-
Verfahren zur Herstellung zinkreicher Insulin-Komplexverbindungen
Unter »zinkreichen Insulin-Komplexverbindungen« sollen im folgenden solche mit einem
Zinkgehalt von mehr als i % verstanden werden. Kristallinische Zink-Insuline mit
bis zu 2°/o Zink sind bereits bekannt: Man erhält sie z. B. dadurch, daß zinkarme
Insulinkristalle in einer Acetatpufferlösung, der etwas Zn CI2 zugesetzt ist, bei
neutralem pA suspendiert werden. Hierbei dürfen jedoch keine zinkaffinen Substanzen,
z. B. Phosphat-, Citrat-, Malationen, anwesend sein, da diese die Aufnahme des Zinks
durch das Insulin verhindern.
-
Es wurde nun gefunden, daß man neue zinkreiche Insulin-Komplexverbindungen
erhalten kann, indem man Insulin mit Zink-Komplexverbindungen von Aminosäuren mit
hoher Zinkaffinität, z. B. Histidin, Kynurenin, Arginin und Cystein, umsetzt.
-
Man geht von einem möglichst kristallinen, sta-. bilen Zink-Komplex
aus, in welchem das Zink mit zwei oder drei Liganden koordinativ fest verbunden
ist. Nun ersetzt man einen der Liganden durch Insulin, so daß ein gemischter Zink-Komplex
der schematischen Zusammensetzung Insulin-Zn-R entsteht.
-
Man geht dabei z. B. so vor, daß man in die wäßrige Lösung des -betreffenden
Zink-Komplexes bei px 6 bis 8 amorphes oder kristallinisches zinkarmes Insulin einbringt,
worauf spontan der Eintritt
des Insulins in den Zink-Komplex erfolgt.
Dabei ist es zweckmäßig, den Zink-Komplex, von dem man ausgeht, in erheblichem molarem
Überschuß gegenüber dem Insulin einzusetzen.
-
In-den so gewonnenen InsulinJZn-R-V#erbindungen befindet sich der
Rest R wie das Insulin in fester koordinativer Bindung am Zink; berechnet man den
Zinkgehalt auf den Insulinanteil, so erge')en sich je nach den angewandten Versuchsbedingungen
Präparate mit Zinkgehalten von etwa- i bis 2,50/0.
-
Arbeitet man z. B. mit a-Aminosäuren., etwa mit Histidin, so läuft
schematisch- folgende Reaktion ab: Histidin-Zn-Histidin -I- Insulin> Insulin-Zink-Histidin
+ Histidin.
-
Der Beweis, daß es sich bei dem erhaltenen Produkt um einen Insulin-Zink-Histidin-Komplex
handelt, läßt sich auf Grund des gegenüber dem Ausgangsinsulin erhöhten Zink- und
N-Gehaltes sowie durch den papierchromatographischen Nachweis des in der neuen Verbindung
enthaltenen Histidins führen.
-
Viele Substanzen, die als starke und stärkste Zink-Komplexbildner
bekannt sind, eignen sich besonders gut für-das neue Verfahren. Daraus ergibt sich
ein wesentlicher Unterschied zu den bisher bekannten Methoden (s. o.) : Das neue
Verfahren gestattet die Gewinnung zinkreicher Insulinpräparate trotz Gegenwart und
mit Hilfe zinkaffiner Substanzen.
-
Die Festigkeit der in den. gewonnenen Insulin-Zn-R-Verbindungen vorliegenden
Chelatbindungen geht unter anderem daraus hervor, daß trotz intensiven Waschens
mit Wasser nur Spuren von Zink oder des. Liganden R daraus zu entfernen sind. Als
qualitive und quantitative Nachweismethoden für den in den Insulin-Zn-R-Präparaten
enthaltenden Liganden R sind geeignet: 1. Papierchromatographie im sauren Medium,
z. B. Insulin-Zink-Histidin, Insulin-Zink-Arginin; 2. Kolorimetrie des sauer gelösten
Präparates, z. B. bei Insulin-Zink-Xanthurensäure, Insulin-Zink-Kynurensäure; 3.
N-Analyse, falls der Ligand der N-Gehalt des Ausgangsinsulins verändert, z. B. bei
Insulin-Zink-Histidin, Insulin-Zink-Arginin.
-
Die durch das beschriebene Verfahren erhaltenen Präparate sind in
Wasser bei neutralem pH sehr schwer löslich; in saurem Mittel dissoziieren sie wie
die meisten Zink-Komplexe. Injiziert man sie intravenös, so tritt die blutzuckersenkende
Wirkung praktisch ebenso rasch wie bei gewöhnlichem Insulin ein. Bei intramuskulärer
oder subcutaner Injektion ist die Wirkung jedoch mehr oder weniger stark verzögert.
-
Mit dem vorliegenden Verfahren gelingt es, einen gemischten Zink-Komplex
des Insulins herzustellen, in welchem sich der betreffende Ligand in fester Bindung
befindet. Dadurch, daß die Valenzen des Zinks teils im Insulin, teils von dem betreffenden
Liganden abgesättigt werden, unterscheiden sich die beanspruchten Produkte von den
bisherigen Zink-Insulin-Verbii.,iungen, in welchen sämtliche Valenzen des Zinks
vom Insulin selbst abgesättigt sind. In den neuen Insulin-Zink-Präparaten liegen
zumeist Komplexe vor, die einen geringeren Dissoziationsgrad besitzen als gewöhnliches
Zink-Insulin. Für das Verhalten im lebenden Gewebe hat die Geschwindigkeit des Komplexzerfalls
bekanntlich große Bedeutung. Ein weiterer Fortschritt des Verfahrens liegt darin,
daß z. B. Löslichkeit und Eigen-p11, je nach der Art des als Zink-Komplex eingeführten,
stark zinkaffinen Liganden, variiert werden können, denn man kann z. B. stark basische,
aliphatische oder cyclische, von Aminosäuren sich ableitende Liganden fest mit Insulin
verknüpfen. Beispiels Insulin-Zink-Kynurenin 2o,8 mg (o,i mMol) d, 1-Kynurenin löst
man in Acetatpuffer und gibt 4m9 Zink hinzu. Nach Stehenlassen über Nacht filtriert
man von einem etwaigen Niederschlag ab, stellt den PH auf 6,8 ein und gibt 2omg
kristallines Insulin mit einem Zinkgehalt von 0,3 % zu. Nach 2stündigem gelindem
Schütteln, Abzentrifugieren und Waschen mit Wasser, Aceton und Äther trocknet man
das Verfahrensprodukt im Exsikkator. Die Ausbeute beträgt 16,9 mg. Der Zinkgehalt
des erhaltenen Insialin-Zink-Kynurenins beträgt 1,8°/o. Papderchromatographisch
beträgt sein Kynureningehalt etwa 5 0/0. Beispiel'2 Insulin-Zink-Histidin
30 mg kristallisiertes Zink-Histidin (Zinkgehalt 15 0/c,) löst man in 3ö
ccm Wasser und gibt Zoo mg Insulin (Zinkgehalt o,2 bis o,5 °/o) hinzu. Nach 2stündigem
gelindem Aufwirbeln der entstandenen Suspension zentrifugiert man ab, wäscht zweimal
finit Wasser, einmal mit Aceton und Äther und trocknet im Vakuum. Das erhaltene
Insulin-Zink-Histidin besitzt einen Zinkgehalt von 1,5 bis 2% und einen im Vergleich.
zum Ausgangsinsulin um t 1/o oder mehr erhöhten N-Gehalt.