DK149077B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af encephalin-analoge pentapeptidamidderivater eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf - Google Patents

Description

o i 149077

Opfindelsen angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte, encephalin-analoge pentapeptidamidderivater med den almene formel 5 Tyr-D-Met-Gly-Phe-Pro-NH-Y (I) hvor Y betyder et hydrogenatom eller en alkylgruppe med 1-4 carbonatomer, eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf.

10 De forkortelser, der anvendes i den foreliggende beskrivelse til betegnelse af aminosyrer, peptider, deres derivater og deres substituenter og endvidere til betegnelse af det sted, hvor aminosyrerne er til stede i peptiderne, følger henstillingerne fra IUPAC-IUB 15 Commission on Biochemical Nomenclature [Biochemistry 5, 2485 (1966), 6, 322 (1967), J. Biol. Chem. 241, 2491 (1966), 242, 555 (1967), 247, 977 (1972)].

Tre-bogstavsforkortelserne for aminosyrer er som følger: 20 Tyr = tyrosin Met = methionin

Gly = glycin Phe = phenylalanin

Pro = prolin

Forkortelsen alene angiver aminosyren i en L-kon-figuration (med undtagelse af det inaktive Gly), medens 25 i tilfælde af en D-aminosyre dette angives hver gang, f.eks. D-Met = D-methionin.

En bindestreg, der står foran eller efter forkortelsen angiver, at der mangler et hydrogenatom i a-amino-eller α-iminogruppen, eller at der mangler en hydroxyl-30 gruppe i α-carbonylgruppen. Følgelig er tyrosin = Tyr = H-Tyr-OH, carbobenzoxytyrosin - Z-Tyr, idet Z = carbobenz-oxy, og tyrosinmetnylester = Tyr-OMe, idet Me = methyl.

Det følger af det anvendte forkortelsessystem, at såvel Gly-Phe-Pro som H-Gly-Phe-Pro-OH angiver gly-35 cyl-L-phenylalanyl-L-prolin. Aminosyrekomponenterne 149077 2 0 nummereres begyndende ved den endestillede aminogruppe.

Således er den mellemliggende Gly-del af tripeptidet Tyr-Gly-Gly Gly3, medens dets Gly-del med den endestil- 3 lede carboxygruppe er Gly .

5 Foruden disse anvendes også nedenstående forkor telser: Z = benzyloxycarbonyl = carbobenzoxy Boc = tert.butyloxycarbonyl OTCP = 2,4,5-trichlorphenoxy 10 OPCP = pentachlorphenoxy ONP = 4-nitrophenoxy Et = ethyl.

Det er kendt, at naturligt Met-encephalin med formlen 15 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH (IX) og Leu-encephalin med formlen

Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH (III) hvori pentapeptidet med formel (II) svarer til fragmentet 61-65 i β-lipotropin, har en morfinagtig virkning 20 [j. Hughes et al., Nature 258, 577 (1975)1. Denne mor- finagtige virkning af forbindelserne med formel (II) og (III) manifesterer sig ved, at de in vitro er bundet til opiat-receptorer. Deres aktivitet in vivo er imidlertid diskutabel. En karakteristisk analgetisk virkning af 25 morfin kunne kvin påvises utvetydigt i tilfælde af β-lipotropinfragmenter med et større antal led, såsom fragmenterne 61-67 og 61-91 [L. Graf et al.: Nature (London), 263, 240-242, (1976)]. Hidtil harman ikke kunnet fremstille nogen pentapeptidderivater eller 50 -analoge, hvis in vitro-aktivitet ville have overgået in vitro-aktiviteten af Met-encephalin eller endog af det mindre aktive Leu-encephalin [L. Terenius et al..

Biochem. Biophys. Res. Commun. 71/ 175 (1976)], eller hvis analgetiske virkning kunne være blevet påvist utve-35 tydigt.

Opfindelsen sigter mod at fremstille hidtil ukendte pentapeptid-derivater, hvis morfinagtige o 149077 3 aktivitet også manifesterer sig in vivo.

Det har nu vist sig, at man ved modificering af molekylet i encephaliner med formel (II) og (III) ved 2 5 5 erstatning af aminosyregrupperne Gly og Leu eller Met 5 kan fremstille pentapeptid-derivater med en analgetisk virkning, der er bedre end den analgetiske virkning af morfin. Det har nemlig vist sig, at tilstedeværelsen af en D-Met-rest i stilling 2 og den samtidige tilstedeværelse af en Pro-rest i stilling 5 sammen med den neu-10 trale carboxamidogruppe ved encephalins endestillede carboxygruppe tilvejebringer en overlegen analgetisk virkning, jfr. nedenstående tabel I.

I overensstemmelse hermed angår opfindelsen en analogifremgangsmåde til fremstilling af encephalin-ana-15 loge pentapeptidamidderivater med den almene formel (I), hvor Y har den ovenfor angivne betydning, eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf, hvilken analogifremgangsmåde er ejendommelig ved, at man på kendt måde inden for peptidkemien kondenserer prolin, prolinamid eller et 20 N-Cj^-alkylamidderivat af prolin med de på hinanden føl gende aminosyrer og/eller peptidfragmenter, der er beskyttet ved den endestillede aminogruppe, hvorefter man, om nødvendigt, omdanner det fremkomne peptidmellemprodukt, der er beskyttet på sin endestillede aminogruppe, til arai-25 det eller et N-C-^-alkylamidderivat, fjerner beskyttel sesgruppen og om ønsket, omdanner den fremkomne forbindelse med formel I til et syreadditionssalt deraf.

Den morfinagtige virkning, der iagttages in vivo, af forbindelserne med den almene formel (I) er angivet 30 i tabel I i forhold til virkningen af morfin. Morfins aktivitet sattes til 1,0.

Undersøgelserne er foretaget ved halesvirpmetoden på rotter efter intracerebroventriculære (i.c.v.) og intravenøse (i.v.) injektioner og er gennemført ved 35 hjælp af fremgangsmåden ifølge D'Amour og Smith (J. Pharm.

0 149077 4

Ther. 72.» 74 (1941) ], henholdsvis Chermat og Simon [J. Pharmacol. (Paris) _6, 489 (1975)].

Tabel I

5 Morfinagtig virkning af forbindelser med den almene formel (I)

Eks. Aktivitet in vivo nr. Forbindelse ........... i.v« i.c.v.

10 -'-

Tyr—A—Gly-Phe—B-X-Y (I)

-A- _-B-X-Y

15 ! -D-Met- -Pro-NH-Et 0,55 16,9 2 -D-Met ·. -Pro-NH-H 5,5 48,8

Referenceforbindelse: morfin 1,0 1,0 20---:-:- . Af tabel I fremgår, at den i.v. mest aktive for- 2 bindelse indeholdende D-Met er den med en neutral endestillet carboxamidogruppe (CONI^), og at denne for-^ bindelse tillige er langt kraftigere virkende end sammenligningsforbindelsen morfin.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres yderligere ved hjælp af nedenstående eksempler.

I eksemplerne er R^-værdierne bestemt ved tyndt-lagschromatografi på silicagel "Kieselgel G", Reanal,

Budapest, i nedenstående bpløsningsmiddelblandinger: 1. chloroform/methanol (9:1) 2. ethylacetat/pyridin/eddikesyre/vand (240:20:6:11) 3. ethylacetat/pyridin/eddikesyre/vand (120:20:6:11) ^ 4. ethylacetat/pyridin/eddikesyre/vand (60:20:6:11) 5. ethylacetat/pyridin/eddikesyre/vand (30:20:6:11) 0 5 149077

Opløsningerne inddampes på et vandbad på 40°C ved formindsket tryk. Aminosyreanalysen af peptiderne gennemføres med en analyzer af "JLC-5AN"-typen efter endt hydrolyse (6 N HC1, 24 timer, 110°C).

5

Eksempel 1..

Fremstilling af L-tyrosyl-D-methionyl-glycyl-L--phenylalanyl-L-prolin-ethylamid.

10 1. trin: Glycyl-L-phenylalanyl-L-prolin-ethylamid- -oxalat.

3,7 g (13 mmol) Pro-NH-Et [S. Shinagawa og M.

Fujino: Chem. Pharm. Bull. 23, 229 (1975)] opløses i 50 ml methanol og hydrogeneres i nærværelse af en palladiumka- 3 15 talysator. Ved reaktionens afslutning (R^ 0,2-0,3) fra-filtreres katalysatoren, der vaskes med methanol, de methanoliske opløsninger inddampes, og remanensen opløses i 10 ml dimethylformamid. Efter tilsætning af 3,9 g (13 mmol) Z-Phe-OH, l,75g (13 mmol) 1-hydroxybenztriazol 20 og 2,7 g (13 mmol) dicyclohexylcarbodiimid får reaktionsblandingen lov at henstå natten over og inddampes dernæst. Remanensen opløses i 50 ml ethylacetat og vaskes successivt med en 5%'s opløsning af natriumhydrogencarbonat, vand, 0,5 N svovlsyre og vand igen. Den organiske fase 25 tørres på natriumsulfat og inddampes. Det fremkomne 2 produkt (R 0,63-0,68) opløses i 50 ml methanol og hy- ί drogeneres i nærværelse af palladium som katalysator. Katalysatoren frafiltreres, og den methanoliske opløsning 3 inddampes. Remanensen (Rf 0,1-0,2) opløses i 10 ml 30 pyridin, dernæst tilsættes 2,09 g (10 mmol) Z-Gly-OTCP. Reaktionsblandingen får lov at henstå natten over og inddampes dernæst. Efter inddampning opløses remanensen i 50 ml ethylacetat og vaskes med 0,5 N svovlsyre, hvorpå den organiske fase tørres over natriumsulfat og inddampes.

35 Remanensen opløses i 50 ml methanol og hydrogeneres i nærværelse af palladium som katalysator. Ved reaktionens o 149077 6 afslutning frafiltreres katalysatoren, og opløsningen inddampes. Efter inddampning opløses remanensen i en blanding af 2 ml ethanol og 2 ml ethylacetat, dernæst tilsættes 0,9 g (10 mmol) oxalsyre, og blandingen fortyndes 5 med 50 ml ethylacetat. Det præcipiterede produkt filtreres, vaskes med ethylacetat og tørres. Udbytte: 2,7 g (62%) af det i overskriften angivne tripeptid-ethyl-amid--oxalat. Smp. 98-100°C, 0,4-0,5.

2. trin: L-Tyrosyl-D-methionyl-glycyl-L-phenyl-10 alanyl-L-prolin-ethylamid.

0,9 g (2 mmol) af tripeptid-ethylamid-oxalatet (1. trin) opløses i 3 ml pyridin, hvorpå 0,86 g (2 mmol) Boc-D-Met-OTCP og 56 ml (4 mmol) triethylamin tilsættes. Reaktionsblandingen får lov at henstå natten over, ind-15 dampes dernæst, opløses i 30 ml ethylacetat, vaskes med 0,5 N svovlsyre, tørres over natriumsulfat og inddampes. Remanensen (r£ 0,80-0,85) får lov at henstå med 10 ml 3 N saltsyre i ethylacetat, fortyndes med 30 ml n-heptan efter 1/2 time, og det dannede præcipitat filtreres, va-20 skes med n-heptan og tørres i vakuum i nærværelse af kaliumhydroxid. Det fremkomne produkt opløses i 5 ml pyridin, og 1,06 g (2 mmol) Boc-Tyr-Pp<-- og 0,56 ml (4 mmol) triethylamin tilsættes. Reaktionsblandingen får lov at henstå natten over, inddampes dernæst, opløses i 50 ml 25 ethylacetat, vaskes med 0,5 N svovlsyre, tørres over 2 natriumsulfat og inddampes. Remanensen (Rj 0,85-0,90) opløses i 3 ml trifluoreddikesyre og får lov at henstå i 1/2 time. Opløsningen indeholdende et præcipitat inddampes, og remanensen udrives med en blanding af ethylacetat og 30 benzen i forholdet 1:1. Det fremkomne produkt opløses i en blanding af 5 ml 10%'s natriumcarbonatopløsning og 50 ml ethylacetat. Den vandige fase udrystes med 3 x 10 ml ethylacetat, de kombinerede ethylacetatopløsninger tørres over natriumsulfat og inddampes. Efter inddampning udri-35 ves remanensen med en blanding af n-heptan og ethylacetat i forholdet 1:1, den filtreres, vaskes med samme blanding 149077

O

7 og dernæst med n-heptan og tørres. Udbytte: 1,02 g (80%) af det i overskriften angivne pentapeptid-ethylamid.

4 0,45-0,55·. Aminosyreanalyse: Pro = 1,0, Gly = 1,0,

Met = 0,98, Tyr = 1,02, Phe = 1 (referencebasis).

5

Eksempel 2 .

Fremstilling af L-tyrosyl-D-methionyl-glycyl-L--phenylalanyl-L-prolin-amid.

1. Trin: Glycyl-L-phenylalanyl-L-prolin.

10 5,25 g (20 mmol) H-Phe-Pro-OH [S. Bajusz og T. Låzår: Acta Chim. Acad. Sci. Hung. £8, 111 (1966)] suspenderes i 20 ml pyridin, dernæst tilsættes 2,8 ml (20 mmol) triethylamin og 7,77 g (20 mmol) Z-Gly-OTCP, der omrøres, indtil forbindelserne er opløst, og blan-15 dingen for lov at henstå natten over.

Reaktionsblandingen inddampes, og remanensen opløses i 50 ml ethylacetat og så meget 0,5 N svovlsyre, at den vandige fase får en pH-værdi på 2-3. Den organiske fase vaskes med vand, dernæst ekstraheres det 20 N-benzyloxycarbonylpeptid, der er til stede som et opløst produkt, med 3 x 20 ml af en 5%'s opløsning af natriumhydrogencarbonat. De kombinerede natriumhydro-gencarbonatekstrakter syrnes med 0,5 N svovlsyre, det præcipiterede peptid ekstraheres med ethylacetat, og 25 ethylacetatopløsningen inddampes.

Det produkt, der fremkommer som remanens ved ind-2 dampning (R^ 0,5-0,6), opløses i 100 ml methanol og hydrogeneres i nærværelse af palladium som katalysator. Ved reaktionens afslutning frafiltreres katalysatoren, der vaskes 30 med methanol, hvorpå de methanoliske opløsninger forenes og inddampes. Remanensen krystalliseres med ether, filtreres, vaskes med ether og tørres. Udbytte: 5,43 g (85%) af det i over- 4 skriften angivne tripeptid. R^ 0,31-0,38.

2. trin: L-Tyrosyl-D-methionyl-glycyl-L-phenyl- 35 -alanyl-L-prolin-amid.

8

O

149077 0,96 g (3 mmol) H-Gly-Phe-Pro-OH (1. trin) suspenderes i 5 ml pyridin, dernæst tilsættes 0,42 ml (3 mmol) triethylamin og 1,27 g (3 mmol) Boc-D-Met-OTCP, og der omrøres, indtil forbindelserne er opløst. Efter at reak-5 tionsblandingen har fået lov at henstå natten over, behandles den på den under 1. trin angivne måde. Efter udhældning af 10 ml 2 N saltsyre i ethylacetat ud på den remanens 2 (R^ 0,30-0,35), der er fremkommet efter inddampnmg, omrøres blandingen. Efter 1/2 time fortyndes reaktionsblandingen med 10 n-heptan, den filtreres, vaskes med n-heptan og tørres i vakuum i nærværelse af kaliumhydroxid. Det på denne måde fremstil- 4 lede produkt (R^ 0,16-0,24) suspenderes i 5 ml pyridin, dernæst tilsættes 0,84 g (6 mmol) triethylamin og 1,32 g (2,5 mmol) Boc-Tyr-OPCP, og der omrøres, indtil forbindel-15 serne er opløst. Efter at reaktionsblandingen har fået lov at henstå natten over, behandles den på den under 1. trin angivne måde. Efter inddampning udrives remanensen med n-heptan, den filtreres, vaskes med n-heptan og tørres.

4

Det fremkomne Boc-Tyr-D-Met-Gly-Phe-Pro-OH (R^ 0,60-0,66) 20 opløses i 5 ml dimethylformamid, hvorpå 0,52 g (2,5 mmol) dicyclohexyl-carbodiimid og 0,4 g (2,5 mmol) 1-hydroxybenzo-triazol-ammoniumsalt tilsættes. (Sidstnævnte er fremstillet på følgende måde: En opløsning af 1-hydroxy-benzotriazol i koncentreret vandigt ammoniumhydroxid (0,5 g/ml) fortyndes med 25 acetone, hvorpå de præcipiterede krystaller frafiltreres, vaskes med acetone og tørres]. Reaktionsblandingen får lov at henstå natten over til amidering, den filtreres og inddampes, og efter inddampning opløses remanensen i methylenchlorid, vaskes med en 5%'s opløsning af natrium-30 hydrogencarbonat, tørres over natriumsulfat og inddampes.

Efter inddampning opløses remanensen (R^ 0,53-0,58) i 10 ml trifluoreddikesyre, blandingen får lov at henstå ved stuetemperatur i 30 minutter, inddampes dernæst, og 4 remanensen (R^ 0,50-0,60) tørres i vakuum i nærværelse 35 af kaliumhydroxid. Det på denne måde fremkomne produkt opløses i 30-40 ml af en blanding af chloroform og n-bu- 149077

O

9 tanol i forholdet 3:1 og 5-7 ml vand. Den vandige fase neutraliseres med fast natriumhydrogencarbonat, ekstraileres med ovenstående blanding af chloroform og n-butanolf hvorpå de kombinerede organiske faser inddampes, og re-5 manensen udrives med n-heptan. Udbytte: 1,25 g af det i overskriften angivne produkt, der in vivo er ca. 50 gange mere aktivt end morfin ifølge de undersøgelser, der er gennemført ved anvendelse af fremgangsmåderne ifølge D'Amour og Smith [J. Pharm. Ther. 72, 74 (1941)] og 10 Chermat og Simon [J. Pharmacol. (Paris) jj, 489 (1975)]. Aminosyreanalyse: Pro = 1,0, Gly = 1,0, Met = 1,0,

Tyr = 0,98, Phe = 1 (referencebasis).