DK166519B1 - Fremgangsmaade til maaling af haemoglobinkoncentrationen i de roede blodlegemer i en proeve af antikoaguleret helblod - Google Patents

Description

i DK 166519 B1

Opfindelsen angår en enkel fremgangsmåde til måling af hæmoglobinkoncentrationen i de røde blodlegemer i en prøve af antikoaguleret helblod, især en fremgangsmåde, der kan gennemføres hurtigt af en forholdsvis uøvet tekniker.

5 To målinger, der almindeligvis udføres i forbindelse med helblod, er bestemmelsen af hæmatokrit og hæmoglobin. Hæmatokrit er det procentvise rumfang, som pakkede røde blodlegemer optager i en centrifugeret prøve af helblod, og hæmoglobinindholdet er vægten af hæmoglobinet pr. rumfangs-10 enhed helblod. Det numeriske forhold mellem hæmoglobin og hæmatokrit betegnes som den gennemsnitlige hæmoglobinpar-tikelkoncentration (MCHC) eller den middel-korpuskulære hæmoglobinkoncentration, og hos normale individer er den tæt ved 33,9%. Når et individ lider af visse sygdomme, kan 15 forholdet dog variere fra ca. 38% og ned til 26%. Bestemmelsen af både hæmatokrit og hæmoglobin er således vigtig for opdagelsen og diagnosen af anæmi eller andre unormale tilstande i blodet.

I et stort laboratorium udføres målingerne af hæmato-20 krit og hæmoglobin almindeligvis samtidig i en automatiseret analysator, men i en lille klinik eller i lægens konsultation må disse målinger udføres særskilt under anvendelse af to forskellige metoder. Hæmatokrit-bestemmelsen kan i øjeblikket udføres ved fyldning af et glasrør med en lille gennemboring 25 med antikoaguleret helblod, hvorpå man forsegler den ene ende af røret og centrifugerer røret til sammenpakning af de røde blodlegemer. Efter sammenpakningen, der tager ca. 3 til ca. 5 minutter i en lille centrifuge, måles længden af den pakkede søjle af røde blodlegemer, og den totale fyldte 30 længde måles, hvorpå hæmatokrit beregnes som en procentværdi.

Det vil forstås, at der kun kræves ringe færdighed til klargøring af røret eller foretagelsen af målingerne. I US patentskrifterne nr. 4.027.660, nr. 4.181.609, nr. 4.156.570 og nr. 4.558.947 er der beskrevet en procedure, der omfatter 35 indføring af en prøve af antikoaguleret helblod i et kapillarrør, anbringelse af en flyder i røret med blodprøven og 2 DK 166519 B1 centrifugering af blodprøven til at bevirke, at flyderen anbringer sig i laget af røde blodlegemer til forlængelse af det brungule lag ("buffy coat", dvs. det overfladiske lag af koaguleret plasma fra blodet, der fås, når de røde 5 blodlegemer er fraskilt således, at overfladekoaglet synes næsten farveløst) i blodprøven. Denne kendte teknik kan også anvendes til måling af hæmatokrit, idet man blot tager hensyn til ekspansionen af en portion af blodprøven på grund af flyderen, når man beregner den totale længde af blodbe-10 standdelene, idet den iagttagne totale længde nedsættes i skala af måleinstrumentet' til kompensation for tilstedeværelsen af flyderen.

På den anden side er målingen af hæmoglobinkoncentrationen betydeligt mere kompliceret. Til udførelse af denne 15 bestemmelse i en lille klinik eller i en lægekonsultation skal blodprøven fortyndes mere nøjagtigt til et forhold på enten 1:250 eller 1:500, afhængigt af det anvendte apparatur. Fortyndingen foretages ved nøjagtigt at optage en meget lille prøve af blodet i en pipette og overføre den til en 20 beholder indeholdende et middel, der opløser de røde blodlegemer, og cyanid, der omdanner hæmoglobinet til en lettere målelig form. Blandingen anbringes efter henstand i fra tre til ti minutter i et fotometer, hvor lysafsvækkelsen ved 560 nm (grøn) sammenlignes med standardopløsninger. Ud fra 25 disse' sammenligninger kan koncentrationen af hæmoglobin beregnes. Der findes mange publicerede varianter af denne metode, men alle acceptable metoder til dato kræver den nøjagtige måling af lysafsvækkelsen i et instrument, der er udformet til dette formål. Endvidere kræver behovet for 30 nøjagtig håndtering af små mængder af prøven en højere grad af øvelse og omhu end hæmatokrit-bestemmelsen og er derfor også en kilde til analysefejl.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en fremgangsmåde til måling af hæmoglobinkon-35 centrationen i de røde blodlegemer i en prøve af antikoagu-leret helblod, ved hvilken hæmoglobinindholdet i blodprøven 3 DK 166519 B1 måles som en funktion af den udstrækning, i hvilken en flyder synker ned i et pakket lag af røde blodlegemer i en centrifugeret prøve af helblodet.

Dette formål opnås ifølge opfindelsen under anven-5 delse af i princippet de samme hjælpemidler og instrumenter, som i øjeblikket anvendes til måling af hæmatokrit, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man a) tilvejebringer et rør, b) anbringer en prøve af blodet i røret, 10 c) anbringer en flyder i røret i blodprøven, hvilken flyder er fremstillet af et materiale, der flyder i laget af de røde blodlegemer fra blodprøven, når røret - centrifugeres med blodprøven og flyderen anbragt deri, d) centrifugerer blodprøven, flyderen og røret til tilveje-15 bringelse af lag af de røde blodlegemer, hvide blodlegemer og plasma i overensstemmelse med deres respektive massefylder, e) måler længden af den del af flyderen, der er nedsænket under toppen eller den øverste overflade af laget af røde 20 blodlegemer, og f) beregner hæmoglobinkoncentrationen som en funktion af den længde af flyderen, der er nedsænket under toppen eller den øverste overflade af laget af røde blodlegemer.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er baseret på den 25 erkendelse, at.hæmoglobinkoncentrationen af de pakkede røde blodlegemer er omvendt proportional med den dybde, til hvilken flyderen ifølge den kendte teknik synker ned i laget af røde blodlegemer. Mikroprocessoren i måleinstrumentet programmeres til at omdanne yderligere dybdemålinger til hæmo-30 globinkoncentrationen. De fremgangsmådetrin, der anvendes til udførelse af den her omhandlede fremgangsmåde, er følgende. Prøven af helblod indtages i centrifugerøret, fortrinsvis et kapillarrør, og antikoaguleres, og flyderen anbringes i røret. Efter at bunden af røret er lukket til, 35 centrifugeres prøven til opdeling af blodet i lag bestående af lag af røde blodlegemer, brungult overtræk ("buffy coat", 4 DK 166519 B1 jfr. ovenfor) og plasma. Under centrifugeringen finder flyderen sin stilling i laget af røde blodlegemer. Hæmatokriten måles derpå i almindelighed som ifølge den kendte teknik.

Hæmoglobinet måles på følgende måde. Som angivet 5 ovenfor er MCHC for de røde blodlegemer koncentrationen af hæmoglobin i disse, normalt ca. 340 gram pr. liter. Ca. 1/3 af hver celle er derfor hæmoglobin, idet resten er vand samt en ringe koncentration af salte og mindre proteiner med forholdsvis konstant koncentration. Det følger heraf, 10 at den faktisk eneste bidragyder til massefyldeforskelle mellem forskellige patienters røde blodlegemer er deres hæmoglobinkoncentration. Massefylden af de - pakkede røde blodlegemer er derfor proportional med MCHC-værdien, og såfremt denne værdi kan opnås nøjagtigt, kan hæmoglobinind-15 holdet beregnes som: hæmoglobin = hæmatokrit x MCHC.

Det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendte apparat omfatter et transparent rør med konstant udboringsdiameter, hvori der er anbragt en harpiksagtig eller -holdig flyder. Antikoaguleret blod trækkes ind i røret, enten ved 20 kapillarvirkning eller ved svag sugning. Den eksakte mængde er ikke kritisk, blot der er tilstrækkeligt blod til at bære flyderen oppe. Den ene ende af røret tillukkes, og røret centrifugeres derpå ved ca. 10.000 G i ca. 5 minutter. Dette er det samme arrangement, som løbende anvendes til 25 udførelse af standard-hæmatokritbestemmelsen. Når centrifugeringen er fuldstændig, vil flyderen, der har en specifik massefylde mellem massefylden for plasma og for de pakkede røde blodlegemer, blive båret delvis oppe af de pakkede røde blodlegemer. Hæmokritmængden måles ved at tage forholdet 30 mellem længden af blodprøven i røret (den samlede længde af de pakkede røde blodlegemer, brungult overtræk ("buffy coat") og plasma) og længden af kun søjlen af de pakkede røde blodlegemer. Rumfanget af flyderen skal der naturligvis tages hensyn til ved udførelsen af denne beregning. Eftersom 35 dybden af flyderen er omvendt proportional med massefylden af de pakkede røde blodlegemer, kan massefylden af røde 5 DK 166519 B1 blodlegemer beregnes og omregnes til hæmoglobinindhold på følgende måde:

Summen af opdriftskræfter på et flydende eller svømmende objekt, der har nået ligevægt, f.eks. den ifølge opfin-5 delsen anvendte flyder, er nul. De oppebærende kræfter i et trefasesystem såsom det her omhandlede, der består af en cylindrisk plastflyder, pakkede røde blodlegemer og plasma, kan udtrykkes som følger: (Dj- — Df) x Lj- + (Dp — Df) x Lp = 0, 10 hvor Dj- er massefylden af de pakkede røde blodlegemer, Df er massefylden af plastflyderen, Lr er længden af flyderen, der er nedsænket i de pakkede røde blodlegemer, Dp er massefylden af plasmaet, og Lp er længden af flyderen, der er nedsænket i plasmaet.

15 I den foranstående ligning er massefylden af de pak kede røde blodlegemer ikke kendt. Massefylden og længden af plastflyderen er kendt og indføres i mikroprocessorens hukommelse. Ligeledes er massefylden af plasmaet kendt og indføres i mikroprocessorens hukommelse. Længden af flyderen, der er 20 nedsænket i de røde blodlegemer, måles og indføres derpå i processoren. Endelig beregnes længden af flyderen, der er nedsænket i plasmaet, af processoren ved subtraktion af længden af flyderen nedsænket i de røde blodlegemer fra flyderens totale længde. Mikroprocessoren kan således heref-25 ter løse ligningen med hensyn til massefylden af de røde blodlegemer, Dj..

Når først Dr er beregnet, kan MCHC-værdien beregnes af mikroprocessoren ved løsning af ligningen: MCHC = (Dj- X Kg) + K0 .

30 MCHC-konstanterne, KD og Ks, kan bestemmes empirisk ved udførelse af massefyldemålinger for røde blodlegemer / for et antal forskellige prøver og korrelation af massefylden med MCHC-værdien som bestemt ved konventionelle referencemålinger. Hældningskonstanten, Ks, og offset-konstanten, 35 K0, fra den bedst passende korrelationsligning anvendes derpå til beregning af MCHC-værdien ud fra massefylden af 6 DK 166519 B1 de røde blodlegemer. Når først de er beregnet, vil Ks og KD ikke blive ændret, medmindre kritiske parametre for udstyret, dvs. flyder-massefylden etc., ændres.

Ud fra MCHC-værdien kan hæmoglobinkoncentrationen 5 bestemmes som tidligere beskrevet, dvs. hæmoglobin = hæmato-krit x MCHC.

Opfindelsen illustreres nærmere i den følgende detaljerede beskrivelse i forbindelse med tegningen, på hvilken fig. 1 viser et lodret sidesnit i et glasrør indehol-10 dende en centrifugeret blodprøve og en flyder, der befinder sig i laget af røde blodlegemer i den centrifugerede blodprøve, og fig. 2 viser et tværsnit af røret langs' linien 2-2 i fig. 1.

15 På tegningen er et rør 2 fortrinsvis et glaskapillar- rør, der kan have et antikoagulatidnsmiddel overtrukket på rørets indre væg. Bunden af røret 2 er aflukket med en lerprop 4 eller med en plastkappe, der kan trykkes ind over enden af røret 2, efter at blodprøven er trukket ind i røret 20 2. En flyder 6 anbringes i røret 2, og når blodprøven centri fugeres i røret 2, indtager flyderen 6 en position i laget af de røde blodlegemer, der har betegnelsen 8. Oven over flyderen 6 befinder der sig et plasmalag 10. Flyderen 6 vil have en forud fastlagt, kendt aksial længde L, og den tek-25 niker, der udfører målingerne, vil måle afstanden Lr, der er den længde af flyderen 6, der er sunket ned i laget af røde blodlegemer. Den flyder, der er vist på tegningen, har en rilleformet tværsnitskonfiguration. Denne konfiguration giver flyderen 6 et mindre tværsnitsareal således, at den 30 iagttagne aksiale længde af den centrifugerede blodprøve og især det brungule lag ("buffy coat") ikke forlænges signifikant. Rillerne 7 på flyderen 6 tjener til at opretholde det koaksiale forhold til røret 2. Som tidligere nævnt er en rillet, tværsnitformindsket flyder ikke essentiel for 35 udførelsen af hæmatokrit- og hæmoglobinmålingerne. I den foreliggende udførelsesform bør tværsnitsarealet af flyderen 7 UK Ibbblb tn fortrinsvis være ikke mere end ca. 2/3 af tværsnitsarealet af rørlysningen.

Det blod, der anvendes til bestemmelsen, skal være antikoaguleret, således at de røde blodlegemer og plasma 5 vil blive adskilt. Dette kan gøres ved at trække blodet ind i en beholder indeholdende antikoagulationsmiddel inden tilførslen af blodet til røret, eller ved inkorporering af et antikoagulationsmiddel, f.eks. heparin eller lignende, i selve det transparente rør. Dette vil tillade fyldning af 10 røret direkte fra en finger-blodprøveaftapning.

Det vil forstås, at denne procedure ikke tager længere tid eller kræver mere øvelse end målingen af hæmatokriten alene. Det vil også forstås, at en optisk scanner, f.eks. som beskrevet i US patentskrift nr. 4.156.570 eller i US pa-15 tentskrift nr. 4.558.947, kan anvendes til aflæsning af længderne og automatisk beregning af resultaterne. Eftersom denne procedure byger på to primære målinger (længde og massefylde), kræver testen ikke standardisering.

Der findes to generelle udførelsesformer for udstyr 20 eller apparatur til anvendelse til udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Den første er som vist på tegningen og som beskrevet ovenfor, og den anden er identisk med det apparat, der er beskrevet i US patentskrift nr. 4.077.396 og er anvendeligt til visuel bestemmelse af de generelle 25 leukocyt- og blodplademængder, der udgør det brungule ("buffy") lag i en prøve af helblod ved anbringelse af en flyder i et rør indeholdende blodprøven. Flyderen ekspanderer fysisk det brungule ("buffy") lag således, at der tillades visuel bestemmelse af blodbestanddelene.

30 Når flyderen er tilstrækkelig stor til udførelse af "buffy coat"-målingerne, som beskrevet i de ovennævnte US patentskrifter, kan man kompensere for den opdriftsvirkning, som det ekspanderede "buffy coat" udøver på flyderen, på følgende måde. Når der anvendes en sådan flyder, vil de tre 35 cellulære bestanddele af det foreliggende "buffy coat" forøge de opdriftskræfter, der udøves på plastf lyderen, og de må DK 166519 B1 8 derfor tages med i betragtning, når man beregner massefylden af de røde blodlegemer. Der anvendes derfor den følgende ligning: 5 (Dr-Df) xLr+ (Dg-Df) xLg+ (Dlm-Df) xLlm+(Dpf-Df)Χΐρ!+ (Dp-Df) xLp=0, hvor Dp/ Dr, Lp, Lr og Lf har den ovenfor angivne betydning,

Lp! er den iagttagne længde af flyderen anbragt i blodpladelaget af blodprøven, 10 L^ er den iagttagne længde af flyderen anbragt i monocyt/-lymfocytcellelaget af blodprøven,

Lg er den iagttagne længde af flyderen anbragt i granulocyt--cellelaget af blodprøven,

Dg er massefylden af granulocytcellelaget, 15 Dxm er massefylden af lymfocyt/monocyt-cellelaget, og Dp! er massefylden af blodpladelaget.

Det instrument, der anvendes, er indrettet til måling af antallet af hvide blodlegemebestanddele som beskrevet i den nævnte kendte teknik.

20 Mikroprocessoren vil således have input-informationer som ovenfor beskrevet og vil også have input med hensyn til massefylderne af granulocytter, lymfocytter/monocytter og blodplader. Under målingen måles længderne af flyderen anbragt i lagene af granulocytter, lymfocytter/monocytter og 25 blodplader, og disse længder indføres som input i mikroprocessoren. Værdien af Lf beregnes af mikroprocessoren som forskellen mellem den totale flyderlængde og de kumulative længder af flyderen, der er nedsænket i de røde blodlegemer, granulocytter, lymfocytter/monocytter og blodplader. Dr kan 30 derpå beregnes af mikroprocessoren. Når først Dr er beregnet, kan hæmoglobinværdien bestemmes som angivet i det første eksempel.

Denne teknik er blevet afprøvet ved bestemmelse af hæmoglobin og hæmatokrit hos 100 patienter. Resultaterne, 35 der opnås ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er praktisk taget identiske med de resultater, der DK 166519 B1 9 o opnås i et hospitalslaboratorium under anvendelse af automatiserede analyseapparater (relativ standardfejl på 2,7%).

Det vil ses, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen hurtigt og let fører til hæmatokrit- og hæmoglobin-målinger 5 i en antikoaguleret prøve af helblod. Fremgangsmåden kan udføres af en forholdsvis uøvet person og kan gennemføres med en enkelt blodprøve. Fremgangsmåden er særlig velegnet til anvendelse i mindre klinikker og i lægekonsultationer, men kan også anvendes i større laboratorier og hospitaler.

10

Claims (6)

1. Fremgangsmåde til måling af hæmoglobinkoncentrationen i de røde blodlegemer i en prøve af antikoaguleret helblod, kendetegnet ved, at man 5 a) tilvejebringer et rør, b) anbringer en prøve af blodet i røret, c) anbringer en flyder i røret i blodprøven, hvilken flyder er fremstillet af et materiale, der flyder i laget af de røde blodlegemer fra blodprøven, når røret centrifugeres 10 med blodprøven og flyderen anbragt deri, d) centrifugerer blodprøven, flyderen og røret til tilvejebringelse af lag af de røde blodlegemer, hvide blodlegemer og plasma i overensstemmelse med deres respektive massefylder, 15 e) måler længden af den del af flyderen, der er nedsænket under toppen eller den øverste overflade af laget af røde blodlegemer, og f) beregner hæmoglobinkoncentrationen som en funktion af den længde af flyderen, der er nedsænket under toppen eller 20 den øverste overflade af laget af røde blodlegemer.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den totale længde af laget af de røde blodlegemer måles til beregning af en hæmatokrit-værdi for blodprøven, og at hæmoglobinkoncentrationen i helblodet beregnes 25 ved multiplikation af den beregnede hæmatokrit-værdi med en middel-korpuskulær hæmoglobinkoncentration i blodprøven.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at middel-korpuskulær koncentrationen af hæmoglobin i blodprøven bestemmes ud fra formlerne 30 (Dr-Df) X Lr + (Dp - Df) x Lp = 0 og MCHC = (Dr x Ks) + K0, hvor Dr er massefylden af de røde blodlegemer, Df er massefylden af flyderen,

35 Dp er massefylden af plasmaet, Lr er længden af flyderen, der er nedsænket i de røde blod- DK Ί665Ί9 bl legemer, Lp er længden af flyderen anbragt i plasmalaget, MCHC er den middel-korpuskulære hæmoglobinkoncentration, og K0 og Ks er empirisk bestemte konstanter.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at flyderen er aksialt aflang og med minimalt aksialt, konstant tværsnit til minimering af udstrækningen af de cellelag, hvori flyderen indtager sin position.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendete g- 10 net ved, at flyderen har en rillet tværsnitskonfiguration, der minimerer cellelagsekspansion, men tillader koaksial konformitet mellem flyderen og kapillarrøret.-

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at alle beregningerne udføres af en forprogram- 15 meret mikroprocessor.