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Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Eiweißstoffen und Autolyse
von tierischen Geweben Bei den Verfahren, die bei der enzymatischen Hydrolyse von
Eiweißstoffen oder bei der Autolyse von tierischen Organen bisher angewandt wurden,
ist es nicht möglich, in zuverlässiger Weise die Entwicklung von Mikroorganismen
zu verhindern. Die als Hydrolysemittel verwendeten Handelspräparate, wie Pepsin,
Papain, Pankreatin, sind in der Tat selten gänzlich frei von mikroben Keimen. Selbst
wenn man die Pankreasdrüse verwendet, die eine sehr schnelle Hydrolyse erlaubt,
ist es nötig, auf frische Organe zurückzugreifen und mit besonderer Vorsicht vorzugehen,
um Keime auszuschließen. Bei den Verfahren zur Autolyse von Geweben ist es erforderlich,
die Wegnahme der zu autolysierenden Gewebe so aseptisch wie möglich vorzunehmen,
wobei selbst dieses Verfahren keine absolute Sicherheit gibt und ein Hindernis für
die praktische Anwendung dieses Verfahrens bildet.
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Die am Anfang der obenerwähnten Verfahren fast unvermeidliche Aufnahme
von Keimen verursacht, daß die bei diesen Verfahren entstandenen Spaltprodukte der
Eiweißstoffe sehr oft Aminosäuren als Abbaustoffe, wie Histamin, verschiedene giftige
Stoffe und Fieber erzeugende Stoffe enthalten, die sich bei der Umwandlung der Mikroorganismen
im Verlaufe der Hydrolyse bilden.
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Diese giftigen Substanzen zeigen, insbesondere im Falle der Peptone
und der injizierbaren Eiweißhydrolysate, schädliche Eigenschaften bei ihrer industriellen
und wissenschaftlichen Anwendung, insbesondere
bei ihrer therapeutischen
Anwendung bei Menschen oder Tieren. Ihre weitgehende Beseitigung nach verschiedenen
Verfahren ist oft schwierig.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hydrolyse von Eiweißstoffen,
wobei als Hydrolysemittel ein beliebiges handelsübliches enzymatisches Präparat
oder frische oder gefrorene Organe ohne Entwicklung von Mikroorganismen verwendet
werden, selbst wenn man diese Mittel ohne besondere Vorsichtsmaßnahmen anwendet.
nie hierbei erhaltenen Endprodukte sind frei von giftigen Stoffen.
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Ferner wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die Autolyse der
Gewebe ein praktisch leicht durchzuführendes Verfahren. Ferner kann man nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren die Hydrolyse der Eiweißstoffe derart weit treiben,
daß das Verhältnis von Amidstickstoff zu dem Gesamtstickstoff der Umwandlungsprodukte
72 °/o erreichen kann.
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Schließlich kann man nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die Pankreasdrüsen
als Hydrolysemittel allgemein anwenden.
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Nach diesem Verfahren kann man direkt ohne weitere Reinigung Endprodukte
erhalten, die frei von Histamin und giftigen Stoffen sind.
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Erfindungsgemäß wird bei der gewünschten Hydrolyse außer dem hydrolysierenden
Mittel ein Gemisch eines flüchtigen antiseptischen Mittels, wie Toluol oder Chloroform,
mit zwei antibiotischen Stoffen, wie Penicillin und Streptomycin, verwendet. Dieses
Gemisch verhindert die Entwicklung von Mikroorganismen, ohne den fermentativen Mechanismus
zu hindern. Die Mengenverhältnisse dieser drei Stoffe richten sich nach den jeweils
verwendeten Ausgangsstoffen. Es können bei einem Präparat z. B. folgende Mengen
angewendet werden:
| Chloroform . . ¢ °% |
| Penicillin ... 8ooo Oxfordeinheiten |
| Streptomycin o,o8 g |
bei. einem anderen folgende Mengen:
| Chloroform . . 2 °/o |
| Penicillin ... 5000 Oxfordeinheiten |
| Streptomycin 0,03 g |
Je nach Art des zu hydrolysierenden Stoffes und des gewünschten Hydrolysegrades
kann das Verhältnis von Hydrolysemittel zu den Eiweißstoffen geändert werden. Ebenso
können die Bedingungen der Wasserstoffionenkonzentration, der Temperatur, der Dauer
und der Verdünnung hierbei geändert werden. Optimale Arbeitsbedingungen können hierbei
gewählt werden, ohne befürchten zu müssen, daß diese optimalen Bedingungen für die
Entwicklung der Mikroorganismen besonders hinderlich wären.
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Das Verfahren der Hydrolyse ist im allgemeinen genau dasselbe wie
bei den bekannten Verfahren, wobei die Eiweißstoffe in einem wäßrigen Medium mit
verschiedenen Hydrolysemitteln unter optimalen Bedingungen der Verdünnung, der Temperatur
und des p11-Wertes in Berührung gebracht werden. Aber das Verfahren wird durch die
Zugabe von Gemischen antiseptischer Mittel aus Penicillin, Streptomycin und insbesondere
der Chloroform-Penicillin-Streptomycin-Mischung vervollständigt.
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Jede Hydrolyse wird bis zu einem konstanten pH-Wert durchgeführt,
dessen Wert von der Art des zu hydrolysierenden Stoffes und dem gewünschten Hydrolysegrad
abhängt. Die nicht umgewandelten Eiweißstoffe können gegebenenfalls durch Kochen
entfernt werden. Nach dem Filtrieren können die erhaltenen Flüssigkeiten gegebenenfalls
mit Kohle entfärbt oder über besondere adsorbierende Stoffe filtriert werden. Das
Filtrat kann in vorliegender Form verwendet, konzentriert oder zur Trockne eingedampft
werden.
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Die erhaltenen pulverförmigen Produkte zeigen folgende Merkmale: Sie
sind hygroskopische Pulver von charakteristischem Geruch 'und Geschmack, deren Feuchtigkeitsgehalt
ungefähr 5 °/o beträgt. Sie sind gänzlich oder teilweise in Wasser löslich und sind,
was wichtig ist, frei von giftigen Produkten, insbesondere von Fieber erzeugenden
Stoffen oder Histamin.
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Der Gehalt an Gesamtstickstoff beträgt zwischen 12 und 14 "/,. Ihr
Gehalt an Amidstickstoff, der nach dem Verfahren von Sörensen bestimmt wurde, schwankt
zwischen 5 und 90/,. Das Verhältnis von Amidstickstoff zu dem Gesamtstickstoff
schwankt zwischen 25 und 72 °/o. Es ist bemerkenswert, daß der Gehalt von 7z"/,
erreicht werden kann, während die besten bisher bekannten Verfahren 651)[, nicht
überschritten.
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Die Erfindung ist anwendbar erstens bei den meisten enzymatischen
Hydrolyseverfahren von Eiweißstoffen, wobei das Hydrolysemittel handelsübliches
Pankreatin, Pepsin oder Erepsin oder auch die frische Bauchspeicheldrüse oder gefrorene
Bauchspeicheldrüse verschiedener Tiergattungen sein kann; zweitens bei der Autolyse
von verschiedenen Organen und tierischen Geweben, wobei das oben beschriebene Verfahren
die aseptische Wegnahme des Gewebes unnötig macht.
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Man kann nach diesem Verfahren die meisten tierischen oder vegetabilen
Eiweißstoffe behandeln, insbesondere Kasein,. Parakasein, Lactalbumin, Blut, Muskel,
Gelatine, Fibrin, Fischeiweiß, vegetabiles Eiweiß, verschiedene tierische Organe,
z. B. Leber, Milz, Schleimhaut vom Darm und Magen.
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Die Hauptvorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens bestehen, wie schon
oben beschrieben, in der Möglichkeit, als Hydrolysemittel frische oder eingefrorene
Organe zu verwenden, die ohne besondere Vorsichtsmaßnahmen erhaltenwurden.Fernerbestehen
die Vorteile der Erfindung darin, daß man auch Handelspräparate verwenden kann,
wobei die Mikroorganismen, die gegebenenfalls in den Ausgangsprodukten der Hydrolyseversuche
zugegen sein können, diese nicht hindern. Die Erfindung erlaubt auch das Arbeiten
bei optimalen Bedingungen der Temperatur, des pH-Wertes, der Verdünnung und der
Dauer. Die erhaltenen Endprodukte sind frei von giftigen, Fieber erzeugenden Abbauprodukten
oder Histamin. Sie sind sehr oft frei von Aktivität gegenüber Meerschweinchendärmen,
gegenüber dem Blut des Hundes und erzeugen weder bei Menschen noch bei Tieren einen
Schock. Schließlich wird. der Amidstickstoff der
Eiweißstoffe in
Form von nicht racemischen Aminosäuren in Freiheit gesetzt, d. h. in ihrer optischphysiologisch-aktiven
Form und, wie oben beschrieben, in Mengen, die 720/, des Gesamtstickstoffes
erreichen können.
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In den nach diesem Verfahren hergestellten Proteolysaten, insbesondere
aus Kasein und Parakasein, sind die für das Wachstum der tierischen Organismen unentbehrlichen
Aminosäuren in den hierfür nötigen Gleichgewichtsmengen vorhanden. Diese Präparate,
die lediglich aus Eiweißstickstoff hergestellt sind, können das Wachstum und die
richtige Ernährung des Organismus sicherstellen.
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Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren und
zeigen, daß das vorliegende Verfahren ebenso leicht durchzuführen ist wie die bisher
bekannten Verfahren.
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Beispiel i Peptone des Kaseins oder des Parakaseins Folgende Mischung
wurde einem fermentativen Abbau unterworfen
| Kasein oder Parakasein .... iooo;o g |
| Frische oder eingefrorene |
| Schweine- oder Rinder- |
| bauchspeicheldrüsen ..... 2oo,o g |
| Destilliertes Wasser. . . . . . . . 8ooo,o ccm |
| Chloroform . . . . . . . . . . . . . . . 12,0 ccm |
| Penicillin . . . . . . . . . . . . . . . . 2oooo,o Oxfordeinheiten |
| Streptomycin . . . . . . . . . . . . . - o,io g |
Unter fermentativem Abbau der Eiweißstoffe versteht man die Überführung der Eiweißstoffe
in kleinere Moleküle unter dem EinflÜß von Fermenten, sogenannten Hydrolasen.
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Der pii-Wert der obigen Mischung wurde mit einem Puffer, z. B. Natriumphosphat
oder Natriumcarbonat, auf 6,8 bis 7 eingestellt. Das Gemisch wurde 8 bis 48 Stunden
einem fermentativen Abbau unterworfen, wobei die Temperatur 38 bis 40° betrug. Die
erhaltene Flüssigkeit wurde einige Minuten zum Kochen erhitzt. Hierauf wurde sie
abfiltriert, konzentriert und zur Trockne eingedampft.
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Beispiel 2 Peptone des Muskels Ein Gemisch folgender Zusammensetzung
wurde fermentativ abgebaut:
| Entfettetes und gehacktes |
| Ochsenfleisch . . . . . . . . . . . iooo,o g |
| Frische oder gefrorene |
| Schweine- oder Rinder- |
| bauchspeicheldrüsen ..... 2oo,o g |
| oder Handelspankreatin .... io,o g |
| Destilliertes Wasser. . . . . . . . 5000,0 ccm |
| Chloroform . . . . . . . . . . . . . . . 10,0 ccm |
| Penicillin . . . . . . . . . . . . . . . . 2oooo,o Oxfordeinheiten |
| Streptomycin . . . . . . . . . . . . . 0,20 g |
Der pH-Wert des Gemisches wurde auf 7 eingestellt, wobei man nach dem im Beispiel
i beschriebenen Verfahren verfuhr. Beispiel 3 Hydrolysat des Kaseins oder des Parakaseins
Folgendes Gemisch wurde einem fermentative Abbau unterworfen:
| Kasein oder Parakasein .... iooo,o g |
| Frische oder eingefrorene |
| Schweine- oder Rinder- |
| bauchspeicheldrüsen ..... 2ooo,o g |
| Destilliertes Wasser. . . . . . . . ioooo,o ccm |
| Chloroform . . . . . . . . . . . . . . . 40,0 ccm |
| Penicillin . . . . . . . . . . . . . . . . 75ooo,o Oxfordeinheiten |
| Streptomycin . . . . . . . . . . . . . 01759 |
Man stellt das Präparat bei einer Temperatur von 40° während 5 bis 7 Tagen auf einen
pH-Wert von 6,8 ein. Das erhaltene Produkt wird hierauf aufgekocht, filtriert und
das Filtrat direkt verwendet oder in konzentrierter oder zur Trockne eingedampfter
Form gebraucht. Im Falle des mittels Säuren gefällten Kaseins entfärbt man das Hydrolysat
vor dem Filtrieren mit Tierkohle.
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Beispiel 4 Hydrolysat der Leber Folgendes Gemisch wurde einem fermentativen
Abbau unterworfen
| Schweine-, Ochsenoder Kalbs- |
| leber in frischem oder gefro- |
| renem Zustand . . . . . . . . . . -iooo,o g |
| Frische oder eingefrorene |
| Schweine- oder Rinder- |
| bauchspeicheldrüse ....... 250,09 |
| Destilliertes Wasser. . . . . . . . . 2ooo,o g |
| Chloroform . . . . . . . . . . . . . . . . 4,0 ccm |
| Penicillin . .... ... ... ... . . . iooo,o Oxfordeinheiten |
| Streptomycin . . . . . . . . . . . . . . 0,0259 |
Das Gemisch wurde innerhalb i2 Stunden bei einer Temperatur von 40° auf einen pH-Wert
von 6 eingestellt. Das erhaltene Produkt wurde aufgekocht und über Infusorienerde
filtriert. Die erhaltene Flüssigkeit kann nach der Filtration direkt verwendet oder
in konzentrierter oder zur Trockne eingedampfter Form gebraucht werden.
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Beispiel 5 Autolysat der Leber In einem sterilen Behälter wurde folgendes
Gemisch einem fermentativen Abbau unterworfen, wobei als Hydrolasen die in dem betreffenden
Organ selbst enthaltenen Fermente verwendet wurden:
| Ochsen-, Schweine- oder Kalbs- |
| leber in gehacktem Zustand iooo,o g |
| 8°/oige Natriumchloridlösung |
| in destilliertem Wasser .... 5oo,o g |
| Chloroform . . . . . . . . . . . . . . . . 2,0 ccm |
| Penicillin . . . . . . . . . . . . . . . . . 8ooo,o Oxfordeinheiten |
| Streptomycin . . . . . . . . . . . . . . o,o6 g |
Dieses Gemisch wurde im Durchschnitt 24 bis 72 Stunden behandelt. Das erhaltene
Autolysat wurde über Leinen filtriert. Nach dem Auspressen wurde die
erhaltene
Flüssigkeit aufgekocht, über Infusorienerde filtriert, konzentriert und zur Trockne
eingedampft.
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Alle nach diesem Verfahren erhaltenen .Produkte sind frei von Eiweißabbauprodukten,
die von Mikroorganismen verursacht worden sind, insbesondere von Histamin.