-клеток памяти из 30 мл крови человека. Полученные клетки иммортализуют, например, вирусом Эпштейн-Барр и культивируют олигоклонально на облученных питающих подслоях фибробластов человека (2иЬ1ег и др., 1. Iттиπο1. 134 (1985), 3662-3668; Тгадд1а1 и др., №Н. Меб. 10 (2004), 871-875). Чтобы улучшить эффективность трансформации и иммортализации секретирующих антитела В-клеток памяти, можно применять СрС 2006, который имитирует активности бактериальных неметилированных Срб-динуклеотидов (Найтапп и Кпед, 1. Iттиπο1. 164(2) (2000), 944-953).

Протокол эксперимента.

Селекцию В-клеток из массы лимфоцитов периферической крови выполняли, применяя технологию иммунномагнитной сортировки клеток (МАС8) и СП22-микрогранулы (МШепук Бергиш-Гладбах, Германия). Лимфоциты периферической крови метили для МАС8-анализа атителами к СЭ22 человека, фикоэритрин-конъюгированными атителами к 1дЭ человека и АРС-конъюгированными антителами к 1дМ, 1дА, СЭ3, СЭ8, СЭ56 человека (Вес!оп Эккткоп, Базель, Швейцария). СЭ22-положительные клетки выделяли, применяя колонки Ь8 и прибор М1б1 МАС8 (МШепу1) с последующей селекцией фикоэритрин- и АРС-отрицательных клеток с использованием клеточного сортера ΜοΡ1ο (Нако, Форт-Коллинз, США). СП22-положительные, 1дМ-, 1дЭ-, 1дА- и 1дЕ-отрицательные В-клетки затем инкубировали с супернатантом, содержащим вирус Эпштейн-Барр, полученным от клеток В95-8, и СрС 2006 (81дта, Бухс, Швейцария) при концентрации, равной 2,5 мг/л, в среде для В-клеток (ЯРМ1 1640, дополненной 10% фетальной телячей сыворотки (Нус1опе, РегЬю, Лаузанне, Швейцария). 5-50 клеток на лунку высевали в 96луночные планшеты Сок!аг со скругленным дном (Согшпд, Уйайк, Баар, Швейцария) в среду для Вклеток на 30.000 облученных лимфоцитов периферической крови человека, полученных из добровольных доноров. Культуры В-клеток памяти поддерживали при 37°С и 5% СО₂ во влажном инкубаторе для культур клеток в течение 2-4 недель, после чего кондиционированную культурами среду анализировали методом ЕЫ8А и на тканевых чипах.

Скрининг антител.

Антитела в кондиционированных средах подвергали скринингу на связывание с патологическими эпитопами, включая белковые агрегаты и аномальные, патологически значимые структуры на срезах ткани, полученных из пациентов-людей с патологически подтвержденными диагнозами, включая, но не ограничиваясь ею, болезнь Альцгеймера, или полученных из срезов тканей из трансгенных моделей заболеваний человека на мышах, или из срезов тканей, полученных из моделей заболеваний человека на животных, включая пожилых не принадлежащих человеку приматов, или с помощью анализа методом ЕЫ8А агрегированных синтетических пептидных препаратов. Аномальные, патологические структуры в смысле изобретения включают, но не ограничены перечисленными, β-амилоидные бляшки, нейрофибриллярные клубки, агрегаты альфа-синуклеина в тельцах Леви, и белковые агрегаты, отложенные в дистрофичных нейритах. Ткани человека также используют, чтобы исключить способность антител вступать в перекрестные реакции с нормальными клеточными или надклеточными тканевыми структурами. Отобранные антитела дополнительно анализируют для определения класса и подкласса легкой цепи. Отобранные патологически значимые информационные молекулы антител из культур В-клеток памяти транскрибировали, применяя ОТ-ПЦР, клонировали и вставляли в векторы экспрессии для рекомбинантного получения.

Протокол эксперимента.

Скрининг кондиционированной В-клетками среды с применением тканевых микрочипов, подходящих для микротитровальных планшетов.

- 50 017611

Получение матрицы.

Залитые в парафин ткани мозга человека с болезнью Альцгеймера, взятые после его смерти, нарезали на палочки диаметром 1-2 мм и длиной 10 мм. Четыре палочки заливали вертикально в парафин, чтобы получить квадрат, подходящий для микротитровального формата 9x9 мм. Препарат нарезали на 5мкм кусочки ткани с помощью микротома и два кусочка приклеивали рядом друг с другом на предметные стекла, что давало набор из 2 рядов по 4 палочки, которые подходили к 96-луночному микротитровальному формату. В качестве альтернативы для получения тканевых чипов применяли ткани из мышей, трансгенных по АРР.

Скрининг В-клеток.

Кондиционированную среду из культур В-клеток памяти переносили на пластинки с матрицей тканей, применяя многоканальную пипетку, и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. После этапа промывки связывание антител человека со срезами тканей анализировали, применяя Су 3конъюгированные вторичные антитела к 1дС человека (^аск8οη Ιιηιηιιιιο Ке8еагсй Епгоре Ь!6., Саффолк, Великобритания). Анализ флуоресценции проводили на инвертированном флуоресцентном микроскопе (Бека, Хеербругг, Швейцария).

ЕБ18А.

96-луночный микропланшеты с лунками вдвое меньшего объема (Соттд) покрывали синтетическим бета-амилоидным пептидом в стандартной концентрации, равной 1 мкг/мл в буфере для сенсибилизации поверхностей (15 мМ №₂СО₃, 35 мМ NаΗСОз, рН 9,42) в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали и блокировали неспецифичные сайты связывания в течение 1 ч при комнатной температуре в ФБР, содержащем 2% БСА (81дта, Бухс, Швейцария). Кондиционированную В-клетками среду переносили из планшетов с культурой В-клеток памяти на планшеты ЕБ18Л и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Связывание антител человека определяли, применяя конъюгированные с пероксидазой хрена (НКР) поликлональные антитела осла против 1дС человека (басктап Ιιηιηιιπο КекеагсБ Еигоре Ь!6., Кембриджшир, Великобритания) с последующим измерением активности НКР в стандартном колориметрическом тесте.

Молекулярное клонирование антител, проявляющих интересующую специфичность.

Живые В-клетки из отобранных культур В-клеток памяти собирали, применяя клеточный сортер. Получали мРНК и получали последовательности тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина, применяя 1дкаркас-специфичные праймеры для всех семейств каркаса 1 (РК1) вариабельной тяжелой и легкой цепи человека в качестве 5'-праймеров, в комбинации с праймерами, специфичными ко всем 1-Н сегментам человека, в качестве 3'-праймеров (Магк8 и др., Μο1. Вю1. 222 (1991), 581-597). В качестве альтернативы ОТ-ПЦР отдельной клетки из отсортированных клеток из культуры В-клеток памяти можно применять в качестве источника последовательностей тяжелой и легкой цепи 1д (ВаЬсοοк и др., Ргос. №!1. Аса6. 8ск И8А 93 (1996), 7843-7848; Вгехпъсйек и др., 1. Iттиηο1. 155 (1995), 190-202; СЬютеИа и др., МШета Ас168 Кезеагсй 28 (2000); О\уеп8 и др., 1. Iттиηο1. 171 (2003), 2725-2733). Сортировка на отдельные клетки позволяет сохранить правильное спаривание тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов клонов антитела, изначально полученных в культуре В-клеток.

Идентификацию клона антитела с желаемой специфичностью выполняли с помощью повторного скрининга на тканевом микрочипе, совместимом с микротитровальным форматом, и ЕБ18А после рекомбинантной экспрессии целых антител. Рекомбинантная экспрессия целых 1дС1 антител достигается в результате вставки вариабельных последовательностей тяжелой и легкой цепи в правильной рамке считывания в векторы экспрессии, которые соединяют последовательность вариабельной области с последовательностью, кодирующей сигнальный пептид, по 5'-концу и с последовательностью, кодирующей подходящий константный домен(ы) по 3'-концу. Для этого указанные праймеры содержали сайты рестрикции, разработанные, чтобы облегчить клонирование вариабельных последовательностей тяжелой и легкой цепи в векторы экспрессии антител. Иммуноглобулин тяжелой цепи экспрессируют с помощью вставки продукта ОТ-ПЦР тяжелой цепи иммуноглобулина с сохранением рамки считывания в вектор экспрессии тяжелой цепи, несущий сигнальный пептид и константные домены иммуноглобулина человека. Каппа легкую цепь иммуноглобулина экспрессируют с помощью вставки ОТ-ПЦР-продукта каппа легкой цепи с сохранением рамки считывания в вектор экспрессии легкой цепи, обеспечивающий сигнальный пептид и константный домен 1 каппа легкой цепи иммуноглобулина человека. В качестве альтернативы лямбда легкую цепь иммуноглобулина экспрессируют с помощью вставки ОТ-ПЦР-продукта лямбда легкой цепи с сохранением рамки считывания в вектор экспрессии лямбда легкой цепи, обеспечивающий сигнальный пептид и константный домен 1 лямбда легкой цепи иммуноглобулина человека.

Функциональные рекомбинантные моноклональные антитела получали в результате одновременной трансфекции клеток НЕК 293 (или любой другой подходящей реципиентной линии клеток) вектором экспрессии тяжелой цепи иммуноглобулина и вектором экспрессии каппа или лямбда легкой цепи иммуноглобулина. Рекомбинантное моноклональное антитело человека затем очищали от кондиционированной среды, применяя стандартный способ очистки на колонке с белком А. Рекомбинантное моноклональное антитело человека можно получить в неограниченных количествах, применяя либо временно,

- 51 017611 либо стабильно трансфецированные клетки. Линии клеток, продуцирующие рекомбинантное моноклональное антитело человека, можно создать либо путем применения 1д-векторов экспрессии непосредственно или с помощью повторного клонирования вариабельных областей 1д в различные векторы экспрессии. Производные, такие как Р(аЬ), Р(аЬ)₂ и ксБу. можно также получить из этих вариабельных областей 1д.

Протокол эксперимента.

ОТ-ПЦР всех В-клеток.

Живые клетки, жизнеспособность определяли по их свойствам прямого и бокового светорассеяния, из выбранных культур В-клеток памяти сортировали по аликвотам по 100-2000 клеток непосредственно в 0,2 мл пробирки для ПЦР, наполненные 20 мкл ЯЫА1а1ег (АтЫоп, Хантингдон, Великобритания), применяя клеточный сортер ΜοΡΙο. мРНК получали, применяя набор для выделения мРНК тИХА-Эйес! М1сго Κίΐ (Иупа1, Битйодеп. Базель, Швейцария). кДНК получали, применяя набор ЯТ £ог РСЯ (С1оп1ес11 Вес!опЭюкткоп, Базель, Швейцария), и ПЦР вариабельных последовательностей тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина (1д) выполняли, применяя набор АбуагИаде 2 РСЯ Κίΐ (С1оп!ес1), применяя специфичные праймеры для всех семейств каркасов 1 (РЯ1) вариабельной тяжелой и легкой цепи человека в качестве 5'-праймеров в комбинации с праймерами, специфичными к константным доменам тяжелых или каппа или лямбда легких цепей иммуноглобулинов человека, в качестве 3'-праймеров. Праймеры приобретались у МюгокупФ (Балгах, Швейцария).

Сигнальный пептид, который применяли во всех векторах экспрессии, был получен из последовательности Ь5 каппа легкой цепи семейства 1 иммуноглобулина человека (МПМЯУРЛрЬЬ6ЬЬЬЬ^БР68ЯС; 8Еф Ш N0: 2), как описано у У-Ваке, и разработан, чтобы обеспечить сайт рестрикции ХЬа 1 для того, чтобы облегчить клонирование амплифицированных с помощью ПЦР вариабельных областей (ЛТ66ЛСЛТ6С666Т6ССС6СССЛ6СТ6СТ66

6ССТ6СТ6СТ6СТ6Т66ТТСССС66СТСТЛ6ЛТ6С; 8ЕО 10 N0: 1). ХЬа1 вводили с помощью введения молчащих мутаций. Так как 3'-сайт рестрикции применяли для клонирования вариабельных областей тяжелой цепи, сайт рестрикции 8а1 1 вводили в С1 1д61, обеспеченный вектором. Аналогично, сайт рестрикции ВкАУ1 вводили в С1 каппа легкой цепи и Х1ю1 вводили в С1 лямбда легкой цепи. Рестрикционное расщепление продуктов ПЦР и лигирование в реципиентные векторы выполняли согласно стандартным процедурам. Плазмидную ДНК получали, применяя стандартные наборы (фшадеп, Хомбректикон, Швейцария). Реципиентные векторы содержали СМУ промотор для экспрессии генов антитела в клетках млекопитающих.

ОТ-ПЦР отдельной клетки.

Для ОТ-ПЦР отдельной клетки вариабельных областей тяжелой и легкой цепи 1д из культивированных В-клеток применяли модификацию способа, описанного у О^епк и др. (О^епк и др., 2003). Отдельные клетки помещали непосредственно в каждую пробирку массива 0.2 мл ПЦР-пробирок, применяя клеточный сортер МоР1о. Каждая пробирка содержала 10 мкл ЯТ-буфера для обратной транскриптазы 8ирегкспр1 II (Иитйодеп). ПЦР-пробирки резко замораживали на сухом льду и размораживали непосредственно перед ОТ-ПЦР. кДНК получали, применяя рассеянные гексамеры (С1оп!ес1) и обратную транскриптазу 8ирегксг1р1 II (Бтийодеп). Первый раунд ПЦР вариабельных областей тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина выполняли, применяя в качестве 5'-праймеров набор праймеров, которые гибридизировались со всеми сигнальными пептидами, консервативными среди всех семейств вариабельных областей ф В 3'-положении применялись отдельные праймеры, специфичные к константной области С1 тяжелой цепи ф или каппа- или лямбда легкой цепи ф Второй раунд ПЦР выполняли на ПЦР-продуктах, полученных в результате первого раунда ПЦР, применяя праймеры, описанные для ОТ-ПЦР всех Вклеток. Клонирование в реципиентные векторы выполняли соответственно.

Альтернативное клеточное клонирование.

Клонирование выполняли, применяя стандартный метод лимитирующих разведений или с помощью отделения отдельных клеток в 96-луночные планшеты для выращивания культуры, применяя клеточный сортер (МоР1о, Иако, Форт-Коллинз, США). Для лимитирующих разведений собирали клетки из культуры В-клеток памяти, пропускали их через нейлоновый фильтр с сеткой 30 мкм (Ра1соп, Вес!оп И1ск1пкоп, Базель, Швейцария), ресуспендировали в среде и высевали на 96-луночные планшеты или 384луночные планшеты при концентрации 0,3 клетки на лунку.

Для высевания с помощью клеточного сортера, прибор был настроен так, чтобы он помещал одну отдельную клетку (режим ктд1е 1) на лунку непосредственно в 96-луночные планшеты со средой для Вклеток. Культуральную среду дополняли средой, кондиционированной активированными Т-клетками. В качестве альтернативы в среду добавляли 30000 облученных питающих клеток.

Анализ секвенирования последовательностей вариабельных областей иммуноглобулинов.

Секвенирование клонированных последовательностей вариабельных областей иммуноглобулинов выполняли, применяя праймеры, специфичные к СМУ промотору, присутствующему с 5'-стороны от вставленных последовательностей вариабельных областей ф в векторе экспрессии. В качестве альтернативы применяли праймеры, которые гибридизировались с константными доменами тяжелых и легких цепей ф. Полученные последовательности анализировали и выравнивали, применяя программное обес

- 52 017611 печение УесЮг ΝΤΙ (1пГогтах-1пуЦгодеп). Плазмиды, содержащие последовательности, которые кодировали целые вариабельные области иммуноглобулинов, внутри рамки считывания с лидерным пептидом и константным доменом, применяли для экспрессии.

Экспрессия функциональных рекомбинантных моноклональных антител.

Антитела можно получить в достаточных количествах путем рекомбинантной экспрессии, применяя методики, известные в данной области (Тгб11 и др., Сигг. Орш. Вю1ес11по1. 6 (1995), 553-601). Рекомбинантное моноклональное антитело человека в количестве вплоть до 1 мг получали при временной трансфекции клеток НЕК 293. Рекомбинантное моноклональное антитело человека в количестве вплоть до 100 мг получали при стабильной трансдукции клеток НЕК 293 или клеток №О мыши, применяя рекомбинантные лентивирусные векторы.

Получение небольшого количества рекомбинантного антитела человека с помощью временной трансфекции.

Вектором, содержащим тяжелую цепь 1д, и векторами, содержащими легкие цепи 1д, одновременно трансфецировали клетки НЕК 293, применяя стандартный способ совместной кальций-фосфатной преципитации. Рекомбинантные антитела очищали от среды, кондиционированной трансфецированными клетками НЕК 293, применяя очистку на колонке с белком А (СЕ-НеаИБсаге, Отельфинген, Швейцария).

Крупномасштабное получение рекомбинантного антитела человека с помощью стабильной трансдукции.

Здесь основанная на лентивирусах система трансфекции применялась для получения стабильно трансдуцированной линии клеток, продуцирующей рекомбинантное антитело человека (2и£Гегеу и др., 1. У1го1. 72 (1998), 9873-9880). Клетки НЕК 293 одновременно трансдуцировали двумя отдельными лентивекторами, первый из которых нес экспрессионную кассету для тяжелой цепи 1д, другой нес кассету для легкой цепи 1д рекомбинантного антитела. Этот способ трансдукции можно применять в широком диапазоне линий клеток млекопитающих, таких как СНО и №О клетки.

Проверка в трансгенной модели заболевания человека на мышах.

Трансгенных мышей получали, как описано ранее (КпоЬ1осН и др., №игоЬю1. Адшд, 28 июля (2006)), на фоне гибрида С57В1/6 и ЭВА2. Тестируемую группу скрестили один раз возвратным скрещиванием с С57В1/6. Мышей держали в стандартных условиях с обращенным циклом света/темноты 12 ч:12 ч и им был обеспечен свободный доступ к пище и воде. В группы лечения распределяли по возрасту (24 месяца для первого тестирования, 26 месяцев для второго тестирования) и полу. Мышам вводили антитела (3 мг/кг веса тела) путем еженедельных интраперитонеальных инъекций в течение 2-месячного периода, то есть 8 инъекций на животное.

Поведенческое тестирование в У-образном лабиринте.

Скорость чередования поведения определяли, применяя У-образный пластиковый лабиринт с размерами плеч 40x20x10 см. В процессе 5-минутных процедур записывали последовательности вхождения в различные плечи лабиринта; чередование определяли как успешный вход в три плеча, при перекрывающихся триплетах вхождений в разные плечи. Процент чередований рассчитывали как отношение фактических к возможным чередованиям. После 2 месяцев введения антитела мышей снова тестировали в У-образном лабиринте. Люди, проводившие эксперимент, не знали вид лечения и генотипы в процессе всего слепого эксперимента.

Прохождение гематоэнцефалического барьера и связывание с аномальными структурами в мозге.

Чтобы определить, могут ли отобранные антитела или их фрагменты пересекать гематоэнцефалический барьер и связываться с аномально агрегированными или конформационно измененными белковыми мишенями в мозге, эффективную дозу указанного антитела вводили системно, интраперитонеально, внутривенно, внутримышечно, подкожно или интраназально трансгенному животному, у которого было обнаружено нефизиологическое накопление агрегированной или конформационно измененной белковой мишени в мозге. Связывание антитела со структурами в мозге, специфичными для патологии, затем оценивали с помощью иммуноокрашивания меченым вторичным антителом против 1д человека с последующим стандартным иммуногистохимическим детектированием.

Протокол эксперимента.

Р8-1/АРР§тее трансгенные модельные мыши для болезни Альцгеймера, получали две периферические инъекции по 150 мкг ΝΙ-101.11 на день 1 и день 3. Мышей умерщвляли через 24 ч после второй инъекции и перфузировали ФБР. Мозг замораживали и пластинки ткани получали из замороженной ткани, применяя замораживающий микротом. Присутствие антитела человека на криостатных срезах анализировали по окрашиванию Су3-меченным антителом против 1дС человека (1аск§оп 1ттипо Яекеагск Еигоре, Саффолк, Великобритания). Локализацию амилоидных бляшек определяли с помощью одновременного окрашивания криостатных срезов бета-амилоид-специфичным контрольным антителом мыши 6Е10 (доступно от Сονаηсе, номер в каталоге 8Ю-39320), а затем Е1ТС-меченым антителом против 1дС мыши. В качестве альтернативы окрашивание Су3-меченным антителом против 1дС человека применяли отдельно. Анализ флуоресценции проводили на инвертированном флуоресцентном микроскопе (Ьеюа).

Уменьшение патологии в мозге.

Эффекты лечения антителом, производимые на уровни агрегированных или конформационно изме

- 53 017611 ненных белковых мишеней в мозге, определяли с помощью системной терапии или направленной доставки в мозг антитела (внутричерепной, интратекальной или интравентрикулярной) и контрольного неродственного антитела трансгенным животным с характерным нефизиологическим накоплением агрегированной или конформационно измененной белковой мишени в мозге. Эффекты лечения оценивали с помощью иммуноокрашивания или гистохимического окрашивания измененных или агрегированных белковых мишеней и измерения области, покрытой такими агрегатами, размера агрегатов и количества агрегатов, и биохимического количественного анализа концентраций белковых мишеней в различных областях мозга.

Отсутствие связанных с лечением антителом побочных эффектов.

Связанные с потенциальной мишенью нежелательные эффекты при лечении антителом определяли с помощью системного введения или направленной доставки в мозг антитела (внутричерепной, интратекальной или интравентрикулярной) и контрольного неродственного антитела трансгенным животным с характерным нефизиологическим накоплением агрегированной или конформационно измененной белковой мишени в мозге. Потенциальные побочные эффекты оценивали с помощью иммуноокрашивания или гистохимического окрашивания (например, берлинской лазурью для выявления микрокровоизлияний, гематоксилин-эозином, активированными белыми кровяными клетками) и биохимического количественного анализа (например, определения уровней цитокинов с помощью ЕЫ8А).

Иммунофлуоресцентное окрашивание живых клеток.

Клетки НЕК 293 временно трансфецировали вектором, который экспрессирует АРР человека дикого типа, слитый по внутриклеточному С-концу с вариантом желтого флуоресцентного белка - Цитрином. Через 24 ч после трансфекции клетки инкубировали с рекомбинантными антителами человека или контрольными антителами при 4°С в течение 30 мин. После этапа промывки клетки фиксировали и обнаруживали связавшееся с поверхностью антитело, применяя Су-3-меченные вторичные антитела к 1дС человека или мыши (басккоп 1ттипо КекеагсН). Анализ флуоресценции осуществляли на конфокальном микроскопе (Ьека).

Получение бета-амилоидных фибрилл.

Бета-амилоидный пептид был приобретен у ВасНет (Бубендорф, Швейцария). Лиофилизированный пептид ресуспендировали в трифторуксусной кислоте (ТФА) и ресуспендировали в ФБР непосредственно перед применением в виде мономерного бета-амилоида в тестах. Бета-амилоидные фибриллы получали путем инкубации мономерного бета-амилоидного пептида 1-42 при концентрации, равной 100 мкг/мл в ФБР при 37°С в течение 24 ч. Мономерный бета-амилоидный пептид и препараты фибрилл также использовали в качестве субстрата для покрытия планшетов ЕЫ8А.

Вестерн-блоттинг.

Мономерный бета-амилоидный пептид смешивали с загрузочным красителем, денатурировали при нагревании, 0,2 мкг загружали на дорожку и разделяли на градиентном ПААГ-ДСН. Блоты инкубировали с первичным антителом в течение 2 ч. Связывание первичного моноклинального антитела человека или мыши с контрольным антителом 6Е10 выявляли, применяя вторичные антитела против антител человека или мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (НКР). Блоты проявляли, применяя высокочувствительный субстрат 8ирег81дпа1 Хек! Рет!о Мах1тит 8епкй1У1!у 8иЬк!га!е (Р1егсе, ПкНег 8с1еп!1йс, Волен, Швейцария).

Конкурентное связывание амилоидных бляшек ткани.

Рекомбинантное антитело человека ΝΙ-101.11 инкубировали в течение 2 ч с препаратами бетаамилоидного пептида. Антитело/бета-амилоидные препараты затем использовали для иммуногистохимического окрашивания среза мозга, полученного от пациента с нейропатологически подтвержденной болезнью Альцгеймера. Получали 5 мкм криосрезы, блокировали их 4% БСА, 5% козей сыворотки и 5% лошадиной сыворотки на ФБР в течение 1 ч при комнатной температуре и окрашивали ΝΙ-10141/бетаамилоидными препаратами в течение 1 ч при комнатной температуре. После этапа промывки связывание антител человека со срезами тканей анализировали, применяя Су3-конъюгированные вторичные антитела к 1дС человека (басккоп 1ттипо КекеагсН Еигоре Ь!б.). Анализ флуоресценции проводили на инвертированном флуоресцентном микроскопе (Ьека, Хеербругг, Швейцария).

Пример 1. Обнаружение антител человека против аномальных структур, преобладающих при заболеваниях мозга человека.

Антитела из фенотипически здоровых субъектов, или клинически необычно стабильных пациентов с болезнью Альцгеймера тестировали с помощью иммуногистохимии на срезах мозга, полученных от пациентов с патологически подтвержденной болезнью Альцгеймера. На изображении А фиг. 1 показано присутствие антител у клинически необычно стабильного пациента, которые связываются с бетаамилоидными бляшками, что было подтверждено одновременным окрашиванием известным антителом против бета-амилоида человека (антитело 4С8; изображение В фиг. 1). Присутствие у здорового человека антител к нейрофибриллярным клубкам в срезе ткани, полученном от пациента с болезнью Альцгеймера, представлено на изображении А фиг. 2. Этот результат был подтвержден одновременным окрашиванием известным антителом против тау-протеина человека (НТ7). На изображении А фиг. 3 показано

- 54 017611 присутствие у здорового человека антител против дистрофичных нейритов в срезе ткани, полученном от пациента с болезнью Альцгеймера. Контрольное окрашивание известным антителом против таупротеина человека (НТ7) показано на изображении В фиг. 3. Эти результаты показывают присутствие у фенотипически здоровых или клинически необычно стабильных пациентов антител против идентифицируемых патологических структур в образцах ткани человека с гистопатологически подтвержденным диагнозом.

Пример 2. Рекомбинантные антитела человека сохраняют специфичность к аномальной структуре ш νί\Ό и узнают конформационный эпитоп связанного с заболеванием бета-амилоидного белка в амилоидных бляшках в мозге, но не узнают его физиологический предшественник или непатогенное производное.

Антитела N1-101.11, N1-101.12, ΝΙ-101.13Λ и N1-101.136 получали от клинически необычно стабильных пациентов с болезнью Альцгеймера со значительно пониженной скоростью спада познавательных способностей. Выделение и рекомбинантное получение антитела осуществляли, как определено в дополнительных способах.

ΝΙ-101.11.

Рекомбинантное ΝΙ-101.11 тестировали на связывание с мозговыми бета-амилоидными бляшками (фиг. 4). Срезы мозга, полученные от пациента с нейропатологически подтвержденной болезнью Альцгеймера, окрашивали в указанных концентрациях. Связывание антител с бета-амилоидными бляшками в концентрациях, равных 50 пМ, позволяют предположить высокую аффинность связывания. Со связыванием антитела ΝΙ-101.11 с бета-амилоидными бляшками в концентрации, равной 0.5 нМ, не может конкурировать добавление избыточных количеств линейных синтетических полипептидов, полученных из Ν-концевого бета-амилоида, представляющего положения с 1 по 16 при концентрациях вплоть до 1 мкМ (фиг. 5). Более того, со связыванием ΝΙ-101.11 с бета-амилоидными бляшками на срезах мозга в 8 нМ концентрации конкурируют избыточные количества бета-амилоидных фибрилл 1-42 (4 мкМ), но не линейных синтетических бета-амилоидных мономеров 1-42 в концентрации 4 мкМ, это позволяет предположить, что ΝΙ-101.11 узнает конформационный эпитоп, который отсутствует в мономерном бетаамилоиде (фиг. 6).

Для дополнительной оценки связывания рекомбинантного антитела человека ΝΙ-101.11 с линейным, мономерным синтетическим бета-амилоидом препараты мономерного бета-амилоида разделяли на неденатурирующем ПААГ. Перенесенный на мембрану белок инкубировали с рекомбинантным антителом человека ΝΙ-101.11 и контрольным антителом против Ν-концевых линейных бета-амилоидных последовательностей (6Е10). Несмотря на то что 6Е10 вызывало значительное окрашивание мономерного бета-амилоидного пептида, не было обнаружено связывания с ΝΙ-101.11 человека, что позволяет предположить, что ΝΙ-101.11 не связывается с линейным мономерным бета-амилоидным пептидом, но узнает конформационный бета-амилоидный эпитоп (фиг. 7).

Связывание рекомбинантного ΝΙ-101.11 с искусственными амилоидными фибриллами, полученными из синтетических бета-амилоидных пептидов 1-42 и мономерного бета-амилоида, определяли с помощью ЕЫ8А (фиг. 8). Синтетические бета-амилоидные фибриллы или мономерный синтетический бета-амилоид, нанесенные на поверхность планшетов ЕЫ8А при равной плотности покрытия, инкубировали с ΝΙ-101.11 в указанных концентрациях. Связывание с искусственными амилоидными фибриллами (пустые квадраты) было более чем в 100 раз более высоким по сравнению со связыванием с мономерным бета-амилоидом (залитые квадраты). Контрольное антитело 22С4 против С-конца бета-амилоида предпочтительно связывается с мономерным бета-амилоидом (залитые круги) и в меньшей степени с фибриллами (пустые круги). Это позволяет предположить, что ΝΙ-101-10 узнает конформационный эпитоп, который также присутствует на искусственных амилоидных фибриллах, полученных из синтетических бета-амилоидных пептидов.

Способность вступать в перекрестные реакции рекомбинантного антитела человека ΝΙ-101.11 с клеточным полноразмерным АРР или с любой из его физиологических производных определяли с помощью клеточных тестов на связывание (фиг. 9).

Живые клетки НЕК 293, стабильно экспрессирующие АРР человека, слитый с цитрином в качестве маркера, инкубировали в течение 30 мин при 4°С, чтобы предотвратить интернализацию, с рекомбинантным антителом человека ΝΙ-101.11 или контрольным антителом 6Е10 против Ν-концевой линейной бета-амилоидной последовательности. Цитрин-положительные сигналы указывают на АРРэкспрессирующие клетки. В противоположность контрольному антителу (6Е10), которое связывается с АРР на клеточной поверхности во всех клетках, экспрессирующих слитую конструкцию, не было обнаружено связывание рекомбинантного антитела человека ΝΙ-101.11 с полноразмерным АРР. Эти результаты показывают отсутствие перекрестной реакции ΝΙ-101.11 с физиологическим клеточным АРР.

Отсутствие связывания ΝΙ-101.11 с мономерным бета-амилоидом дополнительно показали с помощью гель-хроматографии: не наблюдалось связывания ΝΙ-101.11 или неродственного контрольного антитела с мономерным МТС-меченым бета-амилоидом 1-42 (графики А и В фиг. 10). В противоположность, антитело 22С4, направленное против линейного эпитопа, присутствующего в С-конце бетаамилоида, элюировалось совместно с МТС-бета-амилоидными мономерами 1-42 (график С фиг. 10).

- 55 017611

В конкурентном ЕЫ8А связывание 6Е10, антитела, направленного против линейного эпитопа на N конце бета-амилоида, может быть полностью блокировано предварительной инкубацией с избыточными концентрациями мономерных пептидов 1-16 бета-амилоида, 1-28 бета-амилоида и 1-40 бета-амилоида. В противоположность, предварительная инкубация с избыточными концентрациями линейных бетаамилоидных пептидов не нарушала связывание N1-101.11, позволяя предположить, что для связывания N1-101.11 необходим конформационный эпитоп (фиг. 11).

№-101.13А и 13В.

Рекомбинантные антитела человека М-101.13А и 13В тестировали на связывание со срезами мозга, полученными от АРР трансгенной модели болезни Альцгеймера на мышах (Тд 2576). М-101.13А и N1101.13В вызывали значительное окрашивание бета-амилоидных бляшек при 10 нМ концентрации (фиг. 12). Связывание рекомбинантного М-101.13А и М-101.13В с искусственными амилоидными фибриллами, полученными из синтетических бета-амилоидных пептидов 1-42, и мономерным бета-амилоидом определяли с помощью ЕЫ8А. Синтетические бета-амилоидные фибриллы или мономерный синтетический бета-амилоид, нанесенные на поверхность планшетов ЕЫ8А при равной плотности покрытия, инкубировали с М-101.13А и М-101.13В в указанных концентрациях. Предпочтительное связывание с искусственными амилоидными фибриллами по сравнению с мономерным бета-амилоидом наблюдали для обоих тестируемых антител (фиг. 13).

N1-101.12.

Связывание рекомбинантного N1-101.12 с синтетическим бета-амилоидным пептидом 1-42 подтверждали с помощью ЕЫ8А (диаграмма А фиг. 14). Со связыванием N1-101.12 при 133 нМ концентрации конкурировал избыток бета-амилоидного пептида 1-42 (диаграмма В фиг. 14).

Пример 3. Рекомбинантное антитело человека против мозгового бета-амилоида пересекает гематоэнцефалический барьер в трансгенной модели болезни Альцгеймера на мышах и связывается с мозговыми бета-амилоидными бляшками ш т1то.

Чтобы определить, пересекает ли рекомбинантное антитело человека N1-101.11 гематоэнцефалический барьер и связывается ли с мозговыми бета-амилоидными бляшками ш т1то, трансгенные Р81/АРРз\уе модели болезни Альцгеймера на мышах получали две периферические инъекции по 150 мкг N1-101.11 на день 1 и день 3. Мышей умерщвляли через 24 ч после второй инъекции и перфузировали ФБР. Мозг собирали и срезы мозга окрашивали НТС-мечеными антителами против 1дС человека или мышиным моноклональным антителом к бета-амилоиду 6Е10, а затем ЕГГС-меченым антителом против 1дС мыши, чтобы подтвердить присутствие мозговых бета-амилоидных бляшек. Интенсивное окрашивание амилоидных бляшек антителом к ГдС человека указывало на то, что рекомбинантное антитело человека N1-101.11 может пересекать гематоэнцефалический барьер трансгенных мышей и связываться с мозговыми бета-амилоидными бляшками в живых животных (фиг. 15).

Пример 4. Рекомбинантное антитело человека против бета-амилоида улучшает аномальное познавательное поведение и вызывает снижение содержания бета-амилоидных бляшек, астроглиоза и микроглиоза в трансгенной модели болезни Альцгеймера на мышах без повышения частоты микрокровоизлияний.

АгсЛЬей мышам в возрасте 24 месяцев и подходящим по возрасту однопометным животным дикого типа вводили еженедельно интраперитонеально 3 мг/кг рекомбинантного антитела человека N1-101.11 или изотипически сходного контрольного антитела человека в течение 2 месяцев. Чтобы оценить эффект лечения на аномальное поведение у трансгенных мышей, выполняли поведенческое тестирование в Уобразном лабиринте перед и после завершения лечения. Скорость чередования поведения определяли, применяя У-образный пластиковый лабиринт с размерами плеч 40x20x10 см. В процессе 5-минутных процедур записывали последовательности вхождения в различные плечи лабиринта; чередование определяли как успешный вход в три плеча, при перекрывающихся триплетах вхождений в разные плечи. Процент чередований рассчитывали как отношение фактических к возможным чередованиям (определяли как общее число вхождения в различные плечи-2), умноженное на 100%. Сравнивали поведение в Уобразном лабиринте мышей агсАЬе1а, которых не лечили, и контрольных однопометных животных дикого типа, применяя непарный критерий Стьюдента. Непараметрический критерий Крускала-Уоллиса применяли, чтобы сравнить улучшение после лечения во всех 4 группах. Непараметрический И-критерий Манна-Уитни выбрали для попарного сравнения различных групп. Нулевые результаты (т. е. мышей, которые не покидали плечо, в которое их помещали) исключали из анализа.

Что наблюдали в предыдущих исследованиях, агсАЬе1а мыши, не получающие лечения, в возрасте 24-месяцев имели значительные нарушения по сравнению с однопометными мышами дикого типа (диаграмма А фиг. 16, перед лечением; непарный критерий Стьюдента, р=0.0007).

Мыши агсАЬе!а, которым вводили N1-101.11, проявили четко повышенные уровни чередования, сравнимые с контрольными мышами дикого типа, которым вводили N1-101.11, после 2 месяцев лечения. Анализ улучшения (т.е. результат теста после лечения минус результат теста перед лечением) показал значительную разницу между четырьмя группами (диаграмма В фиг. 16, критерий Крускала-Уоллиса; р=0.03). Попарный апостериорный анализ между всеми группами показал, что у мышей агсАЬе1а, которым вводили N1-101.11, улучшалась когнитивная деятельность значительно больше, чем у мышей дикого

- 56 017611 типа (υ-критерий Манна-Уитни; р=0.05 ΝΙ-101.11 трансгены против ΝΙ-101.11 дикого типа; р=0.008 Νΐ101.11 трансгены против контрольных дикого типа). Эта группа мышей также проявила сильную тенденцию к улучшенной деятельности по сравнению с трансгенными однопометными животными, которым вводили контрольное антитело (υ-критерий Манна-Уитни; р=0.08 ΝΙ-101.11 трансгены против контрольных трансгенов). Все мыши проявили ~10% улучшение результатов теста при повторном тестировании, что, похоже, было вследствие знакомой среды задания.

Эффекты длительного, 2-месячного лечения ΝΙ-101.11, на амилоидную нагрузку, астроглиоз и микроглиоз анализировали с помощью количественного гистохимического и иммуногистохимического анализа. Для этого мышей анестезировали после завершения поведенческого тестирования и транскардиально перфузировали ФБР. Одно полушарие мозга фиксировали в 4% параформальдегиде и заливали парафином. 5 мкм сагиттальные срезы получали с помощью микротома Ьека КМ 2135 (Баннокбурн, Иллинойс). Содержание бета-амилоидных бляшек в коре головного мозга и гиппокампе определяли количественно на срезах мозга, окрашенных тиофлавином 8 и конго красным согласно стандартному протоколу. Для иммуногистохимии пластинки депарафинизировали, блокировали 4% БСА, 5% козей сыворотки и 5% лошадиной сыворотки на ФБР в течение 1 ч при комнатной температуре. Антитела инкубировали в течение ночи при 4°С, используя следующие разведения: анти-СЕАР (Αбνаηсеб 1ттипос11е1шса18) 1:500, анти-1ВА1 ^АКО) 1:500. Вторичные связанные с флуорофором антитела инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. 2-3 среза на мозг мыши, отделенные друг от друга на расстояние 75 мкм, использовали для каждого окрашивания. Делали 2 снимка на срез при 10х увеличении для анализа коры головного мозга (теменная и лобная область). Всю область гиппокампа (5х увеличение, обрезали до областей интереса) брали для анализа гиппокампа. Автоматизированный анализ снимков выполняли с помощью программного обеспечения 1шаде1.

Двойное окрашивание срезов мозга из иммунизированных агсАЬе!а мышей 6Е10 и антителами к 1дС человека выявило связывание ΝΙ-101.11 с бета-амилоидными отложениями (фиг. 17, левая часть), указывая на то, что ΝΙ-101.11 может пересекать гематоэнцефалический барьер и связываться с мозговыми бета-амилоидными бляшками. Не было видно такого связывания антитела человека с бетаамилоидными отложениями у агсАЬе!а мышей, которым вводили контрольное антитело (фиг. 17, правая часть).

Длительное лечение 3 мг/кг ΝΙ-101.11 приводило к значительному снижению содержания амилоидных бляшек, что выявляли с помощью окрашивания тиофлавином 8 и конго красным. Это снижение достигало уровней, выше чем 50%, в коре головного мозга и гиппокампе по сравнению с агсАЬе!а мышами, которым вводили контрольное антитело (диаграммы А и В фиг. 18). Вдобавок к области бляшек (диаграмма С фиг. 18), значительное снижение также наблюдали для количества бляшек (диаграмма Ό фиг. 18) и среднего размера бляшек (диаграмма Е фиг. 18).

Чтобы проверить, влияет ли длительное лечение ΝΙ-101.11 на нейровоспалительный ответ у агсАЬе!а мышей, определяли количество реактивных астроцитов и микроглии после иммуногистологического окрашивания. Уменьшение числа реактивных астроцитов (анти-СЕАР окрашивание) наблюдали в коре головного мозга мышей агсАЬе!а, которым вводили ΝΙ-101.11, по сравнению с животными, которым вводили контрольное антитело (диаграмма А фиг. 19; υ-критерий Манна-Уитни; р=0.047). Не было обнаружено изменений в гиппокампе. Окрашивание антителом против маркера микроглии и макрофагов (антиГЬа1) также выявило статистическую тенденцию к уменьшению воспаления (диаграмма В фиг. 19; υкритерий Манна-Уитни; р=0.075 как для коры головного мозга, так и для гиппокампа).

Снижение астроцитоза и микроглиоза согласуется с уменьшением содержания бета-амилоида, наблюдаемым после лечения ΝΙ-101.11.

Пассивная иммунотерапия некоторыми моноклональными антителами, направленными против бета-амилоида, может быть связана с повышенной частотой микрокровоизлияний в мозге (РГегГег и др., 8с1епсе 298 (2002), 1379; V^1соск и др., 1. №иготПаттаНоп 1 (2004), 24). Чтобы оценить эффекты длительной терапии ΝΙ-101.11, выполняли окрашивание берлинской лазурью срезов мозга из мышей агсАЬе!а и дикого типа после длительного лечения ΝΙ-101.11. Это окрашивание позволяет обнаружить присутствие гемосидерина, продукта распада гемоглобина, и маркера предшествующих микрокровоизлияний (фиг. 20). У пожилых агсАЬе!а мышей, которых лечили контрольным антителом, частота положительных профилей при окрашивании берлинской лазурью была значительно повышена по сравнению с однопометными животными дикого типа (υ-критерий Манна-Уитни; р=0.001). Лечение ΝΙ-101.11 не приводило к повышению числа микрокровоизлияний по сравнению агсАЬе!а мышами, которым вводили контрольное антитело (υ-критерий Манна-Уитни; р=0.347), указывая на то, что полезные терапевтические эффекты лечения ΝΙ-101.11 достигались в отсутствии этого часто наблюдаемого побочного действия пассивной бета-амилоидной иммунотерапии.

Пример 5. Рекомбинантное антитело человека против мозгового бета-амилоида ингибирует образование синтетических бета-амилоидных фибрилл ш νίΙΐΌ.

Эффект рекомбинантного антитела человека ΝΙ-101.11 на образование бета-амилоидных фибрилл анализировали путем измерения тиофлавина 8, связавшегося с агрегированным бета-амилоидом, с по

- 57 017611 мощью флуоресцентного анализа. Растворы мономерного бета-амилоида инкубировали при 37°С в течение 24 ч в присутствии или отсутствии возрастающих концентраций ΝΙ-101.11. Образование синтетических бета-амилоидных фибрилл ш νίΙΐΌ ингибировалось рекомбинантным ΝΙ-101.11 человека зависящим от концентрации образом (фиг. 21).

Пример 6. Эффекты ΝΙ-101.11 на ех-νίνΌ фагоцитоз бета-амилоидных фибрилл ВV-2 клетками микроглиального происхождения.

Эффекты ΝΙ-101.11 на фагоцитоз бета-амилоидных фибрилл, опосредованный Ес-гамма рецептором, изучали на линии клеток микроглиального происхождения ВV-2. Клетки ВV-2 поддерживали в ОМЕМ, дополненной 5% ЕВ8, пенициллином/стрептомицином и глутамином. Клетки трипсинизировали и высевали 120000 клеток ВV-2/лунку в 24-луночные планшеты с плоским дном. Через 12 ч среду заменяли на 400 мкл ОМЕМ/Е12/лунку, дополненную 20 мМ НЕРЕ8 (рН 7.3), 1% БСА, 10 мкг/мл пенициллином/стрептомицином. Добавляли 100 мкг/мл фукоидана, ингибитора фагоцитарного рецептора, за 30 мин до начала эксперимента. 50 мкМ Е1ТС-меченых бета-амилоидных фибрилл предварительно инкубировали с указанными концентрациями антител в течение 30 мин при 37°С, промывали дважды, а затем центрифугировали в течение 5 мин при 14000/д. Эту суспензию добавляли в планшеты для выращивания культуры. Через 30 мин ВV-2 клетки промывали дважды сбалансированным солевым раствором Хенкса (НВ88), чтобы удалить несвязанный фибриллярный бета-амилоид.

Клетки орабатывали 250 мкг/мл трипсин/ЕЭТЛ в течение 20 мин при 4°С и промывали дважды с помощью центрифугирования при 500/д в течение 5 мин при 4°С. Клетки фиксировали в течение 20 мин в ЕАС8-Е1Х (ФБР, 2% ЕА, 2% глюкозы, 5 мМ ΝηΝ) и промывали дважды в ЕЛС8-\\'а511 (ФБР, 5 мкМ ЕЭТЛ, 0,2% БСА). Флуоресценцию (ЕЬ-1) 10000 клеток определяли с помощью ЕАС8 анализа (на основании ХУеЬйег 8Ό и др., Л 2001).

Ес-гамма рецептор-зависимый фагоцитоз Е1ТС-меченых бета-амилоидных фибрилл 1-42 измеряли при ингибировании системы фагоцитарного рецептора. Сравнительный анализ ΝΙ-101.11 человека и доступного для приобретения антитела, направленного на линейный эпитоп на Ν-конце бета-амилоидного пептида (6Е10), показал зависимую от дозы индукцию фагоцитоза бета-амилоидных фибрилл. Поглощение фибрилл, опосредованное ΝΙ-101.11, было вплоть до 3 раз больше, чем наблюдаемое для антитела 6Е10 (фиг. 22). Эти результаты указывают на то, что ΝΙ-101.11 инициирует эффективный, зависимый от дозы, опосредованный Ес-гамма рецептором фагоцитоз микроглиальными клетками бета-амилоидных фибрилл.

Заключение

Как было показано в описанных выше экспериментах, выполненных в соответствии с настоящим изобретением, неожиданно оказалось возможным обнаружить защитные и терапевтически активные антитела и продуцирующие антитела В-клетки у фенотипически здоровых, бессимптомных людей, а также у пациентов с необычно стабильным клиническим течением заболевания, несмотря на диагноз когнитивного нарушения или болезни Альцгеймера. В частности, можно обнаружить и выделить новый класс антител человека, которые дискриминируют физиологически функциональную форму антигена, минимизируя тем самым риск аутоиммуногенных побочных эффектов, что до настоящего времени являлось проблемой иммунотерапии. Таким образом, предусмотрены антитела и эквивалентные связывающие молекулы, которые специфично узнают вариант антигена в патофизиологически значимой структуре, с которым должно связываться антитело для того, чтобы уменьшить его токсичность, или снизить его концентрацию, или вызвать его деградацию, посредством, например, экспонирования патогена ЕсЯэкспрессирующим макрофагам или клеткам микроглии, и, следовательно, сделать его безопасным. Что дополнительно показано в примерах, такие антитела являются терапевтически эффективными и способны как задерживать, так и предотвращать опасные эффекты аномальных патологических белков и их агрегатов без увеличения частоты микрокровоизлияний в мозге.

- 58 017611

Перечень последовательностей <110> Юнивэсэти оф Цюрих < 120> Способ получения связывающей молекулы, специфичной к белку, ассоциированному с расстройством, или антитела или его связывающего фрагмента или по меньшей мере одной цепи иммуноглобулина, связывающих вышеуказанный белок (варианты), связывающая молекула, антитело, цепь иммуноглобулина или их связывающий фрагмент (варианты), антиген, полинуклиотид, вектор и клетка-хозяин, их включающие композиция и набор и способ диагностики или лечения неврологических расстройств посредством вышеуказанных объектов (варианты) <130> ΝΕ30Α06/Ρ-ΛΥΟ <160> 56 <170> Патентная версия 3.4 <210> 1 <211> 66 <212> ДНК <213> Человек <220>

<221> ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1)..(66) <223> Сайт рестрикции ХЬа 1 лидирующего пептида, полученного из Укарра I 15человека, встроенный с 3' конца последовательности <220>

<221> Сй8 <222> (1)..(66) <400> 1

агд

да с

аБд

сдд

д*д

ссс

дес

сад

с£д

сед ддс сС.д

сСд

сБд

сЬд

Ёдд

48

МеС

Азр

МеС

Агд

Уа1

Рго

А1а

С1п

ьеи

Ъеи С1у Ьеи

ьеи

Ьеи

Ьеи

Тгр

1

5

10

15

ССс

ссс

ддс

СсЪ

ада

Ьдс

бб

РЬе

Рго

©1у

Зег

Агд

Су 8

20

<210> 2 <211> 22 <212> ПРТ <213> Человек <400> 2

- 59 017611

Мее Авр Мее Агд Уа1 Рго А1а <31п Ьеи Ьеи 61у Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Тгр

10 15

РЬе Рго О1у Зег Агд Суз <210> 3 <211> 372 <212> ДНК <213> Человек <220>

<221> У_область <222> (1)..(372) <223> N1-101.10-последовательность вариабельной области тяжелой цепи <220>

<221> СО8 <222> (1)..(372) <400> 3

дад

д^д

сад

сеа

дед

сад

есе

ддд

дда

ддс

дед

дес

сад

ссе

ддд

адд

48

(31и

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

С1п

Зег

(31у

С1у

<31у

УаЬ

Уа1

□1п

РГО

С1у

Агд

1

5

10

15

есс

сед

ада

сес

есс

еде

дса

дед

есе

дда

еес

дсс

еес

аде

аде

еае

96

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

<з1у

РЬе

А1а

РЬе

Зег

Зег

Туг

20

25

30

ддс

аса

сас

Ъдд

дес

сдс

сад

дсе

сса

ддс

аад

ддд

сед

дад

едд

дед

144

еху

Не

ΗΪ8

Тгр

Уа1

Агд

01п

А1а

Рго

С31у

Ьуз

<31у

Ьеи

<31и

Тгр

Уа1

35

40

45

дса

дЪЬ

аеа

Едд

ееъ

дае

дда

асе

ааа

ааа

еас

еае

аса

дас

есс

дед

192

А1а

Уа1

11е

Тгр

РЬе

Авр

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьув

Туг

Туг

ТЬг

Авр

Зег

Уа1

50

55

60

аад

ддс

ада

еес

асе

аес

есс

ада

дас

аае

есс

аад

аас

аса

сед

еае

240

Ьуз

О1у

Агд

РЬе

ТЙГ

11е

Зег

Агд

Авр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

ьеи

туг

65

70

75

80

сед

саа

аед

аас

асе

сед

ада

дсс

дад

дас

асд

дсе

дед

еае

еас

еде

288

Ьеи

С1п МеБ

Азп ТЬг 85

Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз

90

95

дед

ада

даБ

адд

ддБ

аБа

дд»

дсБ

едд

едд

ддд

ссд

С ас

Бас

аБд

да с

А1а

Агд

Азр

Агд

<31у

Не

С1у

А1а

Агд

Агд

С1у

Рго

Туг

Туг

МеБ

Азр

100

105

110

дБс

Бдд

дде

ааа

ддд

асе

асд

дБс

асе

дБс

Бсс

Беа

Уа1

Тгр

61у

Ьуз

<31у

ТЬг

ТЬГ

Уа1

ТЫ

Уа1

зег

Зег

115 120 <210> 4 <211> 124 <212> ПРТ <213> Человек <400> 4

<31и

Уа1

61п

ьеи

Уа1

С1п

Зег

С1у

<31у

<31у

Уа1

Уа1

<Э1п

Рго

<31у

Агд

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

зег

Суз

А1а

А1а

Зег

(31у

РЬе

А1а

РЬе

Зег

Зег

Туг

20

25

30

С1у

Не

Н1з

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

01у

Ьеи

<31и

Тгр

Уа1

35

40

45

А1а

Уа1

Не

Тгр

РЬе

А$р

<Э1у

ТЬг

Ьуз

Ьуз

Туг

Туг

ТЬг

Аер

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

(31у

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Агд

Абр

АзП

зег

Ьуз

АЗП

ТЬг

Ьеи

Туг

€5

70

75

80

Ьеи

<31 п

МеБ

Азп

ТЬг

Ьеи

Агд

А1а

(31и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Азр

Агд

61у

Не

<31у

А1а

Агд

Агд

О1у

Рго

Туг

Туг

МеЬ

Азр

100

105

110

Уа1

Тгр

С1у

Ьуз

С1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210> 5 <211> 372 <212> ДНК <213> Искусственная

- 61 017611 <220>

<223> Оптимизированный кодон <220>

<221> Уобласть <222> (1)..(372) <223> N1-101.11- последовательность вариабельной области тяжелой цепи <220>

<221> СОК <222> (1)..(372) <400> 5

дад

дед

сад

сед

дЬд

сад

аде

ддс

ддс

ддс

дьд

дьд

сад

ссс

ддс

едд

48

О1и

Уа1

<31л

Ьеи

Уа1

<31п.

Зег

С1у

О1у

С1у

Уа1

Уа1

(31п

Рго

С1у

Агд

1

5

10

15

аде

сед

едд

сед

аде

еде

дсс

дес

аде

ддс

еес

дсс

еес

аде

аде

еас

96

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

С1у

РЬе

А1а

РЬе

Зег

Зег

Туг

20

25

30

ддс

аед

сас

едд

дед

едд

сад

дсс

еес

ддс

аад

ддс

сед

дад

едд

д^д

144

(31у

мее

Ηί$

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

Ьуз

21у

Ьеи

С1и

Тгр

Уа1

35

40

45

дсс

дед

аес

едд

еес

дас

ддс

асе

аад

аад

еас

еас

асе

дас

аде

дьд

192

А1а

Уа1

Не

Тгр

РЬе

Азр

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьуз

Туг

Туг

ТЬг

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

аад

ддс

едд

еес

асе

асе

аде

едд

дас

аас

аде

аад

аас

асе

сед

еас

240

Ьуз

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

сед

сад

аед

аас

асе

сед

едд

дсс

дад

дас

асе

дсс

дед

еас

еас

еде

288

Ьеи

С51ц

мее

Азп

ТЬг

Ьеи

Агд

А1а

<31и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

дсс

едд

дас

едд

ддс

аес

ддс

дсс

едд

едд

ддс

ссс

еас

еас

аед

дас

336

А1а

Агд

Азр

Агд

С1у

11е

(31у

А1а

Агд

Агд

Э1у

Рго

Туг

Туг

Мее

Азр

100

105

110

дЬд

Ьдд

ддс

аад

ддс

асе

асе

дЬд

асе

дьд

аде

аде

372

Уа1 Тгр <31у Ьуз <Э1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг V»! Зег 8ег

115 120 <210> 6 <211> 124 <212> ПРТ <213> Человек <400> 6

<3111

Уа1

<31п

Ьеи

Уа1

<31п

Зег

С1у

(31у

С1у

Уа1

Уа1

(31п

Рго

61у

Агд

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

С1у

РЬе

А1а

РЬе

Зег

Зег

Туг

20

25

30

С1у

мех

Ηχε

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

(31у

Ьуз

<31у

Ьеи

01и

Тгр

Уа1

35

40

45

А1а

Уа1

Не

Тгр

РЬе

Азр

<Э1у

ТЬг

Ьуз

Ьуз

Туг

Туг

ТЬг

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

С31у

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

С1П

Мес

Азп

ТЬг

Ьеи

Агд

А1а

<51и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Азр

Агд

<31у

Не

01у

А1а

Агд

Агд

<31у

Рго

Туг

Туг

МеС

Азр

100

105

110

Уа1 Тгр б1у Ьуз 61у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег

115 120 <210> 7 <211> 327 <212> ДНК <213> Человек <220>

<221> У’область <222> (1)-(327) <223> N1-101.10 и N1-101-11-последовательность вариабельной области карра (УКарра) легкой цепи

- 63 017611 <22О>

<221> СО5 <222> (1)..(327) <400> 7

да а

аее

дед

сед

асе

сад

есе

сса

есс

есс

сед

есе

дса

есе

деа

дда

48

С1Ц

Не

Уа1

ьеи

ТЬг

С1п

Зег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1

О1у

1

5

10

15

да с

ада

дес

асе

аСс

асЬ

еде

едд

дса

аде

сад

аде

аее

аде

аде

еае

96

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суг

Агд

А1а

Зег

«31П

Зег

Не

Зег

Зег

Туг

20

25

30

пса

аае

Ьдд

еае

саа

сад

ааа

сса

ддд

ааа

дес

сес

аад

сес

сед

аес

144

Ьеи

Άε η

Тгр

Туг

(31п

С1п

Ъуа

Рго

С1у

Ьуг

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

35

40

45

еас

дес

дса

есс

аде

есд

саа

аде

ддд

дес

сса

еса

адд

еес

аде

ддс

192

Туг

А1а

А1а

Зег

Зег

Ьеи

01п

Зег

<31у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

<31у

50

55

60

аде

дда

С.СЙ

ддд

аса

дае

еес

асе

сес

асе

аес

аде

аде

сед

саа

ссе

240

Зег

<Э1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

<31п

Рго

65

70

75

80

даа

дае

еее

дса

асе

еае

еас

еде

сад

сад

аде

еас

аде

асе

ссе

сес

288

С1и

Агр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

С1п

С1п

Зег

Туг

Зег

ТЬг

Рго

Ьеи

85

90

95

асе

еес

ддс

дда

ддд

асе

а ад

сес

дад

аСс

ааа

еде

асд

327

ТЬг

РЬе

О1у

С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

<31и

Не

Ьуз

Агд

ТЬг

100 105 <210> 8 <211> 109 <212> ПРТ <213> Человек <400> 8

<31и

Не

Уа1

Ьеи

ТЬг

<31п

Зег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1

С1у

1

5

10

15

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

Агд

А1а

Зег

С1п

Зег

11е

Зег

Зег

Туг

- 64 017611

20

25

30

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

<21п

С1п

Ьуа

Рго

61у

Ьуа

А1а

Рго

Ьуа

Ьеи

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

А1а

А1а

Зег

Зег

Ьеи

О1п

Зег

О1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

<31у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

<31у

ТЬг

Азр

Рке

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

<31п

Рго

65

70

75

80

С1и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

С1п.

б1п

Зег

туг

Зег

ТЬг

Рго

Ьеи

85

90

95

ТЬг

РЬе

С1у

О1у

<31у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

<Э1и

Не

Ьуз

Агд-

ТЬг

100 105 <210> 9 <211> 381 <212> ДНК <213> Человек <220>

<221> У_область <222> (1)..(381) <223> N1-101.12- последовательность вариабельной области тяжелой цепи <220>

<221> СБ8 <222> (1)..(381) <400> 9

дад

дЬд

сад

сед

дбд

дад

аде

ддс

ссс

ддс

сЬд

дед

аад

ССС

дсс

дад

(31и

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

(31и

Зег

(31у

Рго

61у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

А1а

Θΐυ

1

5

10

15

асе

сед

аде

сЬд

асе

где

асе

дйд

аде

ддс

ддс

аде

аес

едд

аде

ддс

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

Уа1

Зег

<Э1у

б1у

Зег

Не

Агд

Зег

<Э1у

20

25

30

аде

аес

еде

едд

•Бас

едд

аес

едд

сад

ССС

ссс

ддс

аад

ддс

сед

дад

зег

Не

Суз

Тгр

Туг

тгр

11е

Агд

61п

Рго

Рго

С1у

Ьуд

□1у

Ьеи

61 и

35

40

45

аЬс

ддс

Ъас

е-ьс

Ъде

Ьас

аде

ддс

дсс

асе

Ыхе

Ьас

асе

ссс

аде

Тхр

Не

О1у

Туг

РЬе

Суз

Туг

Зег

<Э1у

А1а

ТЬг

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Зег

50

55

60

сСд

едд

ддс

едд

сЪд

асе

аЪс

аде

д^д

да с

дсс

аде

аад

аас

сад

сЬд

ьеи

Агд

С1у

Агд

Ьеи

ТЬх

Не

5ег

Уа1

Αερ

А1а

Бег

Ьуз

Αεπ

Θΐη

Ьеи

55

70

75

80

аде

с£д

аде

сс.д

аде

аде

д^д

асе

дсс

дсс

дас

асе

дсс

дьд

•Сае

Ьас

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

5ег

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

А1а

Αερ

ТЬг

А1а

Уа1

Тух

Туг

85

90

95

еде

дес

едд

едд

дес

ддс

дад

аас

аде

ддс

ддс

аъе

дад

ссс

С.ае

Гас

Суз

А1а

Агд

Агд

А1а

б1у

О1и

АЗП

8ег

<31у

61у

Не

(31и

РГО

Туг

Туг

100

105

110

ддс

аСд

дас

дЬд

Ъдд

ддс

сад

ддс

асе

асе

дьд

асе

дьд

аде

аде

С1у

Мег

Азр

Уа1

Тгр

01у

Сг1п

О1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115 120 125 <210> 10 <211> 127 <212> ПРТ <213> Человек <400> 10

С1и 1

Уа1

<31п

Ьеи Уа1 5

(31и

Зег <31у Рго <?1у Ьеи Уа1 Ьуз 10

РГО

А1а 15

<Э1и

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

ναΐ

Зег

С1у

СУу

Зег

Не

Агд

Зег

С1у

20

25

30

Зег

Не

Суд

Тгр

Туг

Тгр

Не

Агд

С1п

Рго

Рго

<21у

Ьуд

<Э1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

11е

<31у

Туг

РЬе

Суз

Туг

Зег

С1у

А1а

ТЬг

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Агд

(31у

Агд

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Уа1

Азр

А1а

Зег

Ьуз

Агп

31п

Ьеи

65

70

75

80

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

А1а

Авр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

А1а

<31у

С1и

Аз П

Зег

С1у

С1у

Не

<31и

Рго

Туг

Туг

- 66 017611

100 105 110 <Э1у Мее Азр Уа1 Тгр <31у (31п О1у ТЬг ТКг Уа1 ТЬг Уа1 Зег ЗеГ

115 120 125 <210> 11 <211> 330 <212> ДНК <213> Человек <220>

<221> У_облас1Ъ <222> (1)..(330) <223> N1-101.12- последовательность вариабельной области карра (Укарра) легкой цепи <220>

<221> СО5 <222> (1)..(330) <400> И

дас

дад

аес

дЬд

сед

асе

сад

аде

ссс

аде

аде

сед

аде

дсс

аде

аес

43

Азр

С1и

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг

(31п

Зег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Зег

11е

1

5

10

15

ддс

дас

едд

дед

асе

асе

асе

Сдс

едд

дсс

аде

дад

аде

аес

аас

аад

96

О1у

Аар

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

Агд

А1а

Зег

С1и

Зег

11е

Аз η

Ъуз

20

25

30

еас

дед

аас

едд

еас

сад

сад

аад

ССС

ддс

аад

дсс

ссс

аад

сед

сед

144

туг

Уа1

АЗП

Тгр

Туг

О1П

О1п

Ьуз

Рго

<31у

ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ъеи.

Ьеи

35

40

45

аес

еас

дсс

дсс

аде

аде

сед

сад

аде

ддс

дсс

ссс

аде

едд

дЬд

аде

192

Не

Туг

А1а

А1а

Зег

Зег

Ъеи

<Э1п.

Зег

<31у

А1а

Рго

Зег

Агд

Уа1

Зег

50

55

60

ддс

аде

ддс

еес

ддс

едд

дас

еес

аде

сед

асе

аес

аде

ддс

сед

сад

240

<31у

Зег

С1у

РЬе

С1у

Агд

Азр

РЬе

Зег

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

С1у

Ьеи

С1п

65

70

75

30

дсс

дад

дас

еес

ддс

дсс

Сае

еес

еде

сад

сад

аде

еас

аде

дсс

ссс

238

А1а

С1и

Азр

РЬе

С1у

А1а

Туг

РЬе

Суз

С1п

О1П

Зег

туг

Зег

А1а

Рго

- 67 017611

90 95

Ъас асе есс ддс сад ддс асе аад дед дад аес аад едд асе Туг ТЬг РЬе 61у С1п <31у Ткг Ьув Уа1 С1и Не Ьув Агд ТЬг 100 105 110 <210> 12 <211> 110 <212> ПРТ <213> Человек <400> 12

330

Азр

С1Ц

Не

Уа1

Ьеи

ТЬг

С1п

бег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

бег

А1а

Зег

11е

1

5

10

15

О1у

А8р

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Сув

Агд

А1а

Зег

С1и

бег

Не

АЗП

Ьуз

20

25

30

Туг

7а1

Авп

Тгр

Туг

<31п

(31п

Ьув

Рго

<31у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

35

40

45

11е

Туг

А1а

А1а

бег

бег

Ьеи

С1п

бег

С1у

А1а

Рго

бег

Агд

Уа1

Зег

50

55

60

С1у

бег

С1у

РЬе

С1у

Агд

Авр

РЬе

бег

Ьеи.

ТЬг

Не

бег

О1у

Ьеи

О1п

65

70

75

80

А1а

С1и

Авр

РЬе

С1у

А1а

Туг

РЬе

Суз

С1п

С1п

бег

Туг

бег

А1а

Рго

85

90

95

Туг

ТЬг

РЬе

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Ьув

\Га1

61и

11е

Ьуз

Агд

ТЬг

100

105

110

<210> 13 <2!1> 363 <212> ДНК <213> Человек <220>

<221> ν_ область <222> (1)..(363) <223> N1-101.13- последовательность вариабельной области тяжелой цепи <220>

- 68 017611 <221> С05 <222> (1)..(363) <400> 13

сад

деа

сад

сед

сад

9 ад

Сса

ддс

сса

дда

сед

дед

аад

ссе

есд

дад

48

О1П

νβΐ

С1п

ьеи

С1п

С1и

Зег

О1у

Рго

О1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

Зег

(31и

1

5

10

15

асе

сед

есс

сес

асе

еде

асе

дес

есе

дде

ддс

есе

аес

аде

ада

ада

96

ТЫ

Ьеи

Зег

ьеи

ты

Суз

ТЫ

Уа1

Зег

С1у

С1у

Зег

Не

Зег

Агд

Агд

20

25

30

аде

Ъас

Ъас

едд

ддс

едд

аес

еде

сад

есс

сса

ддд

аад

ддд

сед

дад

144

Зег

Туг

Туг

Тгр

<Э1у

Тгр

11е

Агд

<31п

Зег

Рго

61у

Ьуз

01у

Ьеи

О1и

35

40

45

едд

аде

дда

аде

аес

сае

еае

аде

999

аде

асе

еас

еас

аас

ссд

есс

192

тгр

Зег

<31у

Зег

Не

Н13

Туг

Зег

<31у

Зег

ТЫ

туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

сес

аад

аде

еда

дес

асе

аеа

есе

деа

дас

асд

есс

аад

аас

сад

еес

240

ьеи

ьуз

Зег

Агд

Уа1

ТЫ

11е

Зег

Уа1

Азр

ТЫ

Зег

Ьуз

Азп

С1п

РЬе

65

70

75

80

ЬСС

сед

ааа

сед

аде

ъсе

дее

асе

дсс

дса

дас

асд

дсе

дес

еае

еас

288

Зег

Ьеи

ьуз

ьеи

Зег

Зег

Уа1

ТЫ

А1а

А1а

Азр

ТЫ

А1а

Уа1

туг

туг

85

90

95

еде

дед

ада

еса

еде

едд

ддс

аде

аде

едд

деа

еее

дас

Ъас

едд

ддс

336

Суз

А1а

Агд

Зег

Агд

тгр

С1у

Зег

Зег

тгр

Уа1

РЬе

АЗр

Туг

тгр

С1у

100

105

110

сад

ддс

аса

сЪд

дес

асе

дес

есе

есд

363

С1п

<31у

ты

Ьеи

Уа1

ТЫ

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210> 14

<211> 121

<212> ПРТ

<213> Человек

<400> 14

С1п

Уа1

О1п

Ьеи

ΰΐη

С1и

Зег

С1у

Рго

С1у

Ьеи

Уа1

ьуз

Рго

Зег

С1и

- 69 017611

1

5

10

15

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

Уа1

Зег

С1у

О1у

Зег

11е

Зег

Агд

Агд

20

25

30

Зег

Туг

Туг

Тгр

С1у

Тгр

Не

Агд

С1п

Зег

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

<31и

35

40

45

Тгр

Зег

<31у

Зег

Не

Ηϊβ

Туг

Зег

С1у

Зег

ТЬг

Туг

Туг

Аап

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Уа1

ТЬг

Не

Зег

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

АЗп

С1П

РЬе

65

70

75

80

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

А1а

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

35

90

95

Суз

А1а

Агд

Зег

Агд

Тгр

31у

Зег

Зег

Тгр

Уа1

РЬе

Аер

Туг

Тгр

С1у

100

105

НО

(31п

<31у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115 120 <210> 15 <211> 330 <212> ДНК <213> Человек <220>

<221> Уобласть <222> (1)..(330) <223> N1-101.13- последовательность вариабельной области 1ашЬба (У1атЬ<1а) легкой цепи <220>

<221> СБ8 <222> (1)..(330) <400> 15

сад

аде

дЬд

сЬд

асе

сад

ссд

ссд

аде

дед

аде

ддс

асе

ссд

ддс

сад

48

<31п.

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

(31п

Рго

Рго

Зег

А1а

Зег

<31у

ТЬг

Рго

<31у

<Э1п

1

5

10

15

сдс

дед

асе

а&Ь

аде

Ъдс

аде

ддс

аде

аде

аде

аас

аЬЪ

ддс

аде

аас

96

Агд

Уа1

ТЬг

Не

Зег

Суа

Зег

О1у

Зег

Зег

Зег

А8П

Не

О1у

Зег

Аеп

- 70 017611

20

25

30

ЪаЪ

дЬд

ЪаЪ

Ьдд

Ъа£

сад

сад

сед

сед

ддс

асе

дед

ссд

ааа

с£д

сЪд

Туг

Уа1

Туг

Тгр

Туг

О1п

<31п

Рго

Рго

<Э1у

ТЪг

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

35

40

45

агъ

ЪаЪ

еде

аас

аас

сад

еде

сед

аде

дде

дид

ссд

дас.

еде

ЪЪЪ

аде

Не

Туг

Агд

Азп

Азп

<Э1п

Агд

Рго

Зег

О1у

Уа1

Рго

Аар

Агд

РИе

Зег

50

55

60

ддс

аде

ааа

аде

ддс

асе

аде

дед

аде

сЬд

дед

аЪЬ

аде

дде

сЪд

еде

С1у

Зег

Ьуз

Зег

С1у

ТИг

Зег

А1а

Зег

Ьеи

А1а

Не

Зек

О1у

Ьеи

Агд

65

70

75

80

аде

даа

да£

даа

дед

даЪ

ЪаЪ

БаБ

Бдс

дед

дед

^дд

даЬ

даЪ

аде

сБд

Зег

31и

Авр

<31и

А1а

Аер

Туг

Тук

Суз

А1а

А1а

Тгр

Аер

Азр

зек

Ьеи

95

90

95

аде

ддс

ъаъ

дСд

еъс

ддс

асе

ддс

асе

ааа

д^д

асе

д^д

с£д

Зег

<31у

тук

Уа1

Рйе

<Э1у

ТЬг

©1у

ТИг

ьуз

Уа1

ткг

Уа1

ьеи

100 105 110 <210> 16 <211> 110 <212> ПРТ <213> Человек <400> 16

<31п

Зег

νβΐ

Ьеи

ТНг

О1п

Рго

Рго

Зег

А1а

Зег

О1у

Ткг

Рго

01у

01п

1

5

10

15

Агд

Уа1

тИг

11е

Зег

Суз

Зег

61у

Зег

Зег

Зег

Азп

11е

С1у

Зек

Азп

20

25

30

Туг

Уа1

Туг

Тгр

Тук

С1п

О1п

Рго

Рго

С1у

ТЬк

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

35

40

45

Не

Туг

Агд

Азп

Азп

С1п

Агд

Рго

Зег

С1у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РНе

Зек

50

55

60

01у

Зег

ьуз

Зег

С1у

Ткг

Зег

А1а

Зек

Ьеи

А1а

Не

Зег

<31у

Ьеи

Агд

65

70

75

80

Зег

<31и

Азр

С1и

А1а

Азр

Туг

Туг

Суз

А1а

А1а

Тгр

Азр

Азр

Зег

Ьеи

85

90

95

- 71 017611

Зег С1у Туг Уа1 РЬе 31у ТЬг <31у ТЬг Ьуз ν*1 ТЬГ Уа1 Ьеи

100 105 110 <210> 17 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>

<223> гипервариабельный участок гипервариабельный участок <220>

<221> Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1)..(5) <223> Значение последовательностейгипервариабельного участка белка в номенклатуре КаЪа!

для N1-101.10 νίί, СОК.1 <400> 17

Зег Туг 31у 11е Ηΐε

5 <210> 18 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

<221 > Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1),.(17) <223 > Значение последовательностей типервариабелъного участка белка в номенклатуре КаЬа!

для N1-101.10 \’Ь, СПК2 <400> 18

Уа1 11е Тгр РЬе Азр О1у ТЬг Ьуз Ьуз Туг Туг ТЬг Авр Зег Уа1 Ьуз

10 15

- 72 017611 <31у <210> 19 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

<221> Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1)..(15) <223> Значение последовательностей гипервариабельното участка белка в номенклатуре КаЪа!

для N1-101.10 \Ъ, СОКЗ <400> 19

Авр Агд С1у 11е С1у А1а Агд Агд <31у Рго Туг Туг Мее Авр Уа1

10 15 <210> 20 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

<221> Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1).,(5) <223> Значение последовательностей гипервариабельного участка белка в номенклатуре КаЬа1 для N1-101.11 и N1-101,12Г6АУК СОК1 <400> 20

Зег Туг С1у мее Ηίε

5

- 73 017611 <210> 21 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

<221 > Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1)..(17) <223> Значение последовательностейгипервариабельного участка белка в номенклатуре КаЬах для N1-101.11 и N1-101.12Г6А ΥΗ, СРЯ2 <400> 21

Уа1 11е Тгр РЬе Азр <31у ТЬг Ьуз Ьуз Туг Туг ТЬг Азр 5ег Уа1 Ьуз

10 15

О1у <210> 22 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

<221 > Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1)..(15) <223> Значение последовательностейгипервариабелъногоучастка белка вноменклатуреКаЬа!

для ΝΙ-10Ι.11Η N1-101.12Р6А VII, СОЯЗ <400> 22

Азр Агд С1у 11е С1у А1а Агд Агд <31у Рго Туг Туг МеС Аэр Уа1

10 15

- 74 017611 <210> 23 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

<221 > Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1)..(11) <223> Значение последовательностей гипервариабельного участка белка в номенклатуре КаЬа1 для N1-101.10, N1-101.11 и N1-101.12Р6А Укарра, СОК1 <400> 23

Агд А1а 5ег 61п Бег Не Зег Бег Туг Ьеи Аеп

10 <210> 24 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

<221 > Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1)..(7) <223> Значение последовательностей гипервариабельного участка белкав номенклатуре КаЬаг для N1-101.10, N1-101.11 и N1-101.12Р6А Укарра, СОК2 <400> 24

А1а А1а Зег Зег Ьеи 61п Зег

5 <210> 25

- 75 017611 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

< 2 21 > Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1)..(9) <223> Значение последовательностей гипервариабельного участка белка в номенклатуре КаЪа1 для N1-101.10, N1-101.11 и N1-101.12РбАУкарра, СОКЗ <400> 25

С1п С1п Зег Туг Зег ТЬг Рго Ьеи ТЬг

5 <210> 26 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

<221> Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1).,(5) <223> Значение последовательностей гипервариабельного участка белкавноменклатуреКаЬа!

для N1-101.12 УЬ, СОРТ <400> 26

Зег О1у Зег 11е Суз

5 <210> 27 <211> 19

- 76 017611 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

<221 > Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1)..(19) <223> Значение последовательностей гипервариабельного участка белкав номенклатуре КаЬа1 для N1-101.12 Μι, С ПК2 <400> 27

Тгр Не <Э1у Туг РЬе Суз Туг бег С1у А1а ТЬг РЬе Туг ТЬг Рго бег

10 15

Ьеи Агд <31у <210> 28 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

<221> Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1)..(17) <223 > Значение последовательностей гипервариабелъного участка белка в номенклатуре КаЬа1 для N1-101.12 Μι, СОЙЗ <400> 28

Агд А1а <31у 31и Азп бег С1у <31у 11е 01и Рго Туг Туг 61у МеЬ Азр

10 15

Уа1

- 77 017611 <210 29 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

<221 > Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1)..(11) <223 > Значение последовательностей гипервариабельного участка белка в номенклатуре КаЬа( для N1-101.12 Укарра, С0К1 <400> 29

Агз А1а 8ег С1и 8ег Не Азп Ьуз Туг Уа1 Азп

5 10 <210> 30 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

<221> Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1)..(7) <223> Значение последовательностей гипервариабельного участка белка в номенклатуре КаЪа( для N1-101.12 Укарра, СБК2 <400> 30

А1а А1а Зег Зег Ьеи (31п Зег

5 <210> 31

- 78 017611 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

<221 > Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1)..(9) <223 > Значение последовательностей гипервариабельного участка белкав номенклатуре КаЬа( для N1-101 12 Укарра, СВЕЗ <400> 31

С1п С1п Зег Туг Зег А1а Рго Туг Ткг

ПРТ

Искусственная гипервариабельный участок

Ошибка нуклеотидной последовательности (П (7) <223 > Значение последовательностей гипервариабельного участка белка в номенклатуре КаЪа1 для N1-101.13 УК, СОР1 <400> 32

Агд Агд Зег Туг Туг Тгр <Э1у

5 <210> 33 <211> 16 <210>

<212>

<213>

<220>

<223>

<220>

<221>

<222>

- 79 017611 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

<221> Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1)..(16) <223> Значение последовательностей гипервариабельного участка белка в номенклатуре КаЬа!

для N1-101.13 УЬ, СГ>Т<2 <400> 33

Зег 11е Н13 Туг Зег С1у Зег ТЬг Туг Туг Азп Рго Зег ьеи Ьуз Зег 15 10 15 <210> 34 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная <220 <223> гипервариабельный участок <220>

<221> Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1)..(11) <223 > Значение последовательностей гипервариабельного участка белкав номенклатуре КаЬа!

для N1-101.13 УЬ, СОКЗ <400> 34

Зег Агд Тгр С1у Зег Зег тгр ναι РЬе Азр Туг ю

<210> 35 <211> 13 <212> ПРТ

- 80 017611 <213> Искусственная <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

<221 > Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1)..(13) <223 > Значение последовательностей гипервариабельного участка белка в номенклатуре КаЬа( для ΝΙ-10Ι.13 У1ал1Ьда, ΟϋΚΙ <400> 35

Зег С1у Зег Зег 5ег Αεη Не (31у Зег Аеп Туг Туг

10 <210> 36 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

<221> Ошибка нуклеотида ой последовательности <222> (1)..(7) <223 > Значение последовательностей гипервариабельного участка белка в номенклатуре КаЬа( для N1-101.13 У1атЬйа, ΟϋΚ2 <400> 36

Агд Αεη Αεη «Э1п Агд Рго Зег

5 <210> 37 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная

- 81 017611 <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

<221> Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1)..(11) <22 3 > Значение последовательностей гипервариабельного участка белка в номенклатуре КаЬа( для N1-101.13 ЛТатЬйа, СОКЗ <400> 37

А1а А1а Тгр Αερ Аар Зег Ьеи Зег С1у Туг Ча!

10 <210> 38 <211> 372 <212> ДНК <213> Человек <220>

<221> Х’ область <222> (1)..(372) <223> N1-101.12Р6А - последовательность вариабельной области тяжелой цепи <220>

<221> СО8 <222> (1)..(372) <400> 38

сад

дед

сад

сед

дед

дад

есе

ддд

дда

ддс

дьд

дЪс

сад

ссе

ддд

адд

С1п

Уа1

<31п

Ьеи

ν&ι

<31и

Зег

31у

О1у

<Э1у

Уа1

Уа1

а1п

РГО

(31у

Агд

1

5

10

15

есс

сед

ада

сес

есс

ьд*

дса

дед

есе

дда

еес

дес

еес

аде

аде

Сае

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

С1у

РЬе

А1а

РЬе

Зег

Зег

Туг

2ϋ

25

30

ддс

аед

сас

бдд

дЬс

сдс

сад

дсе

сса

ддс

аад

ддд

сед

дад

едд

дьд

С1у

Мее

Н1з

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

О1у

Ьуз

<31у

Ьеи

С1и

Тгр

Уа1

- 82 017611

35

40

45

дса

дее

аЪа

Ьдд

еес

дае

дда

асе

ааа

ааа

еас

еае

аса

дас

есс

дед

192

А1а

Уа1

Не

Тгр

РЬе

Авр

С1у

ТЬг

Ьув

Ьув

Туг

Туг

ТЬг

Авр

Зег

Уа1

50

55

60

аад

ддс

ада

еес

асе

асе

еес

ада

дас

ааЬ

есс

аад

аас

аеа

сЬд

ЪаЬ

240

Ьуэ

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Авр

Ав η

Зег

Ьув

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

сед

саа

аед

аас

асе

сед

ада

дсе

дад

дас

асд

дсе

д^д

еае

еас

еде

288

Ьеи

С1п

МеЬ

Азп.

ТЬг

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

АХа

УаХ

Туг

Туг

Сув

85

90

95

дед

ада

дае

адд

ддь

аса

дда

дсе

едд

едд

ддд

сед

еас

еас

аед

дас

336

А1а

Агд

Авр

Агд

(31у

Не

<31у

А1а

Агд

Агд

С1у

Рго

Туг

Туг

Мее

Азр

100

105

110

дЬс

*дд

ддс

ааа

ддд

асе

асд

дЪс

асе

дес

есс

еса

372

Уа1

Тгр

О1у

Ьув

е1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115 120 <210> 39 <211> 124 <212> ПРТ <213> Человек <400> 39

(31п

νβΐ

(31п

ьеи

Уа1

<Э1и

Зег

(31у

(31у

θίγ

Уа1

ЛГаХ

<51п

Рго

51у

Агд

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег-

С1у

РЬе

А1а

РЬе

Зег

Зег

Туг

20

25

30

СХу

МеС

Н1з

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьув

СХу

Ьеи

О1и

Тгр

Уа1

35

40

45

А1а

Уа1

11е

Тгр

РЬе

Азр

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьув

туг

Туг

ТЬг

Авр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

СХу

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

О1п

Мее

Азп

ТЬг

Ьеи

Агд

А1а

<Э1и

Авр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

- 83 017611

А1а Агд Азр Агд С1у Не С1у А1а Агд Агд 01у Рго Туг Туг Мее Азр

100 105 110

Уа1 Тгр <31у Ьуз <31у ТЫ ТЫ Уа1 ТЫ Уа1 Зег Зег

115 120 <210 40 <211> 324 <212> ДНК <213> Человек <220>

<221> У_область <222> (1)..(324) <223> ΝΙ-101.12Ρ6Α- последовательность вариабельной области карра (Укарра) легкой цепи <220 <221> СО5 <222> (1)..(324) <400> 40

дас

аес

сад

аед

асе

сад

есе

сса

есс

есс

сед

есе

деа

есе

деа

дда

48

Аер

Не

С1п.

Мее

ТЬг

<51п

бег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1

61у

1

5

10

15

дас

ада

дес

асе

аЪс

асе

еде

едд

деа

аде

сад

аде

аее

аде

аде

еае

96

Азр

Агд

Уа1

ты

Не

ТЫ

Суз

Агд

А1а

Зег

<31п

Зег

Не

Зег

Зег

Туг

20

25

30

ееа

аае

едд

еае

саа

сад

ааа

сса

ддд

ааа

дсс

ссе

аад

сес

сед

аес

144

ьеи

Азп

тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

РГО

С1у

ьув

А1а

РГО

ьуз

Ьеи

Ьеи

Не

35

40

45

еае

дсе

деа

есс

аде

еед

саа

аде

ддд

дес

сса

еса

адд

еес

аде

ддс

192

Туг

А1а

А1а

Зег

Зег

Ьеи

О1п

Зег

61у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

50

55

60

аде

дда

есе

ддд

аса

дае

еес

асе

сес

асе

аес

аде

аде

сед

саа

ссС

240

Зег

<31у

Зег

01у

ТЫ

Αερ

РЬе

ТЫ

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьеи

С1п

Рго

65

70

75

80

даа

дае

еее

деа

асе

еае

еае

еде

сад

сад

аде

Сае

аде

асе

ссе

сес

288

С1и	Азр	РЬе	А1а	ТЬг	Туг	Туг	Суз	а1п	(31η.	Зег	Туг Зег ТЬг Рго Ьеи
				65					90		95
асС	ЪЪс	ддс	дда	ддд	асе	аад	д^д	д*д	аСс	ааа	едб
ТЬг	РЬе	С1у	С1у	<31у	ТЬг	Ьуз	Уа1	<31и	11е	Ьуз	Агд

100 105 <210> 41 <211> 108 <212> ПРТ <213> Человек <400> 41

Азр

11е

С1п

Мек

ТЬг

<Э1п

Зег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1

С1у

1

5

10

15

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Агд

А1а

Зег

С1п

Зег

11е

Зег

Зег

Туг

20

25

30

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

(31п

Θΐη

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

А1а

А1а

Зег

Зег

Ьеи

<Э1п

Зег

<31у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

б1у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

О1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

С1п

Рго

65

70

75

80

С1и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

С1п

С1п

Зег

Туг

Зег

ТЬг

Рго

Ьеи

85

90

95

ТЫ

РЬе

31у

С1у

<31у

ТЬг

ьуз

Уа1

(31и

11е

Ьуз

Агд

100

105

<210> 42 <211> 121 <212> ПРТ <213> Человек <220>

<221> Уобласть <222> (1)..(121) <223> N1-101.1 ЗА- последовательность вариабельной области тяжелой цепи

- 85 017611 <400> 42

<31п

Уа1

С1п

Ьеи

С31п

(Пи

Зег

С31у

РГО

(31у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

Зег

О1и

1

5

10

15

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

Уа1

Зег

О1у

61у

Зег

11е

Зег

Агд

Агд

20

25

30

Зег

Туг

Туг

Тгр

С1у

Тгр

Не

Агд

С1п

Зег

Рго

С1у

Ьуз

еху

Ьеи

<Э1и

35

40

45

Тгр

Зег

аху

Зег

11е

Нхз

Туг

Зег

ЗХу

Зег

ТЬг

Туг

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

νβΐ

ТЬг

Не

Зег

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

ьуз

АЗП

61п

РЬе

65

70

75

80

8ег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

А1а

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Зег

Агд

Тгр

С1у

Зег

Зег

Тгр

Уа1

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

100

105

110

С1п

<31у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115 120 <210> 43 <211> 121 <212> ПРТ <213> Человек <220>

<221> У_область <222> (1)..(121) <223> N1-101.13В- последовательность вариабельной области тяжелой цепи <400> 43

Уа1 1

31п

Ьеи 31п О1и 5

Зег С1у

Рго <Э1у 10

Ьеи Уа1

Ьуз

Рго

Зег 15

СЭ1и

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

Уа1

Зег

<31у

<31у

Зег

Не

Зег

Агд

Агд

20

25

30

Зег

Туг

Туг

Тгр

<31у

Тгр

11е

Агд

<31п

Зег

Рго

О1у

Ьув

□1у

Ьеи

□1и

35

40

45

- 86 017611

Тгр

5ег 50

С1у 5ег

11е ΗΪ8

Туг Зег С51у Зег ТЬг Туг Туг Азп Рго Зег

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Уа1

ТЬг

11е

Зег

Уа1

Аар

ТЬг

Зег

Ьуа

АЗП

О1П

₽Ье

65

70

75

60

8ег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

бег

Уа1

ТЬг

А1а

А1а

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Зег

Агд

Тхр

<Э1у

Зег

Зег

Тгр

Уа1

РЬе

Азр

Туг

Тгр

31у

100

105

но

Θΐη

&1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210> 44 <211> 107 <212> ПРТ <213> Человек <220 <221> У_область <222> (1). (107) <223> N1-101.13А- последовательность вариабельной области легкой цепи <400 44

Азр 1

11е С1п Ьеи ТЬг <Э1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1

61у

5

10

15

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

Агд

А1а

Зег

61п

Зег

Не

Зег

зех

туг

20

25

30

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

С1п

61п

Ьуз

Рго

01у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

А1а

А1а

Зег

Зех

Ьеи

С1п

Зех

<31у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

<31у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

61у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

тьх

Не

Зег

Зег

Ьеи

01л

Рго

65

70

75

80

С1и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

С1п

О1л

Зег

Туг

Зег

ТЬг

Агд

ТЬг

85

90

95

РЬе

С1у

31л

<31у

ТЬг

Ьуз

Уа1

31и

11е

Ьуз

Агд

100

105

<210> 45 <211> 108 <212> ПРТ <213> Человек <220>

<221> У_область <222> (1)..(108) <223> N1-101.13В- последовательность вариабельной области легкой цепи <400> 45

Авр

Не

Ст1п

Ьеи

ТЬг

(31п

Зег

Рго

Зег

ТЬг

ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1

С1у

1

5

10

15

Авр

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

Агд

А1а

Зег

С1п

зег

Не

Зег

Зег

Тгр

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

<31п

О1П

Не

Рго

61у

Ьуз

А1а

Рго

Ьув

Ьеи.

Ъеи

Не

35

40

45

ΛΊ

С>

<3

Т -г-ч.

ζ-*Ί ч.

<3

Т7- Ί

__

«у о

-ГТХСЯ

ли

чзхУ

уах

Х-4.·-·

|ДСЬ

«гд

гие

вех

•лху

50

55

60

Зег

С51у

Зег

31у

ТЬг

С1и

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьеи

<Э1п

Рго

65

70

75

80

Авр

Авр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

(31п

С1п

Туг

Ави

Зег

туг

Зег

Агд

35

90

95

ТЬг

РЬе

О1у

С1п

С1у

ТЬг

Ъув

Ъеи

С1и

Не

Ьув

Агд

100 105 <210> 46 <211> 11 <212> ПРТ <213> Человек <220>

<223> гмпервариабельный участок <220>

<221> Ошибка нуклеотидной последовательности

- 88 017611 <222> (1)..(11) <223 > Значение последовательностей гипервариабельного участка белка в номенклатуре КаЬаг для N1-101.13А-последовательности вариабельной области легкой цепи, СЭК1 <400> 46

Агд А1а Зег <Э1п Зег 11е Зег Зег Туг Ьеи Азп

10 <210> 47 <211> 7 <212> ПРТ <213> Человек <220>

<223 > гипервариабельный участок <220>

<221> Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1)..(7) <223 > Значение последовательностей гипервариабельного участка белка в номенклатуре КаЬа!

для N1-101.13А- последовательности вариабельной области легкой цепи, СОЕ2 <400> 47

А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег

5 <210> 48 <211> 8 <212> ПРТ <213> Человек <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

<221> Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1)..(8)

- 89 017611 <223> Значение последовательностей гипервариабельного участка бежав номенклатуре КаЬа1 для N1-101.13А- последовательности вариабельной области легкой цепи, СОЕЗ <400> 48

В1П С1п Зег Туг Зег ТЬг Агд ТЫ

5 <210> 49 <211> 11 <212> ПРТ <213> Человек <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

<221 > Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1)..(11) <223?* ЗнэчбнЗ'ШПоследовйтсльностбй’ гигтвртйя.рм’аб&пъного участка белка в номенклатуре ЬСа для N1-101.13В- последовательности вариабельной области легкой цепи, ΟϋΚΙ <400> 49

Агд А1а Зег С1п Зег Не Зег Зег Тгр Ьеи А1а

10 <210> 50 <211> 7 <212> ПРТ <213> Человек <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

<221> Ошибка нуклеотидной последовательности <222> (1)..(7) <223> Значение последовательностей гипервариабельного участка белка в номенклатуре КаЬа!

- 90 017611 для N1-101.13В- последовательности вариабельной области легкой цепи, СЭК2 <400> 50

Ьуз А1а Зег Зег ьеи О1и 5ег

5 <210> 51 <211> 9 <212> ПРТ <213> Человек <220>

<223> гипервариабельный участок <220>

<221 > Ошибка нуклеотидной последовательности <222> ¢1)..(9) <223> Значение последовательностей гипервариабельного участка белка в номенклатуре КаЪа! для N1-101.13В- последовательности вариабельной области легкой цепи, СО КЗ <400> 51 <31п 61п Туг Азп Зег Туг Зег Агд ТЬг

5 <210> 52 <211> 363 <212> ДНК <213> Человек <220>

<221> У_область <222> (1)..(363) <223> N1-101.13А- последовательность вариабельной области тяжелой цепи <400> 52 саддьдсада ьдсаддадсс дддсссадда сьддьдаадс ссьсддадаа ссСдЬсссЪс60 ассЬдсасЬд ЪсЬсЬддЬдд сЬссаСсадс адаадаадЫ: асЬасЪдддд сЪддаьссдс120 садЪссссад ддааддддсе ддадЬддадЪ ддаадЪаЬсс аЬСаЪадсдд дадсассЬас180

- 91 017611

Расаасссд»;	ссс^саадад	ЪсдадЪсасс	аСаССЪдЪад	асасдЬссаа	даассад^Сс	240
есесъдааас	СдадсС-С^дъ	Ъассдссдса	дасасддспд	ЬсьаЬЁасед	ьдсдадаЬса	300
сдЬЬддддса	дсадсЪдддЬ	аЬЪЪдасЪас	Ьдддэссадд	даасссЬддь	сассдЪсьсс	360
£сд						363

<210> 53 <211> 363 <212> ДНК <213> Человек <220>

<221> Уобласть <222> (1)..(363) <223> N1-101.13В- последовательность вариабельной области тяжелой цели <400> 53

саддЬдсадс	ьдсаддадЬс	дддсссадда	С^ддЬдаадс	сСЬсддадас	ссСдЪсссЪс	60
ассЪдсасЪд	ЪсесъддЪдд	сРссаЪсадс	адаадаадъь	асьаседддд	оьддаьссдс	120
садРссссад	ддааддддсР	ддадЬддадс	ддаадЪаосс	аРЬаЬадсдд	дадсассс.ас	180
ЬасаасссдЬ	сссЬсаадад	ЪсдадЪсасс	аЪаЪсЪдЬад	асасдЬссаа	даассадЬЬс	240
СсссЪдааас	£дадс£с£д£	Ъассдссдса	дасасддс^д	ЪсЪа^СасРд	едсдадаСса	300
сдСЪддддса	дсадсЬдддС	аЬЪЪдасРас	рддддссадд	даасссЬддЬ	сассдЪсЪсс	360
Ьсд						363

<210> 54 <211> 324 <212> ДНК <213> Человек <220>

<221> У_областъ <222> (1)..(324) <223> N1-101.13А- последовательность вариабельной области легкой цепи <400> 54 дасаъссадъ ъдасссадРс ЬссаЬссЬсс сЪдЪсЬдсаС сЬдЬаддада сададРсасс 60 а^сасЪЕдсс дддсаадрса дадсашадс адсЪа££Ьаа аъЬддЬаЬса дсадааасса 120

- 92 017611

дддааадссс	сСаадсСссС	даСсСаСдсЪ	дсаСссадСС	ЪдсааадСдд	ддСсссаСса	180
аддсСсадЬд	дсадСддаСс	СдддасадаС	СЪсасссЬса	ссаЬсадсад	ссъдсаассС	240
даадаыхсд	саасЫзасСа	ссдСсаасад	адЬСасадСа	ссадаасдСС	сддссааддд	300
ассааддСдд	адаСсааасд	Саед				324
<210>	55
<211>	327
<212>	ДНК
<213>	Человек
<220>
<221>	У_область
<222>	(1)..(327)
<223>	N1- 101.13В- последовательность вариабельной области легкой цепи
<400>	55
дасасссадС	Сдасссадьс	СссССссасс	ссдссьдсас	сЬдСаддада	сададСсасс	60
ассасссдсс	дддссадьса	дадсасхаде	адссддссдд	ссСддьаСса	дсадаЪЬсса	120
	с Сааде СссС	даЪсСаСаад	ηοπΡ γΊ ялИ’ □ '•э '“Э “	СадааадСдд	ддЪсссаЪса	18 0
аддССсадсд	дсадСддаСс	Ьдддасадаа	ССсасЬсЬса	ссаСсадсад	сссдсадссе	240
дасдаьыхд	саасССаьСа	сСдссаасад	еасаасадсе	аЪЬсСсдаас	дССсддссаа	300
дддассаадс	^ддадаСсаа	асдСасд				327
<210>	56
<211>	372
<212>	ДНК
<213>	Человек
<220>
<221>	У_область
<222>	(1)-(372)
<223>	N1-101.11- последовательность вариабельной области тяжелой цепи
<400>	56
даддьдсадс	сддсдсадсс	ьдддддаддс	дСддьссадс	ссдддаддъс	ссСдадасЬс	60
СссСдСдсад	сдЬсСддаЬЬ	сдссЪЬсадЬ	адсСаСддса	ЬдсасЬддде	ссдссаддсЪ	120
ссаддсаадд	ддсСддадСд	ддСддсадСС	аСаСддСССд	аСддаасСаа	ааааСасСаС	180
асадасСссд	Сдаадддсад	аССсассаСс	Сссададаса	аССссаадаа	сасасСдСаС	240
сЪдсааасда	асассссдад	адссдаддас	асддсСд&дс	аССассдСдс	дададаЪадд	300
ддСаСаддад	сьсддсдддд	дссдсасЬас	аеддасдСсс	ддддсааадд	дассасддъс	360
ассдЪссссЬ	са					372

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (27)

1. Выделенное антитело, которое специфично связывается с неоэпитопом белка, ассоциированного с расстройством, но, по существу, не узнает указанный белок в его форме, не ассоциированной с расстройством, где указанное расстройство является неврологическим расстройством и указанное антитело связывает бета-амилоидные бляшки, цереброваскулярный амилоид, диффузные бета-амилоидные отложения, нейрофибриллярные клубки, гиперфосфорилированный тау-протеин, положительные на альфасинуклеин тельца Леви или белковые агрегаты, связанные с дистрофичными нейритами, где указанное антитело или кодирующая его кДНК происходит из Β-клеток или клеток памяти, полученных от пациента с отсутствием симптомов, но подверженного риску развития заболевания, или от пациента с необычно стабильным течением заболевания, и где антитело идентифицировано путем связывания с препаратом патологически измененных клеток или ткани с заранее определенными клиническими характеристиками, причем указанное антитело содержит последовательности УН и УЪ области, выбранные из группы, включающей 8ЕО ΙΌ 4 и 8ЕО ΙΌ 8, 8ЕО ΙΌ 6 и 8ЕО ΙΌ 8, 8ЕО ΙΌ 10 и 8ЕО ΙΌ

12, 8ЕО ΙΌ ^: 14 и 8ЕО ΙΌ ^: 16, 8ЕО ΙΌ ^: 39 и 8ЕО ΙΌ ^: 41, 8ЕО ΙΌ ^: 42 и 8ЕО ΙΌ №: 44, 8ЕО ΙΌ ^: 43 и 8ЕО ΙΌ ^: 45.

- 93 017611

2. Антитело по п.1, которое способно связывать бета-амилоидные фибрилы, но не бета-амилоидные мономеры.

3. Антитело по любому из пп.1, 2, которое выбрано из группы, включающей одноцепочечный Εν фрагмент (δοΕν), Е(аЬ') фрагмент, Е(аЬ) фрагмент и Е(аЬ')₂ фрагмент.

4. Антитело по любому из пп.1-3, которое представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий последовательность аминокислот УН и/или УЪ области, каждый из которых содержит три гипервариабельных участка (СОЯ) и где по крайней мере один из шести СОЯ указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит последовательность аминокислот, как это показано в табл. 4 описания, или включает последовательность аминокислот УН и/или УЪ области, как показано в табл. 2 и 3 описания.

5. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое:

а) специфично связывается с тем же неоэпитопом бета-амилоида, что и антитела сравнения, где антитело сравнения содержит последовательности УН и УЪ области, выбранные из группы, включающей ^ЕО ΙΌ N0: 4 и 8Ер ΙΌ N0: 8, 8Ер ΙΌ N0: 6 и ^ЕО ΙΌ N0: 8, ^ЕО ΙΌ N0: 10 и ^ЕО ΙΌ N0: 12, ^ЕО ΙΌ N0: 14 и ^ЕО ΙΌ N0: 16, ^ЕО ΙΌ N0: 39 и ^ЕО ΙΌ N0: 41, ^ЕО ΙΌ N0: 42 и ^ЕО ΙΌ N0: 44, ^ЕО ΙΌ N0: 43 и ^ЕО ΙΌ N0: 45;

б) конкурентно ингибирует связывание неоэпитопа бета-амилоида и антител сравнения, где антитела сравнения содержат последовательности УН и УЪ области, выбранные из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 4 и ^ЕО ΙΌ N0: 8, ^ЕО ΙΌ N0: 6 и ^ЕО ΙΌ N0: 8, ^ЕО ΙΌ N0: 10 и ^ЕО ΙΌ N0: 12, ^ЕО ΙΌ N0: 14 и ^ЕО ΙΌ N0: 16, ^ЕО ΙΌ N0: 39 и ^ЕО ΙΌ N0: 41, ^ЕО ΙΌ N0: 42 и ^ЕО ΙΌ N0: 44, ^ЕО ΙΌ N0: 43 и 8Е0 ΙΌ N0: 45; или

с) содержит антигенсвязывающий фрагмент, идентичный антигенсвязывающему фрагменту антитела, которое содержит последовательности УН и УЪ области, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 4 и ^ЕО ΙΌ N0: 8, ^ЕО ΙΌ N0: 6 и ^ЕО ΙΌ N0: 8, ^ЕО ΙΌ N0: 10 и ^ЕО ΙΌ N0: 12, ^ЕО ΙΌ N0: 14 и ^ЕО ΙΌ N0: 16, ^ЕО ΙΌ N0: 39 и ^ЕО ΙΌ N0: 41, ^ЕО ΙΌ N0: 42 и ^ЕО ΙΌ N0: 44, ^ЕО ΙΌ N0: 43 и ^ЕО ΙΌ N0: 45.

6. Полинуклеотид, кодирующий антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-5.

7. Полинуклеотид по п.6, кодирующий, по меньшей мере, вариабельную область цепи иммуноглобулина антитела или связывающего фрагмента по любому из пп.1-5.

8. Вектор, включающий полинуклеотид по п.7.

9. Клетка-хозяин, включающая полинуклеотид по п.6 или 7 или вектор по п.8.

10. Способ получения специфично связывающего бета-амилоид антитела или его антигенсвязывающего фрагмента либо по меньшей мере одной цепи иммуноглобулина, связывающего вышеуказанный белок, включающий:

а) культивирование клетки по п.9 и

б) выделение указанной связывающей молекулы, антитела или его связывающего фрагмента либо по меньшей мере одной цепи иммуноглобулина из культуры.

11. Антитело, цепь иммуноглобулина или их связывающий фрагмент, кодируемые полинуклеотидом по п.6 или 7 или полученные способом по п.10.

12. Антитело или связывающий фрагмент по любому из пп.1-5 или 11, которые содержат:

а) детектируемую метку или

б) связаны с лекарственным средством.

13. Антитело или связывающий фрагмент по п.12, в которых указанная детектируемая метка выбрана из группы, включающей фермент, радиоактивный изотоп, флуорофор и тяжелый металл.

14. Композиция, включающая антитело или связывающий фрагмент по любому из пп.1-5, 11 или 13.

15. Композиция, включающая полинуклеотид по п.6 или 7.

16. Композиция, включающая вектор по п.8.

17. Композиция, включающая клетку-хозяин по п.9.

18. Композиция по любому из пп.14-17, которая:

а) является фармацевтической композицией и дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель или

б) является диагностической и дополнительно включает реактивы, обычно применяемые в иммунологических или основанных на нуклеиновых кислотах способах диагностики.

19. Композиция по любому из пп.14-18, которая дополнительно включает дополнительный агент, эффективный для лечения болезни Альцгеймера и выбранный из группы, включающей малые органические молекулы, анти-бета-амилоидное антитело и их комбинации.

20. Композиция по любому из пп.14-19, которая является фармацевтической композицией для лечения неврологического расстройства, характеризующегося аномальным накоплением и/или отложением белка в центральной нервной системе.

21. Композиция по п.20, в которой указанное расстройство выбрано из группы, включающей болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, умеренное когнитивное нарушение, церебральную амилоидную ан

- 94 017611 гиопатию, сосудистую деменцию, мультиинфарктную деменцию, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, болезнь Крейцфельда-Якоба, кистозный фиброз и болезнь Гоше.

22. Композиция по п.20, в которой введение осуществляют способом, выбранным из группы, включающей внутривенное, внутримышечное, подкожное, интраперитонеальное, интраназальное, парентеральное введения и введение в виде аэрозоля.

23. Применение антитела или связывающего фрагмента по любому из пп.1-5, 11 или 13 для получения фармацевтической или диагностической композиции для лечения или профилактики прогрессирования болезни Альцгеймера, и/или для снижения выраженности симптомов, связанных с болезнью Альцгеймера, и/или для диагностирования или скрининга организма субъекта на наличие болезни Альцгеймера, и/или для установления риска развития болезни Альцгеймера.

24. Применение полинуклеотида по п.6 или 7 для получения фармацевтической или диагностической композиции для лечения или профилактики прогрессирования болезни Альцгеймера, и/или для снижения выраженности симптомов, связанных с болезнью Альцгеймера, и/или для диагностирования или скрининга организма субъекта на наличие болезни Альцгеймера, и/или для установления риска развития болезни Альцгеймера у субъекта.

25. Применение вектора по п.8 для получения фармацевтической или диагностической композиции для лечения или профилактики прогрессирования болезни Альцгеймера и/или для снижения выраженности симптомов, связанных с болезнью Альцгеймера, и/или для диагностирования или скрининга организма субъекта на наличие болезни Альцгеймера, и/или для установления риска развития болезни Альцгеймера у субъекта.

26. Применение клетки-хозяина по п.9 для получения фармацевтической или диагностической композиции для лечения или профилактики прогрессирования болезни Альцгеймера, и/или для снижения выраженности симптомов, связанных с болезнью Альцгеймера, и/или для диагностирования или скрининга организма субъекта на наличие болезни Альцгеймера, и/или для установления риска развития болезни Альцгеймера у субъекта.

27. Применение по любому из пп.23-26, в котором указанную фармацевтическую композицию вводят способом, выбранным из группы, включающей внутривенное, внутримышечное, подкожное, интраперитонеальное, интраназальное, парентеральное введения и введение в виде аэрозоля.