EA014531B1

EA014531B1 - Антиамилоидные иммуногенные композиции, способы и применения

Info

Publication number: EA014531B1
Application number: EA200801735A
Authority: EA
Inventors: Симоне Оттонелло; Надя Моретто; Бруно Пьетро Имбимбо; Джино Виллетти
Original assignee: КЬЕЗИ ФАРМАЧЕУТИЧИ С.п.А.
Priority date: 2006-02-24
Filing date: 2007-02-13
Publication date: 2010-12-30
Also published as: AU2007218318A1; EA200801735A1; US20090186033A1; HK1128614A1; JP5161796B2; MX2008010633A; US7507710B2; EP1996227A2; CN101384279B; US20070224190A1; ZA200807228B; WO2007096076A2; CN101384279A; BRPI0706818A2; WO2007096076A3; JP2009531294A; CA2638841A1; KR20080097188A

Abstract

В изобретении предложена рекомбинантная иммуногенная конструкция, полученная путем тандемной мультимеризации фрагмента Аβ42, несущего В-клеточный эпитоп, внутри активного петлевого участка носителя (участка дисплея), предпочтительно бактериального тиоредоксина (Trx). Полипептиды, несущие множественные копии фрагментов Аβ42, предпочтительно с расположенным между ними аминокислотным линкером, были сконструированы и инъецированы мышам в сочетании с адъювантом. Было обнаружено, что индуцированные антитела избирательно связываются с фибриллярными и/или олигомерными Аβ внутри нейритных AD-бляшек.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к иммуногенным конструкциям, содержащим фрагмент Αβ42 и носитель, отличающимся тем, что указанный фрагмент расположен в пределах активного петлевого участка (экспонированного участка) носителя, к способу их получения и к их применениям.

Предшествующий уровень техники

Амилоидогенные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера (АО), признаны основной причиной деменции у пожилых людей. Снижение когнитивных способностей при АО связано с гистопатологическими изменениями в головном мозге, причем наиболее значимым является образование амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков.

Хотя амилоидные бляшки содержат многие белки, их основным составляющим является пептид амилоид-β (Ав). Образование Ав-пептида и, следовательно, Ав-амилоидных бляшек происходит в результате аберрантного процессинга амилоидного белка-предшественника (АРР).

В настоящее время разработано несколько фармакологических подходов к замедлению или реверсированию развития АО. Хотя некоторые подходы направлены на ингибирование метаболического генерирования Ав-пептида, другие направлены на предотвращение агрегации Ав-амилоида в головном мозге пациентов, пораженных АО.

Однако наиболее перспективные подходы направлены на повышение клиренса Ав-бляшек в головном мозге посредством введения либо антигенов, способных генерировать иммунный ответ против Ав (активная иммунизация), либо антител, направленных против Ав (пассивная иммунизация).

Антигены или иммуногены обычно представляют собой макромолекулы, содержащие отдельные антигенные участки или эпитопы, которые распознаются различными компонентами иммунной системы и взаимодействуют с ними. Они обычно содержат малую молекулу или гаптен, такую как короткий пептид, связанную с подходящим носителем. Носители обычно представляют собой белки с более высокой молекулярной массой, которые способны вызвать иммунный ответ при введении ίη νίνο.

При иммунном ответе антитела продуцируются и секретируются В-лимфоцитами в сочетании с Тхелперными (ТН) клетками. В большинстве систем гаптен-носитель В-клетки продуцируют антитела, специфичные как к гаптену, так и к носителю. В этих случаях Т-лимфоциты будут иметь специфичные связывающие домены на носителе, но не будут распознавать гаптен сам по себе. В случае синергизма Ви Т-клетки содействуют друг с другом в индукции гаптен-специфичного антительного ответа.

Следовательно, при конструировании эффективного антигена выбор подходящего носителя и подходящего гаптена является критическим для гарантии надежного и селективного иммунного ответа. Безопасность антигена является также критически важной. Например, введение пациентам с АО перспективной вакцины ΛΝ-1792. состоящей из предварительно агрегированного Ав42 и иммунного адъюванта 08-21, привело к тяжелому менингоэнцефалиту у примерно 6% субъектов, прошедших лечение. В качестве потенциальных механизмов токсичности были предложена как центральная активация цитотоксических Т-клеток, так и аутоиммунные реакции. Иммунологический ответ против эндогенного мономерного Ав может быть вредным, поскольку неагрегированные молекулы Ав играют физиологическую роль в активности нейронов.

Таким образом, огромную важность имеет правильный выбор как гаптена, так и носителя для гарантии селективности антитела в отношении вредных молекул Ав и для предотвращения аутоиммунной токсичности.

В XVО 2005058940 предложена конъюгация пептидного иммуногена, содержащего Ав пептид или его фрагмент, с белковым/полипептидным носителем.

Иммуногенные конструкции получают химическим способом, включающим дериватизацию функциональных групп аминокислотных остатков носителя, где любые неконъюгированные дериватизированные функциональные группы аминокислотных остатков инактивированы посредством кэппирования с целью блокирования их взаимодействия с другими молекулами. Такой способ приводит в результате к иммуногенам, где фрагмент Ав связан с аминокислотными боковыми цепями носителя. Хотя в νθ 2005058940 предложено несколько различных носителей и гаптенов, их гистопатологическая эффективность ίη νίνο не показана.

В К1т, НГО. е1 а1. Вюейет. ВюрБук, Век. Соттип. Уо1ите 336, р. 84-92 предлагается анти-Ав ДНКвакцина, состоящая из бескаркасных 11-кратных повторов Ав1-6.

Такая конструкция инициировала антитела, которые одинаково распознавали мономерные, олигомерные и фибриллярные Ав42.

Вообще говоря, селективная направленность иммуногенов против разных состояний сборки Ав42 (мономеров, олигомеров или фибрилл) до настоящего времени не была достигнута.

В свете вышеизложенных соображений все еще остается необходимость в разработке безопасной и эффективной иммуногенной конструкции, которую можно использовать в композициях для терапевтической вакцинации для предотвращения агрегации Ав-амилоида в головном мозге пациентов, пораженных АО или другими амилоидогенными заболеваниями, такими как синдром Дауна.

В настоящем изобретении предложена рекомбинантная иммуногенная конструкция, отличающаяся

- 1 014531 тем, что фрагменты Αβ расположены в активном петлевом участке (экспонированном участке) носителя вероятнее, а не связаны с концами носителя. Указанный пептид получают посредством тандемной мультимеризации В-клеточного эпитопа, несущего фрагмент Άβ42, в активном петлевом участке (экспонированном участке) носителя, предпочтительно тиоредоксина (Тгх).

Было обнаружено, что иммуногены по настоящему изобретению инициируют антитела, распознающие нейротоксические олигомерные молекулы Άβ-амилоида, которые, как недавно было показано, являются наиболее непосредственными причинными факторами амилоидогенных заболеваний.

Эта способность связана с конструкцией иммуногена, характерным признаком которого является расположение Άβ амилоида в рамках носителя. Такая конфигурация в некоторой степени обеспечивает правильную укладку иммуногенного белка и более эффективно презентирует его иммунной системе. Когда иммуноген несет более чем один Άβ-амилоидный фрагмент, и, в частности, конкретное число указанных фрагментов, сходство иммуногена с Άβ-амилоидными олигомерами, как представляется, дополнительно улучшает его эффективность, а также повышает селективность.

Линкер между носителем и фрагментами дополнительно способствует сохранению определенного состояния сборки пептидных эпитопов.

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем изобретении предложена иммуногенная конструкция (также указанная здесь ниже как иммуноген), содержащая фрагмент, несущий иммунодоминантный В-клеточный эпитоп Άβ42 и носитель, отличающаяся тем, что указанный фрагмент расположен в активном петлевом участке (экспонированном участке) носителя. Носитель предпочтительно представляет собой тиоредоксин, тогда как Άβфрагмент предпочтительно представляет собой Ν-концевой фрагмент из менее чем 30 аминокислотных остатков, предпочтительно менее чем 20 аминокислот, более предпочтительно представляет собой Αβ115.

Еще более предпочтительно иммуногенная конструкция несет более чем один фрагмент, предпочтительно от 2 до 16, наиболее предпочтительно 4 фрагмента.

В настоящем изобретении также предложен способ конструирования указанного иммуногена, включающий тандемную мультимеризацию В-клеточного эпитопа, несущего фрагмент Άβ42, в экспонированном участке носителя, предпочтительно Ν-концевого фрагмента из менее чем 30 аминокислотных остатков, при помощи линкера.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая указанный иммуноген, для активной вакцинации против амилоидогенных заболеваний.

В еще одном аспекте в настоящем изобретении предложено применение указанного иммуногена для разработки антител, предпочтительно моноклональных антител, для применения в качестве пассивной вакцины против амилоидогенных заболеваний.

Описание графических материалов

На фиг. 1а показана конструкция Τηχ(Αβ 1-15-С1у-С1у-Рго)п по настоящему изобретению.

На фиг. 1б показана очистка до однородности посредством металл-аффинной хроматографии конструкций, несущих одну, четыре или восемь копий Αβ 1-15 на Тгх-экспонированном участке.

На фиг. 1в показаны уровни анти-Άβ антител, индуцируемых иммуногенами в соответствии с воплощениями настоящего изобретения.

На фиг. 1г показаны иммуногены ТЪ2-поляризованного ответа в соответствии с воплощениями настоящего изобретения.

На фиг. 2а-б-в показаны срезы головного мозга человека, обработанные сыворотками мышей, иммунизированных иммуногенами, в соответствии с воплощениями настоящего изобретения.

На фиг. 3 представлены изображения, полученные посредством ΑΕΜ, демонстрирующие предпочтительные связывания иммуногенов в соответствии с воплощениями настоящего изобретения.

Подробное описание предпочтительных воплощений

В настоящем изобретении предложена иммуногенная конструкция (или иммуноген), содержащая носитель, несущий по меньшей мере один фрагмент Άβ42. Указанный фрагмент расположен в экспонируемом на поверхности участке (активном петлевом участке или экспонированном участке) носителя, который конформационно его стабилизирует.

Точный размер и химическую однородность конструкции обычно определяют посредством как гель-электрофореза, так и масс-спектрометрии.

Структуру конструкции можно определить с помощью аналитических методик; однако, предпочтительно использовать ядерный магнитный резонанс (ЯМР).

Носитель предпочтительно представляет собой тиоредоксин (Тгх). Тгх является особенно подходящим благодаря его небольшому размеру (109 аминокислот), емкости пептидного экспонированного участка и способности действовать в качестве нетоксичного иммуноусилителя, способного стимулировать пролиферацию Т-клеток мышей. Однако можно использовать и другие носители.

Άβ-амилоидный фрагмент представляет собой Ν-концевой конец, преимущественно Ν-концевой фрагмент, имеющий менее 30 аминокислотных остатков, предпочтительно менее 20 аминокислот и более

- 2 014531 предпочтительно выбран из группы, состоящей из Αβ1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15, приведенных ниже в таблице 1, в соответствии с однобуквенным кодом для аминокислот. Предпочтительно Ав-амилоидный фрагмент представляет собой Ав 1-15.

Преимущественно иммуногенная конструкция по изобретению несет более чем один фрагмент, предпочтительно от 2 до 16, более предпочтительно 4 фрагмента.

В предпочтительном воплощении фрагменты связаны с носителем через линкер для предотвращения образования соединительных эпитопов. Указанный линкер представляет собой короткую аминокислотную последовательность, предпочтительно линкер, состоящий из 1-5 аминокислотных остатков, более предпочтительно Глицин-Глицин-Пролин (С1у-С1у-Рго). Однако можно использовать и другие линкеры, такие как Глицин-Пролин-Глицин-Пролин-Глицин (О1у-Рго-О1у-Рго-О1у) или Серин -ГлицинСерин-Глицин (8ег-О1у-8ег-О1у).

Предпочтительная иммуногенная конструкция состоит из тиоредоксина, связанного, возможно через подходящий линкер, с четырьмя фрагментами Ав 1-15, и упоминается здесь ниже как Тгх(Ав1-15)₄.

Способом конструирования указанного иммуногена является способ клонирования, который включает амплификацию носителя в подходящей бактерии, встраивание носителя в подходящий вектор, где указанный вектор содержит промотор Т7 для экспрессии белка через систему рЕТ; получение ДНКвставки Ав-фрагмента; рестрикцию и лигирование носителя-вектора и ДНК-вставки Ав-фрагмента.

Предпочтительно ДНК-вставка Ав-фрагмента содержит аминокислотный линкер.

Когда получают мультимеры, используют избыток ДНК-вставки Ав-фрагмента.

Таблица 1

Описание	Последовательность
Αβ1-3	БАЕ
Αβ1-4	БАЕЕ
Αβ1-5	БАЕРВ
Αβ1-6	ВАЕРВН
Αβ1-7	ϋΑΕΡΒΗϋ
Αβ1-8	ϋΑΕΡΒΗϋδ
Αβ1-9	ОАЕРВРЮЗС
Αβ1-10	ΟΑΕΡΒΗ080Υ
Αβ1-11	ΟΑΕΡΒΗϋδΘΥΕ
Αβ1-12	БАЕРВНОЗСУЕУ
Αβ1-13	БАЕРВНОЗОУЕУН
Αβ1-14	ϋΑΕΡΒΗϋδΟΥΕνΗΗ
Αβ1-15	ϋΑΕΡΒΗϋδΟΥΕνΗΗΟ

Оказалось, что предпочтительная иммуногенная конструкция по настоящему изобретению при инъекции один раз в месяц в течение 4 месяцев у трансгенных мышей, у которых была индуцирована вамилоидная патология головного мозга, уменьшает число и размер Ав-бляшек в гиппокампе и в коре головного мозга. Кроме того, было обнаружено, что предпочтительная иммуногенная конструкция по изобретению индуцирует образование антител, которые распознают определенные типы Ав42.

Указанные антитела при инъекции в гиппокамп способны устранять Ав42-положительные бляшки в гиппокампе и коре головного мозга трансгенных мышей, причем указанный эффект устранения особенно очевиден для олигомерных Ав. Было также обнаружено, что указанные антитела значительно улучшают Ав-ассоциированный астроглиоз (пример 2).

Соответственно, иммуногенные конструкции по настоящему изобретению могут составлять композиции для применения в качестве как активной, так и пассивной вакцины против амилоидогенных заболеваний.

Для активной вакцинации фармацевтическую композицию, содержащую иммуногенную конструкцию по изобретению, предпочтительно вводят в комбинации с адъювантом.

Выбор адъюванта и/или носителя зависит от стабильности вакцины, содержащей адъювант, пути введения, режима дозирования, эффективности адъюванта в отношении вакцинируемых видов, а у людей фармацевтически приемлемым адъювантом является такой, который был одобрен или может быть одобрен для введения людям соответствующими регулирующими органами. Например, полный адъювант Фрейнда непригоден для введения людям. Подходящие адъюванты включают 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А (МРЬ), мурамилдипептид и сапонины, такие как 0821 и 0ш1Л.

Предпочтительным классом адъювантов являются соли алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия. Дополнительные адъюванты включают цитокины, такие как интерлейкины (1Ь-1, 1Ь-2 и 1Ь-12), макрофагальный колониестимулирующий фактор (М-С8Е),

- 3 014531 фактор некроза опухоли (ТЛЕ).

Адъювант можно вводить с иммуногеном в виде единой композиции, либо его можно вводить до, одновременно с введением или после введения иммуногена. Возможно, два или более чем два различных адъюванта можно применять одновременно.

Иммуноген и адъювант могут быть упакованы и поставляться либо в одном и том же флаконе, либо они могут быть упакованы в отдельные флаконы и смешаны перед применением.

Фармацевтические композиции, содержащие иммуногенную конструкцию по изобретению, также могут включать ряд других фармацевтически приемлемых компонентов. См. Вет1ид1ои'8 Рйагтасеийса1 8с1еисе (15111 Еб., Маск РиЫщЫид Сотраиу, Еайои, Реиикукаша, 1980).

Предпочтительная фармацевтическая форма зависит от предполагаемого способа введения и от терапевтического применения. Композиции могут также включать, в зависимости от желательного препарата, фармацевтически приемлемые, нетоксичные носители или разбавители, которые определены как носители, обычно используемые для изготовления препаратов фармацевтических композиций для введения животным и людям.

Разбавитель выбирают таким образом, чтобы он не влиял на биологическую активность комбинации. Примерами таких разбавителей являются дистиллированная вода, физиологический фосфатнобуферный солевой раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и раствор Хэнка.

Для парентерального введения иммуногенную конструкцию по изобретению можно вводить в виде инъекционных доз раствора или суспензии вещества в физиологически приемлемом разбавителе с фармацевтическим носителем, который может представлять собой стерильную жидкость, такую как вода, масло, физиологический раствор, глицерин или этанол.

Кроме того, в композициях могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие агенты, поверхностно-активные вещества, рН-буферные вещества и тому подобное.

Композиции по изобретению можно готовить в виде инъекционных препаратов, либо в виде жидких растворов или суспензий; также можно изготовить твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией.

Иммуногенную конструкцию по изобретению можно вводить в форме депо-инъекции или имплантируемого препарата, который можно изготовить таким образом, чтобы он обеспечивал возможность пролонгированного высвобождения активного ингредиента.

Дополнительные препараты, пригодные для других способов введения, включают пероральные, интраназальные и легочные препараты, суппозитории и чрескожные препараты.

Для пассивной вакцинации композицию инъецируют млекопитающему, такому как морская свинка или другие виды животных, и полученные в результате антитела очищают, а затем инъецируют людям.

Предпочтительно антитела являются моноклональными, и их продуцируют путем иммунизации млекопитающего иммуногенной конструкцией Тгх(Ав1-15)₄. Указанные антитела применяют для предупреждения и лечения амилоидогенных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера.

Пример 1.

Получение различных иммуногенных конструкций ΤτχΑβ и оценка ех νίνο эффектов различных анти-ΤκχΑβ антител.

Для конструирования Тгх(Ав1-15)_и применяли стратегию клонирования, основанную на использовании избытка ДНК-вставки Λβ 1-15 по отношению к модифицированному реципиентному вектору, несущему кодирующую последовательность Тгх под контролем промотора фага Т7 (фиг. 1а). Конструкции, несущие одну, четыре или восемь копий Тгх-экспонированных Λβ1-15, выделяли и использовали для экспрессии соответствующих полипептидов, которые затем очищали до гомогенности посредством металл-аффинной хроматографии (фиг. 1б).

Эффективными для получения правильно собранных мультимеров Λβ1-15 были направленность и способность к слиянию в рамке уникального сайта Сро1, присутствующего в последовательности Тгх (положения нуклеотидов 99-105, соответствующие аминокислотным остаткам 34-35, идентифицированные как: 5'...СС/СТ(А)ССС...3'), а также включение в ДНК Λβ 1-15 концевой последовательности, кодирующей промежуточный линкер С1у-С1у-Рго, таким образом, также предотвращая образование соединительных эпитопов.

Четвертая конструкция (Τ^χΑβ42), несущая одну копию полноразмерного пептида Λβ42, была получена аналогично. Хотя все полипептиды Τ^χ(Аβ1-15)_η были растворимы, независимо от кратности Λβ31-15, большая часть белка Τ^χΑβ42 заканчивалась в тельцах включения в нерастворимой форме (не показано). Таким образом, оказалось, что Λβ42 является слаборастворимым даже при слиянии с Тгх в гетерологичном окружении бактериальных клеток.

Пять групп по 10 самцов мышей ВАЬВ/с обрабатывали 10 наномоль вышеописанных полипептидов Τ^χ(Аβ15)_η или эквивалентными количествами предварительно агрегированных синтетических Λβ42 или Τ^χΑβ42, все с добавлением квасцов, адъюванта, одобренного к применению у людей (фиг. 1в).

Две дополнительные группы, которым инъецировали только буфер (РВ8) или Αβ42 без квасцов,

- 4 014531 служили в качестве отрицательных контролен. Сыворотки собирали через две недели после четвертой инъекции, случайно объединяли в пары и анализировали посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8Л), используя агрегированный Άβ42 в качестве антигена-мишени. Как показано на фиг. 1в, средние уровни анти-Άβ антитела, индуцированные Ττχ(Άβ1-15)₄ и Ττχ(Άβ1-15)₈, но не ΤτχΑβ1-15, были значительно выше (Р<0,05), чем в ложно обработанных контролях и подобны уровням групп, обработанных Άβ42, где ΤτχΑβ42 функционировала так же, как свободный Άβ42.

Р представляет собой р-значение, связанное с ΐ-критерием на 1од трансформированном контроле, и экспериментальными данными с использованием байесовского анализа или стандартных отклонений; Р указывает на вероятность, с которой результат, полученный в статистическом тесте, является случайным скорее, чем действительным взаимоотношением между измерениями.

Сильный противовоспалительный Τй2-поляризованный ответ, типичный для квасцового адъюванта, был выявлен путем изотипного профилирования (фиг. 1г). Хотя преобладание иммуноглобулина класса С и подклассов 1 (1дС 1) наблюдалось со всеми антигенами, отношение 1дС1/1дС2 (иммуноглобулина класса С и подклассов 2) было воспроизводимо выше (Р<0,05) для мультимерных Ττχ(Άβ1-15)_η и ΤτχΑβ42 иммуноконъюгатов, чем для неконъюгированного Άβ42.

Затем была исследована способность антисывороток, генерируемых в ответ на Ττχ(Άβ1-15)_η связываться с амилоидными бляшками. Это свойство, в настоящее время рассматриваемое как наилучший прогностический показатель эффективности анти-Άβ антитела ίη νίνο, не является общим для всех ранее описанных анти-Άβ антисывороток (например т266 и других антител, нацеленных на С-концевой участок Άβ42).

Как показано на фиг. 2а-б, сыворотки от мышей, иммунизированных тетрамерной или октамерной формой Ττχ(Άβ1-15)_η, связывались с амилоидными бляшками вплоть до разведения 1/1000.

Большие нейритные бляшки, также как зрелые и незрелые бляшки, метили антимультимерными антителами Ττχ(Αβ1-15)_η, Более широкое иммунологическое окрашивание, в частности в сердцевинах сенильных бляшек, наблюдалось с положительным контролем зити-Рип β-амилоидной антисыворотки, генерируемой у кроликов с использованием Άβ40 в качестве антигена (не показано). Для сравнения, бляшки не были обнаружены ни с сыворотками от ложно обработанных животных (не показано), ни с сыворотками от мышей, иммунизированных мономерным ΤτχΑβ1-15 (фиг. 2в).

Наконец, иммуноблоты использовали для оценки функциональной активности различных антиΤτχ(Άβ1-15)_η антител в отношении разных состояний сборки Άβ42 (мономеров, олигомеров и фибрилл), генерируемых ίη νίίτο в определенных ранее условиях и подтвержденных атомно-силовой микроскопией (ΑΕΜ). Результаты данного анализа приведены на фиг. 3, где показано, что антитела 3Η™-Ττχ(Άβ1-15)₈связывают все три типа Άβ42, тогда как антитела 3ΚΓΉ-Ττχ(Άβ1-15)₄ преимущественно связывают как растворимые олигомеры, так и фибриллы, но не мономеры Άβ42. В резком противоречии с этим, антитела, индуцированные против мономерного антигена ΤτχΑβ1-15, не демонстрировали никакого связывания, а также не распознавали фибриллы Άβ42. Последнее наблюдение находится в соответствии с неспособностью этих антител распознавать агрегаты Άβ42 более высокого порядка в анализах ЕЫ8Л. а также Άβ-фибрилл в бляшках ΑΌ (см. фиг. 1в и 2в). Интересно, однако, что антимономерные антитела ΤτχΑβ115 связывают мономеры и олигомеры Άβ42 (фиг. 3). Ττχ(Άβ1-15)₄ представляет собой, таким образом, растворимое производное амилоида-β с отсутствующим Т-клеточным эпитопом с хорошей иммуногенной активностью, даже при включении в состав препарата с адъювантом умеренной силы, таким как квасцы, Α1(ΟΗ)₃. Также значимой является способность Ττχ(Άβ1-15)₄ генерировать антитела, которые связываются с синаптотоксическими олигомерами и фибриллами Άβ42, но не связываются с предположительно физиологическими мономерными Άβ.

Основными преимуществами Ττχ-άΡΙ по сравнению с другими стратегиями пептидной иммунизации являются их эффективности по времени и стоимости, отсутствие клеточной токсичности и выход химически гомогенных иммуноконъюгатов, однородность которых от партии к партии можно легко подтвердить. Кроме того, как только ведущий антиген идентифицирован, он легко поддается дальнейшей модификации, включающей введение дополнительных пептидных эпитопов и замещение вектора в целях ДНК-вакцинации.

Конструкции ΤτχΑβ. Последовательность, кодирующая тиоредоксин Е. ео1т была амплифицирована с помощью полимеразной цепной реакции (РСК) с использованием праймеров 1 и 2 (табл. 2), сконструированных для создания сайтов рестрикции №с1 и ВатН1. Άмплифицированный фрагмент был подвергнут двойному гидролизу ферментами рестрикции N60 и ВатН1 и лигирован с ρΕΤ28ϋ® (Νοναβοη), гидролизованными теми же двумя ферментами; полученный в результате вектор, обозначенный как рТ7Ка1'1Ττχ, содержит последовательность Н1§6-меченого по Ν- и С-концам варианта бактериального тиоредоксина вместе с маркером устойчивости к канамицину.

Уникальный сайт Сро1, присутствующий в Ττχ-кодирующей последовательности (положения нуклеотидов 99-105, соответствующие аминокислотным остаткам 34-35, идентифицированным как: 5'...СС/СΤ(Α)ССС...3'), использовали в качестве сайта клонирования.

- 5 014531

Эффективными для получения мультимеров Αβ1-15 являются направленность и способности к слиянию в рамке уникального сайта Сро1.

Инструментом для получения мультимеров Ав 1-15 являются способности к направленности и слиянию в рамке уникального сайта Сро1.

ρΤ7Καη-ΤτχΑβ1-15. Последовательность, кодирующая пептид АЦ1-15, Ν-концевой фрагмент амилоидного бета-пептида Ав42, была получена путем отжига фосфорилированных олигонуклеотидов:

5’СТСССАТССАТ6САСЛАТТСССАСАТСАСТСАССАТАТСААСТТСАТСАТСАА

ОвСС-3’ (по ходу)

3’ССТАССТАССТСТТААОССТСТАСТСАСТССТАТАСТТСААбТАСТАСТТСССС

СА6-5’ (против хода) несущих концевую последовательность распознавания Сро1. ДНК-вставка из 57 п.о. (пар оснований) (5'-выступающий Сро1) была лигирована с Сро1-гидролизованным рТ7Кап-Тгх, при молярном отношении вектор/вставка 1/10.

Ν-η4-6χΗΪ5-η10-ΤΒΧ(1·33)ΟΡΜΡΑΕΡΒΗΡ5ΘΥΕνΗΗΟΟ6ΡΊΉΧ(36-109)п15-6хН18-С

Полноразмерная последовательность представляет собой:

тдз8йЫ111НЙ88д17ргд811МСРК11НЬТРР5РРТРУЙКА0СА117РР^АЕ\Л1ССР

ΜΡΑΕΡΚΗΡδβΥΕνΗΗαΟΟΡΟΚΜΙΑΡΙίΡΕΙΑΡΕΥαΟΚίΤνΑΚίΝΙΡαΝΡΟΤΑΡΚΥ

С1КО1РТ1-[-1-ЕК14СЕУААТКУ(ЗА1.8КСС11-КЕР1-РАЫ1.Нс1рп588И1к1ааа1е11п1111пН

Основные признаки конструкции ΤτχΑβ1-15 касаются присутствия остатка Ме1(М) на Ν-конце пептида Αβ 1-15, линкера О1у-О1у-Рто на С-конце пептида Ав 1-15 и последовательностей, кодирующих Ηίκόмеченый по Ν- и С-концам вариант бактериального тиоредоксина.

рТ7Кап-Тгх(Ар1-15)₄ и рТ7Кап-Тгх(Ар1-15)_е.

Конструкции, несущие большее количество копий пептида Ав 1-15, были получены аналогично, но при молярном отношении вектор/вставка 1/100. Рекомбинантные клоны подвергали скринингу посредством рестрикционного гидролиза/гель-электрофореза, и два из них, несущие четыре или восемь копий последовательности Ав 1-15, использовали для экспрессии и очистки соответствующих рекомбинантных белков

Тгх(Ар1-15)₄ и Тгх(Ар1-15)₈.

Присутствие двух меток Ηίκ₆ способствует стадии очистки и может повысить иммуногенность, как в случае тандемных повторов лизиновых остатков.

Таблица 2

№	Название праймера	После довател ькость
1	Ме Тгх-Ρίϋδ	Сдса1а1дддсда1аааайайсасс
2	ВагП-Тгх-ΜΙΝυδ	Сддда1сссдссаддйадсд1сдад

Экспрессия и очистка полипептидов Тгх Ав. Экспрессию индуцировали добавлением 1 мМ изопропил-в-О-тиогалактопиранозида (1РТО) к клеткам Е. сой ВЬ21§1ат (ΌΕ3) (1пуйтодеп), трансформированным каждой из вышеописанных конструкций, и давали возможность продолжаться в течение 2 ч при 37°С. Другой штамм Е. сой (Ойдат1-ОЕ3; Муадеп) и модифицированные условия экспрессии (вектор рТ7-Атр-Тгх; 5 ч при 30°С) использовали для Тгх Ав42, который иначе был полностью нерастворимым. После лизиса клеток Ηίκό-меченые полипептиды Тгх Ав связывали с металл-аффинной смолой (Та1оп; С1оп1есй), очищали в соответствии с инструкциями изготовителя и подвергали интенсивному диализу против фосфатно-буферного солевого раствора (РВ8). Концентрацию белка определяли методом окрашивания Кумасси (Вю-Рай) и по УФ-поглощению. Состав и чистоту индивидуальных полипептидов оценивали как с помощью гель-электрофореза в гелях 11% полиакриламид/δΌδ (додецилсульфат натрия), так и с помощью анализа ΜΑΕΌΙ-ТОЕ (тайтх-аккШей 1акег йекотрйоп юш/айоп-йте о! 1йдй1, времяпролетная система с ионизацией посредством лазерной десорбции при содействии матрицы) (МаккЬупх4.0, \Уа1ег8).

Протокол иммунизации. Рекомбинантные полипептиды Тгх Ав (2 мг/мл в РВ8) стерилизовали фильтрацией, и аликвоту каждого из них (10 наномоль) смешивали с 1 мг квасцов (§^дта-Α1й^^сй) в конечном объеме 400 мкл непосредственно перед использованием. Ав 42 (δίβΐηη-ΑΗΓχΙι) растворяли в РВ8 (2 мг/мл) и подвергали агрегации в течение ночи при 37°С перед иммунизацией. Пяти случайно подобранным группам самцов мышей ΒΑΕΒ/с в возрасте одного месяца (Сйат1ек Ктует йаЬогаЮпек; 10 животных в каждой) инъецировали подкожно вышеуказанные антигены на 1, 15, 30 и 60 сутки, как показано на фиг. 1в. Такую же обработку применяли к двум отрицательным контрольным группам, которым инъецировали РВ8 и агрегированный Ав 42, оба без квасцов. Сыворотки собирали через две недели после по

- 6 014531 следнего бустера и случайным образом объединяли попарно.

Обнаружение анти-Ар42 антител. Суммарные антитела анти-Ав42 обнаруживали с помощью ЕЫ8А при фиксированном разведении 1/200, используя агрегированный Αβ42 (0,5 мкг/лунка) в качестве антигена-мишени23. После инкубации, промывки и добавления конъюгированных с пероксидазой хрена (НКР) иммуноглобулинов против мыши (1/5000; 8|дта-А1йпс11) и хромогенного субстрата ортофенилендиамина (8|дта-А1йпс11) планшеты считывали на спектрофотометре при 450 нм. Определение изотипа иммуноглобулина проводили при фиксированном разведении 1/200, используя специфичные к подклассу 1д НКР-конъюгированные вторичные антитела крысы против мыши (ТесйшРЬатт). ЕЫ8А проводили в трех параллелях на пяти спаренных сыворотках из каждой группы; только подгруппу сывороток от трех животных с максимальным ответом в группах 1, 3, 4, 6 и 7 (фиг. 1в) использовали для определения изотипа. Сравнения между группами проводили посредством одностороннего анализа ΑΝΟνΑ, используя программное обеспечение Απαΐνζοίΐ.

Иммуногистохимия. Сыворотки от мышей, иммунизированных каждым из трех полипептидов ΤτχΑβ1-15, подвергали скринингу на их способность к связыванию Ав бляшек в срезах головного мозга человека - 68-летнего пациента с невропатологическими и клиническими симптомами, типичными для тяжелой болезни Альцгеймера. Анализировали различные разведения (1/100-1/1000) объединенных сывороток от трех высокоотвечающих особей в группах 5, 6 и 7; лучшие результаты были получены с разведением 1/500. Сыворотки добавляли к серийным 8 мкм срезам головного мозга фиксированной в формалине ткани височной коры, предварительно обработанным муравьиной кислотой (80%, 15 мин). Сыворотки от ложно обработанных животных (РВ8), и имеющийся в продаже препарат поликлонального анти-Ав40 антитела (Аий-Раи в-Ату1о1й, Вюхоигсе) использовали в качестве отрицательного и положительного контролей, соответственно. Иммунологическое мечение выявляли с помощью системы Еи VI8юи Р1и§/пероксидаза хрена (Эако). используя 3,3'-диаминобензидин в качестве хромогенного субстрата согласно инструкциям изготовителя.

Изображения получали с помощью цифровой камеры при увеличениях в интервале от 50 до 400Х.

Дот-блот анализы и визуализация посредством АРМ. Ав42 для дот-блот анализа готовили в соответствии с протоколами, ранее известными в данной области техники (см., например, 8йие, \У.В. е( а1. в 1. Вю1. СЬет. ^1ите 278, раде 11612-11622). Кратко, Ав42, растворенный в 2 М ΌΜ8Ο (конечная концентрация 1 мМ), использовали как источник мономерной формы; разбавление концентрированного раствора ΌΜ8Ο в холодной среде Нат'х Р12 К (без фенолового красного; Вюкоитсе) при конечной концентрации 100 мкМ с последующей инкубацией в течение 24 ч при 4°С использовали для получения растворимых олигомеров; тот же исходный раствор, разведенный в 10 мМ НС1 при конечной концентрации 100 мкМ и инкубированный в течение 24 ч при 37°С, использовали для образования Ав фибрилл. Идентичность различных типов Ав, а также отсутствие фибрилл из растворов растворимых олигомеров проверяли с помощью АРМ. К данному моменту вышеописанные растворы Ав42 были разведены 10-кратно в 20 мкл буфера для осаждения (4 мМ НЕРЕ8 рН 7,4, 10 мМ №С1, 7 мМ МдС1₂) до конечной концентрации 10 мкМ и немедленно осаждены на свежих сколах рубиновой слюды при комнатной температуре. Через пять минут слюдяные диски ополаскивали водой марки ιηί11ί-0 и осторожно сушили в потоке азота. Изображения получали с помощью микроскопа №тохсоре III (01дИа1 Шйтитеий), работающего в режиме Тарртд Мойе (режим обстукивания), используя имеющиеся в продаже трамплинные силиконовые кронштейны (М1кгоМа8сй). Фиксированный объем каждого типа Ав, соответствующий либо 0,1 пмоль, либо 1 пмоль пептида Ав42, наносили в виде пятна на нитроцеллюлозную мембрану (ОЕ НеаНЬсате ЬИе 8с1еисе5), предварительно увлажненную 20 мМ Трис-НС1, рН 7,5, 0,8% №1С1 (ТВ8), используя вакуумный аппарат для дот-блоттинга (96 лунок; Вю-Кай). Дот-блоттинги готовили партиями из восьми мембран каждая, которые сушили и хранили при 4°С в течение не более двух недель до использования. Антисыворотку для дот-блот-анализа подвергали аффинной очистке на миниколонках с белком А (П1а1йеуа) согласно инструкциям изготовителя. После определения суммарной концентрации иммуноглобулина методом окрашивания Кумасси очищенные иммуноглобулины использовали для дот-блот анализов при конечной концентрации 0,75 мкг/мл. После блокирования при комнатной температуре с помощью 5%ного обезжиренного сухого молока в ТВ8 с добавлением 0,05% Твин 20 (ТВ8Т) блоттинги инкубировали в течение 1,5 часов с каждым из трех первичных антител Тгх Ав1-15 в сухом молоке-ТВ8Т, отмывали 3x10 мин ТВ8Т, а затем обнаруживали иммуноглобулины мыши с помощью набора 8ирег81дпа1 \Уех1 Рет1о (Р1егсе), как указано изготовителем. Три независимых технических повтора проводили с антисыворотками из пула самого высокого ответа в каждой группе.

Пример 2. Оценка эффектов анти-Тгх(Ав1-15)₄антител ίη у1уо на в-амилоидную патологию головного мозга у взрослых трансгенных мышей Тс.|2576.

Методы

Самок трансгенных мышей АО (Тд2576), экспрессирующих шведскую мутацию человеческого АРР (1), получали из популяции мышей Центра по изучению болезни Альцгеймера Бостонского университета. Основатели этой популяции были предоставлены Ότ. Кагеи Ныао-Акйе (кафедра неврологии медицинского факультета университета Миннесоты). У мышей АРР Тд2576 развиваются поведенческие ано

- 7 014531 малии и проявляются гистологические свидетельства отложений Αβ в головном мозге в виде бляшек, параллельно с сопутствующим астроглиозом в возрасте уже 8 месяцев. Мышей генотипировали с использованием стандартизованного анализа РСК хвостовой ДНК и помещали по четыре в каждую клетку в стандартных условиях при свободном доступе к пище и воде. Шесть 14-месячных мышей АРР (32-34 г каждая), помещенных в 12-часовой световой режим, использовали для хирургических операций. Мышей анестезировали внутрибрюшинной инъекцией кетамина НС1/ксилазина (100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина; 100 мкл/10 г массы тела) и помещали в стереотаксический аппарат (Кор1) с адаптером для головы мыши. Терморегуляцию поддерживали при 37°С, используя грелку-подушку, с мониторингом дыхания на протяжении всей процедуры. Скальп надрезали по срединной линии, чтобы обнажить сагиттальный шов, и определяли стереотаксические координаты в обоих полушариях (2). Брегму использовали в качестве эталонной точки (2,0 мм), и сверлили отверстия в своде черепа на стыке левой и правой латеральной координаты (1,75 мм). Аффинно-очищенные анти-Тгх(Ав1-15)4 антитела параллельно с иммуноглобулинами от ложно обработанных РВ8 (2 мкл каждого) контрольных мышей стереотаксически инъецировали в левый и правый гиппокамп (2,0 мм вентрально) соответственно, используя шприц на 10 мкл с тупым наконечником (НашШои). После помещения шприца и до извлечением шприца проходило 2 мин времени выдержки, затем 4 мин времени инъекции и еще 2 мин времени выдержки. Местный анестетик применяли при закрытии надреза с использованием 9 мм автоматического зажима. Мышей держали на грелке-подушке до полного восстановления. Все эксперименты с животными проводили в соответствии с Руководством по использованию лабораторных животных и уходу за ними Национальных институтов здоровья, а также администрации Комитета Ветеранов и комитета по уходу за животными Бостонского университета. Через семь суток после инъекции мышей подвергали глубокой анестезии и перфузировали транскардиально 2% забуференным параформальдегидом (100 мл). Головной мозг подвергали постфиксации в течение 2 ч, криопротекции в маркированной серии глицерина, и затем получали замороженные срезы (50 мкм). Серийные тканевые срезы мышей окрашивали на субстанцию Ниссля, окрашивали с использованием анти-Ав42 (№ по каталогу 344; Вюкоигсе 1п(сгпа(1опа1). анти-Ав олигомера (А11; ВюБоигсе 1п1егпа1юиа1) и против глиального фибриллярного антигенного белка (ОРАР; Эако) антител, и окрашивали серебром, используя метод СатрЬе11-8\\'Цхег для идентификации зрелых Авбляшек. Серийные фронтальные тканевые срезы, иммуноокрашенные Ав42 в пределах гиппокампа, начиная от между ушами: 1,68 мм/брегма: -2,12 мм до между ушами: 2,16 мм/брегма: -1,64 мм были проанализированы количественно. Ав42-положительные бляшки количественно определяли на основании изображений высокого разрешения одних и тех же областей головного мозга в полушарии, обработанном анти-Тгх(Ав1-15)₄, и противоположном полушарии, обработанном РВ8, используя программы ВюУкюп (3) и №иго1ис1ба (МюгоВгщЫР1е1б, ^Ш181оп, УТ). Программа ВюУыоп дифференцирует бляшки от фонового нейропиля и считает их, тогда как программа Хеиго1ис1ба вычленяет данные из изображений ВюУкюп, передавая их в Ехсе1 (Мюгокой, РебтопЧ \УА) для статистического анализа.

Результаты

Далее оценивали иммунотерапевтический потенциал анти-Тгх(Ав1-15)₄ путем стереотаксической инъекции этого антитела в гиппокамп 14-месячных АРР-трансгенных мышей АО (Тд2576). Иммуноглобулины от ложной обработки мышей только РВ8, инъецировали в противоположное полушарие, что служило внутренним контролем для данного эксперимента. Через семь суток после инъекции гистопатологическое исследование выявило значительное уменьшение иммунологического окрашивания Αβ в гиппокампе и перекрывающей его новой коре головного мозга мышей, получающих антитело антиТгх(Ав1-15)₄, в противоположность полушарию, контрольному к инъецированному. Ав-положительные бляшки не только отсутствовали в месте инъекции, но были значительно уменьшены в пределах инъекционной пенумбры (2 мм спереди/сзади от места инъекции).

Это позволяет предположить, что не только фибриллы и малые олигомеры, но также олигомеры более высокого порядка являются мишенью ш у1уо для антитела анти-Тгх(Ав 1-15)₄. Для подтверждения того, что полученные данные не являлись результатом конкуренции между анти-Тгх(Ав1-15)₄ и первичным анти-Ав антителом, авторы изобретения провели альтернативные гистопатологические анализы, используя иммунологическое окрашивание глиального фибриллярного антигенного белка (ОРАР) и окрашивание серебром СатрЬе11-8\\й/ег (Кэмпбелл-Швайзер) для обнаружения астроглиоза и Ав бляшек. Астроглиоз и бляшки, связанные с глией, были значительно уменьшены в пределах инъекционной пенумбры антитела анти-Тгх(Ав1-15)₄ по сравнению с противоположным ложно инъецированным полушарием. Кроме того, как выявлено путем окрашивания серебром СатрЬеП-Б^й/ег, было намного меньше бляшек в полушарии с инъекцией анти-Тгх(Ав1-15)₄ по сравнению с ложно инъецированным полушарием. Оба наблюдения совпадают с данными иммунологического окрашивания, полученным с обнаружением антитела анти-Ав. С количественной точки зрения, по сравнению с полушарием, обработанным РВ8, происходило значительное уменьшение количества Ав42-положительных бляшек в полушарии, обработанном анти-Тгх(Ар1-15)4 (полушарие, обработанное РВ8: 3,34х10³±0,58; полушарие, обработанное анти-Тгх(Ав1-15)₄: 0,97х10³±0,27, Р< 0,01).

- 8 014531

Перечень последовательностей <110> СЫез! Гагтасеийс1 <120> Антиамилоидные иммуногенные композиции, способы и применения.

<130> 1076рс1 <160> 17 <170> Ра1еп11п νετβϊοη 3.3 <210 1 <211> 4 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> синтетический пептид <400> 1

Азр А1а О1и РЬе <21О 2 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220 <223> синтетический пептид <400> 2

Азр А1а (Ли РЬе Агд

5 <210 3 <211> 6 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220 <223> синтетический пептид <400 3

Азр А1а С1и РЬе Агд ΗΪ8

5

- 9 014531 <2Ι0> 4 <211> 7 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> синтетический пептид <400> 4

Азр А1а О1и Рке Аг§ Нтз Азр

5 <210> 5 <211> 8 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> синтетический пептид <400> 5

Азр А1а С1и РЬе Агд Ηϊδ Азр Зет

5 <210> 6 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220 <223> синтетический пептид <400> 6

Азр А1а О1и РЬе Агд Ηίκ Азр Зег О1у

5 <210> 7 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> синтетический пептид

- 10 014531 <400> 7

Азр А1а 01и Рке Аг§ Н1з Азр 8ег 61у Туг 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> синтетический пептид <400> 8

Азр А1а О1и РЬе Агд Ηϊδ Азр Зег О1у Туг СИи

5 10 <210> 9 <211> 12 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> синтетический пептид <400> 9

Азр А1а СИи РЬе Агд Ηίβ Азр Зег Суз Туг СИи Уа1

5 10 <210> 10 <211> 13 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> синтетический пептид <400> 10

Азр А1а СИи РЬе Аг§ ΗΪ3 Азр Зег СИу Туг СИи Уа1 ΗΪ5

5 10 <210> 11

- 11 014531 <211> 14 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> синтетический пептид <400> 11

Аар А1а О1и РЬе Агд Н1з Азр 8ег О1у Туг О1и Уа1 ΗΪ8 ΗΪ5

5 10 <210> 12 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> синтетический пептид <400> 12

Азр А1а О1н Рйе Агд ΗΪ8 Азр 8ег О1у Туг СИи Уа1 ΗΪ8 ΗΪ8 С1п 15 10 15 <210> 13 <211> 57 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> синтетический олигонуклеотид <400> 13 д1ссда1§§а (дсадааПс сдаса1дас( саддаГаГда адЙсагсаС сааддсд 57 <210> 14 <211> 57 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> синтетический олигонуклеотид <400> 14 дс1асс(ас§ 1сПааддс1 д1ас!§адтс сШасйса ад!ад(ад11 ссдссад 57

- 12 014531 <2Ю> 15 <211> 169 <212> ΠΡΤ <213> искусственная последовательность <220>

<223> синтетический пептид <400 15

Ме! О1у 8ег 8ег Ηϊε Ηΐβ Ηΐβ Ηίβ Ηΐε ΗΪ8 8ег 8ег О1у Ьеи Уа1 Рго 15 1015

Агд О1у 8ег Ыз Ме! О1у Азр Ьуз Пе Пе ΗΪ8 Ьеи ТЬг Азр Азр 8сг 20 2530

РЬе Азр ТЬг Азр Уа1 Ьеи Ьуз А1а Азр О1у А1а Пе Ьеи Уа1 Азр РЬе 35 4045

Тгр А1а О1и Тгр Суз О1у Рго Ме! Азр А1а О1и РЬе Агд Н18 Азр 8ег 50 5560

О1у Туг О1и Уа1 Ηΐβ Ηΐβ О1п О1у О1у Рго Суз Ьуз Ме! Пе А1а Рго 65 70 7580

Пе Ьеи Азр О1и Пе А1а Азр О1и Туг О1п С1у Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 А1а

9095

Ьуз Ьеи Азп Пе Азр О1п Азп Рго О1у ТЬг А1а Рго Ьуз Туг С1у Пе

100 105110

Агд СНу Пе Рго ТЬг Ьеи Ьеи Ьеи РЬе Ьуз Азп (л!у С1и Уа1 А1а А1а

115 120125

ТЬг Ьуз Уа1 <л!у А1а Ьеи 8ег Ьуз О1у СПп Ьеи Ьуз С1и РЬе Ьеи Азр 130 135140

А1а Азп Ьеи Агд Азр Рго Азп 8ег 8ег 8ег Уа1 Азр Ьуз Ьеи А1а А1а

145 150 155160

- 13 014531

А1а Ьеи (Ли ΗΪ8 Ηΐδ ΗΪ8 ΗΪ8 ΗΪ8 Н18

165 <210> 16 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> синтетический олигонуклеотид <400> 16 с§саШ§§§ сдайшаай айсасс 27 <210 17 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> синтетический олигонуклеотид <400 17 с§д§а!сссд ссадцйацс 26

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

1. Иммуногенная конструкция, содержащая в качестве носителя тиоредоксин, связанный по меньшей мере с одним фрагментом А[142.

2. Иммуногенная конструкция по п.1, где по меньшей мере один фрагмент А[142 связан с тиоредоксином посредством аминокислотного линкера.

3. Иммуногенная конструкция по п.1 или 2, где по меньшей мере один фрагмент А[142 выбран из группы, состоящей из Ар1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15.

4. Иммуногенная конструкция по п.3, где по меньшей мере один фрагмент А[142 представляет собой Αβ1-15.

5. Иммуногенная конструкция по п.4, где фрагмент АЦ1-15 связан с тиоредоксином посредством аминокислотного линкера.

6. Иммуногенная конструкция по п.5, где аминокислотный линкер представляет собой О1у-О1у-Рго.

7. Иммуногенная конструкция по п.4, где тиоредоксин несет более чем один фрагмент А β 1-15.

8. Иммуногенная конструкция по п.7, где тиоредоксин несет четыре фрагмента Λβ1-15 (Ττχ(Λβ115)4).

9. Фармацевтическая композиция для вакцинации против амилоидогенных заболеваний, содержащая иммуногенную конструкцию по любому из пп.1-8.

10. Композиция по п.9, дополнительно содержащая адъювант.

11. Композиция по п.10, где адъювант выбран из группы, состоящей из 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида Α (МРЬ), сапонина 0821. мурамилдипептида или соли алюминия.

12. Композиция по п.11, где адъювант представляет собой соль алюминия, выбранную из группы, состоящей из гидроксида алюминия, фосфата алюминия и сульфата алюминия.

13. Моноклональное антитело, которое распознает иммуногенную конструкцию по любому из пп.1-

8.

14. Антитело по п.13, где иммуногенная конструкция представляет собой (Ττχ(Λβ1-15)₄).

15. Терапевтический агент для предупреждения или лечения амилоидогенного заболевания, содержащий моноклональное антитело по п.13 или 14 в качестве активного ингредиента.