DK150203B - Fremgangsmaade til fremstilling af alfa-anomere af anthracyclinglycosider eller hydrochlorider deraf - Google Patents

Description

150203

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af de i krav 1's indledning omhandlede hidtil ukendte anthracyclinglycosider eller hydrochlorider deraf. Den angiver en ny fremgangsmåde til fremstilling af de nye anthracycli-nonglycosider: 3''-epi-6'-hydroxydaunomycin; 3',^'-epi-6'-hydroxyadriamycin; 3',4'-epidaunomycin; 3',V-epi-adriamycin; ^-demethoxy-M'-epi-daunomycin eller il-demethoxy-JP-epi-adriamycin eller hydrochlorider deraf. De ifølge opfindelsen fremstillede nye forbindelser er nyttige ved behandling af visse tumorer hos dyr.

150203 2

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, som er ejendommelig ved det i krav 1.'s kendetegnende del anførte, er baseret på kondensation af en tetracy-- klisk aglycon, som har et hydroxy-anthraquinon kromophort system med struktu rend) :

O OH

II 1 C0CH3 C ^ °h (i) R O OH H !

OH

hvor R er methoxy (d.v.s. daunomycinon) eller hydrogen (d.v.s. 4-demethoxydau-nomycinon), med beskyttede 1-halogenderivater af 3,4-epi-6-hydroxy-daunosamin, 3,4-epi-daunosamin eller 4-epi-daunosamin i et inert organisk opløsningsmiddel i tilstedeværelse af en opløselig sølvsaltkatalysator og en molekylsigte som dehydreringsmiddel, og at de beskyttende grupper fjernes fra de dannede glycosider ved svag alkalisk hydrolyse med 0,1 N natriumhydroxid, og de opnåede daunomy-cinderivater isoleres som hydrochlorider, eller på i og for sig kendt måde bromeres i 14-stillingen, omsættes med natriumformiat og hydrolyseres, hvorefter de dannede adriamycinderivater isoleres som hydrochlorider. Som sølvsaltkatalysator foretrækkes sølvtrifluormethansulfonat (AgSO^CF^), og som inert organisk opløsningsmiddel foretrækkes chloroform eller dichlormethan. Opløseligheden af sølvsaltet i de organiske opløsningsmidler muliggør, at kondensationen finder sted i en homogen fase, hvorved de velkendte komplikationer ved Koenigs-Knorr-reaktionen i tilstedeværelse af uopløselige sølv- eller kviksølvforbindelser undgås. (Gunther Wulff cg Gerhard Rohle. Ang. Chem. Int. Ed. jyj, 157 (1974)). Reaktionen gennemføres på kort tid (sædvanligvis en til otte timer), og de beskyttede glycosider dannes med stort udbytte. Endvidere er det meget vigtigt og overraskende, at reaktionen er stereospecifik: der dannes kun eC-anomere.

Det reaktive beskyttede derivat af aminodeoxysukkeret, som kondenseres med aglycdnen med strukturen I (R = methoxy) under dannelse af det beskyttede glycosid med strukturen II: 3 150203

O OH

II I COCHt

I [I ''OH

vvvy

och3 o oh n I

«I

Ι/^Λ0\ \NH-C0Cfc/

RllRl= -0-CO^ N02

II

er det nye mellemprodukt 2,3-dideoxy-4j 6-di-0-p-nitrobenzoyl-3-N-trifluor-acetyl- <*· -L-ribohexopyranosylchlorid III s *> /f—<\ a )/1^ \i „_, \!»-Μν R.-R,·

III

som afledes af 3-amino-2,3-dideo3y-L-ribohexose (3>4-epi-6-hydroxydaunos-amin) 17 :

HO yl-O

\Ahzoh \

\ϊ_κ0H

17 som tidligere var ukendt i L-serien.

Fra det beskyttede glycosid II dannes, efter at de beskyttende grupper er fjernet med base, slutproduktet 7 : 4 150203 o oh A 1 λ XOCHa OCHj 0 OH H ' oH i tÆT°\ v / 7

Dette er 3»,4*-epi-6«-hydroxydaunomyein, som isoleres aom hydrochlorid. Den følgende behandling af forbindelsen V ifølge metoden, som er beskrevet i US patentskrift nr. 3 803 124, giver forbindelsen VI:

0 OH

COCHjOH

CXXQ''*

T II I

0CHs 0 OH | OH _ 0 (/GT\ \s__z

VI

som er 3'^'-epi-b'-hydroxyadriamycin, der også isoleres som hydrochlorid.

Det ovennævnte US patentskrift angiver en ubesværet vej for kemisk omdannelse af daunomycin-derivater til adriamycin-derivater. Et danunomycin-derivat giver et 14-bromderivat, når det reagerer med en opløsning af brom i chloroform i tilstedeværelse af ethylorthoformiat. 14-brom-derivatet bringes dernæst til reaktion med natriumformiat og hydrolyseres i nærværelse af vandig hydrogen-bromid ved stuetemperatur for at give adriamycin-derivatet.

5 150203

Det beskyttede derivat af aminodeoxysukkeret, som kondenseres med aglyconen med strukturen I (R = methoxy) under dannelse af det beskyttede glycosid med strukturen VII:

O OH

i i r NMH-COCfV/ Rt* -0-00-<ζ \~N02

VII

er det nye mellemprodukt 2,3,6-trideoxy-3-N-trifluoracetyl-4-0-p-nitroben-zoyl- ot. —L—ribohexo—pyrano sy lchlorid VIII :

Ri Cl Æ °\^ , //—v_ < / Rf-O-CO-T y-HOt \nh-cocf3// \-/

VIII

som dannes af 3-amino-2,3,6-trideoxy-L-ribohexose IX {

HO

/oMi °\ K >h,oh \N* / ix som tidligere ligeledes var ukendt i L-serien.

Pra de besluttede glycosider VII dannes, efter at de beskyttende grupper er fjernet, slutproduktet X s 6 150203

O OH

^ 1 λ .. ,COGH,

I I ''GH

VSrVV

OCHj O OH i

O

OH __ /1-o.

/*«3 \ \N%_/

X

som er 3«,4»-epi-<iaunomycin, der isoleres som hydrochloride

Den efterfølgende behandling af forbindelsen X ifølge metoden, som er beskrevet i US patentskrift nr. 3 803, 124 giver forbindelsen XI:

O OH

QJL vL COCHiOH

Yiyi OCHj O OH I i

O

OH __0 γ^Γ \ \ϊϋ_/ xi som er 3’,4,-epi-adriamycin, der også isoleres som hydrochlorid.

uår kondensationen gennemføres ved reaktion mellem en aglycon med strukturen I ( E = hydrogen) og et egnet beskyttet derivat af 4-epi-daunosamin, d.v.s. 1-chlor-H,O-di-trifluoracetyl-4-epi-daunoeamin ( dette mellemprodukt er omhandlet i beskrivelsen til belgisk patent.nr. 826.848), dannes det beskyttede glycosid med strukturen XII: 7.

150203

0 OH

r^^kAv^r/cocH>

I I T j ''OH

Ϊ l «'1

J

CFj-C.0 Λ ° J! yl- 0 /CHj \ \—/ NH-CocFj

XII

hvorfra, efter at de beskyttende grupper er fjernet først med methanol, hvorved ϊ-trifluoraoetylderivatet dannes, og derefter med fortyndet NaOH, slutproduktet 4-demetho2y-4'-epi-daunomycin XIII isoleres som hydroohlorid : ii r

1 J-OH

O OHH ' i i

O

OH__ (/¾ \

NHZ

XIII

Af forbindelsen XIII dannes, idet fremgangsmaden som beskrevet i USpatentskrift nr. 3 803 124 følges, 4-demethoxy-4'-epi-adriamycin XIV som hydroohlorid: 8 150203

0 OM

/\ΛΑ/X/COOkOH ό oh H ; i i i 0 OH _Λ 1/¾¾ \ \_/ ! NHt

XIV

Mellemproduktet 2,3-di-deoxy-4,6-di-0-p-nitrobenzoyl-3-N-trifluoracetyl-<X-L-ribohexo-pyranosyl-chlorid III, som anvendes til fremstilling af forbindelsen II dannes ud fra raethyl-4,6-0-benzyliden-2-deoxy-od-L-erythro-hexopyranosid-3-ulose XV (E.H. Williams et al., Canad. J. Chem. 47, 4467 (1969)).

Ph

CH

° Vi-‘0 OMe j/oOk \| / ^

XV

Denne forbindelse er blevet omdannet til methyl-2,3-dideoxy-3-N-trifluor ace-tyi-oi-L-ribohexopyranosid XVI: HO _Λ OMe

l/taofT \J

\NHC0CF3 /

XVI

idet fremgangsmaden som er tilgængelig i litteraturen for D-isomeren følges ( P.J. Beynon et.al., J. Chem. Soc.(C), 272 (1969))·

Forbindelsen XVI omsættes derefter med p-nitrobenzoylchlorid i tør pyridin og derefter med tør hydrogenchlorid ved 0°C, hvorved der dannes 2,3-di-deoxy- 4,6-di-0-p-nitrobenzoyl-3-N-trifluoracetyl-ød-L-ribohexopyranose XVII : 9 150203 -o \/cM1nx \

\ >H,oH

\T!V

Rt=Rx* -O-CCK^ Vnox

XVII

Ved gentagen omsætning af forbindelsen XVII med p~nitrobenzoylchlorid i ten pyridin isoleres dens 1,4» 6-tri-0-p-nitrobenzoat, hvorfra der, efter behandling i 1 time med tør hydrogenohlorid ved 0°C i methylenchlorid, dannes den ønskede nye forbindelse III.

Fremstillingen af det andet nye mellemprodukt 2,3,6-trideoxy-3-IT-trifluor-acetyl-4-0-p-nitrobenzoyl-oc-L-ribohexo-pyranosylchlorid VIII sker udfra forbindelsen XVI ifølge fremgangsmåden som er beskrevet af S. Hanessian et. al. ( Carb. Res. 2£, 45 (1972)) for syntesen af 6-deoxysukker. Ved omsætning af forbindelsen XVI med N-bromsuooinimid og triphenylphosphin i vandfrit dimethylformamid dannes dens 6-bromderivat, hvorfra der ved katalytisk reduktion i tilstedeværelse af Pd/C 20fo og BaCO^ isoleres methy 1-2,3,6-trideoxy-3-trifluoracetamido- «· -L-ribohexopyranosid XVIII s HO _0 OM t

\J

\nHCOCF3 /

XVIII

Omsætningen af forbindelsen XVIII med p-nitrobenzoylchlorid i tør pyridin giver dens 4-0-p-nitrobenzoyIderivat, hvorfra der efter behandling med tør hydrogen-chlorid dannes 2,3,6-trideo3gr-3-N-triflUoracetyl-4-0-p-nitrobenzoyl-«<-L-ribo- hexopyranose XIX :

Rl/>-°v /CH3 \ < >h,oh \mh-coc^/

Rj= -0-C0-<^ ^>-N0t

XIX

Ved gentagen omsætning af forbindelsen XIX med p-nitrob'enzoylchlorid i tør pyridin isoleres dens 1,4-di-p-nitrobenzoylderivat, hvorfra der efter behandling med tør hydrogenohlorid i dichlormethan ved 0°C dannes den ønskede forbindelse VIII.

150203 ίο

Fremstilling af mellemproduktet 2,3-dideoxy-4, 6-di-0-p-nitrobenzoyl-3-N-trifluoracetyl- tc -L-ribohexopyranosylchlorid III.

En opløsning af hydroxylamin i methanol blev fremstillet ved behandling af hydroxylaminhydrochlorid (8,35 g, 0,12 mol) med natriumhydroxid (4,92 g, 0,12 mol) i methanol (215 ml) og frafiltrering af det dannede natriumchlorid.

4.6.0- henzyliden-2-deoxy-ø£.-L-erythro-hexopyranosid-3-ulose (XV) ( E.H.

Williams et. al. Canad. J. Chem. I969, 4£, 4467) (5,35 g) blev sat til denne friskfremstillede opløsning. Efter 15 timer ved stuetemperatur blev methyl-4, 6,0-benzyliden-2-deoxy-o6-L-erythro-hexo-pyranosid-3-uloseoxim (5,25 g, 93fo) filtreret fra og tørret : smp. 211-213° ; -201,6° ( c * 0,5 i CHCl^); m/e 247 ( M+ -32). PMR spektret er i overensstemmelse med strukturen·

Oximet, som netop fremstillet (5,0 g), i diethylether (600 ml) indeholdende et overskud af lithiumaluminiumhydrid( 2,15 g) blev opvarmet under omrøring Og med tilbageløbskøling i 18 timer. Tyndtlagskromatografi ( solventsystem CHCly MeQE 6:1 v/v) indikerede at reduktionen var fuldstændig. Tilsætning af ethylacetat, filtrering og inddampning gav krystallinsk methyl-3-amino- 4.6.0- benzyliden-2,3-dideoxy-t£-L-ribohexopyranosid ( 4,05 g, 85 f) ; smp. 120-121°·, = -145° ( c = 0,5 i CHC^); m/e 265 ( M+). Denne forbin delse ( 4 g) i 0,5 W HC1 i methanol ( 75 ml) blev henstillet ved stuetemperatur i 1 time. Opløsningen blev indstillet til pH 5,5 med Amberlite ( Varemærke) IR 45 og inddampet til tørhed ved reduceret tryk. Remanensen, suspenderet i diethylether ( 7° ml), blev behandlet med trifluoreddikesyreanhydrid ( 10 ml) ved 0°natten over. Råmaterialet, som fremkom ved inddampning til tørhed i vacuum indtil syren var fuldstændig fjernet, blev behandlet med methanol ved stuetemperatur natten over og gav ved afdampning af opløsningsmidlet methyl-2,3-dideoxy-3-IT-trifluoracetyl-oc-L-ribohexopyranosid (XVI); ( 3,34 g, 82 fo)·, [otjjj = -71,35° ( c = 0,7 i CHCl^j m/e 242 ( M+- 31). Dette ' trin følger fremgangsmåden ifølge P. J. Beynon et. al., J. Ohem. Soo. (C), 1969, 272.

Pyranosidet XVI (’2,5 g) opløst i vandfrit pyridin ( 45 ml) blev behandlet med p-nitrobenzoylchlorid ( 4,25 g) ved 0°C. Efter 2 timer blev reaktions-blandingen hældt på is. Bundfaldet blev filtreret fra og vasket med vand til neutral reaktion. Omkrystallisation fra CHCl^-diethylether gav 4,95 g (95 f>) af. di-p-nitro-benzoat derivatet, smp. 180-182°; = -127° ( c = 0,48 i CECl^). Denne forbindelse ( 4 g) opløst i en blanding af chloroform ( 15 ml) og eddikesyre ( 10 ml) blev mættet med tør hydrogenchlorid ved 0° C* 11 150203

Efter 1 time blev opløsningen inddampet til tørhed under vacuum. For at fjerne ethvert spor af syre blev remanensen opløst i benzen og inddampet til tørhed adskillige gange. Rensning af råproduktet ved kromatografi på silicagelsøjle med chloroform som opløsningsmiddel gav 3,15 g (80 $) rent 2,3-dideoxy-4,6-di-0-p-nitrobenzoyl-3-H-trifluoracetyl-c6-L-ribohexopyranose (XVII) i smp. 114 - 116°; [oi.^ = -124° ( o = 0,43 i CHCl^). PMR spektret viser absorption ved 3,83 ( d, C-10H ), 5,26 ( dd, J* 4 Hz, J'» 10,5 Hz, C-4H ) og 5,39 ( s bred, WH 6 Hz, C-1H ).

Pyranosen (XVIl) ( 2,5 g) i vandfri pyridin ( 40 ml) blev behandlet med p-nitrobenzoylchlorid ( 1,25 g) ved 0°. Efter 14 timer ved stuetemperatur blev reaktionsblandingen hældt på is. Det dannede bundfald af tri-0-p-nitro-benzoylderivat blev filtreret fra, vasket med vand til neutral reaktion og tørret i vacuum. PMRt spektret af produktet ( 2,6 g, 92 %) omkrystalliseret fra CHCL^-EtgO, smp. 168 - 170° viser inter alia absorption ved 6,72 ( s bred, W„ 6 Hz, C-1H), hvilket indikerer en aksial konfiguration i C-l positionen i p-nitrobenzoylgruppen.

Tri-O-p-nitrobenzoylderivatet ( 2 g) opløst i diohlormethan ('60 ml) blev mættet med tør hydrogenchlorid ved 0° i 1 time. Bundfaldet p-nitrobenzoesyre blev filtreret fra og opløsningen blev inddampet til tørhed i vacuum indtil syren var fuldstændig fjernet. Det resulterende rå 2,3-dideoxy-4,6-di-0-p-nitrobenzoyl-3-H-trifluoracetyl- tf-L-ribohexopyranosylchlorid (ill) ( 1,6 g, 95 i°) blev anvendt uden yderligere rensning. PMR. spektret viser inter alia, absorption i C-1H ved 6,45 ( dd, J? 3,5 Hz, «Γ*1 1,0 Hz).

Fremstilling af mellemproduktet 2,3,6-trideoxy-3-H-trifluoracetyl-4-0-p-nitrobenzoyl-OL-L-ribohezopyranosylchlorid (VIIl).

En opløsning af methyl-2,3-dideoxy-3-N-trifluoracetyl- tf-L-ribohexopyranosid (XVI) ( 0,6 g) i vandfrit dimethylformamid ( 14 ml) blev blandet med N-brom-succinimid ( 0,37 g) og triphenylphosphin ( 0,6 g). Reaktionsblandingen blev anbragt 1 time ved 50° og opløsningen blev inddampet i vacuum. Remanensen opløst i chloroform ( 50 mil), blev vasket med vand for at eliminere succin-imidet. Remanensen som fremkom ved afdampning af opløsningsmidlet blev renset ved kromatografi på en kiselsyrésøjle med diethylether som elueringsmiddel.

Det rene 6-bromderivat ( 0,4 g) som herved fremkom blev opløst i methanol ( 40 ml) og blev reduceret i tilstedeværelse af palladium på trækul 20 $ 12 150203 ( 0,5 g) og bariumcarbonat ( 2,0 g) ved 10 atm., dette gav et kvantitativt udbytte af methyl-2,3,6-trideory-3-trifluoracetamido-oc-L-ribohexopyranosid (XVIII), tyndtlagskromatografi på Merck Kiselgel 60 ^254 me<^ CHClyMeOH som solventsystem (6:1 v/v) : EP 0,4· P.M.R. spektret er sammenfaldende med strukturen. Dette trin følger fremgangsmåden i S. Hanessian et. al.,

Carbonhyd. Ses., 1972, 24, 45·

En opløsning af pyranosidet ( XVIII) ( 0,24 g) i vandfrit pyridin ( 4 ml) blev blandet med p-nitrobenzoylchlorid (0,24 g).Beaktionsblandingen blev anbragt under omrøring ved 0°C i tre timer og derefter hældt på is. Det således dannede 4-0-p-nitrobenzoylderivat blev filtreret fra og vasket til neutral reaktion.

Denne forbindelse blev tørret over phosphorpentoxid i adskillige timer og opløst i en blanding af iseddikesyre (1 ml) og vandfrit dichlormethan (5 ml) og blev mættet med tørt hydrogenchlorid ved 0°C. Afdampning af opløsningsmidlerne gav 2,3,6-trideoxy-3-N-trifluoracetyl-4-0-p-nitrobenzoyl-L-ribo-hexopyranose (XIX) ( 0,22 g) : tyndtlagskromatografi på Merck Kiselgel 60 *254 med benzen-ethylacetat som solventsystem ( 20 : 1 v/v) EP : 0,18.

En opløsning af pyranosen ( XIX) ( 0,18 g) i vandfrit pyridin blev blandet med p-nitrobenzoylchlorid ( 0,13 g ).

Reaktionsblandingen blev omrørt ved 0° i tre timer og hældt på is. Det således dannede di-p-nitrobenzoylderivat blev filtreret fra og vasket til neutral reaktion.. Denne forbindelse blev tørret, opløst i dichlormethan ( 5 ml) og mættet med hydrogenchlorid ved 0°. Afdampning af opløsningsmidlet gav et kvantitativt udbytte af det ønskede produkt 2,3,6-trideoxy-3-U-trifluor-acetyl-4-O-p-nitrobenzoyl-OC-L-ribohexopyranosylchlorid ( VIII) som anvendes uden yderligere rensning. De følgende eksempler belyser fremgangsmåden ifølge opfindelsen nærmere.

Eksempel 1 3 *,41-epi-6 *-hydroxy-daunomycin ( V)

Daunomycinon ( I; R = methoxy) ( 1,1 g) i vandfrit dichlormethan ( 110 ml) blev blandet med l-ehlor-2,3-dideoxy-3-N-trifluoracetyl-4,6-di-0-p-nitro-benzoyl-οί-L-ribohexopyranose ( III) ( 0,8 g) i tilstedeværelse af molekyl- 13 150203 sigte ( 12 g, 4 Å Merck) og "behandlet med AgSO^CF^ ( 0,37 g) under kraftig omrøring natten over ved stuetemperatur. Reakt i onsblandingen "blev neutraliseret med en mættet vandig opløsning af natriumbicarbonatv Den organiske fase blev skilt fra og inddampet i vacuum. Remanensen blev renset ved kromatografi på en kiselsyresøjle med benzen-ethylacetat (2*1 v/v) som elueringsmiddel: 1,3 g ( 80 $>) af produktet ( II) s smp. 24l - 243°; = +2410 ( c = 0,07 i CHCl^) fremkom.

Forbindelsen (il) ( 0,7 g) opløst i acetone ( 45 ml) blev blandet med 0,2 H vandig natriumhydroxid ( 50 mil) ved 0°. Efter 40 minutter blev opløsningen indstillet til pH 4,5 med 1 N saltsyre og ekstraheret med chloroform for at eliminere aglyconeme. Den vandige opløsning, indstillet til. pH 8,5 , blev gentagne gange ekstraheret med chloroform.

De samlede ekstrakter, tørret over vandfrit natriumsulfat, blev inddampet til 10 ml. Tilsætning af en støkiometrisk mængde vandfri hydrogenchlorid i methanol og diethylether i overskud gav 3',4'-epi-6·-hydroxydaunomycinhydro-chlorid (V) ( 0,36 g, 83 fo) : smp. 183 - 185°; f0^ = +215° ( c = 0,02 i MeOH), Tyndtlagskromatografi på Merck kiselgel HF plade ved pH 7» M/I5 phosphatbuffer, med chloroform-methanolt-vand som solventsystem ( 13 s 6 s 1 volumenforhold) ; RF 0,43.

Eksempel 2 3',41-epi-61-hydroxy-adriamycin(VI)

Slutproduktet i eksempel 1 ( 0,3 g) opløst i en blanding af vandfri methanol ( 4,2 ml) og dioxan ( 12 ml) blev blandet med ethylorthoformiat ( 0,3 ml ) og 1,1 ml af en opløsning af "brom i chloroform ( 0,93 g i 10 ml.). Efter 1 time ved stuetemperatur blev reaktionsblandingen hældt i en blanding af diethylether ( 60 ml) og petroleumsether ( bp. 40 - 70°C ) ( 30 ml): Et rødt bundfald som blev dannet, blev filtreret fra og vasket med diethylether adskillige gange for at fjerne syren fuldstændigt, og opløst i en blanding af acetone ( 6 ml) og 0,25 N vandig hydrogenbromid ( 6 ml). Efter 15 timer ved stuetemperatur blev blandingen tilsat vand ( 6 ml) og ekstraheret med chloroform gentagne gange for at fjerne aglyconeme. Den vandige fase blev ekstraheret med n-butanol indtil ekstrakterne ikke længere var farvede· Afdampning af det organiske opløsningsmiddel i vacuum til..et lille volumen ( ca. 5 ml) 14 150203 gav i4-brom-derivatet ( 0,26 g) som et rødt krystallinsk produkt, ^^brom-derivatet { 0,26 g) blev opløst i 0,25 N vandig hydrogenbromid ( 6 ml) og blandet med 0,45 g natriumfoimiat i vand ( 4j5 ml)· Reaktionsblandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 100 timer og derefter inddampet til tørhed i vacuum. Remanensen blev opløst i 120 ml chloroform-methanol (2:1 v/v) og.vasket med en 2,5 a/° vandig opløsning af natriumbicarbonat ( 2 gange 50 ml). Den vandige fase blev ekstraheret med chloroform indtil ekstrakterne ikke længere var farvede. Den organiske fase blev samlet med chloroformekstrak-teme, tørret over vandfrit natriumcarbonat og inddampet til et lille volumen ( ca. 30 ml) i vacuum. Den røde opløsning indstillet til pH 3,5 ( Congorødt) med vandfrit hydrogenchlorid i methanol blev blandet med diethylether i overskud, hvorved der fremkom 3’ ,4'*-epi-6'-hydroxyadriamycin ( Ti) som hydrochlorid ( 0,12 g) ; smp. I58 - 160°; [oc]^ = + 178° ( c = 0,01 i MeGH); tyndtlagskromatografi på Merck Kiselgelplade ved pH 7» M/15 phosphatbuffer, med ehloroform-methanol-vand som solventsystem ( 13 s 6 : 1 volumenforhold): EP 0,32. Dette trin følger fremgangsmåden i britisk patentbeskrivelse nr.

1.217.133.

Eksempel 3.

3',4’-epi-daunomyoin (x),

Daunomycinon ( I, R = methoxy), ( 0,29 g) i vandfri dichlormethan ( 30 ml), blandet med pyranosylchloridet ( VIII) ( 0,15 g) "blev behandlet med AgSO^CF^ ( 0,1 g) under kraftig omrøring natten over ved stuetemperatur.

Produktet blev behandlet som i eksempel 1 og ( 0,185 g, 65 % ) af det beskyttede produkt VII, smp. 245°, blev dannet ved tyndtlagskromatografi på Merck Kiselgelplader 60 med benzen-ethylacetat solventsystem (2:1 v/v) : RF 0,3. Behandling med base som i eksempel 1 gav det ønskede produkt (X) i kvantitativt udbytte, smp. 180 - l8l°C5 = + 243,5° ( c = 0,05 MeOH).

Tyndtlagskromatografi på Merck Kiselgelplader ved pH 7, M/15 phosphatbuffer, med chloroform-methanol-vand som solventsystem ( 13 s 6:1 volumenforhold): RF 0,55· Daunomycin under de samme betingelser ; RF 0,43.

Eksempel 4.

3*,4’-epi-adriamycin (XI).

15 150203

Produktet X ( 0,5 g) blev omdannet, som i eksempel 2, til dets adriamycin-analoge (XI) ( 0,28 g) smp. 168 - 170°} Μ-0 - + 284° ( c = 0,044 MeOH).

EP = 0,3 med chl o ro f o rm-me thanol-vand solventsystem ( 14 : 6 : 1 volumenforhold).

Eksempel 5.

4-demethoxy-4·-epi-daunomycin (XIII).

1 gram 4-demethoxydaunomycinon ( I, H = hydrogen) ( beskrevet i· belgisk patentskrift nr. 837 758 ) opløst i 100 ml vandfrit dichlor-methan indeholdende 1,2 g 1-chlor-N,0-trifluoracetyl-4-epi-daunosamin ( beskrevet i belgisk patetskrift nr. 826 848 ) behandles i tilstedeværelse af 10 g moleoularsigte ( 4 ί Merck) med 0,86 g AgSO^CF^ opløst i 40 ml diethylether. Efter 20'min. ved stuetemperatur neutraliseres opløsningen med en mættet vandig opløsning af BaHCO^ og den organiske fase skilles fra og inddampes i vacuum. Det H,0 beskyttede derivat (XII) behandles med 200 ml methanol i 15 min. ved stuetemperatur og råproduktet ( 1,3 g .), som dannes ved fordampning af opløsningsmidlet, kromatograferes på kiselsyre-søjle med blandingen chloroform-benzen-methanol ( 100 : 30 i 4 volumenforhold) som elueringsmiddel; 0,55 S rent E-trifluoracetyl-4-demethoxy-4* -epi-daunomycin fremkommer. PMR ( CDCl^-DMSO-dg 1 : 1 v/v): 1,38 ( d, CH^-C-5'), 5,23 ( bred s, WH 7,5 Hz, 0-7H), 5,5 ( dd, J' 2,5 Hz, J" 1 Hz, C-l'H)j 7,7-8,0 og 8,15-8,50 ( to symmetriske m, aromatisk H ), 13,18 og 13,45 ( to s, C-60H og C-110H); TLC på Merck kiselgel Fg^ plade med chloroform-benzen-methanol ( 100 : 30 : 4 v/v) som solventsystem s RF 0,17.

E-trifluoracetylderivatet opløses i 5 ml acetone og behandles ved 0° med 50 ml 0,1H NaOff. Efter 20min. indstilles opløsningen til pH 8,2 og ekstraheres gentagne gange med chloroform. De kombinerede ekstrakter som tørres og koncentreres til et lille volumen ( ca. 15 ml) tilsættes vandfrit hydrogen-chlorid i methanol til pH 3,5 ( congorødt); ved tilsætning af et overskud diethylether fremkom 0,35 g 4-demethory-4'-epi-daunomycin (XIIl), som hydro-chlorid: TLC på Merck kiselgel ^254. 5^ade med chloro form-methanol-vand ( 120 s 20 s 2 ) som solventsystem s RF 0,25.

16 150203

Eksempel 6.

4-deraethoxy-4*-epi-adriamycin (XIV) 0,35 g 4-,demethoxy-4,-epi-daunomycinhydrochlorid (XIIl) opløst i en blanding af vandfrit methanol C 5ml), dioxan (14 ml) og ethylorthoformiat ( 0,35 ml) behandles med 1,4 ml af en opløsning af brom i chloroform ( 0,93g Br^ i 10 ml CHCl^). Efter 30 min. ved stuetemperatur hældes .reaktionsblandingen i en blanding af ethylether ( 70 ml) og petroleumsether ( 35 ml).

Det røde bundfald som filtreres fra og vaskes med ethylether gentagne gange for fuldstændigt at fjerne syren opløses i en blanding af acetone ( 7 ml) og 0,25 R vandig hydrogenbromid ( 6 ml). Efter 15 timer ved stuetemperatur tilsættes 6 ml vand og ved adskillige ekstraktioner med chloroform fjernes aglyconeme. Derefter ekstraheres den vandige fase med n-butanol indtil ufarvede ekstrakter fremkommer. Fordampning af det organiske opløsningsmiddel· i vacuum til et lille volumen ( ca. 6 ml) gav 0,26 g 14-bromderivat. Denne forbindelse opløses i 6,7 ml 0,25 IT vandig hydrogenbromid og behandles med 0,5 g natriumformiat i 5 ml vand. Reaktionsblandingen anbringes under omrøring ved stuetemperatur i 48 timer og inddampes derefter til tørhed i vacuum. Remanensen opløst i 120 ml chloroform-methanol ( 2 s 1 v/v) vaskes med 2,5$ vandig HaHCO^ ( to gange 50 ml). Den vandige fase ekstraheres med chloroform indtil ufarvede ekstrakter fremkommer, tørres ( Ra^SO^) og inddampes til et lille volumen ( ca. 30 ml) i vacuum. Den røde opløsning, indstillet til pH 3,5 ( congorødt) med vandfrit hydrogenchlorid i methanol, tilsættes overskud af ehtylether, hvorved der dannes 4-demethoxy-4'-epi-adriamycin (XIV) som hydrochlorid ( 0,17 g), dette renses ved kromatografi på en søjle af cellulosepulver med solventsystemet chloroform-methanol-vand ( 140 s 20 : 2 v/v) som elueringsmiddel. Det rene produkt smelter under nedbrydning ved 178°5 TLC på Merck kiselgel Pg,.^ plade ved pH 7, med M/15 phosphatbuffer, med solventsystemet chloroform-methanol-vand ( 130 : 60 s 10 v/v) : RP 0,54· 17 150203

Biologisk aktivitet.

Antitumoraktiviteten af de omhandlede, hidtil ukendte forbindelser 3',4'-epi-daunomycin, 3*,4’-epi-6'-hydroxydaunomycin, 3',4'-epi-6'-hydroryadria-mycin og 4-demethoxy-4'-epi-adriamycin, blev bedømt på adskillige transplanterede tumorer i mus og in vitro forsøg. Resultaterne fra disse forsøg er angivet i de følgende tabeller.

3'jd'-epi-daunomycin

Forsøg in vitro over kloneffektiviteten hos Hela celler.

Efter behandling i 2, 8 eller 24 timer blev Hela-celler udsået ( 200 oeller pr. plade) og antallet af kolonier blev bestemt otte dage senere. Den inhi-berende dosis ( ID^Q) repræsenterer den dosis som giver 50 $ inhibering af kolonier.

If A B E I 1 ( virkning på Hela celler)

Forbindelse I®50 ^ s/nl) 2 t 8 t 24 t daunomycin 17 8>5 6,8 3',4'-epi-daunomycin 270 220 190 18 150203

Porsøg in vitro over dannelsen af foci hos Moloney Sarcoma Virus ( MSV).

Forbindelsen som skulle undersøges blev bedømt på museembryofibroblast (MEP) kulturer inficeret med MSV og på tilsvarende uinficerede kulturer. Efter tre døgns behandling blev den inhiberende dosis ( ID^q) bedømt udfra celleproliferation i uinficerede kulturer ( cytotoksisk virkning) og på MSV fociddannelse i.inficerede kulturer,( antiviral virkning ).

Tabel 2 forbindelse antiviral virkning cytotoksisk virkning

__ID*6 «3/ml__I Da. "9/W

daunomycin 3 16 3',4'-epi-daunomycin 45 90 3',4'-epi-daunomycin viser mindre cytotoksisk aktivitet in vitro, når det sammenlignes med daunomycin.

Hos tumorbærende dyr viser det imidlertid tydelig antitumoraktivitet som vist i tabel 3.

Ascites lymfocitisk P 388 leukæmi.

CDF^ hanmus blev intraperitonealt inoculeret med 6 i 10^ leukæmiceller/mus og derefter intraperitonealt behandlet fra første til niende dag efter inoculeringen med forskellige doser af den undersøgte forbindelse. Bedømmelse på den tyvende dag.

Tabel 3

Dosis Toks. Kurerede Vægtforskel Tumorbedømmelse T/C $ (overlevende middeloverlevel- på femte dag) sestid(dage) (x) 25 . 6/6 i -0,8 28 231 12,5 6/6 - -0,1 21 173 6,25 6/6 - +0,7 18,8 155 3,13 6/6 - +0,3 17,3 142 1,56 6/6 - +1,0 15,7 129 (x) Kontrol 12,1 dag 1S0203 19 31,41-epi-61-hydroxydaunomyc in

Forbindelsen viser tydelig aktivitet in vivo som vist i Tabel 4 der angiver virkningen af stoffet på L 1210 leukæmi-bærende mus.

5

Indavlede BDF mus blev intraperitonealt inoouleret med 1 x 10v leukæmicelle r/mus og derefter behandlet med det undersøgte stof. Enkelt behandling i.p. på første dag.

Tab e l 4 ( virkning på L 1210 leukæmi)

Forbindelse Dosis T/C fo (ng/kg) 3',4·-βρί-6'- 7,5 150 hydroxydaunonycin U·* 15° __17,25_ 150_ 3',4'-epi-6»-hydroxyadriamycin

Forbindelsen er aktiv ved eksperimentelle tumorer.

I Tabel 5 angives dens virkning på Ascites Sarooma 180 hos mus.

Forsøget blev gennemført på grupper & 10 mus ( Swiss CD1). Den undersøgte forbindelse blev anvendt intraperitonealt i varierende doser hos forsøgsdyrene én dag efter intraperitoneal inoculation med 1 x 10^ tumorceller/mus.

Middeloverlevelsestiden er angivet som procent af overlevelsestiden hos ubehandlede dyr som atbitrært sættes til 100 f>. Antallet af langtidsover-levende ( LTS) angives også.

Tabel 5 ( virkning på Ascites Sarcoma 180)

Forbindelse Dosis T/C f> LTS

3 123 1/10 3', 4' -epi-6' -hydroxy- 226 2/10 adriamycin ' 6,7 138 10,5 138 adriamycin 4,5 250 1/10 20 150203 4-demethoxy-4'-epi-adriamycin

Forbindelsen blev undersøgt i sammenligning med adriamycin i adskillige in vitro systemer og eksperimentelle musetumorer.

In vitro resultater angives i Tabel 6. Den undersøgte forbindelse var afgjort mere aktiv end adriamycin.

Resultaterne som blev opnået ved eksperimentelle musetumorer er angivet i Tabel 7, 8 og 9.

På ethvert af de undersøgte systemer, udviste 4-demethoxy-4'-epi-adriamycin en bemærkelsesværdig antitumoraktivitet ved doser 10 gange lavere end ved adriamycin.

Ved L 1210 og P 388 leukæmi var antitumoraktiviteten ved den optimale ( ikke toksiske ) dosis sammenlignelig med adriamycins.

Ved fast Sarkom 180 var inhiberingen af tumorvækst på 11. dagen lidt lavere end adriamycins ved ækvitoksiske doser.

Ved Gross leukæmi ( en systemisk tumor transplanteret i.v, ) var forøgelsen af levetiden hos mus, der blev behandlet med de to forbindelser i ækvitoksiske doser, ens.

Man kan konkludere, at 4-demethoxy-4'-epi-adriamycin udviste en høj antitumor-· aktivitet hos mus, i lighed med adriamycin, ved 10 gange lavere doser.

21 150203

Tabel 6 - In vitro virkning af 4-demethoxy-4,-epi-adria-mycin, sammenlignet med adriamycin ID,.q (ng/ml)

Forbindelse Helaa MSVb MEFC

2a 8 24, 72 72

Adriamycin 125 28 12,5 0,01 0,026 4-demethoxy-4 0j35 0>1 0>03 0>003 0f003 epi-adriamycin a) kloneffektivitet ho® Hela-oeller b) inhibering af MSV focidannelae c) inhibering af museembryofibroblastproliferation 22 150203 fabel 7 - Aktivitet af 4-demetho3y-4'-epi-adriamycin på ascitisk leukæmi. Behandling i.p. på 1. dag.

S t

Leukæmi Forbindelse Bosis T/C LTS Toksisk (mg/kg) fo døde L 1210 Adriamyein 2,5 155 4/H O/ll 5 166 1/11 1/11 10 155 3/11 7/11 4-demethoxy-4' - 0,25 155 O/ll O/ll epi-adriamycin 0,5 166 2/11 O/ll 1 133 0/11 11/11

P 388 Adriamyein 2,5 150 0/10 O/lO

5 162 0/10 0/10 10 200 1/10 0/10 4-demethoxy-4'- 0,25 143 O/lO 0/10

epi-adriamycin 0,5 162 1/10 l/lO

1 162 0/10 8/10 a) Middeloverlevelsestid fa af ubehandlede kontroller.

b) Langtidsoverlevende efter 60 døgn.

23 150203

Tabel 8 - Aktivitet af 4-demethoxy-41 -epi-adriamycin på fast Sarcom l80. Behandling i.v. på 1. til 5· dag.

Samlede data fra 2 forsøg.

Forbindelse Dosis T/C Toksisk døde (mg/kg) io

Adriamycin 2 22,2 3/19 2,5 13,5 11/18 4-demethoxy-4'-epi- 0,06 87,3 0/10 adriamycin 0,12 85,1 2/16 0,25 41,9 4/19 __0,5 - 9/9 a) Tumorvægt på 11.dag, $ af ubehandlede kontroller.

24 150203 T a b e 1 9 - Aktivitet af 4-demethoxy-4' -epi-adriamycin på

Gross leukæmi. Behandling i.v. på 1. til 3. dag. Samlede data fra 2 forsøg.

Forbindelse Dosis T/C LTS Toksisk døde (mg/kg) fo

Adriamycin 3,5 164 0/20 0/20 4,5 182 0/20 0/20 5,5 200 1/10 1/10 6 214 0/10 3/10 4-demethoxy-4 ’ -epi- 0,35 153 2/20 0/10 adriamycin 0,45 196 0/20 0/20 0,55 186 0/10 0/10 0,6 214 0/10 1/10 0,65 207 0/10 0/10 a) Se forklaring til Tabel 7·

Claims (2)

150203

1. Fremgangsmåde til fremstilling af oL -anomere af antracyclinglycosider med den almene formel O OH R O OH o x hvori er methyl eller hydroxymethyl, og enten R er methoxy og X er n eller HO/)-0 y CH3 \ Y CHiOH\ \NHi/Z Χ^ΝΗχ y? eller R er hydrogen og X er HO A °v 1/ch3 \| eller hydrochlorider deraf, kendetegnet ved ,at daunomycinon eller 4-demethoxydaunomycinon omsættes med et beskyttet 1-halogenderivat af 3,4-epi-6-hydroxy-daunosamin, 3,1*-epi-daunosamin eller 4-epi-daunosamin i et inert organisk opløsningsmiddel i tilstedeværelse af en opløselig sølvsaltkatalysator og en molekylsigte som dehydreringsmiddel, og at de beskyttende grupper fjernes fra de dannede gly-cosider ved svag alkalisk hydrolyse med 0,1 N natriumhydroxid, og de opnåede daunomycinderivater isoleres som hydrochlorider, eller på i og for sig kendt måde bromeres i 14-stillingen, omsættes med natriumformiat og hydrolyseres, hvorefter de dannede adriamycinderivater isoleres som hydrochlorider.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at sølvsalt