DK175183B1 - DNA-sekvens, der koder for et protein med i alt væsentligt samme biologiske aktivitet som humanprotein C, ekspressionsvektor og pattedyrsceller indeholdende DNA-sekvensen, samt fremgangsmåde til fremstilling af proteinet - Google Patents

Description

i DK 175183 B1

Den foreliggende opfindelse angår generelt plasmaproteiner og DNA-sekvenser, som koder for samme, og opfindelsen angår nærmere bestemt ekspressionen af proteiner, som har i alt væsentligt samme struktur og/eller aktivitet som 5 human protein C eller aktiveret human protein C.

Protein C er et zymogen eller et forstadium til en serin-protease, som spiller en vigtig rolle ved reguleringen af blodkoaguleringen og frembringelsen af fibrinolytisk ak-10 tivitet in vivo. Det syntetiseres i leveren som et enkeltkædet polypeptid, der udsættes for væsentlig proces-sering til dannelse af et 2-kædet molekyle, som omfatter tunge kæder (molekylvægt = 40.000) og lette kæder (molekylvægt = 21.000), som holdes sammen af en disulfidbin-15 ding. Det cirkulerende mellemprodukt, som består af to kæder, omdannes til den biologisk aktive form af molekylet, der er kendt som "aktiveret protein C" (APC) , ved den thrombinmedierede fraspaltning af et 12 aminosyrer langt peptid fra den aminoterminale ende af den tunge 20 kæde. Denne spaltningsreaktion forstærkes in vivo af thrombomodulin, en endothelcellecofaktor (Esmon og Owen,

Proc.Natl.Acad.Sci. USA 78:2249-2252 (1981).

Protein C er et vitamin K-afhængigt glycoprotein, som 25 indeholder ca. 9 rester af gamma-carboxyglutaminsyre (Gla) og ét ækvivalent beta-hydroxyasparaginsyre, som dannes ved posttranslationelle modifikationer af gluta-minsyreresten henholdsvis asparaginsyre. Den posttranslationelle dannelse af specifikke gamma-carboxyglutamin-30 syrerester i protein C kræver vitamin K. Disse usædvanlige aminosyrerester bindes til calciumioner og formodes at være ansvarlig for vekselvirkningen mellem proteinet og DK 175183 B1 2 phospholipid, hvilket er nødvendigt for den biologiske aktivitet af protein C.

I modsætning til den koaguleringsfremmende virkning, som 5 andre vitamin K-afhængige plasmaproteiner, såsom faktor Vil, faktor IX og faktor X, har, fungerer aktiveret protein C som en regulator af koaguleringsprocessen ved inaktivering af faktor Va og faktor Villa ved begrænset proteolyse. Protein C1 s inaktivering af faktor Va og 10 Villa afhænger af tilstedeværelsen af sure phospholipider og calciumioner. Det er blevet rapporteret, at protein S regulerer denne aktivitet ved at accelerere den APC-katalyserede proteolyse af faktor Va (Walker, J.Biol.Chem. 255:5521-5524, 1980).

15

Protein C er også involveret i virkningen af vævsty-peplasminogenaktivatoren (Kisiel og Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73: 29-42, 1983). Infusion af bovin APC

i hunde resulterer i forøget plasminogenaktivator-20 aktivitet (Comp og Esmon, J.Clin.Invest. 68: 1221-1228, 1981). Nyere undersøgelser (Sakata et al.,

Proc.Natl.Acad. Sci.USA 82: 1121-1125, 1985) har vist, at tilsætning af APC til dyrkede endothelceller fører til en hurtig dosisafhængig forøgelse af fibrinolytisk aktivitet 25 i de konditionerede medier, hvilket afspejler cellernes forøgede aktivitet af både den urokinasebeslægtede plasminogenaktivator og vævstypeplasminogenaktivatoren. APC-behandling medfører også et dosisafhængigt fald i antiaktivatoraktivitet.

Protein C mangel er forbundet med tilbagevendende throm-bosesygdomme (Broekmanns et al., New Eng.J.Med. 309: 340-344, 1983; og Seligsohn et al., New Engl.J.Med. 310: 559- 30 3 DK 175183 B1 562, 1984) og kan skyldes en genetisk sygdom eller et trauma, såsom en leversygdom eller operation. Denne tilstand behandles almindeligvis med orale anti-koagulationsmidler. Der er også opnået gode virkninger 5 ved infusion af protein C-holdigt normalt plasma (se Gardiner og Griffin i Prog, in Hematology, red. Brown, Grune & Stratton, NY, 13: 265-278). Endvidere har nogle forskere fundet, at protein C s antikoagulerende aktivitet er nyttig ved behandling af thrombosesygdomme, såsom veneth-10 rombose (Smith et al., PCT publikation nr. WO 85/00521).

I nogle dele af verden har man beregnet, at ca. 1 ud af 16.000 personer har mangel på protein C. Endvidere er total mangel på protein C fatal hos nyfødte.

15 Det er endvidere blevet påvist, at exogent protein C forhindrer koaguleringspatologiske og letale virkninger af "blodforgiftning", som skyldes Gram-negative bakterier (Taylor et al., J. Cl in. Invest. 79: 918-25, 1987) . Data opnået fra undersøgelser med bavianer indicerer, at pro-20 tein C spiller en naturlig rolle ved beskyttelse mod denne type "blodforgiftning".

Omend naturlig protein C kan oprenses fra størkningsfaktorkoncentrater (Marlar et al., Blood 59: 1067-1072) el-25 ler fra plasma (Kisiel, se ovenfor) er det en kompliceret og dyr proces, hvilket dels skyldes, at udgangsmaterialet er begrænset, og at koncentrationen af protein C i plasma er lav. Den terapeutiske anvendelse af produkter, som hidrører fra humant blod, indebærer endvidere risiko for 30 overføring af sygdom, f.eks. virus, cytomegalovirus eller det agens, som fremkalder erhvervet immundefekt syndrom (AIDS). I betragtning af protein C s kliniske anvendelighed ved behandling af thrombotiske sygdomme er fremstil- DK 175183 B1 4 lingen af nyttige mængder protein C og aktiveret protein C klart af uvurderlig værdi.

I korthed angår den foreliggende opfindelse DNA-5 sekvenser, som koder for proteiner, der stort set har den samme biologiske aktivitet som human protein C eller aktiveret human protein C. DNA-sekensen er ejendommelig ved, at DNA-sekvensen endvidere koder for aminosyre-sekvensen (Ri) n-R2-R3"R4' bvor R1# R2, R3 og R4 er Lys 10 eller Arg, og n = 0, 1, 2 eller 3, ved spaltningsstedet mellem den lette kæde og den tunge kæde. I en foretrukken udførelsesform er aminosyresekvensen ved spaltningsstedet Arg-Arg-Lys-Arg.

15 Endvidere angår den foreliggende opfindelse ekspressionsvektorer, som er i stand til at integrere i pattedyrværts-DNA, hvilke vektorer er ejendommelige ved, at de omfatter en promotor, der nedstrøms efterfølges af en DNA-sekvens, som koder for et protein med i det væsentli-20 ge samme struktur og/ eller aktivitet som human protein C eller aktiveret human protein C, som ovenfor anført, hvor transkriptionen af nukleotidsekvensen styres af promotoren. Nukleotid- og DNA-sekvensen følges nedstrøms af et polyadenyleringssignal. I én udførelsesform inkluderer 25 ekspressionsvektoren en selekterbar markør, som er anbragt mellem nukleotidsekvensen og polyadenyleringssigna-let, hvor transskriptionen af den selekterbare markør styres af promotoren. Ekspressionsvektoren kan også omfatte et sæt RNA-splejsningssteder.

Et beslægtet aspekt af den foreliggende opfindelse angår pattedyrceller, som er transficeret ekspressionsvektoren til at udtrykke et protein, der efter aktivering stort 30 DK 175183 B1 5 set har samme biologiske aktivitet som aktiveret human protein C. Pattedyrcellerne transficeres med en ekspressionsvektor, som er i stand til at integrere i pattedyr-værtscelle-DNA, hvilken ekspressionsvektor omfatter en 5 promotor, der nedstrøms efterfølges af en som ovenfor beskrevet DNA-sekvens. I én udførelsesform indføres der også en selekterbar markør i cellerne, og stabilt trans-ficerede celler udvælges. Foretrukne værtsceller til brug ved den foreliggende opfindelse er COS-, BHK- og 293-10 celler.

Et yderligere aspekt af opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et protein, som stort set har den samme biologiske aktivitet som aktiveret human protein C.

15 Fremgangsmåden er ejendommelig ved (a) at der i en pattedyrværtscelle indføres en ekspressionsvektor, som omfatter en som ovenfor beskrevet DNA-sekvens, der koder for et protein med i det væsentlige den samme struktur og/eller aktivitet som human protein C, (b) at pattedyr-20 værtscellen dyrkes i et egnet medium, og (c) at det proteinprodukt, som kodes af DNA-sekvensen og frembringes af pattedyrværtscellen, isoleres.

Proteinerne kan anvendes som aktive terapeutiske substan-25 ser, herunder til brug ved reguleringen af blodkoagulering. Endvidere kan proteinerne kombineres med en fysiologisk acceptabel bærer og/eller fortynder til tilvejebringelse af egnede farmaceutiske kompositioner.

30 Andre aspekter af opfindelsen vil blive tydelige på baggrund af den detaljerede beskrivelse og tilhørende tegning .

« DK 175183 B1 6

Figur 1 viser et delvis restriktionskort af protein C cDNA i pHCXSL. Kodeområdet er angivet med en åben kasse.

Figur 2 illustrerer nukleotidsekvensen for det fulde pro-5 tein C cDNA og den deducerede aminosyresekvens for protein C. Pile angiver spaltningssteder til fjernelse af for-bindelsesdipeptidet og aktiveringspeptidet.

Figur 3 illustrerer et restriktionsenzymkort af det geno-10 miske DNA, som koder for human protein C. Tal under stregen giver længde i kilobase (kb).

Figur 4 viser den fulde genomiske sekvens, herunder exon-områder og intronområder, af human protein C-genet. Pile-15 hoveder angiver intron-exon-splejsningssamlinger. Polya-denylerings- eller processeringssekvenserne A-T-T-A-A-A og A-A-T-A-A-A ved 3'-enden er indrammet.

♦ angiver potentielle kulhydratfastgørelsessteder, 20 ^ angiver tilsyneladende spaltningssteder for processeringen af forbindelsesdipeptidet, i angiver spaltningsstedet i den tunge kæde, når protein 25 c omdannes til aktiveret protein C, • angiver polyadenyleringssteder.

Figur 5 illustrerer en skematisk todimensional model for 30 strukturen af human protein C.

Figur 6 illustrerer subkloningen af 5'- og 3'-delene af en partiel protein C cDNA-klon.

DK 175183 B1 7

Figur 7 illustrerer fjernelsen af intron A fra den geno-miske klon, hvilket resulterer i fusionen af exonområder-ne I og II.

5

Figur 8 illustrerer fusionen af exonområderne I og II med den mod 5'-enden nærmeste del af cDNA-indføjelsen fra figur 1.

10 Figur 9 illustrerer konstruktionen af et plasmid, som omfatter den fulde kodende sekvens for protein C.

Figur 10 illustrerer ekspressionsvektoren pD7C. De anvendte symboler er ori, adenovirus 5 0-1- 15 mappeenhedssekvensen; E, SV40-forstærkeren; Ad2MLP, den væsentlige, sene adenovirus 2-promotor; LI-3, den tredelte adenovirus 2-leder; 5'ss, 5'-splejsningssted; 3*ss, 31-splejsningssted; pA, det tidlige SV40- polyadenyleringssignal, og Δ, det fjernede område fra 20 pBR322 "gift"-sekvenserne.

Figur 11 illustrerer ekspressionsvektoren pD5{PC-DHFRr), DHFRr betegner den methotrexat-resistente mutant af di-hydrofolatreduktasegensekvensen; pA betegner det sene 25 SV40-polyadenyleringssignal. Andre anvendte symboler har den samme betydning som i figur 10.

Figur 12 illustrerer ekspressionsvektoren pDX/PC. De anvendte symboler er de samme som beskrevet for figur 11.

Figur 13 illustrerer resultatet fra en analyse for aktiveret protein C på medieprøver fra transficerede 293-celler.

30 DK 175183 B1 8

Figur 14 illustrerer ekspressionsvektorerne pDX/PC962 og PC962/229.

5 Figur 15 illustrerer antikoaguleringsaktiviteten af det protein C, som er fremstillet ifølge bestemte udførelsesformer for den foreliggende opfindelse.

Før opfindelsen beskrives, kan det for at forstå denne 10 være en hjælp at angive definitioner på visse af de her anvendte udtryk.

Biologisk aktivitet: En funktion eller sæt af funktioner, som udøves af et molekyle i en biologisk sammenhæng 15 (f.eks. i en organisme eller i en in vitro kopi). Proteiners biologiske aktiviteter inddeles i katalytiske aktiviteter og effektoraktiviteter. Vitamin K-afhængige plasmaproteiners katalytiske aktiviteter involverer almindeligvis den specifikke proteolytiske spaltning af andre 20 plasmaproteiner, hvilket resulterer i aktiveringen eller inaktiveringen af substratet. Effektoraktiviteter inkluderer specifik binding af det biologisk aktive molekyle til calcium, phospholipider eller andre små molekyler, til makromolekyler, såsom proteiner, eller til celler.

25 Effektoraktivitet forøger ofte den katalytiske aktivitet eller er essentiel for den katalytiske aktivitet under fysiologiske betingelser.

Den biologiske aktivitet for protein C er karakteriseret 30 ved dets antikoagulerende og fibrinolytiske egenskaber.

Når protein C er aktiveret inaktiverer det faktor Va og faktor Villa i nærværelse af phospholipid og calcium. Protein S synes at være involvereret i regulationen af 9 DK 175183 B1 denne funktion (Walker, se ovenfor). Aktiveret protein C forøger også fibrinolyse, hvilket er en effekt, som formodes at medieres ved en sænkning af niveauerne af piasminogenaktivatorinhibitorer (van Hinsbergh et al., 5 Blood 65: 444-451, 1985). Som beskrevet i større detaljer nedenfor er den del af protein C, som kodes af exonområ-derne VII og VIII i protein C-genet, primært ansvarlig for dets katalytiske aktiviteter.

10 Præ-Propeptid: En aminosyre sekvens, som findes i den ami-noterminale ende af nogle proteiner, og almindeligvis spaltes fra proteinet under translokation. Præpropeptider omfatter sekvenser, som styrer proteinet ind i cellens sekretionsbane (signalsekvenser), og er karakteriseret 15 ved tilstedeværelsen af en kerne af hydrofobe aminosyrer.

De kan også indeholde processeringssignaler. Som anvendt her kan udtrykket "præpropeptid" også betyde en del af et naturligt forekommende præpropeptid.

20 Ekspressionsenhed: En DNA-konstruktion, der omfatter en primær nukleotidsekvens, som koder for et protein af interesse, sammen med andre nukleotidsekvenser, der dirigerer og styrer transkriptionen af den primære nukleotidsekvens . En ekspressionsenhed består af mindst den primære 25 nukleotidsekvens og en promotorsekvens, som er anbragt opstrøms den primære nukleotidsekvens og koblet hertil på funktionsdygtig måde, samt et polyadenyleringssignal anbragt nedstrøms. Der kan også være inkluderet yderligere genetiske elementer for at forøge ekspressionseffektivi-’ 30 ten. Disse elementer inkluderer "forstærker"-sekvenser, ledere og mRNA-splejsningssteder.

DK 175183 B1 10

Ekspressionsvektor: Et DNA-molekyle, som bl. a. indeholder en DNA-sekvens, der koder for et protein af interesse, sammen med en promotor og andre sekvenser, som fremmer ekspressionen af proteinet. Ekspressionsvektorer in-5 deholder yderligere genetisk information, som muliggør deres replikation i en værtscelle, enten ved autonom replikation eller ved integrering i værtsgenomet. Eksempler på ekspressionsvektorer, der ofte anvendes ved re-kombinant DNA, er plasmider og visse vira, skønt de kan 10 indeholde elementer af begge. De kan også omfatte en se-lekterbar markør.

Som anført ovenfor produceres protein C i leveren, og der kræves vitamin K ved dets biosyntese. Vitamin K er nød-15 vendig til dannelsen af specifikke gamma-carboxy-glutaminsyrerester i det aminoterminale område af den lette kæde. Disse aminosyrerester dannes ved en post-translationel modifikation og er nødvendige for calciummedieret binding til phospholipid. Endvidere indeholder 20 protein C en beta-hydroxyasparaginsyrerest, som også dannes ved en posttranslationel modifikation. Det er imidlertid ikke kendt, hvilken rolle denne aminosyrerest spiller.

25 På baggrund af den kendsgerning, at aktiviteten af protein C er afhængig af posttranslationelle modifikationer, som involverer gamma-carboxyleringen af specifikke gluta-minsyrerester og spaltningen til formen i to kæder samt at den også kan være afhængig af hydroxyleringen af en 30 specifik asparaginsyrerest er det usandsynligt, at der ved kloning og ekspression af protein C i en mikroorganisme frembringes et aktivt produkt.

11 DK 175183 B1

Den lette og tunge kæde af bovinprotein C er blevet se-kventeret (Fernlund og Stenflo, J.Biol.Chem. 257:12170-12179, 1982; og Stenflo og Fernlund, J.Biol.Chem.

5 257:12180-12190, 1982). Isolering og karakterisering af human protein C er blevet beskrevet af Kisiel, J.Clin.Invest. 64: 761-769, 1979. Både humanenzymets og bovinenzymets antikoagulerende aktivitet fandtes at være meget artsspecifik. Artsspecificiteten formodes at være 10 medieret af protein S (Walker, Thromb.Res. 22: 321-327, 1981). Humanproteinet og bovinproteinet udviser imidlertid betragtelig samlet strukturel homologi med hinanden og med andre vitamin K-afhængige plasmaproteiner, herunder prothrombin, faktor VII, faktor IX og faktor X. Lig-15 hederne omfatter tilstedeværelsen af Gla-resterne i deri lette kæde og serinen i det aktive sted i den tunge kæde, såvel som anden aminosyresekvenshomologi i det aminoter-minale område af den lette kæde.

20 I forbindelse med den foreliggende opfindelse blev der fremstillet et Xgtll-cDNA-bibliotek ud fra human lever-mRNA. Dette bibliotek blev derefter screenet med 125I-mærket antistof mod human protein C. De antistofreaktive kloner blev yderligere analyseret for syntese af et fusi-25 onsprotein mellem β-galactosidase og protein C i Xgtll-vektoren.

Én af klonerne gav et kraftigt signal med antistofproben og fandtes at indeholde en indføjelse på ca. 1400 bp.

30 DNA-sekvensanalyse af DNA-indføjelsen viste en forudsagt aminosyresekvens, som udviser en høj grad af homologi med store dele af bovin protein C, hvilket er blevet fastlagt DK 175183 B1 12 af Fernlund og Stenflo (J.Biol.Chem. 2 57: 12170-12179; J.Biol.Chem. 257: 12180-12190) .

DNA-indføj elsen indeholdt hovedparten af det kodende om-5 råde for protein C, idet den begyndte med aminosyre 64 i den lette kæde, inkluderede hele det kodende område for den tunge kæde og fortsatte med termineringscodonen. Efter stopcodonen i den tunge kæde var der endvidere 294 basepar ikke-kodende 3'-sekvens og en poly(A)-hale af 9 10 basepar. Processeringssignalet eller polyadenyle-ringssignalet A-A-T-A-A-A var til stede 13 basepar opstrøms poly(A)halen i denne cDNA-indføj else. Denne sekvens var en af to potentielle polyadenyleringssteder.

15 cDNA-sekvensen koder også for dipeptidet Lys-Arg ved position 156-157 (nummereringen af aminosyrerne er vist i figur 2), som adskiller den lette kæde fra den tunge kæde og fjernes under processering ved proteolytisk fraspalt-ning resulterende i secerneringen af molekylet med to 20 kæder. Når molekylet med de to kæder aktiveres af thrombin spaltes den tunge kæde i human protein C mellem argi-nin 169 og leucin 170, hvorved aktiveringspeptidet frigøres (figur 2).

25 Ved en lignende fremgangsmåde blev der isoleret et andet cDNA, som manglede den sekvens, der koder for præpropep-tidet og de første 23 aminosyrer af protein C. Under anvendelse af dette cDNA som en hybridiseringsprøve blev resten af den kodende sekvens opnået fra et humant geno-30 misk DNA-bibliotek i λ Charon 4A (Foster et al., Proc. Natl.Acad.Sci. USA 82: 4673-4677, 1985) . Der blev isoleret 3 forskellige λ Charon 4A-fager, som indeholdt overlappende indføjelser for protein C-genet.

13 DK 175183 B1

Positionerne af exonområderne på de tre fagkloner blev bestemt ved Southern blot hybridisering af fordøjeiser af disse kloner med prober, som var fremstillet ud fra det 5 ovenfor beskrevne 1400 bp lange cDNA. De genomiske DNA-indføjelser i disse kloner blev kortlagt ved enkelt og dobbelt restriktionsenzymfordøjelse efterfulgt af agaro-segelelektroforese, Southern blot overføring og hybridisering til radioaktivt mærkede 5'- og 3'-prober, som var 10 frembragt ud fra det cDNA, som koder for human protein C, hvilket er vist i figur 3.

Der blev udført DNA-sekventeringsundersøgelser under anvendelse af dideoxykædetermineringsmetoden. Som vist i 15 figur 4 strækker nukleotidsekvensen af det gen, som koder for human protein C, sig over ca. 11 kb DNA. Disse undersøgelser afslørede endvidere et potentielt præpropeptid på 42 aminosyrer. Præprosekvensen spaltes af en signal-peptidase efter Gly-resten ved position -25. Processering 20 til det modne protein involverer yderligere proteolytisk spaltning efter rest -1 til fjernelse af det aminotermi-nale propeptid og spaltning ved aminosyreresterne 155 og 157 til fjernelse af Lys-Arg-dipeptidet, som forbinder den lette og den tunge kæde. Denne sidste processering 2 5 giver en let kæde på 155 aminosyrer og en tung kæde på 262 aminosyrer.

Protein C-genet omfatter 8 exonområder, der i størrelse går fra 25 til 885 nukleotider, samt 7 intronområder, der 30 i størrelse går fra 92 til 2668 nukleotider. Exon I og en del af exon II koder for det 42 aminosyrer lange præpropeptid. Den resterende del af exon II, exon III, exon IV og exon V og en del af exon VI koder for den lette kæde DK 175183 B1 14 af protein C. Den resterende del af exon VI, exon VII og exon VIII koder for den tunge kæde af protein C. Aminosy-resekvensen og DNA-sekvensen for et cDNA, som koder for human protein C, er vist i figur 2.

5

Intronområderne i genet for protein C ligger primært mellem forskellige funktionelle domæner. Exon II strækker sig over det meget konserverede område af præpropeptidet og gamma-carboxyglutaminsyredomænet (Gla-domænet) . Exon 10 III omfatter en strækning på 8 aminosyrer, som forbinder Gla- og vækstfaktordomænerne. Exonområderne IV og V repræsenterer hver et potentielt vækstfaktordomæne, medens exon VI dækker et forbindelsesområde, som omfatter akti-veringspeptidet. Exonområderne VII og VIII dækker det 15 katalytiske domæne, som er typisk for alle serinprotea-ser.

Aminosyresekvensen og foreslået struktur for human præproprotein C er vist i figur 5. Protein C er vist uden 20 Lys-Arg-dipeptidet, som forbinder den lette kæde og den tunge kæde. Lokaliseringen af de 7 intronområder (A til G) er angivet med massive streger. Aminosyrer, som omgiver kendte proteolytiske spaltningssteder, er omgivet af en cirkel. RHOMBE betegner potentielle kulhydratbindings-25 steder. Den første aminosyre i den lette kæde, aktive-ringspeptidet og den tunge kæde starter med nr. 1. Denne nummerering adskiller sig fra den i figurerne 2 og 4 viste .

30 Kulhydratfastgørelsesstederne er lokaliseret ved aminosy-rerest 97 i den lette kæde og aminosyreresterne 79, 144 og 160 i den tunge kæde ifølge det i figur 5 anvendte nummeringsskema. Kulhydratdelen bindes covalent til Asn.

15 DK 175183 B1 I de fleste tilfælde kan omgivelserne omkring kulhydratfastgørelsesstedet repræsenteres ved Asn-X-Ser eller Asn-X-Thr, hvor X = en hvilken som helst aminosyre.

5 Som ovenfor anført spiller protein C en regulatorisk rolle i koaguleringsprocessen. Det katalytiske domæne, som kodes af exonområderne VII og VIII, har serinproteaseak-tivitet, som specifikt spalter visse plasmaproteiner (dvs. faktorerne Va og Villa), hvilket resulterer i deres 10 deaktivering. Som følge af denne selektive proteolyse udviser protein C antikoagulerende og fibrinolytisk aktivitet .

På grund af tilstedeværelsen af intervenerende sekvenser 15 i den genomiske klon er den blotte sammenføjning af den genomiske sekvens og cDNA-sekvensen til tilvejebringelse af en fuldstændig kodende sekvens ikke tilstrækkelig til konstruktion af en acceptabel ekspressionsenhed. Af grunde, som beskrives nærmere nedenfor, er det derfor nødven-20 digt at fjerne disse intervenerende sekvenser, hvis der anvendes en genomisk klon til at konstruere ekspressions-enheden.

Det 5'-kodende område kan også opnås ved alternative me-25 toder og eliminerer følgelig behovet for at fjerne intervenerende sekvenser. Det 5'-kodende område kan opnås ved at anvende prober, som er fremstillet ud fra det eksisterende cDNA eller genomiske kloner til at undersøge yderligere biblioteker. Ved denne fremgangsmåde blev der iso-30 leret et cDNA i fuld længde. De aminoterminale dele af de vitamin K-afhængige plasmaproteiner er endvidere ansvarlig for deres respektive calciumbindings-aktiviteter. Som følge af denne funktionelle homologi har det vist sig, at DK 175183 B1 16 calciumbindingsdomænerne i disse molekyler kan byttes om og stadig bevare den aktivitet, som er specifik for det katalytiske domæne i det fremkomne molekyle. Som beskrevet i US patent ansøgning nr. 724.311, indleveret 17.

5 april 1985 og publiceret som EPO-publikation nr. 200.421 kan f.eks. den aminoterminale del (calciumbindingsdomænet) af faktor IX sammenføjes med faktor VII ved aminosyre 38 til frembringelse af et protein med faktor vil's aktivitet. Faktor VII, faktor IX, faktor X, prothrombin 10 og protein S deler denne aminoterminale sekvenshomologi med protein C. Følgelig kan en klonet sekvens, som omfatter det 5'-kodende område af genet for et hvilket som helst af disse proteiner indsættes i stedet for den tilsvarende sekvens af protein C-genet. Baseret på viden om 15 aminosyresekvenser for adskillige af de vitamin K afhængige plasmaproteiner eller den her beskrevne sekvens for protein C kan der endvidere syntetiseres passende kodende sekvenser. Metoder til frembringelse af syntetiske nu-kleotidsekvenser er velkendte inden for fagområdet. Et 20 sæt af overlappende oligonukleotider kan f.eks. syntetiseres og "anneleres" (eng.: annealed) parvis til frem bringelse af dobbeltstrengede fragmenter med overlappende "klæbrige" ender. Disse fragmenter ligeres derefter som alle andre restriktionsfragmenter ville blive. Det frem-25 komne syntetiske fragment ligeres derefter til cDNA'et på et passende restriktionssted. Om nødvendigt kan sammenføjningssekvensen modificeres ved oligonukleotidstyret mutagenisering.

3 0 Når man har opnået kloner, som repræsenterer hele den kodende sekvens, kan de hensigtsmæssige områder føjes sammen efter behov til frembringelse af den ønskede, kodende sekvens. Fragmenter, som er opnået fra et eller 17 DK 175183 B1 flere biblioteker, skæres med hensigtsmæssige restrik-tionsendonukleaser og sammenføjes enzymatisk i den korrekte orientering. Afhængig af fragmenterne og de bestemte restriktionsendonukleaser, som man har valgt, kan det 5 være nødvendigt at fjerne uønskede DNA-sekvenser ved en deletionsmutageniserings-"udsløjfnings"-proces eller ved en kombination af restriktionsendonukleasespaltning og mutagenisering. Den således opnåede sekvens skal fortrinsvis være i form af en kontinuerlig, åben læseramme, 10 dvs. at den mangler de intervenerende sekvenser (intron-områder), som almindeligvis findes i gener fra højere eukaryotiske celler. Tilstedeværelse af intronområder i klonede gener kan føre til afvigende splejsning af mRNA og/eller nedsat genekspressionseffektivitet eller ustabi-15 litet ved amplifikation, når gensekvensen indføres i en pattedyrværtscelle. For at lette den korrekte processe-ring og secernering af det protein C, som frembringes ifølge den foreliggende opfindelse, foretrækkes det, at den kodende sekvens endvidere koder for et præpropeptid.

20 Præpropeptidet kan være præpropeptidet for protein C eller et andet secerneret protein, såsom faktor IX, faktor VII eller prothrombin.

Under nogle omstændigheder kan det være ønskeligt at 25 frembringe det aktiverede protein C direkte, hvorved man undgår behovet for at aktivere proteinproduktet enten in vitro eller in vivo. De spaltningssteder, som er involveret i modningen og aktiveringen af protein C, er kendte (Foster & Davie, se ovenfor) . Der kan konstrueres en se-30 kvens, som koder for aktiveringspeptidet, ved hjælp af oligonukleotidstyret deletionsmutagenisering. Det fremkomne protein vil så blive aktiveret ved fjernelse af Lys-Arg-dipeptidet under normal proteolytisk processering DK 175183 B1 18 i værtscellens secerneringsbane. Det er blevet vist, at proteiner, der mangler aktiveringspeptidet, ikke desto mindre processeres korrekt af værtscellerne, hvilket fører til secernering af aktiveret protein C.

5

For at forøge den proteolytiske processering, som er involveret i modningen af det rekombinerede protein B til formen med to kæder, kan det være ønskeligt at modificere aminosyresekvensen omkring processeringsstedet. En sådan 10 modifikation har vist sig at lette den korrekte processering af rekombineret protein C i transficerede celler.

Effektiv spaltning kan forøge den specifikke aktivitet af proteinet, da man ikke har kendskab til, at enkeltkæde 15 protein C bliver aktiveret i blodstrømmen. Som tidligere anført omfatter denne modningsproces fjernelsen af dipep-tidet Lys-Arg {aminosyrerne 156-157) (Foster & Davie,

Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81: 4766-4770, 1984). Modifikationer af aminosyresekvensen i nærheden af dette proces-20 seringssted inkluderer substitution og/eller indføjelse af aminosyrer. Én sådan gruppe af modifikationer er ændringen af aminosyresekvensen på en sådan måde, at den indeholder sekvensen (Ri)n._R2_-R3“R4' hvor R^, R2, R3 og R4 er Lys eller Arg og n=0, l, 2 eller 3, i stedet for 25 det native Lys-Arg-dipeptid. En specielt foretrukken modifikation af denne gruppe er sekvensen Arg-Arg-Lys-Arg.

Det har vist sig, at denne sekvens forøger processering af rekombinant protein C med ca. 5 gange i transf icerede BHK-celler. En anden gruppe af modifikationer inkluderer 30 udskiftningen af aminosyrerest 154 (His) af det native protein C med en basisk aminosyrerest (dvs. Lys eller Arg) til dannelse af en processeringssekvens med den almene formel R^-X-R^R^, hvor R^, R2 og R2 er Lys eller 19 DK 175183 B1

Arg, og X er en anden aminosyre end Lys eller Arg, fortrinsvis Leu. En tredie gruppe af modifikationer inkluderer udskiftningen af Asp-resten ved position 158 med en ikke-sur aminosyrerest. Det foretrækkes at anvende en 5 lille, neutral aminosyre, såsom Ala, Ser, Thr eller Gly.

En fjerde gruppe af modifikationer inkluderer udskiftningen af Lys-Arg i det native protein C med Lys-Lys eller Arg-Arg. Der kan også foretages kombinationer af disse grupper af modifikationer. F.eks. kan aminosyre 158 10 blive udskiftet i et protein C molekyle, som indeholder et processeringssted med sekvensen (R]_) n_R2-R3-R4 * Disse modifikationer kan anvendes ved frembringelse af vildtype protein c eller aktiveret protein c.

15 Den kodende sekvens for protein C eller aktiveret protein C indsættes derefter i en egnet ekspressionsvektor, som derefter anvendes til at transficere en pattedyrcellelinie. Ekspressionsvektorer til brug ved udøvelse af den foreliggende opfindelse vil omfatte en promotor, som 20 er i stand til at styre transkriptionen af et fremmed gen, som er indført i en pattedyrcelle. Der foretrækkes virale promotorer på grund af deres effektivitet med hensyn til at styre transkription. En specielt foretrukken promotor er den sene hovedpromotor fra adenovirus 2. Så-25 danne ekspressionsvektorer indeholder fortrinsvis også et sæt RNA-splejsningssteder lokaliseret nedstrøms promotoren og opstrøms indføjelsesstedet for protein C-sekvensen eller i selve protein C-sekvensen. Foretrukne RNA-splejsningssteder kan fås fra adenovirusgener og/eller 3 0 immunoglobulingener. I ekspressionsvektorerne findes ligeledes et polyadenylerings-signal, som er anbragt nedstrøms indføjelsesstedet. Der foretrækkes navnlig virale polyadenyleringssignaler, såsom tidlig eller sene poly- DK 175183 B1 20 adenyleringssignaler fra SV40 eller polyadenyleringssignalet fra adenovirus 5 Eib-området. I en specielt foretrukken udførelsesform omfatter ekspressionsvektoren også en ikke-kodende, viral ledersekvens, såsom den 5 tredelte leder fra adenovirus 2, der anbringes mellem promotoren og RNA-splejsnings-stederne. Foretrukne vektorer kan også omfatte forstærkersekvenser, såsom SV40-forstærkeren og de sekvenser, som koder for adenovirus VA RNA'er.

10 Klonede gensekvenser kan derefter indføres i dyrkede pattedyrceller ved f.eks. calciumphosphatmedieret transfice-ring (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro og Pearson, Somatic Cell Genetics, 7: 603, 1981; Graham og van der Eb, Virology 52: 456, 1973). Der dannes et præcipitat 15 mellem DNA'et og calciumphosphatet, og dette præcipitat tilsættes til cellerne. Nogle af cellerne optager DNA'et og bevarer det inden i cellen i adskillige dage. En lille fraktion af disse celler {typisk 10“^) integrerer DNA'et i genomet. For at kunne identificere disse celler med 20 integreret DNA indføres der almindeligvis et gen, som bibringer cellerne en selekterbar fænotype (en selekter-bar markør) sammen med det gen, som har interesse. Foretrukne, selekterbare markører inkluderer gener, som tilvejebringer resistens mod medikamenter, såsom neomycin, 25 hygromycin og methotrexat. Selekterbare markører kan indføres i cellen på et separat plasmid samtidig med det gen, som har interesse, eller de kan indføres på det samme plasmid. Hvis de sidder på det samme plasmid, kan den selekterbare markør og det gen, som har interesse, være 30 under styring af forskellige promotorer eller den samme promotor. I én udførelsesform er den selekterbare markør anbragt på samme plasmid som den sekvens, der koder for protein C, således at begge sekvenser styres af den samme 21 DK 175183 B1 promotor, en konstruktion, som kaldes et dicistronisk budskab. Der kendes konstruktioner af denne type inden for fagområdet (f.eks. EPO publikation nr. 117.058). Det kan også være fordelagtigt at tilsætte yderligere DNA, 5 hvilket kaldes "bærer-DNA", til den blanding, som indføres i cellerne. Efter at cellen har optaget DNA'et, får de lov til at vokse i en tidsperiode, typisk 1-2 dage, for at begynde at udtrykke det gen, som har interesse. Derefter udføres medikamentselektion for at selektere for 10 væksten af celler, som udtrykker den selekterbare markør på en stabil måde. Kloner af sådanne celler kan undersøges for ekspression af protein C.

Foretrukne pattedyrcellelinier til brug ved den forelig-15 gende opfindelse omfatter COS-, BHK- og 293-

cellelinierne. Der kan endvidere anvendes en række andre cellelinier ved den foreliggende opfindelse, herunder rotte-Hep I (ATCC CRL 1600), rotte-Hep II (ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), humane lungeceller (ATCC CCL 20 75.1), humane hepatomaceller (ATCC HTB-52), Hep G2 (ATCC

HTB 8065), museleverceller (ATCC CC 29.1) og DUKX-celler (Urlaub og Chasin, Proc.Natl. Acad,Sci. USA 77:4216-4220, 1980).

25 293-cellelinien (ATCC CRL 1573; Graham et al., J.Gen.Virol. 36: 59-72, 1977) foretrækkes navnlig på grund af dens evne til effektiv processering af protein C til formen med de to kæder. Denne cellelinie transformeres med human adenovirus 5 DNA og har Ad5 ElA-genet inte-30 greret i sit genom. Foretrukne ekspressions-vektorer til brug med 293-celler vil omfatte en adenoviruspromotor. Neomycinresistens er en foretrukken selekterbar markør til brug i 293-celler. En foretrukken BHK-cellelinie er DK 175183 B1 22 tk~-BHK-cellelinien BHK570 (Waechter og Baserga,

Proc.Natl.Acad.Sci. USA 7 9: 1106-1110, 1982).

Kopiantallet af den integrerede gensekvens kan forøges 5 ved amplifikation ved at anvende visse bestemte selekter-bare markører (f.eks. dihydrofolatreduktase, som tilvejebringer resistens mod methotrexat. Den selekterbare markør indføres i cellerne sammen med det gen, som har interesse, og der udøves medikamentselektion. Medikament-10 koncentrationen forøges derefter på trinvis måde med selektion af resistente celler i hvert trin. Ved at selektere for forøget kopiantal af klonede sekvenser kan ekspressionsniveauet af det kodede protein forøges væsentligt .

15

Protein C fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse oprenses fortrinsvis, såsom ved affinitetskromatografi på en søjle med antistof imod protein C. Yderligere oprensning af søjleeluatet kan opnås ved traditionelle kemiske 20 oprensningsmetoder, såsom højeffektiv væskekromatografi (HPLC).

Protein C, som er fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse, kan aktiveres ved fjernelse af aktive-2 5 ringspept idet fra den aminoterminale ende af den tunge kæde. Aktivering kan opnås ved at inkubere protein C i nærværelse af alfa-thrombin (Marlar et al., Blood 59: 1067-1072, 1982), trypsin (Marlar et al., se ovenfor),

Russell's slangegiftfaktor X aktivator (Kisiel, se oven-30 for) eller den fra gift fremstillede aktivator Protac C, der fås kommericielt (American Diagnostica).

23 DK 175183 B1

Til opsummering af de efterfølgende eksempler beskriver eksempel 1 kloningen af DNA-sekvenser, som koder for human protein C. Eksempel 2 beskriver konstruktionen af en for protein C kodende sekvens i fuld længde ud fra de i 5 eksempel 1 isolerede sekvenser. Eksempel 3 beskriver konstruktionen af ekspressionsvektorer for protein C DNA. Eksempel 4 beskriver fremstillingen af protein C under anvendelse af transficerede pattedyrceller. Eksempel 5 beskriver et fuldlængde cDNA, som koder for protein C, 10 samt dets ekspression i transficerede pattedyrceller. Eksempel 6 beskriver fremstillingen af aktiveret protein C i BHK-celler og 293-celler. Eksempel 7 beskriver fremstillingen af protein C ud fra et forstadie med et modificeret spaltningssted. Eksempel 8 beskriver anvendelsen 15 af faktor Vll-præpropeptidet eller prothrombinpræpropep-tidet til styring af secerneringen af protein C fra transficerede celler.

Eksempler 20

Restriktionsendonukleaser og andre DNA-modificerende enzymer (f.eks. T4-polynukleotidkinase, alkalisk phosphatase fra kalve, Klenow-DNA-polymerase, T4-polynukleotid-ligase) var fra Bethesda Research Laboratories (BRL) og 25 New England Biolabs og blev med mindre andet er anført anvendt som angivet af leverandøren.

Oligonukleotider kan syntetiseres på et Applied Biosystems Model 380 A DNA-syntetiseringsapparat og oprenses 30 ved polyacrylamidgelelektroforese på denature-rende ge-ler. E.coli celler kan transformeres som beskrevet af Maniatis et al. {"Molecular Cloning: A Laboratory Man- DK 175183 B1 24 ual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). M13- og pUC-kloningsvektorer samt værtsstammer var fra BRL.

Eksempel 1

5 Kloning af DNA-sekvenser, som koder for human protein C

Et cDNA, som koder for en del af human protein C, blev fremstillet som beskrevet af Foster og Davie (se ovenfor) . I korthed blev der ved hjælp af traditionelle meto-10 der fremstillet et kgtll cDNA-bibliotek ud fra human le-ver-mRNA. Kloner blev screenet under anvendelse af l25I-mærket, affinitetsoprenset antistof mod human protein C, og der blev fremstillet fager ud fra positive kloner ved pladelysatmetoden (Maniatis et al., se ovenfor), efter-15 fulgt af bånddannelse på en cæsiumchloridgradient. cDNA-indføjeiserne blev fjernet under anvendelse af Eco RI og subklonet i plasmid pUC9 (Vieira og Messing, Gene 19: 259-268, 1982). Restriktionsfragmenter blev subklonet i fagvektorerne M13mpl0 og Ml3mpll (Messing, 20 Meth. in Enzymology, 101: 20-77, 1983) og blev sekvente- ret ved dideoxymetoden (Sanger et al.,

Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74 : 5463-5467, 1977) . Der blev udvalgt en klon, som indeholdt DNA, der svarer til den kendte, delvise sekvens af human protein C (Kisiel, se 25 ovenfor) , og som kodede for protein C begyndende fra aminosyre 64 i den lette kæde og strækkende sig gennem den tunge kæde til det ikke-kodende 3'-område. Denne klon blev betegnet λΗ01375. Der blev identificeret en anden cDNA-klon, som kodede for protein C fra aminosyre 24.

3 0 Indføjelsen fra denne klon blev subklonet i pUC9, og plasmidet blev betegnet ρΗΟλδΕ (figur 1) . Denne klon koder for en større del af protein C, herunder det område, 25 DK 175183 B1 som koder for den tunge kæde, termineringscodonen, og det ikke-kodende 31-område.

cDNA-indføj elsen fra lHC1375 blev nick-translateret under 5 anvendelse af oc-32p dNTP'er og blev anvendt til at pro-bere et humant genomisk bibliotek i λ Charon 4A-fagen {Maniatis et al., Cell 15: 687-702, 1978) under anvendelse af den plaque-hybridiseringsprocedure, som er beskrevet af Benton og Davis (Science 196: 181-182, 1977) og 10 modificeret af Woo (Meth. in Enzymology 68: 381-395, 1979) . Der blev isoleret positive kloner, og de blev oprenset ved plaque-met oden (Foster et al.,

Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82: 4673-4677, 1985, medtaget her ved denne henvisning). Fag-DNA, som var fremstillet ud 15 fra positive kloner (Silhavy et al., i "Experiments with Gene Fusion", Cold Spring Harbor Laboratory, 1984), blev fordøjet med Eco RI eller Bgl II, og de genomiske indføjelser blev oprenset og subklonet i pUC9. Restriktions-fragmenter med indføjelserne blev subklonet i M13-20 vektorer og sekventeret for at bekræfte deres identitet og fastslå DNA-sekvensen af hele genet.

cDNA-indføj elsen fra pHCX6L blev nick-translateret og anvendt til at probere λ-Charon 4A-fagbiblioteket. Der 25 blev identificeret 1 genomisk klon, som hybridiserede til prober, der var fremstillet ud fra 5'- og 3'-enderne af cDNA1 et. Denne fagklon blev fordøjet med Eco RI, og et 4,4 kb langt fragment, som svarer til 5’-enden af protein C-genet, blev subklonet i pUC9. Det fremkomne rekombine-30 rede plasmid blev betegnet pHCR4.4. Analyse af den fuldstændige DNA-sekvens viste, at indføjelsen i pHCR4.4 omfattede 2 exonområder med 70 og 167 basepar adskilt af et intronområde med 1263 bp. Det første exonområde kodede DK 175183 B1 26 for aminosyrerne -42 til -19; det andet kodede for amino-syrerne -19 til 37. Sekvensanalyse bekræftede DNA-sekvensen af det fulde protein C gen.

5 Som anført ovenfor er det nødvendigt at fjerne intronom-rådet for at man kan anvende en genomisk klon til at konstuere en acceptabel, kodende sekvens til brug ved den foreliggende opfindelse.

10 Eksempel 2 Konstruktion af en for protein C kodende sekvens i fuld længde

Der blev konstrueret en for protein C kodende sekvens i 15 fuld længde, herunder præpropeptidet, ved at sammenføje de hensigtsmæssige fragmenter af cDNA'et og genomiske kloner. Dette blev opnået ved at fjerne intronområdet fra den genomiske klon (pHCR4.4) og sammenføje de sammensluttede exonområder til cDNA'et (fra ρΗΟλβίΟ ved passende 20 restriktionssteder. Det ønskede forbindelsessted mellem genomisk DNA og cDNA blev derefter frembragt ved at udsløjfe ikke-ønskede sekvenser ved oligonukleotidstyret deletionsmutagenisering.

25 Plasmid pH^6L indeholder cDNA, som koder for en del af protein C, og som er klonet i EcoRI-stedet i pUC9 (figur 1) . cDNA-indføj elsen subklones i to fragmenter for at forberede en sammenslutning med det kodende område for den genomiske klon, som sidder længst mod 5'-enden.

30 Plasmid ρΗΟλβΙ* blev fordøjet med Eco RI og Sal I, og reaktionsblandingen blev ekstraheret med phenol og CHC13 og derefter ethanolpræcipiteret. De fremkomne DNA-fragmenter blev resuspenderet i en ligeringspuffer, og der blev til- 27 DK 175183 B1 sat T4-DNA-ligase. Den ligerede blanding blev inkuberet ved 15°C i 14 timer. En delmængde af ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E.coli JM83, og cellerne blev udpladet på LB-agar, som indeholdt X-gal. Der blev 5 udvalgt hvide kolonier, og der blev fremstillet plasmid-DNA. DNA'et blev analyseret ved restriktionsenzymfordøjelse for at identificere kloner, som indeholdt 31-delen af cDNA'et {en indføjelse på ca. 1450 bp), og 5'-delen af cDNA'et (en indføjelse på ca. 65 bp) . Disse kloner blev 10 betegnet p9C3' henholdsvis p9C5' {figur 6).

Det kodende 5'-område, som manglede i cDNA'et, fandtes i exonområderne I og II i den genomiske klon pHCR4.4. Dette plasmid indeholdt en indføjelse på ca. 4400 basepar og 15 slutter i dens 3 ’-ende med en Eco Ri-sted lokaliseret i intron B.

For at fjerne de kodende sekvenser fra pHCR4.4, blev plasmidet fordøjet med Pst I og Eco RI, og de fremkomne 20 fragmenter blev separeret ved elektroforese i en agarose-gel. Det ca. 2540 bp lange fragment, som indeholdt exonområderne I og II, blev isoleret fra gelen og ekstraheret med CTAB (Langridge et al., Analyt.Biochem. 103:264, 1980). Dette fragment, som blev kaldt 5' P-R, blev sub-25 klonet i pUC9 til frembringelse af plasmidet p5'P-R (figur 7) .

Intronområdet i p5' P-R (betegnet intron A) blev fjernet ved en to-trins proces {figur 7). Plasmidet blev fordøjet 3 0 med Apa I, som spalter ved et unikt genkendelsessted i intronområdet og efterlader fremspringende 3'-ender. Det lineariserede plasmid blev derefter behandlet med Bal 31-exonuklease eller T4-polymerase til fjernelse af ca. 400 DK 175183 B1 28 bp fra hver ende, og de fremkomne fragmentender blev gjort stumpe med Sl-nuklease. Det linearlserede plasmid blev gendannet til en cirkel med ligase og anvendt til at transformere E.coli JM83. Plasmid DNA blev ekstraheret og 5 analyseret for tilstedeværelsen af Sma X- og Sst I-restriktionssteder i intron A, og der blev valgt et plasmid, som havde et Sma I-Sst I-fragment, som var reduceret til 300-400 bp, og det blev betegnet p5’PAaR.

10 Resten af intron A blev fjernet ved oligonukleotidstyret deletionsmutagenisering, stort set som beskrevet af Zol-ler og Smith ("Manual for Advanced Techniques in Molecular Cloning Course", Cold Spring Harbor Laboratory, 1983) for to-primer metoden. p5'PAaR blev fordøjet med Pst I og 15 Eco RI, og protein C-fragmentet blev subklonet i Ml3mp9 fordøjet med Pst I + Eco RI. Plus-streng fag-DNA blev fremstillet som template og anneleret til oligonukleotid mut-1 (tabel 1) . Dette mutagene oligonukleotid omfattede sekvenser, som er komplementære til de exon-I- og II-20 sekvenser, som skal sammenføjes. Den universelle M13-sekventeringsprimer blev anneleret 3' for mut-1 på den samme template. Primerne blev forlænget under anvendelse af DNA-polymerase I (Klenow-fragment) og nukleo- tidtriphosphater i nærværelse af T4-DNA-ligase. De frem-25 komne duplex-DNA-cirkler blev transformeret i E.coli JM103, og de fremkomne plaques blev screenet under stringente hybridiseringsbetingelser, hvortil det -^P-mærkede, mutagene oligonukleotid anvendtes som probe. DNA fra positive plaques blev isoleret og sekventeret under anven-30 delse af oligonukleotidprimer-1 (tabel 1) , som primer i exon II, hvilket gør det muligt at bestemme DNA-sekvensen hen over sammenføjningsstedet, hvor deletionen har fundet sted. Der udvælges et molekyle, som har den korrekte sam- 29 DK 175183 B1 menslutning af exonområderne I og II i læseramme. Pstl-EcoRI-fragmentet blev isoleret fra den replikative form af M13 ved restriktionsendonuklease-fordøj else og agaro-segelelektroforese og blev subklonet i pUC9 til frembrin-5 gelse af plasmid p5'I-II (figur 7).

For tilføjelse af det kodende 5'-område til cDNA'et henvises til figur 8, hvor det ca. 1277 bp lange Pstl-EcoRI-fragment fra p5'I-II blev isoleret fra en fordøjelse af 10 plasmidet med PstI og EcoRI, og det blev oprenset ved agarosegelelektroforese. Det 65 bp lange cDNA-fragment, som ligger længst mod 5'-enden, blev isoleret for en fordøjelse af p9C5' med Sal I og Eco RI og blev oprenset ved elektroforese på en acrylamidgel. De to fragmenter blev 15 ligeret ved deres Eco RI-ender, og det fremkomne ca. 1330 bp lange Pst I-Sal I-fragment blev subklonet i M13mp9 fordøjet med Pst I og Sal I (figur 8). Plusstrengfag-DNA blev fremstillet som template for oligonukleotidstyret deletionsmutagenisering. Oligonu-kleotid mut-2 (tabel 1) 20 blev anneleret til templaten, og oligonukleotid mut-3 (tabel 1) blev anneleret opstrøms som den anden primer. Primerne blev forlænget som · ovenfor beskrevet. Oligo-nukleotidet mut-2 styrer sammenslutningen af de exon II-sekvenser, som koder for aminosyrerne 23-26, til cDNA'et 25 ved codon 27. Den anden primer (mut-3) indfører et Eco RI-genkendelsessted 35 bp opstrøms translationsstarten. Den fremkomne fag blev undersøgt for fravær af genkendelsessteder for Nco I og Xho I og for tilstedeværelsen af det indføjede Eco Rl-genkendel-sessted. Det fag-30 DNA, som viste det ønskede restriktionsmønster, blev se-kventeret under anvendelse af primer-2 (tabel 1) til bekræftelse af tilstedeværelsen af den korrekte sammenføjning mellem exon II og cDNA'et. Fag-DNA med den korrekte DK 175183 B1 30 sekvens blev selekteret, og Pst I-Sal I-fragmentet, som omfattede det 5'-kodende område, blev isoleret fra den replikative form af den rekombinerede Ml3-fag. Fragmentet blev oprenset i agarosegel-elektroforese og blev indføjet 5 i pUC9 fordøjet med Pst I og Sal I til tilvejebringelse af plasmidet pC5'-ende.

Der henvises til figur 9, hvor plasmid "pC5'-end" blev fordøjet med Eco RI og Sal I, og fragmentet med 5'-enden 10 af protein C blev oprenset ved agarosegelelektroforese og ekstraktion med CTAB. Resten af cDNA'et blev isoleret som et Sal Ι-Eco Ri-fragment fra p9C3'. De to fragmenter blev føjet sammen med Eco RI-fordøj et pUC9 i en ligering med de tre dele. Ligeringsblandingen blev anvendt til at 15 transformere E,coli JM83, cellerne blev udpladet på LB + X-gal, og plasmid-DNA blev isoleret fra hvide kolonier.

Det fremkomne plasmid blev betegnet pMMC. Det indeholder den fulde, kodende sekvens for human protein C på et ca.1500 bp langt Eco RI-fragment.

20

Tabel I

Oligonukleotid Sekvens mut -1 3 ' CGA GGA G AA CTG AGT CAC AA5 '

25 mut-2 3'CTG AAG CTC CTC CGG TTC CTT

TAA5 ' mut-3 5<GGA GGA ATT CTG AGC3' primer-1 5'TTT GCq gat ccg CAG3' primer-2 5'CGA CGT GCT TGG ACC3' 31 DK 175183 B1

Eksempel 3

Konstruktion af ekspressionsvektorer for protein C

5 Den protein C-kodende indføjelse blev fjernet fra pMMC som et Eco RI-fragment og indsat i en egnet pattedyrekspressionsvektor. Et eksempel på en vektor er pD7, som omfatter SV40-forstærkeren og den sene hovedpromotor samt den tredelte leder fra adenovirus 2.

10

Plasmid pD7 blev taget fra plasmid pDHFRIII (Berkner og Sharp, Nuc.Acids.Res. 13: 841-857, 1985). Pst I- genkendelsesstedet umiddelbart opstrøms DHFR-sekvensen i pDHFRIII blev omdannet til et Bel I-genkendelsessted ved, 15 at 10 μg plasmid blev fordøjet med 5 enheder Pst I i 10 minutter ved 37°C i 100 μΐ puffer A {10 mM Tris pH 8, 10 mM MgCl2, 6 mM NaCl, 7 mM β-MSH) . DNA'et blev phe-nolekstraheret, præcipiteret med EtOH og resuspenderet i 40 μΐ puffer B (50 mM Tris pH 8, 7 mM MgCl2, 7 mM β-MSH), 20 som indeholdt 10 mM dCTP og 16 enheder T4-DNA-polymerase, og blandingen blev inkuberet· ved 12°C i 60 minutter. Efter EtOH-præcipitation blev DNA’et ligeret til 2,5 μg kinasebehandlede Bel I-linkere i 14 μΐ puffer C (10 mM Tris pH 8, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1,4 mM ATP), som inde- 25 holdt 400 enheder T4-polynukleotidligase, i 12 timer ved 12°C. Efter phenolekstraktion og EtOH-præcipitation blev DNA'et resuspenderet i 120 μΐ puffer D (75 mM KCl, 6 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT), blev fordøjet med 80 enheder Bel I i 60 minutter ved 50°C, og blev derefter 30 underkastet elektroforese gennem agarose. Form III plasmid-DNA (10 μg) blev isoleret fra gelen og ligeret i 10 μΐ puffer C, som indeholdt 50 enheder T4-poly-nukleotidligase, i 2 timer ved 12°C, og blev anvendt til DK 175183 B1 32 at transformere E.coli HB101. Positive kloner blev identificeret ved hurtig DNA-præparationsanalyse, og plasmid-DNA (kaldt pDHFR1), som var fremstillet ud fra positive kloner, blev transformeret i dAM- E.coli.

5

Plasmid pD2' blev derefter frembragt ved at spalte pDHFR' (15 μg) og pSV4 0 (som omfatter Barn HI-fordøjet SV4 0-DNA, der er klonet i Bam-HI-genkendelsesstedet i pML-1) (25μg) i 100 μΐ puffer D med 25 enheder Bel I i 60 minutter ved 10 50°C, efterfulgt af tilsætning af 50 enheder Barn HI og yderligere inkubering ved 37°C i 60 minutter. DNA-fragmenter blev adskilt ved agarosegelelektroforese, og det 4,9 kb lange pDHFR’-fragment og det 0,2 kb lange SV40-fragment blev isoleret. Disse fragmenter (200 ng 15 pDHFR'-DNA og 100 ng SV40-DNA) blev inkuberet i 10 μΐ puffer C, som indeholdt 100 enheder T4-polynukleotidligase i 4 timer ved 12°C, og den fremkomne konstruktion (pD2') blev anvendt til at transformere E.coli RRI.

20

Plasmid pD2’ blev modificeret ved at fjerne de "giftige" sekvenser i pBR322-området (Lusky og Botchan, Nature 293: 79-81, 1981) . Plasmiderne pD2 1 (6,6 pg) og pML-1 (Lusky og Botchan, se ovenfor) (4 μg) blev inkuberet i 50 μΐ 25 puffer A med 10 enheder af hver af Eco RI og Nru I i 2 timer ved 37°C efterfulgt af agarosegelelektroforese. Det 1,7 kb lange pD2'-fragment og det 1,8 kb lange pML-l-fragment blev isoleret og ligeret sammen (50 ng af hver) i 20 μΐ puffer C, som indeholdt 100 enheder T4-30 polynukleotidligase i 2 timer ved 12°C, efterfulgt af transformation i E.coli HB101. Kolonier, som indeholdt den ønskede konstruktion (betegnet pD2) blev identificeret ved en hurtig præparationsanalyse. 10 pg pD2 blev 33 DK 175183 B1 derefter fordøjet med 20 enheder af hver af Eco RI og Bgl II i 50 μΐ puffer A i 2 timer ved 37°C, DNA'et blev underkastet elektroforese gennem agarose, og det ønskede 2,8 kb lange fragment (fragment C), som omfattede pBR322, 5 3'-indsplejsningsstedet og poly-A-sekvenserne, blev iso leret .

Til frembringelse af de resterende fragmenter, som blev anvendt ved konstruktionen af pD3, blev pDHFRIII modifi-10 ceret til omdannelse af genkendelsesstedet for Sac II (Sst II) til et genkendelsessted for enten Hind III eller Κρη I. 10 μg pDHFRIII blev fordøjet med 20 enheder Sst II i 2 timer ved 37°C efterfulgt af phenolekstraktion og ethanolpræcipitering. Resuspenderet DNA blev inkuberet i 15 100 μΐ puffer B, som indeholdt 10 mM dCTP og 16 enheder T4-DNA-polymerase i 60 minutter ved 12°C, blev pheno-lekstraheret, dialyseret og ethanolpræcipiteret. DNA (5 μg) blev ligeret med 50 ng kinasebehandlede Hind III-eller Kpn I-linkere i 20 μΐ puffer C, som indeholdt 400 20 enheder T4-DNA-ligase i 10 timer ved 12°C, blev phenol-ekstraheret og ethanolpræcipiteret. Efter resuspension i 50 μΐ puffer A blev de fremkomne plasmider fordøjet med 50 enheder Hind III eller Kpn I, hvad der nu var passende, og blandingerne blev underkastet elektroforese gennem 25 agarose. Gelisoleret DNA (250 ng) blev ligeret i 30 μΐ puffer C, som indeholdt 400 enheder T4-DNA-ligase i 4 timer ved 12°C og blev anvendt til at transformere E.coli RRI. De fremkomne plasmider blev betegnet pDHFRIII (Hind III) og pDHFRIII (Kpn I) . Et 700 bp langt Kpn I -30 Bgl II - fragment (fragment A) blev derefter oprenset fra pDHFRIII (Kpn I) ved fordøjelse med Bgl II og Kpn I efterfulgt af agarosegelelektroforese.

DK 175183 B1 34 SV40-forstærkersekvensen blev indføjet i pDHFRIII {Hind III) på følgende måde: 50 μ9 SV40-DNA blev inkuberet i 120 μΐ puffer A med 50 enheder Hind III i 2 timer ved 37°C, og Hind III C SV4 0-fragmentet (5089-968 bp) 5 blev geloprenset. Plasmid pDHFRIII {Hind III) (10 μg) blev behandlet med 250 ng kalvetarmphosphatase i 1 time ved 37°C, blev phenolekstraheret og ethanolpræcipiteret.

Det lineariserede plasmid (50 ng) blev ligeret med 250 ng Hind III C SV40 i 16 μΐ puffer C i 3 timer ved 12°C vinder 10 anvendelse af 200 enheder T4-polynukleotidligase og transformeret i E. coli HB101. Et 700 bp langt Eco Rl-Κρη I fragment (fragment B) blev derefter isoleret fra dette plasmid.

15 Til den endelige konstruktion af pD3 blev fragmenterne A og B (50 ng af hver) ligeret med 10 ng fragment C med 200 enheder T4-polynukleotidligase i 4 timer ved 12°C efterfulgt af transfektion af E.coli RRI. Positive kolonier blev påvist ved den hurtige præparationsanalyse, og der 20 blev udført en storskalapræparation af pD3.

Plasmid pD3 blev modificeret ved at omdanne Bel I-indsættelsesstedet til et Eco Ri-sted, således at protein C-sekvensen kunne indsættes. Først er det nødvendigt at 25 fjerne det Eco RI-sted, som er til stede pD3 ved den ende af adenovirus 5 0-1 kortenhedssekvenserne, som ligger længst til venstre, ved at omdanne Eco RI-stedet til et Barn HI sted ved hjælp af traditionelle linkerprocedurer.

I korthed blev plasmid fordøjet med Eco RI, og det linea-30 riserede DNA blev behandlet med T4-DNA-polymerase og alle fire deoxynukleotidtriphosphater til frembringelse af stumpe ender. Plasmider blev derefter ligeret til octo-nukleotider, som omfattede Barn I-restriktionsstedet, 35 DK 175183 B1 DNA'et blev fordøjet med Bam HI til fjernelse af overskydende linkere, og det fragment, som omfattede pattedyr-celleekspressionssekvenserne, blev klonet i Bam Hi-stedet i pML-1. Det fremkomne plasmid blev transformeret i 5 E.coli HB101, og plasmid-DNA blev fremstillet og undersøgt for korrekt omdannelse. På lignende måde blev Bel I-stedet omdannet til et Eco Ri-sted under ' anvendelse af passende octonukleotidlinkere. Den fremkomne vektor er kendt som pD7. Det 1,5 kb lange protein C Eco Ri-fragment 10 fra pMMC blev derefter indsat i Eco Ri-stedet i pD7 til frembringelse af ekspressionsvektoren pD7C (figur 10).

En vektor, som er i stand til at udtrykke protein C-sekvensen fra et polycistronisk budskab, blev konstrueret 15 ud fra pD5, et plasmid, der ligner pD3, og som indeholder en DHFR-kodende sekvens, der mangler det meste af det ikke-kodende 5'-område. DHFR-sekvensen blev modificeret yderligere for at nedsætte dets bindingsaffinitet overfor methotrexat.

20

Vektoren pD5 blev konstrueret ved en fremgangsmåde, som er analog med den fremgangsmåde, som er beskrevet for pD3, og adskiller sig kun fra pD3 ved at Bam HI-stedet er indføjelsesstedet for heterologe DNA'er, og det Bel I-25 Bam HI SV40-fragment, som indeholder SV40-polyadenyle-ringssignalet, er i den sene orientering.

DHFR-sekvensen blev først modificeret ved at fordøje pDHFRIII med Pst I og Sst I og isolere det 4 00 bp lange 30 DHFR-fragment. Dette blev subklonet i en M13- fagvektor og blev mutageniseret som beskrevet af Simonsen og Levinson (Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 80: 2495-2499, 1983). Mutage- niseringen resulterer i et enkelt baseparskift i DHFR- DK 175183 B1 36 sekvensen. Det ændrede fragment blev derefter genindsat i pDHFRI 11 til frembringelse af plasmidet pDHFRrm.

Det ikke-kodende 5'-område af DHFR-sekvensen blev deref-5 ter fjernet. Plasmidet pDHFRrIII blev spaltet med Fnu 4HI, som skærer plasmidet ca. 20 steder, blev derefter behandlet med T4-DNA-polymerase og alle fire deoxy-nukleotidtriphosphater til frembringelse af stumpe ender.

Bam HI-linkere blev ligeret til enderne, og blandingen 10 blev fordøjet med Bam HI og Nco I. Et 0,6 kb langt Bam HI - Nco I-fragment, som omfattede DHFRr cDNA'et, blev isoleret. Plasmid pDHFRIll blev fordøjet med Nco I og Bam HI, og det 0,2 kb lange fragment, som omfattede SV40-polyadenyleringssignalet blev isoleret. Polyadenyle-15 ringssignalet i den tidlige orientering blev derefter ligeret til DHFRr-fragmentet. Efter fordøjelse med Bam HI blev det fremkomne Bam HI-fragment derefter indsat i Bam HI-genkendelsesstedet i pD5, og ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E.coli HB101. Plasmid 20 DNA blev fremstillet og screenet ved restrik-tionsendonukleasefordøjelse. Et plasmid, som havde DHFRr-indføj elsen i den korrekte orientering til transkription fra den sene Ad2-hovedpromotor, blev betegnet pD5(DHFRr).

25 For at udtrykke protein C under anvendelse af plasmid pD5{DHFRr), blev pMMC fordøjet med Eco RI, og det 1,5 kb lange protein C fragment blev isoleret. Eco Ri-enderne blev omdannet til Bel I-ender ved behandling med linkere. Plasmid pD5(DHFRr) blev delvis fordøjet med Bam HI for at 30 spalte det ved 5'-enden af DHFRr-sekvensen og blev ligeret til protein C-fragmentet. Plasmid DNA blev undersøgt for den korrekte orientering og indføjelsen af protein C

37 DK 175183 B1 fragmentet. Den fremkomne vektor, som blev betegnet pD5(PC-DHFRr), er illustreret i figur 11.

Eksempel 4 5 Ekspression af protein C i transficerede pattedyrceller

Babyhamsternyreceller (BHK-celler) (American Type Culture Collection deponeringsnummer CCL10) blev transficeret med pD7C ved calciumphosphatcopræcipitering (Wigler et al., 10 Cell 14: 725, 1978; Corsaro og Pearson, Soma tic Cell Genetics, 7: 603, 1981 og Graham og Van der Eb, Virology 52: 456, 1973). Cellerne blev dyrket ved 37°C,

5% C02 i Dulbecco's medium (plus 10% varmeinaktiveret føtal kalveserum og suppleret med L-glutamin og penicil-15 lin-streptomycin) i 60 mm vævsdyrkningspetriskåle til en sammenflydning på 20%. Der blev anvendt ialt 10 μg DNA til at transficere én 60 mm petriskål: 3,75 pg pD7C, 1,25 pg pKO-neo (Southern og Berg, J.Mol.Appl. Genet. 1: 327-341, 1982) og 5 pg laksesperm-DNA. DNA'erne blev præcipi-20 teret i 0,3 M NaOAc, 75% ethanol, blev skyllet med 70% ethanol og genopløst i 20 μΐ 10 mM Tris-HCl pH8, 1 mM EDTA. DNA'et blev kombineret med 440 μΐ H20 og 500 μΐ 280 mM NaCl, 1,5 mM NaHP04, 12 mM dextrose, 50 mM HEPES pH

7,12. Der blev dråbevis tilsat 60 μΐ 250 mM CaCl2 til 25 ovennævnte blanding, og opløsningen fik lov til at henstå ved stuetemperatur i 30 minutter. Opløsningen blev derefter tilsat til cellerne, og cellerne blev sat tilbage til 37°C i 4 timer. Mediet blev fjernet, og der blev tilsat 5 ml 20% DMSO i Dulbeccos medium med serum i 2 minutter ved 30 stuetemperatur. Skålen blev derefter vasket hurtigt med to medieskift og inkuberet i frisk medium natten over. 24 timer efter tilsætningen af DNA'et, blev mediet fjernet, og der blev tilsat selektivt medium (10 mg/ml G418, 4 98 DK 175183 B1 38 u/mg, Gibco, i Dulbecco's medium med serum). Efter ca.

10-13 dage blev individuelle kloner, som repræsenterede celler, der havde inkorporeret pKO-neo genet, og således var resistente overfor G418, overført til plader med 96-5 brønde og dyrket i Dulbeccos medium plus 10% føtal kalve-serum til proteinanalyser.

Til analyse for protein C blev mediet separeret fra cellerne og cellulære rester ved centrifugering, og det blev 10 analyseret for protein C-polypeptid og biologisk aktivitet. Cellerne blev fjernet fra pladerne ved trypsin, blev vasket med frisk medium, centrifugeret og frosset ved -20°C. Til analyse blev cellepelleterne optøet i PBS, de blev pelleteret og resuspenderet i PBS, som indeholdt 15 0,25% Triton X-100. Prøverne blev fortyndet og analyseret for polypeptid og aktivitet.

ELISA (eng: enzyme-linked immunosorbent assay) for protein C blev udført på følgende måde: Affinitetsoprensét,

20 polyklonalt antistof mod human protein C (100 μΐ af 1 pg/ml i 0,1 M Na2C03, pH 9,6) blev tilsat til hver brønd i mikrotiterplader med 96 brønde, og pladerne blev inkuberet natten over ved 4°C. Brøndene blev derefter vasket tre gange med PBS (5 mM phosphatpuffer, pH 7,5, 0,15 M

25 NaCl), som indeholdt 0,05% Tween-20 og blev derefter inkuberet med 100 μΐ 1% bovinserumalbumin, 0,05% Tween 20 i PBS ved 4°C natten over. Pladerne blev derefter skyllet adskillige gange med PBS, blev lufttørret og opbevaret ved 4°C. Til analyse af prøver blev 100 μΐ af hver prøve 30 inkuberet i 1 time ved 37°C i antistofbelagte brønde, og brøndene blev skyllet med 0,05% Tween-20 i PBS. Brøndene blev derefter inkuberet 1 time ved 37°C med et biotinkonjugeret, polyklonalt fåreantistof mod protein C (30 39 DK 175183 B1 ng/ml) i PBS, som indeholdt 1% serumalbumin og 0,05% Tween-20. Brøndene blev skyllet med PBS og inkuberet igen 1 time ved 37°C med avidin konjugeret med alkalisk phosphatase i PBS indeholdende 1% bovinserumalbumin og 5 0,05% Tween 20. Brøndene blev derefter skyllet med PBS, og alkalisk phosphataseaktivitet blev målt ved tilsætning af 100 μΐ phosphatasesubstrat {Sigma 104; 600 μg/ml) i 10% diethanolamin, pH 9,8, som indeholdt 0,3 mM MgCl2. Absorbansen ved 4 05 nm blev aflæst på en mikrotiterpla-10 deaflæser.

Protein C s biologiske aktivitet blev analyseret ved dets evne til at forlænge kaolin-cephalin-størkningstiden for plasma efter dets aktivering, hvilket er beskrevet i ek-15 sempel 5C.

Eksempel 5

Ekspression af et protein C-kodende cDNA i fuld længde A. Isolering af cDNA.

20

Et genomisk fragment, som indeholdt et exonområde, der svarer til aminosyrerne -42 til -19 i præpropeptidet (exon 1 i figur 4) af protein C blev isoleret, nick-translateret og anvendt som en probe til at undersøge et 25 DNA-bibliotek, der blev konstrueret i overensstemmelse med den metode, der er beskrevet af Gubier og Hoffman (Gene 25: 262-269, 1983) under anvendelse af mRNA fra HEPG2-celler. Denne cellelinie hidrørte fra human hepato-cytter, og det var tidligere blevet vist, at den synteti-30 serede protein C (Fair og Bahnak, Blood 64 .· 194-204, 1984). 10 positive kloner, som omfattede cDNA indsat i

Eco RI-stedet i λgtll/ blev isoleret og undersøgt med en oligonukleotidprobe, der svarer til det ikke-kodende 5'- DK 175183 B1 40 område af protein C-genet. Én klon var også positiv med denne probe, og hele dens nukleotidsekvens blev bestemt. cDNA'et indeholdt 70 bp ikke-translateret 5'-sekvens, hele den kodende sekvens for human præpro-protein C og 5 hele det ikke-kodende 3'-område, som svarer til det andet polyadenyleringssted (figur 2).

B. Ekspressionsvektorkonstruktion 10 Ekspression af protein C cDNA blev opnået i vektoren pDX.

Denne vektor blev afledt fra pD3 (beskrevet i eksempel 3 ovenfor) , og pD3', hvilket er en vektor, som er identisk med pD3 med undtagelse af, at SV40-polyadenylerings-signalet (dvs. fragmentet fra SV40 BamHI [2533 bp] til 15 Bell [2770 bp] ) er i den sene orientering. pD3' indeholder således et genkendelsessted for Bam HI i genindføj elsesstedet.

Til frembringelse af pDX blev Eco Ri-stedet i pD3' omdan-20 net til et Bel I-sted ved Eco Ri-spaltning, inkubering med Sl-nuklease og efterfølgende ligering med Bel I-linkere. DNA blev fremstillet fra en positivt identificeret koloni, og det 1,9 kb lange Xho-I-Pst I-fragment, som indeholdt det ændrede restriktionssted, blev fremstillet 25 ved hjælp af agarosegelelektroforese. I en anden modifikation blev det Bel I-spaltede pD3 ligeret med kinasebe-handlede Eco RI-Bcl I-adaptorer (som var konstrueret ud fra oligonukleotiderne ZC525, 5'GGAATTCT3'; og ZC526, 51GATCAGAATTCC31) for at frembringe et Eco RI- 30 genkende ls es sted som den position, hvor et gen indsættes i ekspressionsvektoren. Positive kolonier blev identificeret ved restriktionsendonukleaseanalyse, og DNA fra disse blev anvendt til at isolere et 2,3 kb langt Xho I - 41 DK 175183 B1

Pst I-fragment, som indeholdt det modificerede restriktionssted. De to ovenfor beskrevne DNA-fragmenter blev inkuberet sammen med T4-DNA-ligase, blev anvendt til at transformere E.coli HB101, og positive kolonier blev 5 identificeret ved restriktionsanalyse. En præparation af sådant DNA, kaldet pDX, blev derefter fremstillet. Dette plasmid indeholdt et unikt Eco RI restriktionssted til indsættelse af fremmede gener.

10 Protein C-cDNA blev derefter indsat i pDX som et Eco RI-fragment. Rekombinerede plasmider blev screenet ved restriktionsanalyse for at identificere de plasmider, som har protein C-indføjelsen i den korrekte orientering med hensyn til promotorelementet, og der blev fremstillet 15 plasmid-DNA (betegnet pDX/PC) fra en korrekt klon (figur 12) . Da cDNA-indføjelsen i pDX/PC indeholdt en ATG-codon i det ikke-kodende 5'-område (se figur 2) blev der udført deletionsmutagenisering på cDNA'et før transficering og ekspressionsforsøg. Fjernelse af de tre basepar blev ud-20 ført ved standardprocedurer for oligonukleotidstyret mu-tagenisering. Den pDX-baserede vektor, som indeholdt det modificerede cDNA, blev betegnet p594.

C. cDNA-ekspression 25

Plasmid p594 blev transficeret i COS-1 (ATCC CRL1650), BHK og 293-celler ved calciumphosphatpræcipitering. Fire timer senere blev der tilsat frisk dyrkningsmedium (suppleret med 5 pg/ml vitamin K) . På passende tidspunkter 30 (sædvanligvis efter 48 timer eller 72 timer) blev dyrkningsmedierne høstet, og cellerne blev samlet og lyseret.

DK 175183 B1 42

Det protein C, som var secerneret i dyrkningsmediet, blev analyseret ved ELISA under anvendelse af det samme affi-nitetsoprensede, polyklonale antistof, som blev anvendt ved den initielle identifikation af cDNA-klonerne. Analy-5 seresultater for COS-l-celler.

For at vurdere gamma-carboxyleringsgraden af det rekombi-nerede protein blev prøver af dyrkningsmediet udsat for bariumcitratpræcipitering, hvilket er en proces, som se-10 lektivt alene præcipiterer gamma-carboxylerede proteiner fra plasma (Bajaj et al., J.Biol.Chem. 256: 253-259, 1981). Over 70% af det antigene protein C-materiale kunne præcipiteres med bariumcitrat.

15 Det rekombinerede protein C blev analyseret for antikoa-guleringsaktivitet ved at måle dets evne til at forlænge koagulering. Dialyserede medieprøver blev behandlet med Protac C (American Diagnostica) for at aktivere protein C. Prøverne blev derefter tilsat til en in vitro størk-20 ningsanalyse (Sugo et al., J.Biol.Chem. 260: 10453, 1985) . 1 korthed blev 5 0 μΐ af hver af normal, sammen hældt human plasma, kaninhjernecephalin (10 mg/ml i TBS [50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl] ) og kaolinsuspension (5 mg/ml i TBS) blandet i et silikonebehandlet reagensglas.

25 Efter præinkubering ved 37°C i 2 minutter tilsattes 100 μΐ aktiveret protein C fortyndet i TBS, og inkuberingen ved 37°C blev fortsat i yderligere 2 minutter. Størkningen blev derefter påbegyndt ved tilsætning af 50 μΐ 25 mM CaCl2, og størkningstiden blev noteret. Aktiviteten af 30 det rekombinerede materiale viste sig at være stort set den samme som aktiviteten af naturligt forekommende protein C.

43 DK 175183 B1

Protein C frembragt af transficerede BHK- og 293-celler blev yderligere analyseret ved Western-blot-metoden. Medieprøver blev underkastet elektroforese på denaturerende geler, og der blev taget aftryk, som blev proberet med 5 radioaktivt mærket antistof mod protein C. Resultaterne indikerede, at ca. 201 af protein C fra BHK-cel lerne fandtes i formen med to kæder, medens ca. 90% af protein C fra 293-celler blev processeret til formen med to kæder.

10

Tabel 2

Forbigående ekspression og secernering af protein C i COS-1 og 293-celler 15 ng/ml

protein C

Celler Plasmid i medie COS-1 intet 0 COS-1 p594 10 20 293 intet 0 293 p594 50

Eksempel 6

Ekspression af aktiveret protein C 25 cDNA-sekvensen for protein C blev ændret ved stedspecifik mutagenisering for at fjerne den del, som kodede for ak-tiveringspeptidet. Den ændrede sekvens blev derefter transficeret i BHK- og 293-celler, og stabilt transfice-30 rede celler blev selekteret. Der blev påvist aktivt protein C i dyrkningsmedieprøver fra begge cellelinier.

DK 175183 B1 44

For at fjerne den aktiveringspeptidkodende sekvens blev plasmid p594 fordøjet med Sst I, og det ca. 880 bp lange fragment blev oprenset og indsat i Sst I-restriktions-stedet i M13mpl0. De 12 aktiveringspeptidcodoner blev 5 fjernet ved oligonukleotidstyret deletionsmutagenisering {Zoller og Smith, DNA 3: 479-488, 1984) under anvendelse af det mutagene oligonukleotid 5’CTGAAACGACTCATTGAT31.

DNA i den replikative form blev fremstillet ud fra mutantf agkloner og blev fordøjet med Sst I. Protein C-10 fragmentet {ca. 840 bp) blev isoleret og indsat i p594 fordøjet med Sst I. De fremkomne plasmider blev screenet for korrekt orientering af Sst I-fragmentet ved restriktionskortlægning under anvendelse af Bgl II. Der blev udvalgt et korrekt plasmid, og det fik betegnelsen 15 pPC829. Plasmid pPC829 blev sekventeret for at bekræfte tilstedeværelsen af den ønskede kodende sekvens.

Plasmid pPC829 blev cotransficeret ind i BHK-celler (med plasmid pSVDHFR (Lee et al., Nature 294: 228-232, 1981)) 20 og 293-celler (med pKO-neo (Southern og Berg, J.Mol. Appl. Genet. 1_: 327-341, 1982)) ved calciumphosphat-copræcipitering (Graham og van der Eb, Virology, 52: 456-467, 1973). Efter 48 timer blev dyrkningsmediet høstet og analyseret for protein C ved ELISA. Resultaterne er vist 25 i tabel 3. På samme tidspunkt blev kulturer delt 1:5 i medier, som indeholdt 500 pg/ml G418 (293 celler) eller 250 nM methotrexat (BHK-celler). Efter 10 dage i nærværelse af selektivt medie blev stabilt transficerede kolonier undersøgt for protein C-frembringelse ved immunofil-30 teranalyse (McCracken og Brown, BioTechniques, 82-87, marts/april 1984). Pladerne blev skyllet med PBS eller medium uden serum (Dulbecco's medium plus penicillinstreptomycin, 5 pg/ml vitamin K). Et Teflon-net blev der- 45 DK 175183 B1 efter anbragt over cellerne. Nitrocellulosefiltre blev befugtet med PBS eller medium uden serum, hvad der nu var hensigtsmæssigt, og anbragt over nettet. Efter 4 timers inkubering ved 37°C blev filtrene fjernet og anbragt i 5 puffer A (50 mM Tris pH 7,4, 5 mM EDTA, 0,05% NP-40, 150 mM NaCl, 0,25% gelatine) i 30 minutter ved stuetempera tur. Filtrene blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur under omrystning i biotinmærket, polyklonalt fåreantistof mod protein C, 1 μg/ml i puffer A. Filtrene blev derefter 10 vasket i puffer A og inkuberet 1 time ved stuetemperatur under omrystning i avidinkonjugeret peberrodperoxidase (Boehringer-Mannheim), 1:1000 i puffer A. Filtrene blev

vasket i puffer B, derefter i H20 og inkuberet i farvereagens (60 mg peberrodperoxidasefarveudviklingsreagens 15 [Bio-Rad] , 20 ml methanol, 100 μΐ H202 i 100 ml 50 mM

Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl). Reaktionen blev standset ved overføring af filtrene til H20.

Positive kolonier blev opsamlet og dyrket i selektive 20 medier (som indeholdt 500 pg/ml G418 eller 250 nM methotrexat, hvad der nu var hensigtsmæssigt) i 10 dage. Dyrkningsmedierne blev analyseret for APC-aktivitet ved en analyse med et chromogent substrat. Medieprøver blev tilsat til mikrotiterbrønde, som indeholdt 100 μΐ 0,2 mM 25 Spectrozym PCa (American Diagnostica Nr.336) i 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl. Pladerne blev inkuberet ved 37°C, og A405-værdien blev målt med forskellige tidsintervaller. Repræsentative resultater fra en transficeret 293-cellelinie (kaldt 829-20) er vist i figur 13. Medier fra 30 positive kolonier af linie 829-20 viste konsekvent højere aktivitet ved det chromogene substrat for APC end kontrolmedierne gjorde, hvilke medier var blevet inkuberet DK 175183 B1 46 med ikke-transficerede 293-celler i den samme tidsperiode (10 dage).

Tabel 3 5 Forbigående ekspression af aktiveret protein C (ELISA)

Protein C

Cellelinie ng/ml i medie BHK 2,7 10 293 30

Eksempel 7

Modifikation af protein C-processeringsstedet A. Stedspecifik mutagenisering 15

For at forøge processeringen af enkeltkædet protein C til den dobbeltkædede form blev to yderligere argininrester indført i proteinet, hvilket resulterede i et spaltnings-sted, som bestod af 4 basiske aminosyrer. Det fremkomne 20 mutantforstadie af protein C blev betegnet PC962. Det indeholder sekvensen Ser-His-Leu-Arg-Arg-Lys-Arg-Asp ved spaltningsstedet. Processering ved Arg-Asp-bindingen resulterer i et tokædet protein C-molekyle.

25 Mutantmolekylet blev frembragt ved at ændre det klonede cDNA ved stedspecifik mutagenisering (stort set som beskrevet af Zoller og Smith, DNA, 3^: 479-488, 1984, for to-primermetoden) under anvendelse af det mutagene oligo-nukleotid ZC962 (5'AGTCACCTGAGAAGAAAACGAGACA3'). Plasmid 3 0 p594 blev fordøjet med Sst I, og det ca. 87 bp lange fragment blev klonet i M13mpll, og der blev isoleret en-keltstrenget template-DNA. Efter mutagenisering blev en korrekt klon identificeret ved sekventering. Den replika- 47 DK 175183 B1 tive form af DNA blev isoleret, blev fordøjet med Sst I, og protein C-fragmentet blev indsat i p594 behandlet med Sst I. Kloner, som havde fået Sst I-fragmentet indsat i den ønskede orientering, blev identificeret ved restrik-5 tionsenzymkortlægning. Den fremkomne restriktionsvektor blev betegnet pDX/PC962 (figur 14).

B. Ekspression og karakterisering af protein 0.

10 Plasmid pDX/PC962 blev cotransficeret i tk" BHK-celler med pSV2 -DHFR (Subramani et al.. Mol. Cell Biol. 1_: 854- 864, 1981) ved calciumphosphatproceduren (stort set som beskrevet af Graham og van der Eb, se ovenfor). De trans-ficerede celler blev dyrket i Dulbecco's modificerede 15 Eagle's medium (MEM) som indeholdt 10% føtal kalveserum, IX PSN antibiotika-blanding (Gibco 600-5640), 2,0 mM L- glutamin og vitamin K (5 μg/ml). Cellerne blev selekteret i 250 nM methotrexat (MTX) i 14 dage, og de fremkomne kolonier blev screenet ved immunofilteranalyse (eksempel 20 6) . Seks af de mest intenst reagerende kolonier blev op samlet ved "cylinderkloning" og dyrket individuelt i 10 cm plader. Da kulturerne var næsten sammenflydende blev protein C-produktionsniveauerne målt ved ELISA. Resultaterne er anført i tabel 4.

25 DK 175183 B1 48

Tabel 4

Celleantal ELISA

Klon (x 10~7) (ng/ml) pq/celle/dag 962-1 1,1 2500 2,20 5 -2 0,8 1250 1,56 -3 1,2 1350 1,12 -4 1,2 550 0,46 -5 1,2 1550 1,30 -6 1,2 950 0,80 10

Klonen BHK/962-1 blev dyrket i storskalakultur og adskillige hundrede mikrogram, protein C blev oprenset ved affinite tskroma tograf i på en søjle, som var fremstillet ved at koble 7 mg polyklonalt fåreantistof mod human protein 15 C til 2 g CNBr-aktiveret Sepharose 4B (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) . Celledyrkningsmedie blev sat på søjlen, søjlen blev vasket med 100 ml TBS, og protein C'et blev elueret med TBS, som indeholdt 3M KSCN eller med en pH

11,5 puffer. Western-blot analyse viste, at ca. 95% af 20 det muterede protein C var i to-kædeformen, hvilket skal sammenlignes med, at der fra BHK-celler transficeret med den native sekvens opnåedes ca. 20% protein C i den tokædede form.

25 Protein C i milligrammængder blev oprenset fra enten stabile BHK-cellekloner, som udtrykte PC962-mutantprotein eller stabile 293-cellekloner, som udtrykte vildtypepro-tein C (p594-transficerede celler), under anvendelse af en monoklonal antistofsøjle, som var specifik for den 30 calciuminducerede konformation af protein C. Der blev sat cellekulturmedier på søjlen i nærværelse af 5 mM CaCl2, søjlen blev vasket med TBS, som indeholdt 5 mM CaCl2, og protein C blev elueret med TBS, som indeholdt 10 mM EDTA.

49 DK 175183 B1

Anvendelsen af denne oprensningsmetode muliggjorde oprensning af fuldstændig aktiv protein C uden udsættelse for denaturerende betingelser. Det oprensede protein C blev analyseret ved SDS/PAGE efterfulgt af sølvfarvning, 5 og det blev vist at være mere end 90% rent.

Det BHK-producerede PC962-protein blev analyseret for dets evne til at blive aktiveret til en form, som både udviste amidolytisk aktivitet og antikoagulerende aktivi-10 tet. Af finitetsoprensede proteinprøver blev udtømmende dialyseret mod TBS, blev derefter aktiveret ved inku-bering ved 37°C i 1 time med 0,1 volumen 1 enhed/ml Pro-tac C (American Diagnostica). Amidolytisk aktivitet blev målt ved at tilsætte delmængder af aktiveringsblandingen 15 til 100 μΐ 1 mM protein C-substrat (Spectrozyme PCa, American Diagnostica) i en mikrotiterbrønd og måle ændringen i A405 med tiden under anvendelse af en mikrotiterpla-deaflæser. Det aktiverede protein C's antikoagulerende aktivitet blev målt som beskrevet af Sugo et al. (se 20 ovenfor). Det blev vist, at det affinitetsoprensede PC962-protein var fuldt aktivt i både den amidolytiske analyse og antikoagulerings-analysen. Eluering fra antistofsøjlen med pH 11,5 puffer viste sig at give et protein med en højere aktivitet end der blev opnået, når der 25 anvendtes eluering med 3 M KSCN.

Kloncellelinier fra transficeringen af BHK-celler med pDX/PC962 blev også isoleret ved en fremgangsmåde med begrænset fortynding. En plade med MTX-selekterede kolo-30 nier (ca. 300 kolonier) blev trypsinbehandlet, talt og genudpladet i mikrotiterbrønde med et gennemsnit på 0,5 celler/brønd. Disse blev dyrket i selektive medier, som indeholdt 250 nM MTX. Ca. 50% af brøndene indeholdt kolo- DK 175183 B1 50 nier. Brønde, som indeholdt identificerbare kolonier (diameter 1-2 mm) blev ved ELISA-analyseret for protein C-niveau i medierne. Til denne analyse blev der tilsat frisk medium til alle brøndene, brøndene blev inkuberet i 5 75 minutter, hvorefter mediet blev fjernet og analyseret.

5 kolonier, som i løbet af 75 minutter gav akkumuleringer på mere end 50 ng/ml (svarende til over 1000 ng/ml/dag) blev delt ud i 10-cm plader til storskaladyrkning. Protein C-produktionsniveauerne for disse kloner lå fra 1,1 10 til 2,8 pg/celle/dag.

Der blev konstrueret et andet plasmid, betegnet PC962/229, ved at indsætte PC962-CDNA'et i plasmidet Zem229. Zem229 er en pUC18-baseret ekspressionsvektor, 15 som indeholder et unikt Barn HI-restriktionssted til indsættelse af fremmed DNA mellem muse-metallothionein-I-promotoren og SV40-transkriptionsterminatoren. Zem229 indeholder også en ekspressionsenhed med den tidlige .

SV40-promotor, musedihydrofolatreduktasegenet og SV40-20 terminatoren. Et Eco RI-fragment, som indeholdt PC962-cDNA'et fra pDX/PC962, blev sammen med syntetiske Eco RI-Barn HI-oligonukleotidadaptorer ligeret til Zem229, som var blevet skåret med BamHI og behandlet med phosphatase.

Den fremkomne vektor er PC962/229, hvilket er illustreret 25 i figur 14.

BHK-celler blev transficeret med plasmid PC962/229 ved calciumphosphatmetoden. Cellerne blev dyrket i Dulbecco's MEM, som indeholdt 10% føtal kalveserum og 5 pg/ml vita-30 min K. Ved 48 timer var det forbigående ekspressionsniveau for denne transfektion ca. 25 ng/ml. Efter 2 dage blev de transficerede celler delt ud i selektive medier, som indeholdt 250 nM MTX, og de blev dyrket i yderligere 51 DK 175183 B1 14 dage. Tre plader fra denne transfektion, som hver indeholdt ca. 200 kolonier, blev screenet ved immunofilteranalysen, og 24 af de mest intenst reagerende kolonier blev opsamlet ved "cylinderkloning11. Disse blev dyrket 5 individuelt i 10 cm plader, og deres protein C-pro- duktionsniveauer blev målt. Kolonier, som frembragte fra 1,1 til 2,3 pg/celle/dag, blev anvendt til tilvejebringelsen af stabile protein C-producerende cellelinier.

10 Ekspressionsvektor pDX/PC962 og plasmid pKO-neo blev cotransficeret ind i 293-celler ved calciumphosphat-metoden. Efter 48 timer blev de transficerede celler delt ud i medier, som indeholdt 500 pg/ml G418. Efter 10 dage i selektive medier blev immunofilteranalyserne udført, og 15 der blev opsamlet to kloner ved "cylinderkloning". Prote in C-produktionen fandtes at ligge på fra 1 til 2 pg/celle/dag. Kulturerne blev opskaleret, og protein C blev oprenset ved immunoaffinitetkromatografi. Over 95% af protein C fandtes at være i den tokædede form.

20

Strukturen af 962-mutantproteinet frembragt ud fra BHK-og 293-celler blev sammenlignet med strukturen af vildty-peprotein C fra 293-celler og fra plasma. SDS/PAGE-analyse efterfulgt af sølvfarvning viste, at alle de re-25 kombinerede proteiner indeholdt tunge og lette kæder, som vandrede sammen med kæderne i plasmaproteinet. Det vild-typeprotein C, som blev syntetiseret i 293-celler, indeholdt en væsentlig mængde (ca. 20%) enkeltkædet, ikke-processeret protein med en molekylvægt på 66.000, hvor-30 imod mutantproteinet, som blev frembragt i begge celletyper, stort set var fuldstændig processeret til to kæder. Analyse af den N-terminale sekvens viste, at både den lette og den tunge kæde i det rekombinerede vildtypepro- DK 175183 B1 52 tein og BHK/PC962-mutantproteinerne blev processeret korrekt. Gamma-carboxyleringsgraden af de rekombinerede proteiner blev målt i 2 forskellige ELISA-systemer. Det første system genkender både den gamma-carboxylerede form og 5 den ikke-carboxylerede form af proteinet, medens det andet system udnytter specifikke antistoffer, som kun genkender protein C, der har været udsat for en gla-induceret konformationsændring i nærværelse af calcium. Analyser viste, at ca. 60% af det rekombinerede protein 10 c, som blev frembragt i BHK-celler, og 90-95% af det, der blev frembragt i 293-celler, var tilstrækkelig gamma-carboxyleret til at blive genkendt af de specifikke antistoffer.

15 De tre rekombinerede proteiner blev også analyseret for amidolytisk og antikoagulerende aktivitet, og resultaterne blev sammenlignet med aktiviteten af plasmaprotein C.

PC962 fra BHK-celler og vildtype protein C fra 293-celler viste begge fuld amidolytisk aktivitet. I antikoagule-20 ringsanalysen havde protein C fra BHK-celler stort set den samme specifikke aktivitet som plasmaprotein C, hvorimod både vildtypeproteinet og PC962-mutantproteinet fra 293-celler konsekvent viste 40% større specifik aktivitet .

25

C.Modifikation af processeringsstedet i aktiveret protein C

En DNA-sekvens, som kodede for et aktiveret protein C-30 forstadie med følgende sekvens i processeringsstedet Arg-Arg-Lys-Arg, blev konstrueret ved at mutagenisere vildty-peprotein C-sekvensen. Den fremkomne sekvens var analog 53 DK 175183 B1 med sekvensen for PC962, men manglede den del, som kodede for aktiveringspeptidet.

Den protein C-sekvens, som var tilstede i plasmid p594, 5 blev ændret ved en enkelt mutagenisering til fjernelse af codon'erne for aktiveringspeptidet og indføjelse af Arg-Arg-codon'er i processeringsstedet. Mutageniseringen blev udført på det 870 bp lange Sst I-fragment fra p594 stort set som beskrevet i eksempel 7A under anvendelse af et 10 oligonukleotid med sekvensen 5' CGC AGT CAC CTG AGA AGA AAA CGA CTC ATT GAT GGG 3 ' .

Den mutageniserede sekvens blev anvendt til at konstruere ekspressionsvektor pDX/PC1058, og vektoren blev cotrans-15 ficeret i BHK-celler, som illustreret i eksempel 7B. Proteinet blev oprenset på en søjle med polyklonalt antistof og elueret med pH 11,5 puffer.

Aktiviteten af "1058-proteinet" blev sammenlignet med 20 aktiviteten af aktiveret plasma protein C og aktiveret PC962. Plasmaprotein C og PC962 (5 pg/ml) blev aktiveret ved behandling med 1/10 volumen Protac C (American Diagnostica) i 2 timer. Antikoaguleringsaktivitet blev analyseret ved at kombinere 50 μΐ humant plasma med 50 μΐ 25 aktiveret protein C og inkubere blandingerne ved 38°C i 150 sekunder. Til denne blanding tilsattes 50 μΐ aktiveret cephaloplastin (American Scientific Products, McGaw Park, IL) , og blandingen blev inkuberet ved 37°C i 300 sekunder. 100 μΐ 20 mM CaCl2 blev tilsat, og størk-30 ningstiden blev noteret. Resultaterne er vist i figur 15.

DK 175183 B1 54

Eksempel 8

Anvendelse af faktor VII-og prothrombinpræpropeptider til secernering af protein C 5 I et forsøg på at opnå højere udbytte af korrekt proces-seret protein C blev protein C-præpropeptidet udskiftet med faktor VII-præpropeptidet. Disse hybridkonstruktioner blev derefter indført i egnede ekspressionsvektorer og 10 overført til pattedyrcellelinier.

Et cDNA, som koder for faktor VII, er blevet beskrevet (Hagen et al., Proc. Natl.Acad.Sci.USA 83: 2412-2416, 1986) . Klon HVII565 omfatter den kodende sekvens for et 15 38 aminosyrer langt præpropeptid. Denne kodende sekvens blev isoleret som et Eco RI-Hha i-fragment på 140 bp.

Protein C-sekvensen blev isoleret fra p594 ved delvis spaltning med Sst I og fuldstændig fordøjelse med Eco RI.

20 Der blev isoleret et 1540 bp langt fragment, som strækker sig fra Sst I-restriktionsstedet ved codon +7 til Eco RI-restriktionsstedet 3' for cDNA'et.

Faktor VII- og protein C-sekvenserne blev derefter sam-25 menføjet ved hjælp af en oligonukleotidlinker, som fuldender den kodende sekvens for aminosyrerne -3 til -1 i faktor VII-præpropeptidet og aminosyrerne 1-8 i protein C. Linkeren blev konstrueret ud fra to oligonukleotider med sekvenserne 5 ’ CCGGCGCGCCAACTCCTTCCTGGAGGAGCT 3' og 30 5' CCTCCAGGAAGGAGTTGGCGCGCCGGCG 3'. De to oligonukleo tider blev anneleret og blev i en fireparts-ligering fø-jet sammen med faktor Vll-præprosekvensen, protein C cDNA og pUC9, som var blevet spaltet med Eco RI og behandlet 55 DK 175183 B1 med bakteriel alkalisk phosphatase. Det ligerede DNA blev anvendt til at transformere E coli (JFI 101) . Der blev fremstillet plasmid-DNA, og det blev screenet for tilstedeværelse af et 1710 bp langt Eco Ri-fragment. En korrekt 5 klon blev betegnet p7/C-10.

Faktor VII/protein C-fusionen blev udtrykt i 293-celler.

Eco RI-indføj elsen fra plasmid p7/C-10 blev ligeret til Eco RI-fordøjet pDX. Den fremkomne ekspressionsvektor 10 blev anvendt til at cotransficere 293-celler som ovenfor beskrevet. Ekspressionsniveauer efter 48 timer blev analyseret ved hjælp af ELISA og sammenlignet med værdierne for 293-celler transficeret med vildtypeprotein C-ekspressionskonstruktionen samt ikke-transficerede cel-15 ler. Resultaterne er angivet i tabel 5.

Tabel 5

Protein ng/ml

Faktor VII/protein C 123 20 Vildtypeprotein C 187

Kontrol <1

Prothrombinledersekvensen blev konstrueret ud fra de i tabel 6 anførte oligonukleotider og blev sammenføjet med 25 den kodende sekvens for modent protein C. Oligonukleoti-derne blev kinasebehandlede ved at kombineret 50 ng af hvert oligonukleotid med 1 enhed T4-kinase i 20 μΐ kina-sepuffer, som indeholdt 1 mM ATP. Reaktionen fik lov til at forløbe ved 37°C i 30 minutter, hvorefter blandingen 30 blev opvarmet til 65°C i 10 minutter for at inaktivere kinasen.

DK 175183 B1 56

Tabel 6 ZC 1323 5' CCT CCA GGA AGG AGT TGG CTC GCC GGA 3' ZC 1324 5' CGC GTC CGG CGA GCC AAC TCC TTC CTG GAG 5 GAG CT 3’

ZC 1378 5' AAT TCC ACC ATG GCT CAT GTG AGA GGA CTG CAA

CTG CCT GGC TGC CTG GCT CTG GCT GCT CTG TGC AGC CTG GTG CAC AGC CAG CAT GTG TTC CTG GCT CCT CAG CAG GCC AGG AGC CTG CTG CAA 3' 10

ZC137 9 5' CGC GTT GCA GCA GGC TCC TGG CCT GCT GAG GAG

CCA GGA ACA CAT GCT GGC TGT GCA CCA GGC TGC ACA

GAG CAG CCA GAG CCA GGC AGC CAG GCA GTT GCA GTC

CTC TCA CAT GAG CCA TGG TGG 3' 15

Prothrombinlederen blev derefter samlet. 50 ng M13mpl9 behandlet med Eco RI og Sst I blev kombineret med 2,5 ng af hver af de kinasebehandlede oligonukleotider i 20 μΐ lx ligasepuffer, som indeholdt l mM ATP og 4 enheder T4-20 ligase. Blandingen blev inkuberet ved 15°C i 48 timer og blev anvendt til at transformere kompetente E.coli JM101-celler. Der blev udvalgt en klar plaque, og fag-DNA blev præpareret. DNA-sekventeringen bekræftede, at den korrekte sekvens var blevet konstrueret.

25

Prothrombinlederen blev derefter sammenføjet med protein C-sekvensen. Der blev præpareret RF-DNA fra den fag-klon, som indeholdt den syntetiserede leder, og der blev isoleret et 150 bp langt Eco RI-Sst I-fragment. Plasmid p594 30 blev fordøjet fuldstændigt med Eco RI og blev fordøjet delvis med Sst I, og det 1540 bp lange protein C-fragment blev udvundet. Disse fragmenter blev ligeret med pDX behandlet med Eco RI, og ligeringsblandingen blev anvendt 57 DK 175183 B1 til at transformere kompetente E.coli HBlOl-celler. Plasmid-DNA blev isoleret fra transformerede kolonier og blev analyseret ved restriktionsfordøjelse for at bekræfte, at fragmenterne var blevet samlet i den korrekte ori-5 entering.

Af ovennævnte vil det fremgå, at omend der er blevet beskrevet specifikke udførelsesformer for opfindelsen med henblik på illustrering af opfindelsen kan der foretages 10 forskellige modifikationer uden at afvige fra opfindelsens ånd og rækkevidde. Opfindelsen er derfor kun begrænset af de tilhørende krav.

Claims (5)

1. DNA-sekvens, der koder for et protein med i alt væsentligt samme biologiske aktivitet som human protein C 5 eller aktiveret human protein C, kendetegnet ved, at sekvensen yderligere koder for aminosyresekvensen (Ri)n-R2-R3-R4, hvor Ri, R2, R3 og R4 er Lys eller Arg og n=0, 1, 2 eller 3, ved spaltningsstedet mellem den lette kæde og den tunge kæde. 10

2. DNA-sekvens ifølge krav l, kendetegnet ved, at aminosyresekvensen ved spaltningsstedet mellem den lette kæde og den tunge kæde er Arg-Arg-Lys-Arg.

3. Ekspressionsvektor, som er i stand til at integrere i pattedyrværtscelle-DNA, kendetegnet ved, at ekspressionsvektoren omfatter en promotor, der nedstrøms følges af en DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 1-2, hvilken DNA-sekvens nedstrøms følges af et 20 polyadenyleringssignal, hvorhos transkription af DNA-sekvensen styres af promotoren.

4. Pattedyrceller, kendetegn et ved, at de er transficeret med en ekspressionsvektor ifølge krav 3. 25

5. Fremgangsmåde til fremstilling af et protein, som i alt væsentligt har samme struktur og/eller biologiske aktivitet som aktiveret human protein C, kendetegn et ved, at en ekspressionsvektor ifølge 30 krav 3 indføres i en pattedyrværtscelle, at pattedyrværtscellen dyrkes i et egnet medium, og at det proteinprodukt, som kodes af ekspressionsvektoren og produceres af pattedyrværtscellen, isoleres.