DK164865B - Silibininderivater, fremgangsmaade til fremstilling deraf samt farmaceutisk middel indeholdende silibininderivaterne - Google Patents

Description

i

DK 164865 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte silibininderi-vater med den nedenfor anførte formel (I), en fremganganåde til deres fremstilling samt farmaceutiske midler, son indeholder disse forbindelser.

Silybum marianum (L.) Gaertn. (Carduus marianus L.) har siden 5 oldtiden været en kendt lægeplante. Fra flavolignaner, som forekommer i frugterne fra denne plante, har R. Munster isoleret en komponent, silybin, jf. Dissertation R. Miinster,

Munchen 1966. Denne forbindelses kemiske struktur er bestemt af A. Pelter og R. Hånsel, jf. Tetrahedron Letters, London, 10 bind 25, side 2911-2916 (1968).

Det er kendt, at silybin, der tidligere også blev betegnet silymarin I, er et værdifuldt leverterapeutikum, jf. DE-frem-læggelsesskrift nr. 1.767.666. Endvidere kendes en teknisk fremgangsmåde til fremstilling af silybin (silymarin I), jf.

15 f.eks. DE-fremlæggelsesskrift nr. 1.923.082.

Allerede i 1974 blev det antaget, at der med hensyn til silybin findes to stillingsisomerer, nemlig silybin og isosilybin, jf.

H. Wagner, P. Diesel og M.Seitz, Arzneimittelforschung, bind 24 (4), side 466-471.

20 Denne antagelse er blevet præciseret og bekræftet eksperimentelt, jf. A. Arnone, L.Merlini og A. Zanarotti, Journal Chemical Society Chem.comm., 1979, bind 16, side 696-697. Ifølge dette litteratursted består det kendte silybin af to forskellige forbindelser, nemlig silibinin og isosilybin med de 25 nedenfor anførte strukturformler A og B:

* Q CH_OH

A/v 2 HO ^ O L J OCH- YY N/n^o 3

OH O

(A) silibinin

DK 164865 B

2

. OH

/V 0 I

I 3 \^\/ Nj/^V^o^ch^h

Y^O^OH OH O

(B) isosilybin

Det fremgår af disse strukturformler, at disse forbindelser er stillingsisomerer. Forbindelsen med formlen (A) har i den seneste tid fået INN-betegnelsen silibinin. Denne betegnelse an-5 vendes i det følgende for forbindelsen med formlen (A).

Den terapeutiske anvendelse af silybin har været forbundet med vanskeligheder, da silybin praktisk taget er uopløseligt i vand, .'således at det ikke har været muligt at fremstille silybinholdige injektionsopløsninger eller præparater, som kræver en vis vand-10, opløselighed. Fra DE-patentskrift nr. 1.963.318 kendes ganske vist silybinderivater, som har en vis vandopløselighed, men der er dog tale om en yderst kompleks blanding af ravsyrehalv-estere. Denne blandings store kompleksicitet skyldes, at silybin indeholder fem esterificerbare hydroxylgrupper, at 15 silybin desuden indeholder de to ovenfor betegnede stillingsisomerer, og at den til esterificeringen anvendte ravsyre er en dicarboxylsyre, der kan danne såvel mono- som diestere.

Et produkt, som består af et ukendt antal forskellige, ubestemte forbindelser, er ikke anvendeligt til farmaceutiske 20 formål.

Det er formålet med opfindelsen at tilvejebringe vandopløselige silibininderivater, der er velegnede til farmaceutiske formål, og som kan karakteriseres nøjagtigt som individuelle kemiske forbindelser.

DK 164865 B

3

Det har vist sig, at silibininderivater af oxalsyre og af visse alkan- og alkylendicarboxylsyrer opfylder disse fordringer. I overensstemmelse hermed er silibininderivaterne ifølge opfindelsen ejendommelige ved, at de har den almene formel Y 2 1 η 1 5 ^ / OCH 3 (i 0 TT (i) OH 0 \o-(Alk0) -C00Mo 2 m 2 hvori n og m hver for sig er 0 eller 1, Alk^ og Alk3 hver for sig betyder en alkylengruppe med 1-4 carbonatomer eller en alkenylengruppe med 2-4 carbonatomer, og og M3 hver for sig betyder et hydrogenatom eller et alkalimetalatom.

10 Foretrukne forbindelser med formlen (I) er forbindelser, hvori n og m hver for sig er 0 eller 1, Alk^ og Alk£ hver for sig er en alkylengruppe med 2 carbonatomer, og og M^ hver for sig er et alkalimetalatom. Fortrinsvis er henholdsvis n og m, Alk^ og Alk3 samt og M3 ens.

15 Især foretrækkes silibinin-C-2',3-dihydrogensuccinat-dinatrium-salt.

I forbindelserne ifølge opfindelsen er de OH-grupper i silibininet, som ikke er bundet til en benzenkerne, esteri-ficerede, f.eks. med oxalsyre, malonsyre, råvsyre, adipinsyre, 20 maleinsyre eller fumarsyre. Fortrinsvis er de to ikke aromatisk bundne OH-grupper i silibininet esterificeret med en af de nævnte carboxylsyrer.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af de af de anhand- _

DK 164865B

4 lede silibininderivater med formlen (I) hvori n og m er 1, og M1 og M2 er ens, er ejendommelig ved, at man opløser 1 vægtdel silibinin med formlen

. 0 CHo0H

A/y 2 H0 Λ O. 1 l Λ λ OCH,

yv|^Y

nAoh OH 0 (A) silibinin i 1-2 vægtdele pyridin og omsætter under omrøring med 1-3 vægt-5 dele dicarboxylsyreanhydrid med formlen 0 = C - Alk - C = 0 X/ hvori Alk betyder en af de ovenfor definerede grupper Alk^ eller Alk2, tilsætter ethanol til dannelse af en homogen blanding, hvorpå man under intensiv omrøring langsomt tilsætter vand, 10 hvorved tilstedeværende estere af de aromatisk bundne 0H-grupper hydrolyseres, fortynder med ethylacetat så snart hydrolysen er fuldstændig, vasker med ethylacetatmættet surt vand, inddamper ethylacetatfasen, og eventuelt optager remanensen i ethanol og foretager omdannelse med en alkoholisk alkalimetal-15 hydroxidopløsning til alkalimetalsaltet af de frie carboxylsyregrupper.

Omsætningen med dicarboxylsyreanhydridet gennemføres fortrinsvis ved en temperatur på 40-50°C. Det er fordelagtigt at holde det ethylacetatmættede sure vaskevand på en pH-værdi på fra ca. 1,5 til ca. 2,4.

20 Forbindelserne ifølge opfindelsen, især forbindelsen silibinin- 0-^,3- dihydrogensuccinat-dinatriumsalt, udviser overraskende en udtalt farmakologisk virkning ved behandling af forbrændin-

DK 164865 B

5 ger. Til trods for den omtalte derivatisering bibeholder forbindelserne det kendte silybins fulde farmakologiske virkning som leverterapeutikum. Forbindelserne ifølge opfindelsen er særligt velegnede til behandling af leverzirrhose og toksisk-5 metaboliske leverbeskadigelser.

Det har overraskende vist sig, at forbindelserne ifølge opfindelsen også er særdeles virksomme ved behandling af svampeforgiftninger, især den meget farlige forgiftning med grøn løgknoldet fluesvamp (Amanita phalloides). Også forgiftninger 10 med halogenerede organiske opløsningsmidler, såsom carbon-tetrachlorid, trichlorethylen og chloroform, kan behandles med forbindelserne ifølge opfindelsen med overraskende godt resultat. Ved forebyggende anvendelse forhindrer forbindelserne ifølge opfindelsen de ovenfor omtalte beskadigelser.

15 De farmaceutiske midler ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de indeholder mindst én forbindelse med formlen (I) og et farmaceutisk bærestof eller hjælpestof. De omhandlede forbindelser anvendes for det meste systemisk, f .eks. i form af piller, kapsler og opløsninger, i sædvanlige bærestoffer eller sammen med gængse hjælpe-20 stoffer. Dagsdosis for et voksent menneske udgør fra ca. 50 til ca. 500 mg afhængigt af patientens tilstand og sygdomssymptomernes sværhedsgrad.

Forsøg med silibinin-C-2',3-dihydrogensuccinat-dinatriumsalt (sili-suc-na).

25 Symptomerne, som optræder ved forbrændinger, skyldes især en intoksikation med produkter fra den termiske vævsnekrose. Der er på mange forskellige måder ført bevis for, at autointoksi-kative processer efter svære hudforbrændinger er ansvarlige herfor. Særligt overbevisende er krydstransplantationer af 30 forbrændt og ikke-forbrændt hud på henholdsvis sunde og forbrændte dyr, hvorved det er påvist, at forbrændt hud transplanteret på et dyr, som ikke er forbrændt, går til grunde, medens der på sund hud transplanteret til forbrændte dyr ikke kan konstateres skadelige virkninger, jf. K.H. Schmidt 35 et al., Neuere Aspekte zur Autointoxikation nach schweren

DK 164865 B

6

Verbrennungen, Die Verbrennungskrankheit (F.W. Ahnefeld et al., eds. L) , Springer, Berlin 1982, side 45-52.

Ved hudforbrændinger sker der en frigørelse eller nydannelse af et stort antal kemiske forbindelser. Trods det store antal 5 er det lykkedes at fastlægge strukturen af nogle af disse forbindelser. Det kan bl.a. påvises, at de forbindelser, som dannes ved hudforbrændinger, ligner de forbindelser, som dannes ved lipidperoxidation. Der består også analogier med hensyn til disse forbindelsers toksiske virkning. Især fremhæves 10 dannelsen af toksisk virkende mættede og umættede aldehyder med forskellig kædelængde som følge af lipidperoxidationen (Benedetti et al., Identification of 4-hydroxynonenal as a cytotoxic product originating from the peroxidation of liver microsomal lipids, Biochim. Biophys. Acta 620, 281-296, 1980) 15 og den termiske vævsbeskadigelse (K.H. Schmidt et al., Studies on the structure and biological effects of pyrotoxins purified from burned skin, World J. Surg. 3, 361-365, 1979). Det antages derfor, at forbrændinger fører til en oxidativ beskadigelse af cellestrukturer.

20 Der er derfor foretaget undersøgelser af autooxidative forandringer ved membranlipider som følge af en autointoksikation efter svære forbrændinger. Især foretages undersøgelser af forandringer af membranlipidernes fedtsyresammensætning. Det er endvidere blevet undersøgt, om silibininderivaterne ifølge op-25 findelsen påvirker forandringerne i membranlipidernes fedtsyresammensætning .

Forandringer i membranlipiders fedtsyresammensætning efter svære forbrændinger_

Hanrotter (Wistar) med en gennemsnitsvægt på 360 g holdes i 30 grupper på tre med fri adgang til vand og tørfoder. Rumtemperaturen er frem til forsøgets start 22°C, og efter forsøgets begyndelse holdes dyrene ved en temperatur på 30°C.

7 DK 164865 B

Hudforbrændingerne fremkaldes med et kobberstempel med en 2 overflade på 20 cm ved konstant tryk ved en temperatur på 250°C. For at udelukke en termisk beskadigelse af dybereliggende organer, trækkes huden over en luftkølet hul spatel.

5 Ved denne dyremodel kan der foretages yderst nøjagtige forbrændingslæsioner, der giver konstante overlevelsesrater.

Inden forsøgets begyndelse narkotiseres dyrene med 50 mg/kg Nembutal. Efter forbrændingen foretages chok-profylakse ved intraperitoneal injektion af 20 ml Ringer-lactat-opløsning.

10 Dyrene opdeles i 5 forsøgsgrupper som følger: a) Normalgruppe: Helt ubeskadigede dyr.

b) Kontrolgruppe I: Kun silibinin-behandling i 6 dage med 75,5 mg sili-suc-na.

c) Kontrolgruppe II: Skinopererede dyr.

15 d) Gruppe med forbrændte dyr: 25% (udtrykt som.arealet af den forbrændte hudoverflade i forhold til dyrets samlede hudoverflade), 250°C, 20 sekunder, 0,5 atm.

e) Testgruppe: Dyr, som har fået intraperitoneal indgift af 20 75,5 mg sili-suc-na i 6 dage begyndende en dag inden forbrændingen.

Til isolering af mikrosomerne udtages blod fra dyrene i narkose efter forsøgets afslutning. Derefter udtages leveren, som vejes og straks overføres til et iskoldt isoleringsmedium (0,25 M 25 saccharose, 1 mM EDTA, 10 mmol Tris-HCl, pH 7,2). Leveren skæres i stykker og homogeniseres i mediet. Ved differentialcentrifugering isoleres mikrosomfraktionen i form af en lille kugle. Mikrosomerne resuspenderes og centrifugeres på ny. Derpå fremstilles en suspension, hvoraf 1 ml svarer til 1 g lever-3 o væv.

Lipiderne bestemmes under anvendelse af fremgangsmåden ifølge J. Folch (A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues, J. Biol. Chem. 226, 497-508 (1957)), modificeret af Bligh og Dyer (A rapid method of 35 total lipid extraction and purification, Can. J. Biochem.

DK 164865 B

8

Physiol. 37, 911-917 (1959)).

De ekstraherede mikrosomlipider hydrolyseres med natriumhydroxidopløsning. De frie fedtsyrer esterificeres ved tilsætning af BF2-methanol. Efter afdampning af methanolet og 5 fjernelse af hydrofile biprodukter foretages kvantitativ bestemmelse af fedtsyreestrene.

Hos den ikke-forbrændte dyregruppe konstateres ingen nævneværdig forandring af fedtsyremønsteret. Narkosen og det lille operative indgreb medfører således ikke en forandring af de mikroso-10 male lipider. Af denne grund sammenlægges normalgruppen og kontrolgruppen II til en kontrolgruppe til brug ved.de videre sammenligninger. En sammenligning af de ikke-forbrændte og forbrændte, ubehandlede dyr med hensyn til det mikrosomale fedtsyremønster viser kraftige forskydninger fra umættede til mættede fedtsyrer.

15 På tegningen er i fig. 1 vist fedtsyrefordelingen i de mikrosomale leverlipider og de ved termisk hudbeskadigelse fremkaldte forandringer. Andelen af palmitinsyre (C16) stiger efter forbrænding fra 25,1% til 34,4% af det samlede fedtsyreindhold. Ved stearinsyre (C18) ligger andelen ved de forbrænd- 20. te dyr fra 46,3% til 13,2% over værdien opnået med kontroldyrene. Ved oliesyre (C18:l) kan påvises et mindre, ikke signifikant fald. Andelen af linolsyre (C18:2) falder efter forbrænding til ca. 1/3 af udgangsværdien. Ved arachidonsyre (C20:4) findes der efter forbrænding kun 31% af det oprindelige indhold.

25 Den efterfølgende tabel 1 viser indvirkningen af sili-suc-na på fedtsyreindholdet i forbrændte og ikke-forbrændte dyr.

DK 164865 B

9

Tabel 1.

Fedtsyremønster for mikrosomale lipider fra rottelever efter sili-suc-na-terapi af forbrændte og ikke-forbrændte dyr_ _C16_C18_C18:1_C18:2_C20:4

Ikke-forbrændte 29,8% 37,2% 8,9% 9,6% 16,2% 5 dyr (kontrol- ±6,2 ±12,3 ±1,1 ±3,3 ±4,9 gruppe 1)

Forbrændte dyr 25,4% 37,5% 7,8% 11,4% 18,0% ±6,0 ±8,6 ±1,0 ±5,3 ±9,1

Det fremgår af tabellen, at behandlingen af de ikke-forbrændte 10 kontroldyr med et silibininderivat ifølge opfindelsen ikke medfører væsentlige forandringer sammenlignet med de ubehandlede dyr. Ved de forbrændte dyr fører behandlingen til fuldstændig ophævelse af tabet af umættede fedtsyrer.

Konklusion: Forbrændinger fører til forandringer i fedtsyre-15 mønsteret i mikrosomale lipider. Det antages, at dette skyldes en oxidativ beskadigelse af membranerne. Dette viser sig især ved den kraftige nedgang i de flerumættede fedtsyrer.

Silibininderivaterne ifølge opfindelsen er i stand til at inhibere oxidative celleskader. De er derfor særlig velegnede 20 til at afbryde oxidative beskadigelsesmekanismer efter svære forbrændinger.

Som anført ovenfor antager man, at autotoksiske reaktioner efter svære forbrændinger især medfører oxidative cellebeskadigelser. Det er derfor blevet undersøgt, hvilken virk-25 ning en standardiseret termisk læsion har på den PHA-inducere-de blastogenese af T-lymphocyter fra milten og det perifere blod fra rotter.

Det er endvidere undersøgt, hvordan silibininderivaterne ifølge -

DK 164865 B

10 opfindelsen påvirker sådanne lymphocytære funktionsforstyrrelser efter svære forbrændinger.

Virkning af en standardiseret termisk læsion på den PHA-in-ducerede blastogenese af T-lymphocyter fra milten og det 5 perifere blod fra rotter_

Der foretages forbrænding af ryghuden på Wistar-rotter med et kobberstempel som beskrevet ovenfor. Som kontrolgruppe anvendes skinforbrændte dyr, hvor alle de operative manipulationer foretages, uden dog at dyrene forbrændes. Efter 2, 4, 7 10 og 9 dage udtages blod og milt fra de forbrændte dyr og kontroldyrene i ethernarkose. Til isolering af lymphocyterne hældes heparinbehandlet blod på Ficoll-Hypaque-opløsning (vægtfylde 1,077). Derefter foretages centrifugering, og de dannede lymphocyter testes med trypan-blåt for leve-15 dygtighed. Til isolering af miltlymphocyter findeldes organet, hvorpå materialet sigtes, og ledsagende erythrocyter fjernes med lyse-opløsning ifølge Gay.

Derpå inkuberes celleblandingen i en beholder i nærværelse* af 5% varmeinaktiveret føtalt kalveserum i 30 minutter for at 20 formindske mængden af mononukleære celler i suspensionen ved adhæsion til beholdervæggen (5%). Cellerne anbringes i fladbundede mikrotiterplader med henblik på dyrkning. Derefter tilsættes 20% føtalt kalveserum. På denne måde bestemmes den spon-tane blastogenese ved måling af inkorporeringen af H-thymidin 25 (2Ci/mM) i cellernes DNA.

Ved forforsøg er det konstateret, at der optræder en optimal mitogenstimulering ved en PHA-koncentration (mitogen-phyt-hæmagglutinin) på 5 yg/ml. Ved disse forsøg til optimering af det cellulære testsystem konstateres det endvidere, at 30 den maksimale stimulering af nydannelsen af DNA opnås efter 72 timer. Det konstateres desuden, at den optimale koncentration af føtalt kalveserum ligger ved 20% med henblik på opnåelse af den kraftigste stimulering.

DK 164865 B

11

Som beskrevet ovenfor bestemmes den spontane blastogenese 3 ved måling af inkorporeringen af H-thymidin i cellernes DNA.

3 18 timer efter tilsætningen af H-thymidin isoleres cellerne, 3 idet nulpunktet for de 18 timer, som er tidspunktet for H-thymi-5 din-inkorporeringsraten uden stimulering, falder sammen med tidspunktet for den maksimale stimulering.

Til undersøgelse af virkningen af silibininderivaterne ifølge opfindelsen behandles en gruppe rotter med et silibininderivat, idet der foretages intraperitoneal injektion af 75,5 mg sili-10 suc-na 1 gang pr. dag. Denne behandling gennemføres fra forbrændingsdagen indtil dagen for organudtagelsen (maksimalt til og med den 9. dag) .

Til bedømmelse af resultaterne opnået med kontroldyrene og de ikke-forbrændte dyr og de med sili-suc-na behandlede dyr be-15 regnes stimulationsindekset. Dette er kvotienten mellem gennemsnitsværdien for den stimulerede prøve og gennemsnitsværdien for kontrolprøven. Ud fra de således bestemte stimulationsindeks for hvert forsøgsdyr beregnes et gennemsnitsstimulationsgennemsnit pr. dyregruppe. De opnåede resultater udtrykkes-ved 20 dette indeks SI .

På tegningen viser fig. 2 virkningen af det anvendte sili-suc-na på blastogenesen af lymphocyter. Hos de forbrændte dyr opnås der ved behandling med silibinin en udtalt forøgelse af cellernes formindskede stimuleringsevne.

25 Allerede den 2. dag viser de med sili-suc-na behandlede dyr et ca. 10 gange højere respons hos blodlymphocyterne mod PHA.

Den 4. dag efter læsionen er værdien for stimuleringsindekset ved blodlymphocyter for behandlede dyr 8, medens den tilsvarende værdi ved de ubehandlede dyr er 1,5.

30 Ved miltcellerne ligger stimuleringsindekserne hos forbrændte ubehandlede dyr alle tydeligt under 1. Indgivelsen af silibinin medfører en signifikant forbedring på alle dage, hvor der foretages undersøgelse, idet der på den 7. dag efter læsionen opnås et maksimum.

DK 164865 B

12

Der foretages også sammenligningsforsøg, som viser, at sili-suc-na alene ved indgift til sunde dyr ikke fører til signifikante ændringer i stimuleringsevnen ved den PHA-inducerede blastogenese af T-lymphocyter fra milten og fra det peridere blod.

5 Silibininet ifølge opfindelsen stimulerer således blastogenesen af lymphocyter fra forbrændte dyr på signifikant måde.

Det har endvidere vist sig, at den almene katabolisme er mindre hos dyr behandlet med silibininderivaterne, da dyrene hurtigt efter den termiske læsion atter tager på i vægt.

10 Svampeforgiftninger:

Forgiftninger med grøn løgknoldet fluesvamp hører til de vanskeligste, som findes i medicinen. Selv om kun 10-30% af alle svampeforgiftninger er forårsaget af den grønne løgknoldede fluesvamp, har forgiftninger med denne svamp altid haft den 15 største medicinske interesse på grund af dens farlighed. I

ældre værker angives letaliteten til 30-50%. Takket være den moderne intensivmedicin har en undersøgelse af Floresheim et al. på 205 patienter vist, at dette tal er formindsket til-gennemsnitligt 22,4%.

20 Giften i den grønne løgknoldede fluesvamp, amanitin, kan allerede i en dosis på 7 mg være dødelig for et voksent menneske. Denne giftmængde er indeholdt i ca. 50 g frisk svamp.

Efter en række lovende dyreforsøg er forbindelsen sili-suc-na anvendt til behandling af forgiftninger med den grønne løg-25 knoldede fluesvamp. 28 patienter med forgiftning med den grønne løgknoldede fluesvamp behandles på sædvanlig måde og desuden med sili-suc-na. Af disse 28 patienter døde kun én, som havde indtaget større mængder af giftsvampen med henblik på at begå selvmord. Dette resultat demonstrerer et enormt tera-30 peutisk fremskridt på dette område.

Isosilybinfrit silibinin kan fremstilles på følgende måde:

En suspension af 500 g af produktet fremstillet ifølge DE-frem-_

DK 164865 B

13 læggelsesskrift nr. 1.923.082, spalte 8, linie 14-19, med et silymarinindhold på ca. 70% ved et isomerforhold silybin/sili-dianin/silicristin på ca. 3:1:1, idet silybinet indeholder ca. 1/3 isosilybin, og 2 kg methanol svarende til ca. 2,53 liter 5 opvarmes under omrøring i 15 minutter til kogning. Fra den således dannede opløsning kan der efter nogen tid allerede udfældes noget silibinin. Derefter fjernes 0,75-1,25 kg svarende til ca. 0,96-1,58 liter methanol i vakuum, og remanensen henstår i 10-28 dage ved stuetemperatur. Det udfældede 10 silibinin frafiltreres og eftervaskes med to gange 50 ml koldt methanol. Efter tørring ved 40°C i vakuum oprenses det isolerede rå silibinin på følgende måde: 60 g rå silibinin opløses i 3 liter teknisk ethylacetat under opvarmning, hvorpå der tilsættes 20 g aktivt kul, og blandingen omrøres i yder-15 ligere 2 timer under tilbagesvalingsbetingelser. Derefter foretages filtrering til dannelse af et klart filtrat, og opløsningen inddampes ved 50°C under formindsket tryk til et rumfang på ca. 250 ml. Dette koncentrat udrøres i 15 minutter under anvendelse af et Ultra-Turrax-apparatur, og under omrøring 20 tilsættes 25 ml methanol. Derefter henstår blandingen natten over ved stuetemperatur. Inden sugefiltreringen oprøres det udfældede silybin endnu en gang i 5 minutter ligeledes ved hjælp af et Ultra-Turrax-apparatur. Det frasugede bundfald eftervaskes med to gange 50 ml ethylacetat og tørres i et vakuumtørreskab 25 ved 40°c natten over. Derefter formales produktet, hvorefter det eftertørres under samme betingelser i 48 timer.

Opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende eksempler.

DK 164865 B

14

Eksempel 1.

Fremstilling af silibin3-fl~"C~21 ,3—dihydrogensuccinat

O CH„-O-CO-CH„-CH_-COOH

AvV 2 2 2 "wνΑλΛ\ /ocH3 i i i^r VY\ ti

OH 0 O ^K%H

NS^CO-CH2-CH2-COOH

50 g silibinin opløses ved 45°C i 70 ml pyridin, hvorpå der 5 tilsættes 50 g ravsyreanhydrid, og blandingen omrøres i ca.

8 timer ved 45°C, hvorpå der tilsættes 30 ml ethanol, hvorpå blandingen omrøres til dannelse af en homogen blanding. Derpå tilsættes under intensiv omrøring til hydrolyse af phenyl-esteren i løbet af ca. 30 minutter 60 ml vand. Efter ca. 1 10 times omrøring ved 30°C er phenylesteren hydrolyseret kvantitativt. Dette konstateres ved hjælp af HPLC. Hydrolysen afbrydes ved hurtig tilsætning af 1,7 liter ethylacetat til den således fremkomne reaktionsblanding.

Til fraskillelse af overskud af ravsyre og pyridin ekstraheres 15 den med ethylacetat fortyndede reaktionsopløsning med to gange 5 liter vand, som er mættet med ethylacetat, og som har en pH-værdi på 1,85 (indstillet med fortyndet vandig saltsyre), i modstrøm. Ved denne ekstraktionsproces pumpes det med ethylacetat mættede, syrnede vaskevand i kredsløb mod den for-20 tyndede reaktionsopløsning, hvorefter pH-værdien holdes så længe på 1,85 ved tilsætning af fortyndet saltsyre, at denne pH-værdi efter ethylacetatpassagen forbliver konstant.

DK 164865 B

15

Derpå ekstraheres ethylesterfasen til udvaskning af overskud af saltsyre med to gange 3,4 liter vand i modstrøm, hvor vandet er mættet med ethylacetat. Så snart vaskevandets pH-værdi bliver større end 4,5, foretages kvantitativ isolering af den 5 organiske fase, som inddampes ved 40-50°C i vakuum til 1/12 af udgangsrumfanget (ca. 0,2 liter) og fortyndes med 125 ml ethanol-

Den ønskede forbindelse fås ved omfældning fra methanol/vand og tørring ved 50°c i vakuum i løbet af 15 timer. Til frem-10 stilling af en analyseprøve omfældes den ønskede forbindelse tre gange fra ethanol/vand, hvorefter der tørres i 15 timer ved 50°C i vakuum. I FD-massespektrum fremkommer molekyltop-pen ved den forventede molmasse på 682.

IR-spektret viser i området med CO-valensfrekvens to overlap-15 pende bånd, hvor det ene, hvilket også er tilfældet ved sili-binin, skyldes carbonylfunktionen i pyronringen ved bølgelængden 1635 cm Det andet bånd ligger ved 1730 cm ^ og stammer fra de to estercarbonylfunktioner.

^H-NMR-spektret bekræfter, at der er sket en dobbelt forestring. 20 Således udgør det ved integration bestemte forhold mellem aromatiske protoner og methylenprotoner i ravsyregruppen 8:8 (ppm-området 5,9-7,1). Forholdet mellem disse methylenprotoner (ppm 2,6) og methylprotonerne i methoxygruppen (ppm 3,8) udgør 8:3 og stemmer således overens.

13 25 Også den kemiske forskydning ved C-.undersøqelserne viser, at der er sket forestring i to alkoholiske OH-grupper, da de kemiske forskydninger ændrer sig kraftigst ved og de tilliggende carbonatomer C2.2-('14 samt vec^ ^2^4 *

Elementaranalyse for C33H3q016 (682,60)

30 C H O

Beregnet: 58,07 4,43 37,50

Fundet: 58,05 4,57 37,31

DK 164865 B

16

Eksempel 2.

Fremstilling af silibinin-C-21 ,3-dihydrogensuccinat-dinatriumsa.lt „ O CH„-0-C0-CH -CH -CONa A/v2 2 2 HOW°Y^o/^\yiV'OC03 I |14 161 W\ I»1

OH O O

XCO-CH2“CH2-CONa

Til den ifølge eksempel 1 fremstillede ethanolopløsning sættes 5 dråbevis under omrøring og udvendig afkøling ved -5 til 9°C en på grund af en bestemmelse af indholdet af faststof i denne opløsning bestemt mængde 6%'s ethanolisk natriumhydroxidopløsning, hvorefter suspensionen omrøres i yderligere 1 time ved stuetemperatur, det udfældede beige faste stof frafiltre-10 res under sugning, hvorpå det suspenderes to gange i 5-10 minutter pr. gang ved hjælp af et Turrax-apparatur i 150 ml · ethanol og atter suges fra. Til fjernelse af rester af ethyl- . acetat suspenderes produktet derpå i 14 timer ved stuetemperatur i 280 ml ethanol, hvorefter der på ny sugefiltreres, 15 bundfaldet eftervaskes med 70 ml ethanol og tørres i 15 timer ved 40-45°C i vakuumtørreskab. Derpå formales det fortørrede produkt, sigtes til en kornstørrelse på mindre end 0,2 mm og tørres i yderligere 48 timer ved 40-45°C i vakuum. På denne måde fås 52 g af.den ønskede forbindelse (69%’s udbytte).

20 Den ønskede forbindelse har intet skarpt smeltepunkt. Den begynder at sintre ved en temperatur på ca. 80°C og smelter under opblæring ved ca. 100°C.

4 UV-spektrum i methanol: λ = 288 nm, ε = 1,73*10 .

max

Den ønskede forbindelses molvægt er 726,56. Forbindelsen er 25 et let beigefarvet mikrokrystallinsk pulver uden særlig lugt og -

DK 164865 B

17 med saltagtig smag. Det er letopløseligt i vand, tungtopløse-ligt i ethanol og praktisk taget uopløseligt i acetone, ether og chloroform.

Eksempel 3.

5 Fremstilling af lyofilisater til intravenøs indgift.

Silibinin-C-2',3-dihydrogensuccinat-dinatriumsalt 75,0 mg

Mannitol 10,0 mg

Vand til injektionsformål ad 1,5 ml 1,5 ml opløsning fyldes i spidsampuller med en kapacitet på 10 5 ml, hvorpå der frysetørres på kendt måde. Ampullerne med det færdige lyofilisat lukkes på sædvanlig måde med henblik på opbevaring.

Til anvendelse opløses lyofilisatet i 5 ml sterilt, fysiologist natriumchloridopløsning.

Claims (8)

1. Silibininderivater, kendetegnet ved, at de har den almene formel ^γ° YCH2-°-C°-> „-C00«l WvUoV/”3 I I (i) OH 0 ''cO- (Alk„) -COOM. 2 m 2 hvori n og m hver for sig er 0 eller 1, Alk^ og Alk2 hver for 5 sig er en alkylengruppe med 1-4 carbonatomer eller en alkenylen-gruppe med 2-4 carbonatomer, og og M2 hver for sig betyder et hydrogenatom eller et alkalimetalatom.

2. Silibininderivater ifølge krav 1, kendetegnet ved, at n og m hver for sig er 0 eller 1, Alk^ og Alk2 10 hver for sig betyder en alkylengruppe med to carbonatomer, og og M2 hver for sig betyder et alkalimetalatom.

3. Silibininderivater ifølge krav 1, kendetegnet ved, at n og m er ens, Al^ og Alk2 er ens, og Μχ og M2 er ens.

4. Silibininderivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er silibinin-C-2',3-dihydrogensuccinat-dinatrium-salt med formlen . O CH_-0-C0-CHo-CHo-C00Na γγ y 2 2 HO * 0 LI . . OCH- v/y 3 OH 0 \o-CH2-CH2-COONa DK 164865 B 19

5. Fremgangsmåde til fremstilling af silibininderivater ifølge krav 1-4 og med formlen (I), hvori n og m er 1, og og er ens, kendetegnet ved, at man opløser 1 vægtdel silibinin med formlen . Q CH_OH yyy 2 H0 Λ ^ λ I 1 Λ °CH, YY 3 OH 0 (A) silibinin i 1-2 vægtdele pyridin og omsætter under omrøring med 1-3 vægtdele dicarboxylsyreanhydrid med formlen

0. C - Alk - C = O 5 hvori Alk betyder en gruppe Alk1 eller Alk2 som defineret i krav 1, tilsætter ethanol til dannelse af en homogen blanding, hvorpå man under intensiv omrøring langsomt tilsætter vand, hvorved tilstedeværende estere af de aromatisk bundne 0H-grupper hydrolyseres, fortynder med ethylacetat så snart 10 hydrolysen er fuldstændig, vasker med ethylacetatmættet surt vand, inddamper ethylacetatfasen, og eventuelt optager remanensen i ethanol og foretager omdannelse med en alkoholisk alkallmetalhydroxidopløs-ning til alkalimetalsaltet af de frie carboxylsyregrupper.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, 15 at omsætningen med dicarboxylsyreanhydridet gennemføres ved en temperatur på fra ca. 40 til ca. 50°C.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at det ethylacetatmættede sure vaskevand holdes på en pH-værdi på fra ca. 1,5 til ca. 2,4.

8. Farmaceutisk middel, kendetegnet ved, at det indeholder mindst én forbindelse ifølge et af kravene 1-4 og et farmaceutisk bærestof eller hjælpestof.