DK145951B - Endonucleaser og fremgangsmaade til fremstilling heraf - Google Patents
Endonucleaser og fremgangsmaade til fremstilling heraf Download PDFInfo
- Publication number
- DK145951B DK145951B DK333977AA DK333977A DK145951B DK 145951 B DK145951 B DK 145951B DK 333977A A DK333977A A DK 333977AA DK 333977 A DK333977 A DK 333977A DK 145951 B DK145951 B DK 145951B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- bacillus
- bsu
- iam
- atcc
- endonuclease
- Prior art date
Links
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 title claims description 11
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 title claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 13
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 52
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 52
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 49
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 49
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 36
- 108010049705 endonuclease R Proteins 0.000 claims description 36
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 claims description 18
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 14
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 claims description 13
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 241000193386 Lysinibacillus sphaericus Species 0.000 claims description 5
- 241000301512 Bacillus cereus ATCC 14579 Species 0.000 claims description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 48
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 44
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 30
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 6
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 6
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 6
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 6
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 6
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 5
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 4
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 241001669263 Bacillus amyloliquefaciens DSM 7 Species 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 3
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 3
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 2
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000702005 Bacillus phage SPP1 Species 0.000 description 2
- 241001660259 Cereus <cactus> Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 2
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 2
- 102100030684 Sphingosine-1-phosphate phosphatase 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710168942 Sphingosine-1-phosphate phosphatase 1 Proteins 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001148470 aerobic bacillus Species 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 2
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 2
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 2
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000051622 Bacillus meqaterium Species 0.000 description 1
- 241000322342 Bacillus phage M2 Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000626610 Escherichia coli Type II restriction enzyme EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 101100409308 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) adv-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960001570 ademetionine Drugs 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 101150063780 spp1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
(19) DANMARK
6 (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT ου 145951 B
DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET
(21) Ansøgning nr. 5539/77 (51) lnt.CI.3 C 12 Η 9/22 (22) Indleveringsdag 22. Jul« 1977 (24) Løbedag 22. Jul. 1977 (41) Aim. tilgængelig 24. jan. 1978 (44) Fremlagt 25· apr. 1985 (86) International ansøgning nr. -(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. -
(30) Prioritet 25. Jul. 1976, 87883/76, JP
(71) Ansøger RIKAGAKU KENKYUSHO, Wako-shi, JP.
(72) Opfinder Tadahiko Ando, JP: Takehiko Shibata, JP: Shukuko Ika?= wa, JP: Cholung Kim, JP.
(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Lehmann & Ree.
(54) Endonueleaser og fremgangsmåde til fremstilling heraf.
Opfindelsen angår hidtil ukendte endonueleaser betegnet endonuclease R Bsu M, R Bsu 6633, R Bsu 1193, R Bsu 1231, R Bsu 1192, R Bsu 1145, R Bsu 1076, R Bsu 1114, R Bam P, R Bam K, R Bsu 1259, R Bce 14579, R Bee R, R Bce 170, R Bsu 1247, R Bce 1229, R Bme 205, R Bpu 1387, R Bme 899 og R Bsp 1286.
Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af disse endonueleaser.
Enzymer (DNaser), som dekomponer er deoxvribonucleinsyre
(DNA), findes i forskellige biologiske materialer og deltager i livs-UD
_-j. processer, såsom metabolisme, dekomponering, syntese og substitution af DNA.
tt
O
2 145951 DNA-dekomponerende enzymer klassificeres groft i exonucle-ase og endonuclease efter deres virkemåde. Førstnævnte type virker fra enden af DNA-molekylets polvnucleotidkæde og frigiver og dekom-ponerer. successivt nucleotid, og sidstnævnte type danner DNA- eller oligonucleotidfragmenter ved at spalte phosphodiesterbindinger i DNA-molekylet.
I de senere år er der ved undersøgelse af endonucleaser gjort store fremskridt. Ved siden af talrige enzymer med biologisk vigtige funktioner er der blevet udvist særlig opmærksomhed overfor en speciel gruppe med særlige enzymatisk-kemiske egenskaber. Disse enzymer, såkaldte restriktionsnucleaser, udviser en høj specificitet overfor bestemte nucleotidsekvenser og er i deres virkning afhængig af naturlige eller kunstige strukturelle forandringer (modifikationer) i DNA'et. Restriktionsnucleaserne spiller en vigtig rolle ved undersøgelse af DNA-struktur og -funktion samt ved molekylær kloning af DNA-sekvenser med forskellig oprindelse.
Der kendes mikrobiologiske fremgangsmåder til fremstilling af nucleaser, f.eks. en fremgangsmåde til fremstilling af enzymer fra en kultur af Aspergillus oryzae, hvilke enzymer ikke virker på dobbeltstrenget DNA og specifikt dekomponeret, enkeltstrenget DNA (jap. patent nr. 593.368), en fremgangsmåde til fremstilling af enzymer fra Aspergillus oryzae-stammer, hvilke enzymer fortrinsvis dekompo-nerer purin-purinbindingen (jap. patent nr, 621.205), en fremgangsmåde til fremstilling af enzymer, som indfører et begrænset antal enkeltstrengsbrud i dobbeltstrenget DNA fremkommet fra Escherichia coli inficeret med bakteriofag (jap. patent nr. 764.919), en fremgangsmåde til fremstilling af et enzym, som hydrolyserer RNA til nueleosid-2,3-cyklisk phosphat fremkommet fra Escherichia coli inficeret eller induceret af bakteriofag (jap. pat.ans.nr. 78869/1972, jap. offentliggørelsesskrift nr. 35577/1974), en fremgangsmåde til fremstilling af enzymer, som fortrinsvis spalter guanin-guanin-bindingen i DNA-molekylet fra kulturvæsken af en alkalofil Bacillus-art (jap. pat.ans.nr. 114131/1973, jap. offentliggørelsesskrift nr. 64484/1975, og dansk fremlæggelsesskrift nr. 138.332), en fremgangsmåde til fremstilling af enzymer, som specifikt dekomponerer RNA-delen af DNA-RNA-hybrid fremkommet fra celler af Bacillus subtilis (jap. pat.ans.nr. 127276/1974), og en fremgangsmåde til fremstilling af enzymer med substratspecificitet, hvilke enzymer genkender bestemte biologiske deoxyribonucleinsvrer og spalter specifikke bindinger heraf, fra Bacillus subtilis IAM 1522 og Bacillus amylolique-faciens ATCC 23.845 (jap. pat.ans.nr. 121671/1975, jap. offentlig- 3 145951 gørelsesskrift nr. 47980/1977 og dansk pat.ans.nr, 4549/76).
Det har nu vist sig, at der ud fra visse andre Bacillus-stammer kan isoleres nogle hidtil ukendte restriktionsnucleaser (endonucleaser R). Endonucleaserne ifølge opfindelsen betegnes endonuclease R Bsu M, R Bsu 6633, R Bsu 1193, R Bsu 1231, R Bsu 1192, R Bsu 1145, R Bsu 1076, R Bsu 1114, R Bam F, R Bam K, R Bsu 1259, R Bce 14579, R Bee R, R Bce 170, R Bsu 1247, R Bce 1229, R Bme 205, R Bpu 1387, R Bme 899 og R Bsp 1286, og er ejendommelige ved, at enzymerne er vundet fra en cellefri ekstrakt af følgende Bacillus-stammer: endonuclease R Bsu M fra Bacillus subtilis ATCC 6051, endonuclease R Bsu 6633 fra Bacillus subtilis ATCC 6633, endonuclease R Bsu 1193 fra Bacillus subtilis IAM 1193, endonuclease R Bsu 1231 fra Bacillus subtilis IAM 1231, endonuclease R Bsu 1192 fra Bacillus subtilis IAM 1192, endonuclease R Bsu 1145 fra Bacillus subtilis IAM 1145, endonuclease R Bsu 1076 fra Bacillus subtilis IAM 1076, endonuclease R Bsu 1114 fra Bacillus subtilis IAM 1114, endonuclease R Bam F fra Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23350, endonuclease R Bam K fra Bacillus amyloliquefaciens IAM 1523, endonuclease R Bsu 1259 fra Bacillus subtilis IAM 1259, endonuclease R Bce 14579 fra Bacillus cereus ATCC 14579, endonuclease R Bce R fra Bacillus cereus Rf sm st ATCC 31293, endonuclease R Bce 170 fra Bacillus sp. No.170 ATCC 31292, endonuclease R Bsu 1247 fra Bacillus subtilis IAM 1247, endonuclease R Bce 1229 fra Bacillus cereus IAM 1229, endonuclease R Bme 205 fra Bacillus megaterium B205-3 ATCC 31294, endonuclease R Bpu 1387 fra Bacillus pumillus AHU 1387, endonuclease R Bme 899 fra Bacillus megaterium IAM 1030, og endonuclease R Bsp 1286 fra Bacillus sphaericus IAM 1286.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af endonucleaserne er ejendommelig ved, at Bacillus subtilis ATCC 6051, Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus subtilis IAM 1193, Bacillus subtilis IAM 1231, Bacillus subtilis IAM 1192, Bacillus subtilie IAM 1145, Bacillus subtilis IAM 1076, Bacillus subtilis IAM 1114, Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23350, Bacillus amyloliquefaciens IAM 1523, Bacillus subtilis IAM 1259, Bacillus cereus ATCC 14579, Bacillus cereus Rf sm st ATCC 31293, Bacillus sp. No.170 ATCC 31292, Bacillus subtilis IAM 1247, Bacillus cereus IAM 1229, Bacillus megaterium 4 145951 B205-3 ATCC 31294, Bacillus pumillus AHU 1387, Bacillus meqaterium IAM 1030, og Bacillus sphaericus IAM 1286 dyrkes i et næringssubstrat, hvorpå cellerne isoleres og behandles til udvinding af en cellefri ekstrakt heraf, som underkastes fraktionering og rensning.
Stammerne med betegnelsen IAM er deponeret uden restriktioner i The Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo, (adresse: 1-1, Yayoi, Bunkyoku, Tokyo, Japan), og stammerne AHU 1387 af Bacillus pumillus er deponeret uden restriktioner i The Faculty of Agriculture,. Hokkaido University (adresse: Nishi-9-chome, Kita-9-jo, Sapporo City, Hokkaido, Japan) som AHU 1387 (se JFCC Catalogue of Culture (1966)), og disse mikroorganismer er frit tilgængelige for trediepart til enhver tid.
Stammerne med betegnelsen ATCC er deponeret i The American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852) uden restriktioner, hvorved offentligheden har fuld adgang til kulturerne. Stammerne ATCC 6051, 6633, 23350 og 14579 blev til-gængeliggjort for offentligheden den 9. juni 1977 (se ATCC Catalogue of Strains (1974)).
Stammerne ATCC 31292, 31293 og 31294 blev tilgængeliggjort for offentligheden den 10. juni 1977.
Stammernes deponering er opsummeret i nedenstående tabel 1.
Tabel 1
Mikroorganisme Deponerings sted Deponeringsnummer
Bacillus subtilis The American Type
Culture Collection (ATCC) ATCC 6051 do. do. ATCC 6633 do. The Institute of Applied IAM 1076
Microbiology,
University of Tokyo (IAM) do. do. IAM 1114 do. do. IAM 1145 do. do. IAM 1192 do. do. IAM 1193 do. do. IAM 1231 do. do. IAM 1247 do. do. IAM 1259 5 145951
Bacillus amylolique- ’faciens ATCC ATCC 23350 do. (også kaldt "Bacillus subtilis") IAM IAM 1523
Bacillus cereus ATCC ATCC 14579
Bacillus cereus Rf sm st ATCC ATCC 31293
Bacillus cereus IAM IAM 1229
Bacillus sp. No. 170 ATCC ATCC 31292
Bacillus megaterium IAM IAM 1030
Bacillus megaterium B 205-3 ATCC ATCC 31294
Bacillus pumillus Faculty of Agriculture/ AHU 1387
Hokkaido University (AHU)
Bacillus sphaericus IAM IAM 1286
Mikrobiologiske egenskaber af stammerne deponeret i The American Type Culture Collection, nemlig Bacillus sp. nr. 170 (ATCC 31292), Bacillus cereus Rf sm st (ATCC 31293) og Bacillus megaterium B 205-3 (ATCC 31294) vil nu blive beskrevet.
Nedenstående prøver gennemførtes ifølge de i R. E. Gordon, W. C. Haymes & C. H-N. Pang, "The Genus Bacillus", U.S. Dpet. Agr., 1973 og "Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology", 1974, beskrevne metoder.
(1) Mikrobiologiske egenskaber af Bacillus sp. nr. 170: (A) Morfologi:
Stammen har en monokokkisk eller streptokokkisk stavlignende form med en størrelse på (1,0 - 1,2) x (3,0 x 5,0) mp og har lateralt anbragte flageller og bevægelsesevne. Den giver et positivt resultat vedGramfarveprøven og et negativt resultat syrefarveresistensprøven.
Stammen udviser ingen pleomorfi og danner ovale sporer. Sammensætningen af det til de morfologiske iagttagelser anvendte næringssubstrat er følgende:
Pepton: 10 g/1 Kødekstrakt: 10 g/1
NaCl: 5 g/1
Agar: 15 g/1 pH: 7,2 (B) Vækst på forskellige næringssubstrater: 1) Bouillon-Agar pladekultur:
Kolonien er cirkulær og danner en flad ophøjning, og randkanten er bølget. Overfladen af kolonien er glat og hvid.
Der dannes ikke noget pigment i kulturmediet.
6 145951 2) Bouillon-Agar stregkultur: Væksten er middel og spredt. Overfladen er glat og hvid.
Der dannes ikke noget pigment i kulturnæringssubstratet.
3) Væskeformigt bouillon-næringssubstrat:
Overfladen af kulturnæringssubstratet er membranlignende, og der dannes sedimenterede udfældninger.
4) Bouillon-gelatine stavkultur:
Gelatine er forflydiget.
5) Lakmus-mælk:
Lakmusfarven forsvinder, og peptonisering finder sted.
. (C) Biologiske egenskaber: 1) Nitratreduktion: positiv 2) Denitrifikation: negativ 3) MR-prøve: positiv 4) VP-prøve: positiv 5) Dannelse af indol: negativ 6) Dannelse af hydrogensulfid: negativ 7) Hydrolyse af stivelse: positiv 8) Udnyttelse af citronsyre:
Stammen vokser på Christensensubstrat men ikke på Kosersub-strat.
9) Udnyttelse af uorganisk nitrogen:
Stammen kan vokse ved udnyttelse af et ammoniumsalt.
10) Dannelse af pigment: negativ 11) Urease: negativ 12) Oxidase: positiv 13) Catalase: Positiv
14) Vasks tbetingelser: pH-optimum: 7 til 10 Temperaturoptimum: 30 - 37°C
15) Forhold over for oxygen: aerob 16) O-F-prøven:
Stammen danner en syre enten aerobt eller anaerobt.
17) Udnyttelse af carbonkilder:
Stammen danner syrer enten aerobt eller anaerobt udfra D-glucose, D-mannose, D-fructose, maltose, sucrose, trehalose, glycerol og stivelse.
Der iagttages ikke nogen gasudvikling i noget saccharid. Dannelse af syre eller udvikling af gas iagtages ikke for så vidt angår L-arabinose, D-xylose, D-galactose, lactose, raffinose, D-sorbitol, D-mannitol og inositol.
7 145951 18) Saltbestandighed:
Stammen kan vokse ved en hvilken som helst NaCl-koncentra- tion på op til 7,5%.
19) Hydrolyse af casein: positiv 20) Phenylalanindeaminase: negativ.
Af førnævnte litteratursteder fremgår det under indtryk af ovennævnte mikrobiologiske egenskaber, at Bacillus sp. nr. 170 (i det følgende betegnet "stamme nr. 170") tilhører slægten Bacillus. Sammenligning af stamme nr. 170 med stammer hørende til slægten Bacillus afslører, at den ligner Bacillus cereus, men afviger fra Bacillus cereus på det punkt, at stamme nr. 170 vokser godt under alkaliske forhold, medens vækst-pH for den kendte stamme ligger i området fra 5 til 8.
Som påpeget i det følgende udviser stamme nr. 170 maksimal penicillinaseproduktion i et alkalisk kulturmedium, og dette afviger klart fra Bacillus cereus, som danner en penicillinase i et neutralt kulturmedium.
Følgelig har man fundet, at stamme nr. 170 ikke svarer til nogen kendt stamme, og det er blevet anset for rimeligt at anse stamme nr. 170 for en ny stamme hørende til slægten Bacillus - (2) Mikrobiologiske egenskaber af Bacillus cereus Rf sm st: (A) Morfologi:
Stammen er en aerob bacillus, der danner endosporer og giver et negativt resultat vedgramfarveprøven. Sporen har oval eller cylindrisk form. GC-indholdet i DNA er 32 - 37%.
(B) Biologiske egenskaber: 1) Æggeblommeprøve: positiv 2) Vækstbetingelser:
Den højeste temperatur for vækst af stammen er 35 - 45 C, og den laveste temperatur er 0 til 20°C.
3) Nitratreduktion: positiv (C) Vaskst på nærings substrater:
Stammen vokser i et agarnæringssubstrat under anaerobe forhold. Den vokser i et substrat indeholdende 0,001% lysozym.
Sammenligning med førnævnte litteratursteder indicerer, at stammen stort set svarer til kendte Bacillus cereus, og stammen identificeredes som en stamme af Bacillus cereus.
145951
O
(3) Mikrobiologiske egenskaber af Bacillus megaterium B 205-3: (A) Morfologi:
Stammen er en forholdsvis stor aerob bacillus, der danner endosporer og giver et positivt resultat af Gramfarveprøven. Sporen har en oval eller cylindrisk form. GC-indholdet i DNA er 36 - 38%.
(B) Biologiske egenskaber: 1) Æggeblommeprøve: negativ 2) Vækstbetingelser:
Stammen vokser ved en højeste temperatur på 35 - 45°C og en laveste temperatur på 3 - 20°C.
(C) Vækst på kulturnæringssubstrater:
Stammen vokser ikke i agarmedium under aerobe forhold. Stammen Vokser ikke i et medium indeholdende 0,001% lysozym. Sammenligning med førnævnte litteratursteder indicerer, at stammen stort set svarer til kendte Bacillus megaterium, og stammen i-dentificeredes som en stamme af Bacillus megaterium.
De nævnte mikroorganismer kan dyrkes ved en generel dyrkningsmetode, f.eks. ved at inokulere en af ovennævnte mikroorganismer i et .næringssubstrat indeholdende aminosyrer, kaseinnedbrydningsprodukt, glucose, phosphat, sulfat, o.s.v. og foretage dyrkning ved 30-37°C under beluftning og omrøring.
Nogle typiske næringssubstrater er angivet nedenfor.
(1) CI-medium i 10 liter KH2P04 60 g K2HP04 140 g
Natriumcitrat·2H20 10 g (NH4)2S04 20 g
Arginin 2 g
Casaminosyre 2 g
Glucose 50 g
MgS04 2 g
Tryptophan 0,25 g (2) Bacto-Penassay-medium (Difco) 9 145951
Mikroorganismevæksten måles ved at anbringe kulturvæsken i en cuvette og måle transmittansen under anvendelse af lys med bølgelængden 660 mp. Efter dyrkningen opsamles celler over en periode, der går fra den eksponentielle fase til det indledende stadium af den stationære fase. Cellerne underkastes ultralydssvingninger og centrifugalseparering på den form, hvori de findes, eller efter at de har været underkastet en lysozymbehandling til fremstilling af en protoplast, hvorved der opnås en cellefri ekstrakt. Den således fremkomne cellefri ekstrakt kan underkastes streptomvcinsulfatbehand-ling og ammoniumsulfatfraktionering, og derefter kan der gennemføres gelfiltrering under anvendelse af Ultrogel ACA 44 eller Sephadex G-100 og/eller ionbytningschromatografi under anvendelse af DEAE-cellulose eller phosphocellulose, hvorved der fra cellerne udvindes et af ovennævnte enzymer.
De på denne måde tilvejebragte enzymer har vist sig at have følgende biokemiske egenskaber.
Enzymernes biokemiske egenskaber: (1) Aktivitet og substratspecificitet:
Som substrat-DNA for den enzymatiske reaktion fremstilledes og anvendtes DNA fra forskellige fager, jvf. nedenfor.
Efter den enzymatiske reaktion blev størrelsen af det af enzymet ifølge den foreliggende opfindelse spaltede substrat-DNA og antallet af spaltninger undersøgt ved hjælp af det på tegningen viste elektroforetiske mønster.
Tegningen er et fotografi, der viser elektroforetiske mønstre i en agarosegel af substrat-DNA1et behandlet med enzymerne ifølge den foreliggende opfindelse.
Som vist på tegningen, opdeltes substrat-DNA-molekylet i fragmenter af specifik størrelse af enzymerne ifølge den foreliggende opfindelse.
De anvendte substrater var følgende: (1) DNA af ubehandlet Bacillusfag 0 105C.
(2) DNA af ubehandlet E^ colifag.
(3) DNA af E^ colifag λ behandlet med Eco R I enzym af Escherichia coli (kontrol til sammenligning med (1) og (2)).
På tegningen har symbolerne for substraterne følgende betydninger: 10 145951 (1) 0 105C.168 ----- Bacillusfag 0 105C formeret på
Bacillus subtilis ATCC 6051 (2) SPPl.168-----— Bacillusfag SPPl formeret på
Bacillus subtilis ATCC 6051 (3) 0 105C.N ------- Bacillusfag 0 105C formeret på
Bacillus amyloliquefaciens IAM 1522 (4) SPPl.R --------- Bacillusfag SPPl formeret på
Bacillus subtilis R
(5) λ------------— DNA af E. colifag λ formeret på
Escherichia coli B
(6) λ H------------λ DNA modificeret af
Bacillus amyloliquefaciens H
(7) λ DNA----------Ubehandlet λ DNA formeret på
' Escherichia coli B
(8) 105C.168DNA --- Ubehandlet 0 105C.168DNA
(9) λ R.EcoRI-------DNA af E. colifag λ behandlet med
EcoRI-enzym af Escherichia coli
De anvendte enzymnavne er baseret på det generelle norr.en-klatursystem, der er beskrevet af H.O„ Smith & D. Nathans: J. Mol. Biol., bind 81, side 419 (1973).
Navnene "Bsu", "Bam", "Bce", "Bme", "Bpu" og "Bsp" er afledet som følger:
Navn Slagt Art Stamme Nummer
... 1) Bsu M Bacillus subtilis M
2) Bsu 6633 " " 6633 3) Bsu 1193 " n 1193 4) Bsu 1231 " " 1231 5) Bsu 1192 " " 1192 6) Bsu 1145 " " 1145 7) Bsu 1076 " " 1076 8) Bsu 1114 * 1114
9) Bam F " amyloliquefaciens F
10) Bam K " K
11) Bsu 1259 " subtilis 1259 12) Bce 14579 " cereus 14579
13) Bce R " " R
14) Bce 170 " " 170 15) Bsu 1247 " subtilis 1247 H 145951 16) Bee 1229 " cereus 1229 17) Bme 205 " megaterimn 205 18) Bpu 1387 " pumillus 1387 19) Bme 899 Bacillus megaterium 899 20) Bsp 1286 " sphaericus 1286
Ovenfor er forkortelserne af enzymernes navne dannet ved at kombinere de understregede hoveddele af de fuldstændige navne.
Endvidere er symbolet "R." en forkortelse for "Endonuclease R", og symbolet "E" en forkortelse for "Restriction".
Yderligere er betegnelsen "EcoR 1" afledet som følger:
Slægt Art Stamme Nummer
Escherichia coli R 1
Som det ses af elektroforesediagrammet på Fig. 1, har enzymet af Bacillus subtilis ATCC 6051 evne til at dekomponere DNA af ba-cillusfag 0 105C.168 og DNA af bacillusfag 0 105C.N. Enzymet af Bacillus subtilis IAM 1076 og Bacillus subtilis IAM 1114 har samme substratspecificitet, og det ses, at de ikke nar nogen aktivitet overfor DNA af bacillusfag SPP1.R.
Enzymerne af Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus subtilis IAM 1193, Bacillus subtilis IAM 1231 og Bacillus subtilis IAM 1192 opdeler hvert DNA i betydeligt mindre fragmenter, og de udviser en sådan specificitet, at de endog virker på DNA af SPPl-fag modificeret med stammen R af Bacillus subtilis. Det ses også, at enzymet af Bacillus subtilis IAM 1247 har virkninger, der svarer til virkningerne af enzymet af Bacillus sp. No. 170 (ATCC 31292).
Det ses, at enzymerne fremstillet af Bacillus amyloliguefa-ciens ATCC 23350, Bacillus amyloliquefaciens IAM 1523 og Bacillus subtilis IAM 1259 har en sådan substratspecificitet, at de ikke virker på (i) λ-fag DNA behandlet med enzymet Barn NI, (ii) DNA af fag 0 105C.168 eller (iii) λ-fag DNA modificeret med stammen H af Bacillus amyloliguefaciens.
Enzymet ifølge den foreliggende opfindelse fremstillet af Bacillus pumillus AHU 1387 (Bpu 1387) sammenlignedes med enzymerne Bam NI, Bam NII og Bam NIII fremstillet af Bacillus amyloliquefaciens N (IAM 1522) ifølge ansøgerens japanske patent nr.
(japansk patentansøgning nr. 121671/75, japansk offentliggørelsesskrift nr. 47980/1977 og dansk pat.ans.nr. 4549/76) for så vidt angår 12 145951 substratspecificitet på forskellige DNA-substrater, hvorved de i tabel 2 viste resultater fremkom.
Som det ses af tabel 2, adskiller enzymet Bpu 1387 sig fra enzymerne Barn NI og Bam Nil + Bam NIII for så vidt angår virkningerne, ikke blot på DNA af bacillusfag ø 105, SPPl og colifag λ, men også på plasmid DNA (intracellulær faktor) Adv 1 fra Escherichia coli, DNA fra ColEl og DNA fra abevirus 40.
Af tabel 3 fremgår endvidere virkningen af de øvrige af opfindelsen omfattede enzymer.
Tabel 2
Antal spaltede dele Bam Nil +
Substrat DNA Bam NI Barn NIII Bpu 1387
Bacillusfag 0 105C 0 + V7 5
Bacillusfag 0 29 0 0 ikke undersøgt
Bacillusfag M2 00 ikke undersøgt
Bacillusfag SPPl 03 0
Colifag λ 5 VL5 6-7 λ dv 1** 12 eller 3 1 T7 0 >14 ikke undersøgt
ColElS) 0 3 0 SV 40**^ 1 >4 2-3 $) dv 1, ColEl: plasmid (intracellulær faktor) af Escherichia coli ^SV 40: Abevirus 40 13 145951
Tabel 3 _Antal afspaltede dele på DNA-substratet Erkendt
Tn’rvT’trm- bacillus bacillus bacillus coli base- nzy” faer faa faa fag \åvl ColEI SV40 arrangement navn j 105c SPP 1 29 λ (5’ » 3')
Bsu M + + 6633 + + +
IO76 + + GGCC
1114 + + GGCC
1145 + + 1192 + + + + 1193 + + + I23I + + +
1247 + 18 3 CTGCAG
1259 i 0 0 0 5 1 0 1 GGATCC
Barn F O 0 0 5101 GGATCC
K O 0 0 5101 GGATCC
Bcc 14579 + *+
R + + CGCG
1229 + +
170 + 18 2 CTGCAG
Bme 899 + + .
205 + +
Bpu 1387 4-5 0 —6 10 2-3 - - — - i _ -----------l· - —----- 1 . I Ml INI· . — . I· .1... ! i i
Bsp 1286 + ' + +: Spalter (antal afspaltede dele ikke klarlagt).
G: guanin , A: adenin , T: Thymin , C: cytosin (2) pH-optimum:
Hver af de nye enzymer ifølge opfindelsen har et pH-optimum beliggende mellem 7,2 og 8,3.
(3) Driftstemperaturoptimum:
Hver af de nye enzymer ifølge opfindelsen har et driftstemperaturoptimum beliggende fra 35°C til 37°C.
(4) Fremgangsmåde til måling af styrke;
Enzymernes aktivitet bestemmes på følgende måde:
En enzymprøve sættes til reaktionsblandingen, der indeholder 50 mM tris-saltsyrepufferopløsning (pH = 7,5), 5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 5 mM β-mercaptoethanol og 0,1 mg DNA for at den enzymatiske reaktion kan forløbe. Blandingen behandles ved 37°C i 50 minutter. Som følge af, 14 145951 at der ikke iagttages dannelse af et syreopløseligt nucleotid i væsken efter reaktionen, underkastes reaktionsproduktet elektroforese under anvendelse af en agarosegel eller en neutral sucrosegradient ved centrifugalseparation til undersøgelse af spaltningen af substrat DNA'et.
(5) Inhibering, aktivering og stabilisering;
Hvert af enzymerne ifølge den foreliggende opfindelse akti-2+ veres af 1 - 20 millimol Mg , men en cofaktor såsom ATP eller S-adeno- sylmethionin er unødvendig, og aktiviteten inhiberes af mere end 20 2+ millimol Mg eller mere end 0,2 mol NaCl. Enzymet (Bpu 13871 af Bacillus pumillus AHU 1387 aktiveres af 0,1 - 0,2 M NaCl.
(6) Rensningernetode:
En metode til rensning af enzymerne ifølge opfindelsen eksemplificeret ved R.Bam F og R.Bpu 1387 er vist i det følgende:
Celler »* behandles med lysozym
Sprænges ved lydbehandling
Centrifugeres (80.000 g i 90 minutter ved 2°C) supernatant) (Fraktion X) * · 1/4 rumfang 5% streptomycinsulfat opløst i pufferopløsning A tilsættes ! supernatant) (Fraktion II)
Substans udfældet med ammoniumsulfat med en mætning på fra 40% til 60%
Opløses i puffer A (ammoniumsulfatfraktion) r \ f \
Streptomycinsulfatfraktion fra Ammoniumsulfatfraktion fra
Bacillus amyloliquefaciens Bacillus pumillus AHO 1387 ATCC 23350 ΓΊ 1 Ί· . ^ ^ gelfiltrering på AcA34 chromatograferes på en (i nærvær af 0,3M NaCl) DEAE-cellulosesøjle (aktiv fraktion) (0,05M - 0,16M NaCl-fraktion) ' * '· chromatografering på R. BamF phosphocellulosesøjle (0,4M - 0,55M NaCl-fraktioner) R. Bpu 1387 15 145951
Enzymerne Bsu 1145 og Bce 14579 fremkommer direkte fra ovennævnte fraktion I. Enzymerne BsuM, Bsu 6633, Bsu 1193, Bsu 1231, Bsu 1192, Bsu 1076, Bsu 1114, Bam K, Bsu 1259, Bce R, Bce 170, Bsu 1247,
Bce 1229, Bme 205, Bme 877 og Bsp 1286 fremkommer direkte fra ovennævnte fraktion II.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen vil nu blive beskrevet detailleret i forbindelse med nedenstående eksempler.
Eksempel 1
Bacillus pumillus 1387 for-kultiveredes i 500 ml af et hjer-ne-hjerte-infusionskulturmedium ved 30°C i 13 - 15 timer ved rystekulturmetoden. Det forkultiverede medium suspenderedes i 10 liter af et Cl-næringssubstrat med følgende sammensætning: 120 g Κ2ΗΡ0^, 4 g algininhydrochlorid, 280 g KH2P04, 100 g glucose, 20 g natriumcitrat, 4 g MgS04, 40 g ammoniumsulfat, 0,5 g tryptophan og 4 g Casaminosyre (fraregnet vitaminer).
Rystedyrkningen gennemførtes ved 37°C i 6 timer, hvorved der fremkom dyrkede celler i det indledende stadium af den stationære fase. Den således fremkomne kulturvæske underkastedes centrifugal separation ved den kontinuerte, kølede centrifugalsepareringsmetode, hvorved der fremkom ca. 13 g celler. Cellerne suspenderedes i 20 ml pufferopløsning A (indeholdende 20 mM tris-HCl-pufferopløsning (pH - 7,2), 0,1 MM EDTA, 2 mM MgCl2 og 2 mM β-mercaptoethanol), og 13 m æggehvide--·.lysozym tilsattes til suspensionen. Den resulterende suspension fik lov til stille at henstå ved 37°C i 35 minutter og underkastedes lydbehandling (20 Kc, 15 sekunder, 4 gange) og derefter kølet centrifugalseparation ved 75.000 G i 60 minutter. Derefter tilsattes 10 ml af en 5% streptomycinsulfatopløsning til supernatanten under omrøring, og væsken omrørtes i 20 minutter og underkastedes kølecentrifugalsepara-tion. Supernatanten opsamledes.
Ammoniumsulfat sattes til supernatanten under omrøring over en periode på 30 minutter, således at en koncentration på 35% af mætning nåedes. Blandingen omrørtes i 20 minutter. Det resulterende pre-cipitat fjernedes ved kølet centrifugalseparation,og ammoniumsulfat tilsattes til supernatanten under omrøring over en periode på 30 minutter, således at en koncentration på 65% af mætning nåedes. Blandingen omrørtes i 30 minutter. Det fremkomne precipitat opsamledes ved fryse-centrifugalseparation og opløstes i ovennævnte pufferopløsning A, og denne fraktion dialyseredes imod pufferopløsningen natten over.
Den dialyserede fraktion påførtes en søjle af Ultrogel AcA 34 ekvilibreret med puffer A tilsat Q,3M NaCl og 10% glycerol. Eluatet 16 145951 fra søjlen med samme pufferopløsning dialyseredes imod puffer A tilsat 10% glycerol.
Den dialyserede fraktion adsorberedes på phosphocellulose (p 11; 1 cm x 12 cm) ekvilibreret med pufferopløsningen A, efterfulgt af vask med pufferopløsningen A. Derefter gennemførtes elueringen med puf fer opløsningen A med en lineær NaCl-koncentrationsgradient på fra 0 til 0,7 M, og det viste sig, at det ønskede nye enzym (Bpu 1387) elue-redes mellem 0,4 og 0,55 M NaCl.
Eksempel 2
Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23350 dyrkedes i 1.000 ml af et Cl næringssubstrat som beskrevet i Eksempel 1. Cellerne (ca. 3 g), som befandt sig i det indledende stadium af den stationære fase, behandledes med æggehvidelysozym, lyd og streptomycinsulfat som beskrevet ovenfor.
Supernatantvæsken fremkommet ved centrifugalseparering af streptamycinsulfatfraktionen adsorberedes på DEAE-cellulosesøjle (DE52: 1 x 10 cm) ekvilibreret med pufferen A og efterfulgt af vask med samme puffer. Elueringen gennemførtes med pufferopløsningen A med en lineær gradient på fra 0 til 1,0 M NaCl.
Det nye enzym (Bam F) elueredes mellem 0,05 og 0,16 M NaCl i pufferopløsningen A.
Eksempel 3 I stedet for de i eksemplerne 1 og 2 anvendte mikroorga·'-nismer dyrkedes de øvrige mikroorganismer ifølge opfindelsen under de i eksempel 1 beskrevne forhold.
Fra fraktion I opnåedes de nye enzymer Bsu 1145 og Bce 14579.
Fra fraktion II opnåedes de nye enzymer Bsu M, Bsu 6633,
Bsu 1193, Bsu 1231, Bsu 1192, Bsu 1076, Bsu 1114, Bam K, Bsu 1259,
Bce R, Bce 170, Bsu 1247, Bce 1229, Bme 205, Bme 899 og Bsp 1286.
Claims (2)
1. Endonucleaser betegnet endonuclease R Bsu M, R Bsu 6633/ R Bsu 1193, R Bsu 1231, R Bsu 1192, R Bsu 1145, R Bsu 1076, R Bsu 1114, R Bam F, R Bam K, R Bsu 1259, RBce 14579, R Bee R, R Bce 170, R Bsu 1247, R Bce 1229, R Bme 205, R Bpu 1387, R Bme 899 og R Bsp 1286, kendetegnet ved, at enzymerne er vundet fra en cellefri ekstrakt af følgende Bacillus-stammer: endonuclease R Bsu M fra Bacillus subtilis ATCC 6051 endonuclease R Bsu 6633 fra Bacillus subtilis ATCC 6633 endonuclease R Bsu 1193 fra Bacillus subtilis IAM 1193 endonuclease R Bsu 1231 fra Bacillus subtilis IAM 1231 endonuclease R Bsu 1192 fra Bacillus subtilis IAM 1192 endonuclease R Bsu 1145 fra Bacillus subtilis IAM 1145 endonuclease R Bsu 1076 fra Bacillus subtilis IAM 1076 endonuclease R Bsu 1114 fra Bacillus subtilis IAM 1114 endonuclease R Bam F fra Bacillus amyloliguefaciens ATCC 23350 endonuclease R Bam K fra Bacillus amylo1iguefaelens IAM 1523 endonuclease R Bsu 1259 fra Bacillus subtilis IAM 1259 endonuclease R Bce 14579 fra Bacillus cereus ATCC 14579 endonuclease R Bce R fra Bacillus cereus Rf sm st ATCC 31293 endonuclease R Bce 170 fra Bacillus sp. No.170 ATCC 31292 endonuclease R Bsu 1247 fra Bacillus subtilis IAM 1247 endonuclease R Bce 1229 fra Bacillus cereus IAM 1229 endonuclease R Bme 205 fra Bacillus megaterium B205-3 ATCC 31294 endonuclease R Bpu 1387 fra Bacillus pumillus AHU 1387 endonuclease R Bme 899 fra Bacillus megaterium IAM 1030, og endonuclease R Bsp 1286 fra Bacillus sphaericus IAM 1286.
2. Fremgangsmåde til fremstilling af endonueleaserne ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Bacillus' subtilis ATCC 6051, Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus subtilis IAM 1193, Bacillus subtilis IAM 1231, Bacillus subtilis IAM 1192, Bacillus subtilis IAM 1145, Bacillus subtilis IAM 1076, Bacillus subtilis IAM 1114, Bacillus amylQl i'guef ae lens ATCC 23350, Bacillus arnyloliguefaciens IAM 1523, Bacillus subtilis IAM 1259, Bacillus cereus ATCC 14579, Bacillus cereus Rf sm st ATCC 31293, Bacillus sp. No.170 ATCC 31292, Bacillus subtilis IAM 1247, Bacillus cereus IAM 1229, Bacillus megaterium B2Q5-3 ATCC 31294, Bacillus pumillus AHU 1387, Bacillus megaterium IAM 1030 eller Bacillus sphaericus IAM 1286 dyrkes i et næringssubstrat, hvorpå
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8788376A JPS5315491A (en) | 1976-07-23 | 1976-07-23 | Preparation of novel nucleicacidase |
| JP8788376 | 1976-07-23 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK333977A DK333977A (da) | 1978-01-24 |
| DK145951B true DK145951B (da) | 1983-04-25 |
| DK145951C DK145951C (da) | 1983-09-26 |
Family
ID=13927260
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK333977A DK145951C (da) | 1976-07-23 | 1977-07-22 | Endonucleaser og fremgangsmaade til fremstilling heraf |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4161424A (da) |
| JP (1) | JPS5315491A (da) |
| DE (1) | DE2733273C3 (da) |
| DK (1) | DK145951C (da) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5519058A (en) * | 1978-07-28 | 1980-02-09 | Rikagaku Kenkyusho | Preparation of nuclease |
| JPS56140888A (en) * | 1980-04-02 | 1981-11-04 | Yakult Honsha Co Ltd | Preparation of limiting enzyme |
| US5173418A (en) * | 1985-05-10 | 1992-12-22 | Benzon Pharma, A/S | Production in Escherichia coli of extracellular Serratia spp. hydrolases |
| IL78703A (en) * | 1985-05-10 | 1993-02-21 | Benzon Alfred | Method of producing extracellular enzymes, the enzymes produced thereby and compositions containing them; a hybrid plasmid and a dna fragment comprising dna encoding the enzymes; a microorganism harbouring the plasmid; and a method for removing nucleic acids from biological materials |
| US5200336A (en) * | 1990-07-02 | 1993-04-06 | New England Biolabs, Inc. | Restriction endonuclease obtainable foam bacillus coagulans and a process for producing the same |
| EP0555797A1 (en) * | 1992-02-10 | 1993-08-18 | Becton, Dickinson and Company | General buffer for restriction endonucleases |
| JPH07100383A (ja) * | 1993-10-06 | 1995-04-18 | Mitsubishi Chem Corp | 共役ジエンのアシロキシ化触媒及びこれを用いた不飽和グリコ−ルジエステルの製造法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS517747B2 (da) * | 1973-10-11 | 1976-03-10 | ||
| US3990324A (en) * | 1974-03-07 | 1976-11-09 | The Goodyear Tire & Rubber Company | Vibration damper and method of making said damper |
| JPS5247980A (en) * | 1975-10-08 | 1977-04-16 | Rikagaku Kenkyusho | Method of preparing new nuclease |
| US4064011A (en) * | 1977-03-16 | 1977-12-20 | Gesellschaft Fur Biotechnologische Forschung Mbh | Process for producing ECoRI restriction endonuclease with E.coli mutants |
-
1976
- 1976-07-23 JP JP8788376A patent/JPS5315491A/ja active Granted
-
1977
- 1977-07-18 US US05/816,541 patent/US4161424A/en not_active Expired - Lifetime
- 1977-07-22 DE DE2733273A patent/DE2733273C3/de not_active Expired
- 1977-07-22 DK DK333977A patent/DK145951C/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE2733273A1 (de) | 1978-01-26 |
| JPS5315491A (en) | 1978-02-13 |
| US4161424A (en) | 1979-07-17 |
| DK145951C (da) | 1983-09-26 |
| JPS5622512B2 (da) | 1981-05-26 |
| DK333977A (da) | 1978-01-24 |
| DE2733273B2 (de) | 1979-01-25 |
| DE2733273C3 (de) | 1979-11-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Letourneau et al. | Keratinolytic activity of Streptomyces sp. S. K1–02: a new isolated strain | |
| Tiwari et al. | Enhanced production and characterization of a solvent stable amylase from solvent tolerant Bacillus tequilensis RG‐01: thermostable and surfactant resistant | |
| Pathak et al. | Isolation and characterization of salt stable protease producing archaea from marine solar saltern of Mulund, Mumbai | |
| Babaeipour et al. | A proposed feeding strategy for the overproduction of recombinant proteins in Escherichia coli | |
| DK145951B (da) | Endonucleaser og fremgangsmaade til fremstilling heraf | |
| Bilimoria | Conditions for the production of L-asparaginase 2 by coliform bacteria | |
| CHRISTENSEN | Synonymy of Flavobacterium pectinovorum Dorey with Cytophaga johnsonae Stanier | |
| CN105199983A (zh) | 一株解淀粉芽孢杆菌及其产生的蛋白酶在制革脱毛方面的应用 | |
| CN102071157A (zh) | 一株自养硝化细菌及其筛选和鉴定方法 | |
| Roy | Enzymatic production of L-tryptophan by a thermophilic strain of Bacillus licheniformis isolated from a local hot Spring of Paniphala, Asansol area of West Bengal | |
| US4259446A (en) | Process for preparation of deoxyribonucleases | |
| Asscher et al. | Vaginal sulphhydryl and disulphide groups during the oestrous cycle of the mouse | |
| US3956064A (en) | Deoxyribonuclease and process for its preparation | |
| DK145700B (da) | Endonucleaser samt fremgangsmaade til fremstilling heraf | |
| Koike et al. | NADP-specific glutamate dehydrogenase from alkaliphilic Bacillus sp. KSM-635: purification and enzymatic properties | |
| JPH02100674A (ja) | 細菌の培養法 | |
| JP2597849B2 (ja) | リゾチーム阻害物質 | |
| JPS6075283A (ja) | 新菌株 | |
| JPH05236955A (ja) | 耐熱性アルカリホスファターゼの製造法 | |
| JPS63313580A (ja) | 蟻酸脱水素酵素 | |
| JPS60184384A (ja) | Ν−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法 | |
| JPS60241888A (ja) | 新規ヒダントイナ−ゼ | |
| JPS58152482A (ja) | 耐熱性蛋白分解酵素アクアライシンｉおよびその製造法 | |
| JPH04211359A (ja) | 新規微生物 | |
| Hirunmitnakorn | Studies on acid phosphatase in staphylococci |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |