DK157142B - Fremgangsmaade til dyrkning af en cellekultur i et vaekstmedium, som er i kontakt med en substratoverflade samt genstand til anvendelse derved - Google Patents

Description

i

DK 157142 B

Den foreliggende opfindelse angàr generelt fremgangsmâder og genstande til pàvirkning af cellevækst, især vævskulturvækst. Mere specielt angâr opfindelsen modification af organiske og uorganiske substraters overflader, sâledes at der tilvejebrin-5 ges en kemisk modificeret overflade, som fremmer eller inhibe-rer væksten af forskellige celler i kulturen.

Det pâvises heri, at cellulær funktion pà po1ymeroverf1aderne kan kontrolleres selektivt ved at ændre overfΊadekemien i kon-10 takt med ce 11emembranen.

Det er kendt, at en af faktorerne, der pâvirker væksten af bâde primære cellekulturer og bestàende ce 11e1inieku1turer , er grænsefladen mellem vækstmedierne i hvilke kulturerne dyrkes 15 og substratet, der tilvejebringer grænselaget til vækstmed i er-ne. Det er kendt at modificere den dispergerede fase, dvs. me-diet, i hvilket en cellekultur dyrkes. Det er ogsà kendt at ændre overf1adegrænse1aget mellem mediet og substratet, sæd-vanligvis ved at belægge overfladen med forskellige kemikali-20 er, f.eks. sâsom kollagen. Det er sædvanlig laboratoriepraksis at pàfore forskellige kemikaliebelægninger pâ substratet forud for at forsoge cellekulturdyrkning. Nogle kemikalier, som er blevet anvendt, indbefatter polylysin, kollagen, hyaluronsyre, chondroitin-4-sulfat, chondroitin-6-sulfat og forskellige po-25 1ysaccharider og lecitiner. De mest almindeligt anvendte ke- miske materialer til modificering af substratets overflade til primær cellekulturvækst er kollagen, gélatine og polylysin.

Det er ogsâ kendt kun at anvende plast af vævskulturkvalitet 30 til dyrkning af bestàende vedhængende cellekulturer. F.eks.

markedsfores kommercielt tilgængelige vævskulturprodukter un-der varemærket "FALCON" fra Becton, Dickinson and Company. Selv om kommercielle vævskulturprodukter synes at virke godt for etablerede cellelinier, virker de ikke godt for primære 35 celletyper eller visse celletyper, der kræver ko!lagenbelæg- ning, for eksempel.

Ifolge den foreliggende opfindelse modificeres et substrats n\/prf υβΗ at + β «iihctratot for et rtlacma a-f ot

DK 157142 B

2 egnet materiale. Det er kendt at udsætte substrater for plas-maer af forskellig type til gennemforelse af forskellige mâl.

F.eks. foreslàr en brochure fra International Plasma Corporation, Product Bulletin 24000, at polystyrenvævskulturbakker 5 kan gores modtagelige for fugt og modtagelige for levende cel-ler ved hjælp af plasmabehandling med et oxygen- eller argon-plasma. En brochure fra Tegal Corporation, CP1287, angiver, at plasmaer kan anvendes til tor stripning, rensning og ætsning af elektroniske dele, rensning af optiske overflader, tilbe-10 redning af overflader med bindings-, fugtbarhedsegenskaber og kemisk modstandsevne og tor rensning af substrater for at for-bedre fiImafsættelse og vedhæftning. Lee M. Smith's doktordis-putats "Cell Adhesion As Influenced By Substrate Surface Pro-perties", Department of Material Science and Engineering, the 15 University of Utah, 1978, p. 67, foreslàr, at cellevedhæftning er en funktion af overfladens carbon/oxygenforhold. I EP pa-tentansegning nr. 76562, publiceret 13. april 1983, beskrives . at organiske og uorganiske substraters overflader irreversi-belt modificeres ved podning af specifikke, kemisk funktio-20 nelle stoffer pà substratets overflade ved at bringe overfladen i kontakt med udvalgte komponenter af et plasma af et vaporis-eret materiale. De modificerede overflader har specifikke, .kemisk funktionelle grupper podet pâ overfladen og giver egnet overf1adekemi til anvendelser, sâsom vævskulturprodukter og 25 protein-antistofbinding eller -kobling.

Ingen af disse referencer foreslàr eller belærer imidlertid om, at cellevækst kan pàvirkes ved kemisk modifikation af overfladen af substratet, pâ hvilket cellen dyrkes.

30

Det ville være onskeligt at ti1vejebringe kemisk specifikke substratoverf1ader til væksten af udvalgte cellekulturer uden nedvendigheden af at belaegge substratet med kemiske materia-ler, der er egnede til f.eks. at forage væksten af primære 35 celletyper.

Pâ grund af den hoje væksthastighed, der sædvanligvis udvises af fibroblaster i kultur, er det undertiden vanskeligt at

DK 157142 B

3 dyrke primære celler i kultur pâ grund af den hastigere konta-minerende vækst af fibroblaster. Det ville være onskeligt at ti1vejebringe specifikke substratovenf1ader, som er egnede til vækst af cellekulturer, medens de inhiberer væksten af fibro-5 blaster.

Det er derfor et hovedformâl ifolge den foreliggende opfindel-se at tilvejebringe kemisk specifikke overflader til pàvirk-ning af væksten af forskellige cellekulturer ved grænsefladen 10 mellem vækstmediet og substratet.

Et andet formâl ifolge den foreliggende opfindelse er at til-vejebringe et substrat med en kemisk modificeret overf1ade, som pàvirker væksten af cellekulturer pâ overfladen.

15

Et yderligere formâl ifolge den foreliggende opfindelse er at tiIvejebringe et substrat med en kemisk modificeret overflade, som ikke kræver belægning med kemiske forbindelser forud for ce!1ekulturvækst pâ substratoverf1aden.

20

Et yderligere formâl ifolge den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en fremgangsmâde og en genstand til pâvirkning af væksten af cellekulturer.

25 Der anvises ifolge den foreliggende opfindelse en fremgangsmâde til dyrkning af en cellekultur i et vækstmedium, som er i kontakt med en substratoverf1ade, hvilken fremgangsmâde er ejendommelig ved, at substratets overfladekemi modificeres for anvendelse til ce 11ekulturvækst ved at udsætte nævnte sub-30 stratover f 1 ade for et plasma, som er fremstillet ud fra et plasmamateriale, som omfatter carbondioxid, svovldioxid eller ammoniak/carbondioxidblandinger.

Endvidere ti1vejebringes ifolge den foreliggende opfindelse en 35 genstand til brug ved fremgangsmâden ifolge krav 1, hvilken genstand er ejendommelig ved, at den omfatter en polymer genstand, hvis overf1adekemi er blevet modificeret ved at udsætte overfladen for et plasma, som er fremstillet ud fra et plasma- materiale, sont er carbondioxid, svovldioxid eller en aromoniak/ carbondioxidblanding.

Ul\ 10/ I *4- Z D 4

Endvidere ti1vejebringes ifelge den foreliggende opfindelse en 5 genstand til brug ved fremgangsmâden ifolge krav 1, og som er ejendommelig ved det i krav 8's kendetegnende de! angîvne.

Oet har generelt vist sig, at cel1eku1turaktivitet pâ overfla-den af et substrat kan kontrolleres ved at variere overflade-10 kemien af en substratoverf1ade i kontakt med cel1emembranen. Overfladekemien af en polymer overflade kan varieres ved at anvende udvalgte homopolymere, copolymérisation, overf1adepod-ning og kemisk modifikation og ved plasmabehandling af over-fladen. Plasmamodificeringsprocesser kan særligt anvendes til 15 at ti1vejebringe specifikke kemisk funktionelle grupper, ele-mentarforhold og andre overf1adeegenskaber. Ifolge opfindelsen blev polymère overflader fremstillet ved plasmamodificerings-teknikker, som ti1vejebragte en række overfladekemier og egen-skaber. De modificerede polymère overflader blev udsat for 20 ce 11ekulturforseg, som angiver, at cellular respons er stærkt afhængig af overf1adekemi.

Et plasma af et egnet materiale, som omfatter carbondioxid, svovldioxid eller ammoniak/carbondioxidblandinger, kan anven-25 des til at modificere overf1ade1aget af organiske og uorga-niske substrater, indbefattende polymère materialer, glas og metaller, uafhangig af tykkelsen og som er uafhængig af sub-stratsammensatningen, til tiIvejebringelse af specifikke kemisk funktionelle grupper pâ overfladen af substratet. I t i 1 -30 fældet med glas og metaller er det onskeligt at indbefatte en carbonkilde, f.eks. methan, for at ti1vejebringe et tyndt or-ganisk lag pâ det uorganiske substrat. En sâdan plasmaproces er egnet til at ti1vejebringe en overflade til en hvilken som helst cellulær vækstanvendelse, hvadenten det onskede màl er 35 at foroge eller forsinke cellevækst. Substratets overflade er irreversibelt modificeret ved at pode specifikke kemisk funktionelle grupper pâ overfladen med et plasma af et egnet materiale eller med udvalgte komponenter af et plasma af et egnet

DK 157142 B

5 materiale. Plasmamaterialet omfatter carbondioxid, svovld ioxid eller ammoniak/carbondioxidblandinger og kan yderligere om-fatte oxygen, carbon, hydrogen, nitrogen, halogen, svovl, phosphor, blandinger deraf og forbindelser deraf. Overflader-5 ne, som er modificeret ifolge den foreliggende opfindelse, har specifikke kemisk funktionelle grupper podet pâ substratover-fladen og ti1vejebringer egnede overf1adekemier til vævskul-turvækst eller undertrykkelse af vækst.

10 I en anden udforelsesform tilvejebringes en fremgangsmâde til at modificere overfladen af et substrat, specielt modificering af organiske polymère materialer, ved behandling med specifik-ke, kemiske stoffer omfattende*.

15 Ti1vejebringelse af et substrat med en reaktionszone.

TiIvejebringelse af et egnet materiale i reaktionszonen, som indbefatter carbondioxid, svovldioxid eller ammoniak/carbondi-oxidblandinger og dannelse af et plasma, som indbefatter neu-20 trait materiale, positive ioner af materialet, négative ioner af materialet, elektroner og photoner.

At forhindre mindst én af plasmaets komponenter i at blive bragt i kontakt med substratets overflade i reaktionszonen.

25

At bringe substratets overflade i kontakt med resten af plasmaets komponenter i reaktionszonen, og derved dannelse af specifikke funktionelle grupper af materialet pâ 30 overfladen af substratet.

Denne udforelsesform for den foreliggende opfindelse er base-ret pà opdagelsen af, at anvendelse af udvalgte reaktive plas-maarter i kontakt med et substrat kan anvendes til at tilveje-35 bringe specifikke kemisk funktionelle grupper pâ substratets overflade, hvis virkning er at pâvirke cellekulturvæksten.

Der henvises til den efterfolgende tegning, hvor

DK 157142 B

6 fig. 1 er et skematisk diagram af et apparat, som kan anvendes til udovelse af opfindelsen, fig. 2 er en proveholder, der er illustreret i apparate* i 5 fig. 1, set i perspektiv, fig. 3 til 7 er rentgenstrâlefotoelektronspektroskopi, ESCA, undersegelser af forskellige substrater, blandt hvilke nogle er blevet behandlet ifolge opfindelsen, 10 fig. 8 er en afbildning af primære nervecellers vækstkarakte-ristika som en funktion af overfladekemien og tiden, og fig. 9 er en afbildning af primære fibroblasters vækstkarakte-15 ristika som en funktion af overf1adekemien og tiden.

Som vist i fig. 1 tiIvejebringes et forste gasreservoir 11, et andet gasreservoir 13 med et ledningssystem 15 til enten at levere enkeltvis eller bâde en forste gas og en anden gas til 20 et vakuumkammer 17. Flowmetre 19 og 21 er anbragt til màling af gasgennemstromningshastigheden og et vakuummâ1einstrument 23 er anbragt for at kontrollere trykket i vakuumkammeret 17. Ventiler 25, 27 og 29 er anbragt for at regulere gassens stromningshastighed i det forste gasreservoir 11, det andet 25 gasreservoir 13 og gassen, der strommer ind i vakuumkammeret 17. Forud for brug evakueres vakuumkammeret 17 ved at âbne ventilen 31 til vakuumpumpen 33. Egnede elektroder 35 og 37 er forbundet til en egnet stromkilde 39. Reaktorsystemet indbe-fatter ogsà en fælde 41, en ud1uftningskana1 43 og dens ventil 30 45.

Som det bedst fremgâr af fig. 2, placeres et stof 47, der skal behandles ifolge opfindelsen, i en proveholder 55, og anbring-es i vakuumkammeret 17 (fig. 1). Proveholderen indbefatter en 35 gittersamling pâ tre gitre, betegnet gitter 1, gitter 2 og gitter 3. En kollektor 49, som kan være elektrisk ladet, er anbragt pâ den modsatte side af proven fra gittersystemet. Proven holdes pâ plads mellem gitteret 3 og kollektoren ved hjælp af en egnet holder 51.

DK 157142 B

7

Under brug kan et hvilket som helst eller ingen af de tre gi-tre eller kollektoren være forsynet med en positiv eller nega-t i v ladning for at frastode selektive komponenter af et plasma, der er fremkommet mellem elektroderne 35 og 37. Substratet 5 i proveholderen udsættes derpâ for en omsætning med de plasma-komponenter, som ikke er frastodt.

Den foreliggende opfindelse kan benyttes til at ændre overfla-derne af faste polymère materialer, indbefattende naturlige og 10 syntetiske additions- og kondensationspolymerer. Sâdajme polymère materialer indbefatter polyolefiner, sâsom polyethylen, polypropylen, polyisobutylen og ethylen-a-olefincopolymerer, acrylpolymerer og -copolymerer, sâsom polyacrylat, polyethy1 -methacrylat, polyethylacrylat; vinylhalogenidpolymerer og -co-15 polymerer, sâsom polyvinylchlorid; polyvinylethere, sâsom po-1yviny1methy1ether; polyvinylidenhalogenider, sâsom polyviny-lidenfluorid og polyvinylidenchlorid; polyacrylonitri1er, polyvinyl ketoner ; polyvinylamider; aromatiske polyvinylforbin-delser, sâsom polystyren, polyvinylestere, sâsom polyvinylace-20 tat; copolymerer af vinylmonomerer med hinanden og olefiner, sâsom ethy1en-methy1methacry1atcopolymerer, acrylonitrilsty-rencopo1ymerer, ABS-harpikser og ethy1envinylacetatcopo1ymerer; naturlige og syntetiske gummier, indbefattende butadien-styrencopolymerer, polyisopren, syntetisk polyisopren, polybu-25 tadien, butadien-acrylonitriIcopolymerer, polychloroprengummi-er, polyisobutylengummi, ethylen-propy1engummi, ethy1en-propy-len-diengummier, isobutylen-isoprencopolymerer og polyurethan-gummier; polyamider, sâsom Nylon 66 og polycaprolactam; poly-estere, sâsom polyethylenterephthalat, alkydharpikser; phénol-30 forma 1dehydharpikser; urinstof-formaldehydharpikser, melamin-formaldehydharpikser; polycarbonater; polyoxymethylener; poly-imider; polyethere; epoxyharpikser, polyurethaner; uld; bo-muld; silke; rayon; rayon-triacetat; cellulose; cel1uloseace-tat; ce!lulosebutyrat; celluloseacetatbutyrat; cellophan; cel-35 lulosenitrat; cellulosepropionat; cel1uloseethere og carboxy-methylcellulose.

Uorganiske materialer, hvis overflader kan modificeres ifolge oof indplsen . îndhpfatter ildfp-met-al 1er. sâsom «refit· matai-

DK 157142 B

8 1er, sàsom jern, aluminium, tin, kobber og nikkel; métal- og andre naturlige oxider; sàsom magnesiumoxid, silika, alumini-umoxid og titaniumoxid; mineraler, sàsom 1er, pyrit og asbest; sa!te, sàsom natri urneh 1 orid og cal ci umcarbonat; og sàdanne 5 syntetiske sammensætninger som glas og ildfaste materialer.

Hvadenten stofferne er organiske eller uorganiske, kan de an-tage en hvilken som helst form, sàsom kontinuerlig eller par-tikulær form, poros eller tæt, og stor eller lille. Opfindel-10 sen kan anvendes til ændring af overfladerne af krystaller, pulvere, plader, bând, film, ark, tràde, fibre, tekstiler, fi-lamenter, rorsystemer og afstobninger, ekstruderede eller sam-menpressede genstande og lignende.

15 Plasmaer af carbondioxid, svovldioxid og ammoniak/carbondioxid anvendes ifolge den foreliggende fremgangsmâde. Andre plasma-materialer kan indbefattes og sâledes mere generelt plasmaer med bestanddele af carbon, hydrogen, oxygen, m’trogen, svovl, phosphor, halogener, blandinger deeraf og forbindelser deraf 20 nyttige til at modificere overfladen af substrater.

F ire plasmatyper kan frembringes; disse er termiske plasmaer, udladningsplasmaer, strâleplasmaer (sàsom ionstrâler og el-ek-tronstràler) og hybridplasmaer, sàsom koronaudladninger. Egne-25 de plasmaer til brug ved fremgangsmâden ifolge den foreliggende opfindelse er udladningsplasmaer, strâleplasmaer og hybridplasmaer. Egnede plasmaer kan frembringes ved anvendelsen af jævnstromskiIder eller vekselstromskiIder med en frekvens i mikrobolgeomrâdet ved effektniveauer fra ca. 1,0 W til ca, 10 30 kW. Selv om ikke begrænset til hojfrekvenskiIder, sàsom radio-frekvens (r.f.) kilder, er plamaer af denne type særligt nyttige til fremgangsmâden og genstandene ifolge den foreliggende opfindelse, ved at udvalgte plasmaartskoncentrationer kan re-guleres ved hjælp af kildens frekvens, effekt og systemets 35 tryk. Det er ogsâ rigtigt, at r.f. plasmaer er egnede til ens-artet at modificere overfladen af mere komplekse former af genstanden, sàsom rundvævet stof og andre indhy1dninger, for hvilke jævnstrom og plasmaer der er frembragt ved lav frekvens ikke er ti1fredssti11ende.

DK 157142 B

9 Sædvan1igvi s frembringes r. f. plasmaerne, der er egnede til brug i den foreliggende opfindelse, ved en frekvens pâ ca. 1,0 til ca. 300 MHz ved en effekt til at initiere nedbrydning, sâ-som fra ca. 5 til ca. 1000 watt ved tryk i intervallet fra 5 0,001 til 10 mm Hg. Genstandene udsættes sædvanligvis for r.f.

plasmaet i en période fra ca. 0,1 sek. til ca. 120 min., selv om længere og kortere perioder kan anvendes. P1asmabehand1i n-gen kan efterfolges af en behand1ingscyk1 us, beregnet pâ at ti1vejebringe en egnet atmosfære til reaktion med resterende 10 aktive polymerarter ved eller nær overfladen med tryk i intervallet fra 1 mm Hg til 760 mm Hg i tidsperioder pâ 1 sek. til 4 timer. r.f. plasmaet kan frembringes mellem to flade plader, som vist i fig. 1, eller kan frembringes med en spiralring, soin beskrevet i US patentskrift nr. 4.188.426.

15 I de folgende eksempler udsættes et polystyrensubstrat for forskellige plasmaformer. Substratet undersoges derpâ ved rontgenstrâlefotoelektronspektroskopi (ESCA) for at bestemme naturen af de kemisk funktionelle grupper pâ overfladen af po-20 1ystyrensubstratet.

Efter at hâve været udsat for plasmaet fra de folgende eksempler, mâles substraterne med henblik pâ Zeta-potentia 1e og Wî1 -helmy Plate Contact Angle. Disse værdier er anfort i tabel 1.

25 Disse mâlinger af overf1adeladnings- og overf1adespændingska-rakteristika illustrerer det brede interval af overf1adekemi-er, som er gennemfort. Effektiviteten af kulturvækstbelægnin~ gen bestemmes ved at pode petri-skâle med en fortyndet celle-suspension indeholdende ca. 30 humane diploide (MRC5) celler 30 per ml i vækstmediet.

Ce 11eku1turene blev dyrket, indtil kolonierne là i storrelse fra 100 til 300 celler. Gennemsnitsanta11 et af kolonier for hver provegruppe af skâle blev mâlt. Belægningseffektiviteten 35 er defineret som forholdet mellem antallet af kolonier per skâl og antallet af indpodede celler og udtrykkes i procent.

Den relative belægningseffektivitet bestemmes ved forholdet mellem provens belægningseffektivitet og effektiviteten af den

DK 157142 B

10 samme preve dyrket pà en petriskâl identificeret ved varemær-ket "FALCON”, opnàet fra Becton, Dickinson and Company.

Det er klart fra tabel 1, at den cellulære respons af fibro-5 blaster i hoj grad er afhængig af overfladekemien, der er frembragt ved plasmamodificeringsprocesserne. De folgende ek-sempler viser, at fibroblastvækst kan kontrolleres ved at va-riere overfladekemien i kontakt med cellemembranen.

10 Virkningen af specifikke overfladekemier pâ væksten af MRC5-fibroblaster, som màlt ved relativ belægningseffektivitet, blev vist med overflader dækkende en række carbon-, oxygen-, nitrogen- og svovlbindinger.

15 Tabel 1.

Plasma Zêta poten- Wilhelmy Relativ belægnings-

Forstadium/ tiale zêta belægning effektivitet behandlingsgas (mV) 8a (ligevægt) MRC5 fibroblaster 20 "Falcon" -11,8 6±3 100 CO2&NH3/NH3 - 4,1 9±1 64,8 NH3/CO2 +31,3 64 ±3 31,3 S02/luft -19,4 72±3 43 S02/S02 -14,8 77 il 0 25 C02/luft 50,6

Ubehandlet PS - 9,7 101±1 6

Glas_0_4313_2_

Eksempel 1. C02/luft.

30

Petriskâlene blev anbragt i plasmakammeret og evakueret t i 1 75μ i lobet af en période pà 10 min. og derpà fyldt med C02 til et tryk pâ 180μ i 2 min. Et r.f. plasma blev fremstillet i 5 min. med en frekvens pâ 11 MHz ved en effekt pà 40 watt. Ef-35 ter behandling blev systemet ojeblikkeligt âbnet til det fri.

Belægningseffektiviteten er anfort i tabel 1. *

DK 157142 B

11

Eksempel 2. CO2 & NH3/NH3.

Petriskâlene blev anbragt i plasmakammeret og evakueret til 75μ over en période pâ 10 min. NH3 og CO2 blev fort ind i sy-5 stemet til 90μ. Et r.f. plasma ved 11 MHz og 10 watt blev frembragt af 5 min. varighed. Kammeret blev derpâ bragt op til 700 mm Hg med NH3 til en 2 timers behandling. Overf1adeegen-skaberne og belægningseffektiviteterne er anfert i tabel 1.

10 Eksempel 3. NH3/CO2.

Petriskâlene blev anbragt i plasmakammeret og evakueret til 75μ i 10 min. og fyldt med 180μ NH3 i 2 min. Et 10 MHz 35 watt r.f. plasma virkede i 5 min. Systemet blev derpâ bragt op pâ 15 700 mm Hg med CO2 til en 2 timers behandling. Derpâ blev kam meret pumpet ned til 1 Torr og âbnet til det fri. Overflade-egenskaber og belægningseffektivitet er anfort i tabel 1. ESCA-data er angivet i fig. 3.

20 Eksempel 4. S02/luft.

Et plasmakammer indeholdende polystyrenpetriskâle blev evakueret til 50μ i 20 min., og derpâ fyldt til 200μ af SO2 i 10 min. Et 10 MHz 34 watt r.f. plasma virkede i 5 min. Systemet 25 blev efterladt ved 200μ i 2 min. og derpâ pumpet ned til 50μ i 2 min. efterfulgt af en àbning til det fri. Overf1adeegenska-ber og effektivitet er anfort i tabel 1. ESCA-data er angivet i fig. 4. Det er klart ud fra dette eksempel, at fibroblast-vækst forsinkes af.svovlholdige grupper pâ overfladen.

30

Eksempel 5. SO2/SO2.

Petriskâlene blev anbragt i p1asmakammeret og evakueret til 50μ i 20 min. SO2 blev blæst ind til 200μ i 10 min. Et 10 MHz 45 35 watt r.f. plasma virkede i 5 min. Derpâ blev systemet ojeblik-keligt fyldt med SO2 til et tryk pâ 700 mm Hg til en 2 timers behandling. Systemet blev udpumpet til 50μ og derpâ âbnet til fri luft. Som illustreret i tabel 1 var belægningseffektivite-

DK 157142 B

12 ten ubetydelig for fibrob1 aster pâ denne overflade. Dette til-vejebringer en enestâende oveflade ved, at det sænker eller blokerer fibroblastvækst i kulturen. Dette er særligt nyttigt i prîmære kulturer, hvor fibroblastvækst kan forstyrre beva-5 relsen af primærceller i kulturen. Overf1adekemien, som màlt ved ESCA, er vist i fig. 5.

Eksempel 6.

10 Polylysin- og kollagenbelagte petriskâle anvendes i vid ud-strækning til primære ce!lekulturer. I dette eksempel anvendt-es en plasmamodificeringsproces til opnàelse af nitrogenhol-dige overflader. Denne type overflade er beskrevet ved NH3/CO2 som fremstillet i eksempel 3.

15 ESCA-analyse af NH3/C02-overf1aden gav 0/C = 0,14 og N/C = 0,19. ESCA-undersoge1serne af denne prove er vist i fig. 6 og 7 .

20 Responsen af primære neuronale celler i kultur til den plasma-behandlede overflade i henseende til polylysin- og kollagen/-polylysinbelagte kontroloverflader viser en enestâendehed med hensyn til vækstkarakteristika. Cholinacety1transferase, CAT er en specifik biokemisk mark0r, der er tegn pâ foretrukken 25 neuronal celles tôtte. Som illustreret i fig. 8, understetter den plasmamodificerede nitrogenholdige overflade syntese af primære neuroner i et meget sterre omfang end en hvilken som helst af de kemisk belagte overflader.

30 Eksempel 7.

Belægningseffektivitetstestresultater med MRC5 fibroblastcel-lelinier resulterede i en signifikant reduktion af væksten pâ de to overflader S02/luft og SO2/SO2 plasma behandlet som bes-35 krevet i henholdsvis eksempel 4 og 5.

Rigeligheden af primære fibroblaster i neuronalcellekulturer kan mâles ved LDH-indhold. Lactatdehydrogenase, LDH, er en

Claims (8)

1. Fremgangsmâde til dyrkning af en cellekultur i et vækstme- dium, som er i kontakt med en substratoverflade, kende-t e g n e t ved, at substratets overfladekemi modificeres for anvendelse til cellekulturvækst ved at udsætte nævnte substratoverf lade for et plasma, som er fremstillet ud fra et 15 plasmamateriale, som omfatter carbondioxid, svovldioxid eller ammon i ak/carbondioxidblandinger.

2. Fremgangsmâde ifolge krav 1, kendetegnet ved, at plasmaet er et udladningsplasma, som er frembragt ved en 20 frekvens fra 1 til 300 MHz ved en effekt fra 5 til 1000 watt ved et tryk fra 0,001 til 10 mm Hg (0,133 til 1330 Pascal).

3. Fremgangsmâde ifolge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at plasmamaterialet er ammoniak/carbondioxidblandinger. 25

4. Fremgangsmâde ifolge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at plasmamaterialet er carbondioxid.

5. Fremgangsmâde ifolge krav 1 eller 2, kendetegnet 30 ved, at plasmamaterialet er svovldioxid.

6. Fremgangsmâde ifolge et hvilket som helst af de foregàende krav, kendetegnet ved, at den omfatter, at man: 35 a) anbringer substratet inde i en reaktionszone, b) indforer et materiale i nævnte reaktionszone, hvilket mate-riale omfatter carbondioxid, svovldioxid eller ammoniak/carbondioxidblandinger , DK 157142 B c) udsætter materialet for plasmafrembringende bet i nge1ser, hvorved plasmaet omfatter neutralt materiale, positive ioner af materialet, négative ioner af materialet, elektroner og photoner, 5 d) forhindrer i det mindste én af komponenterne af plasmaet i at komme i kontakt med substratets overflade, e) bringer substratets overflade i kontakt med de resterende komponenter af plasmaet, hvorved der dannes specifikke funk-tionelle grupper af materialet pâ overfladen af substratet. 10

7. Genstand til brug ved fremgangsmâden ifolge krav 1, kendetegnet ved, at den omfatter en polymer genstand, hvis overfladekemi er blevet modificeret ved at udsætte overfladen for et plasma, som er fremstillet ud fra et plasma- 15 materiale, som er carbondioxid, svovldioxid eller en ammoniak/ carbondi oxi dblandi ng.

8. Genstand til brug ved fremgangsmâden ifolge krav 1, kendetegnet ved, at den omfatter en uorganisk gen- 20 stand, hvis overf1adekemi er blevet modificeret ved hjælp af et plasmamateriale, som er carbondioxid, svovldioxid eller en ammoni ak/carbond ioxidblanding. 25 30 35