DK173138B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af en jerndextranforbindelse, jerndextranforbindelse fremstillet efter fremgangsmåden, farma - Google Patents

Description

i DK 173138 Bl

OPFINDELSENS BAGGRUND 0(3 KENDT TEKNIK

Anæmi forårsaget af jernmangel er blevet beskrevet som på global basis værende en af de mest almindelige -muligvis den mest almindelige - patologiske tilstand 5 hos mennesker. Endvidere er jernmangelanæmi et problem i det moderne landbrugs opdrætning af svin og andre husdyr, med mindre der tages særlige profylaktiske foranstaltninger.

Selvom jernmangelanæmi ofte kan forhindres eller 10 kureres ved oral administrering af jernholdige præparater, foretrækkes det i mange tilfælde at anvende parenteralt administrerbare jernpræparater til undgåelse af variationer i biotilgængeligheden ved oral administrering, samt for at sikre en effektiv admini-15 strering.

Derfor har der i mange år stået jernholdige præparater til parenteral anvendelse, dvs. subkutan, intramuskulær eller intravenøs administrering, til rådighed for læger og dyrlæger.

20 Forskellige jernholdige stoffer har været fore slået eller anvendt som bestanddele i parenteralt injicerbare præparater mod jernmangelanæmi såsom en saccharose-ferrioxid-forbindelse. Imidlertid er de mest almindeligt accepterede præparater i dag sådanne, som 25 omfatter et kombineret produkt af ferrioxyhydroxid (eller ferrihydroxid) i forbindelse med dextran, idet sådanne præparater er mindre toksiske end f.eks. ferrisaccharater. Dextran er et polymert carbonhydrat, som dannes af mikroorganismen Leuconostoc mesenteroi-3 0 des.

Et jernholdigt præparat til parenteral injektion skal selvsagt tilfredsstille adskillige fordringer, " herunder at jernet er let tilgængeligt for hæmoglobin syntese, fravær af lokale eller systemiske bivirkninger 35 samt stabilitet ved lagring muliggørende en tilfreds- DK 173138 B1 2 stillende holdbarhed ved stuetemperatur.

Jemdextranpræparater til behandling af anæmi har været forhandlet i årtier, og mange variationer såvel i fremstillingsprocessen som med hensyn til udvælgelsen 5 af udgangsmaterialer har været foreslået med henblik på at forbedre stabiliteten af sådanne præparater og formindske mængden af bivirkninger, som fås ved deres administrering.

Som eksempler på patentskrifter, som har relation 10 til disse problemer, kan nævnes følgende: US patent 2.885.393 (1959) beskriver en grund læggende fremgangsmåde til fremstilling af et jemdex-trankompleks, i hvilket den gennemsnitlige molekylvægt af dextranen er fra 30.000 til 80.000 Daltons (Da) 15 eller lavere. Hvorvidt disse komplekser er egnede til human terapi fremgår ikke af patentbeskrivelsen.

US patent RE. 24.642 (1959) omfatter en detaljeret forklaring af de krav, som stilles til en j emopløsning til intramuskulær injektion, hvilket skrift gennem 20 henvisningen skal betragtes som hørende til nærværende beskrivelse. Patentet vedrører et praktisk taget ikke-ionisk kompleks af ferrihydroxid med en dextran med et gennemsnitligt grænseviskositetstal (intrinsic viscosity) ved 25°C på ca. 0,025 til ca. 0,25 så vel som en 25 fremgangsmåde til fremstilling af et sådant kompleks ved at bringe en dextran som beskrevet i kontakt med ferrihydroxid dannet in si tu ved omsætning mellem et ferrisalt og en alkalibase. Der gives ingen oplysning om den ønskede molekylvægt for dextranen, og der 30 foreslås ingen kemisk modifikation af dextranen, bortset fra en partiel depolymerisation.

US patent 3.093.545 (1963). Dette patentskrift giver nogle detaljer såsom temperaturer og pH-værdier ved en forbedret metode til fremstilling af et produkt, 35 som tilsyneladende i høj grad ligner det, der frem- DK 173138 B1 3 stilles i det sidstnævnte patent ovenfor.

GB patent 1.200.902 (1970) beskriver at det, i modsætning til at fremstille ferrihydroxidet in situ, er fordelagtigt først at danne ferrihydroxidet under 5 regulerede betingelser, da et sådant ferrihydroxid let danner komplekser med dextraner. Det anføres, at ikke alene partielt depolymer i serede dextran med en vægt-middelmolekylvægt i området mellem f.eks. 500 og 50.000 Daltons, fortrinsvis i området 1.000-10.000 Daltons, 10 men også modificerede former eller derivater af dextran, såsom hydrogenerede dextraner eller oxiderede dextraner eller dextraner behandlet med alkali, kommer i betragtning som teoretiske muligheder. Imidlertid er de eneste dextraner, som nævnes specifikt, oxiderede 15 dextraner med en gennemsnitlig molekylvægt på henholdsvis 3.000 og 5.000 Daltons. Ferri-hydroxidet fremstilles før kontakten med dextranen. Dette betyder, at det resulterende produkt består af ferrioxyhydroxid, hvorpå dextranen danner et overtræk, i modsætning til 20 de mere homogene produkter, der dannes ved udfældning af ferrihydroxidet in situ, dvs. under tilstedeværelse af dextranen.

DK patent 117.730 (1970) vedrører en fremgangsmåde, hvori hydrogeneret dextran med en molekylvægt 25 mellem 2.000 og 10.000 Daltons omsættes med ferrihydroxid i vandigt medium. Den gennemsnitlige molekylvægt af den anvendte dextran i udførel seseksempi erne er ikke anført. Imidlertid er grænseviskositetstallet angivet til ca. 0,05, hvilket kan svare til en gennemsnitlig 30 molekylvægt på ca. 5.000 Daltons.

DK patent 122.398 (1972) beskriver også anvendelse af hydrogeneret dextran til fremstilling af konpleks-- forbindelser med ferrihydroxid, og det forklares, at der fås en væsentligt lavere toxicitet, end når der 35 anvendes ikke-hydrogeneret dextran. Patentet angår en DK 173138 B1 4 fremgangsmåde, ved hvilken fugtig ferrihydroxid blandes med tør hydrogeneret dextran, og efter en eventuel tilsætning af citronsyre eller citrat opvarmes blandingen og renses.

5 US patent 3.697.502 (1972) beskriver en fremgangs måde til fremstilling af et jerndextranpræparat, i hvilken der sættes citronsyre til dextranen og foretages en samtidig tilsætning af alkalimetalhydroxidop-løsning og ferrichloridopløsning. Den gennemsnitlige 10 molekylvægt af dextranen er mellem 3.000 og 20.000 Daltons. Dextranen, som anvendes i udførelseseksemplerne, har en molekylvægt på henholdsvis 7.000 og 10.000 Daltons.

DK patent 129.353 (1974) angår en analog frem- 15 gangsmåde til fremstilling af et ferrihydroxiddex-tranderivat med en gennemsnitlig molekylvægt for dextranen på højst 50.000 Daltons, og endegrupperne på dextranens polymerkæder er modificeret ved omdannelse af den terminale reducerende anhydroglycoseenhed til en 20 tilsvarende carboxyl syregruppe. Selv om de grænser, som anføres for dextranens molekylvægt, er meget brede, nemlig fra 500 til 50.000 Daltons, fortrinsvis fra 1.000 til 10.000 Daltons, er der kun eksenplificeret en dextran med en gennemsnitlig molekylvægt på 5.000 25 Daltons.

DK patent 129.942 (1974) har lighed med det sidste af de ovennævnte DK patenter og angår fremstilling af ferrihydroxidkomplekser med dextran-heptonsyre eller dextrin-heptonsyre. Heptonsyreme fremstilles ved 30 hydrolyse af de tilsvarende cyanhydrider.

US patenterne 4.827.945 (1989) og 5.102.652 (1992) vedrører begge superparamagnetiske metaloxider, såsom jernoxider overtrukket med eller associeret med polymere materialer, såsom dextran. Polymeren bringes i 35 kontakt med en blanding af metaloxider, som foreligger DK 173138 B1 5 i to forskellige oxidationstrin til dannelse af et superparamagnetisk kombineret produkt, der derpå oxideres for at overføre hele metaloxidmængden til det højeste af nævnte oxidationstrin. Produktet er særligt 5 egnet som kontrastmiddel ved magnetisk resonans billeddannelse ved medicinsk diagnose. Imidlertid nævnes det også, at det kan anvendes til behandling af jernmangel anæmi. Molekylvægten af polymerene, herunder carbon-hydrater såsom dextran, er fortrinsvis fra 5.000 til 10 250.000 Daltons.

På trods af, at der har været foretaget mange forsøg på at forbedre jerndextranpræparater til behandling af anæmi, som det afspejles i ovenstående patenter, har de præparater, som fremstilles i over-15 ensstemmelse med teknikkens stade, endnu nogle ulemper.

Dette skyldes, at hos visse patienter kan præparaterne give forsinket hypersensitivitet eller alvorlige anafylaktiske bivirkninger, som medfører f.eks. dyspnoea, hypotension, chok og død. Også andre toxiske 20 reaktioner kan forekomme.

Endvidere er mange af de hidtil kendte præparater ikke i stand til at opfylde de gældende krav til stabilitet. Manglende stabilitet kan give sig udtryk som gelatinering af væsken eller udfældning af jem-25 hydroxid eller -oxyhydroxid.

Ydermere manifesterer den fremmende virkning af de i handlen tilgængelige jerndextranpræparater på hæmoglobinsyntesen i patienter, der modtager nævnte præparater, sig temmelig sent efter administreringen, og 30 genetablering af ønskede hæmoglobinniveauer finder sted langsommere end ofte ønsket.

SAMDØBENDE TEKNIK

Samløbende danske patentansøgning 420/98 beskriver 35 en opfindelse, ved hjælp af hvilken visse af de oven- DK 173138 B1 6 nævnte ulemper kan overvindes. Nævnte opfindelse er baseret på den erkendelse, at mange af de specificerede ulemper er forbundet med tilstedeværelsen af utilstrækkelig hydrolyseret dextran med relativ høj mo-5 lekyl vægt i den dextran der anvendes som udgangsmateriale, såvel som tilstedeværelse deri af saccharider med lav molekylvægt.

Denne erkendelse anvendes til at producere, blandt andet ved hjælp af membranteknikker, en jemdextranfor-10 bindel se, som er kendetegnet ved, at den omfatter hydrogeneret dextran med en vægtmiddelmolekylvægt (Mw) mellem 700 og 1.400 Da, fortrinsvis ca. 1.000 Da, en antalsmiddelmolekylvægt (Mn) på 400 til 1.400 Da, og hvori 90 vægt% af dextranen har molekylvægte mindre end 15 2.700 Da, og Mw af den 10 vægt% fraktion af dextranen, som har de største molekylvægte, er under 3.200 Da i stabil association med ferrioxyhydroxid.

KORT BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

20 Selvom produktet ifølge den ovenfor citerede danske patentansøgning 420/98 repræsenterer en betydelig forbedring med henblik på at sænke toksiske reaktioner og reducere tendensen til at forårsage hypersensitivitet eller anafylaktiske sideeffekter og 25 ligeledes involverer forbedringer med henblik på stabilitet, er der stadig et behov for at kontrollere middelmolekylvægten af den endelige jemdextranfor-bindelse og således tilgængeligheden af jernet for hæmoglobinsyntese i dyr eller mennesker.

30 Hvis en jerndextranforbindelse med et jernindhold på f.eks. 15 - 45 vægt% fremstilles med anvendelse af en dextran med en vægtmiddelmolekylvægt på ca. 1.000 Da, i hvilken dextran hovedsageligt alle reducerende aldehydgrupper er blevet hydrogeneret til alkohol-35 grupper, vil den tilsyneladende topmolekylvægt (Mp) DK 173138 B1 7 typisk være ca. 140.000 Da.

Det er ønskeligt, at være i stand til at fremstille jemdextranforbindelser med lavere molekylvægte og forbedret stabilitet, særligt for at tilvejebringe 5 forbindelser, hvori jernet er let tilgængeligt for hæmoglobinsyntese i dyr eller mennesker.

Den foreliggende opfindelse er baseret på den erkendelse, at en stabil jerndextran med forholdsvis lav molekylvægt kan frembringes, hvis de reducerende 10 aldehydgrupper på den hydrolyserede dextran før reaktionen med jernforbindelsen kun er delvist hydrogeneret til alkoholgrupper, og i det væsentlige alle de tilbageværende aldehydgrupper oxideres til carboxyl syregrupper. Molekylvægten af den dannede jerndextran, når 15 dextranen har undergået sådan en forbehandling, er væsentligt lavere end molekylvægten af en jerndextran produceret med anvendelse af en tilsvarende hydrolyseret dextran, som kun er blevet forbehandlet med en, muligvis fuldstændig, hydrogenering. Ved at justere 20 forholdet mellem mængden af reducerende grupper, der hydrogeneres, og mængden af reducerende grupper, der oxideres, er det muligt at påvirke middelmolekylvægten af den resulterende jemdext ranforbindelse. Imidlertid, vil jemdext ranforbindelsen ikke blive tilstrækkelig 25 stabil, hvis andelen af oxiderede grupper i den dextran, der anvendes som udgangsmateriale, er for høj.

Det har vist sig, at for at opnå et stabilt produkt må mængden af reducerende grupper i dextranen før oxidering ikke overstige en værdi, der svarer til 15 30 vægt%.

Således angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af en stabil jemdex-tranforbindelse med en relativ lav molekylvægt og en snæver molekylvægtsfordeling, i hvilken fremgangsmåde 35 molekylvægten af en dextran reduceres ved hydrolyse, og DK 173138 B1 8 funktionelle aldehydendegrupper deraf omdannes til alkoholgrupper ved hydrogenering, den hydrogenerede dextran som en vandig opløsning kombineres med mindst et vandopløseligt ferrisalt, base tilsættes til den 5 resulterende opløsning for at danne ferrihydroxid, og den resulterende blanding opvarmes for at omdanne ferrihydroxidet til ferrioxyhydroxid som en associationsforbindelse med dextranen, hvilken fremgangsmåde er kendetegnet ved, at hydrogeneringen kun er delvis 10 idet der dog højest tilbagebliver 15 vægt% reducerende sukker, beregnet på den totale mængde af carbohydrater og nævnte dextran, før den kombineres med ferrisaltet, og efter den underkastes hydrogenering, underkastes en oxidation, idet nævnte hydrogenering og oxidation 15 udføres til opnåelse af dextraner med i det væsentlige alle aldehydgrupper omdannet til alkohol og carboxyl-syregrupper.

Således udføres hydrogeneringen før oxidationen som en delvis hydrogenering efterladende en del af 20 aldehydgruppeme på dextranen ureagerede, og oxidationen foretages efterfølgende for at frembringe en i det væsentlige fuldstændig omsætning af nævnte del af aldehydgruppeme til carboxylsyregrupper.

Det antages, at der ved denne rækkefølge af 25 hydrogenering og oxidation opnås en fordelagtig fordeling af de resulterende alkohol- og carboxylsyregrupper, idet ved udførelse af hydrogeneringen som den første operation, finder den alkoholdannende hydrogenering primært sted i aldehydgrupper på relativt 30 lavmolekylære dextranmolekyler, hvorimod aldehydgrupperne på de mere højmolekylære dextraner omsættes i oxidationstrinet derefter, hvilket betyder, at de ved oxidation dannede carboxylsyregrupper i en stor grad vil være indført i dextranen med højere molekylvægt.

35 Denne fordeling af alkoholgruppeme og carboxyl- DK 173138 B1 9 syregrupperne på henholdsvis den lavere molekylvægt-fraktion og den højere molekylvægt fraktion er fordelagtig, fordi det forventes, at stabiliteten af det resulterende produkt vil være bedre, end hvis alkohol-5 og carboxylsyregrupperne var fordelt tilfældigt, og særligt bedre end hvis carboxylsyregrupperne primært var til stede på den lavere molekylvægtsfraktion af dextranen.

Imidlertid er denne opfindelse ikke begrænset til 10 nogen specifik teori om grunden til den tilfredsstillende stabilitet af produktet fremstillet ved nævnte foretrukne udførelsesform.

I relativt lavmolekylære dextraner som de, der primært kommer i betragtning ifølge den foreliggende 15 opfindelse, er indflydelsen af de terminale grupper (aldehydgrupper hydrogeneret til alkoholgrupper eller oxideret til carboxylsyregrupper) på polymerkædeme betydeligt mere udtalt end i dextraner med højere molekylvægte, idet andelen (på vægtbasis) af funktio-20 nelle terminale grupper er højere. Derfor er det vigtigt, at carboxylsyregrupperne, som ellers kunne bevirke ustabilitet, er til stede på den relativt højmolekylære fraktion af dextranmolekylerne.

Det foretrækkes at udføre hydrogeneringen ved 25 anvendelse af natriumborhydrid i vandig opløsning.

Oxidationen udføres fortrinsvis ved anvendelse af et hypochlorit, fortrinsvis natriumhypochlorit i basisk, vandig opløsning.

Det er vigtigt, at et oxidationsmiddel med en 30 oxiderende kapacitet passende til at omsætte aldehyd-grupperne til carboxylsyregrupper uden at angribe andre steder på dext ranmol ekyleme anvendes. Ved test baseret på NMR-analyse af de resulterende dextraner har det vist sig, at natriumhypochlorit er et passende oxi-35 dationsmiddel med henblik på dette, idet testen in- DK 173138 B1 10 dikerer, at alle oxygenatomer indført ved oxidationen er til stede i carboxyl syregrupperne.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er i princippet ikke begrænset til anvendelse af 5 dextraner med specifikke molekylvægte og molekylvægtfordelinger, imidlertid foretrækkes det at anvende en dextran, som før dannelsen af jerndextranen har en molekylvægt lavere end 7.500 Da. For at opnå et produkt, der ved helhedsbetragtninger betragtes som mest 10 anvendeligt til behandling af jernmangelanæmi, foretrækkes en udførelses form af fremgangsmåden, som er kendetegnet ved, at efter hydrolysen men før foreningen med det vandopløselige ferrisalt, renses dextranen ved hjælp af en eller flere membranprocesser, som anvender 15 en membran med afskæringsværdi (i det følgende betegnet "cut of"-værdi) egnet til at tilbageholde dextran med molekylvægt over 2.700 Da eventuelt efterfulgt af yderligere hydrolyse samt efterfulgt af en eller flere membranprocesser, som anvender membranen med en cut of-20 værdi mellem 340 og 800 Da, hvilken fjerner de mindre molekyler.

En særligt foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden omfatter følgende: fremstilling af en vandig opløsning omfattende den 25 rensede hydrogenerede og oxiderede dextran og i det mindste et vandopløseligt ferrisalt; indstilling af pH af nævnte vandige opløsning til en værdi over 10 ved tilsætning af en base; opvarmning af blandingen til en temperatur over 30 100°C indtil den danner en sort eller mørkebrun, kolloid opløsning, der kan filtreres gennem et 0,45 μτη filter; og yderligere neutralisering, rensning og stabilisering under anvendelse af filtrering, opvarmning og 35 membranprocesser og tilsætning af en eller flere DK 173138 B1 11 stabilisatorer samt eventuelt tørring af opløsningen til opnåelse af den ønskede jemdextranforbindelse som et stabilt pulver. Injektionsvæsker kan fremstilles ved at genopløse dette pulver, indstille pH værdien, 5 sterilisere ved filtrering og påfyldning på ampuller eller vials. Steriliseringen kan også ske ved at autoklavere de fyldte ampuller eller vials.

Alternativt udelades tørreoperationen og der fremstilles en injektionsvæske ud fra den rensede 10 opløsningen uden mellemliggende tørring af denne.

Som forklaret ovenfor er et træk ved opfindelsen justeringen af forholdet mellem hydrogenerede dex-tranaldehydgrupper og oxiderede dextranaldehydgrupper såvel som den totale procentdel af sådanne grupper.

15 Det er væsentligt, at hovedsageligt alle redu cerende grupper i den hydrolyserede dextran, der anvendes som udgangsmateriale, omsættes ved hydrogenering eller ved oxidation. Dette er, fordi en hvilken som helst tilbageværende reducerende gruppe reagerer 20 med ferri forbindelserne, når de kontaktes dermed og danner ferroforbindelser, som ved parenteral administrering er mere toksiske end ferriforbindelser.

Således er en yderligere foretrukket udførelsesform af fremgangsmåden ifølge opfindelsen kendetegnet 25 ved, at oxidationen af den hydrolyserede og hydrogenerede dextran udføres for at nedsætte indholdet af reducerende sukker til ikke over 4 vægt%. Mængden af reducerende sukker i den hydrolyserede dextran før hydrogeneringen er på ingen måde kritisk, og vil typisk 30 være i intervallet 20 - 50 vægt%.

Opfindelsen omfatter ligeledes en jemdextranforbindelse fremstillet ifølge den ovenfor beskrevne fremgangsmåde, hvilken forbindelse er kendetegnet ved, at den tilsyneladende topmolekylvægt (Mp) deraf er 35 50.000 - 150.000 Da, fortrinsvis 70.000 - 130.000 Da, DK 173138 B1 12 mere foretrukket 80.000 - 120.000 Da, og dens jernindhold er 15 - 45 vægt%. Når et vandigt præparat af sådan en jemdextranforbindelse injiceres intramuskulært til en patient, der lider af jernmangel anæmi, kan en 5 positiv påvirkning af hæmoglobinproduktionen observeres tidligere end når en tilsvarende mængde jern injiceres som et præparat baseret på kommercielt tilgængelige jerndextranforbindelser med en tilsyneladende top-molekylvægt på ikke under 150.000 Da.

10 I den foreliggende beskrivelse og i de medfølgende patentkrav henfører indikationerne af molekylvægte til sådanne molekylvægte bestemt ved gelpermeationsch-romatografi.

Stabilitet blev vurderet som fraværet af synlige 15 ugunstige ændringer, såsom geldannelse eller udfældning af produktet efter opvarmning til 70°C eller mere i 10 minutter.

Opfindelsen omfatter endvidere et farmaceutisk præparat til profylakse eller behandling af jemmangel 20 ved parenteral administrering, nævnte præparat er kendetegnet ved, at det omfatter en forbindelse som defineret ovenfor.

Sådanne farmaceutiske præparater omfatter fortrinsvis yderligere et salt af en organisk hydroxysyre, 25 fortrinsvis valgt blandt citrater som stabilisator.

Endelig omfatter opfindelsen anvendelsen af en jemdextranforbindelse som defineret ovenfor til fremstillingen af et parenteralt administrerbart terapeutisk præparat til profylakse eller behandling af 30 jemmangel ved parenteral administrering.

Opfindelsen illustreres nærmere ved hjælp af følgende ikke-begrænsende eksempler.

DK 173138 B1 13

Eksempel 1 (i) Hydrolyse, hydrogenering og oxidation af dextran 2.522 kg hydrolyseret dextran opsamlet som perme-5 alt fra en membran med en cut-off værdi <5.000 Daltons, hydrolyseres ved pH 1,5 ved en temperatur på 95°C.

Hydrolysen følges chromatografisk ved anvendelse af gelpermeationschromatografi (GPC), og den afsluttes ved afkøling, når molekylvægten af det materiale, der 10 hydrolyseres, skønnes at have nået den ønskede værdi, dvs. en vægtmiddelmolekylvægt på 700-1.400 Daltons.

Ved hydrolysen fremkommer lavmolekylær dextran, men der dannes også glucose. Efter afkøling og neutralisation formindskes mængden af glucose og meget 15 lavmolekylære oligomere ved membranprocesser med en cut-off værdi på 340-800 Daltons. Efter denne proces bestemmes indholdet af dextran ved optisk drejning (αίΕ?0 _ 200) til at være 1.976 kg, og mængden af reducerende sukker bestemmes ved anvendelse Somogyi's 20 reagens til at være 32,0 vægt%.

Den reducerende evne nedsættes først ved behandling med natriumborhydrid. Til 939 kg dextran tilsættes 18,4 kg natriumborhydrid ved basisk pH. Ved denne delvise hydrogenering må det antages, at blandt de 25 aldehydgrupper som hydrogeneres, fremhersker de dex-traner, som har relativ lav molekylvægt.

Efter behandlingen med natriumborhydrid bestemmes reduktionsevnen til 6,53 vægt%.

Derefter neutraliseres opløsningen til en pH 30 værdi < 7,0, hvorpå den deioniseres. Middelmolekylvægtene og molekylvægtsfordelingen bestemmes chromatogra-fisk.

35 GPC-analyser viser også, at de ovenstående be- 14 DK 173138 Bl tingelser, nemlig at 90 vægt% af dextranen, har molekylvægte mindre end 2.700 Daltons, og at vægtmiddelmo-lekylvægten (Mw) af den 10 vægt% fraktion af dextranen, som har de største molekylvægte, er under 3.200 Dal-5 tons, er opfyldte.

Mw bestemmes til 1.200, og antalsmiddelmolekylvægten (Mn) er 800 Da.

Derefter udføres oxidation med anvendelse af 10 natriumhypochlorit ved pH 9,5 og ved 50°C. 1.075 1 af en vandig 15 vægt/vol% NaOCl opløsning tilsættes.

Efter færdiggørelsen af. oxidationen bestemmes reducerende sukker til 0,9 vægt%.

Efter oxidationen udføres diafiltrering imod rent 15 vand for at opnå en specifik ledningsevne på 3 mS/cm.

Mængden af dextran på dette trin var 635 kg. NMR-analyse viste, at alle dobbeltbundne oxygenatomer var til stede som carboxylsyregrupper.

20 (ii) Syntese af jerndextran 300 kg dextran fremstillet som ovenfor blandes i form af en 15% opløsning med 300 kg FeCl^, 6H20.

Til den omrørte blanding sættes som en mættet vandig opløsning 250 kg Na2C03 for at opnå pH 3,5, 2 5 hvorpå pH hæves til 11,5 ved anvendelse af 50 1 koncentreret vandig NaOH (27 vægt/volumen%).

Den således opnåede blanding opvarmes til en temperatur over 100eC, indtil den omdannes til en sort, mørkebrun kolloid opløsning, der kan filtreres gennem 30 et 0,45 μττι filter. Opløsningen afkøles, neutraliseres til pH 5,00 med anvendelse af koncentreret saltsyre og filtreres. Opløsningen renses under anvendelse af membranprocesser, indtil chloridindholdet er mindre end 0,68%, beregnet på basis af en opløsning indeholdende 35 5 vægt/volumen% jern.

DK 173138 B1 15

Hvis chloridindholdet i opløsningen er mindre end ønsket til opnåelse af en isotonisk opløsning tilsættes natriumchlorid, og pH indstilles til slut til 5/6, hvorefter opløsningen filtreres gennem et 0,45 μπι 5 (eller alternativt 0,2 μτη) merribranfilter.

Opløsningen spray-tørres og jerndextranpulveret er færdigt til forhandling eller til yderligere oparbejdning.

Som alternativ til spray-tørringen kan opløsningen 10 anvendes til direkte fremstilling af injektionsvæsker med et jemindhold på f .eks. 5%, som beskrevet ovenfor.

Når man anvender jemdextranpulver til fremstilling af injektions- eller infusionsvæsker, genopløses pulveret i et vandigt medium, pH værdien kontrolleres 15 og indstilles om nødvendigt, og opløsningen fyldes på ampuller eller vials efter at være steriliseret ved filtrering. Alternativt kan steriliseringen ske ved autoklavering efter påfyldning på anpuller eller vials.

20 Eksempel 2 (i) Hydrolys«/ hydrogenering og oxidation a£ dextran

Denne del af syntesen udføres som beskrevet under (i) i eksempel 1 ovenfor.

25 (ii) Syntese af jemdextran 240 kg af den ovennævnte dextran som en 12% opløsning blandes med 300 kg FeCl3, 6H20.

Til den omrørte blanding sættes 250 kg Na2C03 som 30 en mættet vandig opløsning for at opnå en pH-værdi på 3,5, hvorpå blandingens pH-værdi hæves til 11,6 med 50 1 koncentreret vandig NaOH (27 vægt/volumen!).

Ovenstående blanding opvarmes til over 100°C indtil den omdannes til en sort eller mørkebrun kolloid 35 opløsning, der kan filtreres gennem et 0,45 μτα filter.

DK 173138 B1 16

Opløsningen afkøles, neutraliseres til pH 5,3 med koncentreret saltsyre, og filtreres. Opløsningen oprenses med anvendelse af membranprocesser, indtil chloridindholdet er mindre en 0,68%, beregnet på basis 5 af en opløsning indeholdende 5 vægt/volumen% jern.

Hvis opløsningen på dette trin opvarmes til over 100°C i 2 timer, findes den tilsyneladende topmolekylvægt (Mp) at være 104.898 Da efter afkøling. Opløsningen er stabil.

10 Opløsningen spray-tørres og j emdextranpul veret er færdigt.

Dette pulver er egnet til fremstilling af et væskeformigt jerndextranpræparat indeholdende ca. 5 vægt/volumen% jern.

15 I begge eksenpler er udbyttet af jerndextranpulver over 95% beregnet på basis af den jemmængde, der anvendes i processen.

Eksempel 3 20 Yderligere jerndextranpræparationer blev frem stillet ved anvendelse af procedurer svarende til de beskrevne i eksemplerne 1 og 2. Egenskaberne af udgangsmaterialerne, mellemprodukterne og resultaterne er vist i den nedenstående tabel.

25 DK 173138 B1 17

Syntese nr.__1__2____3__4__5_

Mw af hydroly- 6.200 2.566 1.212 1.212 922 I

seret dextran I

(Da)______Η 5 Reducerende euk- 4,4 14,4 6,5 6,5 8,9 ker efter vægt% vatgt% vægt% v*gt% v*gt% reduktionstrin___________

Reducerende suk- 1,2 3,0 0,9 0,9 1,8 ker efter vægt% v*gt% vægt* v*gt% vægt% 10 oxidationstrin_______

Anvendt mængde 240 kg 240 kg 300 kg 240 kg 240 kg af reduceret og oxideret dextran___ |

Anvendt mængde 300 kg 300 kg 300 kg 300 kg 300 kg H

15 FeCl., 6H_0 I

IMp af jemdex- 126.350 102.653 88.146 96.875 88.326 tran (Da)_______

Stabil Ja_ Ja Ja Ja Ja* 20 *): Stabilitet testet ved 70°C i 10 minutter.

Det er s&ledes muligt at fremstille stabile lavmolekylvægt jemdextranpræparater med anvendelse af dext raner, der er hydrogeneret og oxideret i forskeili-25 ge grader indenfor opfindelsens specificerede område.

Eksempel 4 (Sammenligningseksempel) 604 kg af en dextran med Mw på 1.209 Da og et indhold af reducerende sukker på 26,6 vægt% blev uden 30 foregående hydrogenering oxideret ved behandling med 1.780 1 af en 15 vægt/volumen% opløsning af NaOCl i vand ved pH 9,5, temperatur 50°C. Efter oxidationen blev indholdet af reducerende sukker bestemt til 0,54%. Indledende forsøg på at syntetisere jerndextran-35 forbindelser med denne oxiderede dextran slog fejl, fordi blandingen indeholdende jern og dextran dannede en gel selv før alt Na CO var tilsat. Opvarmning af sådan en gelerende opløsning fører ikke til dannelse af en stabil kolloid og filterbar opløsning.

DK 173138 B1 18

Dette eksempel viser, at det er væsentligt at nedsætte andelen af reducerende grupper i dextranen ved hydrogenering før oxidationen udføres.

5 Eksempel 5

En jerndextranopløsning blev fremstillet som i eksempel 2.

Efter den chlor idf jernende membranproces, blev pH justeret til 8,5 med 10,5 kg citronsyre opløst i en 10 vandig natriumhydroxidopløsning. Opløsningen blev derefter opvarmet til over 100°C i 2 timer. Efter afkøling justeres pH til 5,6 med koncentreret saltsyre. Opløsningen justeres til en koncentration svarende til 5,0 vægt/volumen% jern. Den tilsyneladende topmolekyl-15 vægt bestemmes til 111.666 og forbindelsen er stabil.

Sammenligning af dette eksempel med eksempel 2 viser, at tilsætningen af citrat ikke ændrer molekylvægten af jemdextranproduktet væsentligt.

Claims (12)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af jerndextran-forbindelse, hvori molekylvægten af en dextran reduceres ved hydrolyse og funktionelle terminale aldehyd- 5 grupper deraf omsættes til alkoholgrupper ved hydrogenering; nævnte dextran som en vandig opløsning blandes med mindst et vandopløseligt ferrisalt; base tilsættes til den resulterende opløsning for at danne ferrihy-droxid, og den resulterende blanding opvarmes for at 10 omdanne ferrihydroxiden til ferrioxyhydroxid som en associationsforbindelse med dextranen, kende -tegnet ved, at hydrogeneringen kun er delvis, idet der dog højst tilbagebliver 15 vægt% reducerende sukker, beregnet på den totale mængde af carbohydrater, 15 og nævnte dextran, før den blandes med ferrisaltet, og efter den underkastes hydrogenering, underkastes en oxidation, idet nævnte hydrogenering og oxidation udføres til opnåelse af dextraner med i det væsentlige alle aldehydgrupper omdannet til alkohol- og carboxyl-20 syregrupper.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kende -tegnet ved, at dextranen, før den blandes med det mindst ene ferrisalt, har en vægtmiddelmolekylvægt mindre end 7.000 Da.

3. Fremgangsmåde ifølge krav l, kende - tegnet ved, at efter hydrolysen men før den blandes med det vandopløselige salt, renses dextranen med en eller flere membranseparationsprocesser med en "cut of"-værdi passende for at tilbageholde dextran-30 molekyler over 2.700 Da, eventuelt fulgt af yderligere hydrolyse, og en eller flere membranseparationsprocesser med en "cut of"-værdi mellem 340 og 800 Da, som fjerner de mindre molekyler.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af 35 kravene 1 til 3, kendetegnet ved, at dex- DK 173138 B1 tranmolekyleme har et reducerende sukkerindhold ikke over 4 vægt% efter oxidationen.

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 4, kendetegnet ved, at hydro- 5 generingen udføres ved hjælp af natriumborhydrid i vandig opløsning.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 5, kendetegnet ved, at oxidationen udføres ved hjælp af hypochlorit, fortrinsvis 10 natriumhypochlorit i en basisk vandig opløsning.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved de følgende trin: en vandig opløsning omfattende den hydrogenerede 15 og oxiderede dextran og mindst et vandopløseligt ferrisalt fremstilles; pH af nævnte vandige opløsning justeres til en værdi over 10 ved tilsætningen af en base; blandingen opvarmes til en temperatur over 100eC 20 indtil den omdannes til en sort eller mørkebrun kolloid opløsning og kan filtreres gennem et 0,45 μτη filter; opløsningen oprenses og stabiliseres ved anvendelse af filtrering, opvarmning og membranseparationsprocesser og tilsætning af en eller flere stabilisatorer, 25 og opløsningen tørres eventuelt for at frembringe den ønskede jerndextranforbindelse som et stabilt pulver.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegn e t ved, at stabiliseringen omfatter tilsætning af 30 mindst ét salt af en organisk hydroxysyre, fortrinsvis udvalgt fra citrater.

9. Jerndextranforbindelse fremstillet ifølge krav 1 til 8, kendetegnet ved, at dens tilsyneladende topmolekylvægt (Mp) er 50.000 til 150.000 Da, 35 fortrinsvis 70.000 til 130.000, mere foretrukket 80.000 DK 173138 B1 til 120.000 Da, og dens jernindhold er 15 til 45 vægt%.

10. Farmaceutisk præparat til profylakse eller behandling af jemmangel ved parenteralt administrering omfattende en forbindelse ifølge krav 9.

11. Farmaceutisk præparat ifølge krav 10, kend e t e g n e t ved, at den omfatter et salt af en organisk hydroxysyre, fortrinsvis udvalgt blandt citrater som stabilisator.

12. Anvendelse af en jerndextranforbindelse ifølge 10 krav 9 til fremstilling af et parenteralt administrerbart terapeutisk præparat til profylakse eller behandling af jernmangel ved parenteral administrering. 15 i