DK166585B

DK166585B - Desoxyribonucleosidthio- og -selenphosphonater

Info

Publication number: DK166585B
Application number: DK131591A
Authority: DK
Inventors: Joachim Engels; Alfred Jaeger
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1983-09-06
Filing date: 1991-07-05
Publication date: 1993-06-14
Also published as: IE842268L; PT79172A; DK131591D0; GR80287B; AU601257B2; JPS6072899A; DK162895C; DK167359B1; EP0136543B1; JPH0662662B2; DK424784D0; ATE38839T1; DE3475307D1; AU3275684A; DK166585C; AU1138488A; DK131691A; ES535627A0; EP0136543A2; JPH05262787A

Description

DK 166585 B

Ikke-ioniske analoge af desoxyribonucleinsyrer (DNA) har betydning til undersøgelse af DNA-DNA- og DNA-protein-vekselvirkninger. Især har phosphonsyreestere af desoxyribo-nucleotider interesse som følge af deres kemiske stabilitet, 5 på grund af deres celletilgængelighed samt deres forøgede resistens mod nucleaser.

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte desoxyribonucleosidthio- og -selenphosphonater, som er i besiddelse af ovennævnte, gunstige egenskaber, og som derfor 10 er af interesse i forbindelse med de nævnte undersøgelser.

De her omhandlede forbindelser er ejendommelige ved, at de har den almene formel 15 y—j 0 1 (i)

Z = P - R

- ' V? G-0 hvori T betyder triphenylmethyl (= Tr), p-anisoyldiphenyl- methyl eller di-(p-anisoyl)-phenylmethyl, 25 B betyder 1-thyminyl, l-(N-4-benzoylcytosinyl), 2-(N- 6-benzoyladeninyl) eller 9-(N-2-isobutyroylguaninyl), G betyder en acyl- eller silylbeskyttelsesgruppe for en sekundær hydroxygruppe, Z betyder svovl eller selen, og 30 R betyder alkyl med indtil 8 carbonatomer, cyclohexyl, benzyl eller eventuelt med fluor, chlor, brom, lavere alkyl, lavere alkoxy eller trifluormethyl substitueret phenyl, men fortrinsvis methyl, ethyl, phenyl eller benzyl, navnlig methyl.

35 De her omhandlede forbindelser med formel (I) kan fremstilles*ved, at et bifunktionelt phosphonyleringsreagens

DK 166585B

2 med den almene formel

X

/ R-P (II) 5 \

Y

hvori R har den ovenfor anførte betydning, X er chlor eller Y, og Y er en gruppe med strukturen 10 R1 /

-N

XR2 15 hvor R1 og.R2 er ens eller forskellige alkyl- eller cyclo-alkylgrupper med indtil 8 carbonatomer eller phenylgrupper, eller Ri og R2 danner sammen med nitrogenet en mættet eller 20 umættet heterocyclisk ring, der kan indeholde yderligere heteroatomer, omsættes med et nucleosid med den almene formel 25 *-°~0 (III) H-0 30 hvori T og B har den ovenfor anførte betydning, fortrinsvis ved en temperatur fra -80 til +100°C, især ved -20 til 0eC, og den herved opnåede forbindelse med den almene formel

B

35 · Τ_0Π<(^)1 (IV) 0 i

R-P

'v ·

Y

DK 166585 B

3 hvori substituenterne har den ovenfor anførte betydning, omsættes med en forbindelse med den almene formel 5 H-°lCj - <V) G-0 10 hvori B og *G har den ovenfor anførte betydning, fortrinsvis ved en temperatur fra -20 til +100°C, især ved stuetemperatur, og den opnåede forbindelse med den almene formel 0 (VI)

R - P B

hC

20 6-0 hvori T, R, B og G har den ovenfor anførte betydning, ved behandling med svovl eller selen overføres til forbindelser med den almene formel I, fortrinsvis ved en temperatur fra -80 til +100®C, især ved en temperatur fra -20°C til stuetem-25 peratur.

Som grupper med den almene formel -NR1R2 kommer f.eks. følgende på tale: dimethylamino, diethylamino, diisopropylamino, methylethyl-amino, methylpropylamino, methylhexylamino, methylcyclohex-30 ylamino, morpholino, pyrrolidino, piperidino, methylanilino, diphenylamino, imidazolo, triazolo, benzotriazolo og tetr-azolo.

Udgangsmaterialerne med den almene formel (II), hvori X betyder chlor, kan fås ved omsætning af den tilsvarende 35 dichlorphosphan, fortrinsvis methyldichlorphosphan, med en sekundær amin med den almene formel

DK 166585B

4 H - NR1!*2 (VII) hvori R1 og R2 har den ovenfor anførte betydning.

Forbindelserne med den almene formel (II), hvori X 5 betyder en gruppe med strukturen Y, kan tilsvarende fås ved yderligere omsætning af samme eller en anden sekundær amin med den almene formel (VII). Forbindelserne med formel (II) kan renses ved vakuumdestillation. Repræsentative eksempler på forbindelser med formel (II) findes i nedenstående tabel 10 1.

Omsætningen af phosphonyleringsreagenset med den almene formel (II) med et egnet beskyttet nucleosid med den almene formel (III) sker i et moderat polært opløsningsmiddel, fortrinsvis chloroform, under udelukkelse af fugtighed.

15 Som hjælpebase på denne reaktion kan anvendes tertiære aminer, fortrinvis ethyldiisopropylamin (Hiinig-base). Oparbejdningen sker ved vandig ekstraktion og fældning af produkterne med den almene formel (IV) ved hjælp af et upolært opløsningsmiddel, såsom petroleumsether eller pentan. De 20 således udvundne phosphorsyrlingesteramider med den almene formel (IV)’ fremkommer som farveløse pulvere og kan karakteriseres ved spektroskopiske data såsom 1H-NMR, 31P-NMR eller UV- eller elementæranalyse.

Forbindelserne med den almene formel (IV) er i tør 25 tilstand og opbevaret ved mindst -20°C stabile i mindst 1 måned, således som påvist ved 31P-NMR. Denne store bestandighed hos phosphorsyrlingesteramiderne er forbløffende. Deres universelle anvendelighed ved opbygningen af nucleo-sidernes phosphonsyrediestere viser sig ved omsætningen med 30 egnede 3'-beskyttede nucleosider:

Herved opløses de 5'-beskyttede nucleosidphosphoniter med den almene formel (IV) i et moderat polært opløsningsmid-del, fortrinsvis acetonitril, chloroform eller tetrahydro-furan, og blandes med nucleosidet med den almene formel (V) 35 (beskyttet i 3'-stillingen). Egnede beskyttelsesgrupper G på forbindelserne med den almene formel (V) er acylgrupper,

DK 166585 B

5 såsom benzoyl, acetyl, pivaloyl eller laevulonyl, eller silylgrupper, såsom tert.butyldimethylsilyl. Reaktionen katalyseres med en syre, fortrinsvis en azol eller et amin-hydrochlorid. Særlig egnet er benzotriazol. Det er bemærkel-5 sesværdigt, at HPLC-analyse af produktet ikke viser tilstedeværelse af de symmetriske 51,51-isomere og kun spor af 31,31-isomere phosphonater.

Fremstillingen af forbindelserne med den almene formel (I) , hvori Z betyder svovl eller selen, sker ved direkte 10 omsætning af forbindelserne med den almene formel (VI) med elementært svovl eller selen. Indrøring i et polært opløsningsmiddel, såsom tetrahydrofuran, sammen med den støkiometriske mængde svovl eller selen fører i gode udbytter til de tilsvarende thio- eller selenphosphonater med den almene 15 formel (I). Karakteriseringen sker foruden ved elementæranalyse også via 3^P-NMR og ^-H-NMR.

På grund af tilstedeværelsen af et asymmetricentrum på nucleosiddelen og tilvejebringelsen af et nyt med phos-phoret foreligger phosphonaterne med den almene formel (I) 20 som diastereomere blandinger (se tabel 4). En variation af parametrene, såsom opløsningsmiddel, temperatur og rækkefølgen for tilsætningen, indvirker kun i meget ringe omfang på isomerforholdet, som ligger i nærheden af det statistiske l:l-forhold.

25 I øvrigt tjener de følgende eksempler til at belyse opfindelsen nærmere:

Eksempel 1

Fremstilling af udgangsmateriale.

H3OP[N(CH3)2)2 30 I en trehalset 1000 ml kolbe med dråbetragt og meka nisk omrører anbringes 125 ml (1,9 mol) dimethylamin i 400 ml vandfri diethylether, og under isafkøling tilsættes i løbet af 60 minutter 60 ml (0,40 mol) methyldichlorphosphan opløst i 200 ml vandfri ether. Efter omrøring i 2 timer ved 35 stuetemperatur og i l time ved 50*C filtreres bundfaldet fra under beskyttende gas, eftervaskes 2 gange med 100 ml

DK 166585B

6 ether, og filtratet inddampes ved ca. 0,1 bar. Den tilbageblivende remanens destilleres hurtigt over ved 0,5 bar/124°C.

En findestillation med en Vigreux-kolonne på 50 cm giver ved 64-65eC/65 mbar et udbytte på 36,6 g (66% af det teore-5 tiske) af en farveløs væske.

Analyse: Cl - <0,2% 31P-NMR (TMF) δ = 87 ppm ^-H-NMR (CDC13) δ = 1,23 ppm (d, 7Hz, P-CH3) δ= 2,66 ppm (d, 7Hz, N(CH3)2 10

Eksempel 2 a) 51 —Tritylnucleosidet med formlen (III) (1 mmol) opløses i 6' ml vandfrit chloroform under indifferent nitrogenatmosfære, og hertil sættes 2 mmol H3CP[N(CH3)2]2* Reak“ 15 tionen er tilendebragt efter 12 timer ved stuetemperatur (omrøring) eller allerede efter 2 timer ved tilsætning af katalystiske mængder (på 0,1 mmol) collidin-hydrochlorid. Derefter overføres opløsningen sammen med 100 ml methylen-chlorid til* en 250 ml skilletragt og rystes to gange med 50 20 ml mættet kogsaltopløsning (indeholdende 0,1 ml triethyl-amin). Den organiske fase tørres over vandfrit natriumsulfat og inddampes til et skum. Dette omrøres i 2 timer med 50 ml pentan. Resten suges fra, opløses i 2 ml diethyl ether og tildryppes langsomt til 50 ml godt omrørt pentan. Det fine 4» 25 bundfald frafiltreres og tørres, hvilket giver et udbytte på 85 til 95% af forbindelsen med den almene formel (IV) (se tabel 2 og 3).

Forbindelserne kan påvises ved 31P-kerneresonansspek-troskopi.

30 Inden for 31P-NMR-spektret viser disse stoffer indtil 3% hydrolyseret produkt (nucleosidmethylphosphinat), men ingen påviselig mængde af symmetrisk 3' ,3'-dinucleosidphos-phit. Dette er en fordel i forhold til de hidtil kendte metoder, der konsekvent har leveret fra ca. 5 til ca. 10% 35 af disse produkter. Som tørrede pulvere opbevares det dannede produkt ved,-20°C, og der kan ingen sønderdeling iagttages 7 UK Ibbbbb b inden for 1 måned.

Analogt anvendes følgende reagenser: N (C0H_ ϊ N /CH(CH,), 7, 5 H,C -1" 2 5 2 H,C - 32'2 3 - ''Cl 3 NC1 0,Ης / 6 5 / \CH n(c6h )2 H-C - CH3 H.C - P^ 6 5 2 10 J XC1 J XC1 b) 5’-Tritylnucleosid med formlen (III) (1,00 mmol) og 1,71 ml (10 mmol) Ν,Ν,Ν-ethyldiisopropylamin kommes i 6 ml THF, og der tildryppes langsomt 2,00 mmol phosphonyle- 15 ringsmiddel med formlen (II). Efter omrøring ved stuetemperatur natten over tildryppes reaktionsopløsningen i 50 ml med NaCl mættet, iskoldt vand. Efter ekstraktion to gange med hver gang 20 ml methylenchlorid tørres den organiske fase med natriumsulfat, og opløsningsmidlet fjernes i vakuum.

20 Den yderligere rensning sker ved fældning således som ovenfor (se tabellerne 2 og 3).

c) Den under a) eller b) fremstillede forbindelse med formlen (IV) røres sammen med 0,20 mmol 31-O-benzoyl-thymidin og 0,80 mmol 1-H-benzotriazol, tørres i en rundbun- 25 det kolbe og opløses derpå i 1,0 ml tørt acetonitril. Inden for et minut er reaktionen afsluttet, hvorved der opstår et meget luft- og syrelabilt phosphonit med formlen (VI).

Derefter sættes 30 mg (0,95 mmol) svovl til 0,7 mmol af forbindelsen med formlen (VI) ved -20°C, idet der omrøres 30 natten over ved stuetemperatur. For det meste er reaktionen allerede afsluttet efter nogle få timer. Derefter tilsættes 20 ml chloroform, og den organiske fase rystes tre gange med vand. Efter tørring over natriumsulfat og fjernelse af opløsningsmidlet fås et råprodukt, som renses ved chromato-35 grafi på kiselgel, og som i et udbytte på 80 til 90% giver forbindelsen med formlen (I), hvor Z betyder svovl (jf.

DK 166585B

8 tabel 4).

Alternativt sættes 118 mg (1,5 mmol) sort selen til 0,7 mmol af forbindelsen med formlen (VI), og der omrøres natten over. Efter oparbejdningen (gennemføres således som 5 ovenfor anført) fås i et udbytte på 60% forbindelsen med formlen (I), hvor Z betyder selen (se tabel 4) .

HPLC-analyse af reaktionsproduktet viser et indhold på ca. 1% af 3 *,3'-phosphonaterne, men intet 5',5'-isomer.

9

Ul\ lOOUOU D

*N

tc

o CO

cm 1 — *. CO X,

n JL I

Ϊ3 J-i ro <u 4-)

S3 (C

« & 0 &1 4J 14 _ Λ _ p τ' o 5 < a: S3 ffinric a:

K ^ Z.P 04 XT CM CM CM CM

& > r- o t-U -Q. 2· )-\ a1 1» 1>· V V v v ^ i'-' r- < c\ in if) in in V) in X V 1 tc vo° ww "" ^

I" S I in in 1- r~ <1 CO

I ^ ·· in _> xr ci in o co co O 2 ·1 e E 11· v».·. ·.

m o- — θ'·— o- vo cococo co X m *—i — u

H Q

HU ___ ci £ H S x _ _ _

£ S - N N ^ — N

Elm m x re nn χ 0 EE cn

Οτ-η ^ 1“ CD CD

u_· Y 1“ >10 M «- Ο II CM II CD II Ο II

· ID £ » OJ U mu xr u ' id U

CU m ϋ ' — 1. — «. — 1. —--

U ,-- - — CM rd CM 'd CM Π3 CM TJ

<D t— ’o £

m 00 1 CO

® I I

“ O O U

h t— in U o % U ^ ^ I °0 ° e «ο· ^ og £ 5 &.Q ^ T Γ n X I '

•P \ xr cm cm I

n U xr «Λ CD ..

t, o 04 ft

EE

w cn

*H

οκο'λ λ “ϋ 10 "did' .G S — cm cm 10 Z E - 1 E-ι · I a »- nj CU & xr <n cm _

r— 'w' t— t— fj1 Γ-. I” T

£ 1 ^ CD CO

I 1 I III

X· o

™ -P

CM g K

cn sT ^ 2-. rrX )-2 ^-¾ S

* so- -» o -0 Ό v:i g r i ' / 3 5 I «2 4.) 0) I 14 '2 2 lH r-

Q5 J~ U

3 3 t\ ί\ h O ^ S'|l 2 1 i i i _ „ d xx u ra

DK 166585B

10 fs p 7) r-,

Z & CM

—' O *7n nJ n ^ ω p

»—2 ci O

n o -cm - δ·· · —» op o r- r-t o \ Π p

p· h o p D

2 b w d op T

v - cm 2 ‘ ES T- ^ —· — u _ I— N —O'. T t— N o -v

™ ^ 2 0,0-; OP CON

K v cr\ v*-2 -r— -p r- OJ - O O I - CM ·5Τ

g —v CO \ I \ KD S. V

2 VD II *3· V.O O II ΓΜ O

r-to or- '-p o ii -'—’ v v - —· ’-I-) Μ Ό *— <N T-'d O — Ό

£ί *N

2 P

O o er— on or— t-”n o *n ,_o -o -vo vin veo ""vs p1 3 ^ '—.co I co \ en H “7\ · *2, o· J voiicoii co ii o ii o ii / v g £ 2 r- t-} v-p v-p o tn T-p

O \ ο_^ <2 τ-Ό ’-'U *- Ό T- »a r-^O

ύ ° p Op 9 2 ~ — 9. . _ 9. 9.

* rf ££ 89 £9 O vN -cm v en vro vcm — Q i- - i- - r-vt-VT-v > d O -v t- \ \ O 'v. τ- \ τι, M 2 "S’ π »- π r-n o n o il φ3 pu 3_3 ^3 3_3 ^3 ^3 “ © . % ’-Ό τ^·σ r—" Ό o £ Ή O 2 ~ _ -H ^ *“ r- Γ— N ΟΝΟΝΓ-Ν j3 in in p in p in p ^ p

Μ Ό ' -ni - CM - CM - CM

o φ r— .—· r— v t— — f-v v r— v fc I 9 >5 \r- -vr- 9^ i O — cri ii t- ii r— ii en ii 2 o tn rj id t~b in t-j> o tn v V«—· V --- V --· V vi ni i— r-O r- ό t— Ό r- p I " i S e5

&§ 2 "1 ID

\v 9 3 o v

'C O CO

rC ' r* fv] - υ i i 3 ^ -v. -v. o gQvoo rr r— o f1* Z i * V V v v **i ICNGir— O^CO Cl ,-0·^· ? 2 ~ C 2 »g

" ~ 1 1 i i S S

ni Jp 2 o 3 ^ 2 j-, cm p in in Tj -u

UD U P P

2Γ VD ID o'0 2 U u 3 rj d o © ^ Æ 2 ^ CM ij ti u

— O O -H

O ιΰ t-t t-· •-Γ* 4_l _ _ *p u in -H „ ^r. o 2 ·— op 11 2 P CM P P ID _ „ .

do ddd π3Λη

DK 166585 B

11

<T\ N

T- as v ro ro i— ·.

as \ r- Π o « T CM l"3 Λ T*~

CM N

__. m ns ro CM co as - >-

U CM CO

2 51¾

I ID W

dj CM Π3 in r- ro ro y vo Tn CM r0 ro 'To “7V S ! „5, 0 I ^ 'ς X>°-? ^ i 5 g f A If, η as ^ co D <D &

* U Æ I

CL — CM -H i—l K r~ »d >i

S CO «Η O

2 I CO — >1 W

i as ^ w o ή «σ ^ as ro ^ io c m ·— r- *H <u

E S « S L

φ i-ι £l i

tø 4) -—- *H

•he ϋ C D

0) u — S t—i— —

-Π 0 g js >1 , H

c Ή · CL-D CO £ rH >,

•H Ep - 3 >i — -C

Λ - i-ι m &) is — «Η *3

£ O vr e+J rH >, C

£ ^ si & 5 i ^ 1-¾ " ^ « SS t 8 5 " ¥? s $ s -as « s & Q- 1 — T τ T fl-& 5 S & 2n I " ” f-d & & s

^ t»,4J N N Λ „P W

s ^ I I $ s * * 8 ? t V η h

— CJ ja VO S3· CM -H

Λ N 3 g £ I I I 4J

e % s a g g £ s s „ „ < <-> o s| I I I Sh s Q - cr> 1- σι o o

Il II II II II u £

Cl Cl N 3 o £ 9 ^ — C-i C-j U s Q «C U O -H ^ H 2 Q 5 To - Λ *υ'd

DK 166585 B

12 E "n ”n “n

E E E

CN ΓΟ <N V£> .

n n N V.

ro in in rr E t— r— t— T- y ii o ii τ n o n T co to co i·} o h m 4 pl| > *— v—- «. ·— V *—· r-fQ »-Ό N Ό r— r0

II It I

ro r—* E ro ^ ID N II VO« Τ' y '.T W «·[/) *3· 1^3 'S" 03 vj \ < ^ *. ^ V *— «, ·—— •—- T— T— r- 03 t— I „ i t lit ^ y cn cn «-». o ii oo ---.

T co w co 0) er» »-D cr> co - ' Ν'— N— rj r- r- r- ro

Q

υ Ή >, «* o c c >i O E CJ COCO) -C N £ c ΟΌΦ-ϋ H —~ πέη > οι > o;

0n 7\_ « ? N -0 c 0 C

X ' T“ ce I kfc.nu ro O I E 0 0 0 0 H7\ E v/- O <- <« «-. tu iw O T V Λ 5

VT-0^-0 xw O

fX S O' m vd 2 fe O IN CN ^ EH ^ w 3, 'β· o

I ε e I

E C C m 0 m ς E VD ID \

^ > CN CN 4J

H E Π3

^ 4J

H- g 0) o 5 H k s! O 0 K, ? •g *“ E 5

•k Ό O H

Λ O O JS c 8 6 εΐ £„ £8 ' ! il &$ <r vT ^ ^ *"3D< m o vj * \ in dj s 1-1 ·Η m m cofcjfc-t <u λ· E cn -N ^

‘S * & Q ^ ^ in H H H

2 e 2Ϊ oo -k -k -k ^ «2 Q cn t-r- uj ii - AA 1 '' „S, ' n ik ik ro r- o > o £ -H £ k 4-1 k 0 (0 0 k H k 0) •k k -k f/\ QJ —«Ν >—Ν N^ w CO «5 Λ ϋ

X

Claims

5 B Z = P - R B (I) G-0 15 hvori T betyder triphenylmethyl, p-anisoyldiphenylmethyl eller di-(p-anisoyl)-phenylmethyl, B betyder 1-thyminyl, l-(N-4-benzoylcytosinyl), 9-(N- 6-benzoyladeninyl) eller 9-(N-2-isobutyroylguaninyl), 20. betyder en acyl- eller silylbeskyttelsesgruppe for en sekundær hydroxygruppe, Z betyder svovl eller selen, og R betyder alkyl med indtil 8 carbonatomer, cyclohexyl, benzyl eller eventuelt med fluor, chlor, brom, lavere 25 alkyl, lavere alkoxy eller trifluormethyl substitueret phenyl. *