DE1296307B

DE1296307B - Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Brucella-abortus-Infektionen

Info

Publication number: DE1296307B
Application number: DEW39222A
Authority: DE
Inventors: Cameron John
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1964-05-26
Filing date: 1965-05-25
Publication date: 1969-05-29
Also published as: GB1091595A; NL6506713A; ES313427A1; BE664557A; DK109646C; US3449209A; IL23597A; FR1459781A; NL146215B; IT1053253B; CA940827A; BR6569934D0

Description

1 2

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Her- Gew./Vol. in dem Medium. Eine Kohlenstoffquelle,

stellung eines Impfstoffes gegen Brucella-abortus- welche aus ungefähr 25% Gew./Gew. Fructose und

Infektionen durch Kultur des Stammes S 19 in einem ungefähr 75% Gew./Gew. Glucose besteht, ist bei-

Nährmedium mit einer gegebenenfalls Glucose ent- spielsweise geeignet.

haltenden Kohlenstoffquelle und Gefriertrocknung 5 Für den Zweck der vorliegenden Erfindung kann der Kultur, gegebenenfalls unter Zusatz von Saccha- irgendein Wuchsmedium verwendet werden, welches, rose". zusätzlich zu einer solchen Kohlenstoffquelle, die Es ist bekannt, avirulente Stämme von Brucella üblichen und notwendigen Nährstoffe enthält, wie abortus, wie der Stamm S 19, zur Herstellung eines eine Stickstoffquelle, anorganische Materialien, Lebendvakzins gegen infektiöse Aborte bei Rindern 10 Wuchsfaktoren, Sauerstoff und Kohlendioxyd,
zu verwenden. Diese Stämme können auf festen Als Stickstoffquelle können Ammoniumsalze oder Oberflächenkulturen oder in belüfteten flüssigen Proteinhydrolysate, welche Aminosäuren enthalten, Kulturen, welche die üblichen Nährstoffe, wie in vorteilhafter Weise verwendet werden. Beispiels-Kohlenstoffquellen, Wachstumsfaktoren und Stabili- weise wurde ein Kaseinhydrolysat oder besonders satoren, enthalten, gezüchtet und dann gefrier- 15 eine Papain-Digestion von Pferdemuskelfleisch als getrocknet werden. Glucose ist eine an sich bekannte geeignet befunden. Gewöhnlich werden Kalium-Kohlenstoffquelle. Für die Herstellung von Brucella- oder Natriumphosphate dem Medium zugegeben, melitensis-Vakzinen ist es bekannt, Saccharose als Vitamine und Wachstumsfaktoren können als Hefe-Stabilisator zu verwenden. extrakte zugegeben werden, und der Sauerstoff-Die Gewinnung wird gewöhnlich so eingestellt, 20 oder Kohlendioxydbedarf kann durch Kontakt mit daß ein Vakzin mit einem Gehalt einer gesetzlich der Luft oder mit einem Gasgemisch geeigneter verordneten Anzahl lebender Organismen von Bru- Zusammensetzung befriedigt werden,
cella abortus pro Dosis erzielt wird. Die Auswahl und Zusammenstellung eines Grund-Solche Vakzine in flüssiger Form haben sogar mediums, das für die Kultivierung eines Stammes unter optimalen Lagerbedingungen bei 0 bis 4°C 25 von Brucella abortus geeignet ist, ist allgemein eine verhältnismäßig kurze Lebensdauer. Während bekannt; derartige Zubereitungen können im Rahmen auf festem Medium Vakzine unter Bildung von der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Da Produkten zufriedenstellender Lagerbeständigkeit ge- der Stamm S 19 von Brucella abortus sich besonders friergetrocknet werden können, verschlechtern sich gut eingeführt hat und für die Verwendung in vielen Kulturen, welche in einem belüfteten flüssigen 30 Ländern obligatorisch ist, ist dieser besondere Stamm Medium gezüchtet und nachfolgend gefriergetrocknet für die Zwecke der vorliegenden Erfindung auch wurden, schnell bei Lagerung. Die Wirkungsfähig» besonders gut geeignet.

keit der Wachstumsstufe ebenso der Gefriertrock- Es können die üblichen Kulturverfahren ver-

nungsstufe und der Lagerungsstufe können durch wendet werden. Das flüssige Medium wird gewöhn-

Lebensfähigkeitsbestimmungen, welche die Anzahl 35 Hch hergestellt durch Lösen der Bestandteile in

der lebenden Organismen vor und nach einem Ver- Wasser, Sterilisieren der Lösung und Einbringen

fahren oder der Lagerung aufzeigen, wiedergegeben der Lösung aseptisch in ein Kulturgefäß. In der

werden. Kultivierungsstufe wird die Temperatur gewöhnlich

Es wurde nunmehr gefunden, daß durch übliche um 35¹C gehalten.

Kultur des Stammes S 19 und Gefriertrocknung die 40 Als Kulturgefäß sind konische Schüttelkolben, Herstellung eines avirulenten Stammes von Brucella die auf einer Schüttelmaschine geschüttelt werden, abortus hoher Lebensfähigkeit dann gelingt, wenn als oder in größerem Bereich Aluminiumtanks oder Kohlenstoffquelle ganz oder teilweise Fructose ver- solche aus rostfreiem Stahl geeignet, aber es können wendet wird. Dies führt zu Produkten vorteilhafter ebenso andere Behältertypen verwendet werden. Aufbewahrungseigenschaften derart, daß sie bei 45 Tanks werden gewöhnlich vom Boden des flüssigen niederen Temperaturen längere Zeit oder bei hohen Mediums belüftet. Das Medium kann ebenso tropischen Temperaturen mehrere Tage ohne schwer- gerührt werden, um einheitliche Bedingungen innerwiegende Verluste Lebensfähigkeit oder sonstigen halb der Kultur zu erhalten. Die Gewinnung kann Verschlechterung, welche die Vakzine unwirksam 2 oder 3 Tage nach der Einimpfung durchgeführt machten, gelagert werden können. Vorzugsweise 5° werden.

wird die Gefriertrocknung in Gegenwart von Saccha- Wie bereits dargelegt, kann die Stabilisierungsrose durchgeführt. wirkung der Fructose bei Gefriertrocknung und Die Fructose ist im Medium üblicherweise in Lagerung durch Zugabe von Saccharose zu dem einer Konzentration von wenigstens 0,1% Gew./Vol. Medium vor dem Gefriertrocknen zusätzlich ver- oder wenigstens 2,5% Gew./Gew., bezogen auf die 55 bessert werden.

Kohlenstoffquelle, enthalten. Irgendeine Standard - Gefriertrocknungs - AusWenn die Kohlenstoffquelle nicht gänzlich aus rüstung, die so eingerichtet ist, daß sie mit einem Fructose besteht, können zusätzlich andere zur Druck um 0,1 mm Hg arbeitet, kann für die vorVermehrung der Organismen geeignete und in aus- liegenden Zwecke geeignet sein. Weder Verdünnung reichender Menge vorliegende Kohlenstoffquellen 60 noch Konzentration durch Zentrifugieren vor dem enthalten sein. Besonders bevorzugt sind Hexosen, Gefriertrocknen scheint eine nachteilige Wirkung im besonderen Glucose und Galaktose. Die Gesamt- auf die Lagerungseigenschaften des nach der vorkonzentration der Kohlenstoffquelle kann anfangs liegenden Erfindung erhaltenen Produktes zu haben, ungefähr 4% Gew./Vol. sein. Innerhalb dieser Die nachfolgenden Beispiele erläutern die ErKonzentration kann das Verhältnis von Fructose 65 findung. . .
verringert werden auf ungefähr 2,5⁰Ai Gew./Gew., Beispiel 1
errechnet für die Gesamtmenge verwendete Kohlen- Das Grundmedium wurde hergestellt durch Lösen stoffquelle, oder auf eine Konzentration von 0,1% in Wasser von 30 Teilen Proteinhydrolysat (eine

Papain-Digestion von Pferdemuskelfleisch mit einem Gehalt von 4,5 g Gesamtstickstoff pro Liter), 1 Teil durch Autolyse gewonnenen, konzentrierten Hefeextrakt, hergestellt durch Messrs. Marmite Ltd., London, 0,16 Teilen Dinatriumhydrogen-orthophosphat und 4 Teilen Fructose zur Herstellung von 100 Teilen einer Lösung, nach Einstellen mit Orthophosphorsäure auf pH 6,4. Die Lösung wurde auf lOO'C erhitzt und durch Filtrieren durch einen Seitz-Filter sterilisiert.

Das Grundmedium (121) wurde aseptisch in einen völlig verschlossenen, 20-1-Aluminium-Kulturkessel eingebracht und geimpft mit ungefähr 10¹² bis 10¹³ Organismen des Stammes S 19 von Bruceila abortus, welche auf einer 3"/oigen Glycerin-agar-Nährlösung gezüchtet worden waren.

Der Kulturkessel wurde auf 34 bis 36°C gehalten und mit steriler Luft belüftet, welche unter dem Rührwerk mit einer Geschwindigkeit von ungefähr 1 1 Luft pro Minute pro Liter Medium eingeführt wurde.

Nach 72 Stunden wurde die Kultur in 3 ml Volumen in kleinen Gefäßen dispergiert, ohne oder mit Zugabe einer 50°/oigen Saccharoselösung, bei Einstellen des Gehalts auf 5°/o Saccharose. Der Inhalt der Gefäße wurde bei -40⁰C gefroren, und die Gefäße wurden dann in einen Edwards-Modell-51 P2-Gefriertrockner gebracht, der auf —40⁰C vorgekühlt war und bei dieser Temperatur 3 bis 4 Stunden gehalten wurde. Der Druck wurde dann auf 0,1 mm Quecksilber reduziert, die Abkühlung beendet und die Temperatur auf 25°C 24 Stunden erhöht. Die Gefäße wurden dann in einen zweiten Vakuumtrockner eingebracht, der bei 0,03 mm Quecksilber und Zimmertemperatur über Phosphorpentoxyd 40 Stunden gehalten wurde, und sie wurden dann unter Vakuum verschlossen.

Es wurden dann Proben entnommen, hinsichtlich der Lebensfähigkeit geprüft, und andere Proben wurden unter verschiedenen Bedingungen gelagert und wiedergeprüft. Die Ergebnisse der verschiedenen unabhängigen Untersuchungen waren wie folgt:

45

Nr.	Dauer	Temperatur	Gewinnung an Lebensfähigkeit
	(Tage)	(⁰C)	(°/o)
	7	35	89
	28	35	48
2	7	35	69
3	7	35	98
	28	35	80
6	7	35	78
7	7	35	76

Die Genauigkeit dieser Messungen liegt zwischen

± 20%.

Beispiel 2

Zu 25 ml Aliquoten des im Beispiel 1 beschriebenen Grundmediums wurde eine Impfung mit einem Gehalt von ungefähr 10⁹ bis 10¹⁰ Organismen des Stammes S 19 von Bruceila abortus aseptisch in 250 ml konisch geformten Schüttelkolben zugegeben, welche mit nicht adsorbierenden Baumwollstöpseln verschlossen waren.

Die Kolben wurden auf einem hin- und herlaufenden Schüttler mit einem Hub von 3,3 cm mit einer Geschwindigkeit von ungefähr 488 Schüttelungen pro Minute geschüttelt. Nach 64 Stunden wurde der Inhalt der Kolben gesammelt und in 2 ml Volumen kleine Gefäße, wie im Beispiel 1 beschrieben, geteilt. Das Gefriertrocknen und die Untersuchungen wurden wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Ergebnisse der unabhängigen Untersuchungen waren wie folgt:

	S	Zugegebene	Lebensfähigkeits	"/ml)	Gewinnung
	O	Saccharose	feststellung		an Lebens
Nr.	O 3	vor dem	(XlO	nach dem	fähigkeit
	Ih U.	Gefrier		Trocknen
	(%)	trocknen	vor dem	129	(%)
	4	\ /0)	Trocknen	125	66
1	4	keine	194	132	61
2	4	keine	204	169	75
3	4	5	175	207	100
4	4	5	171	145	105
5	4	5	197	169	74
6	4	5	197	221	75
7	4 .	5	226		110
8	5	200

	U	Zugegebene	Lebensfähigkeits-	-7ml)	Gewinnung
	G	Saccharose	feststellung	nach dem	an Lebens fähigkeit
Nr.	i	vor dem Gefrier	(XlO	Trocknen
	(%)	trocknen	vor dem	67	(°/o)
	4	CVo)	Trocknen	115	111
9	4	5	60	168	83
10	4	5	139		100
11	5	169

Aufbewahrungseigenschaften

Nr.	Dauer	Temperatur	Gewinnung an Lebensfähigkeit
	(Tage)	(⁰C)	(7o)
9	441	0 bis 4	67
10	7	35	114
11	427	0 bis 4	93

Erhaltene Eigenschaften

Nr.	Dauer (Tage)	Temperatur ("C)	Gewinnung an Lebensfähigkeit (%)
1	7 28	35 35	86 64

55

6ο

Beispiel 3

Um die Wirkung der vollkommenen Abwesenheit von Fructose aufzuzeigen, wurden Untersuchungen nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei die Abänderung der vollkommene Ersatz der Fructose mit 3°/o Glucose als Kohlenstoffquelle war. Es wurde keine Saccharose

vor dem Gefriertrocknen in'diesen Untersuchungen zugegeben. Die Ergebnisse waren wie folgt:

	Lebensfähigkeitsbestimmung	nach dem	Wieder	Aufbewahrungs eigenschaften	Tempe	Wieder
Nr.	vor dem	Trocknen	gewinnung		ratur	gewinnung
	Trocknen	)-»/ml)	(7o)	Dauer	(⁰C)	P/o)
	(XlC	70	22	(Tage)
12	314	86	54
13	158	69	15	—
14	475	122	11	—	35	<1%
15	1080	95	8	7	35	3
16	1250	119	21	7	35	8
17	570	33	10	7	35	7
18	330	7

	Lebensfähigkeitsbestimmung	nach dem	Wieder	Aufbewahrungs eigenschaften	Tempe	Wieder
Nr.	vor dem	Trocknen	gewinnung		ratur	gewinnung
	Trocknen	"'/ml)	(⁰O) _,	Dauer	(⁰C)	<%)
	(XlC	18	16	(Tage)
19	111	32	11		35	1
20	297	153	17	7
21	893	48	6	—
22	745

Beispiel 4

Untersuchungen wurden nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei die Abänderung die Verwendung einer unterschiedlichen und komplexen Kohlenstoffquelle war. Die Ergebnisse waren wie folgt:

	Wachstum und Gefriertrocknung	Glucose <7o)	Saccharose, zugegeben vor dem	Lebensfähigkeitsbestimmung	nach dem Trocknen "7ml)	Wieder gewinnung *(X)*	Aufbewahrungseigenschaften	Temperatur (⁰C)	Wieder gewinnung (7o)
Nr.	Kohlenstoffquelle		*T ^JL* WVtIl Gefrier trocknen (X)**	vor dem Trocknen (XlO	1740	76	Dauer (Tage)	35	76
	Fructose (⁰A.)	—		2280	1615	73	7	35	55
23	3	—	—	2219	115	83	7	35	115
24	3	—	5	139	119	88	7	35	78
25	3		—	136	117	82	7	35	90
26	4	2		143	126	91	7	35	100
			—	139	103	60	7	35	67
27	2	3		170	72	60	7	35	100
			—	120	86	66	7	35	74
28	1	3,5		131	79	60	7	35	100
			—	131	123	90	7	35	50
29	0,5		136		7

Weitere Versuche zeigten keine wesentliche VerbesserungunterhalbO.l % Gew./Vol. (oder 2,5% Gew./ Gew.) Fructose.

In diesen und den anderen in den vorhergehenden Beispielen dargebotenen Ergebnissen stellen die Lebensfähigkeitsbestimmungen das arithmetische Mittel von vier Messungen dar, die in jedem Fall von zwei parallelen Untersuchungen abgenommen wurden.

Beispiele 5 und 6

Um wiederum die Wirkung der vollkommenen Abwesenheit von Fructose aufzuzeigen, wurden Untersuchungen nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei die Abänderung der vollkommene Ersatz der Fructose durch 4^u/o Glucose als Kohlenstoffquelle war. Es wurde vor dem Gefriertrocknen bei diesen Untersuchungen im Beispiel 5 7,5⁰O und im Beispiel 6 10% Saccharose zugegeben. Die Ergebnisse waren wie folgt:

Beispiel

5
6

Lebensfähigkeitsbestimmung (x 10~7ml)

vor dem
Gefriertrocknen

431
406

nach dem Gefriertrocknen

189

182

nach 7tägiger Lagerung bei 37 C

10 12

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Brucella-abortus-Infektionen durch Kultur des Stammes S 19 in einem Nährmedium mit einer gegebenenfalls Glucose enthaltenden Kohlenstoffquelle und Gefriertrocknung der Kultur, gegebenenfalls unter Zusatz von Saccharose, dadurch gekennzeichnet daß als Kohlenstoffquelle Fructose verwendet wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoffquelle ein Gemisch aus ungefähr 25% Gew./Gew. Fructose und ungefähr 75 % Gew./Gew. Glucose verwendet wird.