EA006744B1

EA006744B1 - Применение ингибиторов il-18 для лечения и предотвращения повреждений цнс

Info

Publication number: EA006744B1
Application number: EA200301299A
Authority: EA
Inventors: Эстер Шохами
Original assignee: Арес Трейдинг С. А.
Priority date: 2001-05-25
Filing date: 2002-05-23
Publication date: 2006-04-28
Also published as: BR0210007A; HK1069762A1; WO2002096456A1; US20040191247A1; LT1390070T; US7655616B2; HRP20030842B1; RS56006B1; CN1535160A; CN1305529C; HUP0304067A2; PL216228B1; HUP0304067A3; CZ307321B6; ME00550B; EA200301299A1; CZ20033268A3; HU230294B1; CY1119190T1; IL159014A

Abstract

Данное изобретение относится к применению ингибиторов IL-18 в получении лекарственного препарата для лечения и/или предотвращения повреждения центральной нервной системы, в особенности травматического повреждения головы.

Description

Область применения

Настоящее изобретение относится к области патологических состояний головного мозга. Точнее, оно относится к применению ингибитора 1Ь-18 для лечения и/или предотвращения повреждения центральной нервной системы (ЦНС), в особенности, травматического повреждения головного мозга.

Предпосылки изобретения

В 1989 г. была описана эндотоксин-индуцированная активность сыворотки, которая индуцирует интерферон-γ (ΙΡΝ-γ), полученный в клетках селезенки мышей (№1катига с1 а1., 1989). Данная активность сыворотки действовала не как прямой индуктор ΙΡΝ-γ, а скорее как костимулятор вместе с 1Ь-2 или митогенами. В попытке выделить активное вещество из сыворотки мышей после воздействия эндотоксина был обнаружен, вероятно, гомогенный белок массой 50-55 кД. Так как другие цитокины могут действовать как костимуляторы продукции ΙΡΝ-γ, из-за неспособности нейтрализующих антител к ГС-1, ГР-4, 1Ь5, 1Ь-б или ΤΝΡ нейтрализовывать активность сыворотки предположили, что она определялась особым фактором. В 1995 г. теми же исследователями было продемонстрировано, что эндотоксининдуцированный костимулятор продукции ΙΡΝ-γ находится в экстрактах печени мышей, предварительно подвергнутых воздействию Р.аспек (Окатига с1 а1., 1995). В данной модели популяция печеночных макрофагов (клетки Купфера) увеличивалась, и у данных мышей низкие дозы бактериального липополисахарида (ЬР8), которые у предварительно неподготовленных мышей не были смертельными, становились смертельными. Фактор, названный ΙΡΝ-γ-индуцирующим фактором (ΙΟΙΡ) и позднее обозначенный как интерлейкин-18 (ТС-18), был очищен до гомогенности из 1200 г печени мышей, подвергнутых воздействию Р.аспек. Вырожденные олигонуклеотиды, происходящие из последовательностей аминокислот очищенного ТС-18, применяли для клонирования кДНК ТС-18 мышей. ТС-18 является белком с массой 18-19 кД, состоящим из 157 аминокислот, который не имеет очевидного сходства с каким-либо пептидом из баз данных. Молекулы матричной РНК для РС-18 и интерлейкина-12 (ΙΤ-12) легко определяют в клетках Купфера и активированных макрофагах. Рекомбинантный РС-18 стимулирует ΙΡΝ-γ более эффективно, чем ΙΤ-12, вероятно, через отдельный механизм (М1са11е£ е1 а1., 199б). Подобно эндотоксининдуцированной активности сыворотки, ΙΠ-18 стимулирует ΙΡΝ-γ не самостоятельно, а действует преимущественно как костимулятор с митогенами или ΙΤ-2. ΙΠ-18 усиливает пролиферацию Т-клеток, вероятно по ΙΤ-2-зависимому пути и усиливает продукцию цитокинов ΤΗΙ ίη νίίτο и оказывает синергическое действие при сочетании с ΙΤ-12 в отношении продукции ΙΡΝ-γ (Ма115/е\\ък| е1 а1., 1990).

После клонирования мышиной формы в 199б г. было сообщено о последовательности кДНК ΙΠ-18 человека (ИкЫо е! а1., 199б).

Путем клонирования ΙΠ-18 из пораженных тканей и изучения экспрессии гена ЛС-18 была обнаружена тесная ассоциация данного цитокина с аутоиммунными заболеваниями. У мышей без ожирения с диабетом (ΝΟΌ) спонтанно развивается аутоиммунный инсулит и диабет, которые могут быть усилены и синхронизированы путем одной инъекции циклофосфамида. Наличие мРНК ΙΠ-18 продемонстрировано методом ПЦР с обратной транскриптазой в поджелудочной железе ΝΟΌ-мышей во время ранних стадий инсулита. Уровни мРНК ΙΠ-18 быстро увеличивались после лечения циклофосфамидом и предшествовали увеличению мРНК ΙΡΝ-γ и, впоследствии, диабету. Интересно, что данная кинетика повторяет таковую мРНК ΙΤ-12-ρ40, приводя к тесной корреляции между индивидуальными уровнями мРНК. Клонирование кДНК ΙΠ-18 из панкреатической РНК с последующим секвенированием выявило идентичность с последовательностью ΙΠ-18, клонированной из клеток Купфера и предварительно активированных ίη νίνο макрофагов. Также макрофаги ΝΟΌ-мышей реагировали на циклофосфамид экспрессией гена ЛС-18, в то время как макрофаги мышей линии Ва1Ь/с, обработанных параллельно, не реагировали.

Следовательно, регуляция экспрессии ΙΠ-18 нарушена у ΝΟΌ-мышей с аутоиммунной патологией и тесно ассоциирована с развитием диабета (РоФе е! а1., 1997).

ΙΠ-18 играет потенциальную роль в иммунорегуляции или в воспалении путем усиления функциональной активности Гак-лиганда на клетках ΤΜ (Οοηίί е! а1., 1997). ΙΠ-18 также экспрессируется в коре надпочечников и, следовательно, может являться секретируемым нейроиммуномодулятором, играющим важную роль в гармоничной работе иммунной системы в ответ на стрессовое воздействие (Сйа!ег, 198б).

Ιη νίνο ΙΠ-18 образуется путем расщепления про-Ш-^ и, видимо, его эндогенная активность отвечает за продукцию ΙΡΝ-γ при смертности, опосредованной Р. аснек и ЬР8. Зрелый ΙΠ-18 образуется из его предшественника при помощи ΙΡ-1 β-конвертирующего фермента ДШв-конвертирующий фермент, Ιί'Έ. каспаза-1).

Рецептор ΙΠ-18 состоит как минимум из двух компонентов, действующих совместно при связывании лиганда. Высоко- и низкоаффинные связывающие участки для ΙΠ-18 были обнаружены на стимулированных ΙΤ-12 Т-клетках мышей (Υοκίιίιηοίο е! а1., 1998), что позволило предположить наличие рецепторного комплекса с множеством цепей. До настоящего времени были идентифицированы две субъединицы рецептора, обе принадлежащие к семейству рецепторов РС-1 (Рате! е! а1., 199б). В трансдукцию сигнала ΙΠ-18 вовлечена активация ΝΡ-кВ (ΌίΟοηηΙο е! а1., 1997).

Недавно из мочи человека был выделен растворимый белок, обладающий высокой аффинностью к ΙΠ-18, и были описаны кДНК человека и мыши (ΝονχΚ е! а1., 1999; АО 99/090б3). Данный белок был

- 1 006744 назван 1Ь-18-связывающим белком (1Б-18ВР).

1Ь-18ВР является не внеклеточным доменом одного из известных рецепторов 1Б-18, а секретируемым, встречающимся в природе циркулирующим белком. Он принадлежит к новому семейству секретируемых белков. Данное семейство, кроме того, включает несколько поксвирус-кодируемых белков, которые обладают высокой гомологичностью с 1Ь-18ВР(Ыоу1ск с1 а1., 1999). 1Ь-18ВР постоянно экспрессируется в селезенке, принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов и имеет ограниченную гомологию с рецептором 1Ь-1 типа II. Его ген локализован на человеческой хромосоме 11д13 и в геномной последовательности размером 8,3 т.п.н. не обнаружено экзона, кодирующего трансмембранный домен (Ыоу1ск с1 а1., 1999) .

Четыре человеческие и две мышиные изоформы 1Ь-18ВР, получающиеся в результате сплайсинга мРНК, обнаруженные в различных библиотеках кДНК, были получены, очищены и оценены в отношении биологической активности связывания и нейтрализации 1Б-18 (К1т с1 а1., 2000). Человеческая изоформа а [И-18ВР ([Б-18ВРа) показала наибольшую аффинность к 1Ь-18 с быстрым связыванием и медленным отсоединением и константой диссоциации (К(б)), составляющей 399 пМ. 1Ь-18ВРс имеет 1ддомен такой же как 1Ь-18ВРа, кроме 29 С-концевых аминокислот; К(б) 1Ь-18ВРс в 10 раз меньше (2,94 нМ) . Тем не менее, 1Ь-18ВРа и 1Ь-18ВРс нейтрализуют 1Б-18 > 95% при молярном избытке в два раза. У изоформ 1Ь-18ВРЬ и 1Ь-18ВРб отсутствует полный 1д-домен и отсутствует способность к связыванию или нейтрализации 1Ь-18. Мышиные изоформы 1Ь-18ВРС и 1Ь-18ВРб, обладающие идентичным 1ддоменом, также нейтрализуют >95% мышиного 1Б-18 при молярном избытке в два раза. Однако, мышиный 1Ь-18ВРб, который обладает такой же С-концевой последовательностью, что и человеческий 1Ь18ВРа, также нейтрализует человеческий 1Ь-18. Молекулярное моделирование позволило идентифицировать большие комбинированные электростатические и гидрофобные связывающие участки в 1д-домене 1Ь-18ВР, которые могут отвечать за его высокоаффинное связывание с лигандом (К1т с1 а1., 2000).

Травматическое повреждение головного мозга (ТВ1), также просто называемое травмой головы или закрытой травмой головы (СН1), относится к повреждению центральной нервной системы, при котором повреждение головного мозга вызвано внешним ударом по голове. Это чаще всего встречается при автомобильных или велосипедных авариях, но может также развиваться в результате неполного утопления, сердечного приступа, инсульта или инфекций. Данный тип травматического повреждения головного мозга обычно развивается в результате недостатка кислорода или кровоснабжения головного мозга и вследствие этого может быть отнесен к «аноксическому повреждению».

Закрытое повреждение головы развивается в результате удара по голове, например, при автомобильной аварии или при падении. В данном случае череп ударяется о стационарный объект, и головной мозг, находящийся внутри черепа, поворачивается и скручивается вокруг оси (ствола головного мозга), вызывая местное или распространенное повреждение. Также головной мозг, мягкая масса, окруженная жидкостью, что позволяет ему «плавать», может рикошетировать от черепа, что способствует дальнейшему повреждению.

После травмы может иметь место период бессознательного состояния, который может продолжаться минуты, недели или месяцы. В результате вращения и отдачи пациент с травматическим повреждением головного мозга обычно имеет повреждение или контузию многих отделов головного мозга. Это называется диффузным повреждением или «нереактивным повреждением» головного мозга. Типы повреждения головного мозга, имеющиеся при нереактивных повреждениях, могут быть классифицированы как первичные или вторичные.

Первичное повреждение головного мозга развивается в момент травмы, преимущественно в местах воздействия, в особенности, когда имеет место перелом черепа. Большие контузии могут быть ассоциированы с внутримозговым кровоизлиянием или могут сопровождаться кортикальными разрывами. Рассеянные повреждения аксонов появляются в результате сдвига и деформации растяжения нейрональных отростков, вызываемых ротационными движениями головного мозга внутри черепа. Также могут иметь место небольшие геморрагические повреждения или диффузное повреждение аксонов, что может быть определено только с помощью микроскопа.

Вторичное повреждение головного мозга развивается в результате осложнений, развивающихся после момента травмы. Эти повреждения включают внутричерепное кровоизлияние, травматическое повреждение внечерепных артерий, образование внутричерепных грыж, гипоксическое повреждение головного мозга или менингит.

«Открытая травма головы» представляет собой видимое повреждение головы и может развиться в результате огнестрельного ранения, несчастного случая или повреждения головного мозга предметом, прошедшим через череп («реактивное повреждение головного мозга»). Для данного типа травм головы более характерно повреждение специфической области головного мозга.

Так называемое «мягкое повреждение головного мозга» может развиваться без потери сознания и, возможно, сопровождаться только чувством онемения или спутанного состояния сознания в течение короткого времени. Хотя обеспечиваемый медицинский уход может быть минимальным, пациенты с повреждением головного мозга без комы могут испытывать симптомы и нарушения, похожие на таковые,

- 2 006744 испытываемые выжившими после травматической комы.

В ответ на травму, в головном мозге развиваются изменения, которые требуют наблюдения для предотвращения дальнейшего повреждения. Размер головного мозга часто увеличивается после серьезной травмы головы. Это состояние называется набуханием головного мозга и развивается при увеличении количества крови в головном мозге. С течением заболевания вода может скапливаться в головном мозга, что называется отеком головного мозга. Как набухание головного мозга, так и отек головного мозга приводит к избыточному давлению в головном мозге, называемому внутричерепным давлением (1СР).

Кома является продолжительным периодом бессознательного состояния, развивающимся непосредственно после травматического повреждения головы.

Существует несколько степеней комы. Степени комы могут быть оценены по прогрессированию степени реагирования пациента с травмой головы. В острой фазе травмы головы применяется шкала комы Глазго. При улучшении состояния пациента или его стабилизации применяется шкала «Вапсйо Ьок Аш1док 8са1е», которая оценивает степень когнитивного (понимания и способности к рассуждению) мышления.

Повреждение головного мозга часто приводит к персистирующим нарушениям, таким как посттравматическая эпилепсия, персистирующее вегетативное состояние или посттравматическая деменция.

Повреждение спинного мозга является другим типом повреждений ЦНС. Повреждения спинного мозга являются причиной большинства госпитализаций с параплегией и тетраплегией. Более 80% развиваются в результате дорожных аварий. Клинически выделяют две главных группы повреждений: открытые повреждения и закрытые повреждения.

Открытые повреждения вызывают прямую травму спинного мозга и нервных корешков. Прободающие повреждения могут вызывать распространенные разрывы и кровоизлияния. Закрытые повреждения, являющиеся причиной большинства спинномозговых повреждений, обычно ассоциированы с переломом/смещением позвоночного столба, что обычно определяется радиологически. Повреждение спинного мозга зависит от протяженности повреждения костей и рассматривается как две главные стадии: первичное повреждение, которым являются ушибы, рассечение нервных волокон и геморрагический некроз, и вторичное повреждение, которым являются экстрадуральная гематома, инфаркт, инфекция и отек.

Поздние результаты повреждения спинного мозга включают: восходящую и нисходящую антероградную дегенерацию поврежденных нервных волокон, посттравматическую сирингомиелию и системные проявления параплегии, такие как инфекции мочевого тракта и грудной клетки, пролежни и мышечная слабость.

Патология травматического повреждения головного мозга является комплексной и до настоящего времени неясной. Научно-исследовательские работы в последние десять лет подчеркивают важную роль цитокинов, высвобождающихся системно и локально в подоболочечном отделе после повреждения головного мозга и предполагают наличие двойственного эффекта провоспалительных цитокинов, таких как ΤΝΓ, 1Ь-б или 1Ь-8, на основании обнаружения зависящих от времени полезных и побочных эффектов данных медиаторов (Могдапб-Коккшапи е! а1., 1997; Кокктапп е! а1., 1997; 8йойаш1 е! а1., 1999; 8сйегЬе1 е! а1., 1999; \У11а1еп е! а1., 2000). Как описано выше, недавно открытым цитокином семейства 1Ь-1 является 1Б-18. Недавние исследования продемонстрировали, что 1Б-18 постоянно экспрессируется в ЦНС мышей, крыс и человека ш у1уо (СиШапе е! а1., 1998; 1апбег апб 8!о11, 1998; Рппх е! а1., 1999; РаккЬепбег е! а1., 1999; \У11ее1ег е! а1., 2000), так же, как и в первичных культурах астроцитов и микроглии, но не нейронов, 1п уйго (Сопб е! а1., 1999). Повышенные уровни 1Б-18 определяли в спинномозговой жидкости (СМЖ) пациентов с воспалительными заболеваниями ЦНС, такими как бактериальный менингит и вирусный менингоэнцефалит, но не в СМЖ у пациентов с рассеянным склерозом (М8) (РаккЬепбег е! а1., 1999). В отличие от обнаруженного, как правило, низкого подоболочечного уровня 1Б-18 у пациентов с М8, в спинном мозге крыс линии Ге\\ак с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом (ЕАЕ), модели исследования на животных М8, была продемонстрирована повышенная экспрессия мРНК 1Б-18 (1аибег апб 8!о11, 1998). Экспрессия и функциональное значение 1Б-18 при нейротравме до настоящего времени не исследовалось.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к патофизиологической роли 1Б-18 при заболеваниях ЦНС. Оно основано на обнаружении того, что лечение мышей ингибиторами 1Б-18, через один час или три дня после экспериментального закрытого повреждения головы (СН1), приводит к улучшению восстановления и меньшей протяженности повреждения головного мозга по сравнению с контрольными животными. Поэтому данное изобретение относится к применению ингибитора 1Б-18 для получения лекарственного препарата для лечения и/или предотвращения повреждения центральной нервной системы (ЦНС) и в частности травматического повреждения головного мозга.

Применение комбинаций ингибитора 1Б-18 с интерфероном и/или ΤΝΡ и/или ингибиторами воспаления и/или антиоксидантами также обеспечивается по настоящему изобретению. С целью применения

- 3 006744 подходов генной терапии для доставки ингибитора 1Б-18 в поврежденные ткани или клетки дальнейшие аспекты данного изобретения относятся к применению молекул нуклеиновых кислот, включающих кодирующую последовательность ингибитора 1Ь-18 для лечения и/или предотвращения повреждения ЦНС. Данное изобретение также относится к применению клеток, генетически сконструированных с целью экспрессии ингибиторов ΣΠ-18, для предотвращения и/или лечения повреждения ЦНС.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает гистограмму, изображающую уровень в плазме внутримозгового ΣΠ-18 (нг/мл) в целом мозге (заштрихованный), в левом полушарии (черный), или в правом полушарии (серый) в различных условиях.

Фиг. 2 показывает развитие оценки по шкале N88 (№иго1одюа1 8есеп1у 8соге) спустя 1, 24, 72 или 168 ч после травмы, с введением внутрибрюшинно 50 мкг 1Ь-18ВР через 1 ч после травмы (квадраты) или с инъекцией только растворителя (контроль, круги).

Фиг. 3 показывает ΔΝ88, оцениваемую через 24, 72 или 168 ч после травмы, с введением внутрибрюшинно 50 мкг 1Ь-18ВР через 1 ч после травмы (квадраты) или с инъекцией только растворителя (контроль, круги).

Фиг. 4 показывает ΔΝ88, оцениваемую через 1, 24 ч, 3 дня (д), 7 д или 14 д после травмы с введением внутрибрюшинно 50 мкг 1Ь-18ВР однократно на 3-й после травмы (ромбы) или в двойной дозе через 1 ч и на 3-й день после травмы (квадраты) или инъекции только растворителя (контроль, треугольники).

Описание изобретения

Настоящее изобретение основано на обнаружении статистически достоверного полезного эффекта ингибитора ΣΠ-18 на восстановление после повреждения головного мозга в модели закрытой травмы головы на мышах. В соответствии с настоящим изобретением, в дальнейшем было обнаружено, что 1Б-18 повышается в головном мозге и спинномозговой жидкости после травматического повреждения головного мозга, что показывает, что данный провоспалительный цитокин играет важную роль в патогенезе повреждения головного мозга.

Следовательно, данное изобретение относится к применению ингибитора ΣΠ-18 для получения лекарственного препарата для лечения и/или предотвращения повреждения центральной нервной системы (ЦНС).

Данное изобретение, кроме того, относится к применению ингибитора ΣΠ-18 для получения лекарственного препарата для лечения и/или предотвращения осложнений и поздних последствий повреждения ЦНС.

В предпочтительных вариантах воплощения изобретения повреждением ЦНС является травматическое повреждение головного мозга или закрытая травма головы.

В дальнейших предпочтительных вариантах воплощения изобретения повреждением ЦНС является повреждение спинного мозга.

Кроме того, в дальнейшем предпочтительном варианте воплощения изобретения повреждение головного мозга имеет сосудистое происхождение.

В контексте настоящего изобретения, выражение «повреждение центральной нервной системы» или «повреждение ЦНС» относится к любому повреждению головного или спинного мозга, независимо от периода времени от начала или вызывающей причины. Вызывающей причиной может быть, например, механическое воздействие или инфекция. Повреждение ЦНС, его клинические симптомы и последствия детально описаны в разделе «Предпосылки изобретения». Повреждение ЦНС включает, например, травму или другое повреждение головного или спинного мозга и также может быть названо нейротравмой.

Повреждение головного мозга может, например, включать или приводить к одному или нескольким проявлениям из следующего:

1. ухудшение внимания;

2. нарушение когнитивных функций;

3. нарушение речевых функций;

4. нарушение памяти;

5. нарушение поведения;

6. моторные расстройства;

7. любые другие неврологические нарушения.

Повреждение спинного мозга может, например, приводить к развитию параплегии или тетраплегии.

Осложнения или поздние результаты повреждения ЦНС также можно лечить и/или предотвратить в соответствии с настоящим изобретением. Осложнения и поздние результаты повреждения головного мозга описаны выше в разделе «Предпосылки изобретения». Они включают, но не ограничены указанным, например кому, менингит, посттравматическую эпилепсию, посттравматическую деменцию, дегенерацию нервных волокон или посттравматическую сирингомиелию, или кровоизлияние.

Настоящее изобретение также относится к применению ингибиторов ΣΠ-18 для получения лекарственного препарата для лечения и/или предотвращения любого повреждения головного мозга сосудистого

- 4 006744 происхождения, такого как гипоксическое повреждение головного мозга при церебральном инфаркте, ишемия, цереброваскулярная катастрофа или инсульт.

Термины «лечение» и «предотвращение», применяемые в данном описании, понимают как частичное или полное предотвращение, ингибирование, ослабление, улучшение или регрессия одного или более симптомов или причин(ы) повреждения ЦНС, а также, симптомов, заболеваний или осложнений, сопровождающих повреждение ЦНС. При «лечении» повреждения ЦНС вещества по данному изобретению вводят после начала заболевания, «предотвращение» относится к введению веществ до того, как у пациента будут замечены симптомы заболевания.

Лечение повреждения ЦНС является предпочтительным в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительно, с целью лечения повреждения ЦНС, ингибитор 1Ь-18 вводят по возможности как можно быстрее после повреждения ЦНС, например, в течение первого часа после повреждения. Однако, как показано в примерах, ниже, было показано, что один ингибитор 4Б-18 оказывает свое положительное действие на повреждение головного мозга даже при введении через три дня после развития повреждения головного мозга. Поэтому, с целью лечения повреждения ЦНС, предпочтительно введение ингибитора ΣΠ-18 в течение трех дней после повреждения.

Термин «ингибитор ΣΠ-18» в контексте настоящего изобретения относится к любой молекуле, модулирующей продукцию и/или действие ΣΠ-18 таким образом, что продукция и/или действие ΣΠ-18 ослабляется, уменьшается или частично, существенно или полностью предотвращается или блокируется. Термин «ингибитор ΣΠ-18» заключает в себе ингибиторы продукции ΣΠ-18, так же как ингибиторы действия 1Ь-18.

Ингибитором продукции может быть любая молекула, негативно воздействующая на синтез, процессинг или созревание 4Б-18. Ингибиторы, рассматриваемые по настоящему изобретению, могут быть, например, супрессорами экспрессии гена интерлейкина ΣΠ-18, антисмысловыми мРНК, уменьшающими и предотвращающими транскрипцию мРНК ΣΠ-18 или ведущими к деградации мРНК, белками, нарушающими правильную укладку, или частично или существенно предотвращающими секрецию ΣΠ-18, протеазами, способствующими деградации ΣΠ-18, после того, как он был синтезирован, ингибиторами протеаз, расщепляющих проЛЬ-18 с целью образования зрелого ΣΠ-18, такими как ингибиторы каспазы-1 и подобными.

Ингибитором действия ΣΠ-18 может быть, например, антагонист ΣΤ-18. Антагонисты могут связывать или изолировать саму молекулу ΣΠ-18 с достаточной аффинностью и специфичностью с частичной или существенной нейтрализацией ΣΠ-18 или ΣΤ-18-связывающего участка(ков), ответственного за связывание ΣΠ-18 с его лигандами (как, например, с его рецепторами). Антагонист может также ингибировать путь передачи сигнала с участием ΣΠ-18, который активируется в клетках после связывания ΣΠ-18 с его рецептором.

Ингибиторами действия ΣΠ-18 также могут быть растворимые рецепторы ΣΠ-18 или молекулы, имитирующие рецепторы, или агенты, блокирующие рецепторы ΣΠ-18, или антитела к ΣΠ-18, такие как поликлональные или моноклональные антитела или любые другие агенты или молекулы, предотвращающие связывание ΣΠ-18 с его мишенями, что уменьшает или предотвращает инициирование внутри- или внеклеточных реакций, опосредованных ΣΤ-18.

В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения ингибитор ΣΠ-18 выбирают из ингибиторов каспазы-1 (ΣΟΕ), антител к ΣΠ-18, антител к любым субъединицам рецептора ΣΠ-18, ингибиторов пути передачи сигнала с участием ΣΠ-18, антагонистов ΣΠ-18, которые конкурируют с ΣΠ-18 или связываются и блокируют рецептор ΣΠ-18, и ΣΕ-18-связывающих белков, изоформ, мутеинов, слитых белков, функциональных производных, активных фракций или производных циркулярной перестановки или их солей.

Термин «ΣΕ-18-связывающие белки» в данном описании применяется синонимично с «ΣΕ-18ΒΡ». Он включает ΣΠ-18 связывающие белки, определенные в \УО 99/09063 или в ΝονίοΚ с1 а1., 1999, включая варианты сплайсинга и/или изоформы ΣΕ-18-связывающих белков, как определено в К1т с1 а1., 2000. В частности, человеческие изоформы а и с ΣΕ-18ΒΡ являются полезными в соответствии с настоящим изобретением. Белки, полезные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть гликозилированными или негликозилированными и могут быть получены из натуральных источников, таких как моча, или они могут предпочтительно быть получены рекомбинантным путем. Рекомбинантная экспрессия может выполняться с помощью прокариотических систем экспрессии, таких как Е. сой, или эукариотических, и предпочтительно, систем экспрессии млекопитающих. Клеточной линией, особенно хорошо подходящей для ингибиторов ΣΠ-18 настоящего изобретения, являются клетки яичника китайского хомяка (СНО).

Рекомбинантная продукция ингибитора ΣΠ-18 при рекомбинантной экспрессии в клетках млекопитающих или клеточных линиях может предпочтительно осуществляться в среде для клеточных культур, не содержащей сыворотку.

Применяющийся в данном описании термин «мутеин» относится к аналогам ΣΕ-18ΒΡ или аналогам вирусного ΣΕ-18ΒΡ, в которых один или более аминокислотных остатков встречающегося в природе ΣΕ18ΒΡ или вирусного ΣΕ-18ΒΡ замещены отличными аминокислотными остатками или делетированы, или один или более аминокислотных остатков добавлены к встречающейся в природе последовательности

- 5 006744

4Б-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР, без значительного снижения активности полученных продуктов по сравнению с диким типом 1Ь-18ВР или вирусным 1Ь-18ВР. Данные мутеины получают путем известной технологии синтеза и/или путем технологии сайт-направленного мутагенеза, или любой другой известной подходящей технологии.

Любой такой мутеин предпочтительно имеет последовательность аминокислот, достаточно дублирующую таковую 1Ь-18ВР, или достаточно дублирующую вирусный 1Ь-18ВР так, чтобы обладать в значительной степени сходной активностью с 1Ь-18ВР. Одним из действий 1Ь-18ВР является его способность связывать 1Ь-18. Пока мутеин обладает существенной активностью связывания ΣΠ-18, он может применяться для очистки ΣΠ-18, такой как посредством аффинной хроматографии, и поэтому можно считать, что он обладает в значительной степени сходной активностью с 1Ь-18ВР. Следовательно, можно определить, обладает ли любой конкретный мутеин активностью, в значительной степени сходной с 1Ь18ВР, посредством обычных экспериментов, включающих в качестве объекта такой мутеин, например, методом простого конкурентного сэндвич-анализа для определения, связывает ли он специально помеченный ΣΠ-18, такого как радиоиммуноанализ или анализ ЕЬ1§А. Простые функциональные исследования для оценки биологической активности 1Ь-18ВР были детально описаны в \УО 99/09063, например, в примерах 2 (связывание ΣΠ-18, оцениваемое путем образования поперечных межмолекулярных связей) или 5 (ингибирование индуцированной ΣΠ-18 индукции ΣΕΝ-Υ в мононуклеарных клетках крови).

В предпочтительном варианте воплощения изобретения любой такой мутеин имеет по меньшей мере 40% идентичности или гомологии с последовательностью 1Ь-18ВР или кодированным вирусом гомологом 1Ь-18ВР. Более предпочтительно, чтобы он имел по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% идентичности или гомологии с ними.

Мутеины полипептидов 1Б-18ВР или мутеины вирусных 1Б-18ВР. которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, или нуклеиновая кислота, кодирующая их, включают ограниченный набор в значительной степени соответствующих последовательностей как, например, заменяющих пептиды или полинуклеотиды, которые могут быть обычно получены обычным специалистом в области техники без чрезмерного экспериментирования, основываясь на учении и руководстве, представленных в данном описании.

Мутеины в соответствии с настоящим изобретением включают белки, кодируемые нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которая гибридизуется с ДНК или РНК, которая кодирует ингибитор ΣΠ-18, в соответствии с настоящим изобретением, при умеренно или очень жестких условиях. Термин «жесткие условия» относится к условиям гибридизации и последующего промывания, которые обычно рассматриваются специалистами в данной области техники как «жесткие». См. Аи8иЬе1 е! а1., Сипси! Рго!осок ίη Мо1еси1аг Вю1о§у, ранее, Σηΐе^8с^еηсе, Ν.Υ., §§6.3, 6,4 (1987, 1992), и 8атЬгоок е! а1. (8атЬгоок, Σ.Ο, Егйзсй, Е.Е., апб МашаШ, Т. (1989) Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Рге88, Со1б 8рпп§ НагЬог, ΝΥ).

Без ограничений, примеры жестких условий включают условия промывания при температуре на 1220°С ниже рассчитанной Тср исследуемого гибрида в, например, 2 х 88С (хлорид натрия + цитрат натрия) и 0,5% 8Ό8 (додецилсульфат натрия) в течение 5 мин, 2 х 88С и 0,1% 8Ό8 в течение 15 мин; 0,1 х 88С и 0,5% 8Ό8 при 37°С в течение 30-60 мин и затем, 0,1 х 88С и 0,5% 8Ό8 при 68°С в течение 30-60 мин. Обычные специалисты в данной области техники понимают, что жесткость условий также зависит от длины последовательностей ДНК, олигонуклеотидных зондов (таких как 10-40 оснований) или смеси олигонуклеотидных зондов. При применении смеси зондов предпочтительно применять хлорид тетраметиламмония (ТМАС), вместо 88С, см. Аи8иЬе1, ранее.

В предпочтительном варианте воплощения изобретения любой такой мутеин имеет по меньшей мере 40% идентичности или гомологии с последовательностью 8ЕО ΣΌ N0:1, 2 или 3 в приложенном списке последовательностей. Более предпочтительно, чтобы он имел по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% идентичности или гомологии с ним.

Идентичность отражает взаимоотношение между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более полинуклеотидными последовательностями, определяемое путем сравнения последовательностей. В общих чертах, идентичность относится к точному соответствию нуклеотида с нуклеотидом или аминокислоты с аминокислотой в двух полинуклеотидных или полипептидных последовательностях, соответственно, при сравнении по всей длине последовательности.

Для последовательностей, в которых нет точного соответствия, можно определять «% идентичности». В общих чертах, две сравниваемые последовательности выравнивают для получения максимального соответствия между последовательностями. Данный процесс может включать добавление «интервалов» в одну или обе последовательности для усиления степени выравнивания. % идентичности можно определять по всей длине каждой сравниваемой последовательности (так называемое глобальное выравнивание), которое особенно подходит для последовательностей одинаковой или очень сходной длины, или для более коротких, определенных последовательностей (так называемое локальное выравнивание), что более подходит для последовательностей неравной длины.

- 6 006744

Способы сравнения идентичности и гомологии двух или более последовательностей хорошо известны в области техники. Так, например, программы, имеющиеся в ХУйкопБп 5>сс.|испсс ЛиаПкук Раскадс, версия 9.1 (Эсусгсих 1. с! а1., 1984), например, программы ΒΕ8ΤΡΙΤ и СЛР, могут применяться для определения % идентичности между двумя полинуклеотидами и % идентичности и % гомологии между двумя полипептидными последовательностями. ΒΕ8ΤΡΙΤ использует алгоритм «локальной гомологии» 811Ш11 аиб \Уа1сгтап (1981) и обнаруживает наилучший единственный аналогичный участок между двумя последовательностями. Другие программы для определения идентичности и/или сходства между последовательностями также известны в области техники, например, семейство программ ΒΕΆ8Τ (А11кс1ш1

8.Е. с! а1., 1990, Л118с1ш1 8.Е. с! а1., 1997, доступные на домашней странице ΝΤ’ΒΙ по адресу \\л\л\'.псЫ.п1т.ш11.доу) и ΕΆ8ΤΆ (Рсагкои \У.Р.. 1990; Рсагкои 1988).

Предпочтительными изменениями для мутеинов в соответствии с настоящим изобретением являются таковые, известные как «консервативные» замены. Консервативные аминокислотные замены полипептидов или протеинов 1Б-18ВР или вирусных 1Б-18ВР могут включать синонимические аминокислоты в пределах группы, которые обладают в. достаточной степени сходными физико-химическими свойствами, такие замены между членами группы позволяют сохранить биологическую функцию молекулы (СгаиЮат, 1974). Ясно, что вставки и делеции аминокислот также могут быть сделаны в охарактеризованных выше последовательностях без нарушения их функции, особенно, если вставки или делеции вовлекают всего несколько аминокислот, например, менее тридцати, и предпочтительно, менее десяти и не удаляют или не перемещают аминокислоты, являющиеся критическими для функциональной конформации, например, остатки цистеина. Протеины и мутеины, полученные путем таких делеций и/или вставок, относятся к области действия настоящего изобретения.

Предпочтительно, группы синонимических аминокислот определены в табл. 1. Более предпочтительно группы синонимических аминокислот определены в табл. 2; и наиболее предпочтительно группы синонимических аминокислот определены в табл. 3.

Таблица 1. Предпочтительные группы синонимических аминокислот

Аминокислота	Синонимическая группа
Зег	Зег, ТЬг, С1у, Азп
Агд	Агд, С1п, Ьуз, С1и, НЬз
Ьеи	Не, РЬе, Туг, Мер, Уа1, Ьеи
Рго	С1у, А1а, ТЬг, Рго
ТЬг	Рго, Зег, А1а, С1у, Н1з, С1п, ТЬг
А1а	С1у, ТЬг, Рго, А1а
Уа1	МеР, Туг, РЬе, 11е, Ьеи, Уа1
С1у	А1а, ТЬг, Рго, Зег, С1у
Не	Мер, Туг, РЬе, Уа1, Ьеи, 11е
РЬе	Тгр, Мер, Туг, 11е, Уа1, Ьеи, РЬе
Туг	Тгр, Мер, РЬе, 11е, Уа1, Ьеи, Туг
Суз	Зег, ТЬг, Суз
Н1з	С1и, Ьуз, С1п, ТЬг, Агд, Н1з
С1п	61и, Ьуз, Азп, ΗΪ5, ТЬг, Агд, С1п
Азп	С1п, Азр, Зег, Азп
Ьуз	С1и, С1п, ΗΪ3, Агд, Ьуз
Азр	С1и, Азп, Азр
С1и	Азр, Ьуз, Азп, С1п, Ηίε, Агд, С1и
МеЬ	РЬе, 11е, Уа1, Ьеи, Мер
Тгр	Тгр

- 7 006744

Таблица 2. Более предпочтительные группы синонимических аминокислот

Аминокислота	Синонимическая группа
Зег	Зег
Агд	Н1з, Ьуз, Агд
Ьеи	Ьеи, 11е, РЬе, Мер
Рго	А1а, Рго
ТЬг	ТЬг
А1а	Рго, А1а
Уа1	Уа1, Мек, 11е
61у	С1у
Не	11е, Мек, РЬе, Уа1, Ьеи
РЬе	Мек, Туг, 11е, Ьеи, РЬе
Туг	РЬе, Туг
Суз	Суз, Зег
Н19	Н1з, С1п, Агд
С1п	С1и, С1п, Н1з
Азп	Азр, Азп
Ьуз	Ьуз, Агд
Азр	Азр, Азп
С1и	С1и, С1п
Мек	Мек, РЬе, 11е, Уа1, Ьеи
Тгр	Тгр

Таблица 3. Наиболее предпочтительные группы синонимических аминокислот

Аминокислота	Синонимическая группа
Зег	Зег
Агд	Агд
Ьеи	Ьеи, 11е, Мек
Рго	Рго
ТЬг	ТЬг
А1а	А1а
Уа1	Уа1
С1у	61у
11е	11е, Мек, Ьеи
РЬе	РЬе
Туг	Туг
Суз	Суз, Зег
Н13	Н13
С1п	С1п
Азп	Азп
Ьуз	Ьуз
Азр	Азр
С1и	С1и
Мек	Мек, 11е, Ьеи
Тгр	Мек

Примеры получения замен аминокислот в белках, которые могут быть использованы для получения мутеинов полипептидов или белков 1Б-18ВР. или мутеинов вирусных 1Б-18ВР для применения в настоящем изобретении, включают любые известные стадии способа. такие как представленные в патентах США 4959314, 4588585 и 4737462, выданных Магк е! а1.; 5116943, выданном Ко1115 е! а1., 4965195, выданном Матеи е! а1., 4879111, выданном Сйоид е! а1.; и 5017691, выданном Бее е! а1.; и лизин

- 8 006744 замещенных белков, представленных в патенте США № 4904584 (8йате с1 а1.).

Термин «слитый белок» относится к полипептиду, включающему 1Ь-18ВР или вирусный 1Ь-18ВР или их мутеин или их фрагмент, в слиянии с другим белком, который, например, имеет более продолжительное время существования в жидких средах организма. Так, 1Ь-18ВР или вирусный 1Ь-18ВР может быть слит с другим белком, полипептидом или т. п. например иммуноглобулином или его фрагментом.

Термин «функциональные производные», применяемый в данном описании, включает производные 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР и их мутеины и слитые белки, которые могут быть получены из функциональных групп, которые встречаются в виде боковых цепей на остатках или Ν- или С-концевых групп, посредством способов, известных в области техники, и они включаются в данное изобретение до тех пор, пока они остаются фармацевтически приемлемыми, то есть они не нарушают активность белка, которая в значительной степени сходна с активностью 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР, и не придают токсических свойств композициям, содержащим их.

Данные производные могут, например, включать боковые цепи полиэтиленгликоля, которые могут маскировать антигенные участки и продлевать время жизни 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР в жидких средах организма. Другие производные включают алифатические сложные эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп в результате реакции с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, Ν-ацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образуемые с ацилсоставляющими (например, алканоильные или карбоциклические ароильные группы), или О-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, таковых сериновых или треониновых остатков), образуемых с ацил-составляющими.

В качестве «активных фракций» 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР, мутеинов и слитых белков, настоящее изобретение охватывает любые фрагменты или предшественники полипептидной цепи белковой молекулы как таковой, или вместе с ассоциированными молекулами или остатками, связанными с ней, например, остатками сахара или фосфата, или агрегаты белковых молекул или только остатков сахаров, при условии, что указанная фракция имеет активность, в значительной степени сходную с 1Ь-18ВР.

Термин «соли» в данном описании относится как к солям карбоксильных групп, так и к кислотноаддитивным солям аминогруппы молекулы ингибитора ΣΗ-18 или его аналогов. Соли карбоксильной группы могут быть образованы посредством способов, известных в области техники, и включают неорганические соли, например соли натрия, кальция, аммония, железа или цинка, и т.п., и соли с органическим основанием, как таковые, образующиеся, например, с аминами, такими как триэтаноламин, аргинином или лизином, пиперидином, прокаином и т.п. Кислотно-аддитивные соли включают, например, соли с минеральными кислотами, такими как, например, соляная кислота или серная кислота, и соли с органическими кислотами, такими как, например, уксусная кислота или щавелевая кислота. Конечно, любая такая соль должна сохранять биологическую активность ОРН подходящую для настоящего изобретения, то есть оказывать пролиферативное действие на олигодендроциты.

В следующем предпочтительном варианте воплощения изобретения ингибитором ΣΗ-18 является антитело к 1Ь-18. Антитела к ΣΗ-18 могут быть поликлональными или моноклональными, химерными, гуманизированными или даже полностью человеческими. Рекомбинантные антитела и их фрагменты характеризуются высокой аффинностью связывания с ΣΗ-18 ίη νίνο и низкой токсичностью. Антитела, которые могут применяться в данном изобретении, характеризуются их способностью к лечению пациентов в течение периода, достаточного для достижения хорошей регрессии или облегчения патогенного состояния или любого симптома или группы симптомов, относящихся к патогенному состоянию, и низкой токсичностью.

Нейтрализующие антитела легко получают от животных, таких как кролики, козы или мыши, путем иммунизации 1Ь-18. Иммунизированные мыши являются особенно полезными для обеспечения источника В-клеток для получения гибридом, которые в свою очередь культивируют для получения больших количеств анти-1Ь-18 моноклональных антител.

Химерными антителами являются молекулы иммуноглобулина, характеризующиеся двумя или более сегментами или частями, происходящих от различных видов животных. Как правило, вариабельный участок химерного антитела получают из антитела млекопитающего, не человека, такого как мышиное моноклональное антитело, а константный участок иммуноглобулина получают из молекулы человеческого иммуноглобулина. Предпочтительно, чтобы оба участка и их комбинация обладали низкой иммуногенностью при обычном определении (ЕШой с1 а1., 1994). Гуманизированные антитела являются молекулами иммуноглобулинов, созданными путем технологий генной инженерии, при которых мышиные константные участки заменяют человеческими копиями, сохраняя мышиные участки, связывающие антиген. Полученное мышино-человеческое химерное антитело предпочтительно обладает сниженной иммуногенностью и улучшенной фармакокинетикой у людей (Κηφίιΐ с1 а1., 1993).

Таким образом, в дальнейшем предпочтительном варианте воплощения изобретения антителом к ΣΠ-18 является гуманизированное антитело к 1Ь-18. Предпочтительные примеры гуманизированных анти-1Ь-18 антител описаны, например, в Европейской патентной заявке ЕР 0974600.

В еще одном предпочтительном воплощении изобретения антитело к ΣΠ-18 является полностью человеческим. Технология получения человеческих антител описана детально, например, в XVО 00/76310,

- 9 006744 \νϋ 99/53049, И8 6162963 или ЛИ5336100. Полностью человеческими антителами являются предпочтительно рекомбинантные антитела, получаемые от трансгенных животных, например ксеномышей, включающих полностью или частично функциональные локусы человеческого 1д

В высоко предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения ингибитором ΣΠ-18 является 1Б-18ВР, или его изоформа, мутеин, слитый белок, функциональное производное, активная фракция или производное циркулярной перестановки. Данные изоформы, мутеины, слитые белки или функциональные производные сохраняют биологическую активность [Ц- 18ВР, в особенности в связывании ΣΒ-18, и предпочтительно имеют по существу как минимум активность, сходную с Σ^-18ВР. В идеале, такие белки обладают биологической активностью, которая даже выше при сравнении с немодифицированным Ш^ВР.

Предпочтительные активные фракции обладают активностью, лучшей, чем активность ΣΒ-18ВР, или имеют дальнейшие преимущества, такие как лучшая стабильность или более низкая токсичность или иммуногенность, или их легче получать в больших количествах, или легче очищать.

Последовательности Ш^ВР и его вариантов/изоформ сплайсинга могут быть получены из ν099/09063 или из ΝονχΚ е! а1., 1999, так же как из К1т е! а1., 2000.

Функциональные производные Ш^ВР могут быть конъюгированы с полимерами с целью улучшения свойств белка, таких как стабильность, время полужизни, биодоступность, переносимость организмом человека или иммуногенность. Для достижения этой цели функциональные производные могут включать по меньшей мере одну составляющую, прикрепленную к одной или более функциональным группам, которые встречаются как одна или более боковых цепей на остатках аминокислот. Такой составляющей может быть, например, полиэтиленгликоль (РЕС). РЕС-илирование может осуществляться известными способами, например, описанными в ν0 92/13095.

Следовательно, в предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения ингибиторы ΣΕ18, и особенно Ш-ВЕР. являются РЕС-илированными.

В следующем предпочтительном варианте воплощения изобретения ингибитором ΣΒ-18 является слитый белок, включающий целый ΣΕ-18-связывающий белок или его часть, который соединен с целым иммуноглобулином или его частью. Специалисты в области техники понимают, что получаемый слитый белок сохраняет биологическую активность ΣΒ-18ВР, в особенности в отношении связывания с ΣΕ-18. Слияние может быть непосредственным или через короткий линкерный пептид, который может составлять от 1 до 3 аминокислотных остатков в длину или больше, например, 13 аминокислотных остатков в длину. Указанный линкер может быть, например, трипептидом с последовательностью Е-Е-М (С1и-РйеМе!) или линкером с последовательностью из 13 аминокислот, включающей С1и-Рйе-С1у-Л1а-С1у-ЕеиУа1-Ееи-С1у-С1у-С1и-Рйе-Ме!, вставленным между последовательностью Σ^-18ВР и последовательностью иммуноглобулина. Полученный слитый белок обладает улучшенными свойствами, такими как увеличенное время существования в жидких средах организма (время полужизни), увеличенная специфическая активность, увеличенный уровень экспрессии или облегченная очистка слитого белка.

В предпочтительном варианте воплощения изобретения Ш^ВР соединен с константным участком молекулы Σ§. Предпочтительно, он соединен с участками тяжелых цепей, например, такими как домены СН2 и СН3 человеческого ТдС1. Образование специфических слитых белков, включающих ΣΒ-18ВР и часть иммуноглобулина, описано, например, в примере 11 ν0 99/09063. Другие изоформы молекулы Σ§ также являются подходящими для образования слитых белков по настоящему изобретению, такие как ЦС? или ΣβΟ/ΐ или другие классы Σ§, например, такие как Σ§Μ или Σ§Ά. Слитые белки могут быть мономерными или мультимерными, гетеро- или гомомультимерными.

Интерфероны особенно известны своим ингибирующим действием на репликацию вирусов и клеточную пролиферацию. Интерферон-γ, например, играет важную роль в стимуляции иммунного и воспалительного ответов. Считается, что интерферон β (ΣΕΝ-β, интерферон типа Σ) играет противовоспалительную роль.

Следовательно, данное изобретение относится к применению комбинации ингибитора ΣΒ-18 и интерферона в получении лекарственного препарата для лечения повреждения ЦНС.

Интерфероны также могут быть конъюгированы с полимерами с целью улучшения стабильности белков. Конъюгат между интерфероном β и высокомолекулярным спиртом полизтиленгликолем (РЕС), например, описан в ν0 99/55377.

В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения интерфероном является интерферон-β (ΣΕΝ-β), и более предпочтительно ΣΕΝ-β 1а.

Ингибитор продукции и/или действия ΣΒ-18 предпочтительно применяется одновременно, последовательно или раздельно с интерфероном.

Фактор некроза опухоли, как описано в литературе, обладает как защитным, так и токсическим действием при повреждении головного мозга (81ιο1ιηιηί е! а1., 1999). В примере 1, ниже, инъекция ΤΝΕ мышам после тяжелой травмы головного мозга, приводила к существенному снижению уровней ΣΒ-18 в головном мозге, что показывает, что ΤΝΕ может обладать полезным эффектом на восстановление после травматического повреждения головного мозга. Следовательно, предпочтительный вариант воплощения

- 10 006744 настоящего изобретения относится к применению ингибитора 1Ь-18 в комбинации с ΤΝΕ для получения лекарственного препарата для лечения и/или предотвращения повреждения головного мозга, для одновременного, последовательного или раздельного применения.

Комбинация ингибиторов 1Ь-18 с ΤΝΕ альфа является предпочтительной в соответствии с настоящим изобретением.

В следующем предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения лекарственный препарат кроме того содержит противовоспалительный агент, такой как НСПВС (нестероидные противовоспалительные средства). В предпочтительном варианте воплощения изобретения в комбинации с ингибитором 1Ь-18 применяется СОХ-ингибитор, и более предпочтительно СОХ-2-ингибитор. СОХингибиторы известны в области техники. Специфические ингибиторы СОХ-2, например, описаны в УО 01/00229. Активные компоненты могут применяться одновременно, последовательно или раздельно.

Была описана роль окислительного стресса, в особенности реактивных форм кислорода (ЕО8), в патофизиологии повреждения головного мозга (ЫюНапп с1 а1., 1997).

Следовательно, в предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения лекарственный препарат кроме того включает антиоксидант, для одновременного, последовательного или раздельного применения. Множество антиоксидантов известны в области техники, такие как витамины А, С или Е, или 5-аминосалициловая кислота, или супероксиддисмутаза.

В следующем предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения ингибитор 1Ь-18 применяется в количестве около 0,001-100 мг/кг веса тела, или около 0,01-10 мг/кг веса тела или около 0,1-3 мг/кг веса тела или около 1-2 мг/кг веса тела.

В еще одном варианте воплощения изобретения ингибитор 1Ь-18 применяется в количестве около 0,1-1000 мкг/кг веса тела или 1-100 мкг/кг веса тела или около 10-50 мкг/кг веса тела.

Данное изобретение кроме того относится к применению молекулы нуклеиновой кислоты, включающей кодирующую последовательность ингибитора 1Ь-18, мутеина, функционального производного или их активной фракции, в получении лекарственного препарата для предотвращения и/или лечения повреждения ЦНС.

Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты кроме того включает последовательность вектора экспрессии, например, для применения генной терапии для введения ингибитора 1Ь-18 по изобретению.

Предпочтительно молекулу нуклеиновой кислоты вводят внутримышечно.

С целью лечения и/или предотвращения повреждения ЦНС, вектор генной терапии, включающий последовательность ингибитора продукции и/или действия 1Ь-18, можно вводить прямо в пораженную ткань, например, вследствие этого избегая проблем, связанных с системным введением векторов генной терапии, таких как разведение векторов, достижение и воздействие на клетки-мишени или тканимишени, и побочных эффектов.

Применение вектора для стимуляции и/или усиления эндогенной продукции ингибитора 1Ь-18 в клетках, в норме не секретирующих ингибитор 1Ь-18, или которые экспрессируют недостаточные количества ингибитора, также рассматривается в соответствии с данным изобретением для лечения и/или предотвращения повреждения ЦНС. Вектор может включать регуляторные элементы, функционирующие в клетках, в которых желательна экспрессия ингибитора 1Ь-18. Такими регуляторными последовательностями или элементами могут быть, например, промоторы или энхансеры. Регуляторная последовательность затем может быть встроена в правильный локус генома путем гомологичной рекомбинации, соответственно, оперативно связывая регуляторную последовательность с геном, экспрессию которого требуется индуцировать или усилить. Данная технология обычно относится к эндогенной активации гена (ЕСА), и она описана, например, в УО 91/09955.

Специалисты в области техники понимают, что также возможно непосредственно остановить экспрессию 1Ь-18, без использования ингибитора 1Ь-18, с помощью такой же технологии. Чтобы это осуществить, отрицательный регуляторный элемент, как, например, вызывающий молчание элемент, можно встроить в локус гена 1Ь-18, что приводит к снижению или предотвращению экспрессии 1Ь-18. Специалисты в области техники понимают, что такое понижение регуляции или прекращение экспрессии 1Ь-18 обладает таким же эффектом, что и применение ингибитора 1Ь-18 с целью предотвращения и/или лечения заболевания.

Данное изобретение, более того, относится к применению клетки, которая была генетически модифицирована с целью продукции ингибитора 1Ь-18, в получении лекарственного препарата для лечения и/или предотвращения повреждения ЦНС.

Кроме того, данное изобретение относится к фармацевтической композиции, особенно полезной для предотвращения и/или лечения воспалительного повреждения ЦНС, которая включает терапевтически эффективное количество ингибитора 1Ь-18 и/или терапевтически эффективное количество интерферона и/или фармацевтически эффективное количество ΤΝΕ и/или фармацевтически эффективное количество противовоспалительного агента и/или фармацевтически эффективное количество антиоксидантного агента.

В качестве ингибитора 1Ь-18 данная композиция может включать ингибиторы каспазы-1, антитела к 1Ь-18, антитела к любой субъединице рецептора 1Ь-18, ингибиторы пути передачи сигнала с участием 1Ь- 11 006744

18, антагонисты ΙΠ-18, которые конкурируют с ΙΠ-18 и блокируют рецептор ΙΠ-18, и 1Ь-18-связывающне белки, их изоформы, мутеины, слитые белки, функциональные производные, активные фракции или производные циркулярной перестановки, обладающие такой же активностью.

1Ь-18ВР и его изоформы, мутеины, слитые белки, функциональные производные, активные фракции или производные циркулярной перестановки, как описано выше, являются предпочтительными ингредиентами фармацевтических композиций.

Интерфероном, включенным в фармацевтическую композицию, является предпочтительно ΙΡΝбета или ΙΡΝ-альфа.

В еще одном предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество ΤΝΡ альфа.

Фармацевтическая композиция по данному изобретению может, кроме того, содержать один или более СОХ-ингибиторов.

Определение «фармацевтически приемлемый» обозначает любой носитель, который не влияет на эффективность биологической активности активного ингредиента и не является токсичным для организма-хозяина, которому вводится. Например, для парентерального введения активный белок(ки) могут быть составлены в форме единицы дозирования для инъекций в растворителях, таких как физиологический раствор, раствор декстрозы, сывороточный альбумин или раствор Рингера.

Активные ингредиенты фармацевтической композиции по данному изобретению можно вводить индивиду различными путями. Пути введения включают интрадермальный, трансдермальный (например, в препаративных формах медленного высвобождения), внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, пероральный, интракраниальный, эпидуральный, ректальный, местный и интраназальный пути. Могут быть использованы любые другие терапевтически эффективные пути введения, например всасывание через эпителиальные или эндотелиальные ткани или путь генной терапии, где молекулу ДНК, кодирующую активный агент, вводят пациенту (например, посредством вектора), что вызывает экспрессию активного агента и его секрецию ίη νίνο. Кроме того, белок(ки) по настоящему изобретению можно вводить вместе с другими компонентами биологически активных агентов, такими как фармацевтически приемлемые поверхностно-активные вещества, наполнители, носители, разбавители и растворители.

Для парентерального (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного) введения активный белок(ки) могут быть представлены в виде раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизированного порошка вместе с фармацевтически приемлемым растворителем для парентерального введения (например, водой, физиологическим раствором, раствором декстрозы) и вспомогательными веществами, которые поддерживают изотоничность (например, маннит) или химическую стабильность (например, консерванты и буферные растворы). Препаративную форму стерилизуют путем обычных применяемых технологий.

Биодоступность активного белка(ов) по данному изобретению также может быть улучшена путем применения процессов конъюгации, которые увеличивают время полужизни молекулы в человеческом теле, например связыванием молекулы с полиэтиленгликолем, как описано в патентной заявке РСТ \УО 92/13095.

Терапевтически эффективные количества активного белка(ов) являются производным от множества параметров, включая тип антагониста, аффинность антагониста ΙΠ-18, любую остаточную цитотоксическую активность, проявляемую антагонистами, путь введения, клиническое состояние пациента (включая желательность достижения нетоксического уровня активности эндогенного 1Б-18).

«Терапевтически эффективное количество» является таковым, при введении которого ингибитор ΙΠ-18 приводит к ингибированию биологической активности 1Б-18. Дозировка, которую вводят, в одной дозе или в нескольких дозах индивиду, варьирует в зависимости от множества факторов, включая фармакокинетические свойства ингибитора 1Б-18, путь введения, состояние пациента и его характеристики (пол, возраст, вес тела, состояние здоровья, рост), выраженность симптомов, сопутствующее лечение, частота лечения и желаемые эффекты. Квалифицированные специалисты способны осуществлять коррекцию и манипуляцию в установленном диапазоне доз, а также методы как ίη νίΐτο, так и ίη νίνο для определения ингибирования 1Б-18 у индивида.

По данному изобретению ингибитор ΙΠ-18 применяют в количестве около 0,0001-100 мг/кг или около 0,01-10 мг/кг веса тела, или около 0,1-5 мг/кг веса тела или около 1-3 мг/кг веса тела или около 1-2 мг/кг веса тела. В качестве альтернативы, ингибиторы ΙΠ-18 можно вводить в количестве около 0,1-1000 мкг/кг веса тела или около 1-100 мкг/кг веса тела или около 10-50 мкг/кг веса тела.

Путем введения, предпочтительным по данному изобретению, является введение подкожно. Внутримышечное введение также предпочтительно по данному изобретению. С целью введения ингибитора ΙΠ-18 непосредственно в место его действия, также предпочтительно его вводить интракраниальным или подоболочечным путем. Интракраниальный путь является особенно предпочтительным при открытом повреждении головы (реактивное повреждение головного мозга).

В следующих предпочтительных вариантах воплощения ингибитор ΙΠ-18 вводят ежедневно или через день.

- 12 006744

Суточные дозы обычно применяют в виде отдельных доз или в формах с замедленным высвобождением, эффективных для достижения желаемых результатов. Второе или последующие введения могут производиться в таких же дозах, меньших или больших по сравнению с исходной или предыдущей дозой, вводимой данному индивиду. Второе или последующие введения можно вводить во время или до развития заболевания.

По настоящему изобретению ингибитор Ш-18 можно вводить профилактически или терапевтически индивиду до, одновременно или последовательно с другими терапевтическими мероприятиями или агентами (например, прием множества лекарственных препаратов), в терапевтически эффективном количестве, в особенности с интерфероном и/или ΤΝΓ и/или другим противовоспалительным агентом, таким как СОХ-ингибитор и/или антиоксидант. В зависимости от повреждения головного мозга можно представить совместное введение антагониста ΤΝΕ вместо самого ΤΝΕ (§йойаш1 е! а1., 1999). Активные агенты, которые вводят одновременно с другими терапевтическими агентами, можно вводить в тех же самых или в других композициях.

Данное изобретение, кроме того, относится к способу получения фармацевтической композиции, включающей смесь эффективного количества ингибитора Ш-18 и/или интерферона и/или антагониста ΤΝΕ и/или СОХ-ингибитора с фармацевтически приемлемым носителем.

Данное изобретение кроме того относится к способу лечения повреждения ЦНС, включающему введение фармацевтически эффективного количества ингибитора Ш-18 пациенту, нуждающемуся в этом.

Все ссылки, цитируемые в данном описании, включая журнальные статьи или абстракты, опубликованные или неопубликованные патенты США или зарубежные патентные заявки, выданные патенты США или зарубежные патенты или любые другие ссылки полностью включены в данное описание в виде ссылки, включая все данные, таблицы, чертежи и текст, представленный в цитируемых ссылках. Кроме того, полное содержание ссылочных документов, цитируемых в ссылочных документах, приводимых в данном описании, также полностью включены в качестве ссылок.

Ссылки на известные стадии способов, стадии традиционных способов, известные способы или традиционные способы в любом случае не являются допущением того, что любой аспект, описание или вариант воплощения настоящего изобретения описан, раскрыт или предположен в соответствующей области техники.

Вышеприведенное описание специфических вариантов воплощения изобретения так полно раскрывает общую сущность данного изобретения, что другие, применяя специальные знания в области техники (включая содержание ссылочных документов, цитируемых в данном описании), легко могут модифицировать и/или адаптировать для различного применения такие специфические варианты воплощения изобретения, без чрезмерного экспериментирования, без отклонения от общей идеи настоящего изобретения. Следовательно, такие адаптации и модификации имеют целью находиться в диапазоне эквивалентов описанных вариантов воплощения изобретения, основанных на учении и руководстве, представленном в данном описании. Понятно, что фразеология или терминология в данном описании применяется с целью описания, а не для ограничения, так что терминология и фразеология настоящего описания должна быть интерпретирована специалистом в области техники в свете учения и руководства, представленных в данном описании, в комбинации со знаниями обычного специалиста в области техники.

После описания изобретения, для более полного его понимания представлены ссылки на следующие примеры, которые представлены для иллюстрации и не имеют целью ограничить настоящее изобретение.

Примеры Материалы и методы Модель травмы

Мышами, применяемыми в данном исследовании, были самцы в возрасте 8-16 недель, весившие 3035 г. Их выращивали в специфической свободной от патогенов среде, держали при стандартных условиях температуры и света в клетках по 4-6 животных и снабжали едой и водой в свободном режиме. Исследование проводили в соответствии с руководством ΙηΜίΐΓΐΙίοηηΙ Ашша1 Саге СоттШее, НсЬгс\у Ишуег8Йу, 1еги5а1ет. 1§гае1. Экспериментальное закрытое повреждение головы производили с использованием устройства с падающим грузом, разработанным ранее (Сйеш е! а1. 1996). Коротко, после проведения эфирной анестезии проводили срединный продольный разрез, кожу раздвигали и обнажали череп. Определяли левую переднюю лобную область и туда помещали тефлоновый конус с наконечником на ~1мм вбок от срединной линии, в средне-венечной плоскости. Голову фиксировали, и груз весом 75 г опускали на конус с высоты 18 см, что приводило к локальному повреждению левого полушария. После травмы, мыши получали поддерживающую оксигенацию 100% О₂ не дольше 2 мин, и затем их помещали обратно в клетки.

Оценка уровней Ш-18 в головном мозге мышей

Для определения интракраниальных уровней ΙΠ-18, мыши линии С57ВЬ/6 (В6) (всего η=62) были распределены на шесть отдельных групп: (1) «группа нормального контроля», нелеченые мыши линии В6 (η=10). (2) «группа эфирной анестезии», мышам производили анестезию эфиром в течение 10 мин и обезглавливали спустя 24 ч (η=10) или 7 дней (η=10). (3) «группа ложной операции»; данные мыши под

- 13 006744 вергались анестезии и продольному разрезу скальпа и были умерщвлены через 24 ч (п=15) или 7 дней.

(4) «группа травмы»; выполняли экспериментальную закрытую травму головы, как описано выше, и животных обезглавливали под эфирной анестезией через 4 ч (п=7), 24 ч (п=7) и 7 дней (п=7) после травмы.

(5) «группа инъекции ΤΝΡ»; для оценки возможной роли ΤΝΡ в регуляции интрацеребрального 1Ь-18, мыши подвергались эфирной анестезии, интрацеребровентрикулярно (ί.ε.ν.) вводили 200 нг мышиного рекомбинантного ΤΝΡ (В&С 8у§!ет5, АЬшдбоп, ИК) в 10 мкл стерильного фосфатно-буферного соляного раствора (РВ8), и мышей умерщвляли через 24 ч (п=10). (6) «группа ложной инъекции»; данным животным вводили ί.ε.ν. только растворитель (10 мкл стерильного РВ8) и их умерщвляли через 24 ч (п=6), как контрольную группу для животных, которым вводили ΤΝΡ. У всех мышей после обезглавливания немедленно удаляли головной мозг, который мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С до проведения анализа. Головной мозг из группы травмы был разделен на левое (ипсилатеральное) и правое (контралатеральное) полушарие с целью проведения сравнения уровней 1Ь-18 в поврежденном и неповрежденном полушарии. Гомогенизацию тканей проводили с помощью Ро1у1гоп (Ктетайса, Кпещ. §^11хег1апб). используя разведение 1:4 в ледяном экстракционном буфере (мас./мас.), содержащем 50 мМ Трис (рН 7,2), 150 мМ №1СТ 1% ΤγιΙοπ-Χ-100 (Воейппдег Маппйет, КоЙаенх, 8\\йхег1апб) и смесь ингибиторов протеаз (Воейппдег Маппйе1т). Гомогенат встряхивали на льду в течение 90 мин и затем центрифугировали в течение 15 мин при 3000 х д и 4°С. Затем надосадочную жидкость делили на равные части и хранили при -70°С до проведения анализа. Концентрацию общего белка в экстрактах головного мозга измеряли методом ВгабТогб (Вю Ваб ЬаЬога!ог1е8, Мишсй, Сегтапу) и обнаружили, что она была постоянной у всех оцениваемых мышей (12,1+2,1 мг/мл; среднее±8Э). Определение количественных уровней интрацеребральных цитокинов проводили методом ЕЬ18А, специфичным для мышиного 1Ь-18, в соответствии с инструкциями производителя (В&С 8у§!ет5, АЬшдбоп, ИК). Чувствительность анализа составила 5 пг/мл. Для сравнения уровней интрацеребрального 1Ь-18 между различными группами животных, все концентрации ниже уровня определения в 5 пг/мл были оценены как 4,9 пг/мл. Затем неразведенные образцы были помещены в парные ячейки, и была рассчитана их окончательная концентрация по средней оптической плотности (ΘΌ). ΘΌ определяли с помощью спектрофотометра (Эупа1есй ЬаЬога1ог1еь 1пс., Сйап!111у, УА) при гашении длины волны 405 нм.

Протокол лечения 1Й-18ВР

Самцов крыс 8аЬга линии НеЬгете Иптуегайу (п=40) применяли для исследования Ш-18ВР. Анестезию и экспериментальную СН1 проводили, как описано выше. Для протокола лечения животных разделили на две группы: в группе А («контрольная группа», п=16) мышей подвергли экспериментальной СН1, через 1 ч сделали инъекцию только растворителя (РВ8) и через 7 дней провели неврологическое обследование (см. ниже). В группе В («группа исследования», п=18), мышам вводили внутрибрюшинно 50 мкг 1Ь-18ВР сразу же после освидетельствования по неврологической шкале при времени 1=1 ч после СН1. Так как проницаемость гематоэнцефалического барьера повышается в 5-6 раз между 1 и 4 ч после СН1, как ранее было определено в такой же экспериментальной модели (Сйеп е! а1., 1996), при этих условиях 1Ь-18ВР имел доступ в головной мозг. Две дополнительные группы мышей лечили так же, как группы А и В (группа С: «контрольная группа»; группа Ό: «группа исследования», соответственно), и их обезглавливали спустя 48 часов, после этого проводили вскрытие головного мозга для оценки посттравматического отека, как описано ниже.

Оценка неврологических нарушений

Для оценки посттравматических неврологических нарушений была разработана и утверждена шкала №иго1одюа1 8еνе^^ίу 8соге (N88) (8!айе1 е! а1., 2000).

Шкала состоит из 10 индивидуальных клинических заданий на моторную функцию, быстроту реакции и физиологическое поведение, где один балл присваивается за невыполнение задания и ноль баллов за успешное выполнение (табл. 4). Максимум N88 в 10 баллов свидетельствует о тяжелой неврологической дисфункции, с невыполнением всех заданий, тогда как ноль баллов достигается здоровыми мышами без повреждений. N88 через 1 ч после травмы отражает исходную тяжесть повреждения и высоко коррелирует с клиническим исходом (Веш-Абаш е! а1., 2001). Оценку прохождения заданий проводили двое исследователей, которые не знали группы исследования, через 1, 24, 72 ч и 7 дней после экспериментальной СН1. ΔΝ88, рассчитываемая как разница между N88 при !=1 ч и N88 в любой более поздней временной точке, является параметром, который отражает степень спонтанного восстановления после повреждения головного мозга, как описано ранее (Сйеп е! а1., 1996).

- 14 006744

Таблица 4. Шкала №иго1ощса1 8еуегйу 8соге (N88) для мышей с повреждением головы

Задание	Описание	Баллы эа выполнение/ невыполнение
Выход из круга	Способность и инициатива выйти из круга диаметром 30 см в течение 3 минут	0/1
Моно-/Гемипарез	Парез верхней и/или нижней конечности на контралатеральной стороне	0/1
Ходьба по прямой	Быстрота реакции, инициатива и моторная способность ходить по прямой	0/1
Рефлекс испуга	Врожденный рефлекс; мышь отскакивает в ответ на громкий хлопок в ладоши	0/1
Ищущее поведение	Физиологическое поведение как знак «интереса» в окружающей среде	0/1
Балансирование на	Способность балансировать на	0/1
перекладине	перекладине шириной 7 мм в течение как минимум 10 секунд
Балансирование на	Способность балансировать на	0/1
круглой палочке	круглой палочке диаметром 5 мм в течение как минимум 10 секунд
Ходьба по балке:	Способность пройти 30 см в	0/1
3 см	длину по балке, шириной 3 см
Ходьба по балке:	То же задание, повышенной	0/1
2 см	сложности, на балке, шириной 2 см
Ходьба по балке:	То же, повышенной сложности,	0/1
1 см	на балке шириной 1 см
Максимальный балл		10

Оценка отека мозга

Выраженность отека мозга оценивали путем определения содержания воды в тканях поврежденного полушария, как описано ранее (Сйеп е1 а1., 1996). Коротко, мышей подвергали анестезии, как описано выше через 48 ч после травмы, что соответствовало временной точке, в которой отек все еще остается существенным в данной модельной системе (Сйеп е! а1., 1996). После обезглавливания удаляли мозжечок и ствол мозга и получали сегмент коры головного мозга весом ~20 мг из области, граничащей с местом повреждения, и из контралатерального полушария. Правое (неповрежденное) полушарие использовали в качестве внутреннего контроля. Срезы ткани взвешивали и высушивали в течение 24 ч при 95°С. После взвешивания «сухих» срезов рассчитывали процентное содержание воды в головном мозге, как %Н₂О = [(влажная масса-сухая масса) х100]/влажная масса

Пациенты с повреждением головного мозга

В данное исследование были включены 10 пациентов с изолированной тяжелой СН1 (средний возраст ± 8Ό: 37 ± 10 лет; диапазон 24-57 лет; 9 мужчин и 1 женщина), доставленные в травматологическое отделение Ишуегайу Но§рйа1 2ипсй. Все пациенты имели оценку по шкале комы Глазго (ОС8) < 8 после сердечно-легочной реанимации (Теа§ба1е апб .Теплей, 1974). После КТ-исследования, всем пациентам были установлены интравентрикулярные катетеры для терапевтического дренирования цереброспинальной жидкости (С8Р) при повышении внутричерепного давления (1СР) выше 15 мм рт.ст. Ни один из пациентов не получал лечение стероидами. Пациентов с множественными повреждениями, требующих вмешательств по поводу сопутствующих повреждений грудной клетки, брюшной полости, полости таза, спинного мозга или переломов длинных костей, исключали из исследования. Индивидуальный исход оценивали, используя шкалу С1а5§о\у ОШсоше 8са1е (ОО8) (.Теплей апб Вопб, 1975). Протокол исследования образцов СМЖ и сыворотки был утвержден Е1й1с§ Воагб СоттйТее, Ишуегайу Но§рйа1, 2ипсй.

Сбор образцов и анализ 1Б-18

Образцы СМЖ и соответствующие образцы сыворотки у пациентов с СН1 (п=10) получали ежедневно в одно фиксированное время. Контрольную СМЖ получали от пациентов, подвергавшихся диагностической спинномозговой пункции (п=5). Данные пациенты не имели признаков воспалительных заболеваний ЦНС, на основании нормальных уровней в СМЖ белка, глюкозы и количества клеток (данные не представлены). В группе СН1 забор образцов производили в течение 10 дней после травмы, кроме тех

- 15 006744 случаев, когда вентрикулярный катетер удаляли ранее, например, в случаях, когда 1СР оставалось в нормальных пределах (<15 мм рт.ст.) в течение более 24 ч. Всего 10б соответствующих образцов СМЖ и сыворотки было получено у пациентов с травмами, участвующих в данном исследовании. Все образцы центрифугировали сразу же после получения, делили на равные части и замораживали при -70°С до проведения анализа. Количественное определение уровней ΣΠ-18 в СМЖ и сыворотке проводили методом ЕЫ8А, специфическим для человеческого ΣΠ-18, применяя коммерчески доступные наборы (Κ&Ό 8ук!ешк, ЛЬшдбоп, ИК) . Как и для анализа у мышей, чувствительность ЕЬ18Л составила 5 пг/мл, и окончательную концентрацию ΣΠ-18 рассчитывали на основании средней оптической плотности, определяемой в парных образцах при гашении длины волны 405 нм. Для сравнения уровней ΣΠ-18 в СМЖ между пациентами с СН1 и группой контроля, все концентрации ниже предела определения 5 пг/мл были оценены как 4,9 пг/мл.

Анализ данных

Статистический анализ данных проводили с помощью коммерчески доступного программного обеспечения (8Р88 9,0 для \Уй1бо\\'к^|Л|). Непараметрический критерий Мапп-^Ийлеу-И применяли для анализа данных, не имеющих нормального распределения, таких как оценка по неврологическим шкалам (N88 и ΔΝ88) . Непарный !-критерий Стьюдента применяли для сравнения интрацеребральных концентраций 4й-18 в различных группах мышей и для анализа разницы в содержании воды в головном мозге у мышей, леченных 1Й-18ВР по сравнению с мышами, которым вводили растворитель. Сравнение уровней ΣΕ-18 у людей, как в ежедневной СМЖ по сравнению с соответствующими образцами сыворотки у пациентов с СН1, так и СМЖ при травме по сравнению с группой контроля, проводили, применяя общую линейную модель для повторных измерений ΑΝΟνΑ. Статистически значимым был принят р-критерий < 0,05.

Результаты

Пример 1. Интрацеребральные уровни ΣΠ-18 у мышей

Как показано на фиг. 1, ΣΠ-18 определялся методом ЕЫ8А в гомогенатах головного мозга у нелеченных («нормальных») контрольных мышей линии Вб (п=10), со средним уровнем 27,7 ±1,7 [±8ЕМ] нг/мл. В экспериментальных группах стимуляция только эфирной анестезией или в сочетании с «ложной» операцией (например, эфирная анестезия и продольный разрез скальпа) приводили к существенному повышению уровня интракраниального 1Й-18 до 48,9 ± 1,1 нг/мл («эфирная» группа, п=8) и 54,3 ± 2,7 нг/мл («ложная» группа, п=13), соответственно (р<0,01 по сравнению с «нормальными» мышами, непарный !-критерий Стьюдента; фиг. 1). Разница между животными с воздействием «эфира» и «ложно»оперированными не была статистически достоверной (р=0,1б).

В группе травмы (п=21) индукция СН1 приводила к повышению уровня [И-18 как в поврежденном, так и в контралатеральном полушарии внутри 4 ч (б0,б ± 3,3 и 59,8 ± 5,0 нг/мл, соответственно) - 24 ч (5б,9 ± 2,1 и 5б,3 ± 3,7 нг/мл, соответственно) после травмы, однако уровни не были достоверно выше по сравнению с группами «эфира» и «ложной» (р>0,05).

В отличие от этого через 7 дней после СН1 определили существенное повышение концентрации интрацеребрального ΣΠ-18 в поврежденном полушарии по сравнению с животными, подвергшимися эфирной анестезии или ложной операции (б7,б ± 5,1 нг/мл против 42,2 ± 0,8 и 45,2 ± 0,5 нг/мл соответственно; р<0,01), в то время как уровни ΣΠ-18 в контралатеральном полушарии не были существенно повышены по сравнению с данными двумя контрольными группами (б3,2 ±б,0 нг/мл; р=0,0б).

С целью оценки роли ΤΝΡ, ключевого медиатора воспаления в данной модели травмы (8йойат1 е! а1., 1999), в отношении регуляции интрацеребральных уровней ΣΠ-18 дополнительной группе мышей линии Вб (п=10) было введено 1.с.р. 200 нг мышиного рекомбинантного ΤΝΡ в 10 мкл стерильного РВ8, и их умертвили через 24 ч. Как показано на фиг. 1, «ложная» инъекция только растворителя (п=б) приводила к достоверному повышению интрацеребрального ΣΠ-18 в течение 24 ч, по сравнению с нелеченными нормальными мышами линии Вб (53,б ±3,9 против 27,7 ± 1,7 нг/мл; р<0,001).

Введение ΤΝΡ индуцировало существенное уменьшение уровней ΣΠ-18 в интракраниальном отделе в течение 24 ч (22,1 ± б,9 нг/мл; п=10) по сравнению с контрольной группой с «ложной» инъекцией через 24 ч (53,б ± 3,9 нг/мл; р< 0,001). Уровни ΣΠ-18 в «группе ΤΝΡ» были даже ниже, чем у нелеченных нормальных мышей (27,7 ± 1,7 нг/мл), хотя в данном случае разница не была статистически достоверной (р=0,45).

Пример 2. Эффект от лечения [Й-18ВР на неврологическое восстановление после травмы

С целью изучить гипотезу, что ингибирование ΣΠ-18 может облегчать восстановление при повреждении головного мозга, сравнивали восстановление в различные временные точки после одной инъекции ГО-^ВР. Ранее было показано, что оценка по шкале №иго1ощса1 8еуегйу 8соге (N88) через 1 ч после травмы наиболее точно отражает выраженность травмы и коррелирует с объемом поврежденных тканей, что видно при МРТ и при гистологическом исследовании.

С целью получения групп животных со сравнимой травмой, мыши были распределены на различные группы лечения после исходной оценки по шкале N88 при !=1 ч. Как показано на фиг. 2 (N88 в группе 4Е-18ВР (квадраты) против Контроля (круги), обе группы имели похожий исходный уровень N88 (1) (7,б9 ± 0,3023 и 7,44 ± 0,3б27 контроль и ГО^ЕР соответственно), свидетельствуя о сравнимой тяжести

- 1б 006744 повреждения.

Оценка по N88 в более позднее время (1-7 дней) выявила, что животные, леченные 1Б-18ВР внутрибрюшинно (ί.ρ.) имеют относительно меньшее неврологическое повреждение, что следует из оценки по шкале N88, что достигло достоверности на 7 день после травмы (р=0,045).

Рассчитывали уровень восстановления, выраженный как ΔΝ88(!) = N88(1 ч) - Ν88(!). Больший уровень ΔΝ88 отражает лучшее восстановление, а нулевой или отрицательный ΔΝ88 отражает отсутствие восстановления или ухудшение. Фиг. 3 отражает значения ΔΝ88 в двух группах. В двух временных точках, обе через 24 ч и 7 дней, разница между средними значениями ΔΝ88 достигла достоверности.

Проводили другой эксперимент для изучения, может ли быть эффективным лечение 1Б-18ВР, проводимое на 3-й день после повреждения. Проблема времени лечения является критической, и пока было показано, что терапия будет эффективной при ее начале в течение нескольких часов. После того как было обнаружено, что 1Б-18 сам по себе возрастает на 7-й день после травмы, и лечение 1Б-18ВР, даваемое через 1 ч после травмы, дает наибольший эффект также на 7 день, было решено попробовать лечить мышей на 3 день после повреждения. Для сравнения, другую группу лечили 1Б-18ВР через 1 ч и на 3 день после повреждения. Контрольную группу обрабатывали только растворителем (носителем).

Результаты данного эксперимента представлены на фиг. 4, из которой становится ясным, что однократное лечение, проводимое на 3 день, является таким же эффективным, как и проводимое через 1 ч после СН1 и снова на 3 день.

Данный эксперимент продемонстрировал поразительный полезный эффект однократного введения 1Б-18ВР, проводимого через 1 ч или 3 дня после закрытого повреждения головы, на восстановление после травматического повреждения головы в экспериментальной модели на мышах.

Пример 3. Повышенные уровни 1Б-18 в СМЖ людей после повреждения головного мозга

Уровни 1Б-18 определяли в ежедневных образцах СМЖ и сыворотки от 10 пациентов с тяжелой СН1 в течение 10 дней после травмы. Демографические и клинические данные пациентов представлены в табл. 5.

Таблица 5. Демографические и клинические данные пациентов с тяжелой СН1^а

№ пациен- та	Возраст (годы)/ пол	СС8^Ь	С03^с	11,-18 в СМЖ⁶(пг/мл) среднее [диапазон)^е	11-18 в сыворотке (пг/мл) среднее [диапазон]*
1	4 8 /м	3	1	283 [78-966]	57,5 [12-66]
2	31/м	7	4	228,4 [22-745]	19,7 [4,9-108]
3	26/м	5	3	208,5 [20-392]	37,2 [14-163]
4	57/м	5	4	72,6 [30-286]	48,9 [14-104]
5	24/м	4	5	32,6 [4,9-155]	17 [4,9-58]
6	36/м	8	1	49,4 [10-290]	16,7 [12-67]
7	38/ж	3	4	17,9 [11-100]	13 [4,9-46]
8	35/м	3	3	69,8 [4,9-329]	19,8 [7-77]
9	37 /м	3	4	37 [23-75]	57,3 [25-98]
10	41/м	7	5	4,9 [4,9-169]	26,2 [15-38]
Контрольная СМЖ (	п=5)		4,9 [4,9-7,8]

^аСН1, закрытая травма головы ^ЬСС8, (Иаадохг Ои!соте 8соге (шкала комы Глазго) (Теаз4а1е апс1 1еппе!!, 1974).

^сСО8 = Сг1аадо\\· Ои!соте 8соге через 3 месяца после повреждения;

= отсутствие симптомов, 4 = умеренная потеря трудоспособности, = тяжелая потеря трудоспособности, = персистирующее вегетативное состояние, = смерть (1еппе!! ап4 Воп4, 1975). ^аСМЖ = спинномозговая жидкость. ^еуровни 1Б-18 ниже предела определения 5 пг/мл были расценены как уровень 4,9 пг/мл.

Как показано в табл. 5, подоболочечные уровни 1Б-18 были достоверно повышены у 9/10 пациентов по сравнению с контрольной СМЖ от 5 пациентов без травмы или воспалительного неврологического заболевания (р<0,05; повторные измерения ΑΝΟνΑ). Только у одного пациента (№10) уровень 1Б-18 не был достоверно повышенным при сравнении с контрольной СМЖ (р=0,31). Средние уровни и индивидуальные колебания 1Б-18 в СМЖ и сыворотке представлены в табл. 5.

Примечательно, что максимальные концентрации 1Б-18 в СМЖ (966 нг/мл) были более чем в 200 раз выше у пациентов с повреждением головы, чем в контрольной группе.

- 17 006744

Интрацеребральный уровень ΣΠ-18 определялся методом ЕЫ8Л в 90% всех образцов СМЖ в группе с травмой, в то время как только 40% контрольных образцов СМЖ имели определяемые интрацеребральные уровни ΣΠ-18 (то есть >4,9 нг/мл). У 8/10 пациентов с СШ средние концентрации ΣΠ-18 были достоверно выше в СМЖ, чем в сыворотке (р<0,05; повторные измерения ΑΝΟνΑ). Однако, у двух пациентов (№ 9, 10) средние уровни 11-18 в сыворотке были выше соответствующих концентраций в СМЖ, как показано в табл. 5.

Данные результаты показывают, что уровни ΣΠ-18 в спинномозговой жидкости пациентов с травматическим повреждением головы существенно повышены. Добавление ΣΕ-18ΒΡ может снизить эти повышенные уровни и вследствие этого может оказывать полезный эффект на восстановление после закрытого повреждения головы, как показано в примере 2 выше.

Ссылки

1. А1!ксйи1 8. Р. е! а1., I. Мо1. Βίο1., 215, 403-410, 1990, А1!ксйи1 8. Р. е! а1., №.1с1сю Ас1бк Век., 25:3893402, 1997.

2. Сйа!ег, К. Р. е! а1., ίη 81х!й [п(егпа11опа1 8утрокшт оп Асбпотусе!а1ек Βίοίοβν. Акабет1а1 Ка1бо, Βибарек!, Нипдагу (1986), рр. 45-54).

3. Сйеп, Υ., 8. Сопк!ап!1ш, V. ТгетЬоу1ег, М. ^етк!оск, апб Е. 8йойатЕ 1996. Ап ехрептеп!а1 тобе1 о£ с1океб йеаб тщгу ш тке: ра!йорйукк1оду, Н1>1ора1Но1оду, апб содтбуе бейсйк. 1. №иго!гаита 13:55768.

4. Сопй, С.В., Ν.Υ. Сайпдакап, Υ. К1т, Н. К1т, Υ. Βае, Е. С1Ькоп, апб Т.Н. 1ой. 1999. Си1!игек о£ ак1госу1ек апб ткгодйа ехргекк т!ег1еикт-18. Мо1. Βηίιι Век. 67:46-52.

5. Сопй, В., 1. ^. кйпд, С Ттб, 1. Н. 8оп, апб Т. Н. 1ой. 1997. [пбисбоп о£ йИегГегоп-датта тбистд ГасЮг т Фе абгепа1 сойех. 1. ΒΦ1. Сйет. 272:2035-2037.

6. Си1йапе, А.С, Μ.Ό. На11, Ν.Σ. Во!йете11, апб Ο.Ν. ЬийекЫ. 1998. С1ошпд оГ га! Ьгат т!ег1еикт-18 сЭкА. Мо1. Ρкусй^а!^у 3:362-6. а. Оетегеих I е! а1, №с1ек Ас1бк Век, 12, 387-395, 1984.

7. П1Попа!о, I. А., Науака^а, М., Во!йетагГ, Ό. М., 2апб1, Е. апб Капп, М. (1997), №11иге 388, 1651416517.

8. ЕШо!!, М.Е, Ма1ш, В.К, Ре1бтапп, М., Ьопд-Рох, А., Сйаг1ек, Ρ., Βί)1, Н., апб ^ообу, Σ.Ν., 1994, Ьапсе! 344, 1125-1127.

9. РаккЬепбег, К., О. М1е1ке, Т. РеПксВ Р. Мией1йаикег, М. Неппепа, М. Кипто!о, апб 8. Вокко1. 1999. Ση!е^Ге^οη-γ-^ηбис^ηд Гас!ог (ΣΠ-18) апб т!егГегоп-у ш 1пйатта!огу ΟΝ8 бкеакек. №иго1оду 53:1104-

6.

10. 1апбег, 8., апб С. 8!о11. 1998. ОйТегепйа1 тбисбоп оГ т!ег1еикт-12, т!ег1еикт-18, апб т!ег1еикт1β соуегйпд епхуте тВNΑ ш ехрептеп!а1 аи!о1ттипе епсерйа1отуеййк оГ !йе Ье^1к га!. 1. №иго1ттипо1. 91:93-9.

11. Ьапсе!, 1975, Маг 1;1 (7905) :480-4. кппей Β., Βοηб М.

12. ЬаИ, К. (1978) 1рп. I. Βас!е^^ο1. 33:729-742).

13. К1т 8Н, Е1кепк!ет М., Вехшкох Ь., Рап1ихх1 С., №укк Ό., ВиЬтк!ет М., ОтагеНо СА. 8!гис!ига1 гес.|тгетеп1к оГ к1х па!ига11у осситпд йоГогтк оГ !йе ΣΠ-18 Ьтбтд рго!ет !о 1пй1Ьй ΣΕ-18. бгос №111 Асаб 8а И8А 2000; 97:1190-1195.

14. Кокктапп, Т., ₽.Р. 8!айе1, ΡΜ. Ьепхйпдег, Н. Веб1, В.^. ОиЬк, О. ТгепН, С. 8сй1ад, апб М.С. Могдапй-Кокктапп. 1997. Ση!е^1еик^η-8 ге1еакеб т!о Не сегеЬгокрта1 йшб айег Ьгат щщгу 1к аккоаа!еб \\йй Ь1ооб Ьгат-Ьатег букГипсйоп апб пегуе дго\\1й Гас!ог ргобисйоп. 1. СегеЬ. Е1ооб Р1о\\' Ме!аЬ. 17:280-9.

15. Кшдй! Ό. М., Тппй Н., Ье I., 81еде1 8., 8йеа1у Ό., МсЬопоидй М., 8са11оп Β., Мооге М.А., ^1сек .Ь Ьаббопа Ρ., е! а1. Сопкйисбоп апб шй1а1 сйагааепхабоп оГ а тоике-йитап сййпепс апб-Т№ апйЬобу. Мо1. Σттиηο1 1993 Ναν 30:16 1443-53.

16. Ма11кхе\\'ккк С. В. , Т. А. 8а!о, Т. Vаηбеη Βοк, 8. ^аидй, 8. К. Ьо^ег, I. 81аск, М. Ρ. Βесктаηη, апб К. Н. СгаЬк!ет. 1990. Су!окте гесер!огк апб В се11 Гипсбопк. Σ. ВесотЬтап! ко1иЬ1е гесер!огк креаПса11у бйбЬй ΣΠ-1- апб ΣΕ-4-тбисеб В се11 асбуйкк т уйго. 1. Σттиηο1. 144:3028-3033.

17. Мка11е£, М. I., Т. Ой!кик1, К. Койпо, Р. ТапаЬе, 8. Икйю, М. Νι^ι, Т. Татто!о, К. Топдое, М. РиЩ, М. Σкеба, 8. Рикиба, апб М. Кипто!о. 1996. Ση!е^£е^οη-датта-^ηбис^ηд £ас!ог епйапсек Т йе1рег 1 су!окте ргобисйоп Ьу кйти1а!еб йитап Т се11к: купегдйт тейй т!ег1еикт-12 Гог т!егГегоп-датта ргобисйоп. Еиг-.Нттипо1 26:1647-51 1ккп: 0014-2980.

18. Могдапй-Кокктапп, М.С, Й.М. Еепхйпдег, V. Напк, Ρ. 8!айе1, Е. Скика, Е. Аттапп, В. 8!оскег, О. ТгеШх, апб Т. Кокктапп. 1997. Ρ^οбис!^οη о£ су!октек Го11о\\й1д Ьгат щ)шу: Ьепейаа1 апб бе1е!епоик Гог !йе батадеб бккие. Мо1. Ρ^6ιιϊ^ 2:133-6.

19. №1катига К., Окатига Н., \Уаба М., №1да1а К., Татига Т. Σηίес! Σттиη. 1989 РеЬ; 57(2):590-5.

20. №укк, Ό., К1т, 8-Н, РапШххк С., Вехшкоу, Ь., Отаге11о, С., апб ВиЬтк!ет, М (1999). Σттиηйу 10, 127-136.

21. Окатига Н., №1да1а К., Кота!ки Т., Ташто!о Т., №.1ка1а Υ., ТапаЬе Р., Акйа К., Топдое К., Окига Т., Рикиба 8., е! а1. Σηίес! Σттиη. 1995 Ос!;63(10):3966-72.

22. батек Ρ., Сагка, К. Е., Βοηηеή, Т. Ρ., Оо^ег, 8. К., апб 81тк, 1. Е. (1996), 1. ΒΟ1. Сйет. 271, 3967-3970.

- 18 006744

a. Реагзоп V. В., Ме!йобз ίη Еп/утокду, 183, 63-99, 1990.

b. Реагзоп V. . апб Ыртап Ό. 1., Ргос. №-Ц. Асаб. 8с1 И8А, 85, 2444-2448,1988.

23. Рппх. М. , апб и.К. Нашзсй. 1999. Милпе т1сгодйа1 се11з ргобисе апб гезропб 1о т!ег1еикт-18. 1. №еигосйет. 72:2215-8.

24. 1 С1т Гпуез! 1997 ЕеЬ 1;99(3):469-74 Во!йе Н, 1епктз №А, Соре1апб N6, Ко1Ь Н.

25. 8сйегЬе1, и., В. ВадйираШ, М. №акатига, К.Е. 8аа!тап, 1.0. Тго)апо\\'зкг Е. №еидеЬаиег, М.\У. Маппо, апб Т.К. МскИозй. 1999. 01ГГегеп(1а1 аси!е апб сйгошс гезропзез оГ 1итог песгоз1з Гас1ог-беПс1еп1 т1се !о ехрептеп!а1 Ьгат тщгу. Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А 96:8721-6.

26. 81юйатг Е., I. 61шз, апб 1.М. На11епЬеск. 1999. Эиа1 го1е оГ 1итог песгоз1з Гас!ог а1рйа ш Ьгат тщгу. Су!окте Сго\\1й Еас!ог Веу. 10:119-30.

27. 8йойат1, Е.; Вей№аппа1 Е., Ного\\кх М; Койеп В. (1997): 1. СегеЬ. В1ооб Е1о\г Ме!аЬ. 17, 10071019.

28. Теазба1е 6, 1еппей В. Бапсе! 1974 1и1 13;2 (7872):81-4.

29. 8!айе1 Р.Е., 8йойат1 Е., Уоишз Е.М., Капуа К, Ойо У.Г., БепхИпдег РМ, Сгоз)еап М.В., Еидз!ег НР, ТгегИх О., Коззтапп Т., Могдапй-Коззтапп М.С.1 СегеЬ В1ооб Е1о\г Ме!аЬ 2000 ЕеЬ; 20(2):369-80.

30. Бзйю 8, №атЬа М, Окига Т, Найоп К, №икаба Υ, Акйа К, ТапаЬе Е, КошзЫ К, Мюа11еГ М, ЕиЩ М, Топдое К., Ташто!о Т., Еикиба 8., 1кеба М., Окатига Н., КиптоФ М. 1. 1ттипо1. 1996 1ип. 1; 156(11):4274-9.

31. ^1ее1ег, О., А.С. Си1йапе, МП. На11, 8. Рккеппд-Вго^п, N.1. Во1йете11, апб 6.Ν. БийезЫ. 2000. ОеГесйоп оГ !йе т1ег1еикт-18 Гатйу т га! Ьгат Ьу ВТ-РСВ. Мо1. Вгат Вез. 77:290-3.

32. ^йа1еп, М.1., Т.М. Саг1оз, Р.М. Косйапек, 8.В. ^1зп1е^зк1, М.1. Ве11, В.8. С1агк, 8.Т. ОеКозку, Ω.\ν. Мапоп, апб Р.Э. Абе1зоп. 2000. 1п1ег1еикт-8 1з тсгеазеб ш сегеЬгозрта1 йшб оГ сййбгеп \νί!1ι зеуеге йеаб тщгу. Сгй. Саге Меб. 28:929-34.

33. Υозй^тоЮ Т., Такеба, К., Тапака, Т., Ойкизи, К., КазНиатига, 8., Окатига, Н., Акйа, 8. апб №акашзЫ, К. (1998), 1. 1ттипо1. 161, 3400-3407.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение ингибитора ГБ-18 для получения лекарственного препарата для лечения и/или предотвращения травматического повреждения центральной нервной системы (ЦНС), где ингибитор ГБ-18 выбирают из антител к ГБ-18, антител к любой субъединице рецептора ГБ-18, ингибиторов пути передачи сигнала с участием ГБ-18, антагонистов ГБ-18, которые конкурируют с ГБ-18 и блокируют рецептор ГБ-18, и ГБ-18-связывающих белков, их изоформ, мутеинов, слитых белков, функциональных производных, активных фракций или производных циркулярной перестановки, или их солей.
2. Применение ингибитора ГБ-18 для получения лекарственного препарата для лечения и/или предотвращения осложнений или поздних результатов травматического повреждения ЦНС.
3. Применение по любому из предшествующих пунктов, где травматическим повреждением ЦНС является закрытая травма головы.
4. Применение по п.1 или 2, где травматическим повреждением ЦНС является травма спинного мозга.
5. Применение по п.4, где ингибитором ГБ-18 является антитело к ГБ-18.
6. Применение по п.5, где антителом к ГБ-18 является гуманизированное антитело к ГБ-18.
7. Применение по п.5 или 6, где антителом к ГБ-18 является человеческое антитело к ГБ-18.
8. Применение по любому из пп.1-4, где ингибитором ГБ-18 является ГБ-18-связывающий белок или его соль, изоформа, мутеин, слитый белок, функциональное производное, активная фракция или производное циркулярной перестановки.
9. Применение по любому из предшествующих пунктов, где ингибитор ГБ-18 гликозилирован в одном или нескольких местах.
10. Применение по п.8, где слитый белок включает слияние с иммуноглобулином (Гд).
11. Применение по любому из предшествующих пунктов, где функциональное производное включает по меньшей мере одну составляющую, прикрепленную к одной или более функциональным группам, которые являются одной или более боковыми цепями на остатках аминокислот.
12. Применение по п.11, где указанной составляющей является часть полиэтиленгликоля (РЕО).
13. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лекарственный препарат дополнительно содержит интерферон для одновременного, последовательного или раздельного применения.
14. Применение по п.13, где интерфероном является интерферон-α или интерферон-β.
15. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лекарственный препарат дополнительно содержит фактор некроза опухолей (Т№Е) для одновременного, последовательного или раздельного применения.
16. Применение по п.15, где Т№Е является Т№Е-а.
17. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лекарственный препарат дополнительно содержит противовоспалительный агент для одновременного, последовательного или раздельного

- 19 006744 применения.
18. Применение по п.17, где противовоспалительным агентом является СОХ-ингибитор, в особенности, СОХ-2 ингибитор.
19. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лекарственный препарат дополнительно содержит антиоксидант для одновременного, последовательного или раздельного применения.
20. Применение по любому из предшествующих пунктов, где ингибитор ΙΠ-18 применяют в количестве около 0,001-100 мг/кг веса тела или около 0,01-10 мг/кг веса тела, или около 0,1-5 мг/кг веса тела, или около 1-3 мг/кг веса тела.
21. Применение по любому из предшествующих пунктов, где ингибитор ΙΠ-18 вводят подкожно.
22. Применение по любому из предшествующих пунктов, где ингибитор ΙΠ-18 вводят ежедневно.
23. Применение по любому из предшествующих пунктов, где ингибитор ΙΠ-18 вводят через день.
24. Применение молекулы нуклеиновой кислоты, включающей кодирующую последовательность ингибитора ΙΠ-18, для получения лекарственного препарата для лечения и/или предотвращения повреждения ЦНС.
25. Применение по п.24, где молекула нуклеиновой кислоты дополнительно включает последовательность вектора экспрессии.
26. Применение по п.24 или 25, где молекулу нуклеиновой кислоты вводят внутримышечно.
27. Применение вектора для индуцирования и/или усиления эндогенной продукции ингибитора ΙΕ18 в клетке для получения лекарственного препарата для лечения и/или предотвращения повреждения ЦНС.
28. Применение клетки, которая генетически модифицирована для продуцирования ингибитора ΙΕ18, для получения лекарственного препарата для лечения и/или предотвращения повреждения ЦНС.