EA007300B1

EA007300B1 - Некоторые производные 1-(d-циклопропилглицинил)-4-(пиперидин-4-ил) пиперазина в качестве ингибиторов серинпротеазы фактора ха

Info

Publication number: EA007300B1
Application number: EA200401290A
Authority: EA
Inventors: Майкл Роберт Уайли; Гэри Лоувелл Инджел
Original assignee: Эли Лилли Энд Компани
Priority date: 2002-04-01
Filing date: 2003-03-24
Publication date: 2006-08-25
Also published as: EP1492767A1; ZA200407418B; JP2005531529A; ATE303990T1; BR0308870A; IL164018A0; WO2003084929A1; EA200401290A1; HRP20040900A2; MXPA04009640A; DK1492767T3; WO2003084929A8; DE60301569D1; AU2003218147A1; DE60301569T2; HRP20040900B1; ES2248737T3; CR7497A; NO20044688L; CN1288135C

Abstract

Соединения формулы (I), в которых R представляет собой атом водорода или атом фтора, или их фармацевтически приемлемые соли являются ингибиторами фактора Ха, применимыми при лечении тромботических заболеваний.

Description

Настоящее изобретение относится к соединениям, применимым в качестве лекарственных препаратов, к содержащим соединения фармацевтическим композициям, к способу получения соединений, к промежуточным продуктам, полезным при получении соединений, и к применению соединений в качестве лекарственных препаратов.

Сердечно-сосудистые заболевания продолжают представлять большую проблему для здоровья людей во всем мире и являются основной причиной серьезных заболеваний и смерти.

Одно из направлений исследований, осуществляемых исследователями в области новых способов лечения сердечно-сосудистого заболевания, основано на гипотезе о том, что ингибитор серинпротеазы, являющейся фактором Ха, может быть применен при лечении тромботического заболевания в качестве антикоагулянта.

Ингибиторы фактора Ха известны. Так например, в ^О 01/96323 раскрыты некоторые соединения, содержащие ароматическую группу, глициновый остаток, несущий циклическую группу, и 4замещенную пиперазинильную группу. Циклическая группа может представлять собой циклоалкильную группу, такую как циклопентильная или циклогексильная, но предпочтение отдается соединениям, в которых циклическая группа является фенильной группой.

Неожиданно было найдено, что при выборе в соединениях ^О 01/96323 в качестве ароматической группы 4-метоксифенильной или 3-фтор-4-метоксифенильной группы, в качестве глицинового остатка циклопропилглициновой группы и в качестве 4-замещенной пиперазинильной группы (1метилпиперидин-4-ил)пиперазинильной группы могут быть получены соединения, которые являются селективными ингибиторами фактора Ха и имеют особенно выгодные свойства.

Соответственно настоящее изобретение относится к соединению формулы (I)

И (I) в которой К представляет собой атом водорода или атом фтора, или к его фармацевтически приемлемой соли.

Было найдено, что соединения формулы (I) являются сильнодействующими и селективными ингибиторами серинпротеазы, являющейся фактором Ха, имеют высокую противосвертывающую активность в плазме человека, оказывают эффективное действие на плазму при пероральном введении млекопитающим и обладают особенно выгодными фармакологическими и токсикологическими профилями активности.

Соединения формулы (I) могут быть также представлены химическими названиями: 1-(4метоксибензоил-И-циклопропилглицинил)-4-(1-метилпиперидин-4-ил)пиперазин и 1-(3-фтор-4-метоксибензоил-О-циклопропилглицинил)-4-(1-метилпиперидин-4-ил)пиперазин.

Следует принять во внимание, что соединения формулы (I) содержат центр асимметрии, имеющий (И)-конфигурацию. Поэтому соединения могут существовать и быть выделены в смеси с соответствующим (Б) изомером, такой как рацемическая смесь, или по отдельности. Предпочтительно выделяют соединения, по существу не содержащие (Б) изомеров.

Следует также принять во внимание, что соединения формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли могут быть выделены в форме сольватов и, что соответственно любой такой сольват включен в объем настоящего изобретения.

Примеры фармацевтически приемлемых солей включают гидрохлоридные, фумаратные и малеатные аддитивные соли кислоты.

Необходимо учитывать, что соединения формулы (I) содержат два основных атома азота и поэтому могут образовывать аддитивные соли одно- и двухосновной кислоты.

Одной группой соединений формулы (I) является такая группа, в которой К представляет собой атом водорода.

Конкретные соединения, в которых К является атомом водорода, представляют собой:

1-(4-метоксибензоил-О-циклопропилглицинил)-4-(1-метилпиперидин-4-ил) пиперазин и его гидрохлоридные, фумаратные и малеатные аддитивные соли кислоты, в особенности дигидрохлоридные, дифумаратные и дималеатные аддитивные соли кислоты.

- 1 007300

Получены кристаллические дигидрохлоридные, дифумаратные и дималеатные аддитивные соли кислоты, которые охарактеризованы дифференциальной сканирующей калориметрией (ДСК):

дигидрохлорид: разлагается перед плавлением;

дифумарат: 222,8°С (начало), 225,4°С (пик); и дималеат: 195,8°С (начало), 202,0°С (пик).

Особенного упоминания заслуживает дифумарат 1-(4-метоксибензоил-Э-циклопропилглицинил)-4(1-метилпиперидин-4-ил)пиперазина в кристаллической форме.

Другой группой соединений формулы (I) является такая группа, в которой К представляет собой атом фтора.

Конкретные соединения, в которых К является атомом фтора, представляют собой 1-(3-фтор-4-метоксибензоил-Э-циклопропилглицинил)-4-(1-метилпиперидин-4-ил)пиперазин и гидрохлоридные аддитивные соли кислоты.

Соединения формулы (I) и их фармацевтически приемлемые соли могут быть получены способом,

его соли (такой как тригидрохлорид) с соединением формулы (III) или ноос

или (III) его реакционноспособным производным; или (Ь) взаимодействие соединения формулы (IV)

Ν ΝΗ (IV) или его соли (такой как дигидробромид) с соединением формулы (V)

или его реакционноспособным производным; и последующее образование фармацевтически приемлемой соли, если требуется фармацевтически приемлемая соль.

Реакция между соединением формулы (II) и соединением формулы (III) обычно может быть осуществлена с использованием реагентов и условий реакций, традиционно применяемых для образования амидной связи. Реакцию обычно осуществляют в присутствии реагента на основе бензотриазола, такого как 1-гидроксибензотриазол или 1-гидрокси-7-азабензотриазол, и дегидратирующего агента, такого как дициклогексилкарбодиимид или 1-(3-диметиламинопропил )-3-этилкарбодиимид, в инертном органическом растворителе, таком как диметилформамид и/или метиленхлорид. Реакцию обычно проводят при температуре от 0 до 50°С, предпочтительно при комнатной температуре. Если используют соль соединения формулы (II), реакцию обычно осуществляют при дополнительном присутствии основания, такого как триэтиламин. В данной области известны другие подходящие реагенты и растворители, например галогенангидрид кислоты, такой как п-анизоилхлорид, в присутствии основания, такого как триэтила мин.

Реакция между соединением формулы (IV) и соединением формулы (V) обычно может быть осуществлена с использованием реагентов и условий реакций, традиционно применяемых для образования

- 2 007300 амидной связи, которые, например, указаны выше для реакции соединения формулы (II) с соединением формулы (III).

Соединения формулы (II) могут быть получены взаимодействием соединения формулы (IV) с соединением формулы (VI)

в которой К¹ представляет собой защитную группу для амина, такую как трет-бутоксикарбонил (Вос), с получением соединения формулы (VII)

после чего удаляют защитную группу.

Соединение формулы (IV) известно, и оно может быть названо 1-(1-метилпиперидин-4ил)пиперазин.

Соединения формулы (V) могут быть получены взаимодействием соединения формулы (VIII)

в которой К² представляет собой защитную группу для карбоксила, например С_1-6алкильную группу, такую как метильная или этильная, с соединением формулы (III) с получением соединения формулы (IX)

после чего удаляют защитную группу.

Соединения формул (VI) и (VIII) являются известными или могут быть получены из (Ώ)циклопропилглицина с использованием традиционных способов защиты карбоксильной или аминогруппы в аминокислоте. Удобно получать (П)-циклопропилглицин из циклопропанкарбоксальдегида с использованием (К)-(+)-а-метилбензиламина способом, описанным в патенте США №6090982, или с использованием методики, представленной в данном описании.

Соединения формулы (III) хорошо известны.

Защита амино- и карбоксильной группы описана в МсОт1е, Рго1ес1ш§ Сгоирз ΐη Огдашс Сйет1з!гу, Р1епит Ргезз, ΝΥ, 1973 и Сгеепе апс.1 \\'и1з, Рго1ес1шд Сгоирз ΐη Огдашс ЗупШез1з, 2ηά. Εά., ,ΙοΙιη \\'Пеу & Зопз, ΝΥ, 1991. Примеры защитных групп для карбоксила включают С₁-С₆алкильные труппы, такие как метильная, этильная, трет-бутильная и трет-амильная; арил(С₁-С₄)алкильные группы, такие как бензильная, 4-нитробензильная, 4-метоксибензильная, 3,4-диметоксибензильная, 2,4-диметоксибензильная, 2,4,6-триметилбензильная, бензилгидрильная и тритильная; силильные группы, такие как триметилсилильная и трет-бутилдиметилсилильная; и аллильные группы, такие как аллильная и 1(триметилсилилметил)проп-1-ен-3-ильная.

Примеры защитных групп для амина включают ацильные группы, такие как группы формулы К³СО, в которой К³ представляет собой С_1-6алкокси, фенилС_1-6алкокси или С_3-10циклоалкокси, где фе- 3 007300 нильная группа может быть необязательно замещена, например, одним или двумя заместителями, выбранными из галогена, С1_-4алкила и С1_-4алкокси.

Предпочтительные защитные группы для амина включают бензилоксикарбонил (СВх) и третбутоксикарбонил (Вос).

Полагается, что некоторые из указанных в данном описании промежуточных продуктов, например соединения формул (II) и (V), являются новыми и, соответственно, рассматриваются в качестве дополнительных аспектов изобретения.

Соединения изобретения могут быть введены любым подходящим путем, например в желудочнокишечный тракт (например, ректально или перорально), нос, легкие, мускулатуру или сосудистую сеть или транедермально. Соединения могут быть введены в любой форме, подходящей для введения, например в виде таблеток, порошков, капсул, растворов, дисперсий, суспензий, сиропов, аэрозолей, суппозиториев, гелей, эмульсий, пластырей и т.д. Такие композиции могут содержать компоненты, общепринятые в фармацевтических препаратах, например разбавители, носители, модификаторы рН, подсластители, наполнители и дополнительные активирующие агенты. Если требуется парентеральное введение, композиции должны быть стерильными и находиться в форме раствора или суспензии, подходящих для инъекции или вливания. Такие композиции образуют еще один аспект изобретения.

С точки зрения данного аспекта изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль для использования в терапии.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного препарата, предназначенного для лечения тромботического заболевания.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу лечения тромботического заболевания у субъекта, нуждающегося в таком лечении, включающему введение эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли.

Субъектом может быть человек или отличное от человека животное, такое как отличное от человека млекопитающее, например кошка, собака, лошадь, корова или овца.

Тромботическое заболевание может представлять собой, например, венозный тромбоз, эмболию легких, артериальный тромбоз, ишемию миокарда, инфаркт миокарда или церебральный тромбоз. Соединения могут быть также использованы в соответствии со способом изобретения при лечении резкого закрытия сосуда, связанного с тромболитической терапией и рестенозом, например после транслюминальной пластической операции на коронарных сосудах или обходного сосудистого шунтирования коронарных или периферических артерий, и при сохранении сосуда больного в раскрытом состоянии при продолжительном гемодиализе больных.

Доза соединения формулы (I) будет зависеть от природы и тяжести заболевания, подвергаемого лечению, способа введения лекарственного средства, массы тела и специфических особенностей субъекта. Однако, обычно лекарственное средство вводят в количестве в диапазоне от 0,01 до 100 мкмоль/кг массы тела.

Использованный в данном описании термин «лечение» включает профилактическое применение. Термин «эффективное количество» относится к количеству соединения формулы (I), которое является эффективным для уменьшения или ингибирования развития симптомов подвергаемого лечению тромботического заболевания.

Соединение в соответствии с изобретением может быть введено одно или в комбинации с антикоагулянтом, имеющим другой путь действия, или с тромболитическим средством.

Данное изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Использованные сокращения соответствуют номенклатуре ШРАС-ЮВ. В описании используются следующие сокращения: Вос (третичный бутилоксикарбонил), Выч. (вычислено), ИМ8О (диметилсульфоксид, полностью дейтерированный, если для ЯМР), ЕИО (гидрохлорид (1-(3-диметиламинопропил)-3этилкарбодиимида), Е8-М8 (масс-спектр с ионизацией электрораспылением), НОВ! (1гидроксибензотриазол), ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография с !_г в качестве времени удерживания), МеОН (метанол), ЯМР (ядерный магнитный резонанс), ТЕА (трифторуксусная кислота).

Пример 1. 1-(4-Метоксибензоил-И-циклопропилглицинил)-4-(1-метилпиперидин-4-ил)пиперазин

A. И-Циклопропилглицин

Аминокислоту получали удобным путем из циклопропанкарбоксальдегида с использованием К.-(+)α-метилбензиламина и методики патента США №6090982 или с использованием методики, представленной в данном описании.

B. Вое-И-циклопропилглицин

Перемешивали раствор И-циклопропилглицина (46,1 г, 0,4 моль) в смеси диоксана (600 мл), воды (300 мл) и 1Ν ΝαΟΗ (480 мл, 0,48 моль), охлажденный на бане со льдом до 0-5°С. Медленно добавляли дитрет-бутилдикарбонат (105 г, 0,48 моль) и продолжали перемешивание при комнатной температуре в

- 4 007300 течение 0,5 ч. Раствор концентрировали в вакууме примерно до 500 мл, охлаждали на бане со смесью льда и воды, покрывали слоем этилацетата (500 мл) и подкисляли разбавленным водным раствором КН8О₄ до рН 2-3. Водную фазу экстрагировали этилацетатом (500 мл) и экстракцию повторяли до исчезновения продукта. Этилацетатные экстракты объединяли, промывали водой (0,5 л), насыщенным раствором соли (0,5 л), сушили над Ыа₂80₄, фильтровали и концентрировали с получением белого твердого вещества (78 г, 90,6%).

|а| ² = -31° (с=1,02, МеОН).

Ή ЯМР (ДМС-б₆), δ: 5,9 (ушир.с, 1Н), 5,09 (ушир.с, 1Н), 3,75 (м, 1Н), 1,42 (с, 9Н), 1,10 (д, 1Н), 0,40,7 (м, 4Н).

С. 1-(Вое-Э-циклопропилглицинил)-4-(1-метилпиперидин-4-ил)пиперазин

Вое-Э-циклопропилглицин (216,0 г, 1,0 моль) и 1-(1-метилпиперидин-4-ил)пиперазин (192 г, 1,05 моль) суспендировали в водном растворе СН₂С1₂ (3,2 л) в атмосфере Ν₂. Затем смесь охлаждали на бане со льдом до 0-5°С. К полученной смеси добавляли моногидрат 1-гидроксибензотриазола (НОВ!) (149 г,

1,1 моль) и диизопропилэтиламин (136 г, 1,05 моль), после чего медленно добавляли гидрохлорид 1-[3(диметиламино)пропил]-3-этилкарбодиимида (ЕЭС1) (211 г, 1,1 моль), поддерживая температуру при 05°С в течение 1 ч. Реакционной смеси давали возможность нагреться в течение ночи до комнатной температуры. Затем реакционную смесь гасили добавлением насыщенного (насыщ.) водного раствора NаНСОз (3 л) и экстрагировали метиленхлоридом (2 л). Разделяли слои. Органический слой опять промывали насыщ. NаНСОз (3 л), насыщенным раствором соли (2 л), сушили над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали с получением неочищенного продукта в виде вязкого масла (415 г, 109%), который использовали непосредственно.

Ή ЯМР (ДМС-б₆), δ: 6,91 (д, 1Н), 3,97 (т, 1Н), 3,41 (ушир.с, 4Н), 2,74 (д, 2Н), 2,40 (ушир.с, 4Н), 2,10 (м, 1Н), 2,09 (с, 3Н), 1,79 (т, 2Н), 1,65 (д, 2Н), 1,40 (м, 2Н), 1,36 (с, 9Н), 1,05 (м, 1Н), 0,93 (д, 1Н), 0,40 (м, 2Н), 0,26 (м, 1Н).

Ό. Тригидрохлорид 1-(Э-циклопропилглицинил)-4- (1-метилпиперидин-4-ил)пиперазина

1-(Вое-Э-циклопропилглицинил)-4-(1-метилпиперидин-4-ил)пиперазин (неочищенный, 415 г, 1,0 моль) растворяли в безводном метаноле (1,5 л). К полученному раствору при 0°С добавляли раствор НС1МеОН (380 г/1,5 л, 10,4 моль). Реакционную смесь перемешивали и медленно нагревали до комнатной температуры в течение 2-х ч. Затем при перемешивании добавляли этилацетат (2 л) . Перемешивание продолжали в течение 1 ч при 0-5°С, и продукт выпадал в виде белого порошка, который фильтровали и сушили в вакууме при 45°С с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (357 г, 91,7%).

'Н ЯМР (ДМС-б₆+Э₂О), δ: 8,4 (ушир.с, 1Н), 4,5 (ушир.с, 2Н), 3,0 (т, 4Н), 2,78 (м, 1Н), 2,74 (с, 3Н),

2,35 (м, 2Н), 2,20 (м, 1Н), 2,08 (м, 2Н), 1,06 (ушир.д, 1Н), 0,60 (м, 4Н).

Е. 1-(4-Метоксибензоил-О-циклопропилглицинил)-4-( 1 -метилпиперидин-4-ил)пиперазин

Тригидрохлорид 1-(О-циклопропилглицинил)-4-(1-метилпиперидин-4-ил)пиперазина (300 г, 0,77 моль) суспендировали в безводном СН2С12 (3 л) в атмосфере Ν2. Затем смесь охлаждали на бане со льдом до 0-5°С. Медленно добавляли триэтиламин (450 мл, 3,23 моль), поддерживая температуру при 0-5°С, затем медленно добавляли п-анизоилхлорид (142 г, 0,83 моль), снова поддерживая температуру при 05°С. Реакционной смеси давали возможность нагреться до комнатной температуры в течение 2-х ч. Затем реакционную смесь гасили добавлением насыщенного раствора №1НСО₃ (1л) и разделяли слои. После этого водный слой экстрагировали СН₂С1₂ (2 л). Органические слои объединяли, промывали насыщенным раствором соли (1 л), сушили над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения (326 г, 102%).

'Н ЯМР (ДМС-б₆), δ: 8,55 (д, 1= 7,7 Гц, 1Н), 7,88 (д, 2Н), 6,96 (д, 2Н), 4,39 (т, 1Н), 3,79 (с, 3Н), 3,45 (с, 4Н), 2,74 (д, 2Н), 2,40 (м, 4Н), 2,09 (с, 3Н), 2,08 (м, 1Н), 1,79 (дт, 2Н), 1,62 (д, 2Н), 1,38 (м, 2Н), 1,26 (м, 1Н), 0,43 (м, 2Н), 0,35 (м, 2Н).

Пример 1а. Дифумарат 1-(4-метоксибензоил-О-циклопропилглицинил)-4-(1-метилпиперидин-4ил)пиперазина

К раствору 1 -(4-метоксибензоил-О-циклопропилглицинил)-4-( 1 -метилпиперидин-4-ил)пиперазина (315 г, 0,76 моль) в 95% этаноле (4,2 л), нагретому до 65°С, добавляли раствор фумаровой кислоты (177 г, 1,52 моль) в горячем этаноле (при 65°С, 2,8 л). Конечный прозрачный раствор перемешивали при 65°С и медленно охлаждали до комнатной температуры (в течение 2-х ч), а затем до 0-5°С. Белые кристаллы отфильтровывали, промывали 95% этанолом (1 л) и сушили в вакууме при 45°С с получением указанной в заголовке соли (448 г, 91,2%), т.пл.= 205-207°С.

Ή ЯМР (ДМС-б₆), δ: 11,35 (с, 1Н), 8,58 (д, 1Н), 7,86 (д, 2Н), 6,96 (д, 2Н), 6,55 (с, 4Н), 4,39 (т, 1Н), 3,79 (с, 3Н), 3,45 (с, 4Н), 3,20 (д, 2Н), 2,62 (т, 2Н), 2,55 (с, 3Н), 2,42 (м, 6Н), 1,80 (д, 2Н), 1,62 (д, 2Н), 1,28 (м, 1Н), 0,43 (м, 2Н), 0,35 (м, 2Н).

|а| ² = -37,7° (с=0,836, Н₂О).

- 5 007300

Пример 1Ь. Гидрохлорид 1-(4-метоксибензоил-О-циклопропилглицинил)-4-(1-метилпиперидин-4ил)пиперазина

1-(4-Метоксибензоил-О-циклопропилглицинил)-4-(1-метилпиперидин-4-ил)пиперазин (3,04 г, 6,73 ммоль) растворяли примерно в 0,2 М НС1 (37 мл) и лиофилизовали с получением 2,98 г (количественный выход) указанного в заголовке соединения.

Неполный спектр ^!Н ЯМР (ДМС-б₆), δ: 10,63 (ушир., 1Н), 8,59 (Ьг, 1Н), 7,88 (д, 2Н), 6,98 (д, 2Н),

4,36 (ушир.т, 1Н), 3,82 (с, 3Н), 2,70 (с, 3Н), 1,29 (м, 1Н), 0,48 (м, 2Н), 0,36 (м, 2Н).

Е8-М8, т/ζ: 415,5 (М+1)⁺.

Анализ С₂₃Н₃₄ЩО₃ · 1,25 НС1 · 1,0 Н₂О:

Вычислено: С 57,78; Н 7,85; N 11,72; С1 9,30;

Найдено: С 57,79; Н 7,93; N 11,74; С1 9,64.

Аналитическая ВЭЖХ (Х1егга РР18. 4,6 х 150 см, смесь 10% ацетонитрил/вода (0,1% ТЕА) - смесь 50% ацетонитрил/вода (0,1% ТЕА) в течение 40 мин), 1 мл/мин: 99%, ΐ_Γ = 10,66 мин.

Пример 2. 1-[(3-Фтор-4-метоксибензоил)-О-циклопропилглицинил]-4-(1-метилпиперидин-4ил)пиперазин

К перемешиваемой суспензии тригидрохлорида 1-Э-циклопропилглицинил-4-(1-метилпиперидин4-ил)пиперазина (1,5 г, 3,85 ммоль) в дихлорметане (30 мл) добавляли триэтиламин (1,36 г, 13,5 ммоль), после чего добавляли 3-фтор-4-метоксибензойную кислоту (0,622 г, 3,66 ммоль), НОВ1 (0,573 г, 4,24 ммоль) и ЕЭС1 (0,813 г, 4,24 ммоль). После перемешивания в течение ночи смесь распределяли между дихлорметаном и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Затем органическую фазу опять промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, после этого насыщенным раствором соли, затем сушили Мд8О₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Затем остаток растворяли в дихлорметане и очищали хроматографией на силикагеле, осуществляя градиентное элюирование смесью 012% 2Ν аммиак/метанол в дихлорметане. Содержащие чистый продукт фракции объединяли и концентрировали в вакууме с получением 1,03 г (61%) указанного в заголовке соединения.

Е8-МС, т/ζ: 433,5 (М+1)⁺

Аналитическая ВЭЖХ (Уубас С18, 4,6 х 150 см, смесь 10% ацетонитрил/вода (0,1% ТЕА) - смесь 50% ацетонитрил/вода (0,1% ТЕА) в течение 40 мин), 1 мл/мин: 95%, ΐ_Γ = 13,16 мин.

Пример 2а. Гидрохлорид 1-[(3-фтор-4-метоксибензоил)-О-циклопропилглицинил]-4-(1метилпиперидин-4-ил)пиперазина

1-[(3-Фтор-4-метоксибензоил)-О-циклопропилглицинил]-4-(1 -метилпиперидин-4-ил)пиперазин (1 г, 2,31 ммоль) растворяли примерно в 0,2 М НС1 (12,7 мл) и лиофилизовали с получением 1,03 г (количественный выход) указанного в заголовке соединения.

Неполный спектр ^!Н ЯМР (ДМС-б₆), δ: 10,36 (ушир., 1Н), 8,73 (д, 1Н), 7,75-7,83 (м, 2Н), 7,25 (т, 1Н),

4,36 (т, 1Н), 3,90 (с, 3Н), 2,70 (с, 3Н), 1,28 (м, 1Н), 0,48 (м, 2Н), 0,36 (м, 2Н).

Е8-М8, т/ζ: 433,3 (М+1)⁺.

Анализ С₂₃Н₃₃ЕЩО₃ · 1,6 НС1 · 0,5 Н₂О:

Вычислено: С 55,26; Н 7,18; N 11,21; Е 3,80; С1 11,35;

Найдено: С 55,31; Н 7,24; N 11,38; Е 3,64; С1 11,36.

Аналитическая ВЭЖХ (Х1егга ВР18, 4,6 х 150 см, смесь 10% ацетонитрил/вода (0,1% ТЕА) - смесь 50% ацетонитрил/вода (0,1% ТЕА) в течение 40 мин.), 1 мл/мин: 98%, ΐ_Γ = 8,067 мин.

Анализы ингибирования фермента

Способность испытуемого соединения ингибировать фактор Ха может быть оценена одним или несколькими следующими анализами ингибирования фермента или другими стандартными анализами, известными специалистам в данной области.

Анализ ингибирования фермента

Человеческий фактор Ха и человеческий тромбин приобретали у Еηζуте Вевеатсй ЬаЬогаЮпев (8ои1й Вепб, 1иб1аиа, И8А). Другие протеазы получали из других коммерческих источников. Хромогенные пара-нитроанилидные субстраты для пептидазы приобретали у М|б\те51 Вю1ес11 (Ивйетв, 1иб1аиа, И8А).

Способность к связыванию человеческого фактора Ха измеряли в виде кажущейся константы ассоциации Касса (Каве), полученной из кинетики ингибирования, как описано ранее в ^а' ^Ь' ^с' ^б. Значение кажущейся константы по Кассу получали с использованием автоматических (ВюМек - 1000) разбавлений ингибиторов (определения по Кассу осуществляли в виде трех одинаковых опытов, проводимых при каждых четырех-восьми концентрациях ингибитора) в 96-луночных планшетах, и скорости гидролиза хромогенного субстрата определяли при 405 нм с использованием считывающего устройства Тйеттотах от Мо1еси1аг Оеуюев (8аи Егаиавсо). Для ингибирования фактора Ха протокол анализа был следующим: 50 мкл буфера (0,06 М ίτίβ, 0,3 М №С1, рН 7,4); 25 мкл раствора испытуемого ингибитора (в МеОН); 25 мкл человеческого фактора Ха (32 нМ в 0,03 М ΐτίβ, 0,15 М №С1, 1 мг/мл Н8А); и, наконец, 150 мкл ВζI1е^1и^1уА^дрNА (0,3 мМ в воде), добавленного в течение 2-х мин для начала гидролиза. Конечная концентрация [фактора Ха] составляла 3,2 нМ. Концентрацию свободного фактора [Ха] и концентрацию

- 6 007300 связанного фактора [Ха] определяли по линейным стандартным кривым на том же планшетном считывающем устройстве, используя компьютерное обеспечение 8ойшахРго, для каждой концентрации ингибитора и вычисляли значение кажущейся константы ассоциации по Кассу для каждой концентрации ингибитора, которая давала ингибирование гидролиза, равное значению между 20 и 80% относительно контрольного образца (3,2 нМ фактор Ха) : кажущаяся константа ассоциации по Кассу = [Е:1] / [Е_£] [1_£] = [Е_ь]/[Е_£] [1°-1_ь], где [Е:1] и [Е_Ь] обозначают концентрацию фактора Ха, связанного с ингибитором, [Е_£] обозначает концентрацию свободного фактора Ха, [1_£] и [1°-1_Ь] обозначают исходную концентрацию ингибитора. Полученные таким образом значения кажущейся константы ассоциации по Кассу приблизительно представляют собой обратные значения Κι для соответствующих ингибиторов [1/каж. по Кассу = прибл. Κι]. Отклонения средних значений кажущейся константы по Кассу, определенные при выбранной концентрации субстрата, составляли +/- 15%. Кт анализируемой системы равна 0,347 +/-0,031 мМ [число измерений п= 4]; и Утах равна 13,11 +/- 0,76 мкМ/мин.

Значения по Кассу определяли с тромбином и другими протеазами с использованием такого же протокола и следующих концентраций фермента и субстрата:

5.9 нМ тромбина с 0,2 мМ В/Р11сУа1ЛгдрХЛ;

1,2 нМ фактора Х1а с 0,4 мМ пиро61иРгоЛгдрМЛ;

нМ фактора Х11а с 0,2 мМ НОРгоРкеАтдрЫЛ;

3.4 нМ плазмина с 0,5 мМ НОУаШеиЬлърХЛ;

1,2 нМ ηΐ-РА с 0,8 мМ НОПеРгоАтдрЫЛ;

0,4 нМ урокиназы с 0,4 мМ пироС1иС1уЛгдрЫЛ;

нМ аРС с 0,174 мМ пиро61иРгоАгдрЫА;

1.9 нМ калликреина плазмы с П-РгоРйеАгдрЫА; и

1.4 нМ бычьего трипсина с 0,18 мМ В7РйеУа1АгдрЫА.

Список литературы (a) 8ай Э1. 1А Вакбап, 8Ь Впддк, 1А ВиЬеп, ΝΥ СЫгдабхе. ΌΚ С1а^коп, МЬ Эеппу. ΌΌ О1ега, Ό8 Огйогб-Мооге, Ε\ν Нагрет, КЬ Наикег, VI К11шко^кк1, Т1 Кокп, Н-8 Ып, Ж МеСо^ап, АО Ра1ко^11х, ОЕ διηίΐΐτ МЕ Й1скей, К ТакеисЫ, КЗ Ткгаккег, 1М Тшк1еу, ВО ИйегЬаск, 8-СВ Υаη, М Ζΐκιιΐβ. ЭЫакю Вепхо|Ь|11нор11епе5 Эепуаиуек ак а Ыоте1 С1акк о£ Асбуе 8Не ЭйесШб ТНготЫп 1пЫЬйогк. 1. Оекегтшабоп о£ Не 8еппе Рго1еаке 8е1есбуйу, 8йис1иге-Асбуйу Йе1абопкЫрк апб Вшбшд ОпеШабоп. 1. Меб. СНет. , 40, 3489-3493 (1997).

(b) 8тй11 ОЕ, Т1 Стай, Ό8 ОШогб-Мооге, VI СоШШтап, ΚΌ Кш-ζ, Е ЙоЬейк, ЙТ 8Нитап, ОЕ 8апбикку, ΝΏ 1опек, N СЫ^дабζе, апб СУ касккоп. А Еатйу о£ Агдша1 ТНготЫп 1пЫЬйогк Йе1а1еб 1о ЕШедИгап. 8ет. ТкготЬок. Нетокк 22, 173-183 (1996).

(c) 8ιηί11ι ОЕ, Ό8 Огйогб-Мооге, Т1 Стай, N СЫ^дабζе, КЗ ЙШегЬопек, ТО Ьшбкбот, ДН 8а11ег\\'1Ше. ЕШедабап: А №\ν Сагбюуакси1аг Апбсоади1апЕ 1п №\ν Апбсоади1ап1к £ог Ле Сагбюуакси1аг Рабеп!. Еб. й РШагге. Нап1еу & Ве1£ик, 1пс., РЫ1абе1рЫа (1997) рр 265-300.

(б) 8ай ΌΙ, ОБ Вайеу, 1А Вакйап, ΝΥ СЫ^дабζе, АС С1етепк-8тйН, МЬ Оеппеу, М1 Е1к1ег, ΌΌ Оейа, Ό8 Огйогб-Мооге, ЙV Нагрег, ЬМ Лйпкоп, VI К11тко^кк1, Т1 Кокп, Н8 Ып, Ж МсСо^ап, АО Ра1ко\\'1Щ МЕ йюкей, ОЕ 81111111, Όν 8пубег, К ТакеисЫ, 1Е ТоЛ, М Ζιπ§. П1атшо Веηζо|Ь|ιН^орНеηе Эепуаиуек ак а №се1 С1акк о£ Асйуе 8йе Э1гес1еб ТНготЫп ЫЫЬНогк: 5. Рокепсу, ЕШсасу апб РНагтасокшебс Ргорегбек о£ Моббаеб С-3 81бе Скат Эепуаиуек. 1. Меб. СНет., 43, 649-663 (2000).

Было найдено, что приведенные в данном описании в качестве примеров соединения формулы (I) показывают в анализе ингибирования фермента значения константы по Кассу, равные примерно от 14 х 10⁶ до 35 х 10⁶ л/моль.

Способность испытуемого соединения продлевать неполное время тромбопластина (протромбиновое время) может быть оценена в следующих протоколах испытаний.

Протокол определения неполного времени тромбопластина (протромбина)

Венозную кровь собирали в пробирки с 3,2% (0,109 М) тринатрийцитратом при соотношении 1 объем антикоагулянта к девяти объемам крови. Клетки крови отделяли центрифугированием при 700 д в течение 10 мин с получением плазмы, которую замораживали при 70°С до возникновения необходимости в ее использовании.

Для осуществления испытания 100 мкл плазмы отбирали пипеткой в стеклянную пробирку, добавляли 1 мкл испытуемого соединения в ДМСО и давали нагреться в течение более двух минут до 37°С. Добавляли 100 мкл теплого (37°С) реагента Манчестера (тромбопластин ткани) (Не1епа Вюкаепсек, ИК) и давали возможность установиться равновесию в течение двух минут. Для инициирования свертывания крови добавляли 100 мкл теплого (37°С) 25 мМ раствора хлорида кальция. Пробирку три раза наклоняли под углом 90° каждые пять секунд для смешивания реагентов и регистрировали время образования сгустков. Данные, полученные в результате ряда наблюдений и использования различных концентраций испытуемого соединения, анализировали с помощью программы статистического анализа 8А8 и СТ2 (концентрация, необходимая для удвоения времени свертывания) для каждого полученного соединения.

Было найдено, что соединения изобретения значительно продлевают неполное время тромбопластина (протромбиновое время).

- 7 007300

Альтернативные протоколы протромбинового времени и АРТТ

Определения коагуляции. Значения протромбинового времени и АРТТ определяли в человеческой плазме с использованием прибора 8ТА (81а§о). ΒίοΡΤ представляет специальный анализ неплазматического свертывания, инициированный человеческим тканевым фактором (Ιηηονΐη). Возможное связывание с альбумином или липидом оценивали сравнением действий ΒίοΡΤ в присутствии/отсутствии 30 мг/мл человеческого альбумина (Н8А) и 1 мг/мл фосфатидилхолина (РС) . Ингибиторы доставлялись в 50% водно-метанольном носителе.

Анализ АРТТ мкл плазмы Сйго1 Вах1ег-Иа0е, нормальная человеческая плазма с цитратом мкл испытуемого раствора мкл Αεΐίη Вах1ег-Иа0е, активированный цефалопластин инкубировали 2 мин при 37°С мкл СаС1₂ (0,02 М)

Анализ РТ (ПВ) мкл плазмы мкл испытуемого раствора мкл физиологического раствора инкубировали 1 мин при 37°С.

мкл Ιηηονΐη Вах1ег-Иа0е, рекомбинантный человеческий тканевый фактор

Дополнительные выгодные свойства соединений формулы (I) могут быть наглядно показаны определением их фармакодинамических (ΡΏ) и фармакокинетических (РК) свойств в лабораторных испытаниях на таких видах животных, как крысы и собаки, с пероральным дозированием голодным и накормленным животным.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение формулы (I) н

(I) в которой К представляет собой атом водорода или атом фтора, или его фармацевтически приемлемая соль.
2. Соединение по п.1, в котором К представляет собой атом водорода.
3. Соединение по п.2, выбранное из

1-(4-метоксибензоил-И-циклопропилглицинил)-4-(1-метилпиперидин-4-ил)пиперазина и его гидрохлоридных, фумаратных и малеатных аддитивных солей кислоты.
4. Соединение по п.3, выбранное из дигидрохлоридных, дифумаратных и дималеатных аддитивных солей кислоты в кристаллической форме.
5. Соединение по п.4, представляющее собой дифумарат 1-(4-метоксибензоил-И- циклопропилглицинил)-4-(1-метилпиперидин-4-ил)пиперазина в кристаллической форме.
6. Соединение по п.1, в котором К представляет собой атом фтора.
7. Соединение по п. 6, выбранное из

1-(3-фтор-4-метоксибензоил-И-циклопропилглицинил)-4-(1-метилпиперидин-4-ил)пиперазина и его гидрохлоридных аддитивных солей кислоты.
8. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по одному любому из пп.1-7 вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.
9. Фармацевтическая композиция по п.8, приспособленная для перорального введения.
10. Способ получения соединения по одному любому из пп.1-7, включающий:

(а) взаимодействие соединения формулы (II)

- 8 007300 или его соли с соединением формулы (III) или его реакционноспособным производным; или (Ь) взаимодействие соединения формулы (IV) (IV)

Г~\

Ν ΝΗ или его соли с соединением формулы (V) или его реакционноспособным производным;

и последующее образование фармацевтически приемлемой соли, если требуется фармацевтически приемлемая соль.
11. Соединение формулы (II) или его соль.
12. Соединение формулы (V)
13. Соединение по одному любому из пп.1-7, предназначенное для использования в терапии.
14. Применение соединения по одному любому из пп.1-7 для производства лекарственного препарата, предназначенного для лечения тромботического заболевания.
15. Применение по п.14, в котором лекарственный препарат предназначен для перорального лечения тромботического заболевания.
16. Способ лечения тромботического заболевания у субъекта, нуждающегося в таком лечении, включающий введение эффективного количества соединения по п.1.
17. Способ по п.16, в котором соединение вводят субъекту перорально.