DK172686B1 - Landbrugskemikalium kaldet ''stof nr. 51262'', samt fremgangsmåde til dets fremstilling - Google Patents

Description

i DK 172686 B1

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt forbindelse, der kaldes "stof nr.

51262", og som har herbicid virkning og plantevækstsretarderende virkning. Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af dette stof. Stof nr, 51262 fremstilles ved dyrkning af en mikroorganisme af slægten Streptomyces.

5 Da strukturen af stof nr 51262 endnu ikke er blevet fuldstændigt klarlagt, kan det karakteriseres ved dets egenskaber som følger: (a) udseende: neutralt, farveløse krystaller, (b) specifik drejning: 10 [a]25 = +28,8° (C = 1,04, H20, natrium D-linie), (c) grundstofanalyse: beregnet for C7H,0N2O6: 38,54% C, 4,62% H, 12,84% N, fundet: 38,55% C, 4,53% H, 12,90% N, 15 (d) smeltepunkt for krystaller: 187-189°C, (e) molekyl formel:

CjH k)N206, (f) molekylvægt: 218, 20 g) ultraviolet absorptionsspektrum: som vist i fig. 1 på de medfølgende tegninger ses ingen absorptionsmaksima over 220 nm i vandig opløsning.

DK 172686 B1 2 (h) infrarødt absorptionsspektrum: det infrarøde absorptionsspektrum, målt i en KBr-skive, er som vist i fig. 2 på de medfølgende tegninger, (i) kememagnetisk resonansspektrum: 5 det kememagnetiske resonansspektrum (δ ppm) målt ved 400 MHz i tungt vand under anvendelse af tetramethylsilan som den eksterne standard er som vist i fig. 3 på de medfølgende tegninger, (j) opløselighed: opløselig i vand, methanol og ethanol, ΙΟ uopløselig i ethylacetat og acetone, (k) farvereaktioner: positiv overfor svovlsyre-, anisaldehyd/svovlsyre- og kaliumpermanganatreaktio-ner, (l) tyndtlagschromatografi: 15 Rf-værdi = 0,3, på en silicagelplade nr. 5715 (Merck Co.), fremkaldt med en 50:10:2 vol/vol/vol blanding af ethylacetat, isopropanol og vand.

Opfindelsen tilvejebringer desuden en fremgangsmåde til fremstilling af stof nr. 51262, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved dyrkning af en stof nr. 51262-produceren-de mikroorganisme af slægten Streptomyces, og udskillelse af stof nr. 51262 fra kultur-20 suppen.

Stof nr. 51262 fremstilles ved dyrkning af en mikroorganisme af slægten Streptomyces, og fortrinsvis en mikroorganisme af arten, der er repræsenteret ved den nyligt påviste Streptomyces-stamme, der heri er identificeret som Streptomyces sp. SANK 63584.

3 DK 172686 B1

Den nyligt påviste mikroorganisme, Streptomyces sp. SANK 63584, har de herefter beskrevne karakteristika. Disse karakteristika er blevet bestemt ved dyrkning på forskellige medier, der er foreskrevet af ISP (International Streptomyces Project) eller med de medier, der er anbefalet af S.A. Walksman i bind 2 af "The Acdnomycetes", i alle 5 tilfælde ved en temperatur på 28°C.

1. Morfologiske egenskaber

Vegetative hyfer af stammen SANK 63584 vokser udmærket med forgrening på medierne, der er foreskrevet af ISP, efter dyrkning ved 28°C i 14 dage. Lufthyfeme viser simple forgreninger ved mikroskopisk undersøgelse. Formen af sporekæden er hoved-10 sagelig en lukket spiral. Overfladestrukturen af sporekæden er en vortet, rynket. Der blev ikke set specielle organer såsom hvileknolde, fragmenterede vegetative hyfer eller sporehuse.

2. Dvrkningskarakteristika

Luftmyceliet blev fugtigt og sort efterhånden som dyrkningen skred frem. Der blev ikke 15 dannet opløseligt pigment. Tabel 1 viser resultaterne opnået efter dyrkning i 14 dage ved 28eC på forskellige standarddyrkningsmedier. De anvendte farvenavne og -numre blev tilegnede i overensstemmelse med "Guide to Color Standard", en manual der er publiceret af Nippon Shiksai Kenkyusho, Tokyo, Japan.

TABEL I

20 Dyrkningsmedium_oplysning opførsel af stamme SANK 63584

Sakkarosenitratagar G mindre god, flad, svagt gulorange (2-9-9) AM svagt formet, fløjlsagtig, DK 172686 B1 4 brunhvid (1-6-6) R lysebrun (2-8-9) SP ingen 5 glucose-asparaginagar G god, flad, svagt gulorange (2-9-9) AM svagt formet, fløjlsagtig hvid R svagt gulorange (2-9-9) SP ingen 10 _ glycerol-asparaginagar G kraftig, flad, svagt gulorange (ISP5) (2-9-9) AM mindre god, fløjlsagtig, hvid R svagt gulorange (2-9-9) 15 SP ingen uorganiske saltestivel- G kraftig, flad, lys gulbrun sesagar (ISP4) (6-7-9) AM kraftigt formet, fløjlsagtig brungrå 20 (1-5-6) R gulbrun (6-6-8) SP ingen tyrosinagar (ISP7) G kraftig, flad, lys gulbrun 25 (4-8-9) AM mindre god, fløjlsagtig, hvid R gulbrun (6-7-8) SP ingen 5 DK 172686 B1 pepton-gærekstrakt- G kraftig, flad, svagt gulbrun jemagar (1SP6) (4-8-9) AM svagt formet, fløjlsagtig, hvid R svagt gulbrun (6-7-9) 5 SP ingen næringsagar (Difco) G god, flad, lys gulbrun (4-8-9) AM svagt formet, fløjlsagtig, hvid R lys bulgrun (4-8-9) > 10 SP ingen gærekstraktmalt- G kraftig, flad, lys gulbrun ekstraktagar (6-7-9) AM kraftigt formet, fløjlsagtig, brungrå 15 (1-5-6) R gulbrun (6-5-8) SP ingen havregrynagar G kraftig, flad, lys gulgran 20 (6-7-9) AM kraftigt formet, fløjlsagtig, brunhvid (1-6-6) R gulbrun (6-6-8) SP ingen 25 _ vandagar G ringe, flad, lys gulorange (2-9-9) AM mindre god, fløjlsagtig, lus brunhvid (1-7-6) 30 R lys brungrå (2-8-7) DK 172686 B1 6 SP ingen kartoffelekstrakt- G ringe, flad, lys gulorange gulerodsekstraktagar (2-9-9) 5 AM mindre god, fløjlsagtig, (1-5-6) R lys brunhvid (1-7-6) SP ingen i 10 Forkortelserne under overskriften "oplysning" har følgende betydninger: G = vækst AM = luftmycelium, R = bagside SP = opløselige pigmenter.

3. Fysiologiske egenskaber

De fysiologiske egenskaber af stamme SANK 63584 er vist i tabel 2.

15 TABEL 2 hydrolyse af stivelse + smeltning af gelatine + reduktion af nitrat + koagulering af mælk 20 peptonisering af mælk + interval af væksttemperatur

(medium 1) 11 - 46°C

optimal væksttemperatur (medium 1) 24 - 38°C

vækst i NaCI (medium 1) vækst i 7%, ingen 7 DK 172686 B1 vækst i 10% dekomponering af casein + dekomponering af tyrosin + dekomponering af xanthin 5 dannelse af melanoidpigment (medium 2) dannelse af melanoidpigment (medium 3) dannelse af melanoidpigment (medium 4)

De ovennævnte medier er som følger: 10 Medium l: gærekstrakt-maltekstraktagar (ISP2), medium 2: trypton-gærekstraktsuppe (ISPI), medium 3: pepton-gærekstrakt-jemagar (ISP6), medium 4: tyrosinagar (ISP7).

Anvendelsen af carbonkilder efter inkubation af stamme SANK 63584 i 14 dage blev 15 undersøgt under anvendelse af et Pridham-Gottlieb basal-agarmedium. Da stamme SANK 63584 i et vist omfang kan vokse i dette basalmedium uden tilsat carbonkilde, er det vanskeligt nøjagtigt at beskrive dens evne til at udnytte carbonkilder. De relative udnyttelser er vist i tabel 3, idet man tager udnyttelsen af det ovennævnte basalmedium som negativ (-) som en kontrol.

20 TABEL 3 D-glucose + D-fructose + L-arabinose ± L-rahmnose D-xylose ± sakkarose 25 inositol - raffinose D-mannitol + kontrol 8 DK 172686 B1 + : udnyttet £ : svagt udnyttet - : ikke udnyttet.

4. Helcellekomponenter 5 Cellevæggene af stamme SANK 63584 blev undersøgt under anvendelse af metoden ifølge Beckeretal., [AppliedMicrobiology, 12,421 (1964)]. L,L-diaminopimelinsyre og glycin blev påvist, og det blev derfor konkluderet at cellevæggene var af type 1. Helcelle-sukkerkomponenteme af stamme SANK 63584 blev undersøgt ved hjælp af metoden ifølge Lechevalier [Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 71, 934 10 (1968)]. Der blev ikke påvist noget karakteristisk sukkermønster.

Af de ovennævnte resultater blev det bekræftet, at den nye stamme høer til slægten Streptomyces af actimyceteme, og den blev navngivet Streptomyces sp. SANK 63584.

Den er for nylig blevet nenregnet til arten Streptomyces hygroscopicus og kan således kaldes Streptomyces hygroscopicus SANK 63584.

15 Identifikation af stamme SANK 63584 blev gennemført i overensstemmelse med ISP Reports, Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (8. udgave), "The Actinomy-cetes" bind 2 og anden senere litteratur vedrørende streptomycetemes taxonomi.

Stammen SANK 63584 er blevet deponeret hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Minestry of International Trade and Industry, 20 Japan den 14. december 1984 under accessionsnummer FERM P-8004 og gendeponeret i overensstemmelse med betingelserne, der er angivet i Budapest-traktaten, ved dette Fermentation Research Institute den 9. januar 1986 under accessionsnummer FERM BP-958.

9 DK 172686 B1

Det er blevet godtgjort, at stamme SANK 63584 danner stof nr. 51262. Som det er velkendt, kan egenskaberne af mikroorganismer, som horer til den almene kategori af actinomyceteme, variere væsentligt, og sådanne mikroorganismer kan let undergå mutation, både af naturlige årsager og forårsaget af kunstige påvirkninger. Fremgangsmåden 5 ifølge den foreliggende opfindelse omfatter derfor anvendelsen af en hvilken som helst mikroorganisme, der kan klassificeres inden for slægten Streptomyces, og sotn sammen med den nye stamme SANK 63584 har evnen til at producere stof nr. 51262.

Dyrkningen af mikroorganismer af slægten Streptomyces, og især stammerne af arterne Streptomyces hygroscopicus, i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse til 10 fremstilling af stof nr. 51262 kan gennemføres under betingelser, som almindeligt anvendes til dyrkningen af actinomycetes-arter, især i væskekultur og ønskeligt med omrystning eller omrøring og luftning. Næringsmediet, der anvendes til dyrkningen, er fuldstændigt konventionelt og indeholder sådanne bestanddele, som almindeligt anvendes ved dyrkningen af actinomyceteme. Mediet bør især fortrinsvis indeholde en assimi-15 lerbar carbonkilde, der som egnede eksempler omfatter glucose, maltose, sakkarose, mannitol, melasse, glycerol, dextrin, stivelse, sojabønneolie og bomuldsfrøolie, en assimilerbar nitrogenkilde, der som egnede eksempler omfatter sojabønnemel, jordnød-demel, bomuldsfrømel, Fermamin, fiskemel, majsstøbe væske, pepton, kødekstrakt, presset gær, gærekstrakt, natriumnitrat, ammoniumnitrat eller ammoniumsulfat og et 20 eller flere uorganiske salte, såsom natriumchlorid, phosphater, calciumcarbonat, og om ønsket spormetalsalte. Hvor dyrkningen gennemføres i et flydende medium er det almindeligvis ønskeligt at inkorporere et antiskummemiddel (f.eks. siliconeolie, vegetabilsk olie eller et egnet overfladeaktivt middel) i mediet.

Dyrkningen gennemføres passende ved en i alt væsentlig neutral pH-værdi og ved en 25 temperatur fra 24°C til 38°C, især fra 24°C til 30°C, mest fordelagtigt ved ca.28°C.

Fremstillingen af stof nr. 51262 kan efterhånden som dyrkningen skrider frem overvåges ved anvendelse af en række konventionelle metoder til overvågning af fremstillingen af DK 172686 B1 10 biologisk aktive stoffer ved mikrobe dyrkning, og som her kun kræver ringe eller ingen nærmere forklaring. En egnet teknik er at bestemme hæmningsvirkningen af den dyrkede suppe overfor en følsom planteart, f.eks. Brassica Rapa (L) var. "Komatsuna".

Den dannede mængde af stof 51262 når normalt et maksimum efter dyrkning i 60-120 5 timer, og det er helt klart ønskeligt ikke at skille stof nr. 51262 fra dyrkningsmediet efter det tidspunkt, hvor dette masksimum er blevet nået. Denne periode kan imidlertid variere afhængig af dyrkningsbetingelser og -teknikker, og en kortere eller længere periode kan være passende afhængig af omstændighederne. Den korrekte dyrkningstid kan let bestemmes i hvert tilfælde ved rutineforsøg under anvendelse af egnede overvågningstek-10 nikker f.eks. som beskrevet ovenfor.

Stof nr. 51262 er opløseligt i vand og frigives hovedsageligt i væskedelen af den dyrkede suppe, og kan således udvindes ved fjernelse af fast stof, herunder myceliet, f.eks. ved filtrering fortrinsvis under anvendelse af et filterhjælpemiddel såsom diatomijord, eller ved centrifugering. Det kan derpå udvindes fra den fraskilte væskedel på sædvanlig 15 måde, idet der gøres brug af dets specifikke fysisk-kemiske egenskaber, og renses derpå om ønsket.

Stof nr. 51262 skilles fortrinsvis fra andre produkter i nævnte væskedel ved hjælp af et adsorptionsmiddel, enten ved at adsorbere urenhederne eller ved at adsorbere stof nr.

51262 eller ved at adsorbere begge dele hver for sig eller sammen, og derpå eluere stof 20 nr. 51262. Der kan anvendes en lang række adsorptionsmidler. Eksempler herpå, som har vist sig at være særligt tilfredsstillende, omfatter aktiveret carbon og harpiksagtige adsorbtionsmidler såsom Amberlite (registreret varemærke), XAD-2, XAD-4 eller XAD-7 (produkter fra Rohm og Haas) og Diaion (registreret varemærke) HP10, HP20, CHP20P eller HP50 (produkter fra Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd.). Urenhe-25 deme, som findes i væskedelen, kan fjernes ved at lede opløsningen, som indeholder stof nr. 51262, gennem et lag eller en kolonne af et eller flere af de før nævnte absorptionsmidler eller ved at adsorbere stof nr. 51262 på et eller flere af absorptionsmidlerne og 11 DK 172686 B1 derpå eluere stof nr. 51262 med et egnet elueringsmiddel. Egnede elueringsmidler omfatter blandinger af methanol, acetone eller butanol med vand.

Del således opnåede stof nr. 51262 kan renses yderligere på forskellige måder. Egnede metoder omfatter fordelingssøjlechromatografi under anvendelse af et celluloseprodukt, 5 såsom A vicel (et registreret varemærke for et produkt fra Asahi Chemical Industry Co.,

Ltd.) eller Sephadex LH-20 (et registreret varemærke for et produkt fra Farmacia,

Sverige). Urenhederne, som findes i væskedelen, der indeholder stof nr. 51262, kan også fjernes ved absorption heraf på forskellige typer af kationbytterharpikser (stærke eller svage) såsom Dowex 50W (et registreret varemærke for at produkt fra Dow Chemi-10 cal Co., Ltd.) eller Amberlite IRC-50(et registreret varemærke for et produkt fra Rohm og Haas) eller på en anionbytterharpiks (såsom Dowex 1 eller Diaion WA10).

Yderligere rensning af stof nr. 51262 kan gennemføres ved chromatografi under anvendelse af silicagel om nødvendigt. En enkelt af disse rensningsteknikker eller en hvilken som helst kombination deraf kan anvendes til opnåelse af stof nr. 51262 i ren form med 15 de ovenfor beskrevne fysisk-kemiske egenskaber.

Undersøgelse af litteraturen har ikke vist nogen kendt forbindelse, hvis egenskaber stemmer nøjagtigt med disse, og det er derfor blevet konkluderet, at stof nr. 51262 er en ny forbindelse.

Stof. nr. 51262 viser både herbicide og væksthæmmende aktivitet over for planter. En 20 herbicid virkning betyder, at stoffet skader planter og til slut kan udrydde dem. På den anden side betyder en retarderende virkning, at stoffet hæmmer eller undertrykker plantevæksten uden at vise en sådan herbicid virkning, som resulterer i nekrose eller død af planterne. En plantes reaktion på stoffet (dvs. hvorvidt der ses en herbicid eller væksthæmmende virkning) vil variere i afhængighed af anvendelsesmetoden, koncentra-25 tionen af stof nr. 51262 og den behandlede plantes følsomhed over for stoffet. Som påvist nedenfor har forbindelsen ifølge opfindelsen en fremragende herbicid virkning DK 172686 B1 12 mod forskellige ukrudtsarter både anvendt før og efter emergens, og den er derfor anvendelig som et herbicid til påføring på løvet. Som ligeledes påvist nedenfor kan stoffet hæmme plantevæksten uden at udrydde planterne. Det forventes derfor at være velegnet til at hindre risplanter i at vælte ved forkortelse af risplantestængleme, at 5 reducere tiden til eller hyppigheden af slåning, beskæring eller trimning, ved hæmning af væksten af græs og haveplanter at mindske væksten af blomstrende planter, osv.

Landbrugskemikaliemidlet kan, hvad enten det anvendes som et herbicidt eller et plantevækstregulerende middel, omfatte stof nr. 51262 alene eller dette stof i blanding med en bærer og/eller et hjælpestof. Midlet kan tilberedes til en hvilken som helst form, som 10 er almindelig på landbrugskemikalieområdet, f.eks. kan det formuleres som et pudder, groft pudder, kom, mikrokom, fugtbart pulver, vandopløseligt pulver eller en flydende formulering. Det er naturligvis ikke nødvendigt at anvende en fuldstændig ren form af stof nr. 51262 i midlet, og rensning kan naturligvis udelades på et hvilket som helst trin, og det resulterende rå stof kan anvendes som den akrive bestanddel i midlet.

15 Bæreme, der anvendes i sådanne midler, kan være et syntetisk eller naturligt organisk eller uorganisk stof, og det blandes med forbindelsen ifølge opfindelsen for at gøre lagringen, transporten og håndteringen af den aktive bestanddel lettere eller fremme overførslen af den aktive bestanddel til planterne. Bærere kan være faste eller flydende.

Eksempler på faste bærere omfatter sådanne uorganiske stoffer som ler, talkum, diato-20 mit, kaolin, bentonit, calciumcarbonat, gips, syntetisk udfældet silica, attapulgit, zeolit eller pimpsten, sådanne syntetiske og naturlige harpikser som coumaronharpiks, alkyd-harpisker, polyvinylchlorid, estergummi eller zanthangummi, sådanne voksarter som carnaubavoks eller paraffinvoks og andre organiske stoffer såsom nøddeskaller (f.eks. fra valnødder eller andre nødder) eller sojabønnepulver. Eksempler på flydende bærere 25 omfatter vand og alkoholer såsom methanol, ethanol, isopropanol eller ethylenglycol.

Hvor midlet skal omfatte et overfladeaktivt middel, kan dette være ionogent eller ik-ke-ionogent og anvendes til at fremme dispergering, befugtning eller spredning af mid- 13 DK 172686 B1 let. Eksempler på anioniske, overfladeaktive midler omfatter natrium- og calciumsalte af lininsul fonsyre, natriumoleat, natriumdodecylbenzensulfonat, natriumdi alkylsulfo-succinater, natrium-, ammonium- og aminsalte af polyoxyethylenalkylarylethersulfater eller af polyoxyethylenalkylethersulfater eller de frie syrer eller salte af polyoxyethy-5 lenalkylaryletherphosphater eller af polyoxyethylenalkylphosphater. Eksempler på kat-ioniske, overfladeaktive midler omfatter de højere alifatiske aminer og ethylenamidkon-densater med sådanne aminer, kvartemære ammoniumchlorider, N-alkylaminacetater og N-alkylaminoxider. Amfotere overfladeaktive midler omfatter betainer og overfladeaktive midler af aminosyretypen. Eksempler på ikke-ioniske, overfladeaktive midler omfat-10 ter glycerid og saccaroseestere af fedtsyrer, ethylenoxidkondensater med højere alifatiske alkoholer, ethylenoxidkondensater med alkylphenoler eller alkylnaphtholer, amider eller ethoxylerede amider af højere fedtsyrer, højere fedtsyreestere af sorbitan eller af ethoxy-lerede sorbitaner, højere fedtsyreestere af glycerolborater eller af ethoxylerede glyce-rolborater og copolymerer af ethylenoxid med propylenoxid.

IS Midlerne kan om ønsket også indeholde andre komponenter, f.eks. beskyttende kolloide midler såsom gelatine, gummiarabikum, casein, polyvinylalkohol eller carboxymethyl-cellulose eller fortykkelsesmidler såsom natriumpolyphosphat eller bentonit. Til større anvendelighed og arbejdsbesparelse kan midlet også om ønsket blive kombineret med andre fungicider, insekticider, herbicider, plantevækstregulerende midler og gødnings-20 stoffer.

Opfindelsen belyses yderligere ved hjælp af de efterfølgende eksempler, hvor eksemplerne 1 og 2 belyser fremstillingen af stof nr. 51262, medens eksemplerne 3-7 belyser virkningen af stof nr. 51262, og eksemplerne nr. 8-12 belyser midlerne, som indeholder stoffet 25 EKSEMPEL 1

Fremstilling af stof nr. 51262 DK 172686 B1 I4

En podering fyldt med Streptomyces sp. stamme SANK 63584 blev podet i hver af fire 500 ml Erlenmeyer-kolber, der hver indeholdt 80 ml af et medium med følgende sammensætning (angivet som vægt%):

Glucose 3 % 5 Gær l %

Sojabønnemel 3 %

Calciumcarbonat 0,4%

MgSO*,7H20 0,2%

Antiskummemiddel (Nissan Disfoam) 10 CB-442, fra Nissan Chemical

Industries Limited) 0,01 %

Vand indtil 100% pH 7,2 før sterilisering.

Mikroorganismen blev derpå dyrket under anvendelse af et roterende rysteapparat ved 15 220 omdrejninger pr. minut i 72 timer ved en temperatur på 28°C.

2 ml af den resulterende podekultur blev podet i hver af 130 500 ml Erlenmeyer-kolber, der hver indeholdt 80 ml af det samme dyrkningsmedium, og mikroorganismen blev dyrket under anvendelse af et roterende rysteapparat ved 220 omdrejninger pr. minut ved en temperatur på 28°C i 96 timer. De resulterende dyrkede supper og vaskevæsker, der 20 i alt udgør 11,4 I, blev forenet, og Ikg af et Celite 545 filterhjælpemiddel (varemærke for et produkt fra Johns Manville Products Corp.) blev tilsat, og blandingen blev filtreret til opnåelse af 11 1 af et filtrat med en pH-værdi pa 7,1. Filtratet blev derpå ledt gennem en chromatografikolonne, der er pakket med 3 1 aktiveret carbon (et produkt fra Wako Pure Chemicals Industries Limited), til absorption af stof nr. 51262.

25 Kolonnen blev vasket med 4,5 1 deioniseret vand, og det ønskede stof blev derpå elueret med 15 1 10% vol/vol vandig acetone. De 15 1 aktiv eluat blev kondenseret ved ind- 15 DK 172686 B1 dampning under reduceret tryk og derpå lyofiliseret til opnåelse af 61 g af et råpulver, som indeholdt det ønskede stof nr. 51262. Om ønsket kan dette råpulver anvendes som sådant som landbrugskemikalium.

Råpulveret blev derpå adsorberet på en chromatografikolonne, som indeholdt 500 ml 5 Avicel (et varemærke for et produkt fra Asahi Chemical Industry Co. Ltd.), som forud var blevet bragt i ligevægt med acetonitril. Kolonnen blev derpå elueret først med 2 1 acetonitril, derpå med 3 1 97% vol/vol vandig acetonitril og til slut med 6 1 85% vol/vol acetonitril. Eluatet blev opsamlet i fraktioner på hver en I, og det ønskede stof nr. 51262 viste sig at være til stede i sjette til niende fraktion. Disse fraktioner blev forenet, kon-10 denseret ved inddampning under reduceret tryk og derpå frysetørret til opnåelse af 4,6 g pulver. Pulveret blev opløst i en ringe mængde 50% vol/vol vandig methanol og adsorberet på en Sephadex LH-20-kolonne (et varemærke fra Farmacia, Sverige), som forud var blevet bragt i ligevægt med 50% vol/vol vandig methanol. Kolonnen blev elueret under anvendelse af 50% vol/vol vandig methanol, og eluatet blev opsamlet i frak-15 tioner på 15 ml. Fraktionerne nr. 36-50 indeholdt det ønskede stof nr. 51262 og blev opsamlet, sammenblandet, kondenseret ved inddampning under reduceret tryk og igen sendt gennem den samme Sephadex LH-20-kolonne. De eluerede fraktioner blev opsamlet og frysetørret, hvilket gav 334 mg af en prøve af stof nr. 51262 med en renhed på ca. 70%.

20 300 mg af denne prøve blev adsorberet på en silicagelkolonne (et produkt fra Morck Co.), som forud var blevet bragt i ligevægt med en blanding af 10 volumendele chloroform og 1 volumendel methanol. Det ønskede stof blev elueret med en blanding af 6 volumendele chloroform og 1 volumendel methanol, og eluatet blev opsamlet i fraktioner på 15 ml. Fraktionerne nr. 22-60 blev opsamlet, sammenblandet, kondenseret ved 25 inddampning under reduceret tryk og derpå underkastet præparativ tyndtlagschromato-grafi på silicagel under anvendelse af en blanding af 50 volumendele ethylacetat, 10 volumendele isopropanol og 2 volumendele vand som fremkaldermiddel. Det ønskede stof blev ekstraheret med en blanding af 6 volumendele chloroform og 1 volumendel DK 172686 B1 16 methanol, og ekstrakten blev kondenseret ved inddampning under reduceret tryk og derpå frysetørret til opnåelse af 25,5 mg stof nr. 51262 som et farveløst pulver med følgende egenskaber: (a') udseende: neutralt, farveløst pulver, 5 (b') specifik drejning: [a]20 = +24,4° (C = 0,61, H20, natrium D-linie), (c’> grundstofanalyse: beregnet for C7H,0N206, H20: 35,59% C, 5,08% H, 11,86% N 10 fundet: 35,65% C, 5,00% H, 11,71% N, og egenskaber (e) - (1) som, tidligere beskrevet.

EKSEMPE12

Fremstilling af stof nr. 51262 260 mg delvis renset stof nr. 51262 blev fremstillet ved hjælp af fremgangsmåden, der 15 er beskrevet i eksempel 1 (i alt væsentligst identisk hermed indtil det trin, hvor den rå prøve med en renhed på ca. 70% blev fremstillet), og denne delvis rensede forbindelse blev opløst i en ringe mængde vand. Opløsningen blev adsorberet på en kolonne, der indeholdt 300 ml Diaion CHP-20P, og elueret med vand. Eluatet blev opsamlet i fraktioner på 5 ml, og det ønskede stof nr. 51262 blev elueret i fraktionerne nr. 61-67, som 20 viser en enkelt plet ved tyndtlagschromatografi. Disse fraktioner blev sammenblandet, kondenseret ved inddampning under reduceret tryk og frysetørret til opnåelse af 41 mg af det ønskede stof nr. 51262 som et farveløst pulver med de samme egenskaber som produktet fra eksempel 1.

EKSEMPEL 3 17 DK 172686 B1

Fremstilling af krystallinsk stof nr. 51262

Fremgangsmåden, der er beskrevet i eksempel 2, blev gentaget til opnåelse af 130 mg stof nr. 51262 som et farveløst pulver. Alt dette pulver blev opløst i varm acetone, og 5 den resulterende opløsning blev derpå afkølet. Krystallerne, som udfældedes, blev opsamlet til opnåelse af 37 mg stof nr. 51262 som farveløse nåle med de ovenfor beskrevne egenskaber (a)-(l). ' EKSEMEEL-4 Hæmmende virkning på spiringen af Komatsuna-frø 10 Steriliseret bomuld blev anbragt i bunden af et prøverør (10 mm x 100 mm) til en højde på ca. 5 mm, og bomulden blev derpå gennemblødt med 0,5 ml af enten destilleret vand eller af en vandig opløsning, som indeholdt forskellige koncentrationer af stof nr. 51262.

Ca. 10 frø af planten Komatsuna [Brassica Rapa (L) var. Komatsuna Hara] blev anbragt i hvert prøverør og fik lov til at henstå ved 28°C i 3 dage til bestemmelse af hæmnings-15 koncentrationen af stof nr. 51262 bestemt ved forekomsten eller manglende forekomst af spiring. Den minimale hæmningskoncentration af stof nr. 51262 over for spiringen af Komatsuna frø blev således bestemt til at være 3,13 jig/ml.

EKSEMPEL 5

Præernereensiordbehandlingsprøve 20 En plastpotte blev fyldt med bakkelandsjord, hvilket giver et jordoverfladeareal på ca.

150 cm2, og frø fra følgende etårige bakkelandsukrudt blev sået på jorden og derpå dækket med den samme jord: Setaria faberi Herrm., Digitaria sanquinalis (L) Scorp., 18 DK 172686 B1

Echinochloa crus-galli (L) beauv., Setaria viridis (L.) Beauv., Amaranthus retroflexud L., Brassica arvensis (L) Kuntze, Chenopodium album L, Ambrosia artemsiifolia L, abutilon Theophrasti Medie og Sida spinosa L.

En dag efter såning af frøene blev en vandig opløsning af stof nr. 51262 (fremstillet som 5 beskrevet i eksempel 13) sprøjtet jævnt på jorden i en mængde på 15 ml pr. potte.

Potterne fik derpå lov til at henstå i et drivhus i tre uger, hvorefter væksten af frøene blev observeret. Den herbicide virkning af stof nr. 51262 blev bestemt ved sammenligning af væksten af behandlede frø med væksten af en kontrol, som ikke var blevet ’ behandlet, og resultaterne er angivet i den efterfølgende tabel 4 under anvendelse af 10 følgende koder: Væksthæmning 0-5% effektivitet 0 væksthæmning 6-30% effektivitet l væksthæmning 31-50% effektivitet 2 væksthæmning 51-70% effektivitet 3 15 væksthæmning 71-95% effektivitet 4 væsthæmning 96-100% effektivitet 5

Tabel 3

Dosis (aktiv bestanddel kg/ha) 20 2,5 1,25

Smalbladet ukrudt

Setaria faberi Herrm. 5 5

Digitaria sanquinalis (L) Scop. 5 5 25 Echinochloa crus-qalli (L) Beauv. 5 5

Setaria viridis (L) Beauv. 5 5 19 DK 172686 B1

Bredbladet ukrudt

Amaranthus retroflexus L. 5 4

Brassica arvensis (L) Kuntze 5 5 5 Chenopodium album L. 3 1

Abutilon theophrasti Medie. 5 3

Sida spinose L. 5 4

Ambrosia artemisii folia L. 5 2 10 EKSEMPEL 6 Løvbehandling

Frø af ukrudt (som angivet i tabel 5) blev sået i potter, dækket med jord og fik lov til at henstå i drivhus, idet fremgangsmåden, der er beskrevet i eksempel 5, blev fulgt. 10 dage efter såningen blev en vandig opløsning af stof nr. 51262 (fremstillet ved hjælp 15 af fremgangsmåden der er beskrevet i eksempel 11) med den koncentration, der er vist i tabel 5, blandet med 0,03% vægt/vægt af en Gramin S spreder (et varemærke fra Sankyo Co. Ltd.). 5 ml af den resulterende opløsning blev sprøjtet i hver potte. Ukrudtet blev observeret 10 dage efter behandlingen, og den herbicide virkning af stof nr. 51262 blev bestemt og angivet under anvendelse af de i eksempel 5 anførte koder.

20 Tabel 5

Dosis (aktiv bestanddel ppm) 500 250 25 Smalbladet ukrudt

Setaria faberi Herrm. 4 3

Diqitaria sanquinalis (L) Scop. 5 5 20 DK 172686 B1

Echinochloa crus-qalli (L) Beauv. 5 5

Setaria viridis (L) Beauv. 5 5

Bredbladet ukrudt 5 Amaranthus retroflexus L. 5 3

Brassica arvensis (L) Kuntze 5 5

Chenopodium album L. 3 2

Abutilon theophrasti Medie. 5 5

Sida spinosa L. 5 5 10 Ambrosa artemisiifolia L. 5 5 EKSEMPEL 7

Plantevæksthæmning

En plastpotte blev fyldt med højlandsjord til opnåelse af et jordoverfladeareal på 150 15 cm2. Frø af rismarksris, sojabønner, majs og bomuld blev sået. Knolde af det flerårige ukrudt, purpumøddegræs (Cyperns rotundus), blev derpå plantet i hver potte, og frøene og knoldene blev dækket med den samme jord. Potterne blev anbragt i et drivhus i 10 dage, hvorefter vandige opløsninger af stof nr. 51262 (fremstillet som beskrevet i det efterfølgende eksempel 11) til de krævede koncentrationer blev blandet med 0,03 % vol/-20 vol af sprederen Gramin S. 5 ml af den resulterende opløsning blev sprøjtet på hver potte. Væksten af de resulterende planter blev efter 2 uger sammenlignet med en kontrol, som ikke var blevet behandlet således. De planter, som var blevet behandlet med 125 ppm af stof. nr 51262, viste en væksthæmning på ca. 50% for alle planter, medens de potter, som var blevet behandlet med 500 ppm af stof nr. 51262, viste en næsten 25 fuldstændig væksthæmning af skuddet og jordstænglen af Cyperns rotundus.

EKSEMPEL 8 21 DK 172686 B1

Toksicitet

En opløsning af stof nr. 51262 blev givet intravenøst til mus i en mængde på 100 mg/kg legemsvægt. Musene blev observeret i 14 dage, og der blev intet unormalt påvist.

5 EKSEMPEL 9

Korn

Efter dyrkning ved hjælp af fremgangsmåden, der er beskrevet i eksempel 1, blev kultursuppen adsorberet på en aktiv carbonkolonne. Den aktive fraktion, som blev elueret med 10% vol/vol vandig acetone, blev inddampet til tørhed under reduceret tryk 10 til opnåelse af et råpulver. Dette råpulver blev opløst i vand til opnåelse af 50% vægt/-vægt vandig opløsning, og denne blev absorberet på pimpstenkom (størrelse 10-48 mesh., Tyler standard) til opnåelse afkom.

EKSEMPEL 10

Fugtbart pulver 15 50 vægtdele af det rå pulver, der er beskrevet i eksempel 9, 3 dele natriumdodecylben- zensulfonat, 2 dele polyvinylalkohol og 45 dele ler blev blandet ensartet og pulveriseret til opnåelse af et fugtbart pulver.

EKSEMPEL 11 22 DK 172686 B1

Vandopløseligt pulver 50 dele stof nr. 51262, 2 dele polyoxyethylennonylphenylether, 10 dele syntetisk silica 5 og 38 dele ammoniumsulfat blev blandet ensartet til opnåelse af et vandopløseligt pulver.

EKSEMPEL 12

Flydende formulering 10 dele stof nr. 51262 og 2 dele natriumlaurylsulfat blev opløst ensartet i 88 dele methanol til opnåelse af en flydende formulering.

10 EKSEMPEL 13

Flydende formulering 10 dele stof nr. 51262 og 2 dele natriumdodecylbenzensulfonat blev opløst i 88 dele vand til opnåelse af den flydende formulering.

i

Claims (6)

1. 23 DK 172686 B1 l. Forbindelse, der er navngivet stof nr. 51262, og kendetegnet ved egenskaberne: 5 (a) udseende: neutralt, farveløse krystaller, (b) specifik drejning: [a]-5 = +28,8° (C = 1,04, H20, natrium D-linie), (c) grundstofanalyse: 10 beregnet for C7Hl(lN206: 38,54% C, 4,62% H, 12,84% N, fundet: 38,55% C, 4,53% H, 12,90% N. (d) smeltepunkt for krystaller: 187-189°C, 15 (e) molekylformel: C7H ΙΙ>Ν206, (f) molekylvægt: 218, (g) ultraviolet absorptionsspektrum: som vist i fig. 1 på de medfølgende tegninger, der ses ingen absorptionsmaksima 20 over 220 nm i vandig opløsning, (h) infrarødt absorptionsspektrum: 24 DK 172686 B1 det infrarøde absorptionsspektrum, målt i en KBr-skive, er som vist i fig. 2 på de medfølgende tegninger, (i) kememagnetisk resonansspektrum: det kernemagnetiske resonansspektrum (δ ppm) målt ved 400 MHz i tungt vand 5 under anvendelse af tetramethylsilan som den eksterne standard er som vist i fig. 3 på de medfølgende tegninger, (j) opløselighed: opløselig i vand, methanol og ethanol, uopløselig i ethylacetat og acetone, 10 (k) farvereaktioner: positiv overfor svovlsyre-, anisaldehyd/svovlsyre- og kaliumpermanganatreaktioner, (I) tyndtlagschromatografi: Rf-værdi = 0,3, på en silicagelplade nr. 5715 (Merck Co.), fremkaldt med en 50:10:2 vol/vol/vol blanding af ethylacetat, isopropanol og vand.
2. 2. Fremgangsmåde til fremstilling af stof nr. 51262 som defineret i krav 1, k ende te g n e t ved, at man dyrker en stof nr. 51262-producerende mikroorganisme af slægten Streptomyces og skiller stof nr. 51262 fra kultursuppen.
3. 3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at mikroorganismen er en stamme af Streptomyces hygroscopicus.
4. 4. Fremgangsmåde ifølge krav 3,kendetegnet ved, at mikroorganismen er Streptomyces hygroscopicus SANK 63584 (FERM BP-958). 25 DK 172686 B1
5. 5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 2-4, kendetegnet ved, at dyrkningen gennemføres ved en temperatur fra 24°C til 38°C.
6. 6. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 2-4,kendetegnet ved, at dyrkningen gennemføres ved en temperatur på ca. 28°C. 5