EA011583B1 - Миметические антитела glp-1 человека, композиции, способы и применения - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится по меньшей мере к одному новому миметическому антителу GLP-1 человека, или его конкретной части, или варианту, включая выделенные нуклеиновые кислоты, которые кодируют по меньшей мере одно миметическое антитело GLP-1, или его конкретную часть, или вариант; миметическому антителу GLP-1, или его конкретной части, или вариантам, векторам, клеткам-хозяевам, трансгенным животным или растениям и к способам их получения и применения, включая терапевтические композиции, способы и устройства.

Description

Уровень техники

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к миметическим антителам ОЬР-1 млекопитающих, их конкретным частям и вариантам, характерным для биологически активных белков, фрагмента или лигандов, к кодирующим миметическое антитело ОЬР-1 и комплементарным нуклеиновым кислотам, к клеткам-хозяевам и способам их получения и применения, включая терапевтические препараты, введение и устройства.

Предшествующий уровень техники

Рекомбинантные белки являются развивающимся классом терапевтических средств. Такие рекомбинантные лекарственные средства привели к прогрессу белковых препаратов и химической модификации. Такие модификации потенциально могут расширить терапевтическое применение терапевтических белков, например, путем увеличения периода полужизни (например, путем блокирования воздействия на них протеолитических ферментов), путем усиления биологической активности или путем ослабления нежелательных побочных эффектов. Одной из таких модификаций является применение фрагментов иммуноглобулина, слитых с рецепторными белками, такими как энтерасепт. С целью обеспечить более длинный период полужизни или наделить терапевтические белки функциями, например функцией связывания с рецептором Рс, связывания с белком А и реакцией связывания комплемента, также были созданы белки с использованием Рс-домена.

Диабет является усиливающейся эпидемией, которая в ожидании эффективного фармацевтического способа лечения, как предполагается, к 2025 году поразит более 300 миллионов человек. Диабет типа 2 составляет 90-95% всех случаев. Осложнения, возникающие вследствие длительно повышенного уровня глюкозы плазмы, включают сердечно-сосудистые заболевания, нефропатию, нейропатию и ретинопатию. Кроме того, на поздних стадиях диабета типа 2 β-клетки поджелудочной железы погибают и поэтому прекращают секретировать инсулин. Современные способы лечения диабета сопровождаются разнообразными вредными побочными эффектами, включая гипогликемию и увеличение массы тела. Кроме того, современные способы лечения диабета типа 2 не излечивают болезнь, а просто отсрочивают для пациентов момент, когда потребуется инсулинотерапия.

Глюкагоноподобный пептид-1 (ОЬР-1) представляет собой пептид из 37 аминокислот, который секретируется Ь-клетками кишечника после перорального введения глюкозы. Последующее эндогенное расщепление между 6-м и 7-м положениями создает биологически активный пептид ОЬР-1 (7-37). Последовательность пептида ОЬР-1 (7-37) можно разделить на 2 структурных домена. Аминоконцевой домен пептида участвует в передаче сигналов, в то время как остальная часть пептида, по-видимому, связывается с внеклеточными петлями рецептора ОЬР-1 в спиральной конформации. В ответ на глюкозу, активный ОЬР-1 связывается с рецептором ОЬР-1 в поджелудочной железе и вызывает увеличение секреции инсулина (инсулинотропное действие). Кроме того, показано, что ОЬР-1 замедляет опорожнение желудка, что уменьшает количество глюкозы, которое высвобождается в кровоток, и может уменьшать потребление пищи. Вместе эти действия снижают уровень глюкозы в крови. Также показано, что ОЬР-1 ингибирует апоптоз и усиливает пролиферацию β-клеток в поджелудочной железе. Таким образом, ОЬР-1 является эффективным лекарственным средством, снижающим глюкозу крови и сохраняющим β-клетки поджелудочной железы больных диабетом. Кроме того, активность ОЬР-1 контролируется уровнем глюкозы в крови. Когда уровень глюкозы в крови падает до определенного порогового значения, ОЬР-1 неактивен. Поэтому не существует риска возникновения гипогликемии, вызванной лечением, в котором используется ОЬР-1.

Эффективность лечения ОЬР-1 была показана клинически. 6-недельная инфузия ОЬР-1 понизила уровни глюкозы плазмы натощак и средние 8-часовые уровни у больных диабетом типа 2. Лечение ОЬР1 также привело к улучшению функции β-клеток. Экзенатид является аналогом ОЬР-1 и в настоящее время проходит клинические испытания. Экзенатид впервые был выделен из слюны ящерицы-ядозуба, и он на 53% идентичен ОЬР-1. Экзенатид может связываться с рецептором ОЬР-1 и инициировать каскад передачи сигнала, ответственный за различную активность, которую приписывают ОЬР-1 (7-37). В настоящее время показано, что экзенатид снижает уровень НЬА1с и уровень фруктозамина в сыворотке больных диабетом типа 2. Кроме того, он задерживает опорожнение желудка и подавляет потребление пищи у здоровых добровольцев.

Однако ίη νίνο ОЬР-1 быстро инактивируется протеазой дипептидилпептидазой IV (ЭРР-ΐν). Поэтому применимость лечения с использованием пептидов ОЬР-1 ограничена их быстрым выведением и коротким периодом полужизни. Например, период полужизни ОЬР-1 (7-37) в сыворотке составляет всего лишь 3-5 мин. Время действия ОЬР-1 (7-36) амида при подкожном введении составляет приблизительно 50 мин. Даже аналоги и производные, которые устойчивы к эндогенному расщеплению протеазами, не обладают достаточно продолжительным периодом полужизни, чтобы избежать повторных введений в 24-часовой период. Например, экзенатид устойчив к ЭРР-ΐν, тем не менее, в сутки требуется двукратное введение перед приемами пищи из-за короткого периода полужизни и большой вариабельности фармакокинетики ίη νίνο. NN2211, другое соединение, проходящее в настоящее время клинические испытания,

- 1 011583 является аналогом ОЬР-1, связанным с липидами. Ожидается, что его введение можно будет осуществлять 1 раз в сутки.

Быстрое выведение терапевтического средства нежелательно в случаях, когда необходимо поддерживать высокий уровень средства в крови в течение длительного времени, так как в этом случае будут необходимы повторные введения. Кроме того, длительно действующее соединение особенно важно для больных диабетом, у которых предыдущий режим лечения включал только пероральный прием препаратов. Для таких больных период перехода к режиму, предусматривающему многочисленные инъекции препарата, чрезвычайно труден. Лечение ОЬР-1, который имеет повышенный период полужизни, имело бы значительное преимущество перед другими разрабатываемыми пептидами ОЬР-1 и соединениями.

Соответственно, имеется потребность в создании улучшенных и/или измененных вариантов терапевтических белков ОЬР-1, у которых отсутствовали бы другие трудности, известные в данной области. Технология миметических антител обеспечивает новую платформу доставки для пептидных препаратов. Миметическое антитело ОЬР-1 может обеспечить способ длительной доставки пептида ОЬР-1, усовершенствуя пептиды ОЬР-1, разрабатываемые в настоящее время. Кроме того, на основании димерной структуры и особенностей распределения в тканях, миметическое антитело ОЬР-1 могло бы иметь дифференцируемые особенности относительно секреции инсулина, сохранения β-клеток и приема пищи.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к миметическим антителам ОЬР-1 человека, включая модифицированные иммуноглобулины, продукты расщепления и другие их конкретные части и варианты, а также к композициям миметических антител ОЬР-1, кодирующим или комплементарным нуклеиновым кислотам, векторам, клеткам-хозяевам, композициям, препаратам, устройствам, трансгенным животным, трансгенным растениям и способам их получения и применения, которые описаны и/или которые возможны в соответствии с настоящим описанием, в сочетании с тем, что известно в данной области.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одному выделенному миметическому антителу ОЬР-1 или его конкретной части или варианту, которые описаны в описании и/или известны в данной области. Миметическое антитело ОЬР-1 может необязательно содержать по меньшей мере одну область СН3, непосредственно связанную по меньшей мере с одной областью СН2, непосредственно связанной по меньшей мере с одной частью по меньшей мере одной шарнирной области или ее фрагментом (Н), непосредственно связанной по меньшей мере с одной составляющей вариабельной области (V), непосредственно связанной с необязательной линкерной последовательностью (Ь), непосредственно связанной по меньшей мере с одним терапевтическим пептидом ОЬР-1 (Р).

В предпочтительном варианте осуществления пара СН3-СН2-шарнирная область-последовательность частичной области V - линкер-последовательность терапевтического пептида - пара, необязательно связанная ассоциативной или ковалентной связью, такой как, но ей не ограничеваясь, по меньшей мере одной дисульфидной связью Сук-Сук или по меньшей мере одной СН4 или другой последовательностью иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления миметическое антитело ОЬР-1 образует формулу (I) (Р(п)-Ь(о)-^р)-Н(ф-СН2(г)-СН3(к))Д) где Р представляет собой по меньшей мере один биоактивный пептид ОЬР-1, вариант или производное, Ь представляет собой по меньшей мере одну линкерную последовательность, которая может быть полипептидом, который обеспечивает структурную гибкость, позволяя миметическому антителу принимать альтернативную ориентацию и придавая свойства связывания, V представляет собой по меньшей мере одну часть С-конца вариабельной области иммуноглобулина, Н представляет собой по меньшей мере часть вариабельной шарнирной области иммуноглобулина, СН2 представляет собой по меньшей мере часть константной области СН2 иммуноглобулина, СН3 представляет собой по меньшей мере часть константной области СН3 иммуноглобулина, η равно целому числу от 1 до 10, и о, р, с.|. г, к и I могут быть независимо равны целому числу от 0 до 10, имитируя различные типы молекул иммуноглобулинов, например, но ими не ограничиваясь, 1дО1, 1дО2, 1дО3, 1дО4, 1дА1, 1дА2, 1дМ, 1др, 1дЕ, или любой их подкласс и т.п., или любое их сочетание.

Вариабельная область последовательности антитела может без ограничения быть по меньшей мере одной частью по меньшей мере одной 8ЕО ГО N0: 47-55 или их фрагментов, которые описаны в таблице ниже, и дополнительно, необязательно, содержать по меньшей мере одну замену, вставку или делецию, которые дополнительно показаны на фиг. 1-9 публикации РСТ XV 0 05/05604 (РСТ И804/19898), поданной 24 июня 2004 года и опубликованной 20 января 2005 года, с соответствующими 8ЕО ГО N0: 1-9. СН2, СН3 и шарнирная область могут без ограничения представлять собой по меньшей мере одну часть по меньшей мере одной из последовательностей 8Е0 ГО N0: 56-64 или их фрагмент, которые описаны в таблице ниже, и дополнительно, необязательно, содержать по меньшей мере одну замену, вставку или делецию, которые дополнительно показаны на фиг. 32-40 публикации РСТ ν0 05/05604 (РСТ И804/19898), поданной 24 июня 2004 года и опубликованной 20 января 2005 года с соответствующими 5ЕО ГО N0: 32-40.

Таким образом, миметическое антитело ОЬР-1 по настоящему изобретению имитирует по меньшей мере часть антитела или иммуноглобулиновой структуры или функции с присущими ей свойствами и функциями, обеспечивая при этом терапевтический пептид ОЬР-1 с присущими ему или приобретенны

- 2 011583 ми ίη νίίΓΟ, ίη νίνο или ίη δίΐιι свойствами или активностью. Различные части антитела и части терапевтического пептида миметического антитела СЬР-1 по настоящему изобретению могут изменяться, как описано в настоящем описании, в сочетании с тем, что известно в данной области.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одному выделенному миметическому антителу СЬР-1 или его конкретной части или варианту, которые обладают по меньшей мере одной активностью, например, но им не ограничиваясь, известной биологической активностью по меньшей мере одного биоактивного пептида или полипептида СЬР-1, соответствующего части Р формулы (I), которые описаны в настоящем описании или известны в данной области.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится по меньшей мере к одному выделенному миметическому антителу СЬР-1 человека, содержащему по меньшей мере одну полипептидную последовательность 8ЕЦ Ш N0: 1, или, необязательно, с одной или несколькими заменами, делециями или вставками, как описано здесь или известно в данной области. Еще в одном аспекте по меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или его конкретная часть или вариант по изобретению имитирует связывание по меньшей мере одного пептида СЬР-1 или полипептида, соответствующего части Р миметического антитела формулы (I), по меньшей мере с одним эпитопом, содержащим по меньшей мере от 1-3 до полноразмерной аминокислотной последовательности по меньшей мере одного лиганда, например, но им не ограничиваясь, рецептора СЬР-1 или его фрагмента, где лиганд связывается по меньшей мере с частью 8ЕЦ Ш N0: 1 или, необязательно, с одной или несколькими заменами, делециями или вставками, как описано здесь или известно из уровня техники. По меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 может, необязательно, связываться с рецептором СЬР-1 с аффинностью по меньшей мере 10^-9 М, по меньшей мере 10^-10 М, по меньшей мере 10^-11 М или по меньшей мере 10^-12 М. Таким образом, миметическое антитело СЬР-1 может быть скринировано на соответствующую активность в соответствии с известными способами, такими как, но ими не ограничиваясь, активность связывания с рецептором или его фрагментом.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одному антиидиотипическому антителу к по меньшей мере одному миметическому антителу СЬР-1 по настоящему изобретению. Антиидиотипическое антитело или фрагмент специфически связывается по меньшей мере с одним миметическим антителом СЬР-1 по настоящему изобретению. Антиидиотипическое антитело включает любой белок или пептид, содержащий молекулу, которая содержит по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, такую как, но ей не ограничиваясь, по меньшей мере одна область, определяющая комплементарность (СЭК.) тяжелой или легкой цепи, или ее часть, связывающая лиганд, вариабельная область легкой или тяжелой цепи, константная область легкой или тяжелой цепи, каркасная область или любая их часть, которая конкурентно связывается со связывающей лиганд областью СЬР-1 по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 по настоящему изобретению. Такие идиотипические антитела по изобретению могут содержать или быть получены от любого млекопитающего, такого как, но ими не ограничиваясь, человек, мышь, кролик, крыса, грызун, примат и т.п.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим комплементарный, обладающий значительной идентичностью или гибридизованный с полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или антиидиотипическое антитело к миметическому антителу СЬР-1 или к их конкретным частям или вариантам, содержащим по меньшей мере одну конкретную последовательность, домен, его часть или вариант. Настоящее изобретение дополнительно относится к рекомбинантным векторам, содержащим по меньшей мере одно из указанных выделенных миметических антител СЬР-1, или к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим антиидиотипическое антитело к миметическому антителу СЬР-1, клеткам-хозяевам, содержащим такие нуклеиновые кислоты и/или рекомбинантные векторы, а также к способам получения и/или применения такого миметического антитела СЬР-1 или нуклеиновых кислот антиидиотипического антитела к миметическому антителу СЬР-1, векторов и/или клеток-хозяев.

Также изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей по меньшей мере одно выделенное миметическое антитело СЬР-1 млекопитающего или антиидиотипическое антитело к миметическому антителу СЬР-1; к вектору, состоящему из выделенной нуклеиновой кислоты, содержащему выделенную нуклеиновую кислоту, и/или к прокариотической или эукариотической клетке-хозяину, содержащей выделенную нуклеиновую кислоту. Клетка-хозяин необязательно может представлять собой по меньшей мере одну клетку-хозяин, выбранную из С08-1, С08-7, НЕК293, ВНК21, СНО, В8С1, Нер С2, 653, 8Р2/0, 293, НеЬа, клеток миеломы или лимфомы или любой их производной, иммортализованной или трансформированной указанной клетки.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одному способу экспрессии по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 или антиидиотипического антитела к миметическому антителу СЬР-1 или его конкретной части или варианта в клетке-хозяине, предусматривающему культивирование клетки-хозяина, как описано здесь и/или известно из уровня техники, в условиях, где по меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или антиидиотипическое антитело к миметическому антителу СЬР-1 или его конкретная часть или вариант экспрессируются в количестве, поддающемся обнаружению и/или выделению. Также изобретение относится к способу получения по меньшей мере од

- 3 011583 ного миметического антитела СЬР-1 или антиидиотипического антитела к миметическому антителу СЬР-1, предусматривающему трансляцию нуклеиновой кислоты, кодирующей миметическое антитело СЬР-1 или антиидиотипическое антитело к миметическому антителу СЬР-1, в условиях ίη νίΐτο, ίη νίνο или ίη 8Йи, таких что миметическое антитело СЬР-1 или антиидиотипическое антитело к миметическому антителу СЬР-1 экспрессируется в количествах, поддающихся обнаружению или выделению.

Также изобретение относится к способу получения по меньшей мере одного выделенного миметического антитела СЬР-1 человека или антиидиотипического антитела к СЬР-1 по настоящему изобретению, предусматривающему получение клетки-хозяина или трансгенного животного, или трансгенного растения, способного к экспрессии миметического антитела СЬР-1 или антиидиотипического антитела к СЬР-1 в поддающихся выделению количествах.

Кроме того, настоящее изобретение относится по меньшей мере к одному миметическому антителу СЬР-1, полученному вышеупомянутыми способами.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции, содержащей: (а) нуклеиновую кислоту, кодирующую выделенное миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант, и/или миметическое антитело СЬР-1, описанное здесь; и (Ь) подходящий носитель или разбавитель. Носитель или разбавитель необязательно могут быть фармацевтически приемлемыми согласно известным методикам. Композиция необязательно может дополнительно содержать по меньшей мере одно дополнительное соединение, белок или композицию.

Также изобретение относится к композиции, содержащей по меньшей мере одно выделенное миметическое антитело СЬР-1 человека и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Композиция может необязательно дополнительно содержать эффективное количество по меньшей мере одного соединения или белка, выбранного по меньшей мере из одной визуализируемой метки или репортерной молекулы, противоинфекционного средства, лекарственного средства, действующего на сердечно-сосудистую (СС) систему, лекарственного средства, действующего на центральную нервную систему (ЦНС), лекарственного средства, действующего на вегетативную нервную систему (ВНС), лекарственного средства, действующего на дыхательные пути, лекарственного средства, действующего на желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), гормонального лекарственного средства, лекарственного средства, действующего на водный или электролитный баланс, гематологического лекарственного средства, противоопухолевого, иммуномодулирующего лекарственного средства, глазного, ушного или назального лекарственного средства, лекарственного средства для местного применения, нутритивного лекарственного средства, антагониста ΤΝΡ, противоревматического средства, миорелаксанта, наркотического средства, нестероидного противовоспалительного средство (НПВС), анальгезирующего средства, анестезирующего средства, седативного средства, средства для местной анестезии, блокатора нервномышечной передачи, антимикробного, противопсориатического средства, кортикостероида, анаболического стероида, эритропоэтина, иммунизирующего средства, иммуноглобулина, иммуносупрессивного средства, гормона роста, заместительного гормонального средства, радиофармпрепарата, антидепрессанта, нейролептика, стимулятора, средства для лечения астмы, бета-агониста, стероида для ингаляционного введения, эпинефрина или его аналога, цитокина или антагониста цитокина.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции, устройству и/или способу доставки терапевтически или профилактически эффективного количества по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение, кроме того, относится по меньшей мере к одному способу получения миметического антитела СЬР-1 или композиции для введения терапевтически эффективного количества для модуляции или лечения по меньшей мере одного состояния, связанного с СЬР-1, в клетке, ткани, органе, у животного или пациента и/или перед, после или во время связанного состояния, известного из уровня техники и/или описанного в описании.

Настоящее изобретение, кроме того, относится по меньшей мере к одному миметическому антителу СЬР-1, его конкретной части или варианту для использования в способе или композиции, которая вводится в терапевтически эффективном количестве для модуляции, для лечения или ослабления симптомов по меньшей мере одного метаболического, иммунного, сердечно-сосудистого, инфекционного заболевания, злокачественной опухоли и/или неврологического расстройства в клетке, ткани, органе, у животного или пациента и/или, что необходимо при различных заболеваниях, например, но этим не ограничиваясь, до, после или во время связанного заболевания или состояния, на которое направлено лечение, как известно из уровня техники.

Настоящее изобретение, кроме того, относится по меньшей мере к одному миметическому антителу СЬР-1, его конкретной части или варианту, используемому в способе или композиции, которая вводится в терапевтически эффективном количестве для модуляции, лечения или ослабления симптомов по меньшей мере одного из следующих заболеваний: диабета или расстройства, связанного с нарушеним метаболизма инсулина, заболевания костей и суставов, сердечно-сосудистого заболевания, заболевания зубов или полости рта, дерматологического заболевания, заболевания уха, носа или горла, эндокринного или метаболического расстройства, желудочно-кишечного заболевания, гинекологического заболевания, заболевания печени или желчных путей, акушерского заболевания, гематологического заболевания, имму

- 4 011583 нологического или аллергического заболевания, инфекционной болезни, мышечно-скелетного заболевания, онкологического заболевания, неврологического заболевания, расстройства алиментарного происхождения, офтальмологического заболевания, педиатрического заболевания, отравления, психиатрического заболевания, заболевания почек, заболевания легких или любого другого известного заболевания (см., например, ТНе Мегск Мапиа1, 17111 еб., Мегск Векеатсй ЬаЬотайпек, Мегск апб Со., ^ййейоике 81айоп, N1 (1999), который приведен здесь в качестве ссылки в полном объеме), что необходимо при различных заболеваниях, например, но этими не ограничиваясь, перед, после или во время связанного заболевания или состояния, на которое направлено лечение, как известно из уровня техники.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции, устройству и/или способу доставки для диагностики состояний, связанных с СЬР-1, по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение, кроме того, относится по меньшей мере к одному способу или композиции миметического антитела СЬР-1 для диагностики по меньшей мере одного связанного с СЬР-1 состояния в клетке, ткани, органе, у животного или пациента и/или перед, после или во время связанного состояния, как известно из уровня техники и/или как описано в настоящем описании.

Изобретение также относится к способу диагностики или лечения болезненного состояния в клетке, ткани, органе или у животного, который предусматривает приведение в контакт или введение композиции, содержащей эффективное количество по меньшей мере одного выделенного миметического антитела СЬР-1 человека по настоящему изобретению, в клетку, ткань, орган или животное. Способ может, необязательно, дополнительно предусматривать использование эффективного количества 0,001-50 мг/кг клеток, ткани, органа или животного в течение 0-24 ч, 1-7 дней, 1-52 недель, 1-24 месяцев, 1-30 лет или любого диапазона или значения. Способ может необязательно дополнительно предуматривать приведение в контакт или введение по меньшей мере одним путем, выбранным из парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, эндобронхиального, внутрибрюшного, интракапсулярного, внутрихрящевого, внутриполостного, в желудочки головного мозга, в мозжечок, в толстую кишку, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, интрамиокардиального, внутрикостного, внутритазового, интраперикардиального, внутрибрюшинного, внутриплеврального, в предстательную железу, интрапульмонального, в прямую кишку, интраренального, в сетчатку, внутрипозвоночного, внутрисиновиального, внутригрудного, внутриматочного, внутрипузырного, в очаг повреждения, болюсного, влагалищного, ректального, буккального, подъязычного, интраназального или чрескожного. Способ может необязательно дополнительно предусматривать введение перед, одновременно или после приведения в контакт или введения пс меньшей мере одной композиции, содержащей эффективное количество по меньшей мере одного соединения или белка, выбранного из по меньшей мере одной визуализируемой метки или репортерной молекулы, противоинфекционного средства, противодиабетического средства или средства, применяющегося при нарушениях метаболизма инсулина, лекарственного средства, действующего на сердечно-сосудистую (СС) систему, лекарственного средства, действующего на центральную нервную систему (ЦНС), лекарственного средства, действующего на вегетативную нервную систему (ВНС), лекарственного средства, действующего на дыхательные пути, лекарственного средства, действующего на желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), гормонального лекарственного средства, лекарственного средства, действующего на водный или электролитный баланс, гематологического лекарственного средства, противоопухолевого, иммуномодулирующего лекарственного средства, глазного, ушного или назального лекарственного средства, лекарственного средства для местного применения, нутритивного средства, антагониста ΤΝΕ, противоревматического средства, миорелаксанта, наркотического средства, нестероидного противовоспалительного средства (НПВС), анальгезирующего средства, анестезирующего средства, седативного средства, средства для местной анестезии, блокатора нервно-мышечной передачи, антимикробного, противопсориатического средства, кортикостероида, анаболического стероида, эритропоэтина, иммунизирующего средства, иммуноглобулина, иммуносупрессивного средства, гормона роста, заместительного гормонального средства, радиофармпрепарата, антидепрессанта, нейролептика, стимулятора, средства для лечения астмы, бета-агониста, стероида для ингаляционного введения, эпинефрина или его аналога, цитокина или антагониста цитокина.

Кроме того, настоящее изобретение относится к медицинскому устройству, содержащему по меньшей мере одно выделенное миметическое антитело СЬР-1 человека по изобретению, где устройство подходит для приведения в контакт или введения по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 по меньшей мере одним путем, выбранным из парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, эндобронхиального, внутрибрюшного, интракапсулярного, внутрихрящевого, внутриполостного, в желудочки головного мозга, в мозжечок, в толстую кишку, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, интрамиокардиального, внутрикостного, внутритазового, интраперикардиального, внутрибрюшинного, внутриплеврального, в предстательную железу, интрапульмонального, в прямую кишку, интраренального, в сетчатку, внутрипозвоночного, внутрисиновиального, внутригрудного, внутриматочного, внутрипузырного, в очаг повреждения, болюсного, влагалищного, ректального, буккального, подъязычного, интраназального или чрескожного.

- 5 011583

Также предложено изделие для фармацевтического или диагностического применения у человека, содержащее упаковку и контейнер, содержащий раствор или лиофилизованную форму по меньшей мере одного выделенного миметического антитела ОЬР-1 человека по настоящему изобретению. Изделие необязательно может содержать контейнер в качестве компонента устройства или системы для парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, эндобронхиального, внутрибрюшного, интракапсулярного, внутрихрящевого, внутриполостного введения, введения в желудочки головного мозга, в мозжечок, в толстую кишку, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, интрамиокардиального, внутрикостного, внутритазового, интраперикардиального, внутрибрюшинного, внутриплеврального введения, введения в предстательную железу, интрапульмонального, в прямую кишку, интраренального, в сетчатку, внутрипозвоночного, внутрисиновиального, внутригрудного, внутриматочного, внутрипузырного, в очаг повреждения, болюсного, влагалищного, ректального, буккального, подъязычного, интраназального или чрескожного введения.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к любому изобретению, описанному в настоящем описании.

Описание чертежей

Фиг. 1 иллюстрирует нуклеотидную и пептидную последовательности ММВ (миметического антитела) ОЬР-1 в каркасе 1дО1, показывая важные функциональные домены.

Фиг. 2А-2С иллюстрируют испытания связывания ММВ ОЬР-1 ЕАС8. Фиг. 2А показывает, что ММВ ОЬР-1 связывается с клетками НЕК293, сверхэкспрессирующими СЬР-1К. Серая область: ММВ ОЬР-1, но не вторичное; серая линия: только вторичное; пунктир: отрицательный контроль ММВ и вторичное; черная линия: ММВ ОЬР-1 и вторичное. Фиг. 2В показывает, что ММВ ОЬР-1 не связывается с контролем - клетками НЕК293. Серая область: ММВ ОЬР-1, но не вторичное; черная линия: только вторичное; серая линия: ММВ ОЬР-1 и вторичное. Фиг. 2С показывает, что аналог пептида ОЬР-1 (А28) способен конкурировать с ММВ ОЬР-1 за связывание с клетками НЕК293, сверхэкспрессирующими ОЬР-1В. Серая область: ММВ ОЬР-1, но не вторичное; черная линия: ММВ ОЬР-1 и вторичное; пунктир: ММВ ОЬР-1, 0,2 нМ конкурента, вторичное; пунктир: ММВ ОЬР-1, 20 нМ конкурента, вторичное; серая линия: ММВ ОЬР-1, 100 нМ конкурента, вторичное.

Фиг. 3А-3Е иллюстрируют исследование ММВ ОЬР-1 на цАМФ. Фиг. 3А: \\1 ММВ ОЬР-1 в каркасе 1дО1; фиг. 3В: пептид ОЬР-1; фиг. 3С: ММВ ОЬР-1 (А2О) в каркасе 1дО4 (А1а/А1а, 8ег->Рго); фиг. 3Ό: ММВ ОЬР-1 (А28) в каркасе 1дО4 (А1а/А1а, 8ег->Рго); фиг. 3Е: \\1 ММВ ОЬР-1 в каркасе 1дО4 (А1а/А1а, 8ег->Рго).

Фиг. 4 иллюстрирует устойчивость ММВ ОЬР-1 к расщеплению ИРР-1У.

Фиг. 5 показывает стабильность ММВ ОЬР-1 в сыворотке.

Фиг. 6 демонстрирует, что ММВ ОЬР-1 вызывают секрецию инсулина в клетках КЬЫт. Фиг. 6 А показывает, что пептид ОЬР-1 (7-36) и пептид экзендин-4 стимулируют секрецию инсулина в клетках Шт. Фиг. 6В показывает, что ММВ ОЬР-1 (А28) в каркасе 1дО1 или 1дО4 (А1а/А1а, 8ег->Рго) или ММВ ОЬР-1 (А2О) в каркасе 1дО4 (А1а/А1а, 8ег->Рго) активны в стимуляции секреции инсулина в клетках КЬЫт.

Фиг. 7 демонстрирует, что ММВ ОЬР-1 снижает глюкозу (фиг. 7 А) дозозависимым образом (фиг. 7В).

Фиг. 8 показывает фармакокинетический профиль четырех ММВ ОЬР-1 (А2О, А28, Ех-сар и дикий тип) у макаки-крабоеда.

Фиг. 9 показывает влияния ММВ ОЬР-1 во время перорального теста на толерантность к глюкозе у мышей, больных диабетом.

Фиг. 10 показывает влияния ММВ ОЬР-1 на глюкозу крови натощак при хроническом введении мышам, больным диабетом.

Фиг. 11 показывает влияния ММВ ОЬР-1 в пероральным тесте на толерантность к глюкозе после хронического введения мышам, больным диабетом.

Фиг. 12 показывает влияния ММВ ОЬР-1 на уменьшение НЬА1е после хронического введения мышам, больным диабетом.

Фиг. 13 показывает влияния ММВ ОЬР-1 на уровни глюкозы (фиг. 13А) и инсулина (фиг. 13В) в крови при пероральном тесте на толерантность к глюкозе у здоровых макак-крабоедов.

Фиг. 14 показывает влияния ММВ ОЬР-1 на окрашивание инсулина в островках мышей, больных диабетом, после однократного введения.

Фиг. 15 демонстрирует, что ММВ ОЬР-1 задерживает опорожнение желудка у здоровых собак.

Фиг. 16 демонстрирует, что ММВ ОЬР-1 снижает глюкозу крови в пероральном тесте на толерантность к глюкозе у мышей с ожирением, вызванным питанием.

Фиг. 17 демонстрирует, что ММВ ОЬР-1 снижает уровень глюкозы в крови (фиг. 17А) и снижает уровень инсулина (фиг. 17В) при интраперитонеальном тесте на толерантность к глюкозе у мышей, больных диабетом.

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к выделенным, рекомбинантным и/или синтетическим миметическим антителам или их конкретным частям или вариантам, а также композициям и кодирующим молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий по

- 6 011583 меньшей мере одно миметическое антитело ОЬР-1. Такие миметические антитела или их конкретные части или варианты по настоящему изобретению содержат конкретные последовательности миметического антитела ОЬР-1, его домены, фрагменты и конкретные варианты и способы получения и применения указанных нуклеиновых кислот и миметических антител или их конкретных частей или вариантов, включая терапевтические композиции, способы и устройства.

Настоящее изобретение относится по меньшей мере к одному выделенному миметическому антителу ОЬР-1 или его конкретной части или варианту, которые описаны в настоящем описании и/или известны из уровня техники. Миметическое антитело ОЬР-1 может необязательно содержать по меньшей мере одну область СН3, непосредственно связанную по меньшей мере с одной областью СН2, непосредственно связанной по меньшей мере с одной шарнирной областью или ее фрагментом (Н), непосредственно связанной по меньшей мере с одной составляющей вариабельной области (V), непосредственно связанной с необязательной линкерной последовательностью (Ь), непосредственно связанной по меньшей мере с одним терапевтическим пептидом ОЬР-1 (Р).

В предпочтительном варианте осуществления миметическое антитело ОЬР-1 образует формулу (I) (Γ(η)-Ε(ο)-ν(ρ)-Η(ς)-€Η2(ι·)-€Η3(₈))(1) где Р представляет собой по меньшей мере один биоактивный пептид ОЬР-1, Ь представляет собой по меньшей мере одну линкерную последовательность, которая может быть полипептидом, который обеспечивает структурную гибкость, позволяя миметическому антителу принимать альтернативную ориентацию и придавая свойства связывания, V представляет собой по меньшей мере одну часть С-конца вариабельной области иммуноглобулина, Н представляет собой по меньшей мере часть вариабельной шарнирной области иммуноглобулина, СН2 представляет собой по меньшей мере часть константной области СН2 иммуноглобулина, СН3 представляет собой по меньшей мере часть константной области СН3 иммуноглобулина, т, п, о, р, с.|. г, 5 и I могут быть независимо равны целому числу от 0 до 10, имитируя различные типы молекул иммуноглобулинов, например, но ими не ограничиваясь, 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дО4, 1дА1, 1дА2, 1дМ, 1дЭ, 1дЕ, или любой их подкласс и т.п., или любое их сочетание.

Таким образом, миметическое антитело ОЬР-1 по настоящему изобретению имитирует структуру антитела с присущими ей свойствами и функциями, при этом обеспечивая терапевтический пептид и присущие ему или приобретенные ίη νίΐτο, ίη νίνο или ίη δίΐιι свойства или активность. В предпочтительном варианте осуществления, когда ΐ=1, мономер СН3-СН2-шарнирная область-неполная 1 последовательность-линкер-терапевтический пептид может быть связан с другими мономерами с помощью ассоциативной или ковалентной связи, например, но ей не ограничиваясь, дисульфидной связью Су5-Су5. Различные части антитела и части терапевтического пептида ОЬР-1 по меньшей мере одного миметического антитела ОЬР-1 по настоящему изобретению могут изменяться, как описано в настоящем описании, в сочетании с тем, что известно из уровня техники.

Часть СН3-СН2-шарнирная область можно изменять в широких пределах и, таким образом, образовывать вариант по настоящему изобретению, при условии сохранении связывания с рецептором реутилизации. В таких вариантах можно удалить один и более природных сайтов, которые обеспечивают структурные особенности или функциональную активность, не требующихся для слитых молекул по настоящему изобретению. Эти сайты можно удалить, например, путем замены или удаления остатков, вставки остатков в сайт или путем укорочения областей, содержащих сайт. Вставленные или замененные остатки также могут быть измененными аминокислотами, такими как пептидомиметики или Ό-аминокислоты. У варианта СН3-СН2-шарнирная область может отсутствовать один и более природных сайтов или остатков, которые влияют или вовлечены в: (1) формирование дисульфидной связи, (2) несочетаемость с выбранной клеткой-хозяином, (3) гетерогенность при экспрессии в выбранной клетке-хозяине, (4) гликозилирование, (5) взаимодействие с комплементом, (6) связывание с рецептором Ре, отличным от рецептора реутилизации, или (7) антителозависимую клеточную цитотоксичность. Характерные варианты СН3СН2-шарнирная область включают молекулы и последовательности, в которых: 1. сайты, вовлеченные в образование дисульфидной связи, удалены. Такое удаление позволит избежать взаимодействия с другими цистеинсодержащими белками, которые присутствуют в клетке-хозяине, используемой для продукции молекул по изобретению. С этой целью остатки цистеина могут быть удалены или заменены другими аминокислотами (например, аланином, серином). Даже если остатки цистеина удалены, одноцепочечные домены СН3-СН2-шарнирная область по-прежнему могут образовывать димерный домен СН3СН2-шарнирная область, т.е. удерживаясь вместе нековалентно; 2. область СН3-СН2-шарнирная область модифицирована таким образом, чтобы сделать ее более совместимой с выбранной клеткой-хозяином. Например, если молекула экспрессируется рекомбинантно в бактериальной клетке, такой как Е. со11, то можно удалить последовательность РА шарнирной области, которая может распознаваться расщепляющим ферментом Е. сой, таким как пролиниминопептидаза; 3. часть шарнирной области удалена или заменена другими аминокислотами для предотвращения гетерогенности во время экспрессии в выбранной клетке-хозяине; 4. один или более сайтов гликозилирования удалены. Остатки, которые обычно гликозилированы (например, аспарагин) могут вызвать цитолитическую реакцию. Такие остатки могут быть удалены или заменены негликозилированными остатками (например, аланином); 5. сайты, вовлеченные во взаимодействие с комплементом, такие как сайт связывания С1д, удалены. Вовлечение комплемента

- 7 011583 для молекул по настоящему изобретению может оказаться отрицательным, и его можно избежать с помощью такого варианта; 6. удалены сайты, влияющие на связывание с рецепторами Рс, отличными от рецептора реутилизации. Участок СН3-СН2-шарнирная область может иметь сайты для взаимодействия с определенными лейкоцитами, которые не требуются для слитых молекул по настоящему изобретению и, следовательно, могут быть удалены; 7. сайт АЭСС удален. Сайты АЭСС известны в данной области; касательно сайтов АЭСС в 1дС1 см., например, Мо1ес. 1ттипо1. 29 (5): 633-9 (1992). Эти сайты тоже не требуются для слитых молекул по настоящему изобретению и, следовательно, могут быть удалены.

Линкерный полипептид обеспечивает структурную гибкость, позволяя миметическому антителу принимать альтернативную ориентацию и придавая свойства связывания. Если такой линкерный полипептид присутствует, его химическая структура не важна. Линкер предпочтительно состоит из аминокислот, соединенных вместе пептидными связями. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления линкер состоит из 1-20 аминокислот, связанных пептидными связями, где аминокислоты выбирают из 20 природных аминокислот. Некоторые из этих аминокислот могут быть гликозилированы, что хорошо известно специалистам в данной области. В более предпочтительном варианте осуществления 1-20 аминокислот выбраны из глицина, аланина, серина, пролина, аспарагина, глутамина и лизина. Еще более предпочтительно в линкере преобладают аминокислоты, которые не имеют стерических затруднений, такие как глицин и аланин. Таким образом, предпочтительными линкерами являются поли(С1у-8ег), полиглицины (особенно (С1у)₄, (С1у)₅). поли(С1у-А1а) и полиаланины. Другие конкретные примеры линкеров включают (С1у)₃Ьук(С1у)₄ (8ЕО ΙΌ N0: 65), (С1у)₃АкпС1у8ег (С1у)₂ (8Е0 ΙΌ N0: 66), (С1у)₃Сук (61у)4 (8ЕО ΙΌ N0: 67) и С1уРгоАкпС1уС1у (НЕС) ΙΌ N0: 68).

Поясняя вышеупомянутую номенклатуру, например, (С1у)₃Ьук (С1у)₄ означает С1у-С1у-С1у-Ьук-С1уС1у-С1у-С1у. Сочетания С1у и А1а тоже предпочтительны. Линкеры, показанные здесь, являются иллюстративными; линкеры в рамках настоящего изобретения могут быть намного длиннее и могут включать другие остатки.

Также возможны непептидные линкеры. Например, могут быть использованы алкильные линкеры, такие как -ИН-(СН₂)₈С(О)-, где к=2-20. Эти алкильные линкеры могут быть дополнительно замещены любыми группами, не имеющими стерических затруднений, такими как низшие алкильные группы (например, С₁-С₆), низшие ацильные группы, галогены (например, С1, Вг), СИ, ИН₂, фенил и т.д.

Иллюстративный непептидный линкер представляет собой линкер РЕС, который имеет молекулярную массу 100-5000 кДа, предпочтительно 100-500 кДа. Пептидные линкеры могут быть модифицированы с образованием производных тем же способом, который описан выше.

Используемые в настоящем описании «пептид СЬР-1» или «пептид СЬР-1, вариант или производное» могут быть по меньшей мере одним пептидом СЬР-1, фрагментом СЬР-1, гомологом СЬР-1, аналогом СЬР-1 или производным СЬР-1. Пептид СЬР-1 состоит из приблизительно от 25 приблизительно до 45 природных или неприродных аминокислот, которые обладают достаточной гомологией с природным СЬР-1 (7-37), при этом они проявляют инсулинотропную активность при связывании с рецептором СЬР-1 на β-клетках поджелудочной железы. СЬР-1 (7-37) имеет аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 15 Н1к-А1а-С1и-С1у-Тйг-Рйе-Тйг-8ег-Акр-Уа1-8ег-8ег-Туг-Ьеи-С1и-С1у-С1п-А1а-А1а-Ьук-С1и-Рйе-11е-А1а-ТгрЬеи-Уа1-Ьук-С1у-Агд-С1у

Фрагмент СЬР-1 является полипептидом, полученным после усечения одной или нескольких аминокислот на №конце и/или С-конце СЬР-1 (7-37) или его аналога или производного. Гомолог СЬР-1 является пептидом, в котором одна или несколько аминокислот добавлены к №концу и/или С-концу СЬР-1 (7-37) или его фрагмента или аналога. Аналог СЬР-1 является пептидом, в котором одна или несколько аминокислот СЬР-1 (7-37) были модифицированы и/или заменены. Аналог СЬР-1 обладает достаточной гомологией с СЬР-1 (7-37) или фрагментом СЬР-1 (7-37), при этом аналог обладает инсулинотропной активностью. Производное СЬР-1 определено как молекула с аминокислотной последовательностью пептида СЬР-1, гомолога СЬР-1 или аналога СЬР-1, но дополнительно имеющая химическую модификацию одной или нескольких боковых групп аминокислот, α-атомов углерода, концевой аминогруппы или концевой карбоксигруппы.

Многочисленные активные фрагменты СЬР-1, аналоги и производные известны в данной области, и любой из этих аналогов и производных также может быть частью миметического антитела СЬР-1 по настоящему изобретению. Некоторые аналоги СЬР-1 и фрагменты СЬР-1, известные из уровня техники, раскрыты в патентах США №№ 5118666, 5977071 и 5545618, а также АйеШогк!, е1 а1., 1. Вю1. Сйет. 269: 6275 (1994). Примеры включают, но ими не ограничиваются, СЬР-1 (7-34), СЬР-1 (7-35), СЬР-1 (7-36), С1п9-СЬР-1 (7-37), Э-С1п9-СЬР-1 (7-37), Тйг16-Ьук18-СЬР-1 (7-37) и Ьук18-СЬР-1 (7-37).

«Миметическое антитело СЬР-1», «часть миметического антитела СЬР-1», или «фрагмент миметического антитела СЬР-1», и/или «вариант миметического антитела СЬР-1» и т.п. обладает, имитирует или воспроизводит по меньшей мере одну биологическую активность, например, но им не ограничиваясь, связывание с лигандом, ш уйго, ш кйи и/или предпочтительно ш у1уо, по меньшей мере одного пептида СЬР-1, его варианта или производного, например, но им не ограничиваясь, по меньшей мере одного 8Е0 ΙΌ N0: 1. Например, подходящее миметическое антитело СЬР-1, его конкретная часть или вариант

- 8 011583 могут также модулировать, повышать, изменять, активизировать по меньшей мере одну передачу сигнала от рецептора СЬР-1 или другую измеримую или детектируемую активность.

Миметические антитела СЬР-1, используемые в способах и композициях по настоящему изобретению, характеризуются подходящей аффинностью связывания с белковыми лигандами, например с рецепторами СЬР-1, и, необязательно и предпочтительно, обладают низкой токсичностью. В частности, в настоящем изобретении можно использовать миметическое антитело СЬР-1, в котором отдельные компоненты, такие как часть вариабельной области, константной области (без СН1 части) и каркаса или любой их части (например, часть 1, Ό или V областей вариабельной области тяжелой или легкой цепи; по меньшей мере часть по меньшей мере одной шарнирной области, константной области тяжелой цепи или легкой цепи и т.п.), по отдельности и/или вместе, необязательно и предпочтительно, обладают низкой иммуногенностью. Миметические антитела, которые могут использоваться по изобретению, необязательно отличаются способностью воздействовать на пациентов в лечебных целях длительное время с облегчением симптомов удовлетворительно или превосходно и с низкой токсичностью. Низкая иммуногенность и/или высокая аффинность, так же, как другие неизвестные свойства, могут способствовать в получении терапевтических эффектов. «Низкая иммуногенность» определяется в настоящем описании как возникновение значительных реакций НАМА, НАСА или НАНА менее чем приблизительно у 75% или предпочтительно менее чем приблизительно у 50, 45, 40, 35, 30, 35, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 и/или 1% пациентов, получающих лечение, и/или наличие низких титров у пациента, получающего лечение (менее приблизительно 300, предпочтительно менее приблизительно 100, при измерении иммуноферментным анализом с двойным антигеном) (см., например, ЕШой е! а1., Ьапсе! 344: 1125-1121 (1994)).

Применимость

Выделенные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут использоваться для получения по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1, его фрагмента или конкретного варианта, которые можно использовать для оказания воздействия на клетку, ткань, орган или животное (включая млекопитающих и людей), для модуляции, лечения, облегчения, профилактики заболеваний или ослабления симптомов по меньшей мере одного состояния, связанного с белком, выбранного из, но ими не ограничиваясь, по меньшей мере одного расстройства, связанного с диабетом, расстройства, связанного с нарушением метаболизма инсулина, иммунного расстройства или заболевания, сердечно-сосудистого расстройства или заболевания, инфекционного заболевания, злокачественной опухоли и/или неврологического расстройства или заболевания, а также других известных или указанных состояний, связанных с белком.

Такой способ может предусматривать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант, в клетку, в ткань, в орган, животному или пациенту, которые нуждаются в такой модуляции, лечении, облегчении, профилактике или ослаблении симптомов, эффектов или механизмов. Эффективное количество может составлять от приблизительно 0,0001 до 500 мг/кг на однократное или многократное введение или достигать концентрации в сыворотке 0,01-5000 мкг/мл при однократном или многократном введении или любого эффективного диапазона или значения, указанных здесь, которые получены и определены с использованием известных способов, описанных в настоящем описании или известных из соответствующих областей техники.

Цитаты

Все публикации или патенты, цитируемые в настоящем описании, приведены в качестве ссылки в полном объеме, поскольку в них представлена информация о состоянии уровня техники на момент создания настоящего изобретения и/или дано описание настоящего изобретения. Публикации относятся к любым научным или патентным публикациям или любой другой информации, доступной на любом носителе, включая все записанные, электронные или печатные форматы. Следующие ссылки приведены в качестве ссылки в полном объеме: Аи8иЬе1, е! а1., еб., Сштеп! Рто!осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1ойи \УПеу & 8оп5, 1пс., ΝΥ, ΝΥ (1987-2003); ЗатЬгоок, е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота!оту Мапиа1, 2пб Ебйюп, Со1б 8рттд НагЬог, ΝΥ (1989); Наг1оте апб капе, Ап!1Ьоб1е8, а ЬаЬота!огу Мапиа1, Со1б 8рттд НагЬог, ΝΥ (1989); СоШдап, е! а1., ебз., Сштеп! Рто!осо1з ш 1ттипо1оду, 1ойп \УПеу & 8опз, 1пс., ΝΥ (1994-2003); СоШдап е! а1., Сштеп! Рто!осок ш Рго!еш Заепсе, 1ойп ^11еу & 8опз, ΝΥ, ΝΥ, (1997-2003).

Миметические антитела по настоящему изобретению

Миметическое антитело СЕР-1 необязательно может содержать по меньшей мере одну область СН3, непосредственно связанную по меньшей мере с одной областью СН2, непосредственно связанной по меньшей мере с одной частью по меньшей мере одного фрагмента шарнирной области (Н), например, содержащего по меньшей мере одну центральную шарнирную область, непосредственно связанного по меньшей мере с одной составляющей вариабельной области (V), непосредственно связанной с необязательной линкерной последовательностью (Ь), непосредственно связанной по меньшей мере с одним терапевтическим пептидом СЬР-1 (Р). В предпочтительном варианте осуществления пара ΟΗ3-ΟΗ2-Η-νЬ-Р может быть связана ассоциативной или ковалентной связью, такой как, но ей не ограничиваясь, дисульфидная связь Су8-Су8. Таким образом, миметическое антитело СЬР-1 по настоящему изобретению имитирует структуру антитела с характерными свойствами и активностью, при этом образуя терапевти

- 9 011583 ческий пептид с характерными или приобретенными ίη νίίτο, ίη νίνο или ίη δίΐιι свойствами или активностью. Различные части антитела и части терапевтического пептида по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 по настоящему изобретению могут изменяться, как описано в настоящем описании, в сочетании с тем, что известно из уровня техники.

Таким образом, миметические антитела по настоящему изобретению наделены по меньшей мере одним подходящим свойством по сравнению с известными белками, например, но ими не ограничиваясь, по меньшей мере одним свойством из: увеличенного периода полужизни, повышенной активности, более специфической активности, повышенной авидности, увеличенной или сниженной скорости выведения, селективной или более подходящей подгруппы активности, меньшей иммуногенности, повышенного качества или продолжительности по меньшей мере одного необходимого терапевтического воздействия, меньшего количества побочных эффектов и т.п.

Фрагменты миметических антител формулы (I) можно получить ферментным расщеплением, синтетическими или рекомбинантными методами, которые известны из уровня техники и/или описаны в настоящем описании. Миметические антитела также можно получить в различных укороченных формах, используя гены антител, в которые перед природным «стоп»-кодоном встроены один или несколько «стоп»-кодонов. Различные части миметических антител могут быть объединены химическим путем общепринятыми методами или могут быть получены в виде непрерывного белка с использованием методов генной инженерии. Например, для получения непрерывного белка, использующегося в миметических антителах по настоящему изобретению, можно экспрессировать нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере одну константную область цепи антитела человека. См., например, Ьабпет с1 а1., патент США № 4946778 и Βίτά, Р.Ь. е1 а1., Зс1епсе, 242: 423-426 (1988), касающиеся одноцепочечных антител.

Используемый в настоящем описании термин «миметическое антитело человека» относится к антителу, в котором, как ожидается, по существу, каждая часть белка (например, пептид СЬР-1, домены С_н (например, С_н2, С_н3), шарнирная область, V) будет, по существу, неиммуногенной для человека, при условии лишь незначительных изменений или вариаций последовательности. Такие изменения или вариации, необязательно и предпочтительно, фиксируют или снижают иммуногенность у человека по сравнению с немодифицированными антителами или миметическим антителами человека по настоящему изобретению. Таким образом, антитело человека и соответствующее миметическое антитело СЬР-1 по настоящему изобретению отличаются от химерного или гуманизированного антитела. Необходимо подчеркнуть, что миметическое антитело СЬР-1 может быть продуцировано животным (не человеком) или клеткой, которые способны экспрессировать гены иммуноглобулинов человека (например, тяжелой цепи и/или легкой цепи).

Миметические антитела человека, которые специфичны по меньшей мере для одного белкового лиганда, могут быть сконструированы против соответствующего лиганда, такого как выделенный рецептор СЬР-1 или его часть (включая синтетические молекулы, такие как синтетические пептиды). Получение таких миметических антител осуществляется с использованием известных методов идентификации и получения характеристик лигандсвязывающих областей или последовательностей по меньшей мере одного белка или его части.

В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или его конкретная часть или вариант по настоящему изобретению продуцируется по меньшей мере одной клеточной линией, смешанной клеточной линией, иммортализованной клеточной или клональной популяцией иммортализованных и/или культивируемых клеток.

Иммортализованные клетки, продуцирующие белок, могут быть получены с использованием подходящих способов. Предпочтительно по меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант получают путем обеспечения нуклеиновой кислоты или векторов, содержащих ДНК, являющуюся производной или имеющую последовательность, по существу, сходную по меньшей мере с одним локусом иммуноглобулина человека, который функционально перестроен или который был подвергнут функциональной перестройке и который дополнительно содержит структуру миметического антитела, например, описанную в настоящем описании, но не ограничиваясь формулой (I), где части С-концевых вариабельных областей могут использоваться для V, шарнирных областей - для Н, СН2 - для СН2 и СН3 - для СН3, как известно из уровня техники.

Термин «функционально перестроенный», используемый в настоящем описании, относится к сегменту нуклеиновой кислоты из локуса иммуноглобулина, который подвергается ν(Ό)1 рекомбинации с получением, тем самым, гена иммуноглобулина, который кодирует цепь иммуноглобулина (например, тяжелую цепь) или любую его часть. Функционально перестроенный ген иммуноглобулина может быть непосредственно или косвенно идентифицирован с использованием подходящих способов, таких как, например, нуклеотидное секвенирование, гибридизация (например, Саузерн-блоттинг, Нозерн-блоттинг) с использованием зондов, которые могут отжигаться в кодирующих стыках между сегментами гена, или ферментная амплификация генов иммуноглобулинов (например, полимеразная ценная реакция) с праймерами, которые способны отжигаться в кодирующих стыках между сегментами гена. Продуцирует ли клетка миметическое антитело СЬР-1 или его часть или вариант, содержащий конкретную вариабельную

- 10 011583 область или вариабельную область, содержащую конкретную последовательность (например, по меньшей мере одну последовательность Р), также можно определить, используя подходящие способы.

Миметические антитела, конкретные части и варианты по настоящему изобретению также можно получить, используя по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую миметическое антитело ОЬР-1 или его конкретную часть или вариант, с получением трансгенных животных или млекопитающих, таких как козы, коровы, лошади, овцы и т.п., которые продуцируют такие миметические антитела или их конкретные части или варианты в свое молоко. Таких животных можно получить, используя известные способы, которые применяются к последовательностям, кодирующим антитела. См., например, но ими не ограничиваясь, патенты США №№ 5827690; 5849992; 4873316; 5849992; 5994616; 5565362; 5304489 и т.п., каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Миметические антитела, конкретные части и варианты по настоящему изобретению дополнительно можно получить, используя по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую миметическое антитело ОЬР-1 или его конкретную часть или вариант, с получением трансгенных растений и культивируемых клеток растений (например, но ими не ограничиваясь, табак и кукуруза), которые продуцируют такие миметические антитела, их конкретные части, или варианты в частях растения или в их культивируемых клетках. В качестве неограничивающего примера можно привести успешное использование листьев трансгенного табака, экспрессирующих рекомбинантные белки, которые продуцировали большое количество рекомбинантных белков, например, используя индуцибельный промотор. См., например, статью Сгатег е! а1., Сигг. Тор. М1сгоЬо1. 1ттипо1. 240: 95-118 (1999) и цитируемые в ней ссылки. Кроме того, трансгенную кукурузу и зерновые использовали для экспрессии белков млекопитающих в коммерческих масштабах с биологической активностью, эквивалентной активности белков млекопитающих, продуцированных в других рекомбинантных системах или очищенных из природных источников. См., например, статью Нооб е! а1., Αάν. Ехр. Меб. Βίο1. 464: 127-147 (1999) и цитируемые в ней ссылки. Антитела также получали в большом количестве из семян трансгенных растений, включая фрагменты антител, такие как одноцепочечные миметические антитела СсРу). включая семена табака и клубни картофеля. См., например, статью Сопгаб е! а1., Р1ап! Мо1. Вю1. 38: 101-109 (1998) и цитируемые в ней ссылки. Таким образом, миметические антитела, их конкретные части и варианты по настоящему изобретению также можно получить известными способами, используя трансгенные растения. См. также, например, статьи Р18сЬег е! а1., Вю!есЬпо1. Арр1. ВюсНет. 30: 99-108 (Ос!., 1999), Ма е! а1., Тгепбк Вю(есЬпо1. 13: 522-7 (1995); Ма е! а1., Р1ап! РЬу8ю1. 109: 341-6 (1995); \У1и1е1ат е! а1., ВюсНет. 8ос. Тгапз. 22: 940-944 (1994) и цитируемые в них ссылки. Вышеупомянутые ссылки приведены в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме.

Миметические антитела по изобретению могут связываться с белковыми лигандами человека с широким диапазоном аффинности (К_с). В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одно миметическое антитело ОЬР-1 человека по настоящему изобретению может необязательно связываться по меньшей мере с одним белковым лигандом с высокой аффинностью. Например, по меньшей мере одно миметическое антитело ОЬР-1 по настоящему изобретению может связываться по меньшей мере с одним белковым лигандом с К_с, равной приблизительно 10^-7 М или меньше, или, более предпочтительно, с К_с, равной приблизительно 0,1-9,9 (или находящейся в любом диапазоне, или имеющей любое значение) х10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10, 10^-11, 10^-12 или 10^-13 М или меньше, или находящейся в любом диапазоне, или имеющей любое значение, как определено в настоящем описании.

Аффинность или авидность миметического антитела ОЬР-1 по меньшей мере для одного белкового лиганда можно определить экспериментально, используя любой подходящий способ, например, использующийся для определения антитело-антигенсвязывающей аффинности или авидности. (См., например, Вег/оШу, е! а1., «АпбЬобу-Апбдеп 1п!егас!юп8, ΐη Рипбатеп!а1 1ттипо1оду, Раи1, ЭД'.Е., Еб., Рагеп Ргезз: №\ν Уогк, ΝΥ (1984); КиЬу, 1аш8 1ттипо1о§у, \У.Н. Ргеетап апб Сотрапу: №\ν Уогк, ΝΥ (1992); и способы, описанные в настоящем описании). Измеренная аффинность взаимодействия конкретного миметического антитела ОЬР-1 с лигандом может меняться при измерении в различных условиях (например, концентрации солей, рН). Таким образом, измерение аффинности и других параметров связывания лигандов (например, К_с, К_а, К_б) предпочтительно осуществляют со стандартизированными растворами миметического антитела ОЬР-1 и лиганда и стандартизированным буфером, таким как буфер, описанный в настоящем описании или известный в данной области.

Молекулы нуклеиновой кислоты

Используя приведенную в настоящем описании информацию, например нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере 90-100% последовательных аминокислот по меньшей мере одной 8ЕО Ш ΝΟ: 1-6, а также по меньшей мере одну часть антитела, в которую встроены вышеупомянутые последовательности, как последовательность Р формулы (I), для создания миметического антитела ОЬР-1 по настоящему изобретению, дополнительно содержащего конкретные фрагменты, варианты или консенсусные последовательности, или депонированный вектор, содержащий по меньшей мере одну из этих последовательностей, можно получить молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, кодирующую по меньшей мере одно миметическое антитело ОЬР-1 или его конкретную часть или вариант, используя способы, описанные в настоящем описании или известные из уровня техники.

- 11 011583

Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут находиться в форме РНК, такой как мРНК, гяРНК, тРНК или любая другая форма, или в форме ДНК, включая, но ими не ограничиваясь, кДНК и геномную ДНК, полученную путем клонирования или полученную искусственно, или любое их сочетание. ДНК может быть трехцепочечной, двухцепочечной, или одноцепочечной, или любым их сочетанием. Любая часть по меньшей мере одной цепи ДНК или РНК может быть кодирующей цепью, также известной как смысловая цепь, или некодирующей цепью, также известной как антисмысловая цепь.

Выделенные молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут включать в себя молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие открытую рамку считывания (ΘΚΡ), необязательно с одним или несколькими интронами; молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие кодирующую последовательность миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта; и молекулы нуклеиновой кислоты, которые содержат нуклеотидную последовательность, по существу, отличную от описанных выше, но которые на основании вырожденности генетического кода могут кодировать по меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1, которое описано в настоящем описании и/или известно из уровня техники. Разумеется, генетический код хорошо известен из уровня техники. Таким образом, специалист в данной области может без труда получить такие вырожденные варианты нуклеиновой кислоты, которые кодируют конкретные миметические антитела СЬР-1 или его конкретные части или варианты по настоящему изобретению. См., например, Ли8иЬе1, с1 а1., кирга, и такие варианты нуклеиновой кислоты входят в рамки настоящего изобретения.

Как указано в настоящем описании, молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, которые содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант, могут включать, но ими не ограничиваясь, молекулы нуклеиновой кислоты, которые, собственно, кодируют аминокислотную последовательность фрагмента миметического антитела СЬР-1; кодирующую последовательность для полноразмерного миметического антитела СЬР-1 или его части; кодирующую последовательность миметического антитела СЬР-1, его фрагмента или части; а также дополнительные последовательности, такие как кодирующая последовательность по меньшей мере одной сигнальной лидерной последовательности или слитого пептида, вместе или в отсутствие вышеупомянутой дополнительной кодирующей последовательности, такой как по меньшей мере один интрон, вместе с дополнительной, некодирующей последовательностью, включая, но ими не ограничиваясь, некодирующие 5'- и 3'-последовательности, такие как транскрибируемые, нетранслируемые последовательности, которые играют роль в транскрипции, процессинге мРНК, включая сигналы сплайсинга и полиаденилирования (например, для связывания рибосом и стабильности мРНК); дополнительную кодирующую последовательность, которая кодирует дополнительные аминокислоты, такие как аминокислоты, обеспечивающие дополнительные функциональные возможности. Таким образом, последовательность, кодирующую миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант, можно слить с маркерной последовательностью, такой как последовательность, кодирующая пептид, что облегчает очистку слитого миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта, содержащего фрагмент или часть миметического антитела СЬР-1.

Полинуклеотиды, которые селективно гибридизируются с описанным полинуклеотидом

Настоящее изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, которые гибридизируются в условиях селективной гибридизации с полинуклеотидом, описанным в настоящем описании, или с другим полинуклеотидом, описанным в настоящем описании, включая его конкретные варианты или части. Таким образом, полинуклеотиды этого варианта осуществления могут использоваться для выделения, обнаружения и/или количественного определения нуклеиновых кислот, содержащих такие полинуклеотиды.

Условия гибридизации с низкой или умеренной жесткостью обычно, но не исключительно, используются для последовательностей с пониженной идентичности последовательности по сравнению с комплементарными последовательностями. Условия с умеренной и высокой жесткостью могут необязательно использоваться для последовательностей с большей идентичностью. Условия с низкой жесткостью делают возможной селективную гибридизацию последовательностей с идентичностью последовательности приблизительно 40-99% и могут использоваться для идентификации ортологичных и паралогичных последовательностей.

Необязательно, полинуклеотиды по настоящему изобретению будут кодировать по меньшей мере часть миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта, кодируемого полинуклеотидами, описанными в настоящем описании.

Полинуклеотиды по настоящему изобретению охватывают последовательности нуклеиновых кислот, которые могут использоваться для селективной гибридизации с полинуклеотидом, кодирующим миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант по настоящему изобретению. См., например, публикации Ли8иЬе1, выше; СоШдап, выше, каждая из которые приведена в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме.

Конструирование нуклеиновых кислот

Выделенные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению можно создать, используя: (а) рекомбинантные методы, (Ь) синтетические методы, (с) методы очистки или их сочетания, известные в данной области.

- 12 011583

Нуклеиновые кислоты могут содержать подходящие последовательности в дополнение к полинуклеотиду по настоящему изобретению. Например, в нуклеиновую кислоту можно встроить сайт мультиклонирования, содержащий один или несколько сайтов для рестриктаз, содействующих выделению полинуклеотида. Кроме того, можно вставлять транслируемые последовательности для облегчения выделения транслированного полинуклеотида пс настоящему изобретению. Например, маркерная последовательность гексагистидина делает более удобным очистку белков по настоящему изобретению. Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению, исключая кодирующую последовательность, необязательно является вектором, адаптером или линкером для клонирования и/или экспрессии полинуклеотида по настоящему изобретению.

К таким последовательностям клонирования и/или экспрессии можно добавить дополнительные последовательности, оптимизирующие их функцию при клонировании и/или экспрессии, помогающие выделению полинуклеотида или помогающие введению полинуклеотида в клетку. Применение векторов клонирования, экспрессионных векторов, адаптеров и линкеров известно в данной области. См., например, АикиЬе1, кирга; или 8ашЬгоок, кирга.

Рекомбинантные способы конструирования нуклеиновых кислот

Композиции выделенной нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, такой как РНК, кДНК, геномная ДНК или любого их сочетания, можно получить из биологических источников, используя любое количество методологий клонирования, известных специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления для идентификации желаемой последовательности в кДНК или геномной библиотеке ДНК используются олигонуклеотидные зонды, которые селективно гибридизируются в условиях с подходящией жесткостью с полинуклеотидами по настоящему изобретению. Методы выделения РНК и конструирования кДНК и геномных библиотек известны среднему специалисту в данной области (см., например, АикиЬе1, кирга или 8атЬгоок, кирга).

Синтетические способы конструирования нуклеиновых кислот

Выделенные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению также могут быть получены прямым химическим синтезом согласно известным методам (см., например, АикиЬе1 е1 а1., кирга). Химический синтез, как правило, дает одноцепочечный олигонуклеотид, который можно преобразовать в двухцепочечную ДНК посредством гибридизации с комплементарной последовательностью или посредством полимеризации с ДНК-полимеразой с использованием одной цепи в качестве матрицы. Специалисту в данной области известно, что, хотя химический синтез ДНК ограничивается последовательностями длиной приблизительно 100 и более оснований, могут быть получены более длинные последовательности с помощью лигирования коротких последовательностей.

Рекомбинантные экспрессионные кассеты

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантной экспрессионной кассете, содержащей нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Для конструирования рекомбинантной экспрессионной кассеты, которую можно ввести по меньшей мере в одну желаемую клетку-хозяин, можно использовать нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, например кДНК или геномную последовательность, кодирующую миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант по настоящему изобретению. Рекомбинантная экспрессионная кассета обычно будет содержать полинуклеотид по настоящему изобретению, связанный через оператор с регуляторной последовательностью, инициирующей экспрессию, которая будет управлять транскрипцией полинуклеотида в намеченной клетке-хозяине. Для управления экспрессией нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут использоваться как гетерологичные, так и негетерологичные (т.е. эндогенные) промоторы.

В некоторых вариантах осуществления выделенные нуклеиновые кислоты, которые служат промотором, энхансером или другими элементами, могут быть встроены в подходящее положение (против хода транскрипции, по ходу транскрипции или в интрон) негетерологичной формы полинуклеотида по настоящему изобретению для увеличения или снижения экспрессии полинуклеотида по настоящему изобретению. Например, эндогенные промоторы могут быть изменены ίη у1уо или ίη νίΙΐΌ с помощью мутации, делеции и/или замены, известных из уровня техники. Полинуклеотид по настоящему изобретению, необязательно, может экспрессироваться в смысловой или антисмысловой ориентации. Следует учитывать, что контроль экспрессии генов как в смысловой, так и в антисмысловой ориентации может прямо влиять на наблюдаемые характеристики. Другой способ супрессии представляет собой смысловую супрессию. Показано, что введение нуклеиновой кислоты в смысловой ориентации служит эффективным средством блокировки транскрипции целевых генов.

Векторы и клетки-хозяева

Настоящее изобретение также относится к векторам, которые содержат выделенные молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, клеткам-хозяевам, в которые с помощью генной инженерии введены рекомбинантные векторы, и к получению по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта рекомбинантными методами, известными из уровня техники. См., например, публикации 8ашЬгоок и др., кирга; АикиЬе1 и др., кирга, каждая из которых приведена в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме.

- 13 011583

Полинуклеотиды можно, необязательно, соединить с вектором, содержащим селективный маркер, для воспроизводства в хозяине. Как правило, плазмидный вектор вводится в клетку с использованием подходящих известных способов, таких как электропорация и т.п., другие известные способы включают применение вектора в виде осадка, такого как осадок с фосфатом кальция, или в комплексе с заряженным липидом. Если вектор является вирусом, его можно упаковать ίη νίίτο, используя подходящую упаковывающую клеточную линию, а затем осуществить трансдукцию клеток-хозяев.

ДНК-вставка должна быть связана с подходящим промотором через оператор. Экспрессионные конструкции могут, кроме того, необязательно содержать сайты для по меньшей мере одного из следующих: инициирования транскрипции, терминации, и, в транскрибируемой области, сайт связывания рибосом для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессированных конструкциями, предпочтительно будет содержать точку инициации трансляции в начале и стоп-кодон (например, ИЛЛ, ИСА или БАС), соответственно, помещенный в конец мРНК, которая будет транслироваться, причем для экспрессии в клетке млекопитающего или эукариотической клетке предпочтительны ИАА и ИАС.

Экспрессионные векторы будут предпочтительно, но необязательно включать по меньшей мере один селектируемый маркер. Такие маркеры включают, например, но ими не ограничиваясь, устойчивость культуры эукариотических клеток к метотрексату (МТХ), дигидрофолатредуктазе (РНТЯ, патенты США №№ 4399216; 4634665; 4656134; 4956288; 5149636; 5179017), ампициллину, неомицину (С418), микофеноловой кислоте или глутаминсинтетазе (С8, патенты США №№ 5122464; 5770359; 5827739) и гены устойчивости к тетрациклину или ампициллину для культивирования в Е. сой и других бактериях или прокариотах (вышеупомянутые патенты приведены в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме). Подходящие питательные среды и условия для вышеописанных клеток-хозяев известны в данной области. Подходящие векторы будут очевидны квалифицированному специалисту в данной области. Введение векторной конструкции в клетку-хозяина можно выполнить с помощью трансфекции с фосфатом кальция; трансфекции, опосредованной РЕАЕ-декстраном; катионной трансфекции, опосредованной липидами; электропорации; трансдукции; инфекции или других известных способов. Такие способы описаны в данной области, например, 8ашЬгоок, зирга, главы 1-4 и 16-18; АизиЬе1, зирга, главы 1, 9, 13, 15, 16.

По меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или его конкретная часть или вариант по настоящему изобретению могут быть экспрессированы в модифицированной форме, такой как слитый белок, и могут содержать не только сигналы секреции, но и дополнительные гетерологичные функциональные области. Например, к Ν-концу миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта можно добавить область дополнительных аминокислот, в частности заряженных аминокислот, чтобы улучшить стабильность и устойчивость в клетке-хозяине, в процессе очистки или во время последующей обработки и хранения. Кроме того, к миметическому антителу СЬР-1 или его конкретной части или варианту по настоящему изобретению можно добавить пептидные остатки, облегчающие очистку. Такие области могут быть удалены перед заключительной обработкой миметического антитела СЬР-1 или по меньшей мере одного его фрагмента. Такие способы описаны во многих стандартных лабораторных руководствах, таких как ЗатЬгоок, зирга, главы 17.29-17.42 и 18.1-18.74; АизиЬе1, зирга, главы 16, 17 и 18.

Специалисты в данной области хорошо знают многочисленные экспрессионные системы, доступные для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей белок по настоящему изобретению.

Иллюстративными культурами клеток, используемыми для получения миметических антител, их конкретных частей или вариантов, являются клетки млекопитающих. Системы клеток млекопитающих часто будут находиться в виде монослоя клеток, хотя также могут использоваться суспензии клеток млекопитающих или биореакторы. В данной области известен ряд подходящих линий клеток-хозяев, способных к экспрессии интактных гликозилированных белков, включая клеточные линии СО8-1 (например, АТСС СНЕ 1650), СОЗ-7 (например, АТСС СКЬ-1651), НЕК293, ВНК21 (например, АТСС СКЬ-10), СНО (например, АТСС СЯЬ 1610, РС-44) и ВЗС-1 (например, АТСС СЯЬ-26), клетки йерС2, Р3Х63Ад8.653, ЗР2/0-Ад14, клетки 293, клетки НеЬа и т.п., которые можно легко приобрести, например, в Атепсап Туре СиЙите Сойесйоп, Мапаззаз, Уа. Предпочтительные клетки-хозяева включают клетки лимфоидного происхождения, такие как клетки лимфомы и миеломы. Особенно предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки Р3Х63Ад8.653 (номер доступа АТСС СКГ-1580) и клетки ЗР2/0Ад14 (номер доступа АТСС СЯЬ-1851).

Экспрессионные векторы для этих клеток могут включать одну или несколько следующих последовательностей, контролирующих экспрессию, таких как, но ими не ограничиваясь, точка начала репликации; промотор, например поздний или ранний промотор 8У40, промотор СМУ (например, патенты США №№ 5168062; 5385839), промотор НЗУ 1к, промотор рдк (фосфоглицераткиназы), промотор ЕТ-1 альфа (например, патент США № 5266491), по меньшей мере один промотор иммуноглобулина человека; энхансер и/или сайт процессинга информации, например сайты связывания рибосом, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования (например, 8У40 - крупный сайт добавления Т Ад поли-А) и последовательности терминатора транскрипции. См., например, АизиЬе1 и др., зирга; ЗатЬтоок и др., зирга. Другие клетки, применимые для получения нуклеиновых кислот или белков по настоящему изобретению,

- 14 011583 известны и/или доступны, например, в Атепсап Туре Си1!иге Со11ес11оп Са!а1одие о£ Се11 Ыпек апй НуЬпботак (те^ет.а!сс.огд) или из других известных или коммерческих источников.

Если используются эукариотические клетки-хозяева, в вектор обычно включают последовательности полиаденилирования или терминатора транскрипции. Примером терминаторной последовательности является полиаденилированная последовательность гена бычьего гормона роста. Также могут включаться последовательности для точного сплайсинга транскрипта. Примером последовательности, участвующей в сплайсинге, служит интрон УР1 из 8У40 (8ргадие, е! а1., 1. Уйо1. 45: 773-781 (1983)). Как известно из уровня техники, в вектор могут быть встроены генные последовательности для управления репликацией в клетке-хозяине.

Очистка миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта

Миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант можно выделить из культур рекомбинантных клеток и очистить известными способами, например, но ими не ограничиваясь, очисткой с помощью белка А, осаждением сульфатом аммония или этанолом, экстракцией кислотой, анионоили катионообменной хроматографией, хроматографией на фосфоцеллюлозе, гидрофобной хроматографией, аффинной хроматографией, хроматографией на гидроксиапатите и лектиновой хроматографией. Для очистки также можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). См., например, СоШдап, Сиггеп! Рго!осо1к ίη 1ттипо1оду, или Сиггеп! Рго!осо1к ίη Рго!еш 8с1епсе, 1оНп \УПеу & 8опк, ΝΥ, ΝΥ, (1997-2003), например, главы 1, 4, 6, 8, 9, 10, каждая из которых приведена в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме.

Миметические антитела или их конкретные части или варианты по настоящему изобретению включают природные очищенные продукты, продукты процессов химического синтеза и продукты, продуцированные рекомбинантными методами в эукариотическом хозяине, включая, например, клетки дрожжей, высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от хозяина, используемого в процессе рекомбинантной продукции, миметическое антитело СЬР-1 или его конкретная часть или вариант по настоящему изобретению могут быть гликозилированными или негликозилированными; предпочтительными являются гликозилированные. Эти способы описаны во многих стандартных лабораторных руководствах, таких как 8атЬгоок, кирга, разделы 17.37-17.42; АикиЬе1, кирга, главы 10, 12, 13, 16, 18 и 20, СоШдап, Рго!еш 8с1епсе, кирга, главы 12-14, все из которых приведены в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме.

Миметические антитела, их конкретные фрагменты и/или варианты

Выделенные миметические антитела по настоящему изобретению включают в себя миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант, кодируемые любым из полинуклеотидов по настоящему изобретению, что более подробно рассмотрено в настоящем описании, или любое выделенное или предварительно обработанное миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант.

Предпочтительно, чтобы миметическое антитело СЬР-1 или лигандсвязывающая часть или вариант связывались по меньшей мере с одним белковым лигандом СЬР-1 и, тем самым, обеспечивали по меньшей мере одну биологическую активность СЬР-1 соответствующему белку или его фрагменту. Различные терапевтически или диагностически значимые белки известны в данной области, и подходящие методы анализа или биологическая активность таких белков тоже известны в данной области.

Неограничивающие примеры подходящих пептидов, вариантов и производных СЬР-1 настоящего изобретения приведены в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 1: Н1к-Хаа2-Хаа3-С1у-Хаа5-Хаа6-Хаа7-Хаа8-Хаа9-Хаа10-Хаа11Хаа12-Хаа13-Хаа14-Хаа15-Хаа16-Хаа17-Хаа18-Хаа19-Хаа20-Хаа21-РНе-Хаа23-Хаа24-Хаа25-Хаа26-Хаа27Хаа28-Хаа29-Хаа30-Хаа31, где Хаа2 представляет собой А1а, С1у, 8ег, ТНг, Ьеи, 11е, Уа1, С1и, Акр или Ьук; Хаа3 представляет собой С1и, Акр или Ьук; Хаа5 представляет собой ТНг, А1а, С1у, 8ег, Ьеи, 11е, Уа1, Агд, Н1к, С1и, Акр или Ьук; Хаа6 представляет собой РНе, Н1к, Тгр или Туг; Хаа7 представляет собой Т1п или Акп; Хаа8 представляет собой 8ег, А1а, С1у, ТНг, Ьеи, 11е, Уа1, С1и, Акр или Ьук; Хаа9 представляет собой Акр или С1и; Хаа10 представляет собой Уа1, А1а, С1у, 8ег, ТНг, Ьеи, 11е, Ме!, Туг, Тгр, Н1к, РНе, С1и, Акр или Ьук; Хаа11 представляет собой 8ег, Уа1, А1а, С1у, ТНг, Ьеи, 11е, С1и, Акр или Ьук; Хаа12 представляет собой 8ег, Уа1, А1а, С1у, ТНг, Ьеи, 11е, С1и, Акр или Ьук; Хаа13 представляет собой Туг, РНе, Тгр, С1и, Акр или Ьук; Хаа14 представляет собой Ьеи, А1а, Ме!, С1у, 8ег, ТНг, Ьеи, 11е, Уа1, С1и, Акр или Ьук; Хаа15 представляет собой С1и, А1а, ТНг, 8ег, С1у, С1п, Акр или Ьук; Хаа16 представляет собой С1у, А1а, 8ег, ТНг, Ьеи, 11е, Уа1, С1п, Акп, Агд, Сук, С1и, Акр или Ьук; Хаа17 представляет собой С1п, Акп, Агд, Н1к, С1и, Акр или Ьук; Хаа18 представляет собой А1а, С1у, 8ег, ТНг, Ьеи, 11е, Уа1, Агд, С1и, Акр или Ьук; Хаа19 представляет собой А1а, С1у, 8ег, ТНг, Ьеи, 11е, Уа1, Ме!, С1и, Акр или Ьук; Хаа20 представляет собой Ьук, Агд, Н1к, С1п, Тгр, Туг, РНе, С1и или Акр; Хаа21 представляет собой С1и, Ьеи, А1а, Н1к, РНе, Туг, Тгр, Агд, С1п, ТНг, 8ег, С1у, Акр или Ьук; Хаа23 представляет собой 11е, А1а, Уа1, Ьеи или С1и; Хаа24 представляет собой А1а, С1у, 8ег, ТНг, Ьеи, 11е, Уа1, Н1к, С1и, Акр или Ьук; Хаа25 представляет собой Тгр, РНе, Туг, С1и, Акр или Ьук; Хаа26 представляет собой Ьеи, С1у, А1а, 8ег, ТНг, 11е, Уа1, С1и, Акр или Ьук; Хаа27 представляет собой Уа1, Ьеи, С1у, А1а, 8ег, ТНг, 11е, Агд, С1и, Акр или Ьук; Хаа28 представляет собой Ьук, Акп, Агд, Н1к, С1и или Акр; Хаа29 представляет собой С1у, А1а, 8ег, ТНг, Ьеи, 11е, Уа1, Агд, Тгр, Туг, РНе, Рго, Н1к, С1и, Акр или Ьук; Хаа30 представляет собой Агд, Н1к, ТНг, 8ег, Тгр, Туг, РНе, С1и, Акр или Ьук; и Хаа31 представляет собой С1у, А1а, 8ег, ТНг, Ьеи, 11е, Уа1, Агд, Тгр, Туг, РНе, Н1к, С1и, Акр, Ьук.

- 15 011583

Другая предпочтительная группа пептидов, вариантов или производных СЬР-1 иллюстрируется 81+) ΙΌ N0: 6: Н1к-Хаа2-Хаа3-С1у-ТЬг-Хаа6-Хаа7-Хаа8-Хаа9-Хаа10-8ег-Хаа12-Туг-Хаа14-С1и-Хаа16Хаа17-Хаа18-Хаа19-Ьук-Хаа21-РЬе-Хаа23-А1а-Тгр-Ьеи-Хаа27-Хаа28-С1у-Хаа30, где Хаа2 представляет собой А1а, С1у или 8ег; Хаа3 представляет собой С1и или Акр; Хааб представляет собой РЬе или Туг; Хаа7 представляет собой ТЬг или Акп; Хаа8 представляет собой 8ег, ТЬг или А1а; Хаа9 представляет собой Акр или С1и; Хаа10 представляет собой Уа1, Ьеи, Ме! или Г1е; Хаа12 представляет собой 8ег или Ьук; Хаа14 представляет собой Ьеи, А1а или Ме!; Хаа16 представляет собой С1у, А1а, С1и или Акр; Хаа17 представляет собой Ст или С1и; Хаа18 представляет собой А1а или Ьук; Хаа19 представляет собой А1а, Уа1, Г1е, Ьеи или Ме!; Хаа21 представляет собой С1и или Ьеи; Хаа23 представляет собой Г1е, А1а, Уа1, Ьеи или С1и; Хаа27 представляет собой Уа1 или Ьук; Хаа28 представляет собой Ьук или Акп; и Хаа30 представляет собой Агд или С1и.

Эти пептиды могут быть получены способами, раскрытыми и/или известными в данной области. Хаа в последовательности (и по всему настоящему описанию, если в конкретном случае не определено иначе) содержат конкретные аминокислотные остатки, их производные или измененные аминокислоты. Поскольку за наблюдаемую ίη νίνο быструю инактивацию введенного СЬР-1 может отвечать фермент дипептидилпептидаза ГУ (ЭРР-ГУ), предпочтительны пептиды, гомологи, аналоги и производные СЬР-1, которые защищены от действия ЭРР-ГУ в случае с миметическим антителом.

Миметическое антитело СЬР-1 или его конкретная часть или вариант, которые частично или предпочтительно, по существу, обладают по меньшей мере одной биологической активностью СЬР-1, могут связывать лиганд СЬР-1 и, таким образом, обеспечивать по меньшей мере одну активность, которая иначе опосредуется через связывание СЬР-1 по меньшей мере с одним лигандом, таким как рецептор СЬР-1, или через другие зависимые от белка или опосредованные белком механизмы. Использованный в настоящем описании термин «активность миметического антитела СЬР-1» относится к миметическому антителу СЬР-1, которое может модулировать или вызывать по меньшей мере одну зависящую от СЬР-1 активность примерно на 20-10000%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000% или более, в зависимости от метода анализа.

Способность миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта обеспечивать по меньшей мере одну зависящую от белка активность, предпочтительно оценивается по меньшей мере одним подходящим методом биологического анализа белка, который описан в настоящем описании и/или известен из уровня техники. Миметическое антитело СЬР-1 человека или его конкретная часть или вариант по настоящему изобретению могут быть подобны любому классу (ГдС, ГдА, ГдМ и т.д.) или изотипу и могут содержать по меньшей мере часть легкой цепи каппа или лямбда. В одном варианте осуществления миметическое антитело СЬР-1 человека или его конкретная часть или вариант содержит вариабельные фрагменты тяжелой цепи ГдС. шарнирную область, СН2 и СН3 по меньшей мере одного изотипа, например ГдС1, ГдС2, ГдС3 или ГдС4.

По меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или его конкретная часть или вариант по изобретению связывается по меньшей мере с одним лигандом, его субъединицей, фрагментом, частью или любым их сочетанием. По меньшей мере один пептид СЬР-1, его вариант или производное по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1, его конкретной части или варианта по настоящему изобретению может необязательно связываться по меньшей мере с одними конкретным эпитопом лиганда. Связываемый эпитоп может содержать любое сочетание по меньшей мере одной аминокислотной последовательности длиной по меньшей мере от 1-3 аминокислот до полноразмерной конкретной части последовательных аминокислот последовательности белкового лиганда, такого как рецептор СЬР-1 или его часть.

Такие миметические антитела можно получить путем соединения различных частей миметического антитела СЬР-1 формулы (I) с использованием известных методов, путем подготовки и экспрессии по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует миметическое антитело СЬР-1, используя известные методы технологии рекомбинантных ДНК, или с использованием любого другого подходящего способа, такого как химический синтез.

Миметические антитела, которые связываются с лигандами СЬР-1 человека, такими как рецепторы, и которые содержат конкретную вариабельную область тяжелой или легкой цепи или ее часть, можно получить, используя подходящие способы, такие как фаговое отображение (Ка!киЬе, Υ., е! а1., Ιη!. ί. Мо1. Меб., 1 (5): 863-868 (1998)), или способы, в которых используются трансгенные животные, как известно из уровня техники. Миметическое антитело СЬР-1, его конкретную часть или вариант можно экспрессировать, используя кодирующую нуклеиновую кислоту или ее часть, в подходящей клетке-хозяине.

Изобретение также относится к миметическим антителам, лигандсвязывающим фрагментам и цепям иммуноглобулина, содержащим аминокислоты в последовательности, по существу, такой же, как аминокислотная последовательность, описанная в настоящем описании. Предпочтительно такие миметические антитела или их фрагменты, связывающиеся с лигандом, могут связываться с лигандами СЬР-1 человека, такими как рецепторы, с высокой аффинностью (например, с К_с, равной приблизительно 10^-7 М или ме

- 16 011583 нее). Аминокислотная последовательность, которая, по существу, такая же, как последовательности, описанные в настоящем описании, включает в себя последовательности, содержащие консервативные замены аминокислот, а также делеции и/или вставки аминокислот. Консервативная замена аминокислоты относится к замене первой аминокислоты второй аминокислотой, которая имеет химические и/или физические свойства (например, заряд, строение, полярность, гидрофобность/гидрофильность), подобные таковым первой аминокислоты. Консервативные замены включают замену одной аминокислоты другой в пределах следующих групп: лизин (К), аргинин (К) и гистидин (Н); аспартат (Ό) и глутамат (Е); аспарагин (Ν), глутамин (О), серин (8), треонин (Т), тирозин (Υ), К, К, Н, Ό и Е; аланин (А), валин (V), лейцин (Ь), изолейцин (I), пролин (Р), фенилаланин (Е), триптофан (V), метионин (М), цистеин (С) и глицин (С); Е, V и Υ; С, 8 и Т.

Коды аминокислот

Аминокислоты, из которых состоят миметические антитела или их конкретные части или варианты по настоящему изобретению, часто обозначают сокращенно. Названия аминокислот могут быть указаны путем обозначения аминокислоты ее однобуквенным кодом, трехбуквенным кодом, названием или кодоном(ами) из трех нуклеотидов, что известно из уровня техники (см. А1Ьей8, В., с1 а1., Мо1еси1аг Вю1оду о£ Т11С Се11, ТЫгб Еб., Саг1аиб РиЬШЫпд, 1пс., №\ν ΥογΕ 1994).

ОДНОБУКВЕННЫЙ ТРЕХБУКВЕННЫЙ НАЗВАНИЕ КОДОН(Ы) ИЗ ТРЕХ

	код	код	НУКЛЕОТИДОВ
А		А1а	Аланин	ССА,	ссс, ссс, сси
С		Суз	Цистеин	ОСС,	иси
ϋ		Азр	Аспарагиновая	САС,	САЦ
Е		С1и	кислота Глутаминовая	САА,	САС
Е		РЬе	кислота Фениланин	иис,	иии
С		С1у	Глицин	ССА,	ссс, ссс, сси
Н		Н1з	Гистидин	САС,	САи
I		Не	Изолейцин	АиА,Аис,Аии
к		Цуз	Лизин	ААА,	ААС
ь		Ьеи	Лейцин	иил,	иис, спа.
м N		Мер ' Азп	Метионин Аспарагин	СПС, дис ААС,	сис, сии ΑΑϋ
Р		Рго	Пролин	ССА,	ссс, ссс, сси
Ω		С1п	Глутамин	САА,	САС
к		Агд	Аргинин	АСА,	АСС, ССА,
3		Зег	Серин	ССС, АСС,	ссс, сси Аси, исд.
т		ТЬе	Треонин	исс, АСА,	исс, иси АСС, АСС, Аси
V		Уа1	Валин	си а,	сис, сис, сии
и Υ		Тгр Туг	Триптофан Тирозин	исс □АС,	ΠΑϋ

Миметическое антитело СЬР-1 или его конкретная часть или вариант по настоящему изобретению могут содержать одну или несколько замен, делеций или добавок аминокислот, возникших либо вследствие естественных мутаций, либо манипуляций человека, как определено в настоящем описании. Эти или другие последовательности, которые могут использоваться по настоящему изобретению, включают, но ими не ограничиваясь, последовательности, представленные в таблице ниже, которые показаны в соответствии с конкретными частями 8ЕЦ ΙΌ N0: 47-64, где составляющая вариабельной области последовательности антитела может без ограничения быть по меньшей мере одной частью по меньшей мере одной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 47-55 или их фрагментов, которые представлены в таблице ниже, дополнительно, необязательно, включая по меньшей мере одну замену, вставку или делецию, как представлено на фиг. 1-9 публикации РСТ \У0 05/05604 (РСТ И804/19898), поданной 24 июня 2004 года и опубликованной 20 января 2005 года, с соответствующими 8ЕЦ ΙΌ N0: 1-9. СН2, СН3 и шарнирная область могут без ограничения быть по меньшей мере одной частью по меньшей мере одной 8ЕЦ ΙΌ N0: 56-64 или их фрагментов, которые описаны в таблице ниже, дополнительно, необязательно, включая по меньшей мере одну замену, вставку или делецию, как представлено на фиг. 32-40 публикации РСТ XV0 05/05604 (РСТ И804/19898), поданной 24 июня 2004 года и опубликованной 20 января 2005 года, с соответствующими 8ЕЦ ΙΌ N0: 32-40. Конечно, число замен аминокислот, которые мог бы произвести квалифицированный специалист, зависит от многих факторов, включая описанные выше. В сущности, число замен, вставок или делеций аминокислот по меньшей мере для одного миметического антитела СЬР-1

- 17 011583 будет составлять не более 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 аминокислоты, например 1-30 или любые диапазон или значение, определенное в настоящем описании.

В формуле I настоящего изобретения ((Р(п)-Ь(о)-У(р)-Н(д)-СН2(г)-СН3(к))(1), части V, Н, СН2, СН3 формулы I могут быть любой подходящей последовательностью человека или последовательностью, совместимой с последовательностью человека, например, как представлено в таблице ниже, где последовательность составляющей вариабельной области антитела может быть, но без ограничения, по меньшей мере одной частью по меньшей мере одной 8ЕО ГО N0: 47-55 или их фрагментов, которые представлены в таблице ниже, дополнительно, необязательно, включая по меньшей мере одну замену, вставку или делецию, которые представлены на фиг. 1-9 публикации РСТ ν0 05/05604 (РСТ И804/19898), поданной 24 июня 2004 года и опубликованной 20 января 2005 года, с соответствующими 8ЕО ГО N0: 1-9; и где СН2, СН3 и шарнирная область могут без ограничения быть по меньшей мере одной частью по меньшей мере одной 8Е0 ГО N0: 56-64 или их фрагментов, которые описаны в таблице ниже, дополнительно, необязательно, включая по меньшей мере одну замену, вставку или делецию, которые дополнительно показаны на фиг. 32-40 публикации РСТ ν0 05/05604 (РСТ И804/19898), поданной 24 июня 2004 года и опубликованной 20 января 2005 года, с соответствующими 8ЕО ГО N0: 32-40 или, как известно в данной области, любым их сочетанием или консенсусной последовательностью или любым их слитым белком, предпочтительно человеческого происхождения или сконструированного так, чтобы минимизировать иммуногенность при введении человеку.

Часть Р может содержать по меньшей мере один терапевтический пептид ОЬР-1, известный из уровня техники или описанный в настоящем описании, например, но ими не ограничиваясь, представленный 8Е0 ГО N0: 1, или любое их сочетание или консенсусную последовательность, или любой их слитый белок. В предпочтительном варианте осуществления часть Р может содержать по меньшей мере один пептид ОЬР-1, имеющий последовательность по меньшей мере одной последовательности 8Е0 ГО N0: 6, или любое их сочетание или консенсусную последовательность, или любой их слитый белок.

Необязательная линкерная последовательность может быть любым подходящим пептидным линкером, который известен в данной области. Предпочтительные последовательности включают любое сочетание О и 8, например Х1-Х2-Х3-Х4-...-Хп, где X может быть О или 8 и η может быть равно 5-30. Неограничивающие примеры включают О8, ОО8, ООО8 (8ЕО ГО N0: 16), О8ООО8 (8ЕО ГО N0: 17), ОО8ООО8 (8ЕО ГО N0: 18), ОО8ООО8ОО (8ЕО ГО N0:19) и ООО8ООО8ОО (8ЕО ГО N0:20) и т.п.

Аминокислоты в миметическом антителе ОЬР-1 или его конкретной части или варианте по настоящему изобретению, являющиеся необходимыми для его активности, можно выявить способами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (например, см. АикиЬе1, кирга, СНарЫк 8, 15; СипшпдНат апб νβΐΐκ, 8с1епсе 244: 1081-1085 (1989)). Последняя процедура встраивает единичные мутации аланина у каждого остатка в молекуле. Полученные в результате мутантные молекулы затем проверяют на биологическую активность, например, но ей не ограничиваясь, по меньшей мере на одну активность, связанную с белком, которая определена в настоящем описании или известна из уровня техники. Сайты, которые являются критическими для связывания миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта, также можно выявить с помощью структурного анализа, такого как кристаллизация, ядерный магнитный резонанс или введение фотоаффинной метки (διηίΐΐι, е! а1., I. Мо1. Βίο1. 224: 899-904 (1992) и бе ^к, е! а1., 8с1епсе 255: 306-312 (1992)).

Миметические антитела или их конкретные части или варианты по настоящему изобретению могут содержать в качестве части Р формулы (Ι), например, но ей не ограничиваясь, по меньшей мере одну часть по меньшей мере одной последовательности 8Е0 ГО N0: 1 и 6. Миметическое антитело ОЬР-1 или его конкретная часть или вариант могут дополнительно необязательно содержать в качестве части Р формулы (Ι) по меньшей мере одну функциональную часть по меньшей мере одного полипептида, по меньшей мере 90-100% по меньшей мере 8Е0 ГО N0: 1 и 6. Неограничивающие варианты, которые могут усиливать или поддерживать по меньшей мере одну активность из перечисленных выше, включают, но ими не ограничиваясь, любые из вышеупомянутых полипептидов, дополнительно содержащие по меньшей мере одну мутацию, соответствующую по меньшей мере одной замене, вставке или делеций, которая незначительно влияет на соответствующую биологическую активность или функции указанного миметического антитела ОЬР-1.

В одном варианте осуществления аминокислотная последовательность Р или его части приблизительно на 90-100% идентична (т.е. 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или любые диапазон или значение из перечисленных) соответствующей аминокислотной последовательности соответствующей части по меньшей мере одной 8Е0 ГО N0: 1 и 6. Предпочтительна 90-100% идентичность аминокислот (т.е. 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или любые диапазон или значение из перечисленных), определенная с использованием подходящего компьютерного алгоритма, который известен из уровня техники.

Миметические антитела или их конкретные части или варианты по настоящему изобретению могут содержать любое число последовательных аминокислотных остатков миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта по настоящему изобретению, где указанное число выбрано из группы целых чисел, составляющих 10-100% от числа последовательных остатков в миметическом антителе ОЬР-1. Необязательно, длина указанной подпоследовательности последовательных аминокислот состав

- 18 011583 ляет по меньшей мере приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 или более аминокислот или любые диапазон или значение из указанных. Кроме того, количество таких последовательностей может быть любым целым числом, выбранным из группы, состоящей из чисел от 1 до 20, таким как по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или больше.

Специалисты примут во внимание, что настоящее изобретение относится по меньшей мере к одному биологически активному миметическому антителу СЬР-1 или его конкретной части или варианту по настоящему изобретению. Биологически активные миметические антитела или их конкретные части или варианты имеют специфическую активность, составляющую по меньшей мере 20, 30 или 40%, и предпочтительно по меньшей мере 50, 60 или 70%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 80, 90 или 95-1000% от активности природного (несинтетического), эндогенного или родственного и известного конструированного или слитого белка или его конкретной части или варианта. Способы анализа и количественного определения ферментативной активности и специфичности по отношению к субстрату известны специалистам в данной области.

Другой аспект изобретения относится к миметическим антителам и лигандсвязывающим фрагментам человека, описанным в настоящем описании, которые изменены путем ковалентного присоединения органического остатка. Такая модификация может создать миметическое антитело СЬР-1 или лигандсвязывающий фрагмент с улучшенными фармакокинетическими свойствами (например, увеличенным ίη νίνο периодом полужизни в сыворотке). Органический остаток может представлять собой линейную или разветвленную гидрофильную полимерную группу, группу жирной кислоты или группу сложного эфира жирной кислоты. В конкретных вариантах осуществления гидрофильная полимерная группа может иметь молекулярную массу от приблизительно 800 до приблизительно 120000 Да и может представлять собой полиалкангликоль (например, полиэтиленгликоль (РЕС), полипропиленгликоль (РРС)), полимер углеводов, полимер аминокислот или поливинилпирролидон, а группа жирной кислоты или сложного эфира жирной кислоты может содержать от приблизительно 8 до приблизительно 40 атомов углерода.

Модифицированные миметические антитела и лигандсвязывающие фрагменты по изобретению могут содержать один или несколько органических остатков, которые ковалентно связаны, непосредственно или опосредованно, с миметическим антителом СЬР-1 или его конкретной частью или вариантом. Каждый органический остаток, соединенный с миметическим антителом СЬР-1 или его лигандсвязывающим фрагментом по изобретению, может быть, независимо, группой гидрофильного полимера, группой жирной кислоты или группой сложного эфира жирной кислоты. Использующийся в настоящем описании термин «жирная кислота» включает монокарбоновые кислоты и дикарбоновые кислоты. «Группа гидрофильного полимера», как термин, использующийся в настоящем списании, относится к органическому полимеру, который более растворим в воде, чем в октане. Например, полилизин более растворим в воде, чем в октане. Таким образом, миметическое антитело СЬР-1, модифицированное путем ковалентного присоединения полилизина, входит в объем изобретения. Гидрофильные полимеры, подходящие для модификации миметических антител по изобретению, могут быть линейными или разветвленными и включают, например, полиалкангликоли (например, РЕС, монометоксиполиэтиленгликоль (тРЕС), РРС и т.п.), углеводы (например, декстран, целлюлозу, олигосахариды, полисахариды и т.п.), полимеры гидрофильных аминокислот (например, полилизин, полиаргинин, полиаспартат и т.п.), полиалканоксиды (например, полиэтиленоксид, полипропиленоксид и т.п.) и поливинилпирролидон. Предпочтительно гидрофильный полимер, который модифицирует миметическое антитело СЬР-1 по изобретению, имеет молекулярную массу от приблизительно 800 до приблизительно 150000 Да как отдельная молекулярная сущность. Например, может использоваться РЕС₂₅₀₀, РЕС₅₀₀₀, РЕС₇₅₀₀, РЕС₉₀₀₀, РЕС1₀₀₀₀, РЕС1₂₅₀₀, РЕС15000 и РЕС20000, где подстрочный индекс представляет собой среднюю молекулярную массу полимера в дальтонах.

Группу гидрофильного полимера можно заместить алкильными группами, группами жирных кислот или группами сложных эфиров жирных кислот в количестве от 1 до приблизительно 6. Гидрофильные полимеры, которые замещены группой жирной кислоты или группой сложного эфира жирной кислоты, можно получить подходящими способами. Например, полимер, содержащий аминогруппу, можно присоединить к карбоксильной группе жирной кислоты или сложного эфира жирной кислоты и активированную карбоксильную группу (например, активированную Ν,Ν-карбонилдиимидазолом) жирной кислоты или сложного эфира жирной кислоты можно присоединить к гидроксильной группе полимера.

Жирные кислоты и сложные эфиры жирных кислот, подходящие для модификации миметических антител по изобретению, могут быть насыщенными или могут быть со степенью ненасыщенности один или более. Жирные кислоты, которые подходят для модификации миметических антител по изобретению, включают, например, н-додеканоат (С₁₂, лаурат), н-тетрадеканоат (С₁₄, миристат), н-октадеканоат (С₁₈, стеарат), н-эйкозанат (С₂₀, арахидат), н-докозаноат (С₂₂, бегенат), н-триаконтаноат (С₃₀), н-тетраконтаноат (С₄₀), цис-Д9-октадеканоат (С₁₈, олеат), полностью цис-Д5,8,11,14-эйкозатетраеноат (С₂₀, арахидоноат), октандиовую кислоту, тетрадекандиовую кислоту, октадекандиовую кислоту, докозандиовую кислоту и т.п. Подходящие сложные эфиры жирных кислот включают моноэфиры дикарбоновых кислот,

- 19 011583 которые содержат линейную или разветвленную низшую алкильную группу. Низшая алкильная группа может содержать от 1 до приблизительно 12, предпочтительно от 1 до приблизительно 6 атомов углерода.

Модифицированные миметические антитела человека и их лигандсвязывающие фрагменты можно получить, используя подходящие способы, такие как реакция с одним и более модифицирующими агентами. «Модифицирующий агент», как термин, использующийся в настоящем описании, относится к подходящей органической группе (например, гидрофильному полимеру, жирной кислоте, сложному эфиру жирной кислоты), которая содержит активирующую группу. «Активирующая группа» представляет собой химический остаток или функциональную группу, которая при подходящих условиях может реагировать со второй химической группой, тем самым, формируя ковалентную связь между модифицирующим агентом и второй химической группой. Например, аминореактивные активирующие группы включают электрофильные группы, такие как тозилат, мезилат, галоген (хлор-, бром-, фтор-, йод-), сложные эфиры Ν-гидроксисукцинимидила (ΝΉ8) и т.п. Активирующие группы, которые могут реагировать с тиолами, включают, например, малеимид, йодацетил, акрилолил, пиридилдисульфиды, тиол 5-тиол-2нитробензойной кислоты (ТNВ-!Ыо1) и т.п. Функциональную альдегидную группу можно присоединить к амин- или гидразидсодержащим молекулам, и азидная группа может реагировать с группой трехвалентного фосфора с образованием фосфорамидатных или фосфоримидных связей. Подходящие методы введения активирующих групп в молекулы известны в данной области (см., например, Негтапкоп, О.Т., Вюсопщда!е Тес11п1С|г1ек, Асабетю Ргекк: 8ап О|едо. СА (1996)). Активирующая группа может быть связана с органической группой (например, гидрофильным полимером, жирной кислотой, сложным эфиром жирной кислоты) непосредственно или через линкерную группу, например двухвалентную группу С1-С12, в которой 1 и более атомов углерода могут быть замещены гетероатомом, таким как кислород, азот или сера. Подходящие линкерные остатки включают, например, тетраэтилгликоль, -(СН₂)₃-, -NН-(СН₂)₆-NН-, -(СН₂)₂-Ж- и -СН₂-Ο-СН₂-СН₂-Ο-СН₂-СН₂-Ο-СН-NН-. Модифицирующие агенты, которые содержат линкерную группу, можно получить, например, посредством реакции моно-Вос-алкиламина (например, моно-Вос-этилендиамина, моно-Вос-диаминогексана) с жирной кислотой в присутствии 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (ЕЭС) с образованием амидной связи между свободным амином и карбоксильной группой жирной кислоты. Защитную группу Вос в продукте можно удалить путем обработки трифторуксусной кислотой (ТЕА), чтобы получить первичный амин, который можно соединить с другой карбоксильной группой, как описано, или подвергнуть реакции с малеиновым ангидридом и полученный в результате продукт циклизовать, чтобы получить активированное малеимидное производное жирной кислоты (см., например, публикацию ТЕотркоп, е! а1., \¥О 92/16221, которая приведена в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме).

Модифицированные миметические антитела по изобретению можно получить путем реакции миметического антитела ОЬР-1 человека или его лигандсвязывающего фрагмента с модифицирующим агентом. Например, органические группы могут быть присоединены к миметическому антителу ОЬР-1 не сайт-специфическим способом с использованием аминореактивного модифицирующего агента, например эфира ΝΉ8 или РЕО. Модифицированные миметические антитела человека или их лигандсвязывающие фрагменты также можно получить восстановлением дисульфидных связей (например, дисульфидных связей внутри цепи) миметического антитела ОЬР-1 или его лигандсвязывающего фрагмента. Восстановленное миметическое антитело ОЬР-1 или его лигандсвязывающий фрагмент затем могут реагировать с тиол-реактивным модифицирующим агентом с образованием модифицированного миметического антитела ОЬР-1 по изобретению. Модифицированные миметические антитела человека и их лигандсвязывающие фрагменты, содержащие органическую группу, которая присоединена к конкретным сайтам миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта по настоящему изобретению, можно получить, используя подходящие способы, такие как обратный протеолиз (Е1ксЕ е! а1., Вюсопщда!е СЕет., 3: 147-153 (1992); \Уег1еп е! а1., Вюсопщда!е СЕет., 5: 411-417 (1994); Китагап е! а1., Рго!еш 8с1. 6 (10): 2233-2241 (1997); 1!оЕ е! а1., Вюогд. СЕет., 24 (1): 59-68 (1996); Саре11ак е! а1., Вю1есЬпо1. Вюепд., 56 (4): 456-463 (1997)), и способы, описанные у Негтапкоп, О.Т., Вюсопщда!е Тес11тс|г1ек, Асабетю Ргекк: 8ап П1едо, СА (1996).

Композиции миметического антитела ОЬР-1

Настоящее изобретение также относится к композиции по меньшей мере одного миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта, содержащей по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6 и более миметических антител или их конкретных частей или вариантов, которые описаны в настоящем описании и/или известны из уровня техники, которые предлагаются в искусственной композиции, смеси или форме. Процентное содержание в таких композициях измеряется по массе, объему, концентрации, молярности, моляльности, например, жидкости или сухого раствора, смесей, суспензий, эмульсии или коллоидов, как известно из уровня техники или описано в настоящем описании.

Такие композиции могут содержать 0,00001-99,9999% по массе, объему, концентрации, молярности или моляльности, например, жидкости, газа или сухих растворов, смесей, суспензии, эмульсий или коллоидов, как известно из уровня техники или описано в настоящем описании, в любом диапазоне или значении, как, например, но ими не ограничиваясь, 0,00001, 0,00003, 0,00005, 0,00009, 0,0001, 0,0003, 0,0005,

- 20 011583

0,0009, 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9%. Такие композиции по настоящему изобретению, тем самым, включают, но без ограничения ими, 0,00001-100 мг/мл и/или 0,00001-100 мг/г.

Композиция может, необязательно, дополнительно содержать эффективное количество по меньшей мере одного соединения или белка, выбранного из по меньшей мере одного лекарственного средства, относящегося к лечению диабета или нарушений метаболизма инсулина, противоинфекционного средства, лекарственного средства, действующего на сердечно-сосудистую (СС) систему, лекарственного средства, действующего на центральную нервную систему (ЦНС), лекарственного средства, действующего на вегетативную нервную систему (ВНС), лекарственного средства, действующего на дыхательные пути, лекарственного средства, действующего на желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), гормонального лекарственного средства, лекарственного средства, действующего на водный или электролитный баланс, гематологического лекарственного средства, противоопухолевого, иммуномодулирующего лекарственного средства, глазного, ушного или назального лекарственного средства, лекарственного средства для местного применения, нутритивного средства и т. п. Такие лекарственные средства известны в данной области, включая препараты, показания, дозирование и введение для каждого из представленных в настоящем описании (см., например, публикации Ыигатд 2001 НапйЬоок оГ 2151 еййюп, Зрппдйоике Согр.,

Зрппдйоике, РА, 2001; НеаЙк РгоГе551опа1'5 Эгид Си1йе 2001, ей., Зкапиоп, ^ίίδοη. 31аид, Ргеп(1се-На11, 1пс., Иррег Зайй1е Ктует, N1; РкаттсоШетару НапйЬоок, ^е11§ е1 а1., ей., Арр1еЮп & Ьапде, 3!атГогй, СТ, каждая из которых приведена в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме).

Средство, относящееся к лечению диабета, может быть по меньшей мере одним, выбранным из глитазонов, инсулина и его производных, сульфонилмочевин, меглитинидов, бигуанидов, ингибиторов альфа-гликозидазы, протеинтирозинфосфоатазы-1В, киназы гликогенсинтазы-3, ингибиторов глюконеогенеза, ингибиторов киназы пируватдегидрогеназы (РЦН), ингибиторов липолиза, ингибиторов окисления жиров, ингибиторов карнитинпальмитоилтрансферазы I и/или II, агонистов бета-3 адренорецепторов, ингибиторов контранспортера натрия и глюкозы (ЗСЬТ) или соединений, которые действуют на один или несколько процессов по меньшей мере из следующего: аутоиммунной супрессии, иммунной регуляции, активации, пролиферации, миграции и/или супрессорной клеточной функции Т-лимфоцитов, ингибирования взаимодействия рецептора Т-лимфоцитов/пептида/МНС-П, индукции анергии Т-лимфоцитов, уничтожения аутореактивных Т-лимфоцитов, снижения транспорта через гематоэнцефалический барьер, нарушения баланса провоспалительных (Тк1) и иммуномодулирующих (Тк2) цитокинов, ингибирования ингибиторов матриксной металлопротеазы, нейропротективного действия, снижения глиоза, стимуляции ремиелинизации.

Противоинфекционное лекарственное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из амебоцидных или антипротозойных средств, антигельминтных средств, противогрибковых средств, противомалярийных, противотуберкулезных или противолепрозных средств, аминогликозидов, пенициллинов, цефалоспоринов, тетрациклинов, сульфониламидов, фторхинолонов, противовирусных средств, макролидных противоинфекционных средств и разных противоинфекционных средств. Лекарственное средство, действующее на СС систему, может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из инотропных, противоаритмических, антиангинальных, антигипертензивных средств, противолипидемических средств и разных сердечно-сосудистых средств. Лекарственное средство, действующее на ЦНС, может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из ненаркотических анальтезирующих средств, или по меньшей мере одним средством, выбранным из жаропонижающих, нестероидных противовоспалительных средств, наркотических или опиоидных анальгетиков, седативных-снотворных, противосудорожных, антидепрессантов, противотревожных средств, антипсихотических средств, стимуляторов центральной нервной системы, противопаркинсонических средств и различных средств, действующих на центральную нервную систему. Лекарственное средство, действующее на ВНС, может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из холинергических средств (парасимпатомиметиков), антихолинергических средств, адренергических средств (симпатомиметиков), адреноблокаторов (симпатолитических средств), миорелаксантов скелетных мышц и блокаторов нервно-мышечной передачи. Лекарственное средство, действующее на дыхательные пути, может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из антигистаминных средств, бронхолитических средств, отхаркивающих средств или противокашлевых средств и различных препаратов, действующих на дыхательные пути. Лекарственное средство, действующее на ЖКТ, может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из антацидов, адсорбентов, устраняющих метеоризм средств, пищеварительных ферментов, солюбилизаторов желчных конкрементов, антидиарейных средств, слабительных средств, противорвотных средств и противоязвенных средств. Гормональное лекарственное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из кортикостероидов, андрогенов, анаболических стероидов, эстрогенов, прогестинов, гонадотропинов, противодиабетических препаратов, по меньшей мере одним средством, выбранным из глюкагона, гормонов щитовидной железы, антагонистов гормонов щитовидной железы, гормонов

- 21 011583 гипофиза и средств, подобных паратиреоидному гормону. Лекарственное средство, действующее на водный и электролитный баланс, может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из мочегонных средств, электролитов, замещающих растворов, подкисляющих и подщелачивающих растворов. Гематологическое лекарственное средство может быть по меньшей мере одним, выбранным из средств, повышающих содержание эритроцитов и/или гемоглобина, противосвертывающих средств, препаратов крови и тромболитических ферментов. Противоопухолевые средства могут быть по меньшей мере одним средством, выбранным из алкилирующих средств, антиметаболитов, противоопухолевых антибиотиков, противоопухолевых средств, изменяющих гормональный баланс, и разных противоопухолевых средств. Иммуномодулирующее лекарственное средство может быть меньшей мере одним средством, выбранным из иммунодепрессантов, вакцин, анатоксинов, антитоксинов, противоядий, иммунных сывороток и модификаторов биологических реакций. Глазные, ушные и назальные лекарственные средства могут быть по меньшей мере одним средством, выбранным из глазных противоинфекционных средств, глазных противовоспалительных средств, миотических средств, мидриатических средств, средств, сужающих сосуды глаза, и разных глазных, ушных, назальных средств. Лекарственное средство для местного применения может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из местных противоинфекционных средств, средств, убивающих чесоточных клещей, средств, убивающих вшей, и кортикостероидов для местного применения. Нутритивное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из витаминов, минеральных веществ и калорийных средств. См., например, содержание вышеупомянутой публикации Νιπκίηβ 2001 Эгид НаибЬоок.

По меньшей мере одно амебоцидное или антипротозойное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из атоваквона, хлорохина гидрохлорида, хлорохина фосфата, метронидазола, метронидазола гидрохлорида и пентамидина изетионата. По меньшей мере одно антигельминтное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из мебендазола, пирантела памоата и тиабендазола. По меньшей мере одно противогрибковое средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из амфотерицина В, комплекса амфотерицина В и холестирилсульфата, липидного комплекса амфотерицина В, липосомного амфотерицина В, флуконазола, флуцитозина, микронизированного гризеофульвина, ультрамикронизированного гризеофульвина, итраконазола, кетоконазола, нистатина и тербинафина гидрохлорида. По меньшей мере одно противомалярийное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из хлорохина гидрохлорида, хлорохина фосфата, доксициклина, гидроксихлорохина сульфата, мефлохина гидрохлорида, примахина фосфата, пириметамина и пириметамина с сульфадоксином. По меньшей мере одно противотуберкулезное или противолепрозное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из клофазимина, циклосерина, дапсона, этамбутола гидрохлорида, изониазида, пиразинамида, рифабутина, рифампина, рифапентина и стрептомицина сульфата. По меньшей мере один аминогликозид может быть по меньшей мере одним аминогликозидом, выбранным из амикацина сульфата, гентамицина сульфата, неомицина сульфата, стрептомицина сульфата и тобрамицина сульфата. По меньшей мере один пенициллин может быть по меньшей мере одним, выбранным из амоксициллина/клавуланата натрия, амоксициллина тригидрата, ампициллина, ампициллина натрия, ампициллина тригидрата, ампициллина натрия/сульбактама натрия, клоксациллина натрия, диклоксациллина натрия, мезлоциллина натрия, нафциллина натрия, оксациллина натрия, бензатинбензилпенициллина, бензилпенициллина натрия, прокаинбензилпенициллина, феноксиметилпенициллина натрия, пиперациллина натрия, пиперациллина натрия/тазобактама натрия, тикарциллина динатрия и тикарциллина динатрия/клавуланата натрия. По меньшей мере один цефалоспорин может быть по меньшей мере одним, выбранным из цефаклора, цефадроксила, цефазолина натрия, цефдинира, цефепима гидрохлорида, цефиксима, цефметазола натрия, цефоницида натрия, цефоперазона натрия, цефотаксима натрия, цефотетана динатрия, цефокситина натрия, цефподоксима проксетила, цефпрозила, цефтазидима, цефтибутена, цефтризоксима натрия, цефтриаксона натрия, цефуроксима ацетила, цефуроксима натрия, цефалексина гидрохлорида, цефалексина моногидрата, цефрадина, лоракарбефа. По меньшей мере один тетрациклин может быть по меньшей мере одним, выбранным из демеклоциклина гидрохлорида, доксициклина кальция, доксициклина хиклата, доксициклина гидрохлорида, доксициклина моногидрата, миноциклина гидрохлорида, тетрациклина гидрохлорида. По меньшей мере один сульфаниламид может быть по меньшей мере одним, выбранным из котримоксазола, сульфадиазина, сульфаметоксазола, сульфизоксазола, сульфизоксазола ацетила. По меньшей мере один фторхинолон может быть по меньшей мере одним, выбранным из алатрофлоксацина мезилата, ципрофлоксацина, эноксацина, левофлоксацина, ломефлоксацина гидрохлорида, налидиксовой кислоты, норфлоксацина, офлоксацина, спарфлоксацина, тровафлоксацина мезилата. По меньшей мере одно противовирусное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из абакавира сульфата, ацикловира натрия, амантадина гидрохлорида, ампренавира, цидофовира, делавирдина мезилата, диданозина, эфавиренза, фамцикловира, фомивирсена натрия, фоскарнета натрия, ганцикловира, индинавира сульфата, ламивудина, ламивудина/зидовудина, нелфинавира мезилата, невирапина, оселтамивира фосфата, рибавирина, римантадина гидрохлорида, ритонавира, саквинавира, саквинавира мезилата, ставудина, валацикловира гидрохлорида, зальцитабина, занамивира, зидовудина. По меньшей мере одно макролидное противоинфекционное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из азитромици

- 22 011583 на, кларитромицина, диритромицина, основания эритромицина, эритромицина эстолата, эритромицина этилсукцината, эритромицина лактобионата, эритромицина стеарата. По меньшей мере одно другое противоинфекционное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из азтреонама, бацитрацина, хлорамфеникола натрия сукцината, клиндамицина гидрохлорида, клиндамицина пальмитата гидрохлорида, клиндамицина фосфата, имипенема и циластатина натрия, меропенема, макрокристаллов нитрофурантоина, микрокристаллов нитрофурантоина, квинупристина/далфопристина, спектиномицина гидрохлорида, триметоприма, ванкомицина гидрохлорида (см., например, стр. 24-214 из Мпктд 2001 Эгид НапбЬоок).

По меньшей мере одно инотропное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из амринона лактата, дигоксина, милринона лактата. По меньшей мере одно антиаритмическое средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из аденозина, амиодарона гидрохлорида, атропина сульфата, бретилия тозилата, дилтиазема гидрохлорида, дизопирамида, дизопирамида фосфата, эсмолола гидрохлорида, флекаинида ацетата, ибутилида фумарата, лидокаина гидрохлорида, мексилетина гидрохлорида, морицизина гидрохлорида, фенитоина, фенитоина натрия, прокаинамида гидрохлорида, пропафенона гидрохлорида, пропранолола гидрохлорида, хинидина бисульфата, хинидина глюконата, хинидина полигалактуроната, хинидина сульфата, соталола, токаинида гидрохлорида, верапамила гидрохлорида. По меньшей мере одно антиангинальное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из амлодипина безилата, амилнитрита, бепридила гидрохлорида, дилтиазема гидрохлорида, изосорбида динитрата, изосорбида мононитрата, надолола, никардипина гидрохлорида, нифедипина, нитроглицерина, пропранолола гидрохлорида, верапамила, верапамила гидрохлорида. По меньшей мере одно антигипертензивное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из ацебутолола гидрохлорида, амлодипина безилата, атенолола, беназеприла гидрохлорида, бетаксолола гидрохлорида, бисопролола фумарата, кандесартана цилексетила, каптоприла, картеолола гидрохлорида, карведилола, клонидина, клонидина гидрохлорида, диазоксида, дилтиазема гидрохлорида, доксазозина мезилата, эналаприлата, эналаприла малеата, эпросартана мезилата, фелодипина, фенолдопама мезилата, фозиноприла натрия, гуанабенза ацетата, гуанадрела сульфата, гуанфацина гидрохлорида, гидралазина гидрохлорида, ирбесартана, исрадипина, лабеталола гидрохлорида, лизиноприла, лосартана натрия, метилдопы, метилдопата гидрохлорида, метопролола сукцината, метопролола тартрата, миноксидила, моэксиприла гидрохлорида, надолола, никардипина гидрохлорида, нифедипина, нисолдипина, нитропруссида натрия, пенбутолола сульфата, периндоприла эрбумина, фентоламина мезилата, пиндолола, празозина гидрохлорида, пропранолола гидрохлорида, квинаприла гидрохлорида, рамиприла, телмисартана, теразозина гидрохлорида, тимолола малеата, трандолаприла, валсартана, верапамила гидрохлорида. По меньшей мере одно антилипидемическое средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из аторвастатина кальция, церистатина натрия, холестирамина, колестипола гидрохлорида, фенофибрата (микронизированного), флувастатина натрия, гемфиброзила, ловастатина, ниацина, правастатина натрия, симвастатина. По меньшей мере одно другое СС средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из абсиксимаба, алпростадила, арбутамина гидрохлорида, цилостазола, клопидогрела бисульфата, дипиридамола, эптифибатида, мидодрина гидрохлорида, пентоксифиллина, тиклопидина гидрохлорида, тирофибана гидрохлорида (см., например, стр. 215-336 из Νω^ί^ 2001 Эгид НапбЬоок).

По меньшей мере один ненаркотический анальгетик или жаропонижающее средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из ацетаминофена, аспирина, холина магния трисалицилата, дифлунизала, магния салицилата. По меньшей мере одно нестероидное противовоспалительное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из целекоксиба, диклофенака калия, диклофенака натрия, этодолака, фенопрофена кальция, флурбипрофена, ибупрофена, индометацина, индометацина натрия тригидрата, кетопрофена, кеторолака трометамина, набуметона, напроксена, напроксена натрия, оксапрозина, пироксикама, рофексоксиба, сулиндака. По меньшей мере один наркотический или опиоидный анальгетик может быть по меньшей мере одним, выбранным из алфентанила гидрохлорида, бупренорфина гидрохлорида, буторфанола тартрата, кодеина фосфата, кодеина сульфата, фентанила цитрата, системы для чрескожного введения фентанила, системы для чресслизистого введения фентанила, гидроморфона гидрохлорида, меперидина гидрохлорида, метадона гидрохлорида, морфина гидрохлорида, морфина сульфата, морфина тартрата, налбуфина гидрохлорида, оксикодона гидрохлорида, оксикодона пектината, оксиморфона гидрохлорида, пентазоцина гидрохлорида, сочетания пентазоцина гидрохлорида и налоксона гидрохлорида, пентазоцина лактата, пропоксифена гидрохлорида, пропоксифена напсилата, ремифентанила гидрохлорида, суфентанила цитрата, трамадола гидрохлорида. По меньшей мере одно седативно-снотворное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из хлоралгидрата, эстазолама, флуразепама гидрохлорида, пентобарбитала, пентобарбитала натрия, секобарбитала натрия, темазепама, триазолама, залеплона, золпидема тартрата. По меньшей мере одно противосудорожное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из ацетазоламида натрия, карбамазепина, клоназепама, клоназепама динатрия, диазепама, дивалпроэкса натрия, этосукцимида, фосфенитоина натрия, габапентина, ламотриджина, магния сульфата, фенобарбитала, фенобарбитала натрия, фенитоина, фенитоина натрия, фенитоина натрия (пролонгированного), примидона, тиага

- 23 011583 бина гидрохлорида, топирамата, вальпроата натрия, вальпроевой кислоты. По меньшей мере один антидепрессант может быть по меньшей мере одним, выбранным из амитриптилина гидрохлорида, амитриптилина памоата, амоксапина, бупропиона гидрохлорида, циталопрама гидробромида, кломипрамина гидрохлорида, дезипрамина гидрохлорида, доксепина гидрохлорида, флуоксетина гидрохлорида, имипрамина гидрохлорида, имипрамина памоата, миртазапина, нефазодона гидрохлорида, нортриптилина гидрохлорида, пароксетина гидрохлорида, фенелзина сульфата, сертралина гидрохлорида, транилципромина сульфата, тримипрамина малеата, венлафаксина гидрохлорида. По меньшей мере одно противотревожное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из альпразолама, буспирона гидрохлорида, хлордиазепоксида, хлордиазепоксида гидрохлорида, клоразепата динатрия, диазепама, доксепина гидрохлорида, гидроксизина эмбоната, гидроксизина гидрохлорида, гидроксизина памоата, лоразепама, мепробамата, мидазолама гидрохлорида, оксазепама. По меньшей мере одно антипсихотическое средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из хлорпромазина гидрохлорида, клозапина, флуфеназина деканоата, флуфеназин энантата, флуфеназин гидрохлорида, галоперидола, галоперидола деканоата, галоперидола лактата, локсапина гидрохлорида, локсапина сукцината, мезоридазина безилата, молиндона гидрохлорида, оланзапина, перфеназина, пимозида, прохлорперазина, кветиапина фумарата, рисперидона, тиоридазина гидрохлорида, тиотиксена, тиотиксена гидрохлорида, трифторперазина гидрохлорида. По меньшей мере один стимулятор центральной нервной системы может быть по меньшей мере одним, выбранным из амфетамина сульфата, кофеина, декстроамфетамина сульфата, доксапрама гидрохлорида, метамфетамина гидрохлорида, метилфенидата гидрохлорида, модафинила, пемолина, фентермина гидрохлорида. По меньшей мере одно антипаркинсоническое средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из амантадина гидрохлорида, бензтропина мезилата, биперидена гидрохлорида, биперидена лактата, бромокриптина мезилата, карбидопы-леводопы, энтакапона, леводопы, перголида мезилата, прамипексола дигидрохлорида, ропинирола гидрохлорида, селегилина гидрохлорида, толкапона, тригексифенидила гидрохлорида. По меньшей мере одно из различных средств, действующих на центральную нервную систему, может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из бупропиона гидрохлорида, донепезила гидрохлорида, дроперидола, флувоксамина малеата, лития карбоната, лития цитрата, наратриптана гидрохлорида, никотина полакрилекса, чрескожной системы для введения никотина, пропофола, ризатриптана бензоата, сибутрамина гидрохлорида моногидрата, суматриптана сукцината, такрина гидрохлорида, золмитриптана (см., например, стр. 337-530 из Ыигашд 2001 Эгид НапбЬоок).

По меньшей мере одно холинергическое средство (например, парасимпатомиметик) может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из бетанехола гидрохлорида, эдрофония хлорида, неостигмина бромида, неостигмина метилсульфата, физостигмина салицилата, пиридостигмина бромида. По меньшей мере одно антихолинергическое средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из атропина сульфата, дицикломина гидрохлорида, гликопирролата, гиосциамина, гиосциамина сульфата, пропантелина бромида, скополамина, скополамина бутилбромида, скополамина гидробромида. По меньшей мере одно адренергическое средство (симпатомиметик) может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из добутамина гидрохлорида, допамина гидрохлорида, метараминола битартрата, норэпинефрина битартрата, фенилэфрина гидрохлорида, псевдоэфедрина гидрохлорида, псевдоэфедрина сульфата. По меньшей мере один адреноблокатор (симпатолитик) может быть по меньшей мере одним, выбранным из дигидроэрготамина мезилата, эрготамина тартрата, метисергида малеата, пропранолола гидрохлорида. По меньшей мере один миорелаксант может быть по меньшей мере одним, выбранным из баклофена, каризопродола, хлорзоксазона, циклобензапина гидрохлорида, дантролена натрия, метокарбамола, тизанидина гидрохлорида. По меньшей мере одно средство, блокирующее нервно-мышечную передачу, может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из атракурия безилата, цизатракурия безилата, доксакурия хлорида, мивакурия хлорида, панкурония бромида, пипекурония бромида, рапакурония бромида, рокурония бромида, сукцинилхолина хлорида, тубокурарина хлорида, векурония бромида (см., например, стр. 531-84 из Ыигашд 2001 Эгид НапбЬоок).

По меньшей мере одно антигистаминное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из бромфенирамина малеата, цетиризина гидрохлорида, хлорфенирамина малеата, клемастина фумарата, ципрогептадина гидрохлорида, дифенгидрамина гидрохлорида, фексофенадина гидрохлорида, лоратадина, прометазина гидрохлорида, прометазина теоклата, трипролидина гидрохлорида. По меньшей мере одно бронхорасширяющее средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из альбутерола, альбутерола сульфата, аминофиллина, атропина сульфата, эфедрина сульфата, эпинефрина, эпинефрина битартрата, эпинефрина гидрохлорида, ипратропия бромида, изопротеренола, изопротеренола гидрохлорида, изопротеренола сульфата, левалбутерола гидрохлорида, метопротеренола сульфата, окситрифиллина, пирбутерола ацетата, сальметорола ксинафоата, тербуталина сульфата, теофиллина. По меньшей мере одно отхаркивающее или противокашлевое средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из бензонатата, кодеина фосфата, кодеина сульфата, декстраметорфана гидробромида, дифенилгидрамина гидрохлорида, гуайфенезина, гидроморфона гидрохлорида. По меньшей мере одно другое средство, действующее на дыхательные пути, может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из ацетилцистеина, беклометазона дипропионата, беракранта, будесонида,

- 24 011583 калфактанта, кромолина натрия, дорназы альфа, эпопростенола натрия, флунизолида, флутиказона пропионата, монтелукаста натрия, недокромила натрия, паливизумаба, триамцинолона ацетонида, зафирлукаста, цилеутона (см., например, стр. 585-642 из Ышьтд 2001 Эгид НапбЬоок).

По меньшей мере один антацид, адсорбент или средство, устраняющее метеоризм, может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из алюминия карбоната, алюминия гидроксида, кальция карбоната, магалдрата, магния гидроксида, магния оксида, симетикона и натрия бикарбоната. По меньшей мере один пищеварительный фермент или солюбилизатор желчных конкрементов может быть по меньшей мере одним, выбранным из панкреатина, панкрелипазы и урсодиола. По меньшей мере одно антидиарейное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из аттапульгита, висмута субсалицилата, кальция поликарбофила, дифеноксилата гидрохлорида или атропина сульфата, лоперамида, октреотида ацетата, настойки опиума, настойки опиума (с камфорой). По меньшей мере одно слабительное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из бисакодила, кальция поликарбофила, крушины, ароматического жидкого экстракта крушины, жидкого экстракта крушины, касторового масла, докузата кальция, докузата натрия, глицерина, лактулозы, магния цитрата, магния гидроксида, магния сульфата, метилцеллюлозы, минерального масла, полиэтиленгликоля или раствора электролитов, семени подорожника, сенны, фосфатов натрия. По меньшей мере одно противорвотное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из хлорпромазина гидрохлорида, дименгидрината, доласетрона мезилата, дронабинола, гранисетрона гидрохлорида, меклизина гидрохлорида, метоклопрамида гидрохлорида, ондансетрона гидрохлорида, перфеназина, прохлорперазина, прохлорперазина эдизилата, прохлорперазина малеата, прометазина гидрохлорида, скополамина, триэтилперазина малеата, триметобензамида гидрохлорида. По меньшей мере одно противоязвенное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из циметидина, циметидина гидрохлорида, фамотидина, ланзопразола, мизопростола, низатидина, омепразола, рабепрозола натрия, ранитидина висмута цитрата, ранитидина гидрохлорида, сукралфата (см., например, стр. 643-95 из Шгетд 2001 Эгид НапбЬоок). По меньшей мере один кортикостероид может быть по меньшей мере одним, выбранным из бетаметазона, бетаметазона ацетата или бетаметазона натрия фосфата, кортизона ацетата, дексаметазона, дексаметазона ацетата, дексаметазона натрия фосфата, флудрокортизона ацетата, гидрокортизона, гидрокортизона ацетата, гидрокортизона ципионата, гидрокортизона натрия фосфата, гидрокортизона натрия сукцината, метилпреднизолона, метилпреднизолона ацетата, метилпреднизолона натрия сукцината, преднизолона, преднизолона ацетата, преднизолона натрия фосфата, преднизолона тебутата, преднизона, триамцинолона, триамцинолона ацетонида, триамцинолона диацетата. По меньшей мере один андроген или анаболический стероид может быть по меньшей мере одним, выбранным из даназола, флуоксиместерона, метилтестостерона, нандролона деканоата, нандролона фенпропионата, тестостерона, тестостерона ципионата, тестостерона энантата, тестостерона пропионата, системы для чрескожного введения тестостерона. По меньшей мере один эстроген или прогестин может быть по меньшей мере одним, выбранным из этерифицированных эстрогенов, эстрадиола, эстрадиола ципионата, системы для чрескожного введения эстрадиола/норэтиндрона ацетата, эстрадиола валерата, эстрогенов (конъюгированных), эстропипата, этинилэстрадиола, этинилэстрадиола и дезогестрела, этинилэстрадиола и этинодиола диацетата, этинилэстрадиола и левоноргестрела, этинилэстрадиола и норэтиндрона, этинилэстрадиола и норэтиндрона ацетата, этинилэстрадиола и норгестимата, этинилэстрадиола и норгестрела, этинилэстрадиола и норэтиндрона ацетата, и фумарата железа, левоноргестрела, медроксипрогестерона ацетата, местранола и норэтиндрона, норэтиндрона, норэтиндрона ацетата, норгестрела, прогестерона. По меньшей мере один гонадотропин может быть по меньшей мере одним, выбранным из ганиреликса ацетата, гонадорелина ацетата, гистрелина ацетата, менотропинов. По меньшей мере одно антидиабетическое средство или глюкагон может быть по меньшей мере одним, выбранным из акарбозы, хлорпропамида, глимепирида, глипизида, глюкагона, глибутида, инсулинов, метформина гидрохлорида, миглитола, пиоглитазона гидрохлорида, репаглинида, розиглитазона малеата, троглитазона. По меньшей мере один гормон щитовидной железы может быть по меньшей мере одним, выбранным из левотироксина натрия, лиотиронина натрия, лиотрикса, тироида. По меньшей мере один антагонист гормонов щитовидной железы может быть по меньшей мере одним, выбранным из метимазола, йодида натрия, йодида калия (насыщенного раствора), пропилтиоурацила, радиоактивного йода (¹³¹1 йодида натрия), концентрированного раствора йода. По меньшей мере один гормон гипофиза может быть по меньшей мере одним, выбранным из кортикотропина, козитропина, десмопрессина ацетата, леупролида ацетата, кортикотропина продленного действия, соматрема, вазопрессина. По меньшей мере одно средство, подобное паратиреоидному гормону, может быть по меньшей мере одним, выбранным из кальцифедиола, кальцитонина (человека), кальцитонина (лосося), кальцитриола, дигидротахистерола, этидроната динатрия (см., например, стр. 696796 из Шгапд 2001 Эгид НапбЬоок).

По меньшей мере один диуретик может быть по меньшей мере одним, выбранным из ацетазоламида, ацетазоламида натрия, амилорида гидрохлорида, буметанида, хлорталидона, этакрината натрия, этакриновой кислоты, фуросемида, гидрохлортиазида, индапамида, маннитола, метолазона, спиронолактона, торсемида, триамтерена, мочевины. По меньшей мере один электролитный или замещающий раствор может быть по меньшей мере одним, выбранным из кальция ацетата, кальция карбоната, кальция хлори

- 25 011583 да, кальция цитрата, кальция глубионата, кальция глюцептата, кальция глюконата, кальция лактата, кальция фосфата (двухосновного), кальция фосфата (трехосновного), декстрана (высокомолекулярного), декстрана (низкомолекулярного), гетастарча, магния хлорида, магния сульфата, калия ацетата, калия бикарбоната, калия хлорида, калия глюконата, раствора Рингера, раствора Рингера (с лактатом), натрия хлорида. По меньшей мере одно подкисляющее или подщелачивающее средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из натрия бикарбоната, натрия лактата, трометамина (см., например, стр. 797-833 из МиМпд 2001 Эгид НапбЬоок).

По меньшей мере одно средство, увеличивающее содержание эритроцитов и/или гемоглобина, может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из железа фумарата, железа глюконата, железа сульфата (безводного), декстрана железа, сорбитола железа, комплекса полисахарид-железо, комплекса натрия-железа глюконат. По меньшей мере одно противосвертывающее средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из ардепарина натрия, далтепарина натрия, данапароида натрия, эноксапарина натрия, гепарина кальция, гепарина натрия, варфарина натрия. По меньшей мере один препарат крови может быть по меньшей мере одним, выбранным из 5% альбумина, 25% альбумина, антигемофильного фактора, комплекса антиингибитора свертывания, антитромбина III (человека), фактора IX (человека), комплекса фактора IX, фракций белков плазмы. По меньшей мере один тромболитический фермент может быть по меньшей мере одним, выбранным из алтеплазы, анистреплазы, ретеплазы (рекомбинантной), стрептокиназы, урокиназы (см., например, стр. 834-66 из ΝιιΐΈίπβ 2001 Эгид НапбЬоок).

По меньшей мере одно алкилирующее средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из бусульфана, карбоплатина, кармустина, хлорамбуцила, цисплатина, циклофосфамида, ифосфамида, ломустина, мехлоретамина гидрохлорида, мелфалана, мелфалана гидрохлорида, стрептозоцина, темозоломида, тиотепы. По меньшей мере один антиметаболит может быть по меньшей мере одним, выбранным из капецитабина, кладрибина, цитарабина, флоксуридина, флударабина фосфата, фторурацила, гидроксимочевины, меркаптопурина, метотрексата, метотрексата натрия, тиогуанина. По меньшей мере один противоопухолевый антибиотик может быть по меньшей мере одним, выбранным из блеомицина сульфата, дактиномицина, липосомального даунорубицина цитрата, даунорубицина гидрохлорида, доксорубицина гидрохлорида, липосомального доксорубицина гидрохлорида, эпирубицина гидрохлорида, идарубицина гидрохлорида, митомицина, пентостатина, пликамицина, валрубицина. По меньшей мере одно противоопухолевое средство, влияющее на гормональный баланс, может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из анастрозола, бикалутамида, эстрамустина фосфата натрия, экземестрана, флутамида, гозерелина ацетата, летрозола, леупролида ацетата, мегестрола ацетата, нилутамида, тамоксифена цитрата, тестолактона, торемифена цитрата. По меньшей мере одно другое противоопухолевое средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из аспарагиназы, бациллы Кальметта-Герена (БЦЖ) (живой внутрипузырной), дакарбазина, доцетаксела, этопозида, этопозида фосфата, гемцитабина гидрохлорида, иринотекана гидрохлорида, митотана, митоксантрона гидрохлорида, паклитаксела, пегаспаргаса, порфимера натрия, прокарбазина гидрохлорида, ритуксимаба, тенипозида, топотекана гидрохлорида, трастузумаба, третиноина, винбластина сульфата, винкристина сульфата, винорелбина тартрата (см., например, стр. 867-963 из Ышьтд 2001 Эгид НапбЬоок).

По меньшей мере один иммунодепрессант может быть по меньшей мере одним, выбранным из азатиоприна, базиликсимаба, циклоспорина, даклизумаба, лимфоцитарного иммуноглобулина, муромонабаСЭ3, микофенолята мофетила, микофенолята мофетила гидрохлорида, сиролимуса, такролимуса. По меньшей мере одна вакцина или анатоксин может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из вакцины БЦЖ, холерной вакцины, дифтерийного и столбнячного анатоксинов (адсорбированных), дифтерийного и столбнячного анатоксинов и бесклеточной коклюшной вакцины (адсорбированных), дифтерийного и столбнячного анатоксинов и цельноклеточной коклюшной вакцины, конъюгированных вакцин против НаеторйПшк Ь, вакцины против гепатита А (инактивированной), вакцины против гепатита В (рекомбинантной), противогриппозной вакцины 1999-2000 годов тривалентного типа А & В (из очищенного поверхностного антигена), противогриппозной вакцины 1999-2000 годов тривалентного типа А & В (субвирионной или из очищенного субвириона), противогриппозной вакцины 1999-2000 годов тривалентного типа А & В (из цельного вириона), вакцины против вируса японского энцефалита (инактивированной), вакцины против лаймской болезни (с рекомбинантным ОкрА), вакцины против вирусов кори, эпидемического паротита и краснухи (живой), вакцины против вирусов кори, эпидемического паротита и краснухи (живой аттенуированной), вакцины против вируса кори (живой аттенуированной), менингококковой полисахаридной вакцины, вакцины против вируса эпидемического паротита (живой), противочумной вакцины, пневмококковой вакцины (поливалентной), полиомиелитной вакцины (инактивированной), полиомиелитной вакцины (живой, пероральной, тривалентной), вакцины против бешенства (адсорбированной), вакцины против бешенства (из диплоидных клеток человека), вакцины против вирусов краснухи и эпидемического паротита (живой), вакцины против вируса кори (живой аттенуированной), столбнячного анатоксина (адсорбированного), столбнячного анатоксина (жидкого), брюшнотифозной вакцины (пероральной), брюшнотифозной вакцины (парентеральной), брюшнотифозной вакцины из полисахарида VI, вакцины против вируса ветряной оспы, вакцины против желтой лихорадки. По меньшей мере один антитоксин или антитоксическая иммунная сыворотка может быть по меньшей мере од

- 26 011583 ним средством, выбранным из сыворотки против яда паука «черная вдова», поливалентной сыворотки против яда змей подсемейства ямкоголовых, дифтерийного антитоксина (лошадиного), сыворотки против яда Мгсгигиз ГиКшз. По меньшей мере одна иммунная сыворотка может быть по меньшей мере одной сывороткой, выбранной из иммуноглобулина против цитомегаловируса (внутривенного), иммуноглобулина против гепатита В (человека), внутримышечного иммуноглобулина, внутривенного иммуноглобулина, антирабического иммуноглобулина (человека), внутривенного иммуноглобулина против респираторного синтициального вируса (человека), иммуноглобулина Η1ι₀(Ό) (человека), внутривенного иммуноглобулина Η1ι₀(Ό) (человека), противостолбнячного иммуноглобулина (человека), иммуноглобулина против вируса сапсе11а-хоз1ег. По меньшей мере один модификатор биологического ответа может быть по меньшей мере одним, выбранным из алдеслейкина, эпоэтина альфа, филграстима, глатирамера ацетата для инъекций, интерферона альфакон-1, интерферона альфа-2а (рекомбинантного), интерферона альфа-2Ь (рекомбинантного), интерферона бета-1а (рекомбинантного), интерферона бета-1Ь (рекомбинантного), интерферона гамма-1Ь, левамизола гидрохлорида, опрелвекина, сарграмостима (см., например, стр. 964-1040 из Шгзтд 2001 Эгид НапбЬоок).

По меньшей мере одно глазное противоинфекционное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из бацитрацина, хлорамфеникола, ципрофлоксацина гидрохлорида, эритромицина, гентамицина сульфата, 0,3% офлоксацина, полимиксина В сульфата, 10% сульфацетамида натрия, 15% сульфацетамида натрия, 30% сульфацетамида натрия, тобрамицина, видарабина. По меньшей мере одно глазное противовоспалительное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из дексаметазона, дексаметазона натрия фосфата, 0,1% диклофенака натрия, флурометолона, флурбипрофена натрия, кеторолака трометамина, преднизолона ацетата (суспензии), преднизолона натрия фосфата (раствора). По меньшей мере одно миотическое средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из ацитилхолина хлорида, карбахолина (внутриглазного), карбахолина (местного), эхотиофата йодида, пилокарпина, пилокарпина гидрохлорида, пилокарпина нитрата. По меньшей мере одно мидриатическое средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из атропина сульфата, циклопентолата гидрохлорида, эпинефрина гидрохлорида, эпинефрина бората, гоматропина гидробромина, фенилэфрина гидрохлорида, скополамина гидробромида, тропикамида. По меньшей мере одно средство, сужающее сосуды глаза, может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из нафазолина гидрохлорида, оксиметазолина гидрохлорида, тетрагидрозолина гидрохлорида. По меньшей мере одно другое глазное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из апраклонидина гидрохлорида, бетаксолола гидрохлорида, бримонидина тартрата, картеолола гидрохлорида, дипивефрина гидрохлорида, дорсоламида гидрохлорида, эмедастина дифумарата, флуоресцеина натрия, кетотифена фумарата, латанопроста, левобунолола гидрохлорида, метипранолола гидрохлорида, натрия хлорида (гипертонического), тимолола малеата. По меньшей мере одно ушное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из борной кислоты, пероксида мочевины, хлорамфеникола, конденсата олеата триэтаноламина полипептида. По меньшей мере одно назальное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из беклометазона дипропионата, будесонида, эфедрина сульфата, эпинефрина гидрохлорида, флунизолида, флутиказона пропионата, нафазолина гидрохлорида, оксиметазолина гидрохлорида, фенилэфрина гидрохлорида, тетрагидрозолина гидрохлорида, триамцинолона ацетонида, ксилометазолина гидрохлорида (см., например, стр. 104197 из Шгзтд 2001 Ргид НапбЬоок).

По меньшей мере одно местное противоинфекционное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из ацикловира, амфотерицина В, крема азелаиновой кислоты, бацитрацина, бутоконазола нитрата, клиндамицина фосфата, клотримазола, эконазола нитрата, эритромицина, гентамицина сульфата, кетоконазола, мафенида ацетата, метронидазола (местного), миконазола нитрата, мупироцина, нафтифина гидрохлорида, неомицина сульфата, нитрофуразона, нистатина, сульфадиазина серебра, тербинафина гидрохлорида, терконазола, тетрациклина гидрохлорида, тиоконазола, толнафтата. По меньшей мере одно средство, уничтожающее чесоточных клещей или вшей, может быть по меньшей мере одним средством, выбранным из кротамитона, линдана, перметрина и пиретринов. По меньшей мере один кортикостероид для местного применения может быть по меньшей мере одним, выбранным из бетаметазона дипропионата, бетаметазона валерата, клобетазола пропионата, дезонида, дезоксиметазона, дексаметазона, дексаметазона натрия фосфата, дифлоразона диацетата, флуоцинолона ацетонида, флуоцинонида, флурандренолида, флутиказона пропионата, халционида, гидрокортизона, гидрокортизона ацетата, гидрокортизона бутирата, гидрокортизона валерата, мометазона фуроата, триамцинолона ацетонида (см., например, стр. 1098-1136 из ΝϋΠίΐ^ 2001 Эгид НапбЬоок).

По меньшей мере один витамин или минеральное вещество могут быть по меньшей мере одним, выбранным из витамина А, комплекса витаминов В, цианокобаламина, фолиевой кислоты, гидроксокобаламина, кальция лейковорина, никотиновой кислоты, никотинамида, пиридоксина гидрохлорида, рибофлавина, тиамина гидрохлорида, витамина С, витамина Ό, холекальциферола, эргокальциферола, аналога витамина Ό, доксекальциферола, парикальцитола, витамина Е, аналога витамина К, фитонадиона, фторида натрия, фторида натрия (местного), микроэлементов, хрома, меди, йода, марганца, селена, цинка. По меньшей мере одно калорийное средство может быть по меньшей мере одним средством, выбран- 27 011583 ным из инфузий аминокислот (кристаллических), инфузий аминокислот в декстрозе, инфузий аминокислот с электролитами, инфузий аминокислот с электролитами в декстрозе, инфузий аминокислот для лечения печеночной недостаточности, инфузий аминокислот при тяжелом метаболическом стрессе, инфузий аминокислот для лечения почечной недостаточности, декстрозы, эмульсий жиров, среднецепочечных триглицеридов (см., например, стр. 1137-63 из Шгктд 2001 Эгид НапбЬоок).

Кроме того, настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одному из любых подходящих и/или эффективных количеств композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант, необязательно дополнительно содержащей эффективное количество по меньшей мере одного другого соединения, белка или композиции, выбранных по меньшей мере из одного антагониста ΤΝΡ (например, но ими не ограничиваясь, химического или белкового антагониста ΤΝΡ, моноклонального или поликлонального антитела к ΤΝΡ или их фрагмента, растворимого рецептора ΤΝΡ (например, р55, р70 или р85) или его фрагмента, их слитых полипептидов или малой молекулы антагониста ΤΝΡ, например ΤΝΡ-связывающого белка I или II (ГВР-1 или ΤΒР-II), нерелимонмаба, инфликсимаба, энтерацепта, СОР-571, СЭР-870, афелимомаба, ленерцепта и т.п.), противоревматического средства (например, метотрексата, ауранофина, ауротиоглюкозы, азатиоприна, этанерцепта, ауротимолата натрия, гидроксихлорохина сульфата, лезфлуномида, сульфасалазина), миорелаксанта, наркотического средства, нестероидного противовоспалительного средства (НПВС), анальгетика, анестетика, седативного средства, средства для местной анестезии, блокатора нервно-мышечной передачи, антимикробного средства (например, аминогликозида, противогрибкового средства, антипапаразитарного средства, антивирусного средства, карбапенема, цефалоспорина, фторхинолона, макролида, пенициллина, сульфаниламида, тетрациклина, другого антимикробного средства), антипсориатического средства, кортикостероида, анаболического стероида, средства для лечения диабета, минерального вещества, нутритивного средства, средства, действующего на щитовидную железу, витамина, гормона, влияющего на обмен кальция, антидиарейного средства, противокашлевого средства, противорвотного средства, противоязвенного средства, слабительного средства, антикоагулянта, эритропоэтина (например, эпоэтина альфа), филграстима (например, С-С8Р, нейпогена), сарграмостима (СМ-С8Р, лейкина), иммунизирующего средства, иммуноглобулина, иммунодепрессанта (например, базиликсимаба, циклоспорина, даклизумаба), гормона роста, заместительного гормонального средства, модулятора рецептора эстрогенов, мидриатического средства, средства, вызывающего паралич аккомодации, алкилирующего средства, антиметаболита, ингибитора митоза, радиофармпрепарата, антидепрессанта, антиманиакального средства, антипсихотического средства, нейролептика, анксиолитика, снотворного средства, симпатомиметика, стимулятора, донепезила, такрина, средства для лечения астмы, бета-агониста, ингаляционного стероида, ингибитора лейкотриенов, метилксантина, кромолина, эпинефрина или его аналога, дорназы альфа (пульмозима), цитокина или антагониста цитокина. Неограничивающие примеры таких цитокинов включают, но без ограничения ими, любой интерлейкин от 1Ь-1 до 1Ь23. Подходящие дозировки известны в данной области. См., например, публикации \Уе11к е! а1., ебк., Рйагтасойегару НапбЬоок, 2пб Ебйюп, Арр1е1оп и Ьапде, 81атГогб, СТ (2000); РЭВ Рйагтасорое1а, Τа^аксоη Роске! Рйагтасорое1а 2000, Эе1ихе Ебйюп, Τа^аксоη РиЬйкйпд, Ьота Ьтба, СА (2000), каждая из которых приведена в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме.

Такие композиции также могут содержать молекулы токсина, которые ассоциированы, связаны, из которых совместно изготовлен препарат или которые совместно вводят по меньшей мере с одним антителом или полипептидом по настоящему изобретению. Необязательно, токсин может действовать, избирательно уничтожая патологическую клетку или ткань. Патологическая клетка может быть раковой или другой клеткой. Такие токсины могут быть, но ими не ограничеваясь, очищенными или рекомбинантными токсинами, или фрагментом токсина, содержащим по меньшей мере один функциональный цитотоксический домен токсина, например, выбранного из по меньшей мере одного из следующих: рицина, токсина дифтерии, токсина животного происхождения или бактериального токсина. Термин «токсин» также включает как эндотоксины, так и экзотоксины, продуцированные любыми природными, мутантными или рекомбинантными бактериями или вирусами, которые могут вызвать любое патологическое состояние у людей и других млекопитающих, включая токсиновый шок, который может привести к смерти. Такие токсины могут включать, но ими не ограничеваясь, термолабильный φΤ) энтеротоксин энтеротоксигенной Е. сой, термостабильный энтеротоксин (8Τ), цитотоксин 8Ыде11а, энтеротоксины Аеготопак, токсин синдрома токсического шока 1 (Τ88Τ-1), стафилококковый энтеротоксин А (8ЕА), В (8ЕВ) или С (8ЕС), стрептококковый энтеротоксин и т. п. Такие бактерии включают, но ими не ограничеваясь, штаммы энтеротоксигенных разновидностей Е. сой (ЕТЕС), энтерогеморрагической Е. сой (например, штаммы серотипа 0157:Н7), виды стафилококков (например, 81арйу1ососсик аигеик, 81арйу1ососсик руодепек), виды 8Ыде11а (например, 8Ыде11а букеШепае, 8Ыде11а Пехпеп, 8Ыде11а Ьоубй и 8Ыде11а коппе1), виды 8а1топе11а (например, 8а1топе11а 1урЫ, 8а1топе11а сйо1ега-кшк, 8а1топе11а еШепйбй), виды С1окйгбшт (например, С1окйгбшт рейлпдепк, С1окйгбшт бйюйе, С1окй1бшт Ьоййпит), виды Сатрй1оЬас1ег (например, СатрЫоЬайег _)е.)иш, СатрЫоЬайег Ге!ик), виды Не1юЬас1ег (например, Не1юЬас1ег ру1оп), виды Аеготопак (например, Аеготопак коЬпа, Аеготопак йубгорййа, Аеготопак сау1ае), РШкотопак кЫде11о1бек, Уегкта ейегосоййса, виды У1Ьпок (например, У1Ьпок сйо1егае, У1Ьпок рагайето1уйсик), виды

- 28 011583

К1еЬк1е11а, Ркеиботоиак аетидтока и стрептококки. См., например, δίοίη, еб., ЮТЕВИАБ ΜΕΌΙΟΙΝΕ, 3тб еб., рр. 1-13, ЬШ1е, ΒΐΌ\νη аиб Со., Вок4ои, (1990); Еуаик е( а1., ебк., Вас(ег1а1 1п£есбоик оГ Нитаик: Ер1бетю1оду аиб Сои1го1, 2б. Еб., рр. 239-254, Р1еиит Меб1са1 Воок Со., №\ν Уогк (1991); Маибе11 е( а1., Рттс1р1ек аиб Ртасйсе оГ [иГесиоик П1кеакек, 3б. Еб., СНигсНШ Ь1утдк4оие, №\ν Уотк (1990); Веткой е( а1., ебк., ТНе Мегск Маииа1, Ι61Η ебШои, Мегск аиб Со., Вайтау, Ν.6., 1992; Уооб е( а1., ЕЕМ8 МютоЬю1оду 1ттиио1оду, 76: 121-134 (1991); Маггаск е( а1., 8с1еисе, 248: 705-711 (1990), данные ссылки приведены в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме.

Композиции миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или вариантов по настоящему изобретению могут дополнительно содержать по меньшей мере одно из любых подходящих вспомогательных средств, например, но ими не ограничиваясь, разбавитель, связующее, стабилизатор, буферы, соли, липофильные растворители, консерванты, адъюванты и т. п. Предпочтительными являются фармацевтически приемлемые вспомогательные средства. Неограничивающие примеры и способы изготовления таких стерильных растворов известны в данной области, например, Семпаго, Еб., Вет1ид£ои'к Рйаттасеийса1 8с1еисек, 18(11 Ебйюи, Маск РиЬйкЫид Со. (Еак4ои, РА) 1990. Фармацевтически приемлемые носители могут быть выбраны по стандартной методике из тех, которые подходят для способа введения, растворимости и/или стабильности композиции миметического антитела СЬР-1, как хорошо известно в данной области или описано в настоящем описании.

Фармацевтические наполнители и добавки, применимые в настоящей композиции, включают, но ими не ограничиваясь, белки, пептиды, аминокислоты, липиды и углеводы (например, сахара, включая моносахариды, ди-, три-, тетра- и олигосахариды; производные сахаров, такие как альдитолы, альдоновые кислоты, этерифицированные сахара и т. п.; и полисахариды или полимеры сахаров), которые могут присутствовать по отдельности или в сочетании, составляя по отдельности или в сочетании от 1 до 99,99% по массе или объему. Иллюстративные белковые наполнители включают сывороточный альбумин, такой как сывороточный альбумин человека (Н8А), рекомбинантный белок человека (гНА), желатин, казеин и т.п. Характерные аминокислоты/компоненты миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта, которые также могут функционировать как буферная емкость, включают аланин, глицин, аргинин, бетаин, гистидин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, цистеин, лизин, лейцин, изолейцин, валин, метионин, фенилаланин, аспартам и т.п. Единственной предпочтительной аминокислотой является глицин.

Углеводные наполнители, подходящие для применения в изобретении, включают, например, моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, Ό-манноза, сорбоза и т.п.; дисахариды, такие как лактоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза и т.п.; полисахариды, такие как раффиноза, мелезитоза, мальтодекстрины, декстраны, крахмалы и т.п.; и альдитолы, такие как маннит, ксилит, мальтит, лактит, ксилит, сорбит (глюцитол), миоинозитол и т.п. Предпочтительными углеводными наполнителями для применения в настоящем изобретении являются маннит, трегалоза и раффиноза.

Композиции миметического антитела СЬР-1 могут содержать также буфер или средство, регулирующее рН; обычно буфер представляет собой соль, полученную из органической кислоты или основания. Типичные буферы включают соли органических кислот, такие как соли лимонной кислоты, аскорбиновой кислоты, глюконовой кислоты, угольной кислоты, винной кислоты, янтарной кислоты, уксусной кислоты или фталевой кислоты; Трис-буфер, трометамина гидрохлорид или фосфатный буфер. Предпочтительные буферы для применения в настоящих композициях являются солями органических кислот, такими как цитрат.

Кроме того, композиции миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или вариантов по изобретению могут содержать полимерные наполнители/добавки, такие как поливинилпирролидоны, фиколлы (полимерный сахар), декстраты (например, циклодекстрины, такие как 2-гидроксипропил-вциклодекстрин), полиэтиленгликоли, ароматические вещества, антимикробные средства, подсластители, антиоксиданты, антистатические средства, поверхностно-активные вещества (например, полисорбаты, такие как «Твин-20» и «Твин-80»), липиды (например, фосфолипиды, жирные кислоты), стероиды (например, холестерин) и хелатирующие средства (например, ЭДТА).

Эти и другие известные фармацевтические наполнители и/или добавки, подходящие для применения в композициях миметического антитела СЬР-1 по изобретению, известны в данной области, как, например, наполнители и/или добавки, перечисленные в «Вет1ид£ои: ТНе 8с1еисе & Ртасйсе оГ РНагтасу», 19(11 еб., ХУИПатк & Уййатк, (1995) и в «РНукЫаи'к Эекк ВеГегеисе», 52иб еб., Мебюа1 Есоиотюк, Мои(уа1е, N6 (1998), раскрытие которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме. Предпочтительные вещества-носители или наполнители представляют собой углеводы (например, сахариды и альдитолы) и буферы (например, цитрат) или полимерные вещества.

Препараты

Как отмечено выше, изобретение относится к стабильным препаратам, которые предпочтительно могут содержать подходящий буфер с физиологическим раствором или выбранной солью, а также, необязательно, к консервированным растворам и препаратам, содержащим консервант, а также к консервированным препаратам для многократного использования, подходящим для фармацевтического или ветеринарного применения, содержащим по меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или его кон

- 29 011583 кретную часть или вариант в фармацевтически приемлемой композиции. Консервированные препараты содержат по меньшей мере один известный консервант или необязательно выбранный из группы, состоящей по меньшей мере из одного консерванта, выбранного из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, фенилмеркурнитрита, феноксиэтанола, формальдегида, хлорбутанола, магния хлорида (например, гексагидрата), алкилпарабена (метил-, этил-, пропил-, бутил- и т.п.), бензалкония хлорида, бензетония хлорида, дегидроацетата натрия и тимеросала или их смесей в водном разбавителе. Может использоваться любая подходящая концентрация или смесь, известная в данной области, такая как 0,001-5%, или любой диапазон или значение из перечисленных, например, но ими не ограничиваясь, 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 или любым диапазоном или значением из перечисленных. Неограничивающие примеры включают отсутствие консерванта, 0,1-2% м-крезола (например, 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,9; 1,0%), 0,1-3% бензилового спирта (например, 0,5; 0,9; 1,1; 1,5; 1,9; 2,0; 2,5%), 0,001-0,5% тимеросала (например, 0,005; 0,01), 0,001-2,0% фенола (например, 0,05; 0,25; 0,28; 0,5 0,9 1,0%), 0,00051,0% алкилпарабена(ов) (например, 0,00075; 0,0009; 0,001; 0,002; 0,005; 0,0075; 0,009; 0,01; 0,02; 0,05; 0,075; 0,09; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 0,75; 0,9; 1,0%) и т.п.

Как отмечено выше, изобретение относится к изделию, содержащему упаковку и по меньшей мере один флакон, содержащий раствор по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта с предписанными буферами и/или консервантами, необязательно в водном разбавителе, где указанная упаковка содержит этикетку, на которой указано, что такой раствор может храниться в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 ч и более. Кроме того, изобретение относится к изделию, содержащему упаковку, первый флакон, содержащий по меньшей мере одно лиофилизованное миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант, и второй флакон, содержащий водный разбавитель, выбранный из заданного буфера или консерванта, где указанная упаковка содержит этикетку с инструкцией для пациента о том, как развести (растворить) по меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант в водном разбавителе, чтобы получить раствор, который можно хранить в течение 24 ч и более.

По меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант, используемые по настоящему изобретению, можно получить рекомбинантными методами, в том числе из клетки млекопитающего или трансгенных препаратов, или их можно выделить в чистом виде из других биологических источников, которые описаны в настоящем описании или известны из уровня техники.

Диапазон количеств по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта в продукте по настоящему изобретению включает количества, полученные при разведении, если они находятся в системе влажный/сухой, в концентрации от приблизительно 1,0 мкг/мл до приблизительно 1000 мг/мл, хотя более низкие и более высокие концентрации являются действующими и зависят от предполагаемого растворителя для: введения, например лекарственные формы в виде раствора будут отличаться от чрескожных пластырей, легочных, чресслизистых или осмотических способов или способов с использованием микронасоса.

Предпочтительно, водный разбавитель необязательно дополнительно содержит фармацевтически приемлемый консервант. Предпочтительные консерванты включают выбранные из группы, состоящей из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, алкилпарабена (метил-, этил-, пропил-, бутил- и т.п.), бензалкония хлорида, бензетония хлорида, дегидроацетата натрия и тимеросала или их смесей. Концентрация консерванта, используемого в препарате, является концентрацией, достаточной, чтобы обеспечить антимикробный эффект. Такие концентрации зависят от выбранного консерванта и легко определяются квалифицированным специалистом.

К разбавителю можно, необязательно и предпочтительно, добавить другие наполнители, например средства, обеспечивающие изотоничность, буферы, антиоксиданты, усилители консервирующего действия. Средство, обеспечивающее изотоничность, такое как глицерин, обычно используется в известных концентрациях. Предпочтительно добавляют физиологически допустимый буфер для обеспечения улучшенного контроля рН. Препараты могут покрывать широкий диапазон рН, такой как от приблизительно рН 4 до приблизительно рН 10, и предпочтительный диапазон составляет от приблизительно рН 5 до приблизительно рН 9, и наиболее предпочтительный диапазон составляет от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0. Предпочтительно препараты по настоящему изобретению имеют рН от приблизительно 6,8 до приблизительно 7,8. Предпочтительные буферы включают фосфатные буферы, наиболее предпочтительно фосфат натрия, в частности физиологический раствор с фосфатным буфером (РВ8).

Чтобы уменьшить агрегацию, к препаратам или композициям можно, необязательно, добавить другие добавки, такие как фармацевтически приемлемые солюбилизаторы, подобные Твин-20 (полиоксиэтилен (20) сорбитан монолаурату), Твин-40 (полиоксиэтилен (20) сорбитан монопальмитату), Твин-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитан моноолеату), Р1игошс Е68 (блок-сополимеру полиоксиэтилена и полипропилена) и РЕС (полиэтиленгликолю), или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбат 20 или 80 или полоксамер 184 или 188, Р1игошс® ро1у1§, другие блоксополимеры и хелатные комплексы, такие как ЭДТА и ЭГДА. Эти добавки особенно полезны, если для введения препарата ис

- 30 011583 пользуется насос или пластмассовый контейнер. Наличие фармацевтически приемлемого поверхностноактивного вещества ослабляет склонность белка к агрегации.

Препараты по настоящему изобретению можно получить способом, который включает смешивание по меньшей мере одного миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта и консерванта, выбранного из группы, состоящей из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, алкилпарабена (метил-, этил-, пропил-, бутил- и т. п.), бензалкония хлорида, бензетония хлорида, дегидроацетата натрия и тимеросала или их смесей в водном разбавителе. Смешивание по меньшей мере одного миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта и консерванта в водном разбавителе выполняют, используя общепринятые процедуры растворения и смешивания. Чтобы приготовить подходящий препарат, например, известное количество по меньшей мере одного миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта в буферном растворе объединяют с желаемым консервантом в буферном растворе в количествах, достаточных, чтобы создать желаемые концентрации белка и консерванта. Различные варианты данного процесса будут ясны среднему специалисту в данной области. Например, порядок добавления компонентов, использование дополнительных добавок, температура и рН, при которых изготовливают препарат, - все являются факторами, которые можно оптимизировать для используемой концентрации и способов введения.

Заявленные препараты можно предоставить пациентам в виде прозрачных растворов или двойных флаконов, содержащих флакон по меньшей мере одного лиофилизованного миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта, которое разводится при помощи второго флакона, содержащего воду, консервант и/или наполнители, предпочтительно фосфатный буфер и/или физиологический раствор и выбранную соль в водном разбавителе. Как одиночный флакон с раствором, так и двойной флакон, требующий разведения, можно использовать многократно, и их может оказаться достаточно для одного или нескольких циклов лечения пациента, что, тем самым, обеспечивает более удобный режим лечения, чем доступные в настоящее время.

Настоящие заявленные изделия применимы как для немедленного введения, так и введения в течение до 24 ч и больше. Соответственно, заявленные здесь изделия обладают существенными преимуществами для пациента. Необязательно, препараты по изобретению могут без риска храниться при температурах от приблизительно 2 до приблизительно 40°С и сохранять биологическую активность белка продолжительное время, тем самым, позволяя указывать на этикетке упаковки, что раствор может храниться и/или использоваться в течение 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 или 96 ч и более. Если используется консервированный разбавитель, такая этикетка может включать указание на применение в течение до по меньшей мере одного из следующих: 1-12 месяцев, полугода, полутора и/или 2 лет.

Растворы по меньшей мере одного миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта по изобретению можно получить способом, который предусматривает смешивание по меньшей мере одного миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта с водным разбавителем. Смешивание выполняют, используя общепринятые процедуры растворения и смешивания. Чтобы получить подходящий разбавитель, например, отмеренное количество по меньшей мере одного миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта в воде или буфере объединяют в количествах, достаточных, чтобы создать желаемую концентрацию белка и, необязательно, консерванта или буфера. Различные варианты данного процесса будут ясны среднему специалисту в данной области. Например, порядок добавления компонентов, использование дополнительных добавок, температура и рН, при которых изготовливают препарат, - все являются факторами, которые можно оптимизировать для используемой концентрации и способов введения.

Заявленные препараты можно предоставить пациентам в виде прозрачных растворов или двойных флаконов, содержащих флакон по меньшей мере одного лиофилизованного миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта, которые разводятся при помощи второго флакона, содержащего воду, консервант и/или наполнители, предпочтительно фосфатный буфер и/или физиологический раствор и выбранную соль в водном разбавителе. Как одиночный флакон с раствором, так и двойной флакон, требующий разведения, можно использовать повторно многократно, и их может оказаться достаточно для одного или нескольких циклов лечения пациента, что, тем самым, обеспечивает более удобный режим лечения, чем доступные в настоящее время.

Заявленные продукты можно обеспечивать пациентам опосредованно, поставляя в аптеки, клиники или другие подобные учреждения и объекты прозрачные растворы или двойные флаконы, содержащие флакон по меньшей мере одного лиофилизованного миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта, которые разводятся при помощи второго флакона, содержащего водный разбавитель. Объем прозрачного раствора в этом случае может составлять до 1 л или более, заполняя крупный резервуар, из которого меньшие части раствора по меньшей мере одного миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта могут быть взяты один или множество раз для переноса в меньшие флаконы и предоставления аптекой или клиникой своим клиентам и/или пациентам.

Известные устройства, содержащие систему с одним флаконом, включают такие ручки-инъекторы для введения раствора, как Нита_)ес!®, NονοРеη®, В-Ό®Реп, Аи!оРеп® и ОрбРеп®. Признанные устройст

- 31 011583 ва, содержащие систему с двумя флаконами, включают такие системы ручек-инъекторов для разведения лиофилизованного препарата в картридже для введения разведенного раствора, как Нита1гоРеп®.

Настоящие заявленные продукты включают упаковку. Упаковка содержит, в дополнение к информации, требуемой органами государственного регулирования, условия, при которых может использоваться продукт. Упаковка по настоящему изобретению предоставляет пациенту инструкции по разведению по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта в водном разбавителе для получения раствора и использования раствора в течение 2-24 ч и более для двух флаконов, с жидкостью/сухим продуктом. Для одиночного флакона - раствора продукта - этикетка указывает, что такой раствор может использоваться в течение 2-24 ч и более. Заявленные продукты пригодны для применения фармацевтических продуктов у человека.

Препараты по настоящему изобретению можно получить способом, который включает смешивание по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта и выбранного буфера, предпочтительно фосфатного буфера, содержащего хлорид натрия или выбранную соль. Смешивание по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта и буфера в водном разбавителе выполняют, используя общепринятые методы растворения и смешивания. Чтобы приготовить подходящий препарат, например, известное количество по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта в воде или буфере объединяют с желаемым буферным агентом в воде в количествах, достаточных, чтобы создать желаемые концентрации белка и буфера. Разновидности данного процесса будут ясны среднему специалисту в данной области. Например, порядок добавления компонентов, использование дополнительных добавок, температура и рН, при которых изготовливают препарат, - все являются факторами, которые можно оптимизировать для используемой концентрации и способов введения.

Заявленные препараты можно предоставить пациентам в виде прозрачных растворов или двойных флаконов, содержащих флакон по меньшей мере одного лиофилизованного миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта, которые разводятся при помощи второго флакона, содержащего консервант или буфер и наполнители в водном разбавителе. Как одиночный флакон с раствором, так и двойной флакон, требующий разведения, можно использовать повторно многократно, и они могут оказаться достаточными для одного или нескольких циклов лечения пациента, что, тем самым, обеспечивает более удобный режим лечения, чем доступные в настоящее время.

По меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или его конкретная часть или вариант либо в стабильных препаратах или растворах, либо в препаратах или растворах с консервирующими агентами, описанных в настоящем описании, могут быть введены пациенту разнообразными методами доставки в соответствии с настоящим изобретением, включая подкожную или внутримышечную инъекцию; чрескожный, легочный, чресслизистый пути, имплантацию, осмотический насос, картридж, микронасос или другие известные из уровня техники способы, значение которых понятно квалифицированному специалисту. Терапевтические применения

Настоящее изобретение, относящееся к миметическим антителам, также относится к способу модуляции или лечения диабета, сахарного диабета типа Ι или типа ΙΙ, в том числе с началом во взрослом или подростковом периоде, инсулинозависимого, инсулиннезависимого и т.п., включая связанные с диабетом проявления, такие как, но ими не ограничиваясь, инсулинорезистентность, гипергликемия, гипогликемия, панкреатит, синдром 8икЫпд, акантокератодермия, липоатрофический диабет, ретинопатия, нефропатия, полинейропатия, мононейропатия, вегетативная нейропатия, язвы, язвы стоп, поражение суставов, инфекции (например, грибковая или бактериальная) и т.п., в клетке, ткани, органе, у животного или пациента.

Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного иммунного заболевания, связанного с диабетом, в клетке, ткани, органе, у животного или пациента, включая, но ими не ограничиваясь, по меньшей мере одно, выбранное из сахарного диабета типа Ι или типа ΙΙ, в том числе с началом во взрослом или подростковом периоде, инсулинозависимого, инсулиннезависимого и т.п., включая связанные с диабетом проявления, такие как, но ими не ограничиваясь, инсулинорезистентность, гипергликемия, гипогликемия, панкреатит, синдром 8икЫпд, акантокератодермия, липоатрофический диабет, ретинопатия, нефропатия, полинейропатия, мононейропатия, вегетативная нейропатия, язвы, язвы стоп, поражение суставов, инфекции (например, грибковая или бактериальная) и т.п. См., например, публикации ТЬе Мегск Мапиа1, 12111-17111 Ебйюпк, Мегск & Сотрапу, Яакгау, N1 (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), РкагтасоШегару НапбЬоок, \Уе11к е! а1., ебк., 8есопй Ебйюп, Арр1е1оп апб Ьапде, 81атГогЧ Сопп. (1998, 2001), каждая из которых приведена в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме.

Такой способ может, необязательно, включать введение эффективного количества по меньшей мере одной композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант в клетку, ткань, орган, животному или пациенту, нуждающемуся в такой модуляции, лечении или терапии.

Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного сердечно-сосудистого заболевания в клетке, ткани, органе, у животного или пациента, включая, но

- 32 011583 ими не ограничиваясь, по меньшей мере одно заболевание, выбранное из синдрома оглушенного миокарда, инфаркта миокарда, застойной сердечной недостаточности, инсульта, ишемического инсульта, кровотечения, артериосклероза, атеросклероза, диабетического атеросклеротического заболевания, гипертензии, артериальной гипертензии, вазоренальной артериальной гипертензии, обморока, шока, сифилиса сердечно-сосудистой системы, сердечной недостаточности, сог ри1топа1е, первичной легочной гипертензии, аритмий сердца, эктопических сокращений предсердий, трепетания предсердий, фибрилляции предсердий (постоянной или пароксизмальной), хаотической или многоочаговой предсердной тахикардии, регулярной тахикардии с узкими комплексами ОКБ, специфических аритмий, фибрилляции желудочков, аритмий, связанных с пучком Гиса, предсердно-желудочковой блокады, блокады ножки пучка, ишемических расстройств миокарда, заболевания коронарных артерий, стенокардии, инфаркта миокарда, кардиомиопатии, дилатационной застойной кардиомиопатии, рестриктивной кардиомиопатии, заболеваний клапанов сердца, эндокардита, заболевания перикарда, опухолей сердца, аневризм аорты и периферических сосудов, расслоения аорты, воспаления аорты, окклюзии брюшной аорты и ее ветвей, периферических сосудистых расстройств, окклюзионных артериальных расстройств, периферического атеросклеротического заболевания, облитерирующего тромбангиита, функциональных периферических артериальных расстройств, феномена и болезни Рейно, акроцианоза, эритромелалгии, заболеваний вен, тромбоза вен, варикозного расширения вен, артериовенозного свища, лимфедемы, липедемы, нестабильной стенокардии, реперфузионного повреждения, синдрома, вызванного искусственным кровообращением, ишемически-реперфузионного повреждения и т.п. Такой способ может необязательно предусматривать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант в клетку, ткань, орган, животному или пациенту, нуждающемуся в такой модуляции, лечении или терапии.

Любой способ по настоящему изобретению может предусматривать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант, в клетку, ткань, орган, животному или пациенту, нуждающемуся в такой модуляции, лечении или терапии. Такой способ может, необязательно, дополнительно предусматривать совместное введение или комбинированную терапию для лечения таких иммунных заболеваний, при которых введение по меньшей мере одного указанного миметического антитела СЬР-1, его конкретной части или варианта, дополнительно предусматривает введение перед, одновременно и/или после введения по меньшей мере одного средства, выбранного по меньшей мере из одного антагониста ΤΝΕ (например, но ими не ограничиваясь, антитела к ΤΝΕ или его фрагмента, растворимого рецептора ΤΝΕ или его фрагмента, их слитый белок или малую молекулу антагониста ΤΝΕ), противоревматического средства, миорелаксанта, наркотического средства, нестероидного противовоспалительного средства (НПВС), анальгетика, анестетика, седативного средства, местного анестетика, блокатора нервно-мышечной передачи, антимикробного средства (например, аминогликозида, противогрибкового средства, антипаразитарного средства, антивирусного средства, карбапенема, цефалоспорина, фторхинолона, макролида, пенициллина, сульфаниламида, тетрациклина, другого антимикробного средства), антипсориатического средства, кортикостероида, анаболического стероида, противодиабетического средства, минерального вещества, нутритивного средства, средства, влияющего на щитовидную железу, витамина, гормона, влияющего на обмен кальция, антидиарейного средства, противокашлевого средства, противорвотного средства, противоязвенного средства, слабительного средства, антикоагулянта, эритропоэтина (например, эпоэтина альфа), филграстима (например, С-СБЕ, нейпогена), сарграмостима (СМСБЕ, лейкина), иммунизирующего средства, иммуноглобулина, иммунодепрессанта (например, базиликсимаба, циклоспорина, даклизумаба), гормона роста, заместительного гормонального средства, модулятора рецептора эстрогенов, мидриатического средства, средства, вызывающего паралич аккомодации, алкилирующего средства, антиметаболита, ингибитора митоза, радиофармпрепарата, антидепрессанта, антиманиакального средства, антипсихотического средства, нейролептика, анксиолитика, снотворного средства, симпатомиметика, стимулятора, донепезила, такрина, средства для лечения астмы, бета-агониста, ингаляционного стероида, ингибитора лейкотриенов, метилксантина, кромолина, эпинефрина или его аналога, дорназы альфа (пульмозима), цитокина или антагониста цитокина. Подходящие дозировки известны в данной области. См., например, публикации \Уе115 е! а1., ебк., РНагтасоШегару НапбЬоок, 2пб Ебйюп, Лрр1е!оп и Ьапде, Б!атГогб, СТ (2000); РОК РНагтасорое1а, Τа^а8соп Роске! РНагтасорое1а 2000, ЬеНгхе Ебйюп, Τа^а8соп РиЬШЫпд, Ьота Ьтба, СА (2000), каждая из которых приведена в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме.

Миметические антитела также могут использоваться ех у1уо, например, в культуре аутологичного костного мозга. Кратко, у пациента перед химиотерапией удаляют костный мозг и обрабатывают ТРО и/или СЬР-1, необязательно в сочетании с миметическими антителами, необязательно в сочетании с одним или несколькими дополнительными цитокинами. Затем обработанный костный мозг вводят пациенту после химиотерапии, чтобы ускорить восстановление костного мозга. Кроме того, ТРО, один и в сочетании с миметическими антителами СЬР-1 и/или СЬР-1, также можно использовать для ех у1уо расселения клеток костного мозга или периферических клеток-предшественников кроветворения (РВРС). Перед лечением химиотерапией костный мозг можно простимулировать фактором стволовой клетки (БСЕ) или

- 33 011583

О-С8Е, чтобы произошло высвобождение ранних клеток-предшественников в периферический кровоток. Этих предшественников необязательно забирают из периферической крови и концентрируют, а затем обрабатывают в культуре с ТРО и миметическими антителами, необязательно в сочетании с одним или несколькими другими цитокинами, включая, но ими не ограничиваясь, 8СЕ, О-С8Е, ГЬ-3, ОМ-С8Е, ГЬ-6 или ГЬ-11, для дифференцировки и пролиферации в высокоплотные культуры мегакариоцитов, которые затем, необязательно, вводят пациенту после химиотерапии высокими дозами. Дозы ТРО для ех νίνο обработки костного мозга будут находиться пределах от 100 пг/мл до 10 нг/мл, предпочтительно от 500 пг/мл до 3 нг/мл. Дозы миметических антител будут эквивалентны по активности ОЬР-1, который может использоваться в количестве от 0,1 до 20 ед./мл, предпочтительно от 0,5 до 2 ед./мл, или любого диапазона или значения из указанных.

Антагонисты ТИР, подходящие для композиций, комбинированной терапии, совместного введения, устройств и/или способов по настоящему изобретению (дополнительно предусматривающих по меньшей мере одно антитело, его конкретную часть и вариант по настоящему изобретению), включают, но ими не ограничиваясь, антитела к Т№, их лигандсвязывающие фрагменты и рецепторные молекулы, которые специфически связываются с Т№; соединения, которые предотвращают и/или ингибируют синтез ТНЕ, высвобождение Т№ или его действие на клетки-мишени, такие как талидомид, тенидап, ингибиторы фосфодиэстеразы (например, пентоксифиллин и ролипрам), агонисты рецептора аденозина А2Ь и энхансеры рецептора аденозина А2Ь; соединения, которые предотвращают и/или ингибируют передачу сигналов от рецептора ТЫР, такие как ингибиторы митоген-активированной протеинкиназы (МАР); соединения, которые блокируют и/или ингибируют разрушение ТНЕ мембраны, такие как ингибиторы металлопротеиназ; соединения, которые блокируют и/или ингибируют активность ТНЕ, такие как ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (АСЕ) (например, каптоприл); и соединения, которые блокируют и/или ингибируют образование и/или синтез Т№, такие как ингибиторы МАР-киназы.

Используемые в настоящем описании «антитело к фактору некроза опухоли», «антитело к ТИР», «антитело к ТМЕа» или фрагмент и т.п. ослабляют, блокируют, ингибируют, устраняют или вмешиваются в активность ТИРа ш νίΐτο, ш кПи и/или, предпочтительно, ш νίνο. Например, подходящее антитело человека к ТНЕ по настоящему изобретению может связывать ТНЕа и включает антитела к ΕΧΕ, его антигенсвязывающие фрагменты и конкретные мутанты или домены, которые специфично связываются с ТНЕа. Подходящее антитело к ТНЕ или его фрагмент также могут ослаблять, блокировать, устранять, вмешиваться, подавлять и/или ингибировать синтез РНК, ДНК или белка ТНЕ, высвобождение !№, передачу сигналов от рецептора ТЫЕ, разрушение ТНЕ мембраны, активность ТНЕ, продуцирование и/или синтез ТНЕ.

Химерное антитело сА2 состоит из антигенсвязывающей вариабельной области нейтрализирующего антитела мыши класса (называемого А2), с высокой аффинностью связывающегося с ТНЕа человека, и константных областей Ιβ61 человека, иммуноглобулина каппа. Ес-домен !дС1 человека улучшает аллогенную эффекторную функцию антитела, увеличивает время полужизни в сыворотке и ослабляет иммуногенность антитела. Авидность и эпитопная специфичность химерного антитела сА2 обусловлены вариабельным регионом антитела мыши А2. В конкретном варианте осуществления предпочтительным источником нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельную область мышиного антитела А2, является клеточная линия гибридомы А2.

Химерное А2 (сА2) дозозависимо нейтрализует цитотоксическое действие и природного, и рекомбинантного ТНЕа человека. На основании анализа связывания химерного антитела сА2 и рекомбинантного ТНЕа человека была вычислена константа аффинности химерного антитела сА2, которая составила 1,04x1010 М^-1. Предпочтительные способы определения специфичности и аффинности моноклональных антител посредством конкурентного ингибирования можно найти в следующих публикациях: Наг1о\у, е! а1., АпЦЬоШек: А ЬаЬота!оту Мапиа1, Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬота!оту Ргекк, Со1б 8ргтд НагЬог, №\ν Уотк, 1988; СоШдап е! а1., ебк., Сштеп! Рго!осо1к т [ттипо1оду, Огеепе РиЬНкЫпд Аккос. апб νίΕν Шегкшепсе, №\ν Уотк, (1992-2003); КохЬог е! а1., Iттиηο1. Тобау, 4: 72-19 (1983); АикиЬе1 е! а1., ебк. Сиггеп! Рго!осо1к 1п Мо1еси1аг Вю1оду, \νίΚν Иегкиепсе, №\ν Уотк (1987-2003); и Ми11ег, МеШ ЕпхутоН, 92: 589-601 (1983), которые приведены в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме.

Дополнительные примеры моноклональных антител к ТНЕ, которые могут использоваться в настоящем изобретении, описаны в данной области (см., например, патент США № 5231024; Мо11ег, А. е! а1., Су!окше 2 (3): 162-169 (1990); заявку на патент США № 07/943852 (поданую 11 сентября 1992 года), Иа111)еп е! а1., международную публикацию № 91/02078 (опубликована 21 февраля 1991 года); КиЬш е! а1., публикацию патента на ОЬР-1 № 0218868 (опубликован 22 апреля 1986 года); Уопе е! а1., публикацию патента на ОЬР-1 № 0288088 (26 октября 1988 года); Ыапд, е! а1., ВюсНет. ВюрНук. Кек. Сотт. 137: 847-854 (1986); Меадег, е! а1., НуЬпбота 6: 305-311 (1987); Еепб1у е! а1., НуЬпбота 6: 359-369 (1987); Вппдтап, е! а1., НуЬпбота 6: 489-507 (1987); и Ниш, е! а1., I. Iттиηο1. Ме!Н. 96: 51-62 (1987), данные ссылки приведены в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме).

Рецепторные молекулы ТНЕ

Предпочтительными рецепторными молекулами !№, применимыми в настоящем изобретении, являются те, которые связываются с ТНЕа с высокой аффинностью (см., например, Ее1бтапп е! а1., между

- 34 011583 народная публикация νΟ 92/07076 (опубликована 30 апреля 1992 года); 8сйа11 е! а1., Се11 67: 361-370 (1990); и Ьоексйег е! а1., Се11 67: 351-359 (1990), данные ссылки приведены в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме) и, необязательно, обладают низкой иммуногенностью. В частности, в настоящем изобретении могут использоваться рецепторы ΤΝΡ поверхности клетки массой 55 кДа (р55 ΤΝΕ-Р) и 75 кДа (р75 ΤΝΕ-Р). Укороченные формы этих рецепторов, содержащие внеклеточные домены (ΈΟΌ) рецепторов или их функциональных частей (см., например, Согсогап е! а1., Еиг. I. Вюсйет. 223: 831-840 (1994)), тоже применимы в настоящем изобретении. Укороченные формы рецепторов ΤΝΡ, содержащие ЕСО, были обнаружены в моче и сыворотке в виде ингибирующих белков массой 30 и 40 кДа, связывающихся с ΤΝΕα (Епде1тапп, Н. е! а1., I. Вю1. Сйет. 265: 1531-1536 (1990)). Дополнительными примерами рецепторных молекул ΤΝΡ, которые могут использоваться в способах и композициях по настоящему изобретению, служат мультимерные рецепторные молекулы ΤΝΡ, и слитые иммунорецепторные молекулы ΤΝΡ, и их производные и фрагменты или части. Рецепторные молекулы ΤΝΡ, которые могут использоваться в настоящем изобретении, характеризуются способностью лечить пациентов длительное время, хорошо или превосходно облегчая симптомы, и низкой токсичностью. В достигнутые результаты лечения могут вносить свой вклад низкая иммуногенность и/или высокая аффинность, а также другие еще не определенные свойства.

Мультимерные рецепторные молекулы ΤΝΡ, применимые в настоящем изобретении, содержат все части или функциональную часть ЕСЭ от двух и более рецепторов ΤΝΡ, связанные посредством одного и более полипептидных линкеров или других, непептидных линкеров, таких как полиэтиленгликоль (РЕС). Мультимерные молекулы могут дополнительно содержать сигнальный пептид секретируемого белка, который управляет экспрессией мультимерной молекулы. Эти мультимерные молекулы и способы их получения описаны в заявке на патент США № 08/437533 (поданной 9 мая 1995 года), содержание которой приведено в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме.

Иммунорецепторные слитые молекулы ΤΝΡ, применимые в способах и композициях по настоящему изобретению, содержат по меньшей мере одну часть одной или нескольких молекул иммуноглобулина и все части или функциональную часть одного и более рецепторов ΤΝΡ. Эти иммунорецепторные слитые молекулы могут быть собраны в виде мономеров или гетеро- или гомомультимеров. Иммунорецепторные слитые молекулы также могут быть моновалентными или поливалентными. Примером такой иммунорецепторной слитой молекулы ΤΝΡ служит слитый белок «рецептор ΤΝΕ/ЦС». Иммунорецепторные слитые молекулы ΤΝΕ и методы их получения описаны в данной области (ЬекИаиег е! а1., Еиг. I. 1ттипо1. 27: 2883-2886 (1991); А^ккепа/! е! а1., Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8сЕ И8А 88: 10535-10539 (1991); Рерре1 е! а1., I. Ехр. Меб. 774: 1483-1489 (1991); Ко115 е! а1., Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8сЕ И8А Р7: 215-219 (1994); Вибег е! а1., Су!окше 6 (6): 616-623 (1994); Вакег е! а1., Еиг. I. 1ттипо1. 24: 2040-2048 (1994); Веи!1ег е! а1., патент США № 5447851; и заявка на патент США № 08/442133 (подана 16 мая 1995 года), каждая из данных публикаций приведена в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме). Способы получения иммунорецепторных слитых молекул можно найти у Сароп е! а1., патент США № 5116964; Сароп е! а1., патент США № 5225538; и Сароп е! а1., Ыа!иге 337: 525-531 (1989), данные ссылки приведены в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме.

Функциональный эквивалент, производное, фрагмент или область рецепторной молекулы ΤΝΕ относится к части рецепторной молекулы ΤΝΕ или части последовательности рецепторной молекулы ΤΝΕ, кодирующей рецепторную молекулу ΤΝΕ, которая имеет достаточный размер и последовательности, чтобы иметь функциональное сходство с рецепторными молекулами ΤΝΕ, которые могут использоваться в настоящем изобретении (например, связывает ΤΝΕα с высокой аффинностью и обладает низкой иммуногенностью). Функциональный эквивалент рецепторной молекулы ΤΝΕ также включает модифицированные рецепторные молекулы ΤΝΕ, которые имеют функциональное сходство с рецепторными молекулами ΤΝΕ, которые могут использоваться в настоящем изобретении (например, связывают ΤΝΕα с высокой аффинностью и обладают низкой иммуногенностью). Например, функциональный эквивалент рецепторной молекулы ΤΝΕ может содержать «8ΙΕΒΝΤ» кодон или одну и более аминокислотных замен, делеций или вставок (например, замену одной кислой аминокислоты другой кислой аминокислотой; или замену одного кодона, кодирующего гидрофобную аминокислоту, другим кодоном, кодирующим ту же самую или другую гидрофобную аминокислоту). См. Аи8иЬе1 е! а1., Сиггеп! Рго!осо1§ ш Мо1еси1аг Вю1оду, Сгеепе РиЬШЫпд А55ос апб V^1еу-Iη!е^8с^еηсе, Νο\ν Уогк (1987-2003).

Цитокины включают, но ими не ограничиваясь, все известные цитокины. См., например, Сореу1!йСу!окте8.сот. Антагонисты цитокинов включают, но ими не ограничиваясь, любое антитело, фрагмент или миметик, любой растворимый рецептор, фрагмент или миметик, любую малую молекулу антагониста или любое их сочетание.

Любой способ по настоящему изобретению может предусматривать способ лечения расстройства, опосредованного белком, предусматривающий введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант, в клетку, ткань, орган, животному или пациенту, нуждающемуся в такой модуляции, лечении или терапии. Такой способ может необязательно дополнительно предусматривать

- 35 011583 совместное введение или комбинированную терапию для лечения таких иммунных заболеваний, где применение по меньшей мере одного указанного миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта дополнительно предусматривает введение перед, одновременно и/или после введения по меньшей мере одного средства, выбранного из по меньшей мере одного другого цитокина, такого как ГЬ-3, -6 и -11; фактора стволовой клетки; С-С8Р и СМ-С8Р.

Как правило, лечение патологических состояний производится путем введения эффективного количества или дозировки по меньшей мере одной композиции миметического антитела СЬР-1, общее количество которой, в среднем, составляет по меньшей мере от приблизительно 0,0001 до 500 мг по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта на килограмм массы пациента на дозу и предпочтительно составляет по меньшей мере от приблизительно 0,001 до 100 мг одного миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта на килограмм массы пациента для однократного или многократного введения, что зависит от специфической активности содержимого композиции. Альтернативно, эффективная концентрация в сыворотке может составлять 0,001-5000 мкг/мл при однократном или многократном введении. Подходящие дозировки известны врачам и будут, конечно, зависеть от конкретного болезненного состояния, конкретной активности вводимой композиции и конкретного пациента, подвергающегося лечению. В некоторых случаях, чтобы получить желаемое терапевтическое количество, может оказаться необходимым обеспечить повторное введение, т.е. повторные отдельные введения конкретной контролируемой или отмеренной дозы, где отдельные введения повторяют до тех пор, пока не будет достигнута желаемая суточная доза или эффект.

Предпочтительные дозы могут необязательно включать 0,0001, 0,0002, 0,0003, 0,0004, 0,0005, 0,0006, 0,0007, 0,0008, 00009, 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 и/или 30 мг/кг/на введение, или любой их диапазон, значение или часть, или достижение концентрации в плазме крови 0,0001, 0,0002, 0,0003, 0,0004, 0,0005, 0,0006, 0,0007, 0,0008, 00009, 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0, 07, 0, 08, 0, 09, 0, 1, 0,5, 0, 9, 1,0, 1, 1, 1,2, 1, 5, 1,9, 2,0, 2,5, 2,9, 3,0, 3,5, 3,9, 4,0, 4,5,

4.9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 20, 12,5,

12.9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5,

10.9, 11, 11,5, 11,9, 12, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14, 14,5, 15, 15,5, 15,9, 16, 16,5, 16,9, 17, 17,5, 17,9, 18, 18,5, 18,9, 19, 19,5, 19,9, 20, 20,5, 20,9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400 и/или 500 мкг/мл серологической концентрации при однократном или многократном введении, любого их диапазона, значения или части.

Альтернативно, введенная дозировка может меняться в зависимости от известных факторов, таких как фармакодинамические особенности конкретного средства и способ и путь его введения; возраст, здоровье и масса реципиента; характер и объем симптомов, вид сопутствующего лечения, частота лечения и желаемый эффект. Обычно дозировка активного ингредиента может составлять приблизительно от 0,0001 до 100 мг/кг массы тела. Обычно, чтобы получить желаемые результаты, эффективными являются 0,001-10 и предпочтительно 0,001-1 мг/кг на введение или в форме с длительным высвобождением.

В качестве неограничивающего примера лечение людей или животных может представлять собой однократное или периодическое дозирование по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта по настоящему изобретению от 0,0001 до 100 мг/кг, например 0,0002, 0,0003, 0,0004, 0,0005, 0,0006, 0,0007, 0,0008, 00009, 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мг/кг в сутки, в течение дней по меньшей мере одного из следующих: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40, или, альтернативно, в течение недель по меньшей мере одной из следующих: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20, или любое их сочетание, при использовании однократной дозы, инфузии или повторных введений доз.

Лекарственные формы (композиции), подходящие для внутреннего введения, как правило, содержат от приблизительно 0,0001 до приблизительно 500 мг активного ингредиента на единицу или контейнер. В этих фармацевтических композициях активный ингредиент будет обычно присутствовать в количестве приблизительно от 0,5 до 99,999 мас.% в расчете на общую массу композиции.

Для парентерального введения на основе миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта можно приготовить раствор, суспензию, эмульсию или лиофилизованный порошок, предоставляемые отдельно или вместе с фармацевтически приемлемым растворителем для парентерального введения. Примерами таких растворителей служат вода, физиологический раствор, раствор Рингера, раствор глюкозы и 5% сывороточный альбумин человека. Также могут использоваться липосомы и неводные растворители, такие как нелетучие масла. Растворитель или лиофилизованный порошок могут содержать добавки, которые поддерживают изотоничность (например, хлорид натрия, маннит) и химическую стабильность (например, буферы и консерванты). Препарат стерилизуют известными или подходящими методами.

- 36 011583

Подходящие фармацевтические носители описаны в последнем издании КеттЦоЮ Рйагтасеи11са1 8с1епсе5, А. 0§о1, стандартном справочнике в данной области.

Терапевтическое введение

Для введения фармацевтически эффективных количеств по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта по настоящему изобретению можно использовать многие известные и разработанные способы. Миметическое антитело СЬР-1 по настоящему изобретению можно вводить в носителе, таком как раствор, эмульсия, коллоид или суспензия, или в виде порошка, используя любое из разнообразных устройств и способов, подходящих для введения посредством ингаляции или других способов, описанных в настоящем описании или известных из уровня техники.

Парентеральные препараты и введение

Препараты для парентерального введения могут содержать в качестве общих наполнителей стерилизованную воду или физиологический раствор, полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль, масла растительного происхождения, гидрогенизированные нафталины и т.п. Водные или масляные суспензии для инъекции можно получить при использовании подходящего эмульгатора или увлажнителя и суспендирующего агента согласно известным способам. Средства для инъекций могут быть нетоксичными, пригодными для неперорального введения разбавителями, такими как водный раствор, или стерильный инъекционный раствор, или суспензия в растворителе. В качестве применимого носителя или растворителя допустимы вода, раствор Рингера, физиологический раствор и т.д., в качестве обычного растворителя или суспендирующего растворителя можно использовать стерильное нелетучее масло. Для этих целей можно использовать любой вид нелетучего масла и жирных кислот, включая природные, или синтетические, или полусинтетические жирные масла или жирные кислоты; природные, или синтетические, или полусинтетические моно-, или ди-, или триглицериды. Парентеральное введение известно из уровня техники и включает, но ими не ограничиваясь, общепринятые способы инъекций, безыгольный инъектор со сжатым газом, описанный в патенте США № 5851198, и лазерное перфорационное устройство, описанное в патенте США № 5839446, которые приведены в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме.

Альтернативное введение

Изобретение дополнительно относится к введению по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта парентеральным, подкожным, внутримышечным, внутривенным, болюсным, влагалищным, ректальным, буккальным, подъязычным, интраназальным или чрескожным путями. Композиции белка, миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта можно приготовить с целью применения для парентерального (подкожного, внутримышечного или внутривенного) введения, в частности, в форме жидких растворов или суспензий; с целью применения путем влагалищного или ректального введения, в частности, в полутвердых формах, таких как кремы и суппозитории; для буккального или подъязычного введения, в частности, в форме таблеток или капсул; или для интраназального введения, в частности, в форме порошков, капель в нос или аэрозолей или определенных агентов; или для чрескожного введения, в частности, в форме геля, мази, лосьона, суспензии или пластырной системы доставки с химическими усилителями, такими как диметилсульфоксид, либо меняющими структуру кожи, либо повышающими концентрацию лекарственного средства в чрескожном пластыре (.Типдтдег, е1 а1. Ιη «Эгид РегтеаРоп Епйапсетеп!»; Нией, Ό 8., Еб§., рр. 59-90 (Магсе1 Оеккег, Мс. №\ν Уогк 1994, приведенные в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме), или с окисляющими агентами, которые делают возможным нанесение на кожу препаратов, содержащих белки и пептиды (ν0 98/53847), или с приложением электрических полей для создания временных транспортных путей, например, путем электропорации, или с увеличением транспорта заряженных препаратов через кожу, например, путем электрофореза, или с применением ультразвука, например, путем сонофореза (патенты США № 4309989 и № 4767402) (вышеупомянутые публикации и патенты приведены в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме).

Введение в легкие/в нос

Для введения в легкие композицию предпочтительно по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта доставляют в частицах с размером, эффективным для достижения нижних дыхательных путей легких или синусов. В соответствии с изобретением по меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант можно ввести с помощью любого из разнообразных ингаляционных или назальных устройств, известных в данной области, для введения терапевтического средства посредством ингаляции. Эти устройства, способные доставлять препараты в виде аэрозолей в полости синусов или альвеолы пациента, включают ингаляторы-дозаторы, распылители, генераторы сухого порошка, пульверизаторы и т.п. Из уровня техники также известны другие устройства, подходящие для управления введением в легкие или нос миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или вариантов. Во всех таких устройствах могут использоваться препараты, подходящие для введения для распределения миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта в аэрозоле. Такие аэрозоли могут состоять из любых растворов (как водных, так и неводных) или твердых частиц. В ингаляторах-дозаторах, подобных ингалятору-дозатору Vеηΐо1^η®, обычно используется газ-вытеснитель, и их требуется приводить в действие во время вдоха (см., например, ν0

- 37 011583

94/16970, АО 98/35888). В ингаляторах сухого порошка, подобных ТигЬиЕа1ег^ТМ (Ак!га), Во!айа1ег® (О1ахо), Эщкик® (О1ахо), ингалятору 8р1гок™ (Оита) устройствам, которые продает 1пЕа1е ТЕегареийск, и в ингаляторе порошка 8ршйа1ег® (Икопк) используется приведение в движение смешанного порошка дыханием (И8 4668218 Ак!га, ЕР 237507 Акйа, АО 97/25086 О1ахо, АО 94/08552 Оига, И8 5458135 1пЕа1е, АО 94/06498 Икопк, приведенные в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме). Распылители, подобные ЛЕВх™ АгаФдт, распылителю И1!гауеп!® (МаШпскгоб!) и распылителю Асогп II® (Магциек! Меб1са1 Ргобис!к) (И8 5404871 АгаФдт, АО 97/22376, вышеупомянутые ссылки приведены в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме), создают аэрозоли из растворов, в то время как ингаляторы-дозаторы, ингаляторы сухого порошка и т.д. создают аэрозоли из мелких частиц. Предполагается, что эти конкретные примеры имеющихся в продаже ингаляционных устройств являются типичными представителями конкретных устройств, подходящих для осуществления настоящего изобретения на практике, и не предполагается, что они ограничивают объем изобретения. Предпочтительно, чтобы композиция, содержащая по меньшей мере одно миметическое антитело ОЬР-1 или его конкретную часть или вариант, вводилась с помощью ингалятора сухого порошка или распылителя. Имеется несколько желательных особенностей ингаляционного устройства для введения по меньшей мере одного миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта по настоящему изобретению. Например, введение с помощью ингаляционного устройства выгодно тем, что оно надежное, воспроизводимое и точное. Ингаляционное устройство необязательно может вводить мелкие сухие частицы, например размером менее приблизительно 10 мкм, предпочтительно приблизительно 1-5 мкм, что способствует хорошей пригодности для вдыхания.

Введение композиций миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или вариантов в виде аэрозоля

Аэрозоль, содержащий композицию белка миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта, можно получить путем нагнетания суспензии или раствора по меньшей мере одного миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта через наконечник под давлением. Размер и конфигурация наконечника, прикладываемое давление и скорость подачи жидкости можно выбирать, чтобы достичь желаемой производительности и размера частиц. Электроаэрозоль можно получить, например, с помощью электрического поля вместе с подачей через капилляр или наконечник. Выгодно, чтобы частицы белка композиции по меньшей мере одного миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта, вводимые распылителем, имели размер частиц менее приблизительно 10 мкм, предпочтительно в пределах от приблизительно 1 до приблизительно 5 мкм и наиболее предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 3 мкм.

Препараты по меньшей мере одного композиционного белка миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта, подходящие для применения в распылителе, обычно содержат белок композиции миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта в водном растворе в концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 20 мг по меньшей мере одного белка композиции миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта на 1 мл раствора. Препарат может содержать такие средства, как наполнитель, буфер, средство, обеспечивающиее изотоничность, консервант, поверхностно-активное вещество и предпочтительно цинк. Препарат также можно содержать наполнитель или средство для стабилизации белка композиции миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта, такое как буфер, восстановитель, белок-наполнитель или углевод. Белки-наполнители, применимые в приготовлении композиции миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта, включают альбумин, протамин и т.п.

Типичные углеводы, применимые для композиции миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта, включают сахарозу, маннит, лактозу, трегалозу, глюкозу и т.п. Препараты белка композиции миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта также могут содержать поверхностно-активное вещество, которое может уменьшить или предотвратить вызванную поверхностным натяжением агрегацию белка композиции миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта, вызванную распылением раствора при образовании аэрозоля. Можно использовать различные общепринятые поверхностно-активные вещества, такие как сложные эфиры полиоксиэтилена и жирных кислот и спиртов, и сложные эфиры полиоксиэтилена, сорбита и жирных кислот. Количество их, как правило, будет составлять от 0,001 до 14 мас.% препарата. Особенно предпочтительными для настоящего изобретения являются поверхностно-активные вещества, которые представляют собой полиоксиэтиленсорбитана моноолеат, полисорбат 80, полисорбат 20 и т.п. В препарат также можно включить дополнительные агенты, известные в данной области, для приготовления лекарственных форм на основе белков, таких как миметические антитела или их конкретные части или варианты.

Введение композиций миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта с помощью распылителя

Композиции миметического антитела ОЬР-1 или его конкретной части или варианта могут быть введены с помощью распылителя, такого как струйный распылитель или ультразвуковой распылитель. Как правило, в струйном распылителе для создания высокоскоростного потока воздуха через отверстие

- 38 011583 используется источник сжатого воздуха. Поскольку вне наконечника газ расширяется, создается область низкого давления, которая всасывает раствор белка композиции миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта в капиллярную трубку, связанную с резервуаром жидкости. Поток жидкости в капиллярной трубке при выходе из трубки рассекается на нестабильные нити и капли, создавая аэрозоль. Для достижения желаемых особенностей работы этого струйного распылителя можно использовать диапазон конфигураций, скоростей потока и типов преграды. В ультразвуковом распылителе используется высокочастотная электрическая энергия, чтобы создать вибрационную, механическую энергию, в обычном случае с использованием пьезоэлектрического преобразователя. Энергия передается к препарату белка композиции миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта либо непосредственно, либо через сопряженную жидкость, создавая аэрозоль, содержащий белок композиции миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта. Желательно, чтобы частицы белка композиции по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта, доставляемые распылителем, имели размер частиц менее приблизительно 10 мкм, предпочтительно в пределах от приблизительно 1 до приблизительно 5 мкм и наиболее предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 3 мкм.

Препараты по меньшей мере одного белка композиции миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта, подходящие для применения в распылителе, обычно содержат белок композиции миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта в водном растворе в концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 20 мг по меньшей мере одного белка миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта на 1 мл раствора. Препарат может содержать средства, такие как наполнитель, буфер, средство, обеспечивающее изотоничность, консервант, поверхностно-активное вещество и предпочтительно цинк. Препарат также может содержать наполнитель или средство для стабилизации белка композиции миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта, такое как буфер, восстановитель, белок-наполнитель или углевод. Белки-наполнители, которые можно использовать в приготовлении композиции миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта, включают альбумин, протамин и т.п. Типичные углеводы, применимые для изготовления композиции миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта, включают сахарозу, маннит, лактозу, трегалозу, глюкозу и т. п. Препараты белка композиции миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта также могут содержать поверхностно-активное вещество, которое может уменьшить или предотвратить обусловленную поверхностным натяжением агрегацию белка композиции миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта, вызванную распылением раствора при образовании аэрозоля. Можно использовать различные общепринятые поверхностно-активные вещества, такие как сложные эфиры полиоксиэтилена и жирных кислот и спиртов и сложные эфиры полиоксиэтилена, сорбита и жирных кислот. Количество их, как правило, будет составлять от 0,001 до 4 мас.% препарата. Особенно предпочтительные для целей настоящего изобретения поверхностно-активные вещества представляют собой полиоксиэтиленсорбитана моноолеат, полисорбат 80, полисорбат 20 и т.п. В препарат также можно включить дополнительные средства, известные в данной области, для приготовления лекарственных форм белков, таких как миметические антитела или их конкретные части или варианты.

Введение композиций миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта с помощью ингалятора-дозатора

В ингаляторе-дозаторе (МЭ!) в контейнере содержатся в виде смеси, содержащей сжиженный сжатый газ, газ-вытеснитель, по меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или его конкретная часть или вариант и любые наполнители или другие добавки. Срабатывание дозирующего клапана высвобождает смесь в виде аэрозоля, предпочтительно содержащего частицы с размером менее приблизительно 10 мкм, предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 5 мкм и наиболее предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 3 мкм. Необходимый размер частиц аэрозоля можно получить путем использования препарата композиционного белка миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта, полученных различными способами, известными специалистам в данной области, включая вихревой размол, сушку распылением, конденсацию в критической точке и т.п. Предпочтительные ингаляторы-дозаторы включают ингаляторы, изготовленные 3М или С1ахо и использующие газ-носитель гидрофторуглерод.

Препараты по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта для применения в устройстве ингаляторе-дозаторе будут, как правило, содержать тонкоизмельченный порошок, содержащий по меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант, в виде суспензии в неводной среде, например взвешенный в газе-носителе при помощи поверхностно-активного вещества. Газ-носитель может быть любым традиционным веществом, используемым для этой цели, таким как хлорфторуглерод, гидрохлорфторуглерод, гидрофторуглерод или гидроуглерод, включая трихлорфторметан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтанол и 1,1,1,2-тетрафторэтан, НЕА-134а (гидрофторалкан-134а), НЕА-227 (гидрофторалкан-227) и т.п. Предпочтительным газом-носителем является гидрофторуглерод. Поверхностно-активное вещество можно выбрать для того, чтобы стабилизировать по меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть

- 39 011583 или вариант в виде суспензии в газе-носителе, чтобы защитить активное вещество от химического разложения и т. п. Подходящие поверхностно-активные вещества включают сорбитантриолеат, соевый лецитин, олеиновую кислоту и т.п. В некоторых случаях предпочтительны аэрозоли растворов с использованием таких растворителей, как этанол. Также в препарат можно включить дополнительные агенты, известные в данной области для приготовления лекарственных форм из белка, такого как белок.

Среднему специалисту в данной области будет ясно, что способы по настоящему изобретению могут быть достигнуты путем введения в легкие композиций по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта с помощью устройств, не описанных в настоящем описании.

Препараты и введение через слизистую оболочку

Для всасывания через поверхность слизистой оболочки композиции и методы введения по меньшей мере одного миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта включают эмульсию, содержащую множество субмикронных частиц, мукоадгезивные макромолекулы, биоактивный пептид и сплошную водную фазу, которая стимулирует всасывание через поверхность слизистой оболочки путем достижения мукоадгезии частиц эмульсии (патент США № 5514670). Слизистые оболочки, подходящие для наложения эмульсий по настоящему изобретению, могут включать роговичный, конъюнктивальный, буккальный, подъязычный, назальный, влагалищный, легочный, желудочный, кишечный и ректальный пути введения. Препараты для влагалищного или ректального введения, например суппозитории, могут содержать в качестве наполнителей, например, полиалкиленгликоли, вазелин, масло какао и т.п. Препараты для интраназального введения могут быть твердыми и содержать в качестве наполнителей, например, лактоз, или могут быть водными или масляными растворами капель в нос. Наполнители для буккального введения включают сахар, стеарат кальция, стеарат магния, клейстеризованный крахмал и т.п. (патент США № 5849695).

Пероральные препараты и введение

Препараты для перорального введения зависят от совместного введения вспомогательных веществ (например, резорцинолов и неионогенных поверхностно-активных веществ, таких как полиоксиэтиленолеиловый эфир и н-гексадецилполиэтиленовый эфир), искусственно увеличивающих проницаемость стенки кишечника, а также от совместного введения ингибиторов ферментов (например, ингибиторов панкреатического трипсина, диизопропилфторфосфата (ΌΡΡ) и трасилола), ингибирующих ферментативное разрушение. Активное лекарственное вещество лекарственной формы твердого типа для перорального приема можно смешать по меньшей мере с одной добавкой, включая сахарозу, лактозу, целлюлозу, маннит, трегалозу, рафинозу, мальтит, декстран, крахмалы, агар, аргинаты, хитины, хитозаны, пектины, камедь трагаканта, гуммиарабик, желатин, коллаген, казеин, альбумин, синтетический или полусинтетический полимер и глицерид. Эти лекарственные формы также могут содержать другой(ие) тип(ы) добавок, например неактивный разбавитель, смазывающее вещество, такое как стеарат магния, парабен, консервант, такой как сорбиновая кислота, аскорбиновая кислота, альфа-токоферол, антиоксидант, такой как цистеин, разрыхлитель, связующее, загуститель, буферное средство, подсластители, вкусовое вещество, ароматизатор и т.д.

Таблетки и пилюли могут быть далее переработаны в препараты с кишечнорастворимым покрытием. Жидкие препараты для перорального приема включают эмульсию, сироп, эликсир, суспензию и препараты растворов, допустимые для медицинского применения. Эти препараты могут содержать неактивные разбавители, обычно используемые в указанной области, например воду. В качестве систем доставки лекарственного средства для инсулина и гепарина также описаны липосомы (патент США № 4239754). Позже для доставки фармацевтических препаратов были использованы микросферы искусственных полимеров из смешанных аминокислот (протеиноиды) (патент США № 4925673). Кроме того, из уровня техники известны соединения-носители, описанные в патенте США № 5879681 и патенте США № 55871753, которые использовались для пероральной доставки биологически активных средств.

Чрескожные препараты и введение

Для чрескожного введения по меньшей мере одно миметическое антитело СЬР-1 или его конкретная часть или вариант заключают в устройство для доставки, такое как липосомы или полимерные наночастицы, микрочастицы, микрокапсулы или микросферы (все они называются микрочастицами, если не указано иначе). Известен ряд подходящих устройств, включая микрочастицы, сделанные из синтетических полимеров, таких как полигидроксикислоты, например, полимолочной кислоты, полигликолевой кислоты и их сополимеров, полиортоэфиров, полиангидридов и полифосфазенов, природных полимеров, таких как коллаген, полиаминокислоты, альбумин и другие белки, альгинат и другие полисахариды и их сочетания (патент США № 5814599).

Пролонгированное введение и препараты

Иногда может оказаться желательным доставлять соединения по настоящему изобретению субъекту в течение длительного времени, например в течение от 1 недели до 1 года после однократного введения. Можно использовать различные лекарственные формы с медленным высвобождением, депо-формы или имплантаты. Например, лекарственная форма может содержать фармацевтически приемлемую нетоксичную соль соединений, которая имеет низкую растворимость в жидкостях организма, например: (а) кислотно

- 40 011583 аддитивную соль с многоосновной кислотой, такой как фосфорная кислота, серная кислота, лимонная кислота, винная кислота, дубильная кислота, памоевая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота, нафталин моно- или дисульфоновые кислоты, полигалактуроновая кислота и т.п.; (Ь) соль с поливалентным металлическим катионом, таким как цинк, кальций, висмут, барий, магний, алюминий, медь, кобальт, никель, кадмий и т.п., или с органическим катионом, сформированным, например, из Ν,Ν'дибензилэтилендиамина или этилендиамина; или (с) сочетания (а) и (Ь), например соль танната цинка. Кроме того, из соединений по настоящему изобретению или предпочтительно из относительно нерастворимой соли, такой как только что описанные, можно приготовить гель, например гель алюминия моностеарата, например, с сезамовым маслом, пригодным для инъекций. Наиболее предпочтительными солями являются соли цинка, соли танната цинка, соли памоата и т.п. Другой тип депо-формы препарата с медленным высвобождением для инъекций может содержать соединение или соль, диспергированную для инкапсулирования в медленно распадающемся, нетоксичном, неантигенном полимере, таком как полимер полимолочной кислоты/полигликолевой кислоты, например, как описанный в патенте США № 3773919. Из соединений или предпочтительно из относительно нерастворимых солей, таких как описанные выше, можно приготовить силастиковые шарики с холестериновой матрицей, в частности, для применения у животных. Из литературы известны дополнительные лекарственные формы с медленным высвобождением, депо-формы или имплантаты, например газовые или жидкие липосомы (патент США № 577 0222 и «Зиз!ашеб апб Соп!го11еб Яе1еазе Ргид Рейсегу Зуз!етз», ЬЯ. ЯоЫпзоп еб., Магсе1 Реккег, 1пс., Ν.Υ., 1978).

Имея описание изобретения в общих чертах, вышеупомянутое будет легче понять при соотнесении со следующими примерами, которые приведены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения изобретения.

Пример 1.

Клонирование и экспрессия миметического антитела СЬР-1 в клетках млекопитающих

Типичный экспрессионный вектор млекопитающих содержит по меньшей мере один промоторный элемент, который опосредует инициацию транскрипции мРНК, последовательность, кодирующую миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант, и сигналы, необходимые для терминации транскрипции и полиаденилирования транскрипта. Дополнительные элементы включают усилители, последовательности Козака и интроны, к которым примыкают донорные и акцепторные сайты для сплайсинга РНК. Высокоэффективной транскрипции можно достичь с ранними и поздними промоторами от ЗУ40, длинными терминальными повторами (ЬТЯЗ) от ретровирусов, например ЯЗУ, НТЬУ1, Н1У1, и ранним промотором цитомегаловируса (СМУ). Однако также могут использоваться клеточные элементы (например, промотор актина человека). Подходящие экспрессионные векторы для использования в практическом осуществлении настоящего изобретения включают, например, такие векторы, как р1ЯЕЗ1пео, рЯе!го-ОГГ, рЯе!го-Оп, РЬХЗН или рЬНСХ (С1опе!есй ЬаЬз, Ра1о А1!о, СА), рсРНА3.1 (+/-), рсРНА/2ео (+/-) или рс^NА3.1/Ηуд^ο (+/-) (^йгодеп), РЗУЬ и РМЗС (Рйагташа, Иррза1а, Швеция), рЯзУса! (АТСС 37152), рЗУ2бйГг (АТСС 37146) и рВС12М1 (АТСС 67109). Клетки-хозяева млекопитающего, которые могут использоваться, включают клетки человека Не1а 293, Н9 и 1игка!, клетки мыши МН3Т3 и С127, Соз 1, Соз 7 и СУ 1, клетки перепела ЦС1-3, Ь-клетки мыши и клетки яичника китайского хомячка (СНО).

Альтернативно, ген может экспрессироваться в стабильных клеточных линиях, которые содержат ген, интегрированный в хромосому. Котрансфекция с селектируемым маркером, таким как РНРЯ, др!, неомицин или гидромицин, делает возможным идентификацию и выделение трансфицированных клеток.

Трансфицированный ген также можно амплифицировать, чтобы экспрессировать большие количества кодируемого миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта. Маркер РНРЯ (дигидрофолатредуктаза) применим для разработки клеточных линий, которые несут несколько сотен или даже несколько тысяч копий интересующего гена. Другой применимый маркер селекции представляет собой фермент глутаминсинтазу (ГС) ((Мигрйу, е! а1., Вюсйет. 1. 227: 277-279 (1991); ВеЬЬтд!оп, е! а1., Вю/Тесйпо1оду 10: 169-175 (1992)). Используя эти маркеры, клетки млекопитающих выращивают в избирательной среде и отбирают клетки с самой высокой устойчивостью. Эти клеточные линии содержат амплифицированный(е) ген(ы), интегрированные в хромосому. Клетки яичника китайского хомячка (СНО) и клетки ЖО часто используются для получения миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или вариантов.

Экспрессионные векторы рС1 и рС4 содержат сильный промотор (ЬТЯ) вируса саркомы Рауса (Си11еп, е! а1., Мо1ес. Се11. Вю1. 5: 438-447 (1985)) плюс фрагмент энхансера СМУ (Возйаг! и др., Се11 41: 521-530 (1985)). Множественные сайты клонирования, например, с сайтами, которые расщепляются рестриктазами ВатН1, ХЬа1 и Азр718, облегчают клонирование представляющего интерес гена. Кроме того, векторы содержат 3' интрон, полиаденилирование и ген сигнала терминации препроинсулина крысы. Клонирование и экспрессия в клетках СНО

Для экспрессии миметического антитела СЬР-1 или его конкретной части или варианта использовали вектор рС4. Плазмида рС4 является производным плазмиды рЗУ2-бйГг (номер доступа АТСС 37146). Плазмида содержит ген РНРЯ мыши под контролем раннего промотора ЗУ40. Клетки яичника китайского хомячка или другие клетки с недостаточной активностью дигидрофолата, которые трансфи

- 41 011583 цировали этими плазмидами, можно отобрать путем выращивания клеток в избирательной среде (например, а1рНа ттик МЕМ, Ь1£е ТесНпо1од1ек, СаййегкЬигд, МИ) с добавкой химиотерапевтического средства метотрексата. Амплификация генов ИНЕК в клетках, устойчивых к метотрексату (МТХ), подтверждена документально (см., например, Р.^. А1!, е! а1., 1. Вю1. СНет. 253: 1357-1370 (1978); 1.Ь. Нат1ш и С. Ма, Вюсйет. е! Вюрйук. Ас!а 1097: 107-143 (1990); и М.1. Раде апб М.А. 8уйепйат, Вю!есНпо1оду 9: 64-68 (1991)). Клетки, выращенные при возрастающих концентрациях МТХ, вырабатывают устойчивость к этому препарату путем повышенной выработки целевого фермента, ИНРК, в результате амплификации гена ИНЕК. Если второй ген связан с геном ИНРК, он обычно тоже амплифицируется и сверхэкспрессируется. Из уровня техники известно, что этот подход может использоваться для создания клеточных линий, несущих более 1000 копий амплифицированного(ых) гена(ов). Впоследствии, когда метотрексат удаляют, получают клеточные линии, которые содержит амплифицированный ген, интегрированный в одну или несколько хромосом клетки-хозяина.

Плазмида рС4 для экспрессии интересующего гена содержит сильный промотор длинного терминального повтора (ЬТК) вируса саркомы Рауса (Си11еп, е! а1., Мо1ес. Се11. Вю1. 5: 438-447 (1985) ) плюс фрагмент, выделенный из энхансера, непосредственного раннего гена цитомегаловируса человека (СМУ) (ВокНагЕ е! а1., Се11 41: 521-530 (1985)). Ниже промотора находятся сайты расщепления рестриктазами ВатН1, ХЬа1 и Акр718, которые делают возможным интеграцию генов. Далее за этими сайтами клонирования плазмида содержит 3' интрон и сайт полиаденилирования гена препроинсулина крысы. Для экспрессии также можно использовать другие высокоэффективные промоторы, например промотор Ь-актина человека, ранние или поздние промоторы 8У40 или длинные терминальные повторы от других ретровирусов, например ВИЧ и НТЬУЬ Для регулируемой экспрессии СЬР-1 в клетках млекопитающих можно использовать системы Те!-0££ и Те!-0п от С1оп!есН для экспрессии генов и похожие системы (М. Соккеп, апб Н. Ви)агй, Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А 89: 5547-5551 (1992)). Для полиаденилирования мРНК также можно использовать другие сигналы, например от гормона роста человека или генов глобина. Стабильные клеточные линии, несущие интересующий ген, интегрированный в хромосомы, также можно отобрать после котрансфекции с помощью селектируемого маркера, такого как др!, С418 или гидромицин. Вначале выгодно использовать более одного селектируемого маркера, например С418 плюс метотрексат.

Плазмиду рС4 расщепляют рестриктазами, а затем дефосфорилируют кишечной фосфатазой теленка в соответствии с процедурами, известными в данной области. Вектор затем выделяют из 1% геля агарозы.

Используют последовательность ДНК, кодирующую полное миметическое антитело СЬР-1 или его конкретную часть или вариант, соответствующие вариабельным областям НС и ЬС миметического антитела СЬР-1 по настоящему изобретению, согласно стадиям известного способа. В этой конструкции также используют выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую подходящую константную область (т. е. области НС и ЬС).

Выделенную ДНК, кодирующую вариабельную и константную области, и дефосфорилированный вектор затем лигируют ДНК-лигазой Т4. После этого трансформируют клетки Е. сой НВ101 или ХЬ-1 В1ие и выявляют бактерии, которые содержат фрагмент, введенный в плазмиду рС4, используя, например, рестрикционный анализ.

Для трансфекции использовали клетки яичника китайского хомячка (СНО) с недостаточностью активного гена ИНРК. 5 мкг экспрессионной плазмиды рС4 котрансфицировали с 0,5 мкг плазмиды р8У2нео, используя липофектин. Плазмида р8У2-нео содержит доминирующий селектируемый маркер, ген нео из Тп5, кодирующий фермент, который придает устойчивость к группе антибиотиков, включая С418. Клетки высевали на культуральную среду а1рНа ттик МЕМ с добавкой 1 мкг/мл С418. Через 2 суток клетки обрабатывали трипсином и высевали на планшеты для клонирования гибридомы (Сгетег, Сегтапу) на а1рНа ттик МЕМ с добавкой 10, 25 или 50 нг/мл метотрексата плюс 1 мкг/мл С418. Приблизительно через 10-14 дней единичные клоны обрабатывали трипсином и затем засевали на 6-луночные чашки Петри или 10 мл колбы, используя различные концентрации метотрексата (50, 100, 200, 400, 800 нМ). Клоны, растущие при самых высоких концентрациях метотрексата, затем переносили на новые 6-луночные чашки, содержащие еще более высокие концентрации метотрексата (1, 2, 5, 10, 20 мМ). Ту же самую процедуру повторяли, пока не получали клоны, которые росли при концентрации 100-200 мМ. Экспрессию желаемого генного продукта анализировали, например, с помощью 8И8-РАСЕ и Вестерн-блоттинга или ВЭЖХ с обращенными фазами.

Пример 2.

Неограничивающий пример миметического антитела СЬР-1 по изобретению

СЬР-1 является пептидом из 37 аминокислот, секретируемым Ь-клетками кишечника после пероральной нагрузки глюкозой. Ожидается, что конструкция миметического антитела, содержащая биологически активный пептид СЬР-1 (7-37), его вариант или производное, продлит период существования пептида ίη νί\Ό и обеспечит новое лечение, позволяющее снизить глюкозу крови у больных диабетом типа 2. В каркас миметического антитела можно включить пептиды, кодирующие природный пептид СЬР-1 (7-37) или устойчивый к ИРР-1У аналог. Некоторые из этих молекул были получены, и полученные в результате миметические антитела показывали активность ίη νίΙΐΌ в функциональных клеточных анализах. Следует отметить, что в этих исследованиях можно использовать различные анализы ίη νίΙΐΌ и

- 42 011583 модели ίη νίνο, и активности могут оказаться не сравнимыми друг с другом или с результатами, представленными в настоящем описании.

Чтобы создать варианты миметического антитела СЬР-1, последовательности пептида СЬР-1, линкера, шарнирной области или СН2 и СН3 в миметическом антителе можно удалить, добавить, заместить, мутировать или модифицировать, чтобы улучшить экспрессию, активность, стабильность или эффекторные функции.

В каркас миметического антитела можно включить последовательность СЬР-1 дикого типа, а также устойчивых к БРР-ΐν вариантов СЬР-1, таких как СЬР-1 (А28) или СЬР-1 (А2С). Можно осуществить мутации пептида, чтобы улучшить свойства миметического антитела СЬР-1. Например, мутации в аминоконцевых остатках могут улучшить передачу сигналов, в то время как мутации в спиральном домене могут стабилизировать спираль и, таким образом, улучшить связывание с рецептором и/или стабильность миметического антитела.

Можно изменить длину и состав линкера, чтобы изменить гибкость или стабильность связи между пептидом СЬР-1 и Ес-доменом. В шарнирную область молекулы можно ввести различные изотипы. Кроме того, можно вызвать мутации внутри шарнирной области миметического антитела, чтобы стабилизировать молекулу. Например, шарнирную область 1дС4 человека можно подвергнуть мутации, чтобы создать вариант 8ет²²⁸->Рто, для стабилизации дисульфидных связей между цепями миметического антитела. Можно произвести изменения в пределах Ес-домена миметического антитела, чтобы улучшить стабильность молекулы и изменить эффекторные функции, такие как связывания с ЕсЕ. Например, можно использовать изотипы человека или мыши (или варианты этих молекул), такие как 1дС4 с мутациями А1а/А1а.

Миметическое антитело СЬР-1 по настоящему изобретению

Специфическим, неограничивающим примером настоящего изобретения является конструкция миметического антитела СЬР-1 (8ЕЦ ΙΌ N0: 2) формулы (I) ((Р(п)-Ь(о)-^р)-Н(ф-СН2(т)-СН3(₅))(1) где Р является единичной копией биоактивного пептида СЬР-1 (7-36), Ь является тандемным повтором либо С1у-8ег, либо С1у-С1у-С1у-8ег гибкого линкера, V является С-концом последовательности νΗ, т.е. области 1 природного 1дС, Н является полной шарнирной областью 1дС1 и СН2 и СН3 относятся к подклассу 1дС1 изотипа. Ожидается, что период полужизни этой конструкции будет во много раз больше, чем у одного пептида СЬР-1 или его варианта или производного, и будет подобен таковому 1дС.

В дополнение к основной структуре, описанной выше, описаны варианты с потенциально благоприятными биологическими особенностями. Они включают конструкции, которые могут иметь ослабленную тенденцию к самоассоциации, сниженные эффекторные иммунные функции или уменьшенную иммуногенность. Предвидятся другие модификации, которые наделяют желаемыми особенностями, такими как улучшенная конформация биологически активного пептида и проникновение через гематоэнцефалический барьер. Предложенные варианты и модификации можно объединять любым способом, чтобы получить конструкции с желаемой активностью.

Используя методы рекомбинантных ДНК, пептид СЬР-1 был введен в промежуточный вектор между сигнальным пептидом иммуноглобулина и 1-последовательностью человека. Это было сделано с использованием комплементарных синтетических олигонуклеотидов с концами, совместимыми с рестрикционными сайтами, присутствующими в векторе. Упомянутые олигонуклеотиды содержали кодирующие последовательности для пептида СЬР-1 и гибкого линкера, составленного из двух повторов ССС8. Рестрикционный фрагмент, содержащий вышеупомянутые функциональные элементы, затем перенесли в экспрессионный вектор. Этот вектор содержал промотор иммуноглобулина анти-СБ4, и энхансер, и кодирующую последовательность для шарнирной последовательности 1дС1 человека, константной области НС 2 (СН2) и константной области 3 (СН3), а также необходимые элементы для репликации плазмиды и селекции в бактериях и селекции по устойчивой экспрессии в клетках млекопитающих.

Эту плазмиду ввели в клетки НЕК293Е, и экспрессия \\1 ММВ СЬР-1 был получена в случайно трансфицированных клетках. Очистку ММВ СЬР-1 проводили стандартной аффинной хроматографией на белке А и суперозе 12, что дало приблизительно 1,5 мг/л трансфицированных клеток. Этот белок послужил исходным материалом для экспериментов, описанных ниже.

Аминокислотная последовательность миметического антитела СЬР-1 показана на фиг. 1. Функциональные домены аннотированы над последовательностью, кодирующей пептид. Полагают, что последовательность 1 будет обеспечивать даже большую гибкость, позволяя димеру СЬР-1 принимать надлежащую конформацию и позволяя димеру выступать из глобулярной структуры иммуноглобулина и проникать в расщелину между двумя рецепторами СЬР-1. В шарнирной области 1дС1 присутствуют три цистеина. Первый обычно образует пару с легкой цепью иммуноглобулина (ЬС), а два других участвуют в связях между двумя цепями НС. Области СН2 и СН3 составляют основной объем белка. Одной из причин, по которой считается, что иммуноглобулины имеют длительный период полужизни в сыворотке, является их способность связывать ЕсЕп, который увеличивает период полужизни в сыворотке, возвращая подвергшиеся пиноцитозу иммуноглобулины обратно во внеклеточное пространство. Сайт связыва

- 43 011583 ния РсКп частично закрывает соединение областей СН2 и СН3 (8НеПб5 е! а1., 2001, 1. Вю1. С1ет., νο1. 276 (9), 6591-6604).

Известно, что две тяжелые цепи 1дО собираются во время клеточного процессинга с помощью дисульфидных связей между цистеинами, находящимися в шарнирной области, чтобы сформировать гомодимер. Ожидается, что это также будет происходить между модифицированными пептидами с формированием собранной конструкции миметического антитела ОЬР-1. Кроме того, ожидается, что также будет формироваться дисульфидная связь внутри цепи между двумя цистеинами в пептиде ОЬР-1. Ожидаемая структура миметического антитела ОЬР-1 содержит два пептида ОЬР-1. Пространственное расположение пептидов на Ν-конце наряду с гибкостью соседних последовательностей должно позволить пептидам формировать биоактивный димер.

Пример 3.

Анализ связывания РАС8

Активность миметического антитела ОЬР-1 проверяли в анализе ш νίΙΐΌ связывания РАС8. Чтобы определить, будет ли ММВ ОЬР-1 связывать ОЬР-1К, клетки НЕК293 (1х 10⁶ клеток), сверхэкспрессирующие ОЬР-1К, инкубировали с ММВ ОЬР-1 (20 нМ) в течение 2 ч при 4°С. Клетки промывали и на 30 мин при 4°С добавляли для обнаружения вторичное антитело с флюоресцентной меткой (1 мкг/мл козьего 1дО, специфичного к Рс гамма человека). Интенсивность флюоресценции клеток измеряли методом проточной цитометрии. Фиг. 2 А показывает, что ММВ ОЬР-1 связываются с клетками НЕК293, сверхэкспрессирующим ОЬР-1К (серый - ММВ ОЬР-1, но не вторичное; черный - только вторичное; красный отрицательный контроль ММВ и вторичного; синий - ММВ ОЬР-1 и вторичное). Фиг. 2В показывает, что ММВ ОЬР-1 не связывается с контрольными клетками НЕК293 (серый - ММВ ОЬР-1, но не вторичное; черный - только вторичное; синий - ММВ ОЬР-1 и вторичное). Фиг. 2С показывает, что аналог пептида ОЬР-1 (А28) способен конкурировать с ММВ ОЬР-1 за связывание с клетками НЕК293, сверхэкспрессирующими ОЬР-1К (серый - ММВ ОЬР-1, но не вторичное; черный - ММВ ОЬР-1 и вторичное; оранжевый - ММВ ОЬР-1, 0,2 нМ конкурента, вторичное; синий - ММВ ОЬР-1, 20 нМ конкурента, вторичное; красный - ММВ ОЬР-1, 100 нМ конкурента, вторичное).

Пример 4.

Исследование на цАМФ

ОЬР-1 связывается со своим рецептором, рецептором, соединенным с О-белком, что приводит к дозозависимому увеличению количества сигнальной молекулы, 3',5'-циклоАМФ (цАМФ). цАМФ можно измерить с помощью ш уйго исследования в клетках, экспрессирующих ОЬР-1К (АррНеб Вюкуйетк). Кратко, клетки Ктпт (100000 клеток) инкубировали с увеличивающимися концентрациями пептида ОЬР1 (0-30 нМ) или ММВ ОЬР-1 (0-100 нМ). Клетки лизировали и определяли количество цАМФ, используя конкурентный анализ, в котором используется меченный щелочной фосфатазой конъюгат цАМФ и хемилюминесцентный субстрат (Тгор1х® СЭРЬ®). Зависимая от концентрации активность цАМФ для \\1 ММВ ОЬР-1 (фиг. 3А) сопоставима с пептидом ОЬР-1 (фиг. 3В) (ЕС₅₀=11 нМ против 0,4 нМ, соответственно). В аналогичном эксперименте как ММВ ОЬР-1 (А2О) в каркасе 1дО4 (фиг. 3С), так и ММВ ОЬР-1 (А28) в каркасе 1дО4 (фиг. 3Ό) повышали уровень цАМФ в клетках Ктпт до значительно более высокого уровня, чем \\1 ММВ ОЬР-1 в каркасе 1§О4.

Пример 5.

Оценка расщепления ЬРР-ΐν

Так как ОЬР-1 быстро инактивируется ЬРР-ΐν, был проведен анализ ш уйго, чтобы количественно определить интактное (т.е. нерасщепленное) ММВ ОЬР-1. Кратко, ММВ ОЬР-1 или пептид (1,2 нМ) инкубировали при комнатной температуре с ЬРР-ΐν (1 мкг/мл, Κ&Ό ЗуЧеиъ). Через различное время (0, 5, 10, 15, 20, 30, 40 мин) добавляли ингибитор ЬРР-ΐν (100 мкМ, Ьтсо), чтобы погасить реакцию. Количество интактного ММВ ОЬР-1 или пептида измеряли, используя ОЬР-1 АсШе ЕЫ8А на (Ьтсо) и ММВ ОЬР-1 или пептиды для соответствующих стандартных кривых. На фиг. 4 показано, что ММВ ОЬР-1 значительно более устойчив к расщеплению ЬРР-ΐν по сравнению с пептидом ОЬР-1.

Пример 6.

Оценка стабильности в сыворотке человека

Также измеряли стабильность ММВ ОЬР-1 в сыворотке, чтобы убедиться, что другие серологические протеазы не могут расщепить и инактивировать ММВ ОЬР-1. Кратко, пептид ОЬР-1 или ММВ ОЬР1 (30 нМ) инкубировали в сыворотке человека при 37°С. Через различное время реакции гасили ингибитором ЬРР-ΐν (100 мкМ, Ьтсо) и анализировали пробы, используя ОЬР-1 Асйус ЕЫ8А от Ьтсо. Фиг. 5 показывает, что ММВ ОЬР-1 устойчив в сыворотке человека в течение 24 ч, в то время как пептид быстро распадается.

Пример 7.

ММВ ОЬР-1 вызывает секрецию инсулина в клетках ΚΐΝηι

Чтобы проверить влияние ММВ ОЬР-1 на секрецию инсулина, клетки ΚΐΝιιι обрабатывали увеличивающимися концентрациями пептида ОЬР-1 (7-36) (0-5 нМ), пептида экзендина-4 (0-5 нМ) или различных миметических антител ОЬР-1 (5 или 50 нМ) и измеряли количество секретированного инсулина с

- 44 011583 помощью ЕЫ8А. Все исследованные ММВ СЬР-1 были активны в стимуляции секреции инсулина в клетках КРЫт (фиг. 6). При 50 нМ активность ММВ была сопоставима с таковой для пептида СЬР-1 (736) дикого типа.

Пример 8.

ММВ СЬР-1 понижает уровень глюкозы у мышей бЬ/бЬ

6-недельные мыши бЬ/бЬ голодали в течение 2 ч, затем им внутривенно вводили дозу растворителя, пептида СЬР-1 или ММВ СЬР-1 (А28). Глюкозу крови измеряли через 0,5, 1, 2, 3 и 4 ч после введения дозы. Пептид СЬР-1 снижал глюкозу крови через 30 мин, но к 60 мин глюкоза крови начинала увеличиваться снова, вероятно, из-за короткого периода полужизни пептида СЬР-1. Для сравнения: ММВ СЬР-1 (А28) в дозе в 100 раз ниже дозы пептида СЬР-1 вызывало снижение глюкозы крови в течение всего 4-часового периода (фиг. 7А). Кроме того, снижение глюкозы крови было дозозависимым (фиг. 7В).

Пример 9.

Фармакокинетики ММВ СЬР-1 у мышей и макак-крабоедов

Чтобы измерить фармакокинетику четырех миметических антител СЬР-1 (А2С, А28, ехебш-сар и дикого типа), мышам С57/В16 внутривенно вводили 1 мкг/кг ММВ. Плазму получали при пункции сердца после забоя мышей в различные моменты времени. Использовали различные методы ЕЫ8А, чтобы измерить Рс, общее количество ММВ, количество активных ММВ и активного пептида, поскольку они метаболизировались у животного. Активное ММВ отражает интактный №конец пептида, все еще присоединенного к Рс-фрагменту миметического антитела. Замена второй аминокислоты в пептиде (аланина) либо на серин, либо на глицин удлиняла продолжительность существования активного ММВ в кровотоке.

Макакам-крабоедам внутривенно вводили 1,0 мг/кг конструкций четырех различных ММВ СЬР-1 и брали пробы сыворотки в различные моменты времени, от 10 мин до 5 дней после ввода дозы. Пробы сыворотки анализировали с помощью ЕЫ8А, чтобы количественно определить интактное ММВ. Как проиллюстрировано на фиг. 8, все четыре ММВ демонстрируют быструю фазу распределения, за которой следует более медленная фаза выведения. Для каждой из конструкций были вычислены фармакокинетические константы, чтобы показать Т_1/2, равное приблизительно 3 суткам, с похожей экспозицией, определенной с помощью АИС от Т=0 до Т=120 ч.

Пример 10.

Влияния ММВ СЬР-1 во время перорального теста на толерантность к глюкозе у мышей с диабетом

8-недельные мыши бЬ/бЬ, больные диабетом, перед подкожной инъекцией ММВ СЬР-1 (0,02-2 мг/кг) голодали в течение 6 ч. После введения дозы мыши голодали в течение еще 6 ч, и у них измеряли начальный уровень глюкозы крови натощак. В ΐ=0 мышам перорально принудительно вводили 1,0 мг/г глюкозы и в различное время измеряли глюкозу крови. Результаты, приведенные на фиг. 9, указывают, что ММВ СЬР-1 эффективно снижает диапазон колебаний уровня глюкозы в течение перорального теста на толерантность к глюкозе во всех исследованных дозах.

Пример 11.

Влияния ММВ СЬР-1 на уровень глюкозы крови натощак в течение хронического введения мышам с диабетом

10-недельным мышам бЬ/бЬ, больным диабетом, ежедневно подкожно вводили растворитель или ММВ СЬР-1 (от 1 мг/кг) в течение 6 недель. Глюкозу крови натощак измеряли дважды в неделю на протяжении исследования. На протяжении исследования у животных, получавших лечение, глюкоза крови натощак была ниже, чем у контрольных животных (фиг. 10), и к шестой неделе различие превысило 200 мг/дл (466 против 221 мг/дл, у контрольных животных и животных, получавших лечение, соответственно).

Пример 12.

Влияния ММВ СЬР-1 во время перорального теста на толерантность к глюкозе после хронического введения мышам с диабетом

Как и в примере 11, 10-недельным мышам бЬ/бЬ, больным диабетом, ежедневно подкожно вводили растворитель или ММВ СЬР-1 (от 1 мг/кг) в течение 6 недель. После 40 дней введения мышам проводили пероральный тест на толерантность к глюкозе. Кратко, в ΐ=0 мышам перорально принудительно вводили 1,0 мг/г глюкозы и в различное время измеряли глюкозу крови. Результаты, приведенные на фиг. 11, указывают, что ММВ СЬР-1 эффективно снижает диапазон колебаний глюкозы в течение перорального теста на толерантность к глюкозе, что говорит о том, что мыши, длительно получавшие лечение ММВ СЬР1, в состоянии избавиться от нагрузки глюкозой более эффективно, чем контрольные животные.

Пример 13.

Влияния ММВ СЬР-1 на снижение НЬА1с после хронического введения мышам с диабетом

Как и в примерах 11 и 12, 10-недельным мышам бЬ/бЬ, больным диабетом, ежедневно подкожно вводили растворитель или ММВ СЬР-1 (от 1 мг/кг) в течение 6 недель. Перед и после 6 недель введения брали пробы цельной крови и анализировали на процентное содержание НЬА1с. Как показано на фиг. 12, уровень НЬА1с у животных, получавших лечение СЬР-1, повысился на 109% в течение 6-недельного периода, тогда как у контрольных животных, получавших лечение, увеличился на 142%. Эти данные сви

- 45 011583 детельствуют о том, что животные, получающие лечение, способны более успешно регулировать уровень глюкозы крови в течение длительного периода по сравнению с контрольными.

Пример 14.

Влияния ММВ СЬР-1 в течение перорального теста на толерантность к глюкозе у здоровых макак-крабоедов

Пероральный тест на толерантность к глюкозе (ПТТГ) проводили здоровым макакам-крабоедам перед введением 1 дозы ММВ СЬР-1 (1 мг/кг) и 6 дней спустя. Кратко, в !=0 обезьянам перорально принудительно вводили 2,0 мг/г глюкозы и измеряли глюкозу крови в различное время. Уровни глюкозы крови были значительно ниже при ПТТГ, проведенном через 6 дней после введения дозы (фиг. 13 А), а уровни инсулина были значительно повышены (фиг. 13В). Это свидетельствует о том, что ММВ СЬР-1 вызывает выделение инсулина из поджелудочной железы при повышенных концентрациях глюкозы.

Пример 15.

Влияния ММВ СЬР-1 на окрашивание на инсулин островков мышей с диабетом (6Ь/6Ь) после введения 1 дозы

12-недельных мышей (6Ь/6Ь), больных диабетом, лечили однократной подкожной дозой ММВ СЬР1 (1,5 мг/кг) и 4 недели спустя забирали поджелудочные железы. Поджелудочные железы разрезали на части и окрашивали для определения наличия инсулина. Как показано на фиг. 14, у животных, получавших лечение, окрашивание на инсулин было значительно более сильным, чем у контрольных животных.

Пример 16.

ММВ СЬР-1 задерживает опорожнение желудка у здоровых собак

Самкам собак (10-15 кг) породы бигл хирургически имплантировали желудочную канюлю под общей анестезией и давали возможность выздороветь в течение по меньшей мере 2 недель. Собаки голодали в течение 24 ч, после чего им давали свободный доступ к воде. Желудочную канюлю открывали и желудочный сок и остатки пищи удаляли 40-50 мл теплой воды. Группам по 6 собак подкожно вводили лидамидин, альфа2 агонист (0,63 мг/кг), за 60 мин до приема пищи, положительный контроль для задержки опорожнения желудка. Собакам, которым вводили контроль - растворитель или ММВ СЬР-1 (0,1 мг/кг), вводили их внутривенно в головную вену за 15 мин до приема пищи. За 5 мин до приема пищи желудочную канюлю открывали, чтобы определить количество жидкости, находящееся в желудке, как исходное значение, и жидкость быстро вводили обратно. Затем через канюлю вводили пробный завтрак, состоящий из 250 мл раствора глюкозы (5 г/л), и позволяли ему остаться в желудке в течение 30 мин. Содержимое желудка выпускали из желудка, чтобы измерить общий объем через 30 мин. 1 мл содержимого желудка сохраняли для анализа, а оставшийся объем возвращали в желудок через канюлю. Исследование объема содержимого желудка и взятие проб повторяли на 60, 90 и 120 мин. Во взятых пробах измеряли концентрацию глюкозы и использовали ее, чтобы определить абсолютное количество глюкозы, остающейся в желудке в каждый момент времени. Количество глюкозы в процентах, остающееся в желудке, определяли исходя из начального количества и концентрации глюкозы в каждый момент времени. Время, в течение которого сохранялось 50% от содержимого желудка, определяли подгонкой кривых к единственной экспоненциальной. Как показано на фиг. 15, 50% содержимого желудка высвобождалось у собак, которым ввели растворитель, через 12,35±3,69 мин, в то время как собаки с введенным лидамидином (положительный контроль) и ММВ СЬР-1 показывали значимую задержку опорожнения желудка (30,60±6,47 и 59,23±14,46, соответственно).

Пример 17.

ММВ СЬР-1 снижает глюкозу крови в пероральном тесте на толерантность к глюкозе (ПТТГ) у мышей с ожирением, вызванным питанием

Чтобы создать мышиную модель ожирения, вызванного питанием, мышей держали на пище с высоким содержанием жиров в течение по меньшей мере 27 недель. Мыши стали тучными, и, после того как глюкоза крови натощак превысила 120 мг/дл, у них был диагностирован диабет. Чтобы оценить влияние лечения ММВ СЬР-1 на уровни глюкозы крови после приема пищи, мыши с ожирением, вызванным питанием, голодали в течение ночи, а затем им подкожно вводили 0,02, 0,2 или 2 мг/кг ММВ СЬР-1 или контроль (растворитель). Через 6 ч после введения дозы мышам в желудок принудительно вводили 1,5 мг/г глюкозы. Уровень глюкозы крови определяли перед введением ММВ и в моменты времени (=0, 15, 30, 60, 90, 120, 150 и 180 мин, используя кровь из вены хвоста. Как показано на фиг. 16, ММВ СЬР-1 вызывало дозозависимое снижение значения глюкозы крови натощак в !=0 и все последующие моменты времени. Площади под кривой были вычислены между !=0 и 1=180, и они показали значимое снижение выделения глюкозы при всех дозах.

Пример 18.

ММВ СЬР-1 снижает глюкозу крови в интраперитонеальном тесте на толерантность к глюкозе (IРСΤΤ) у мышей 6Ь/6Ь

Мыши-самцы 6Ь/6Ь в возрасте приблизительно 13-15 недель были случайным образом распределены на группы лечения по 6 мышей, на основании уровней глюкозы крови натощак. За 6 ч до теста на толерантность к глюкозе мышам вводили дозу либо 0,02, либо 0,1 мг/кг ММВ СЬР-1, либо 0,1 мг/кг отрицательного контроля ММВ. За 5 мин до теста на толерантность к глюкозе измеряли уровень глюкозы в

- 46 011583 крови вены хвоста с помощью ручного глюкометра. После этого мышам интраперитонеально вводили 1 мг/г ϋ-глюкозы и измеряли уровни глюкозы крови через 10, 20, 30, 60, 90, 120, 150 и 180 мин. Как проиллюстрировано на фиг. 17А, уровни глюкозы крови были значительно ниже в обеих группах, получавших лечение ММВ СЬР-1 в течение всего времени. Дополнительные группы животных, получавших такое же лечение, умерщвляли для измерения уровней инсулина в !=10 мин. Существует дозозависимое повышение количества инсулина, выделенного через 10 мин после введения дозы ММВ СЬР-1.

Преимущества

Применение этой новой молекулы в качестве лекарственного средства для лечения диабета типа 2 обеспечивает несколько преимуществ перед другими аналогами СЬР-1. Например, она, вероятно, увеличит период полужизни пептида СЬР-1. Кроме того, пептид СЬР-1 дикого типа в каркасе миметического антитела устойчив к разрушению протеазами, а именно ЭРР-1У. Это может сделать возможным лечение пептидом СЬР-1 дикого типа, а не мутантным пептидом. Так как СЬР-1 является природным пептидом, иммунный ответ у пациентов, получавших лечение миметическим антителом СЬР-1, может оказаться меньшим, чем у пациентов, получавших лечение мутантным аналогом СЬР-1. Кроме того, крупный размер ММВ СЬР-1 может препятствовать проникновению через гематоэнцефалический барьер. Это может явиться преимуществом, так как тошнота и тревога связаны с СЬР-1-связыванием СЬР-1 К в головном мозге. Кроме того, платформа миметического антитела приводит к экспрессии двух пептидов на каждую молекулу миметического антитела. Это может позволить пептидам СЬР-1 взаимодействовать друг с другом, формируя димерный лиганд, который мог бы увеличить аффинность к рецептору СЬР-1 клеточной поверхности.

Будет ясно, что изобретение можно осуществить иначе, чем конкретно описано в предшествующем описании и примерах.

В свете вышеупомянутого обучения возможны многочисленные модификации и изменения настоящего изобретения, и, тем самым, они находятся в пределах объема настоящего изобретения.

ЗЕО Ю N0:			Общее число АА	Области
		ΕΉ1	ЕК4
47	Вариабельная область тяжелой цепи	уы	125	1-31	81-215
48	УЬ2	97	1-30	80-97
49	УНЗа	102	1-30	80-102
50	УЬЗЬ	102	1-30	80-102
51	УЬЗс	94	1-30	80-94
52	УМ	106	1-30	80-106
53	УЬ5	97	1-30	80-97
54	УЬ6	91	1-30	80-91
55	У57	91	1-30	80-91

3Εβ Ю ΝΟ:			Число АА	Области
Шарнирнам область 1	Шарнирная область 2	Шарнирная область 3	Шарнирная область 4	СН2	снз	СН4
56	Константная область тяжелой цепи	1дА1	354	103-122				123-222	223-354
57	1дА2	340	103-108				109-209	210-340
58	1дО	384	102-135	319-497			160-267	268-384
59	1дЕ	497					104-210	211-318	319-497
60	1дО1	339	99-121				122-223	224-339
61	1дС1	326	99-117				118-219	220-326
62	1дОЗ	377	99-115		131-145	146-168	169-270	271-377
63	1дС4	327	99-110	324-476			111-220	221-327
64	1дМ	476					105-217	218-323	324-476

- 47 011583

Список последовательностей

5ЕСЭ Ιϋ N0:1

нххзхххххх χχχχχχχχχχ χριχχχχχχχ χ	31
3Ε0 ΙΟ N0:2
ΗΑΕ0ΤΡΤ3ϋν 35ΥΕΕΟ0ΑΑΚ ЕР1А«ЬУК0Н ©3Ο8ΟΟΟ3ΟΤ ЪУТУЗЗЕРКЗ СОКТНТСРРС	€0
ΡΑΡΕΙΛ00Ρ5 νΡΙ,ΡΡΡΚΡΚϋ ТЬМХЗНТРЕУ ТСУУТОУЗНЕ ОРЕУКРШУУ ΏΟνΕΥΗΝΑΚΤ	120
ΚΡΡΕΕ0ΥΝ5Τ УКУУЗУЕТУЪ Η<2ΟΗΕΝΘΚΕΥ КСКУЗИКАЪР ΑΡΙΕΚΤΙ5ΚΑ КСОРНЕРСУУ	180
ТЬРРЗКЕЕЕТ КЫОУЗЬТСЬУ ΚΟΡΥΡδϋΙΑν ΕΝΕΒΝΟΟΡΕΝ ΝΥΚΤΤΡΡνίΛ 3ϋΟ3ΡΡΕΥ3Κ	240
ЬТУОКЗЙИГОО СЫУКЗСЗУМН ΕΑΙ,ΗΝΗΥΤΟΚ ЗЬЗЬЗРСК	278

3Ε<2 Ιϋ N0:3

сайдсйдаад	ддассЪЬЬас	ЬадйдайдЪа	адййсЬЬаЬЪ	Ъддааддсса	адсйдссаад	60
дааййсаЪЬд	сЬЪддсйддЬ	даааддссда	ддаддйддай	ссддйддадд	сйссддйасс	120
ЬЬадйсассд	Ъсйссйсада	дсссааайсй	Ьдйдасаааа	сйсасасдйд	сссассдйдс	180
ссадсассйд	аасйссйддд	дддассдйса	дйсййссЬсЬ	Ессссссааа	асссааддас	240
асссЬсайда	Ьсйсссддас	сссйдаддйс	асайдсдйдд	Ьддйддасдй	дадссасдаа	300
дасссйдадд	ЬсаадЬЕсаа	с-йддйасдйд	дасддсдйдд	аддйдсайаа	Едссаадаса	360
аадссдсддд	аддадсадйа	саасадсасд	Ъассдддйдд	Ьсадсдйссй	сассдйссйд	420
сассаддасй	ддсйдаайдд	сааддадйас	аадйдсаадд	Ьсйссаасаа	адсссйссса	480
дсссссайсд	адаааассай	сйссааадсс	ааадддсадс	сссдадаасс	асаддйдйас	540
асссйдсссс	сайсссддда	Едадсйдасс	аадаассадд	йсадссйдас	сйдссйддЬс	600
аааддсййсй	айсссадсда	сайсдссдйд	дадйдддада	дсаайдддса	дссддадаас	660
аасйасаада	ссасдссйсс	сдйдсйддас	Ьссдасддсй	ссЬЪсЬйссй	сЬасадсаад	720
сйсассдйдд	асаададсад	дйддсадсад	дддаасдйсй	ЬсЕсайдсйс	сдЪдайдсаЪ	780
даддсйсйдс	асаассасйа	сасдсадаад	адссйсйссс	йдйсйссддд	йааайда	837

- 48 011583

ΗΑΕ0ΤΡΤ3ϋν

ЗЗУЬВеОААК

ЕПАИЪУКаК (ЗООЗООСЗОТ

Ι»ντν88Ε3ΚΥ

СРРСРРСРДР

ЕААООРЗУРЪ

РРРКРКРТЬМ ΐδκτΡΒντον ννϋνδΟΕΡΡΕ νφΡΝΚΥνϋΟν

ΕΥΗΝΑΚΤΚΡΚ

120

ΕΕ0ΡΝ8ΤΥΚν νενίιτνίιΗοπ

ИШСКЕУКСК узыкеьрзз!

ΕΚΤΙ8ΚΑΚΟΟ

ΡΕΕΡςνγτΐιΡ

180

Ρ5ΟΕΕΜΤΚΝζ2

УЗЬТСЬУКСЗР

ΥΡδϋΙΑνΕΗΕ

5ΝΟ0ΡΕΝΝΥΚ ττρρνι,Μϋα

ЗРРЪУЗКЪТУ

240 βΕδΗΙίΟΕΟΝν

РЗСЗУМНВАЬ

ΗΝΗΥΤ0Κ8Ι18 ьзьск

275

ЗЕф ГО N0:5

саЬдсЕдаад	ддассЕЬЪас	ЪадЪдаЪдЪа	адЬИсЬЕа'ЬЬ	Ъддааддсса	адсйдссаад	60
дааЬЪсаЕЬд	сЬЪддсЬддЪ	даааддссда	ддаддеддаь	ссддкддадд	сЪссддЬасс	120
ЕЬадЬсассд	ЬсЪссЪсада	дЕссаааЬаЬ	ддЬсссссаЕ	дсссассакд	сссддсдссЪ	180
даддссдссд	ддддассаЕс	адЬсЪЬссЪд	ЬЬссссссаа	аасссаадда	сасЪсЬсаЬд	240
аьсксссдда	ссссЬдаддЕ	сасдЪдсдкд	д^ддьддасд	Ъдадссадда	адассссдад	300
дЕссадЪЕса	асЪддЬасдЪ	ддабддсдЬд	даддЬдсайа	аЕдссаадас	ааадссдсдд	360
даддадсадЕ	Есаасадсас	дЕассдЬдЬд	дЬсадсдЕсс	ЪсассдЪссЪ	дсассаддас	420
ЪддсЕдаасд	дсааддадЕа	саадйдсаад	дЕсЪссаааа	ааддссЕссс	дЕссЕссаЬс	480
дадаааасса	ЬсЕссааадс	сааадддсад	ссЕсдададс	сасаддЬдЕа	сасссЪдссс	540
ссаЬсссадд	аддадаЪдас	саадаассад	дЕсадссЬда	ссЕдссЬддЬ	саааддсЪЬс	600
Ьассссадсд	асаЪсдсадЬ	ддадЬдддад	адсааЬдддс	адссддадаа	саасЬасаад	660
ассасдссЬс	ссдЪдсЬдда	сйссдасддс	ЬссЕЬсЪЕсс	ЕсЬасадсад	дсЪаассдЬд	720
дасаададса	ддЬддсадда	ддддаа-едЪс	ЬЪсЬсаЬдсЬ	ссдЬдайдса	ЬдаддсЪсЬд	780
сасаассаск	асасасадаа	аадсЬЬдксс	сЪдЬсЬсЬдд	дЪаааЬда		828

ЗЕ<2 ГО N0:6

НХХОТХХХХХ 8ХУХВХХХХК хрхаиьххох

8Е0 ГО N0:7

НЗЕОТГТЗЕУ ЗЗУЬЕСОААК

ЕР1АИЬУК6К ооозсоозот

ЬУТУЗЗЕЗКУ

ОРРСРРСРАР

ЕАА

- 49 011583 £5ЕСЗ ГО N0:8

ноеотртзоу 5зубесоаак ер1А«ьукок еосзооозот БУТУЗЗЕЗКУ СРРСРРСРАР ЕАА	60 63
ЗЕО ГО N0:9
Н0ЕЗТРТ80У ЯЗУБЕСОААК ЕПАИБУКОК СССЗСССЗЗТ БУТУЗЗЕЗКУ СРРСРРСРАР	60
ЕАА	63
ЗЕО ГО N0:10
НТЕСТРТЗОУ ЗЗУЬЕСОААК ЕР1АНБУК(Ж ОООЗССЮЗбТ БУТУЗЗЕЗКУ СРРСРРСРАР	60
ЕАА	63
8Е0 10 N0:11
НУЕСТРТЗОУ 83УБЕО0ААК ЕР1АИБУКСК. ОСОЗСЗООЗСТ БУТУЗЗЕЗКУ СРРСРРСРАР	60
ЕАА	63
8Е0 Ю N0:12
НЗЕСТЕТЗОУ ЗЗУБЕ00ААК ЕР1АИБУКСН ТОССЗЕЗКУС РРСРРСРАРЕ АА	52
ЗЕО 10 N0:13
НЗЕОТРТЗОУ ЗЗУБЕСОААК ЕРХАИБУКОК ТСЗСРРСРАР ЕАА	43
8Е0 ГО N0:14
НЗЕСТРТЗОУ ЗЗУБВООААК ЕР1АИЪУК0С РЗЗЗАРРРЗО ССЗСССЗСТБ УТУЗЗЕЗКУС	60
РРСРРСРАРЕ АА	72
ЗЕО ГО N0:15
НАЕОТРТЗОУ ЗЗУБЕ&2ААК ЕР1АЧБУКСК С	31

- 50 011583

8Е0 Ιϋ N0:16
0(308	4
ЗЕО Ю N0:17 080003	6
ЗЕ<2 ГО N0:18 00300(33	7
ЗЕО ГО N0:19 008000300	9
ЗЕО ГО N0:20 00030(30800	10
ЗЕО ГО N0:21 ОТЬУТУЗЗ	8
8Е0 ГО N0:22 ОТЬУАУЗЗ	8
БЕО ГО N0:23 (ЗТАУГУЗЗ	8
8Е<3 ГО N0:24 ТУЗ 8	4

- 51 011583

5Е0 ГО N0:25
АУЗЗ		4
8Εβ ГО N0:26 ЕРКЗСОКТНТ СРРСРАРЕЬЬ	ССР	23
3Εζ} ГО N0:27 ЕЗКУОРРСРЗ СРАРЕЕЬССР		20
ЗЕО ГО N0:28 ВЗКУСРРСРР СРАРЕААССР		20
ЗЕО ГО N0:29 ЕРКЗАОКТНТ СРРСРАРЕАА	сор	23
ЗЕО 10 N0:30 ЕРКЗАОКТНТ СРРСРАРЕЬА	СОР	23
8ΕΏ 10 N0:31 ЕРКЗАОКТНТ СРРСРАРЕАО	СОР	23
5ΕΏ ГО N0:32 ЕРКЗАОКТНТ СРРСРАРЕЬЕ	ССР	23
8Ξ0 ГО N0:33 ЕРК880КТНТ СРРСРАРЕЕЪ	ССР	23
3Εζ) ГО N0:34

- 52 011583

- 53 011583

ТУКУУЗУЫУ ЬНОЦИШСКЕ ΥΚσΚνδΝΚΑΒ ΡΑΡΙΕΚΤΙ5Κ АК

102

5Е<2 1Л N0:44

ΟΟΡΚΕΡβνΥΤ ЬРРЗКОЕЬТК №УЗЬТСЬУК ΟΡΥΡδυϊΑνΕ ΚΕ5Ν00ΡΕΝΝ УКТТРРУЫЗЗ60

ЬСЗРРЬУЗКЪ ΤνϋΚ8ΚΝΟΟ£3 ИУРЗСЗУМНЕ АЬНЫНУТОКЗ ЪЗЪЗРСЗ106

ЗЕС2 Ιϋ N0:45

ЗУЕЬРРРКРК ОТЬМ1ВЕТРЕ ντθνννϋν3θ ΕϋΡΕνΟΡΝΝΥ νϋΟνΕνΗΝΑΚ ΤΚΡΕΕΕΟΡΝ360 ττκννενι,τν ьнооиъыоке укскузиксь рззхекттзк АК102

ВЕС ΙΒ N0:46

ΟΟΡΚΕΡΟνΥΤ ЬРРЗОЕЕМТК ЫОУЭЬТСЬУК ОРУРЗОТАУЕ ΚΓΕ3ΝΟ0ΡΕΝΝ УКТТРРУЪОЗ60

ГКЗЗРРЬУЗКЬ ТТОКЗЕИОЕО КУРЗСЗУМНЕ АЬНМНУТОКЗ ЬЗЬЗЬОК107

ЗЕ<2 10 N0:47 ςνΟΟΟνςβΟΑ ЕУККРОАЗУК УЗСКАЗОУТР ТХИУЕОАРОО ОЬЕНМОХЕУТ МТКОТ8Т8ТА60

УМЕЬЗЗЪЯЗЕ ЭТАУУУСАКХ ИО^ТЪУТУЗ ЗЗЗТКСРВУЕ РЬАРЗЗКЗТЗ ООТААЬОСЬУ120

КОУРР125

3Εβ Ю N0:48

0ΙΤΟΚΕ8ΟΡΆ ЬУКРТОТОТЬ ТСТРЗОРЗЬЗ ΧΝΙΚ0ΡΡΟΚΑ ЬЕИЬАХКЬТТ 5ΚΟΤ3ΚΝ<2νν60

ЪТМТЫМОРУО ΤΑΤΥΥΟΑΚΧΝ ЗОЗТЪУТУЗЗ ЗЗАЗАРЗ97

8Е0 Ю N0:49

ЕУОЬУЕЗООО ЬУОРССЗЬНЬ ЗСАА80РТРЗ ХИУЕ0АР0КЗ 0Е«УЗХКРТ1 3ΚΟΝ3ΚΝΤΟΥ60

ЬОМЙЗЬКАЕО ТАУУУСАКХИ (ЗОЗООТЬУТУ ЗЗЗЗТКАРЗУ РР102

5Е0 Ю N0:50.

ЕУОЬУЕЗЗОО ЪУКРСОЗЫгЬ ЗСААЗОРТРЗ ХИУЕОАРОКО ЪЕИУЗХЕРТ! ЗЕООЗКИТЬУ60

- 54 011583

ЬОМИЗЬКТЕО ТАУУУСТТХИ СОСТЬУТУЗЗ А8ТКОР8УРР ЬА	102
ЗЕ<2 Ш N0:51
ЕУОЕУЕЗСОЗ ЬУОРСЕЗЬКЪ ЗСТАЗОРТЕЗ ХНУКОАРСКО ЬЕИУОХЕРТ! 5Κϋϋ8Κ3ΙΑΥ	60
ΙβΜΝβΙ,ΚΤΕΟ ΤΑΥΥΥΟΤΕΧΥ ТУЗЗСЗТКСЗР 8УЪР	94

8Е0 Ю N0:52

ОУОЬОЕЗСРО ЬУКРЗЕТЬЗЬ ТСТУЗССЗТЗ ΧΝΙΚΟΡΡαΚΘ ЬЕИЮХКУТТ	8νϋΤ3ΚΝ0Ρ8	60 106
ЬКЬЗЗУТААО ΤΑνΥΥΟΑΕΧΚ	(зооотьутуз зарткарруе	РИЗСС
8Е0 Ю N0:53
Εν0Ι>ν08(3ΑΕ УККРЗЕЗЬК!	ЗСКСЗСУЗРТ	ΧΝνηΟΜΡΟΚΟ	ΒΕΝΜαΧονΤΙ	ЗАПКЗ13ΤΑΥ	60
ЬОИЗЗЬКАЗР ТАМУУСАКХИ	ОООТЪУТУЗЗ	Α8ΤΚΘΡ3			97

8Εβ Ю N0:54

ΟνβΑΟβδΟΡΟ	ЬУКРЗОТЬЗЪ	ТСА1ЯОР8УЗ	ХИ1Е08Р8ЕО	ЪЕНЬСХЕ1Т1	ΝΡϋΤ3ΚΝ0Ρ8	60
ΙβΙιΝενΤΡΕϋ	ТАУУУСАКХК	состьутузз	0			91
ЗЕО Ιϋ N0:55
ΟνΟίνβΒΟΗΕ	ΙΚΚΡΟΑβνκν	ЗСКАЗОУТРТ	ΧΝνΚΟΆΡΟΟΟ	ЬЕИМОХЕРУР	БЕРТЗУЗТАУ	60
ЬфТЗЗЬКАЕР	ТАУУУСАЕХИ	СООТЬУТУЗЗ	8			91

8Е0 Ιϋ N0:56

АЗРТЗРКУГР ЬаЬСНТОРОО ΝννίΑΟΪ,νβΟ РРРОЕРЬЗУТ №Ε8Ο0βνΤΑ ΚΝΡΡΡ30ΡΑ360

СРЬУТТЗЗОЬ ТЪРАТОСЬАС КЗУГСНУКНУ ΤΝΡΒΟϋνΤνΡ СРУРЗТРРТР 8РЗТРРТР8Р120

ЗССНРКЬЗЬН КРАЬЕРЪРЬС ЗЕАИЬТСТЬТ СЪНЛАЗСУТР ТИТРЗЗОКЗА УООРРЕКОЬС180 (ЗСУЗУЗЗУЬР ОСАЕРИЫНаК ΤΡΤΟΤΑΑΥΡΕ ЗКТРЬТАТЬЗ ΚδΟΝΤΡΚΡΕν НЪЬРРРЗгЕЕ240

ЬАЬЫЕАУТЬТ СЕАКОЕЗРКР УЬУКИЬДОЗО ЕЬРКЕКУЪТИ АЗКОЕРЗОСТ ТТРАУТ31ЬЕ300

- 55 011583

УААЕ0ИКК00 ТРЗСМУОИЕА Ι,ΡΙΑΡΤΟΚΤΙ ОКЪАСКРТНУ НУЗУУМАЕУЮ ОТСУ	354
3Ες Ιϋ N0:57
АЗРТЗРКУЕР ЬЗЬОЗТРОПО КУУУАСЬУОС РРРОЕРЬЗУТ ИЗЕЗОООТТА ΚΝΡΡΡ30ΟΑ3	60
ОПЬУТТЗЗОЬ ТЬРАТОСРЭС КЗУТСНУКНУ ΤΝΡ30ϋντνΡ СРУРРРРРСС НРЕЕЗЕНКРА	120
ЕЕОЬЕЬОЗЕА МЬТСТЬТОЬЯ ЦАЗОАТРТИТ РЗЗОКЗАУОО РРЕИЗЬСОСУ ЗУЗЗУЪРЙСА	180
ΟΡΝΝΗΟΕΤΡΤ СТААНРЕЬКТ ΡΕΤΑΝΙΤΚ3Ο ЫТРЕРЕУНЪЬ РРРЗЕЕЬАЬЫ ЕЕУТЕТСЬАК	240
ОРЗРКОУЕУР ИЪООЗОЕЬРН ЕКУЪТИАЗКО ЕРЗОСТТТРА УТ31ЕЕУААЕ ϋΝΚΚ0ϋΤΡ30	300
МУСЗНЕАЬРЕА ΡΤΟΚΓΙϋΗΑΑ ОКРТНУИУЗУ УМАЕУООТСУ	340

5Е0 Ю N0:58

АРТКАРПУРР.	ИЗССКНРКО МЗРУУЬАСЫ ТСУНРТЗУТУ ΤΝΥΜ0Τ030Ρ 0КТЕРЕ10ЙЙ	60
ϋ3ΥΥΜΤ830Ε	ЗТРЬООМЕОСЗ ЕУКСУУОНТА 8К8ККЕ1РЙЮ ΡΕ8ΡΚΑ0Ά53 УРТАОРОАЕС	120
3ΙΛΚΑΤΤΑΡΑ	ΤΤΚΝΤΟΚΟΟΕ ЕКККЕКЕКЕЕ ОЕЕКЕТКТРЕ СРЗНТОРЬОУ УЕЪТРАУООЬ	180
ИЕМЖАТРТС	ЕУУСЗЕЬКЕА НЬТМЕУАСКУ РТОСУЕЕСЬЬ ΕΚΗ5Ν03030 НЗЙЬТЬРКЗЪ	240
ЯЫАСЗТЗУГСТ	ЫЯНРЗЬРРОК ЬМАЕРЕРААО АРУКЬЗЬЫЬЬ АЗЗОРРЕААЗ ИЕЕСЕУЗСРЗ	300
РРШЬЬМЮЬЕ	ΐΧ)ΚΕνΝΤ3(3Ρ ΑΡΆΕΡΡΡςΡΡ ЗТТРИАИЗУЕ КУРАРР8Р0Р АТУТСУУЗНЕ	360
ЮЗКТЬШАЗК	ЗЬЕУЗУУТЕН СРМК	384

3Ε<3 Ю N0:59

АЗТОЗРЗУРР ЬТКССКИ1Р8 ИАТЗУПХЭСЬ АТОТРРЕРУМ УТТОТОЗЕШ ТТМТЬРАТТЬ	60
ΤΕ3ΟΗΥΑΤΙ5 ЬЪТУЗаАИАК аМРТСКУАНТ РЗЗТСЙЛЛЖК ТРЗУСЗВОРТ РРТУКТЪОЗЗ	120
ΟϋΟΟΟΗΡΡΡΤ ЮЬЬСЬУЗСУ ΤΡΟΤΙΝΙΤΜΕ ЕСООУМОТОЬ 8ТАЗТТ0Е0Е ЪАЗТОЗЕЕТЬ	180
ЗОКНИЬЗПКТ УТСОУТУООН ΤΡΕϋ8ΤΚΚΟΑ ϋ3ΝΡΚ0ν3ΑΥ ЬЗРРЗРРОЕР 1ЕКЗРТ1ТСЕ	240
УУРЕАР8КОТ ΜΝΕΤΝ8ΗΑ8(3 КРУЫНЗТККЕ ΕΚΟΚΝΟΤΕΤν ТЗТЕРУОТЕЕ ΝΙΕΟΕΤΥςΟΚ	300
УТНРНЬРКАЬ МНЗТТКТБСР ТСРКААРЕУУ АРАТРЕИРЗЗ НОККТЬАСЫ 0№МРЕО13У	360
0ΗΕΗΝΞν<2ΕΡ ОАКНЗТТОРК КТКОЗОТРУР ЗКЪЕУТКАЕИ ЕОКОЕР1СКА УНЕААЗРЗОТ	420
УОКАУЗУИРС КОУСУЕЕАЕО ЕАРИТГСТОЕС ГРААЬРЬЬЗУ ЗУЗААЬТЬЬМ УОКГЕЗАТКО	480

- 56 011583

СКРОТЗЪЛУТ ЯУЬОРНА

497

8Е0 1Э N0:60
А8ТКСР8УРР	ЬАРЗЗКЗТЗЗ	СТААЬОСЬУК	тгррЕРУГуз	НЫЗСАЬТЗСУ	НТРРАУЦЭ58	60
СЬУЗЬЗЗУХТТ	УР888ИЗТ0Т	УТСЫУННКРЗ	ΝΤκνϋΚΚνΕΡ	КЗСВКТНТСР	РСРАРЕЬЬОС	120
Р8УРГ.РРРКР	КПТГ1М13ЯТР	еутсуууюуз	НВОРЕУКРЫИ	УУГХЗУЕУНЫА	ΚΤΚΡΗΕΕΟΥΝ	180
ЗТУНУУЗУЬТ	УЪНОЬКЪКГСК	ЕУКСКУЗИКА	БРАР1ЕКТ1Б	КАКеОРЯЕРО	УУТЪРРЗШЖ	240
ьтклоузьтс	ЬУКОРУРЗЫ	ΑνΕΝΕΞΒΝΟΟ	ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡ	УБОбГИЗЭРРЬ	У5КБТУГ)К8Е	300
ΝΟΟΟΝΥΡΒΟΒ	УМНЕАЪНЫНУ	ТОКЗЬЗЬЗРО	КТНТСРРСР			339

ЗЕО ΙΟ N0:61
АЗТКОРЗУРР	1АРС8К8Т8Е	ЗТААБОСБУК	ОУЕРЕРУТУЗ	ШЗеАБТЗОУ	НТРРАУЬОЗЗ	60
СЬУЗЬЗЗУУТ	УРЗЗЫРОТОТ	утситонкрз	ΝΤΚνϋΚΤνΕΚ	КССУЕСРРСР	АРРУАОРЗУР	120
ЬРРРКРКЛТБ	М18НТРЕУТС	УУУЛУЗНЕПР	ΕνΟΕΝΚΥνοΟ	УЕУНЫАКТКР	ΚΕΕ0ΡΝ5ΤΓΚ	180
УУЗУЬТУУНО	СТПЛКЗКЕУКС	КУЗЫКОЬРАР	ΙΕΚΤΙ3ΚΤΚΟ	ОРЕЕРОУУТЬ	ΡΡ8ΚΕΕΜΤΚΝ	240
ОУЗЪТСБУКО	ΕΥΡβϋΙΑνΕΝ	Ε8Ν60ΡΒΝΝΥ	КТТРРМЬВЗО	(ЗЗЕРЬУЗКЪТ	νϋΚδΚΝΟΟΒΝ	300
УРЗСЗУМНЕА	ЫШНУТОКЗЬ	ЗЬЗРОК				326

ЗЕО Ю N0:62
А8ТКОР8УРР	БАРСЗК8Т8О	(ЗТААЬОСЬУК	БУРРЕРУТУЗ	ΝΝ36ΑΙιΤ8(3ν	НТРРАУЬОЗЗ	60
ОЪУ8Б88УУТ	УРЗЗЗЬОТОТ	УТСЫУЫНКРЗ	ИТКУОККУЕБ	ктрьесттнт	СРЕСРЕРК8С	120
ПТРРРСРКСР	ЕРКБСОТРРР	СРКСРЕРК8С	ϋΤΡΡΡΟΡΕΟΡ	АРЕЬЫЗСРЗУ	ЕЬЕРРКРКЬТ	180
1М18КТРЕУТ	СУУУОУЗНЕЬ	РЕУОРКИУТО	ΟνΕνΗΝΑΚΤΚ	ΡΚΕΕ0ΎΝ8ΤΡ	КУУЗУЬТУЬН	240
ΟϋΝΒΝΟΚΕΥΚ	скузюаьРА	ΡΣΕΚΤΙ8ΚΤΚ	ΟΟΡΚΕΡΟνΎΤ	ЬРРЗКЕЕМТК	ЫОУЗЬТСБУК	300
(ЗРУРЗШАУЕ	ΚΕ8300ΡΕΝΝ	ΥΝΤΤΡΡΜΙΛβ	ЦОЗРРЬУЗКЪ	ТУОКЗННООО	ΝΙΡ3Ο8νΜΗΕ	360
ΑΒΗΝΚΡΤ0Κ8	ЬЗЬЗРСК					377

ЗЕО Ю N0:63

- 57 011583

АЗТКОРЗУРР	ЬАРСЗЕЗТЗЕ	ЗТААЫЗСЬУК	ϋΥΡΡΕΡντνδ	ИЫЗОАЬТЗОУ	ΗΤΡΡΑνΕβΞδ	60
СОУЗЬЗЗУУТ	УРЗЗЗЬСТКТ	УТСИУОНКРЗ	ΝΤΚνϋΚΚνΕβ	КУОРРСРЗСР	АРЕРЬСЮРЗУ	120
РЬРРРКРКОТ	ЬМ13КТРЕХГТ	σνννονβοΕο	ΡΕνΟΕΝΝΥνΟ	ΟνΕνΗΝΑΚΤΚ	ΡΕΕΕ0ΓΝ8ΤΥ	180
ΚννθνίΤνίιΗ	βϋΙίΟΝΟΚΕΥΚ	СКУЗЫКОЬРЗ	3ΙΕΚΤΙ8ΚΑΚ	ΟβΡΝΕΡΟνΥΤ	ЬРРЗОЕЕМТК	240
Νονβιτοονκ	ЗЕУРЗШАУЕ	ΝΕ8ΝΟ0ΡΕΝΝ	УКТТРРУЮЗ	ϋΘ3ΡΡΟΥ3Ε1ι	ΤνοΚ3ΕΝβΕ0	300
КУРЗСЗУМНЕ	ΑΟΗΝΗΥΤ0Κ3	ЬЗЬЗЬОК				327

ЗЕО ΙΟ N0:64

СЗАЗАРТЬРР Ι№ΟΕΝ8Ρ3ϋ ТЗЗУАУОСЬА βΟΡΟΡϋΒΙΤΡ 5Ρ/ΚΎΚΝΝ3ΟΙ ЗЗТКЗЕРЗУЬ60

Κ6ΟΚΥΑΑΤ8β νίΛΡΒΚΟνΜΟ ΟΊΌΕΗννΟΚν βΗΡΝΟΝΚΕΚΝ УРЬРУТАЕЬР РКУЗУГУРРР120 ϋΘΡΡΘΝΡΚ8Κ 5КЫС0АТСР ЗРЕОЮУЗИЬ ΕΕΟΚΟνΟδΟν ΤΤΟΟνΟΑΕΑΚ ΕΞΟΡΤΤΥΚνΤ180

8ΊΊιΤΙΚΕ3ϋΝ 03β8ΜΡΤ0Εν ОНКСЬТРООИ АВЗМСУРГфО ΤΑΙκνΡΑΙΡΡ ЗРАЗХБЪТКЗ240

ТКЬТСЬУТОЬ ΤΤΥΏ3νΤΙ3Ν ΤΚΟΝΰΕΑνΚΤ ΗΤΝΙ8Ε3ΗΡΝ АТРЗАУОЕАЗ Ι0ΕϋϋνϊΝ86Ε300

НРТСТУТНТС ЬРЗРЪКОТХЗ ЕРКОУАЬНЕР ΟνΥΕΙΡΡΑΕΞ βΟΝΟΕΕ3ΑΤΙ ТСЬУТСРЗРА360 ηνρνβΗΟΜΟΚ СОРЪЗРЕКУУ Τ8ΑΡΜΡΕΡ0Ά Р0ЮТАН311 ΤνβΕΕΕΗΝΤΟ ЕТУТСТУАНЕ420

ΑΙιΡΝΕνΤΕΕΤ ТОКЗТОКРТЗ АОЕЕСЕЕЫЪИ АТАЗТЕХУЬУ КП781Л7МЗОТА ОТСУУК476

ЯЕО 10 N0:65 оеокскзсо8

8Е(5 » N0:66 азстюзсса

3Εβ Ю N0:67

ОООСОООС .8

ЗЕО Ю N0:68

ΟΡΝβΟ5

Claims (35)

1. По меньшей мере одна нуклеиновая кислота миметического антитела СЬР-1 с удаленным участком СН1, содержащая по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2 или 4, или комплементарный ему полинуклеотид.

- 58 011583

2. По меньшей мере одна нуклеиновая кислота миметического антитела СЬР-1 с удаленным СН1, содержащая по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну последовательность, выбранную из 8Е0 Ш N0: 7-14, или комплементарный ему полинуклеотид.

3. По меньшей мере один полипептид миметического антитела СЬР-1 с удаленным СН1, содержащий все последовательные аминокислоты 8Е0 ΙΌ N0: 2 или 4.

4. По меньшей мере один полипептид миметического антитела СЬР-1 с удаленным СН1, содержащий все последовательные аминокислоты 8Е0 ΙΌ N0: 7-14.

5. Антиидиотипическое моноклональное антитело или его фрагмент, который специфично связывается по меньшей мере с одним полипептидом миметического антитела СЬР-1 с удаленным СН1 по п.3 или 4.

6. Поликлональное антитело или его фрагмент, который специфично связывается по меньшей мере с одним полипептидом миметического антитела СЬР-1 с удаленным СН1 по п.3 или 4.

7. Слитый белок или его фрагмент, который специфично связывается по меньшей мере с одним полипептидом миметического антитела СЬР-1 с удаленным СН1 по п.3 или 4.

8. Нуклеиновая кислота, кодирующая по меньшей мере один полипептид миметического антитела СЬР-1 с удаленным СН1 по п.3 или 4, или полинуклеотид, комплементарный ей.

9. Нуклеиновая кислота, кодирующая по меньшей мере одно антитело к миметическому антителу СЬР-1 с удаленным СН1 по п.5 или 6, или полинуклеотид, комплементарный ей.

10. Вектор миметического антитела СЬР-1 с удаленным СН1, содержащий по меньшей мере одну выделенную нуклеиновую кислоту по п.8 или 9.

11. Клетка-хозяин миметического антитела СЬР-1 с удаленным СН1, содержащая выделенную нуклеиновую кислоту по п.8 или 9.

12. Клетка-хозяин миметического антитела СЬР-1 с удаленным СН1 по п.11, где указанная клеткахозяин представляет собой по меньшей мере одну клетку-хозяин, выбранную из С08-1, С08-7, НЕК293, ВНК21, СН0, В8С-1, Нер С2, 653, 8Р2/0, 293, N80, ОС44 СН0, СН0 К1, НеЬа, клеток миеломы или лимфомы, или любой производной, иммортализованной или трансформированной клетки этих линий.

13. Способ получения по меньшей мере одного полипептида миметического антитела СЬР-1 с удаленным СН1 или антитела к миметическому антителу СЬР-1 с удаленным СН1, предусматривающий трансляцию нуклеиновой кислоты по п.8 или 9 в условиях ш νίίΐΌ, ш νί\Ό или ш кйи с тем, чтобы происходила экспрессия миметического антитела СЬР-1 с удаленным СН1 или его антитела в количествах, поддающихся обнаружению или выделению.

14. Композиция, содержащая по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту миметического антитела СЬР-1 с удаленным СН1 по п.1 или 2.

15. Композиция, содержащая по меньшей мере один полипептид миметического антитела СЬР-1 с удаленным СН1 по п.3 или 4.

16. Композиция, содержащая по меньшей мере одно антитело к миметическому антителу СЬР-1 с удаленным СН1 по п.5 или 6.

17. Композиция по пп.14-16, где указанная композиция дополнительно содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

18. Композиция по пп.14-16, дополнительно содержащая по меньшей мере одну композицию, содержащую терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного соединения, композиции или полипептида, выбранного по меньшей мере из одного лекарственного средства, относящегося к лечению диабета или нарушения метаболизма инсулина, визуализируемой метки или репортерной молекулы, антагониста ТИР, противоинфекционного средства, лекарственного средства, действующего на сердечно-сосудистую (СС) систему, лекарственного средства, действующего на центральную нервную систему (ЦНС), лекарственного средства, действующего на вегетативную нервную систему (ВНС), лекарственного средства, действующего на дыхательные пути, лекарственного средства, действующего на желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), гормонального лекарственного средства, лекарственного средства, действующего на водный или электролитный баланс, гематологического лекарственного средства, противоопухолевого, иммуномодулирующего лекарственного средства, глазного, ушного или назального лекарственного средства, лекарственного средства для местного применения, нутритивного средства, цитокина или антагониста цитокина.

19. Композиция по пп.14-16 по меньшей мере в одной форме, выбранной из жидкости, газа или сухого вещества, раствора, смеси, суспензии, эмульсии или коллоида, лиофилизованного препарата или порошка.

20. Способ диагностики или лечения состояния, связанного с СЬР-1, в клетке, ткани, органе или животном, предусматривающий (а) приведение в контакт с композицией или введение композиции, содержащей эффективное количество по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты по п.1 или 2, в указанную клетку, ткань, орган или животному.

21. Способ диагностики или лечения состояния, связанного с СЬР-1, в клетке, ткани, органе или животном, предусматривающий (а) приведение в контакт с композицией или введение композиции, со

- 59 011583 держащей эффективное количество по меньшей мере одного полипептида миметического антитела СЬР1 с удаленным СН1 по любому из пп.3 или 4, в указанную клетку, ткань, орган или животному.

22. Способ диагностики или лечения состояния, связанного с СЬР-1, в клетке, ткани, органе или животном, предусматривающий (а) приведение в контакт с композицией или введение композиции, содержащей эффективное количество по меньшей мере одного антитела к миметическому антителу СЬР-1 с удаленным СН1 по любому из пп.5 или 6, в указанную клетку, ткань, орган или животному.

23. Способ по пп.20-22, где состояние, связанное с СЬР-1, представляет собой диабет или застойную сердечную недостаточность.

24. Способ по пп.20-22, где указанное эффективное количество составляет от 0,0001 до 50 мг антитела к миметическому антителу СЬР-1 с удаленным СН1; от 0,1 до 500 мг указанного миметического антитела СЬР-1 с удаленным СН1; или от 0,0001 до 100 мкг указанной нуклеиновой кислоты миметического антитела СЬР-1 с удаленным СН1 на 1 кг указанных клеток, указанной ткани, органа или животного.

25. Способ по пп.20-22, где указанное приведение в контакт или указанное введение осуществляется по меньшей мере одним способом, выбранным из парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, эндобронхиального, внутрибрюшного, интракапсулярного, внутрихрящевого, внутриполостного, в желудочки головного мозга, в мозжечок, в толстую кишку, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, интрамиокардиального, внутрикостного, внутритазового, интраперикардиального, внутрибрюшинного, внутриплеврального, в предстательную железу, интрапульмонального, в прямую кишку, интраренального, в сетчатку, внутрипозвоночного, внутрисиновиального, внутригрудного, внутриматочного, внутрипузырного, в очаг повреждения, болюсного, влагалищного, ректального, буккального, подъязычного, интраназального или чрескожного.

26. Способ по пп.20-22, дополнительно предусматривающий введение перед, одновременно или после указанного (а) приведения в контакт или введения по меньшей мере одной композиции, содержащей эффективное количество по меньшей мере одного соединения или полипептида, выбранного по меньшей мере из одного лекарственного средства, относящегося к лечению диабета или нарушения метаболизма инсулина, визуализируемой метки или репортерной молекулы, антагониста ΊΝΓ, противоинфекционного средства, лекарственного средства, действующего на сердечно-сосудистую (СС) систему, лекарственного средства, действующего на центральную нервную систему (ЦНС), лекарственного средства, действующего на вегетативную нервную систему (ВНС), лекарственного средства, действующего на дыхательные пути, лекарственного средства, действующего на желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), гормонального лекарственного средства, лекарственного средства, действующего на водный или электролитный баланс, гематологического лекарственного средства, противоопухолевого, иммуномодулирующего лекарственного средства, глазного, ушного или назального лекарственного средства, лекарственного средства для местного применения, нутритивного средства, цитокина или антагониста цитокина.

27. Устройство, содержащее по меньшей мере один выделенный полипептид по п.3 или 4, антитело по п.5 или 6 или нуклеиновую кислоту миметического антитела СЬР-1 с удаленным СН1 по п.1 или 2, где указанное устройство подходит для приведения в контакт или введения по меньшей мере одного указанного полипептида, антитела или нуклеиновой кислоты миметического антитела СЬР-1 с удаленным СН1 по меньшей мере одним способом, выбранным из парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, эндобронхиального, внутрибрюшного, интракапсулярного, внутрихрящевого, внутриполостного, в желудочки головного мозга, в мозжечок, в толстую кишку, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, интрамиокардиального, внутрикостного, внутритазового, интраперикардиального, внутрибрюшинного, внутриплеврального, в предстательную железу, интрапульмонального, в прямую кишку, интраренального, в сетчатку, внутрипозвоночного, внутрисиновиального, внутригрудного, внутриматочного, внутрипузырного, в очаг повреждения, болюсного, влагалищного, ректального, буккального, подъязычного, интраназального или чрескожного.

28. Изделие для фармацевтического или диагностического применения у человека, состоящее из упаковки и контейнера, содержащего по меньшей мере один выделенный полипептид по п.3 или 4, антитело по п.5 или 6 или нуклеиновую кислоту по п.1 или 2 миметического антитела СЬР-1 с удаленным СН1.

29. Изделие по п.28, где указанный контейнер представляет собой компонент устройства или системы для парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, эндобронхиального, внутрибрюшного, интракапсулярного, внутрихрящевого, внутриполостного, в желудочки головного мозга, в мозжечок, в толстую кишку, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, интрамиокардиального, внутрикостного, внутритазового, интраперикардиального, внутрибрюшинного, внутриплеврального, в предстательную железу, интрапульмонального, в прямую кишку, интраренального, в сетчатку, внутрипозвоночного, внутрисиновиального, внутригрудного, внутриматочного, внутрипузырного, в очаг повреждения, болюсного, влагалищного, ректального, буккального, подъязычного, интраназального или чрескожного введения.

30. Способ получения по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты миметического антитела СЬР1 с удаленным СН1 по п.1 или 2, предусматривающий получение по меньшей мере одной клетки-хозяина, трансгенного животного, трансгенного растения, растительной клетки, способных экспрессировать

- 60 011583 поддающиеся обнаружению или выделению количества указанного полипептида, антитела или нуклеиновой кислоты.

31. Способ получения по меньшей мере одного выделенного полипептида миметического антитела ОЬР-1 с удаленным СН1 по п.3 или 4, предусматривающий получение по меньшей мере одной клеткихозяина, трансгенного животного, трансгенного растения, растительной клетки, способных экспрессировать поддающиеся обнаружению или выделению количества указанного полипептида, антитела или нуклеиновой кислоты.

32. Способ получения по меньшей мере одного антитела миметического антитела ОЬР-1 с удаленным СН1 по п.5 или 6, предусматривающий получение по меньшей мере одной клетки-хозяина, трансгенного животного, трансгенного растения, растительной клетки, способных экспрессировать поддающиеся обнаружению или выделению количества указанного полипептида, антитела или нуклеиновой кислоты.

33. По меньшей мере одна нуклеиновая кислота миметического антитела ОЬР-1 с удаленным СН1, полученная способом по любому из пп.30-32.

34. По меньшей мере один выделенный полипептид миметического антитела ОЬР-1 с удаленным СН1, полученный способом по любому из пп.30-32.

35. По меньшей мере одно антитело миметического антитела ОЬР-1 с удаленным СН1, полученное способом по любому из пп.30-32.