DK170344B1 - Makrolidforbindelser, farmaceutiske, veterinære og ikke-terapeutisk pesticide præparater indeholdende forbindelser, ikke-terapeutisk fremgangsmåde til bekæmpelse af skadedyr samt fremgangsmåde til fremstilling af forbindelserne - Google Patents

Description

i DK 170344 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil tikendte makrolidforbindel-ser, farmaceutiske, veterinære og ikke-terapeutiske pesticide præparater indeholdende forbindelserne, ikke-terapeutisk fremgangsmåde til bekæmpelse af skadelige insekter, mider eller nematoder samt 5 fremgangsmåde til fremstilling af forbindelserne.

Ét aspekt af den foreliggende opfindelse angår således de omhandlede hidtil ukendte forbindelser med formlen (1) T3 ® CH, RO, i, Λ ϊ λ Γ ο ν.***ι\„ η I _ ®3 Η |\ 'V 0¾ .0 X (1) flif

Hys* Η b 10 hvor R er en α-L-oleandrosyl-a-L-oleandrosylgruppe eller en a-L- oleandrosylgruppe, X betegner -(¾- eller -C(-N0CH3)-, idet gruppen >C-N0CH3 er i E-konfigurationen, og betegner hydroxy eller me-thoxy.

Vigtige aktive forbindelser ifølge opfindelsen er forbindelser med 15 formlen (1), hvor: R betegner en α-L-oleandrosyl-a-L-oleandrosylgruppe, X betegner >ONOCH3, og R4 betegner en hydroxygruppe; og R betegner en a-L-oleandrosyl-a-L-oleandrosylgruppe, X betegner -CHl·)-og R^ betegner en hydroxygruppe.

20 Forbindelserne ifølge opfindelsen har antibiotisk aktivitet, fx aktivitet mod indvoldsorme, fx mod nematoder, og især antiendoparasi-tisk og antiektoparasitisk aktivitet. Forbindelserne ifølge opfindelsen kan også anvendes som mellemprodukter ved fremstilling af andre aktive forbindelser.

DK 170344 B1 2

Den antibiotiske aktivitet af forbindelserne med formlen (1) kan fx demonstreres ved deres aktivitet in vitro mod fritlevende nematoder, fx Caemorhabditis elegans.

Ektoparasitter og endoparasitter inficerer mennesker og forskellige 5 dyr og er specielt talrige i husdyr såsom svin, får, kvæg, geder og fjerkræ (fx kyllinger og kalkuner), heste, kaniner, fuglevildt, bur-fugle og dyr såsom hunde, katte, marsvin, hoppemus og hamstere. Parasitisk infektion af husdyrbesætninger, der fører til anæmi, fejlernæring og vægttab, er en væsentlig årsag til økonomisk tab verden over.

10 Eksempler på endoparasitiske slægter, der inficerer sådanne dyr og/eller mennesker, er Ancylostoma, Ascaridia, Ascaris, Aspicularis,

Brugia, Bunostomm, Capillaria, Chåbertia, Cooperia, Dictyocaulus,

Dirofilaria, Dracunculus, Enterobius, Haemonchus, Heterakis, Loa,

Necator, Nematodirus, Nematospiroides (Heligomosoides), Nippostrongy-15 lus, Oesophagostomum, Onchocerca, Ostertagia, Oxyuris, Parascaris,

Strongylus, Strongyloides, Syphacia, Toxascaris, Toxocara, Trichone-ma, Trichostrongylus, Trichinella, Trichuris, Triodontophorus, Un-cinaria og Wuchereria.

Eksempler på ektoparasitter, der inficerer dyr og/eller mennesker, er 20 leddyrektoparasitter såsom bidende insekter, spyfluer, lopper, lus, mider, sugende insekter, tæger og andre tovingede skadedyr.

Eksempler på slægter af sådanne ektoparasitter, der inficerer dyr og/eller mennesker, er Åmbylomma, Boophilus, Chorioptes, Culliphore,

Demodex, Damalinia, Dermatobia, Gastrophilus, Haematobia, Haematopi-25 nus, Haemophysalis, Hyalomma, Hypoderma, Ixodes, Linognathus, Luci-lia, Melophagus, Oestrus, Otobius, Otodectes, Psorergates, Psoroptes, Khipicephalus, Sarcoptes, Stomoxys og Tabanus.

Yderligere er forbindelser med formlen (1) også egnede til bekæmpelse * af skadelige insekter, mider og nematoder inden for landbrug, have-30 brug, skovbrug, sundhedsvæsenet og i lagrede produkter. Skadedyr i jord og afgrøder, herunder kornafgrøder (fx hvede, byg, majs og ris), grønsager (fx soja), frugt (fx æbler, vindruer og citrus) samt rodaf- DK 170344 B1 3 grøder (fx sukkerroer, kartofler) kan med fordel behandles. Specielle eksempler på sådanne skadedyr er frugtmider og bladlus såsom Aphis fåbae, Aulacorthim circmsflexum, Myzus persicae, Nephotettix cinc-ticeps, Nilparvata lugens, Panonychus ulmi, Phorodon humuli, Phyllo-5 coptruta oleivora, Tetranychus urticae og medlemmer af slægten Tria-leuroides; nematoder såsom medlemmer af slægterne Aphelencoides, Globodera, Heterodera, Meloidogyne og Panagrellus; biller såsom Heliothis, Plutella og Spodoptera; komsnudebiller såsom Anthonomus grandis og Sitophilus granarius; melbiller såsom Tribolium castaneum; 10 fluer såsom Musca dornes tica; stikmyrer; bladminerer; Pear psylla;

Thrips tabaci; kakerlakker såsom Blatella germanica og Periplaneta americana og myg såsom Aedes aegypti.

I overensstemmelse hermed angår opfindelsen derfor forbindelser med formlen (1) som defineret ovenfor, som kan anvendes som antibiotika.

15 Specielt kan de anvendes til behandling af dyr og mennesker med en-doparasitiske, ektoparasitiske og/eller fungale infektioner og i landbrug, havebrug eller skovbrug som pesticider til bekæmpelse af skadelige insekter, mider og nematoder. De kan også anvendes generelt som pesticider til bekæmpelse eller kontrol af skadedyr under andre 20 forhold, fx i butikker, bygninger eller på andre offentlige steder, eller steder, hvor skadedyrene befinder sig. Generelt kan forbindelserne påføres enten værten (dyr eller mennesker eller planter eller vegetation) eller deres levested eller selve skadedyrene.

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan formuleres til administration ' 25 på en hvilken som helst hensigtsmæssig måde til anvendelse i veterinær eller human medicin, og opfindelsen angår også farmaceutiske og veterinære præparater, der indeholder en pesticidt effektiv mængde af mindst én forbindelse ifølge opfindelsen sammen med en farmaceutisk, henholdsvis veterinært acceptabel bærer. Sådanne præparater kan 30 præsenteres til anvendelse på konventionel måde ved hjælp af én eller flere egnede bærere eller excipienser. Præparaterne ifølge opfindelsen omfatter sådanne præparater i en form, der er specielt formuleret til parenteral (herunder intrabryst-administration), oral, rektal, topisk, oftalmisk, nasal eller genital-urinær anvendelse eller til 35 implantation.

DK 170344 B1 4

Forbindelserne med formlen (1) kan formuleres til anvendelse i veterinær eller human medicin ifølge de generelle fremgangsmåder, der er beskrevet i GB 2166436.

De totale daglige doser af forbindelserne ifølge opfindelsen til 5 anvendelse i både veterinær og human medicin vil passende være i området 1-2000 /zg/kg legemsvægt, fortrinsvis 50-1000 μg/kg, og doserne kan gives som delte doser, fx 1-4 gange dagligt.

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan formuleres på en hvilken som helst hensigtsmæssig måde til havebrugsmæssig eller landbrugsmæssig 10 anvendelse, og opfindelsen angår også ikke-terapeutiske pesticide præparater, der indeholder en pesticidt effektiv mængde af en forbindelse ifølge opfindelsen, sammen med en pesticidt acceptabel bærer. Sådanne formuleringer omfatter tørre og flydende typer, fx puddere, herunder pudderbaser eller -koncentrater, pulvere, herunder 15 opløselige eller befugtelige pulvere, granulater, herunder mikrogra-nuler og dispergerbare granuler, pellets, "flowables", emulsioner såsom fortyndede emulsioner eller emulgerbare koncentrater, dips såsom dips til rødder og frø, frøbejdse, frøpellets, oliekoncentrater, olieopløsninger, injektioner, fx stængelinjektioner, sprays, røg 20 og tåger.

Generelt omfatter sådanne formuleringer forbindelsen i forbindelse med en egnet bærer eller et egnet fortyndingsmiddel. Sådanne bærere og fortyndingsmidler er som beskrevet i GB 2166436. *

Koncentrationen af aktivt materiale i formuleringerne er generelt fra 25 0,01 til 99 vægtprocent og fortrinsvis mellem 0,01 og 40 vægtprocent.

Kommercielle produkter leveres generelt som koncentrerede præparater, der skal fortyndes inden anvendelse til en passende koncentration, fx fra 0,001 til 0,0001 vægtprocent.

Den hastighed, hvormed en forbindelse appliceres, afhænger af et 30 antal faktorer, herunder typen af skadelige organismer og den skadelige organismes angrebsgrad. Generelt vil en applikationsmængde på 10 g/ha til 10 kg/ha imidlertid være passende; mængden er fortrinsvis DK 170344 B1 5 fra 10 g/ha til 1 kg/ha til kontrol af mider og insekter og fra 50 g/ha til 10 kg/ha til kontrol af nematoder.

Opfindelsen angår også en ikke-terapeutisk fremgangsmåde til bekæmpelse af skadelige insekter, mider eller nematoder, hvilken frem-5 gangsmåde er ejendommelig ved, at en forbindelse ifølge opfindelsen appliceres til skadelige insekter, mider eller nematoder eller det sted, hvor de befinder sig, i en mængde, der er effektiv til bekæmpelse af skadedyrene.

Til anvendelse i veterinær medicin eller til havebrugsmæssig og 10 landbrugsmæssig anvendelse kan det være ønskeligt at anvende den samlede fermenteringsvæske (jfr. nedenstående fremgangsmåde til fremstilling af de omhandlede forbindelser) som kilde til den aktive forbindelse. Det kan også være passende at anvende tørret næringsvæske (jfr. nedenstående fremgangsmåde til fremstilling af de omhand-15 lede forbindelser) (indeholdende mycelier) eller at anvende mycelier, der er blevet adskilt fra næringsvæsken (jfr. nedenstående fremgangsmåde til fremstilling af de omhandlede forbindelser) og pasteuriseret eller især tørret, fx ved sprøjte-, fryse- eller rulletørring. Om ønsket kan næringsvæsken eller myceliet (jfr. nedenstående fremgangs-20 måde til fremstilling af de omhandlede forbindelser) formuleres i præparater, der indeholder konventionelle inerte bærere, excipienser eller fortyndingsmidler som beskrevet ovenfor.

De antibiotiske forbindelser ifølge opfindelsen kan administreres eller anvendes i kombination med andre aktive bestanddele.

25 Især kan den antibiotiske forbindelse ifølge opfindelsen anvendes sammen med andre antibiotiske forbindelser. Dette kan fx forekomme, hvor den samlede fermenteringsvæske (jfr. nedenstående fremgangsmåde til fremstilling af de omhandlede forbindelser) anvendes uden forudgående adskillelse af forbindelser ifølge opfindelsen, eller hvor rå 30 fermenteringsprodukter omsættes ifølge opfindelsens fermenteringsproces (jfr. nedenstående fremgangsmåde til fremstilling af de omhandlede forbindelser) uden forudgående eller efterfølgende adskillelse; dette kan fx foretrækkes til landbrugsmæssig anvendelse af en DK 170344 B1 6 forbindelse, hvor det er vigtigt at opretholde lave produktionsomkostninger.

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan fremstilles som beskrevet i det følgende, hvor og X har de for den almene formel (1) anførte 5 betydninger.

Et yderligere aspekt af opfindelsen angår således en fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse med formlen (1), hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en forbindelse med formlen (2) | £ $N.-u*CH3 V'k '8kvtv"™ H I _ k !| |\ ^ /0 CH3 (2) «i ψ HVv H b 10 hvori X og har de i krav 1 anførte betydninger, inkuberes i et substrat indeholdende assimilerbare kilder til carbon, nitrogen og mineralsalte, i nærværelse af en mikroorganisme af typen Streptomyces avermitilis ATCC 31272 eller ATCC 31780 eller mutanter deraf med væsentlig samme egenskaber.

15 Mutanter af de ovennævnte stammer kan opstå spontant eller kan fremstilles ved forskellige metoder, herunder sådanne, der er beskrevet i GB 2166436.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan omdannelse af en forbindelse med formlen (2) til en forbindelse med formlen (1) udføres ved at 20 sætte forbindelsen med formlen (2), fx i et egnet opløsningsmiddel, f til et fermenteringssubstrat, der omfatter den ovennævnte mikroorganisme i nærværelse af assimilerbare kilder til carbon, nitrogen og mineralsalte. Assimilerbare kilder til carbon, nitrogen og mineraler kan tilvejebringes af enten simple eller komplekse næringsstoffer.

DK 170344 B1 7

Carbonkilder omfatter generelt glucose, maltose, stivelse, glycerol, melasse, dextrin, lactose, saccharose, fructose, carboxylsyrer, aminosyrer, glycerider, alkoholer, alkaner og vegetabilske olier. Carbonkilder omfatter generelt fra 0,5 til 10 vægtprocent af fermen -5 teringssubstratet.

Nitrogenkilder omfatter generelt sojabønnemel, majsudtræk, opløselige stoffer til spritfremstilling, gærekstrakter, bomuldsfrømel, peptoner, formalede nødder, maltekstrakt, melasse, kasein, aminosyreblan-dinger, ammoniak (gas eller opløsning), ammoniumsalte eller nitrater.

10 Urinstof eller andre amider kan også anvendes. Nitrogenkilder omfatter generelt fra 0,1 til 10 vægtprocent af fermenteringssubstratet.

Nærende mineralsalte, der kan inkorporeres i kultursubstratet, omfatter de generelt anvendte salte, der er i stand til at give na-15 trium-, kalium-, ammonium-, jern-, magnesium-, zink-, nikkel-, ko-balt-, mangan-, vanadium-, chrom-, calcium-, kobber-, molybdæn-, bor-, phosphat-, sulfat-, chlorid- og carbonationer.

Et antiskumningsmiddel kan også være til stede for at kontrollere overskydende skumdannelse, og det kan tilsættes i intervaller efter 20 behov.

Forbindelsen med formlen (2) i et opløsningsmiddel såsom et vandblandbart, organisk opløsningsmiddel (fx en alkohol såsom methanol eller propan-2-ol, en diol såsom propan-l,2-ol eller butan-l,3-ol, en keton såsom acetone, en nitril såsom acetonitril, en ether såsom 25 tetrahydrofuran eller dioxan, et substitueret amid såsom dimethylfor-mamid eller et dialkylsulfoxid såsom dimethylsulfoxid) kan tilsættes ved dyrkningens start eller mere normalt, når mikroorganismens vækst er begyndt, fx 2-4 dage efter dyrkningens start.

Dyrkning af organismen udføres generelt ved.en temperatur på 20-50°C, 30 fortrinsvis 25-40eC, og finder hensigtsmæssigt sted med gennemluft-ning og agitation, fx ved rystning eller omrøring. Substratet kan indledningsvis inokkuleres med en lille mængde af en suspension af den sporulerede mikroorganisme, men for at tindgå en forsinkelse i DK 170344 B1 8 vækst kan der fremstilles et vegetativt inokkulum af organismen ved at inokkulere en lille mængde af kultursubstratet med organismens sporeform, og det opnåede vegetative inokkulum kan overføres til fermenteringssubstratet eller fortrinsvis til ét eller flere pod-5 ningsstadier, hvor yderligere vækst finder sted, inden overførsel til hovedfermenteringssubstratet.

Når forbindelsen med formlen (2) er blevet sat til kulturen, normalt under let omrøring, fortsættes dyrkningen, således at det ønskede produkt akkumuleres. Tilstedeværelsen af produktet i fermenterings-10 væsken kan bestemmes ved at følge ekstrakter af væsken ved HPLC og ved UV-spektroskopi ved 238 nm.

Produktet eller produkterne kan isoleres fra den samlede fermenteringsvæske ved konventionelle isolerings- og adskillelsesteknikker som beskrevet i GB 2166436 og GB 2176182.

15 I en særlig udførselsform af fermenteringsprocessen fremstilles forbindelser med formlen (1), hvor betegner en hydroxygruppe, hensigtsmæssigt ud fra tilsvarende forbindelser med formlen (2) i et egnet substrat.

Mellemproduktforbindelser med formlen (2) kan fremstilles ved reduk-20 tion af en forbindelse med formlen (3)

TT

°γ^Φ^ΐΓ;αΐ3 λ.·'** 1 >n *1 1 mi 'w V <·> 3 h* I 3 hvor R^ og X har de i krav 1 anførte betydninger.

DK 170344 B1 9

Reduktionen kan fx udføres under anvendelse af et reduceringsmiddel såsom et borhydrid, fx et alkalimetalborhydrid såsom natriumborhydrid eller et lithiumalkoxyaluminiumhydrid såsom lithiumtributoxyalumi-niumhydrid.

5 Den reaktion, der involverer et borhydridreduceringsmiddel, finder sted i nærværelse af et opløsningsmiddel såsom en alkanol, fx isopro-pylalkohol eller isobutylalkohol, hensigtsmæssigt ved en temperatur i området -30°C til 80°C, fx ved 0eC. Den reaktion, der involverer et lithiumalkoxyaluminiumhydrid, finder sted i nærværelse af et opløs-10 ningsmiddel såsom en ether, fx tetrahydrofuran eller dioxan, hensigtsmæssigt ved en temperatur i området -78eC til 0°C, fx ved -78°C.

Mellemproduktforbindelser med formlen (3) kan fremstilles ved oxidation af en forbindelse med formlen (4) k V013

I« 0¾. /0H CH3 W

ilit 15 hvor X har den i formel 1 anførte betydning, og R^' betegner methoxy eller en beskyttet hydroxygruppe, efterfulgt af fjernelse af en eventuel tilstedeværende beskyttelsesgruppe.

Egnede oxidationsmidler til omdannelsen omfatter dialkylsulfoxider, fx dimethylsulfoxid, i nærværelse af et aktiveringsmiddel såsom N,N'-20 dicyclohexylcarbodiimid eller et acylhalogenid, fx oxalylchlorid. Reaktionen kan hensigtsmæssigt udføres i et egnet opløsningsmiddel såsom et halogeneret carbonhydrid, fx methylenchlorid, ved en temperatur i området -80°C til 50eC.

DK 170344 B1 10

Mellemproduktforbindelser med formlen (4) kan fremstilles ved oxidation af en forbindelse med formlen (5) <Τϊ Τ’ “ <5> upt «i 3 hvori X og R^' har de ovenfor anførte betydninger.

5 Oxidationen kan fx udføres med et oxidationsmiddel såsom selendioxid, fortrinsvis i nærværelse af et aktiveringsmiddel såsom et peroxid, fx tert-butylhydroperoxid. Reaktionen kan hensigtsmæssigt udføres i et inert opløsningsmiddel såsom et halogeneret carbonhydrid, fx di-chlormethan, en ester, fx ethylacetat, eller en ether, fx tetrahydro-10 furan, ved en temperatur i området 0-50°C, fortrinsvis ved stuetemperatur .

Alternativt kan en forbindelse med formlen (5) behandles med et oxidationsmiddel, der er beskrevet ovenfor, i myresyre ved en temperatur på 20-100°C, fx 60°C, til dannelse af en forbindelse med 15 formlen (6) 0HC0, 3 ? *2, \ ^313 <«> !(l<w Uh Η X 3 DK 170344 B1 11 hvor X og har de ovenfor anførte betydninger, som efter sur hydrolyse, fx under anvendelse af saltsyre, giver en forbindelse med formlen (4).

Mellemproduktforbindelser med formlen (6), hvor -X- betegner 5 >C-N0CH3, kan om ønsket fremstilles ud fra en forbindelse svarende til en forbindelse med formlen (6), men hvor -X- betegner >C=0, ved omsætning med et reagens med formlen H2NOCH3.

Oximeringsreaktionen kan hensigtsmæssigt udføres ved en temperatur i området fra -20°C til 100eC, fx fra -10°C til 50°C. Det er hensigts-10 mæssigt at anvende reagenset H2NOCH3 i form af et salt, fx et syreadditionssalt såsom hydrochloridet. Når et sådant salt anvendes, kan reaktionen udføres i nærværelse af et syrebindemiddel.

Opløsningsmidler, som kan anvendes, omfatter alkoholer (fx methanol eller ethanol), amider (fx N,N-dimethylformamid, N,N-dimethylacetamid 15 eller hexamethylphosphoramid), ethere (fx cykliske ethere såsom tetrahydrofuran eller dioxan og acykliske ethere såsom dimethoxyethan eller diethylether), nitriler (fx acetonitril), sulfoner (fx sulfo-lan) og carbonhydrider såsom halogenerede carborihydrider (fx methy-lenchlorid) samt blandinger af to eller flere sådanne opløsningsmid-20 ler. Vand kan også anvendes som co-opløsningsmiddel.

Når vandige betingelser anvendes, kan reaktionen hensigtsmæssigt bufres med en egnet syre, base eller buffer.

Egnede syrer omfatter mineralsyrer såsom saltsyre eller svovlsyre og carboxylsyrer såsom eddikesyre. Egnede baser omfatter alkalimetal-25 carbonater og -hydrogencarbonater såsom natriumhydrogencarbonat, hydroxider såsom natriumhydroxid og alkalimetalcarboxylater såsom natriumacetat. En egnet buffer er natriumacetat/eddikesyre.

Mellemproduktforbindelser med formlen (5), hvor X betegner er kendte forbindelser, der er beskrevet i GB 2166436 og GB 2176182.

30 Mellemproduktforbindelser med formlen (5), hvor X betegner >C«N0CH3, kan fremstilles ud fra 5-ketoforbindelser svarende til formlen (5) DK 170344 B1 12 ved omsætning med et reagens H2NOCH3 under anvendelse af de ovenfor beskrevne betingelser til oximeringsreaktionen.

Opfindelsen belyses yderligere ved de følgende fremstillinger og eksempler, hvor forbindelsen svarende til forbindelsen med formlen 5 R2 R3 v* (5) ovenfor, men hvor X betegner -C- (hvor R2 betegner en hydroxylgruppe, og R3 betegner et hydrogenatom) og R^' betegner en hydroxygruppe, er betegnet "faktor A". Forbindelserne ifølge opfindelsen er benævnt i forhold til faktor A.

10 Mellemprodukt 1 (13R) -Hydroxy-23-desoxy faktor A, 5-acetat 23-Desoxy faktor A, 5-acetat (4,79 g, eksempel 112 i GB 2176182) blev sat til en omrørt opløsning af selendioxid (416 mg) og t-butylhydro-peroxid (3M i dichlormethan; 5 ml) i dichlormethan (30 ml). Efter 15 omrøring ved stuetemperatur i 30 timer blev reaktionsblandingen fortyndet med ethylacetat (200 ml), vasket med vand og saltvand og tørret (Na2S0^.). Opløsningsmidlet blev afdampet, og remanensen blev oprenset ved kromatografi (250 g silicagel, Merck# 9385). Eluering med ethylacetat: let petroleum (1:4-+1:2) gav titelforbindelsen (560 20 mg) som et svagt gult skum. v^-y (CHBr-^) 3600, 3460 (OH), 1732 (OAc), 1712 (CO2R), 993 cm-^- (C-0); δ (CDCI3)-værdier omfatter 0,69 (3H, t, J 5 Hz), 2,15 (3H,s), 3,32 (lH,m), 3,72 (IH, d, J 10 Hz), 4,05 (IH, d, J 5 Hz), 5,52 (2H,m).

Mellemprodukt 2 25 13-Keto-23-desoxy faktor A, 5-acetat

En opløsning af dimethylsulfoxid (92 μΐ) i dichlormethan (1 ml) blev tilsat dråbevis i løbet af 2 minutter til en opløsning af oxalyl-chlorid (57 μΐ) i dichlormethan (2 ml) ved -50°C i nitrogenatmosfære. Efter 5 minutter blev en opløsning af mellemprodukt 1 (213 mg) i DK 170344 B1 13 dichlormethan (3 ml) tilsat dråbevis i løbet af 2 minutter ved -50eC. Efter 30 minutter ved fra -50°C til -45°C blev triethylamin (453 μΐ) tilsat. Efter 5 minutter blev afkølingsbadet fjernet, og reaktions-blandingen lodes opvarme til stuetemperatur i løbet af 30 minutter.

5 Reaktionsblandingen blev adskilt mellem dichlormethan (50 ml) og vand (50 ml). Den organiske fase blev fraskilt, og den vandige fase blev ekstraheret med dichlormethan (25 ml). De samlede organiske ekstrakter blev vasket med 2M saltsyre (75 ml), mættet natriumhydrogencarbo-natopløsning (75 ml) og saltvand (75 ml) og tørret (Na2S0^). Opløs-10 ningsmidlet blev afdampet, og remanensen blev oprenset ved flashkromatografi (35 g silicagel, Merckx 9385). Eluering med ethylacetat: let petroleum (1:2) gav titelforbindelsen (132 mg) som et hvidt skum. [a]$2 + 256° (c0,6, CHCI3); 8 (CDCI3)-værdier omfatter 1,76 (3H,s), 1,82 (3H,s), 2,16 (3H,s), 3,40 (2H,m), 5,09 (IH, d, J 9 Hz), 5,52 15 (2H,m), 6,26 (IH, t, J 8 Hz).

Mellemprodukt 3 (13S)·Hydroxy-23-desoxy faktor Å, 5-acetat

En opløsning af natriumborhydrid (0,2M i ethanol; 3,63 ml) blev dråbevis sat til en opløsning af mellemprodukt 2 (431 mg) i ethanol 20 (15 ml) ved 0eC. Efter 30 minutter ved 0“C blev reaktionsblandingen fortyndet med ethylacetat, vasket med 2M saltsyre, mættet natrium-hydrogencarbonatopløsning og saltvand og tørret (Na2S0^). Opløsningsmidlet blev afdampet, og remanensen blev oprenset ved flashkromatografi (40 g silicagel, Merck® 9385), Eluering med ethylacetat: let 25 petroleum (1:3) gav titelforbindelsen som et hvidt skum (368 mg); 8 (CDCI3)-værdier omfatter 0,69 (3H,d,J5Hz), 0,93 (3H,d,J6Hz), 1,04 (3H,d,J6Hz), 1,17 (3H,d,J6Hz), 3,31 (lH,m), 4,00 (IH,s), 4,04 (lH,d,5Hz), 5,52 (2H,m).

DK 170344 B1

Mellemprodukt 4 14

(13S)-Hydroxy - 23-desoxy faktor A

Vandigt natriumhydroxid (1M; 87 μΐ) blev sat til en omrørt opløsning af mellemprodukt 3 (38 mg) i methanol (1 ml) ved 0°C. Efter 1,5 time 5 ved 0°C blev reaktionsblandingen fortyndet med ethylacetat (25 ml), vasket med vand og saltvand og tørret (Na2S0^). Opløsningsmidlet blev af dampet, og remanensen blev oprenset ved flashkromatografi (10 g silicagel, Merck® 9385). Eluering med ethylacetat: let petroleum (1:2) gav titelforbindelsen som et hvidt skum (31 mg); t/mgv (CHB^) 10 3540, 3460 (OH), 1704 cm"^ (CO2R); S CDCI3)-værdier omfatter 0,69 (3H,d,J5Hz), 0,95 (3H,d,J6Hz), 1,06 (3H,d,J6Hz), 1,18 (3H,d,J6Hz), 3,26 (lH,m), 3,96 (lH,d,J5Hz), 4,01 (2H,s), 4,29 (lH,t,J5Hz).

Mellemprodukt 5 (13R)-Formyloxy-23-keto faktor A, 5-acetat 15 En opløsning af 23-keto faktor A, 5-acetat (420 mg, eksempel 18 i GB 2176182) i myresyre (3 ml) blev tinder omrøring sat til en opslæmning af selendioxid (120 mg) i myresyre (1 ml) ved 60eC. Reaktionsblandingen blev omrørt ved 60eC i 6 minutter, derefter hældt i vand (150 ml) og ekstraheret med diethylether (4 x 50 ml). Den organiske fase blev 20 tørret (MgSO^, og opløsningsmidlet blev fjernet til dannelse af et brunt fast stof, som blev oprenset ved mellemtrykssøjlekromatografi på silica (100 g Merck® kieselgel 60; 230-400 mesh (63-38 /im)). Eluering med dichlormethan:ethylacetat (16:1) gav titelforbindelsen som et cremefarvet skum (103 mg); (CHBr3) 3480 (OH) og 1714 crn'^· 25 (ester og keton); δ (CDCI3) omfatter 0,86 (d,6Hz,3H), 0,97 (d,6Hz,3H), 1,02 (d,6Hz,3H), 1,07 (d,6Hz,3H), 1,76 (s,3H), 3,32 (m,lH), 2,16 (s,3H), 4,06 (d,6Hz,lH), 5,02 (d,10Hz,lH), 5,53 (m,2H), 8,08 (s,IH).

DK 170344 B1

Mellemprodukt 6 15 (13R) -Formyloxy-23 (E) -methoxyimino faktor Å, 5-acetat

En opløsning af methoxyaminhydrochlorid (29 mg) og natriumacetat (33 mg) i vand (0,7 ml) blev sat til en opløsning af mellemprodukt 5 5 (80 mg) i methanol (8 ml). Reaktionsblandingen blev omrørt ved stue temperatur i 3 timer, derefter hældt i ether (40 ml) og vasket med vand. Den organiske fase blev tørret (MgSO^), og opløsningsmidlet blev fjernet til dannelse af titelforbindelsen som et cremefarvet skum (79 mg); S (CDC13) omfatter 0,91 (d,6Hz,3H), 0,97 (d,6Hz,3H), 10 1,02 (d,6Hz,3H), 1,07 (d,6Hz,3H), 1,76 (s,3H), 2,16 (s,3H)m, 3,28 (d,15Hz,lH), 1,91 (d,15Hz,lH), 3,32 (m,lH), 3,83 (s,3H), 4,06 (d,6Hz,lH), 5,04 (d,10Hz,lH), 5,54 (m,2H), 8,09 (s,IH).

Mellemprodukt 7 (13R) -Hydroxy-23 (E) -methoxyimino faktor Å, 5-acetat 15 2N Saltsyre (0,1 ml) blev sat til en opløsning af mellemprodukt 6 (65 rag) i methanol (5 ml). Reaktionsblandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 4 timer, derefter hældt i dichlormethan (60 ml) og vasket med mættet natriumhydrogencarbonatopløsning og vand. Den ’ organiske fase blev tørret (MgSO/,.), og opløsningsmidlet blev fjernet 20 til dannelse af et skum, som blev oprenset ved mellemtrykssøjlekromatografi på silica (30 g, Merck® kieselgel 60, 230-400 mesh (63-38 μα)). Eluering med dichlormethan:ethylacetat (4:1) gav titel-forbindelsen som et hvidt skum (39 mg); [α]β^· + 126° (C-0,22, CH2C12). S (CDCI3) omfatter 0,92 (d,6Hz,3H), 0,96 (d,6Hz,3H), 1,05 25 (d,6Hz,3H), 1,12 (d,6Hz,3H), 1,77 (s,3H), 2,17 (s,3H), 3,29 (d,15Hz,lH), 1,91 (d,15Hz,lH), 3,32 (m,lH), 3,70 (ddl0,2Hz,lH), 3,83 (s,3H), 4,04 (d,6Hz,lH), 5,54 (m,2H).

Mellemprodukt 8 DK 170344 B1 16 13-Keto-23(E)-methoxyimino faktor A, 5-acetat

En opløsning af dimethylsulfoxid (0,4 ml) i nydestilleret dichlorme-than (3,6 ml) blev sat til en opløsning af oxalylchlorid (0,24 ml) i 5 nydestilleret dichlormethan (3,6 ml) under omrøring ved -60°C i nitrogenatmosfære. Opløsningen blev afkølet til -65°C, og efter 5 minutter blev en opløsning af mellemprodukt 7 (770 mg) i dichlormethan (6 ml) tilsat. Afkølingsbadet blev opvarmet til -60°C, hvorefter reaktionsblandingen blev omrørt i yderligere 30 minutter ved fra 10 -60eC til -50eC.

Triethylamin (1,5 ml) blev tilsat, og reaktionsblandingen lodes opvarme til stuetemperatur. Reaktionsblandingen blev derefter hældt i dichlormethan (100 ml), og opløsningsmidlet blev fjernet i vakuum. Diethylether (60 ml) blev tilsat, og triethylaminsaltet blev fra-15 filtreret. Etheren blev fjernet i vakuum til dannelse af et skum, som blev oprenset ved mellemtrykssøjlekromatografi på silica (180 g,

Merck® kieselgel 60, 230-400 mesh (63-38 μιη)). Eluering med dichlormethan: ethylacetat (14:1) gav titelforbindelsen som et beige skum (450 mg); 5 (CDC13) omfatter 0,92 (d,6Hz,3H), 0,96 (d,6Hz,3H), 1,01 20 (d,6Hz,3H), 1,18 (d,6Hz,3H), 1,76 (s,3H), 1,80 (s,3H), 2,16 (s,3H), 3,31 (d,15Hz,lH), 1,93 (d,15Hz,lH), 3,39 (m,lH), 3,84 (s,3H), 4,08 (d,6Hz,lH), 5,54 (m,2H), 6,22 (t,9Hz,lH).

Mellemprodukt 9 (13S)-Hydroxy-23(E)-methoxyimino faktor A, 5-acetat 25 En opløsning af natriumborhydrid (4,9 ml af en 0,2M opløsning i ethanol) blev sat til en opløsning af mellemprodukt 8 (620 mg) i ethanol (25 ml) under omrøring ved 0eC. Reaktionsblandingen blev omrørt ved 0eC i 30 minutter, derefter hældt i ethylacetat (400 ml) og vasket med 2N saltsyre, mættet natriumhydrogencarbonatopløsning, 30 vand og saltvand. Den organiske fase blev tørret (MgSO^.), og opløsningsmidlet blev fjernet til dannelse af et beige skum, som blev DK 170344 B1 17 oprenset ved mellemtrykssøjlekromatografi på silica (180 g, Merck® kieselgel 60, 230-400 mesh (63-38 μιη)). Eluering med dichlormethan:-ethylacetat (10:1) gav titelforbindelsen som et hvidt skum (502 mg); S (CDC13) omfatter 0,92 (d,6Hz,3H), 0,97 (d,6Hz,3H), 1,05 (d,6Hz,3H), 5 1,16 (d,6Hz,3H), 1,76 (s,3H), 2,16 (s,3H), 3,29 (d,15Hz,lH), 1,91 (d,15Hz,lH), 3,32 (m,lH), 3,84 (s,3H), 4,00 (bred s,IH), 4,06 (d,6Hz,IH), 5,53 (m,2H).

Mellemprodukt 10

(13S)-Hydroxy-23(E)-methoxyimino faktor A

10 En opløsning af natriumhydroxid (17 mg) i vand (0,6 ml) blev dråbevis sat til en opløsning af mellemprodukt 9 (291 mg) i methanol (7 ml) under omrøring ved 0°C. Reaktionsblandingen blev omrørt ved O’C i 2 timer, derefter hældt i dichlormethan (75 ml) og vasket med 2N saltsyre (2 x 50 ml), vand og saltvand. Den organiske fase blev tørret 15 (MgSO^.), og opløsningsmidlet blev fjernet til dannelse af et beige skum, som blev oprenset ved mellemtrykssøjlekromatografi på silica (80 g, Merck® kieselgel 60, 230-400 mesh (63-38 μιη)). Eluering med dichlormethan:ethylacetat (4:1) gav titelforbindelsen som et hvidt skum (228 mg). S (CDCI3) omfatter 0,91 (d,6Hz,3H),'0,96 (d,6Hz,3H), 20 1,05 (d,6Hz,3H), 1,17 (d,6Hz,3H), 1,88 (s,3H), 3,29 (d,15Hz,lH), 1,92 (d,15Hz,lH), 3,27 (m,lH), 3,83 (s,3H), 3,96 (d,6Hz,lH), 4,00 (bred s,IH), 4,28 (t,6Hz,lH).

EKSEMPEL 1

En skråkultur af Streptomyces avermitilis ATCC 31272 blev anvendt til 25 inokkulering af en 250 ml rysteflaske, der indeholdt substrat A (25 ml): DK 170344 Bl 18 gi'1 D-glucose 2,5

Maltdextrose MD30E 25,0

Arkasoy 50 12,5 5 Melasse 1,5 KH2P04 0,125

Calciumcarbonat 1,25 [3-(N-morpholino)propansulfonsyre] 21,0

Destilleret vand efter behov 10 pH justeret til 6,5 med H2SO4 inden autoklavering.

Flasken blev inkuberet ved 28°C i 2 dage på en roterende rystemaskine (250 omdrejninger pr. minut), og en portion (5 ml) af denne 2 dage gamle kultur blev placeret i en 50 ml rysteflaske, og 50 μΐ af en 20 mg/ml opløsning af (13S)-hydroxy-23(E)-methoxyimino faktor A i 15 methanol blev tilsat. Flasken blev inkuberet ved 28°C i 5 dage på en roterende rystemaskine (250 omdrejninger pr. minut), hvorefter et tilsvarende volumen methanol blev tilsat. Rysteflasken og indholdet blev rystet i 1 time, centrifugeret for at fjerne cellerne, og super-natanten blev inddampet i vakuum til 1 ml.

20 180 μΐ af prøven blev fraktioneret på en søjle af Spherisorb S5 ODS-2 (100 mm x 4,6 mm) med påvisning ved 238 nm. Et gradientopløsnings-middelsystem blev anvendt ved en konstant strøm på 3 ml/minut mellem opløsningsmiddel A (acetonitril/vand 1:1) og opløsningsmiddel B (acetonitril/vand 65:35). Det første eluent indeholdt 80% opløsnings- * 25 middel A og 20% opløsningsmiddel B og efter 10 minutter 100% opløsningsmiddel B. Fra hver injektion blev UV-absorberende toppe med retentionsforhold i forhold til uændret substrat på 2,13 og 3,45 opsamlet, og de toppe, der havde identiske retentionsforhold, blev samlet og inddampet til dannelse af (a) en forbindelse med formlen 30 (1), hvor R er a-L-oleandrosyl-a-L-oleandrosyl-, X er X3-NOCH3, R^ er en hydroxylgruppe (retentionsforhold 2,13); massespektrum (elektron-impakt) m/z omfatter 907, 795, 764, 620, 618, 566, 476, 408, 376 og 145 (negativ Cl, NH3) m/z 943 (M*. 925, 907 (positiv Cl, NH3) m/z 961 (Μ+ΝΗ4)+, 944 (MH)+ og (b) en forbindelse med formlen (1), hvor R er 35 o-L-oleandrosyl-a-L-oleandrosyl, X er >C-N0CH3, R^ er en methoxygrup-pe (retentionsforhold 3,45; massespektrum (elektronimpakt) m/z om- DK 170344 B1 19 fatter 907, 827, 814, 795, 764, 670, 651, 376, 275, 264, 263, 257, 145, 127, 113, 95 og 87 (negativ Cl, NH3) m/z 957 (Μϊ), 907 (M*H20-CH30H)i (positiv Cl, NH3) m/z 975 (M+NH4)"1·, 958 (MH) + .

EKSEMPEL 2 5 2 x 25 ml volumener af substrat A i 250 ml rysteflasker blev inokku- leret direkte fra en skråkultur af Streptomyces avermitilis ATCC 31780 og dyrket ved 28eC på en roterende rystemaskine med en hastighed på 250 omdrejninger pr. minut og en omdrejning på ca. 5 cm (2") i 2 dage.

10 Flaskernes indhold blev anvendt til inokkulering af 2,5 1 substrat A i et 3,5 1 garingskar, der indeholdt polypropylenglycol 2000 (1,25 ml). Kulturen blev holdt ved 28eC og rystet ved 250 omdrejninger pr. minut og gennemluftet ved 1,25 1 pr. minut. Efter 2 dage blev 13(S)-hydroxy-23-desoxy faktor A (234 mg) i methanol (25 ml) tilsat efter-15 fulgt af sinefungin (30 mg) i vand (25 ml). På dette stadium blev rystnings- og gennemluftningshastighederne øget til henholdsvis 500 omdrejninger pr. minut og 2,5 1 pr. minut.

Efter 4 dage blev fermenteringsvæsken centrifugeret, supematanten blev dekanteret, og cellerne blev vasket med vand (0,5 1) og centri-20 fugeret igen. Vaskevandet blev sat til supematanten, og denne blev ekstraheret med ethylacetat (4 x 0,25 1). De samlede ethylacetateks-trakter blev inddampet i vakuum til dannelse af en olie. Cellerne blev ekstraheret med methanol, og de samlede methanolekstrakter blev vasket med hexan (4 x 0,1 1 med 0,1 1 vand tilsat på hvert stadium), 25 og det vandige lag blev derefter ekstraheret med methylenchlorid (3 x 0,2 1), og de samlede methylenchloridlag blev inddampet i vakuum til en olie. Olien fra ekstraktionen af supematanten blev ekstraheret med acetonitril (25 ml), og denne opløsning blev sat til den olie, der stammede fra cellerne, og filtreret. Filtratet blev sat på 30 en søjle (26 x 2 cm) af Sephadex® LH20 i acetonitril, og fraktioner (10 ml) blev opsamlet efter en indledende kørsel på 50 ml. Fraktioner 2-18 blev samlet, inddampet i vakuum til en olie, som blev opløst i acetonitril (15 ml) og vand (1 ml) og udsat for præparativ kromato- DK 170344 B1 20 graf i på Spherisorb S50DS-2 (25 cm x 2 cm) i et opløsningsmiddel af acetonitril/vand (7:3) ved en strømhastighed på 25 ml/minut og påvisning ved λ 238 nm. Fraktioner, der eluerede på mellem 43-46 minutter fra på hinanden følgende (1 ml) injektioner, blev samlet, for- .

5 tyndet med vand (1:1) og pumpet tilbage på søjlen og derefter elueret med acetonitril. Afdampning af acetonitrilen i vakuum gav en olie, * som blev opløst i methanol (2 ml) og passeret gennem en søjle (100 ml) af Sephadex® LH20 i methanol. Kombination af fraktioner med Amax på 244 nm og inddampning igen i vakuum gav en olie. Denne blev 10 igen opløst i acetonitril (4 ml) og fraktioneret (15 ml) på en søjle (25 cm x 2 cm) af Sephadex® LH20 i acetonitril. Kombination af fraktioner 5-10, inddampning af disse i vakuum, efterfulgt af lyofili-sering fra remanensen af cyclohexan/acetone gav en forbindelse med formlen (1), hvor R er a-L-oleandrosyl-et-L-oleandrosyl, X er >CH2 og 15 R^ er en hydroxygruppe, (19,3 mg) som et farveløst fast stof, A(MeOH) 231,2 inf. (Ej 202), 240 inf. (Ej 256), 244,6 (Ej; 278), 250 nm inf.

(Ej 206), j/ CHBr3 3570, 3550, 1705, 1040, 980 cm'1.

Et 125 MHz 13c-NMR-spektram i CDCI3 gav signaler ved ca. 5173,8, 139.5, 137,9, 137,8, 136,4, 134,6, 131,5, 124,5, 120,3, 118,4, 117,9, 20 98,4, 97,5, 94,5, 82,4, 81,5, 80,4, 80,2, 79,2, 79,0, 78,1, 76,0, 68.5, 68,3, 68,0, 67,6, 67,1, 56,3, 56,2, 45,6, 40,8, 39,6, 36,8, 35.5, 34,4, 34,1, 31,5, 27,5, 26,5, 22,8, 22,6, 20,1, 19,8, 18,2, 17.6, 17,5, 15,0 og 10,9.

500 MHz %-NMR-spektrum gav signaler ved ca. 53,78 (IH, dq, 10, 6), 25 3,82 (IH, dq, 10, 6), 3,18 (IH, t, 9), 3,22 (IH, t, 9) og 3,42 (6H,s).

MS (E.l.) 900 (Ml-) 882, 756, 738, 612, 594, 576, 484, 333, 315, 261, 249, 221, 179, 145.

DK 170344 B1 21 EKSEMPEL 3

Streptomyces avermitilis ATCC 31272 blev inkuberet med 13(S)-hydroxy-23-desoxy faktor A ifølge fremgangsmåden i eksempel 1.

180 μΐ portioner af den vundne prøve blev fraktioneret på en søjle af 5 Spherisorb S5 0DS-2 (100 mm x 4,6 mm) med påvisning ved 238 nm under anvendelse af acetonitril/vand (65:35) justeret til pH 4,2 med eddikesyre som eluent. Den UV-absorberende top med et retentionsforhold i forhold til uændret substrat på 1,87 blev opsamlet fra hver injektion, og toppene med identiske retentionsforhold blev samlet og 10 inddampet i vakuum til dannelse af en forbindelse med formlen (1), hvor R er a-L-oleandrosyl, X er >CH2 og er en hydroxygruppe, (retentionsforhold 1,87); massespektrum (elektronimpakt) m/z omfatter 756 (Mt), 738, 720, 594, 576, 333, 315, 261, 249, 221, 179, 151 og 145 (negativ Cl, NH3) m/z 756 (M*).

15 TESTEKSEMPEL

Forbindelsen fra eksempel 2 blev afprøvet med hensyn til minimum dødelig koncentration mod Cooperia elegans idet testforbindelsen (i vand) blev sat til en suspension af nematoden i vand (bufret til pH 7). Suspensionen undersøges efter 4 timer for at bestemme den mini-20 ' mumkoncentration, der giver 98% effektivitet. Bestemt på denne måde viste forbindelsen sig at have en minimum dødelig koncentration på 0,15 /ig/ml.

Forbindelsen blev endvidere afprøvet in vivo i mus mod Nematospiroi-des dubius som en model for parasitisk gastritis i mus. Ved denne 25 test blev CRH-hunmus (20 g) inficeret oralt med 100 13-larver af N. dubius. Terapeutiske tests blev udført i musene 3 uger efter infektionen, på hvilket tidspunkt udvoksede orme havde etableret sig i tyndtarmen. Testforbindelsen blev opløst i propylenglycol, og en enkelt dosis blev administreret subcutant i en mængde på 10 mg/kg.

30 3-5 dage efter behandling blev musene aflivet og tyndtarmen fjernet, og orme blev opsamlet over et tidsrum på 5 timer under anvendelse af et modificeret Baermann-apparat holdt ved 37eC. Efter ormemigrering DK 170344 B1 22 blev ormene koncentreret og talt (orme fanget i Baermann-gazen og migrerede orme). Aktivitet blev bestemt som den gennemsnitlige procentuelle reduktion i ormebelastningen hos behandlede mus sammenlignet med ubehandlede inficerede kontroldyr.

» 5 Det viste sig, at forbindelsen fra eksempel 2 gav en 99% reduktion i ormebelastningen ved denne test.

De følgende er eksempler på præparater ifølge opfindelsen. Udtrykket "aktiv bestanddel", som anvendt i det følgende, betyder en forbindelse ifølge opfindelsen.

10 Hultidos is parenteral injektion EKSEMPEL 1 X vægt/volumen område

Aktiv bestanddel 2,0 0,1-6,0% vægt/vol.

Benzylalkohol 1,0 15 Polysorbat 80 10,0

Glycerolformal 50,0

Vand til injektioner til 100,0

Den aktive bestanddel opløses i polysorbat 80 og glycerolformal. Benzylalkohol tilsættes, og vand til injektioner tilsættes til slutvolu-20 menet. Produktet steriliseres ved konventionelle metoder, fx ved sterilfiltrering eller ved opvarmning i en autoklave, og pakkes aseptisk.

EKSEMPEL 2 % vægt/volumen område 25 Aktiv bestanddel 4,0 0,1-7,5% vægt/vol.

Benzylalkohol 2,0

Glyceryltriacetat 30,0

Propylenglycol til 100,0 DK 170344 B1 23

Den aktive bestanddel opløses i benzylalkohol og glyceryltriacetat. Propylenglycol tilsættes til slutvolumenet. Produktet steriliseres ved konventionelle farmaceutiske metoder, fx sterilfiltrering, og pakkes aseptisk.

5 EKSEMPEL 3 X område

Aktiv bestanddel 2,0 vægt/vol. 0,1-7,5% vægt/vol.

Ethanol 36,0 vol./vol.

Ikke-ionisk overflade-10 aktivt middel (fx Synperonic® PE L44*) 10,0 vægt/vol.

Propylenglycol til 100,0

Den aktive bestanddel opløses i ethanol og overfladeaktivt middel, og der fyldes op til slutvolumenet. Produktet steriliseres ved konventi-15 onelle farmaceutiske metoder, fx sterilfiltrering, og pakkes aseptisk.

* Varemærke ICI EKSEMPEL 4 % område 20 Aktiv bestanddel 2,0 vægt/vol. 0,1-3,0% vægt/vol.

Ikke-ionisk overflade-aktivt middel (fx Synperonic® PE F68*) 2,0 vægt/vol.

Benzylalkohol 1,0 vægt/vol.

25 Miglyol® 840 ** 16,0 vol./vol.

Vand til injektioner til 100,0

Den aktive bestanddel opløses i Miglyol® 840. Det ikke-ioniske overfladeaktive middel og benzylalkohol opløses i hovedparten af vandet. Emulsionen fremstilles ved tilsætning af den olieagtige opløsning til 30 den vandige opløsning under homogenisering ved anvendelse af konven- DK 170344 B1 24 tionelle midler. Der fyldes op til slutvolumenet. Der fremstilles og pakkes aseptisk.

* Varemærke ICI ** Varemarke Dynamit Nobel 5 Aerosol spray Vægtprocent område

Aktiv bestanddel 0,1 0,01-2,0 vægtprocent

Trichlorethan 29,9

Trichlorfluormethan 35,0 10 Dichlordif luormethan 35,0

Den aktive bestanddel blandes med trichlorethan og fyldes i en aerosolbeholder. Drivgassen fyldes på, og ventilen sættes på plads. Den krævede vægtmængde flydende drivmiddel påfyldes gennem ventilen under tryk. Beholderne udstyres med udløsere og støvkapsler.

15 Tablet

Fremstillingsmetode - vådgranulering mg

Aktiv bestanddel 250,0

Magnesiumstearat 4,5 -- 20 Majsstivelse 22,5

Natriumstivelsesglycolat 9,0

Natriumlaurylsulfat 4,5

Mikrokrystallinsk cellulose til tabletkemevægt på 450 mg

En tilstrækkelig mængde af en 10% stivelsespasta sættes til den ak-25 tive bestanddel til dannelse af en passende våd masse til granulering. Granulerne fremstilles og tørres under anvendelse af en bakke-eller fluid-bed-tørrer. Der sies gennem en si, de øvrige bestanddele tilsættes, og der komprimeres til tabletter.

DK 170344 B1 25

Om nødvendigt kan tabletkernerne filmovertrækkes under anvendelse af hydroxypropylmethylcellulose eller andre lignende filmdannende materialer under anvendelse af enten et vandigt eller ikke-vandigt opløsningsmiddelsystem. Et blødgøringsmiddel og en passende farve kan in-5 kluderes i filmovertræksopløsningen.

Veterinær tablet til små-/husdyrbrug Fremstillingsmetode - tør granulering mg

Aktiv bestanddel 50,0 10 Magnesiumstearat 7,5

Mikrokrystallinsk cellulose til tabletkernevægt på 75,0

Den aktive bestanddel blandes med magnesiumstearat og mikrokrystallinsk cellulose. Blandingen komprimeres til kugler. Kuglerne ned-15 brydes ved at passere dem gennem en roterende granulator til dannelse af fritflydende granuler. Der komprimeres til tabletter.

Tabletkernerne kan derefter, om ønsket, filmovertrækkes som beskrevet ovenfor.

Veterinær intrabryst-injektion 20 mg/dosis område

Aktiv bestanddel 150 mg 0,05-1,0 g

Polysorbat 60 3,0 vægtprocent) )

Hvid bivoks 6,0 vægtprocent) til 3 g) til 3 eller 15 g

Arachisolie 91,0 vægtprocent) ) 25 Arachisolie, bivoks og polysorbat 60 opvarmes til 160eC under omrøring. Blandingen holdes ved 160®C i 2 timer og afkøles derefter til stuetemperatur under omrøring. Den aktive bestanddel sættes aseptisk til bæreren og dispergeres vinder anvendelse af en højhastighedsmixer. Blandingen findeles ved at passere den gennem en kolloidmølle. Pro-30 duktet fyldes aseptisk i sterile plastsprøjter.

DK 170344 B1 26

Veterinær bolus til langsom frigivelse vægtprocent område

Aktiv bestanddel 0,25-2 g

Kolloidt silicium- ) til den krævede 5 dioxid 2,0) fyldevægt

Mikrokrystallinsk ) cellulose til 100,0)

Den aktive bestanddel blandes med det kolloide siliciumdioxid og mikrokrystallinsk cellulose under anvendelse af en passende alikvot 10 blandingsteknik til opnåelse af en tilfredsstillende fordeling af den aktive bestanddel i bæreren. Blandingen inkorporeres i anordningen til langsom frigivelse og giver (1) en konstant frigivelse af den aktive bestanddel eller (2) en pulseret frigivelse af den aktive bestanddel.

15 Veterinær oral dosis X vægt/vol. område

Aktiv bestanddel 0,35 0,01-2% vægt/vol.

Polysorbat 85 5,0

Benzylalkohol 3,0 20 Propylenglycol 30,0

Phosphatbuffer til pH 6,0-6,5

Vand til 100,0

Den aktive bestanddel opløses i polysorbat 85, benzylalkohol og propylenglycol. En del af vandet tilsættes, og pH justeres om nødvendigt 25 til 6,0-6,5 med phosphatbuffer. Der fyldes med vand til slutvolu- » menet. Produktet fyldes i dosisbeholderen.

* Φ DK 170344 B1 27

Veterinær oral pasta vægtprocent område

Aktiv bestanddel 4,0 1-20 vægtprocent S ac char innatr ium 2,5 5 Polysorbat 85 3,0

Aluminiumdis tearat 5,0

Fraktioneret kokosolie til 100,0

Aluminiumdistearatet dispergeres i den fraktionerede kokosolie og polysorbat 85 ved opvarmning. Der afkøles til stuetemperatur, og sac-10 charinnatrium dispergeres i den olieagtige bærer. Den aktive bestanddel dispergeres i basen. Plastsprøjter fyldes dermed.

Granuler til veterinær administration i foder vægtprocent område

Aktiv bestanddel 2,5 0,05-5 vægtprocent 15 Calciumsulfat, hemi-bydrat til 100,0

Den aktive bestanddel blandes med calciumsulfatet. Granulerne fremstilles under anvendelse af en vådgranuleringsfremgangsmåde. Der tørres under anvendelse af en bakke- eller fluid-bed-tørrer. En egnet • beholder fyldes.

20 Veterinær "pour-on" X vægt/vol. område

Aktiv bestanddel 2,0 0,1-30%

Dime thylsulfoxid 10,0

Methylisobutylketon 30,0 25 Propylenglycol (og pigment) til 100,0

Den aktive bestanddel opløses i dimethylsulfoxid og methylisobutylketon. Pigmentet tilsættes, og der fyldes til slutvolumenet med propylenglycol. "Pour-on"beholderen fyldes.

DK 170344 Bl 28

Emulgerbart koncentrat

Aktiv bestanddel 50 g

Anionisk emulgator 40 g (fx phenylsulfonat CALX) 5 Ikke-ionisk emulgator 60 g (fx Synperonic® NP13) *

Aromatisk opløsningsmiddel til 1 liter (fx Solvesso® 100)

Samtlige ingredienser blandes, og der omrøres til opløsning.

10 * Varemærke ICI

Granuler (a) Aktiv bestanddel 50 g

Træharpiks 40 g

Gipsgranuler 15 (250-850 μπι, 20-60 mesh) til 1 kg (fx Agsorb 100A) (b) Aktiv bestanddel 50 g

Synperonic® NPI3 * 40 g

Gipsgranuler 20 (250-850 μιη, 20-60 mesh) til 1 kg

Samtlige ingredienser opløses i et flygtigt opløsningsmiddel, fx me-thylenchlorid, og sættes til granuler, der tumles i en mixer. Opløsningsmidlet fjernes ved tørring.

*

* Varemærke ICI

«

Claims (7)

1. Makrolidforbindelser med formlen (1) J*3 ? %.'o~»'CH3 R0 -4^^3 h i _ ®3 Η IV 5 j( ψ Ua (l> I T I H £ kendetegnet ved, at R er en a-L-oleandrosyl-a-L-oleandro-sylgruppe eller en a-L-oleandrosylgruppe, X betegner -CH2- eller -C(-N0CH3)-, idet gruppen >C=N0CH3 er i E-konfigurationen, og R^ betegner hydroxy eller methoxy.

2. Forbindelser ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R betegner en a-L-oleandrosyl-a-L-oleandrosylgruppe, X betegner XJ-NOCH3 og R^ er en.hydroxygruppe; eller R betegner en α-L-oleandrosyl-a-L-oleandrosylgruppe, X betegner -CH2-15 og R^ er en hydroxygruppe.

3. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder en pesticid effektiv mængde af mindst én forbindelse ifølge krav 1 sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer.

4. Veterinært præparat, kendetegnet ved, at det indeholder en pesticid effektiv mængde af mindst én forbindelse ifølge krav 1 og en veterinært acceptabel bærer. DK 170344 B1 30

5. Ikke-terapeutisk pesticidt præparat, kendetegnet ved, at det indeholder en pesticid effektiv mængde af en forbindelse ifølge krav 1 og en pesticid acceptabel bærer. *

6. Ikke-terapeutisk fremgangsmåde til bekæmpelse af skadelige insek ter, mider eller nematoder, kendetegnet ved, at en forbindelse ifølge krav 1 appliceres til skadelige insekter, mider eller nematoder eller det sted, hvor de befinder sig, i en mængde, der er effektiv til bekæmpelse af 10 skadedyrene.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse med formlen (1) ifølge krav 1, kendetegnet ved, at en forbindelse med formlen (2) <% f . ^ JlrttlUlCHg yfv,. η 1___*b, ^3 H I hH 3 (2) lii· 0¾. ,0 CH3 j| QH J^H H h 15 hvori X og har de i krav 1 anførte betydninger, inkuberes i et substrat indeholdende assimilerbare kilder til carbon, nitrogen og mineralsalte, i nærværelse af en mikroorganisme af typen Streptomyces svermitilis ATCC 31272 eller ATCC 31780 eller mutanter deraf med væsentlig samme egenskaber. 4