DK169559B1 - Amperometrisk fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af 1,4-dihydronikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) i opløsning og enzymelektrode til brug ved udøvelse af fremgangsmåden - Google Patents

Description

i DK 169559 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af 1,4-dihydronikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) i opløsning og en enzymelektrode til brug ved udøvelse af fremgangsmåden.

NADH og dets oxiderede modpart NAD er cofaktorer i talrige enzym-5 katalyserede redoxreaktioner. I nogle reaktioner oxideres et enzymsubstrat i nærvær af cofaktor NAD og en egnet oxidase eller dehydrogenase til opnåelse af NADH i opløsning, og i andre reduceres et enzymsubstrat i nærvær af cofaktor NADH til opnåelse af NAD i opløsning. I mange tilfælde kan bestemmelsen af NADH-koncentrationen anvendes som en indikator 10 for substratkoncentrationen eller som et middel til at følge forløbet af en enzymreaktion, der involverer NADH (eller NAD).

Det er kendt, at NADH-koncentrationen i opløsning kan måles kolo-rimetrisk, men kolorimetriske metoder er i det store og hele uhensigtsmæssige. Meget mere fordelagtige er elektrokemi ske metoder, men forsøg 15 på elektrokemisk bestemmelse af NADH har indtil videre ikke været særlig vellykkede. Det er for eksempel kendt, at NADH-koncentrationen kan bestemmes ved en amperometrisk analyse, ved hvilken NADH oxideres ved en elektrode med et fastlagt, kontrolleret potential, idet den under egnede betingelser passerende strøm er proportional med NADH-koncentrationen.

20 Uheldigvis kræver den elektrokemi ske oxidation af NADH et højt overpotential, og NADH'et oxideres sædvanligvis ikke rent ved elektrodeoverfladen. I mange tilfælde forurenes elektrodeoverfladen fx. hurtigt ved dannelse af en overfladefilm, der påvirker størrelsen og hastigheden af den elektrokemi ske respons: I. Moiroux og P.J. Elving, J. Amer. Chem.

25 Soc. (1980) 102, 6533-6538, og D.G. Johnson, M.D. Ryan og G.S. Wilson, Analyt. Chem. (1986), 58, 42R.

Der er gjort mange forsøg på at undgå disse problemer. For eksempel er det blevet foreslået at anvende modificerede elektroder overtrukket med et lag af ledende organiske salte: J.J. Kulys, Biosensors 30 (1986), 2, 3-13. Alternativt er det blevet foreslået at anvende en adsorberet redox-mediator såsom Meldola's blåt til en mere effektiv kobling af oxidationsreaktionen til elektroden og/eller sænkning af oxidationspotentialet: L. Gorton et al., J. Electroanalyt. Chem. (1984), 161, 103-20. I et andet forslag er redox-mediatorer blevet anvendt i fri op-35 løsning. For eksempel er methoxyphenazinmethosulfat blevet anvendt med en modificeret pyrolitisk grafitelektrode: Y. Kimura og K. Nihi,

Analytical Sciences (1985), 1, 271-4. Andre forsøg er blevet udført med platin, grafit og glasagtige carbonelektroder, men hidtil er der ikke DK 169559 Bl 2 blevet udviklet nogen elektrokemisk metode til bestemmelse af NADH, der både er hurtig og reproducerbar.

I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse er det blevet opdaget, at NADH kan oxideres rent, med god amperometrisk respons, både 5 i pufferopløsninger indeholdende NADH alene og i opløsninger indeholdende enzym, enzymsubstrat og NADH, ved anvendelse af en aktiveret carbon-elektrode af en type, der anvendes inden for brændstofcelleteknologien og omfatter et heterogent harpiksbundet lag af ædelmetal, der fortrinsvis indeholder platiniserede eller palladiserede (som anvendt i det ιοί 0 religgende omfatter disse udtryk materialer indeholdende eller behandlet med platin- og/eller palladiumoxid samt materialer indeholdende eller behandlet med platin- eller palladiunmetal) carbon- eller grafitpartikler bundet med et naturligt eller syntetisk harpiksbindemiddel, fortrinsvis et syntetisk, hydrofobt bindemiddel såsom en fluorcarbonhar-15 piks, mest foretrukket polytetrafluorethylen. Fortrinsvis anvendes en platiniseret eller palladiseret aktiveret carbonelektrode, hvis carbon-eller grafitpartikler er platiniseret eller palladiseret ved adsorption eller aflejring af kolloidalt platin- eller palladiummetal, eller platin- eller palladiumoxid, på overfladen af pulverpartiklerne før bind-20 ing, idet den resulterende elektrode omfatter et heterogent, porøst, aktiveret carbon-pulverlag med kolloidalt platin eller palladium eller de tilsvarende oxider, fordelt i det væsentlige ensartet gennem laget. Det harpiksbundne lag af platiniserede eller palladiserede aktiverede carbon- eller grafitpartikler kan være selvbærende, men bæres sædvanligvis 25 af et støtteorgan, fortrinsvis et elektrisk ledende støtteorgan, og fortrinsvis et lag af elektrisk ledende carbonpapir, hvortil de platiniserede eller palladiserede carbon- eller grafitpartikler er bundet som et overfladelag eller imprægneret i et carbonfibervæv. Selvom platiniserede og palladiserede materialer foretrækkes, kan andre ædelmetal holdige 30 aktiverede carbonelektroder, fx. guldholdige elektroder, anvendes.

I det foreliggende indbefatter udtrykkene "platiniseret" og "palladiseret" oxiderne, medmindre andet fremgår af sammenhængen.

Desuden betegner i det foreliggende udtrykkene "aktiveret" carbon, "aktiveret" grafit, etc. carbon- og grafitmaterialer med høj porøsitet 35 og store overfladearealer på 50 m2/g eller derover, og mere almindeligt over 200 m2/g, fx. fra 200 til 600 m2/g eller derover. Sådanne materialer med stort overfladeareal opnås fx. ved varmebehandling af carbon- eller grafitpulvere i damp eller COg til opnåelse af et produkt DK 169559 B1 3 med stort overfladeareal, der sædvanligvis betegnes som "aktiveret carbon" inden for teknikken.

Helt bortset fra de allerede nævnte fordele i form af stabilitet, reproducerbarhed og hurtige responstider har materialerne ifølge opfind-5 elsen den yderligere specielle fordel, at de kan anvendes til overvågning af NADH-koncentrationer ved relativt lave potentialer, fx. i området fra 0 til 600 mV eller endog ved negative potentialer i forhold til standard Ag/AgCl-referenceelektroden, i modsætning til de 750 mV og derover, der kræves til overvågning af NADH-koncentrationer ved anvendelse 10 af glasagtige carbon- eller grafitelektroder. Elektroderne ifølge opfindelsen er således karakteriseret ved en relativt lav baggrundsstrøm og en dermed forbedret følsomhed. Elektroderne er også karakteriseret ved deres lave respons på potentielt forstyrrende komponenter såsom urinsyre, der hyppigt er til stede i biologiske eller kliniske prøver.

15 De ifølge opfindelsen anvendte foretrukne elektrodesubstrater er faktisk kommercielt tilgængelige materialer, der forhandles af Prototech Company, Newton Highlands, Massachussets, og de er hidtil blevet anvendt som elektrokatalytiske gasdiffussionselektroder i brændstofceller. Fremstillingen af sådanne materialer er beskrevet detaljeret i US-A-20 4.044.193, US-A-4.166.143, US-A-4.293.396 og US-A-4.478.696, til hvilke der henvises for en mere udtømmende beskrivelse. Men i store træk adsor-beres kolloidalt platin med en partikelstørrelse i området 15 til 25 Ångstrøm (1,5 til 2,5 nm) på overfladen af det pulverformige carbon (partikelstørrelse 50 til 300 Ångstrøm: 5 til 30 nm), fx. ved dannelse 25 af en platinsol in situ i nærvær af pul verformigt carbon, der fungerer som kimdannelsesmiddel for solen. De platiniserede carbonpartikler formes herefter på en elektrisk ledende støttestruktur, fx. elektrisk ledende carbonpapir, under anvendelse af et syntetisk harpiksbindemiridel, fortrinsvis en fluoreret carbonhydridharpiks, og især polytetra-30 fluorethylen. Alternativt kan et platin- eller palladiumoxid med en partikelstørrelse i et lignende område anvendes i stedet for det kolloidale platin og adsorberes på carbon- eller grafitpartiklerne på lignende måde.

Alternativt kan, som omhandlet i US-A-4.293.396, et forud dannet 35 porøst carbonklæde imprægneres med de platiniserede carbonartikler, som bindes dertil ved anvendelse af fluorcarbonharpiks, fortrinsvis polyte-trafluorethylen. Det skulle imidlertid være indlysende, at den foreliggende opfindelse ikke er begrænset til anvendelse af Prototech materia- DK 169559 B1 4 ler, men omfatter andre lignende substratmaterialer indeholdende et porøst harpiksbundet lag af piatini serede eller pal!adiserede aktiverede carbon- eller grafitpartikler, eller tilsvarende partikler med andre ædelmetaller.

5 Selvom de foretrukne harpiksbindemidler, der anvendes til binding af de platiniserede eller palladiserede carbon- eller grafitpartikler, er hydrofobe fluorcarbonharpikser, især polytetrafluorethylen, kan andre egnede naturlige eller syntetiske harpiksbindemidler anvendes, fx. poly-ethylmethacrylat, polyvinyl acetat, polyvinylchloird, polycarbonater, po-10 ly(4-methylpenten-l), polyisopren, polychloropren, poly(l,3-butadien), siliconegummi og gelatine.

Forholdet mellem bindemiddel og de ædelmetal holdige aktiverede carbon- eller grafitpartikler på vægtbasis kan ligge i området fra 10 til 75% bindemiddel og 90 til 25% aktiveret carbon eller grafit, 15 fortrinsvis fra 20 til 50% bindemiddel og, tilsvarende, 80 til 50% aktiveret carbon eller grafit. Indholdet af ædelmetal, fx. platin eller palladium eller deres tilsvarende oxider, eller guld, i de aktiverede carbon- eller grafitpartikler kan ligge i området fra 1 til 10% på basis af den samlede vægt af aktiveret carbon eller grafit og bindemiddel, for-20 trinsvis fra 2 til 8%, mest foretrukket fra 4 til 6%.

I stedet for at forme harpiksen/det aktiverede platiniserede eller palladiserede carbonpulver direkte på overfladen af et egnet støtteorgan, fx. direkte på overfladen af elektrisk ledende carbonpapir, kan blandingen af bindemiddel og platiniseret eller palladiseret carbonpul-25 ver suspenderes i et egnet inert medium og anbringes på overfladen af substratet ved en serigrafi teknik, der tilvejebringer en tynd film af harpiksbundne platiniserede eller palladiserede carbonpartikler på substratoverfl aden.

Ligesom til den direkte kvantitative måling af NADH i opløsning 30 kan elektroderne og fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes til kvantitativ bestemmelse af NADH, der dannes eller forbruges in situ fx. ved enzymatisk reaktion mellem et enzym og dets cofaktor. Sådanne reaktioner omfatter fx. omdannelsen af pyruvat til lactat med lactatdehydrogenase, dvs. ved reaktionen 35 1actatdehydrogenase pyruvat + NADH ....................> lactat + NAD, DK 169559 Bl 5 hvilken reaktion kan overvåges gennem formindskelsen i NADH-koncentra-tion, samt oxidationen af glucose til gluconolacton ved reaktionen glucose 5 Ø-D-glucose + NAD.............-> D-gluconol acton + NADH, dehydrogenase der kan overvåges gennem forøgelsen i NADH-koncentration under reaktionsforløbet. Til dette formål kan de ifølge opfindelsen anvendte akti -10 verede platiniserede eller palladiserede carbonelektroder have et enzym såsom lactatdehydrogenase eller glucosedehydrogenase inkorporeret i eller immobil i seret på det harpiksbundne carbonlag iht. en hvilken som helst af de kendte enzymimmobiliseringsteknikker, fx som beskrevet EP-A- 0.247.850.

15 I en yderligere modifikation af dette koncept omhandler den fore liggende opfindelse også en såkaldt "one-off" enzymelektrode til engangsbrug og en fremgangsmåde, ved hvilken selve elektroden ikke kun omfatter det immobil i serede enzym, men også den til dette enzym passende cofaktor, alt efter omstændighederne enten NAD eller NADH, idet enzym-20 elektroden således er i stand til at reagere amperometrisk på enzymets aktivitet som bestemt ved ændringen i NADH-koncentrationen ved kontakt med en prøve, fx. en klinisk eller biologisk prøve, der indeholder det relevante substrat for det pågældende enzym, uanset om denne prøve indeholder den nødvendige cofaktor, da denne tilvejebringes af selve elek-25 troden. NAD- eller NADH-cofaktoren kan inkorporeres i elektroden på en hvilken som helst passende måde såsom ved imprægnering med en passende opløsning af enten NAD eller NADH og tørring.

Som det er velkendt inden for teknikken kan elektrodematerialets overflade være enten beskyttet eller ikke beskyttet af en porøs membran 30 såsom en polycarbonatfilm med en porestørrelse på fx. ca. 0,03 pm. Andre egnede membranmaterialer kan også anvendes.

Opfindelsen beskrives nærmere i det følgende under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 er et skematisk snit gennem et modificeret Rank Brothers 35 elektrokemisk element, der anvendes til testning af NADH-responsen af de aktiverede carbonelektroder ifølge opfindelsen, fig. 2 viser elektroderesponsen på successive tilsætninger af NADH til elementet under anvendelse af en pi atini seret carbonpapir (PCP) DK 169559 B1 6 elektrode ifølge opfindelsen, fig. 3 viser PCP-elektrodens respons på NADH ved forskellige ligevægtspotenti al er over for Ag/AgCl-referenceelektroden, fig. 4 viser elektrodens respons på pyrodruesyre i nærvær af lac-5 tatdehydrogenase (LDH), fig. 5 viser elektrodens respons på acetaldehyd i nærvær af al kohol dehydrogenase (ADH), fig. 6 er en anden kurve, der viser responsen af platiniserede carbonpapirelektroder på NADH-koncentration i overensstemmelse med 10 opfindelsen, fig. 7 viser resultaterne af et andet forsøg, der involverer elektrodens respons på pyrodruesyre, fig. 8 viser elektrodens respons på NADH fremstillet in situ ved enzymatisk oxidation af glucose under anvendelse af giucosedehydrogena-15 se, fig. 9 viser den tilsvarende responskurve for en platinoxidholdig elektrode, og fig. 10 viser responskurven for en palladiseret aktiveret carbon-elektrode.

20 I de følgende eksempler testedes forskellige platiniserede eller palladi serede carbonpapir (PCP) elektroder for deres respons på NADH et modificeret Rank oxygenelektrodesystem (Rank Brothers, Bottisham, Cambridge) som vist på tegningen (fig. 1). Det modificerede Rankel ementsystem omfatter et todelt element med en basis (1) og en ringfor-25 met krave (2), der omslutter et vandkammer (h), hvorigennem vand kan cirkuleres til styring af elementets temperatur, og de to dele er forbundet med hinanden ved hjælp af en fangende, med gevind forsynet omløber (3). I den centrale del af basis (1) er anbragt en platinkontaktknap (d), hvorpå testskiven (a) af papirelektrodemateriale er anbragt, 30 og som holdes på plads på platinkontakten af O-ring gummipakninger (e) og (f), når de to elementdele kobles sammen.

I den øverste del af elementet, der selvfølgelig vil indeholde den NADH-holdige testopløsning, er indført en prop (4) støttet af en justerbar ring (g), hvori der er monteret en platinmodelektrode (b) og en Ag/-35 AgCl-referendeelektrode (c). Testene udførtes med den arbejdende elektrode bragt i ligevægt ved forskellige potentialer i området fra 100 til 600 mV over for Ag/AgCl-elektroden. Andre tests udførtes i et element med to elektroder som vist i fig. 16 i EP-A-0.247.850 og mere detaljeret DK 169559 B1 7 beskrevet deri. I udførelsesformen med de to elektroder holdes elektrodematerialet mod en platinkontaktknap i elementets basis ved hjælp af en polycarbonatmembran (0,03 μιη porestørrelse), hvorpå den NADH-holdige prøve bliver anbragt. Omkring platinkontakten i elementets basis, men 5 adskilt derfra med en isolerende manchet, er anbragt en ringformet Ag/AgCl-referenceelektrode. Elektrodeelementet polariseres ved forskellige potentialer i forhold til Ag/AgCl-elektroden, og den afgivne strøm overvåges ved forskellige potentialer.

Opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler, hvori elek-10 trodematerialet er et piatini seret carbonpapir (PCP), leveret af

Prototech Company, Newton Highlands, Massachusetts, og udviklet af leverandøren som gasdiffusionselektroder. PCP-elektrodematerialet fremstilles iht. de i US-A-4.044.193 givne anvisninger ved indledende platinise-ring af carbonpul verparti kl er (Vulcan XC-72, nominel partikelstørrelse 15 30 nm) ved oxidativ dekomponering af en kompleks piatinsulfitsyre i nærvær af carbonpulveret under anvendelse af H2O2, hvilket fører til aflejring af kolloidalt platin, parti kel større!se 1,5 til 2,5 nm, på overfladen af carbonpulverparti kl erne. Efter platinisering formes det platini-serede carbonpulver og bindes til overfladen af et kommercielt tilgænge-20 ligt, grafitiseret, elektrisk ledende carbonpapir under anvendelse af ca. 50 vægt-%, baseret på platiniseret carbonpulver, polytetrafluorethy-len som bindemiddel. Det resulterende platiniserede carbonpapirelektro- demateriale har en tykkelse i området fra 0,1 til 0,5 mm, og et _2 platinindhold på 0,24 mg.cm . Til anvendelse i de følgende tests 25 (eksempel 1-3) blev carbonpapirelektrodematerialet klippet i skiver på 5 mm i diameter og monteret på den platiniserede arbejdselektrode i det i tegningens fig. 1 viste elementsystem. Det faktiske areal af carbonpa-pirelektroden, der udsættes for prøven i hvert enkelt tilfælde, er ca.

0,16 cm2.

30 De opnåede resultater er som følger:

Eksempel 1

Elektrokemisk oxidation af NADH på platiniseret carbonpapir (PCP)

Under anvendelse af en potentiostatisk standardteknik sattes prø-35 ver af en 20 mM NADH-opløsning i Tris/HCl-puffer, pH 9, til elementet, der indeholdt 2 ml 0,1 M phosphat (pH 7)/1 M KC1 pufferopløsning. Den platiniserede carbonpapirelektrode (PCP) bragtes i ligevægt ved forskellige potentialer over for Ag/AgCl-referenceelektroden. Modelektroden var 8 υκ ibybby bi platin. Der opnåedes stabile strømplateauer (fig. 2), som var proportionale med NADH-koncentrationen (tabel 1 og fig. 3).

Tabel 1 5 Strømrespons af piatini seret carbonpapir på NADH ved forskellige ligevagtspotenti al er NADH-koncentration/mM Strømafgivelse i μΑ ved

100 mV 300 mV 600 mV

10 _ 0,95 7 15 28 1,8 13 25 53 2,7 - 32 73 4,0 38 42 113 15 6,6 - 52 183 10,0 60 -

Eksempel 2 20 Respons af NADH-elektrodes.ystem på pyrodruesyre i nærvær af lactatdehy-drogenase (LDH)

Der opstilledes et lignende element indeholdende 12,5 mM NADH og 10 mM pyrodruesyre i 2 ml phosphat(pH 7)/KCl-puffer ved 25°C. Ar-bejds-, mod- og reference-elektroderne var som i eksempel 1. Arbejds-25 elektroden bragtes i ligevægt ved 400 mV og gav et stabilt signal på 170 μΑ i forhold til baggrunden. Ved tilsætning af 120 enheder LDH (kvæghjerte type XV) mindskedes strømmen med en begyndelseshastighed på 92 μΑ/minut (fig. 4), hvilket viste, at den enzymatiske omdannelse af pyru-vat til lactat overvåges effektivt gennem virkningen af NADH koblet 30 elektrokemisk til elektroden.

Eksempel 3

Respons af NADH-elektrodesystem på acetaldehyd i nærvær af alkoholdehy-drogenase (ADH) på en PCP-elektrode 35 Der opstilledes et element indeholdende 3 mM NADH og 35 mM acetal dehyd i 2 ml Tris(pH 9)/HCl-puffer ved 25°C. Arbejds-, mod- og reference-elektroderne var som i eksempel 1. Arbejdselektroden bragtes i ligevægt ved 400 mV og gav et stabilt signal på 40 μΑ i forhold til DK 169559 B1 9 baggrunden. Ved tilsætning af 2 enheder ADH (hestelever) mindskedes strømmen med en begyndelseshastighed på 130 μΑ/minut (fig. 5), hvilket viste, at den enzymatiske omdannelse af acetaldehyd til ethanol overvåges effektivt gennem virkningen af NADH koblet elektrokemisk til elek-5 troden.

I de følgende eksempler anvendtes enten en elementkonfiguration med to eller med tre elektroder. Elementet med tre elektroder var som beskrevet i det foreliggende og vist i fig. 1. Konstruktionen af elemen-10 tet med to elektroder var identisk med den i fig. 16 i EP-A-0.247.850 viste konstruktion, hvortil der henvises for yderligere detaljer.

Eksempel 4 (fig. 6)

Dataene opsamledes under anvendelse af konfigurationen med to 15 elektroder polariseret ved 200 mV. Der anvendtes en puffer med 16 mmol/1 Nal^PO^, 53 mmol/1 Na^HPO^, 52 mmol/1 NaCl og 1,5 mmol/1 ethylendiamin-tetraeddikesyre, pH 7,4. Efter opnåelse af en stabil baggrundsstrøm i denne puffer tørredes pufferen af membranen og erstattedes med prøver af NADH i samme puffer. Strømtoppene optegnedes. Fig. 6 viser responserne 20 for en platiniseret carbonpapirelektrode, som er kommercielt tilgængelig fra Prototech Company og omfatter harpiksbundne, platiniserede carbon-partikler aflejret på en elektrisk ledende carbonpapirbaggrundsark, idet det harpiksbundne platiniserede carbonlag på vægtbasis omfatter 50% po-lytetrafluorethylen, 45% findelt carbon (Vulcan XC72) og 5% kolloidalt 25 platin præadsorberet på carbonpulveret. Til formindskelse af baggrunds-strømmen adsorberedes natten over en 5 mg/ml proteinopløsning (glucose-oxidase) på elektroden før NADH-målinger. Det påpeges, at gluco-seoxidasen kun er et eksempel på et egnet protein. 1 2 3 4 5 6

Eksempel 5 (fig. 7) 2

Dette eksempel illustrerer opfindelsens anvendelighed til måling 3 af enzymsubstraterne, der anvender NADH. Et element med tre elektroder 4 anvendtes som tidligere beskrevet, men forsynedes med en magnetisk omrø- 5 rerstang. Arbejdselektroden var platiniseret carbonpapir som i eksempel 6 4, men L-lactatdehydrogenase (EC 1.1.1.27 fra kvæghjerte) immobil i seredes til elektroden gennem carbodiimidkobling, se EP-A-0,247,850, men under anvendelse af en 1 mg/ml opløsning af 1actatdehydrogenase (fra Sigma Chemicals, type XV, 500 enheder pr. mg protein). Elementet inde- DK 169559 Bl 10 holdt fra start 12,5 mmol/1 NADH i 0,1 mol/1 phosphat/1 mol/1 KCl-puf-fer, pH 7. Polariseringspotentialet var 350 mV. Apparatet kunne anvendes til overvågning af NADH-forbruget, når portioner af pyrodruesyre sattes til elementet som vist i fig. 7.

5

Eksempel 6 (fig. 81

Eksempel 5 gentoges med undtagelse af, at den immobil iserede lac-tatdehydrogenase erstattedes med glucosedehydrogenase (EC 1.1.1.47 fra Bacillus spp, leveret af Sigma, 100-300 U/mg protein) immobiliseret på 10 elektroden på lignende måde. Lactatdehydrogenase anvendtes til måling af pyrodruesyre ved overvågning af NADH-forbruget pyruvat + NADH .......-> lactat + NAD, 15 hvorimod glucosedehydrogenase anvendtes til måling af glucose ved at følge NADH-produktionen: jS-D-glucose + NAD.........> D-gluconolacton + NADH.

20 Elementet indeholdt 0,1 mol/1 phosphat/0,1 mol/1 KCl/2,4 mmol/1 NAD, pH 7.

Eksempel 7 (fia. 91

Ved at følge den i eksempel 4 beskrevne fremgangsmåde måltes 25 strømafgivelsen for en platinoxidholdig carbonelektrode ved 200 mV (over for en Ag/AgCl referenceelektrode) i et element med to elektroder ved forskellige NADH-koncentrationer, hvilket viste en i det væsentlige lineær respons ækvivalent med responsen for de pi atiniserede carbonpa-pirelektroder. I dette tilfælde omfattede elektrodematerialet et lag af 30 harpiksbundne (polytetrafluorethylen) carbonpartikler (Vulcan XC72) med 5 vægt-% (baseret på de harpiksbundne partiklers samlede vægt) platinoxid præadsorberet på carbonpulverparti kl erne, bindemiddel 50 vægt-%, carbon 45 vægt-%, og bundet til overfladen af elektrisk ledende Toray (varemærke) carbonpapir.

Eksempel 8 (fia. 101

Ved at følge den i eksempel 4 beskrevne fremgangsmåde måltes igen strømafgivelsen for en palladiseret carbonpapirelektrode ved 200 mV

35 DK 169559 B1 11 (over for Ag/AgCl) under anvendelse af en elementkonfiguration med to elektroder ved forskellige NADH-koncentrationer. Igen var responserne (fig. 10) i det væsentlige lineære. Elektrodematerialet var som beskrevet i eksempel 7, bortset fra, at de harpiksbundne carbonpartikler 5 omfattede 5 vægt-% præadsorberet findelt palladium.

De ovenfor anførte eksempler viser anvendelsen af elektrodematerialerne til frembringelse af en hurtig og reproducerbar oxidation af NADH. Disse responser står i klar modsætning til dem, der opnås med de 10 fleste andre elektrodematerialer som påvist i sammenligningsforsøg under anvendelse af platin, glasagtig carbon eller grafitelektrodematerialer, der (med sjældne undtagelser) i almindelighed er træge, relativt ufølsomme og har meget ringere reproducerbarhed. Effektiviteten af de platiniserede eller palladiserede carbonelektroder, der blev anvendt 15 ifølge opfindelsen, synes at være et resultat af deres specielle heterogene struktur og deres kompatibilitet med biologiske molekyler såsom NADH og enzymer. Oxidationen af NADH forløber også effektivt i nærvær af enzymer og substrater og kan anvendes som grundlag for hurtige NADH-kob-lede enzymatiske analyser. Potentialet for en effektiv analyse af pyru-20 vat (under anvendelse af LDH) og acetaldehyd (under anvendelse af ADH) fremgår klart af de ovenfor anførte eksempler, men et meget stort antal lignende analyser er også tilgængelige ved anvendelse af andre enzymer og substrater.

Selvom den foreliggende opfindelse kun har været beskrevet med 25 henblik på bestemmelse af NADH i opløsning, kan phosphoryleret 1,4-dihydronikotinamid-adenin-dinukleotid (NADPH), dvs. phosphoryleret NADH, bestemmes ved nøjagtig samme teknik. Da NADPH (eller NADP) snarere end NADH (eller NAD) er en cofaktor i en udvalgt gruppe af enzym-katalyserede reaktioner, muliggør teknikken ifølge opfindelsen desuden en overvåg-30 ning af sådanne reaktioner på nøjagtig samme måde, dvs. ved amperome-trisk bestemmelse af enten forbruget eller produktionen af NADPH i opløsning. Alle henvisninger til NADH eller NAD i det foreliggende skal således forstås som indbefattende det phosphorylerede derivat, medmindre andet fremgår af sammenhængen.

Claims (16)

1. Fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af 1,4-dihydroniko-tinamid-adenin-dinukleotid (NADH) i opløsning, KENDETEGNET ved, at man bringer den NADH-holdige opløsning i kontakt med en aktiveret 5 carbonelektrode, holder carbonelektroden på et kontrolleret, fastlagt potential, der er i stand til at fremkalde oxidation af NADH ved elektrodeoverfladen, og måler strømafgivelsen fra carbonelektroden, idet der anvendes en ædelmetalholdig aktiveret carbonelektrode omfattende et porøst, heterogent, harpiksbundet lag af aktiverede carbon- eller grafit- 10 partikler med findelt ædelmetal eller de tilsvarende oxider præadsorbe-ret på de aktiverede carbon- eller grafitpartikler, og bundet sammen med et naturligt eller syntetisk harpiksbindemiddel.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at harpiksbinde-midlet er en fluorcarbonharpiks.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, at fluorcarbon- harpiksen er polytetrafluorethylen.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, KENDETEGNET ved, at de harpiksbundne, ædelmetalholdige carbon- eller grafitpartikler er dannet som et harpiksbundet overfladelag på et under- 20 liggende støtteorgan.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, KENDETEGNET ved, at det underliggende støtteorgan er elektrisk ledende.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, KENDETEGNET ved, at det elektrisk ledende støtteorgan er et lag af elektrisk ledende carbonpapir, hvortil 25 de ædelmetal holdige carbon- eller grafitpartikler er bundet som et overf1 adel ag.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, KENDETEGNET ved, at de harpiksbundne ædelmetal holdige carbon- eller grafitpartikler er imprægneret i og støttet af et carbonfibervæv.

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, KEN DETEGNET ved, at de ædelmetal holdige carbon- eller grafitpartikler har en partikelstørrelse i området fra 5 til 30 nm.

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8, KENDETEGNET ved, at carbon- eller grafitpartiklerne er præpi atini serede el- 35 ler præpalladi serede partikler med findelt platin eller palladium eller de tilsvarende oxider præadsorberet på grafit- eller carbonpartiklerne.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 8, KENDETEGNET ved, at der anvendes en piatiniseret eller pal!adi seret carbonelektrode, der som de præpiati- DK 169559 B1 niserede eller præpalladiserede carbon- eller grafitpartikler omfatter carbon- eller grafitpartikler med partikler af kolloidalt platin- eller palladiummetal præadsorberet på overfladen deraf, hvilke kolloidale platin- eller palladiumpartikler har en parti kel størrelse i området fra 1,5 5 til 2,5 nm.

11. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8, KENDETEGNET ved, at den anvendes til overvågning af produktionen eller forbruget af NADH i en enzymatisk reaktion mellem et enzym og dets substrat, og at den enten involverer NADH eller NAD som en cofaktor.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, KENDETEGNET ved, at der anvendes en ædelmetal holdig carbonelektrode med enzymet inkorporeret eller immobil i seret derpå eller deri, og at elektroden anvendes til overvågning af aktiviteten af enzymet via ændringen i NADH-koncentrationen, når elektroden er i kontakt med en prøve indeholdende enzymsubstratet og i nær- 15 vær af enten NAD eller NADH som en cofaktor, der er involveret i reaktionen mellem enzymet og dets substrat.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, KENDETEGNET ved, at der anvendes en ædelmetalholdig elektrode med enzymet inkorporeret eller immobilise-ret derpå eller deri sammen med enten NADH- eller NAD-cofaktoren, alt 20 efter tilfældet, idet NADH- eller NAD-cofaktoren således indføres i prøven via elektroden.

14. Enzymelektrode til engangsbrug til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 13, KENDETEGNET ved, at den omfatter en aktiveret carbonel ektrode bestående af eller omfattende et porøst, harpiksbundet he- 25 terogent lag af aktiverede carbon- eller grafitpartikler med et findelt ædelmetal, eller det tilsvarende oxid præadsorberet på de aktiverede carbon- eller grafitpartikler, og bundet sammen med et syntetisk hydrofobt harpiksbindemiddel, hvilket harpiksbundne lag har et enzym immobi-1 i seret deri eller derpå sammen med NAD eller NADH som en cofaktor for 30 enzymet, hvilken elektrode reagerer amperometrisk på aktiviteten af enzymet i nærvær af dets substrat og af NAD eller NADH, alt efter tilfældet.

15. Enzymelektrode til engangsbrug ifølge krav 14, KENDETEGNET ved, at den aktiverede carbonelektrode omfatter et porøst, harpiksbundet 35 heterogent overfladelag af præpiatini serede eller præpalladi serede aktiverede carbon- eller grafitpartikler bundet med en fluorcarbonharpiks og støttet på et underliggende støtteorgan med enzymet og cofaktoren immobil i seret deri eller derpå. DK 169559 B1

16. Enzymelektrode til engangsbrug ifølge krav 15, KENDETEGNET ved, at det underliggende støtteorgan for det harpiksbundne lag af præ-platiniserede eller præpalladi serede aktiverede carbon- eller grafitpartikler omfatter et elektrisk ledende carbonpapir. 5 10