DE945502T1 - Mutierte Subtilisin-protease - Google Patents
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Claims (39)
1. Mutierte Subtilisin Protease, wobei die elektrostatische Nettoladung im Vergleich
zu der Ausgangsprotease bei gleichem pH verändert wurde, so dass es in der Protease,
relativ zu der Ausgangsprotease weniger oder mehr positiv-geladene(n) Aminosäurerest(e) gibt und/oder mehr oder weniger negativ-geladene(n) Aminosäurerest(e)
gibt, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Mutation von den Aminosäureresten an einer oder mehrerer der Positionen
1, 2, 3, 4, 10, 14, 15, 17, 18, 20, 40, 43, 44, 51, 52, 60, 61, 62, 91, 98, 100, 105,
106, 108, 112, 113, 117, 133, 134, 137, 141, 143, 144, 145, 146, 165, 167, 173,
183, 184, 185, 191, 192, 209, 210, 211, 212, 239, 240, 242, 243, 244, 245, 247,
248, 251, 252, 253, 255, 256, 257,259, 263, 269, 271, 272,
verursacht ist durch Deletion, Substitution oder Insertion (einfach oder mehrfach)
in Nachbarschaft zu den genannten Positionen, wobei die mutierte Subtilisin Protease
einen niedrigeren isoelektrischen Punkt (plo) hat als die Ausgangsprotease.
2. Mutierte Subtilisin Protease, wobei die elektrostatische Nettoladung im Vergleich
zu der Ausgangsprotease bei gleichem pH verändert wurde, so dass es in der Protease,
relativ zu der Ausgangsprotease weniger oder mehr positiv-geladene(n) Aminosäurerest(e) gibt und/oder mehr oder weniger negativ-geladene(n) Aminosäurerest(e)
gibt, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Mutation von den Aminosäureresten an einer oder mehreren der Positionen
1,2, 3,4,10,14,15,17,18,20,40,43, 44, 51, 52, 60, 61, 62, 91, 98,100,105,
106, 108, 112, 113, 117, 133, 134, 137, 141, 143, 144, 145, 146, 165, 167,173,
106, 108, 112, 113, 117, 133, 134, 137, 141, 143, 144, 145, 146, 165, 167,173,
DE/EP O 945502T1
-2-
183, 184, 185, 191, 192, 209, 210, 211, 212, 239, 240, 242, 243, 244, 245, 247,
248, 251,252, 253,255, 256,257,259,263,269, 271,272,
248, 251,252, 253,255, 256,257,259,263,269, 271,272,
verursacht ist durch Deletion, Substitution oder Insertion (einfach oder mehrfach)
in Nachbarschaft zu den genannten Positionen, wobei die Subtilisin Protease einen
höheren Isoelektrischen Punkt (plo) hat als die Ausgangsprotease.
3. Protease nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine
Mutation besitzt, die einen Aminosäurerest beeinflusst, der eine Position besetzt,
ausgewählt aus der Gruppe von Positionen
1, 2, 3, 4, 10, 14, 15, 17, 18, 20, 40, 43, 44, 51, 52, 60, 61, 62, 91, 98, 100, 105,
106, 108, 112, 113, 117, 133, 134, 137, 141, 143, 144, 145, 146, 165, 167, 173, 183, 184, 185, 191, 192, 209, 210, 211, 212, 239, 240, 242, 243, 244, 245, 247,
248,251,252,253,255,256,257,259,263,269,271,272,
und mindestens eine weitere Mutation, die einen Aminosäurerest beeinflusst, der
eine Position besetzt, ausgewählt aus der Gruppe von Positionen
1, 2, 3, 4, 6, 9, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 36, 37, 38, 40, 41, 43,.
44, 45, 46, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 75, 76, 77, 78, 79,
87, 89, 91, 94, 97, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 112, 113,
115, 116, 117, 118, 120, 126, 128, 129, 130, 131, 133, 134, 136, 137, 140, 141, 143, 144i 145, 146, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167,
170, 171, 172, 173, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 188, 189, 191, 192, 194, 195,
197, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 251, 252, 253, 254, 255,
256,257,259, 260, 261,262,263,265,269, 271, 272,275.
4. Mutierte Subtilisin Protease, wobei die elektrostatische Nettoladung im Vergleich
zu der Ausgangsprotease bei gleichem pH verändert wurde, dadurch gekennzeichnet,
dass sie eine oder mehrere der folgenden Mutationen enthält:
RlOF5RlOL,
DE/EPO 345.502 &Pgr;
-3-
RI0F+R45A+E89S+E136Q+R145A+D181N+R186P+E271Q, R10F+R19Q+E89S+E136Q+R145A+D181N+E271Q+R275Q,
Q12K,Q12R,
Q12K+P14D+T22K+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E+A158R+A172D+
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♦36D+H120D+G195E+K235L, T38K, T38R, N43R, N43K,
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D14K+D120K+D140K+D172K,
E54T, E54Y, N97D, N97D+S98D, N97D+T213D, S98D, S98D+T213D,
D120K, D140K, S156E, D172K, T213D,N218D.
5. Mutierte Subtilisin Protease, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Insertionsmutation an Position 36 besitzt.
6. Protease nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine einen negativ
geladenen Aminosäurerest gebende Insertionsmutation an Position 36 besitzt.
7. Protease nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation *36D oder
*36Eist.
8. Protease nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Insertionsmutation einen
neutralen Aminosäurerest zur Verfügung stellt.
9. Protease nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation *36A, *36Q.
oder *36N ist.
10. Protease nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Insertionsmutation einen
positiv geladenen Aminosäurerest zur Verfügung stellt.
DE /EP O 94 5 5.02 Tl
11. Protease nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation *36R oder
*36K ist.
12. Protease nach einem der Ansprüche 5 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens
eine weitere Mutation an mindestens einer der Positionen 120, 170, 195, 235, und 251 hat.
13. Protease nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Insertion *36D, *36E,
oder *36Q ist und die mindestens eine weitere Mutation ausgewählt ist aus H120D,
R170Y.G195E, K235L undK251E.
14. Protease nach einem der Ansprüche 5 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine
weitere Mutation an Position 76 besitzt.
15. Protease nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Mutation dazu
da ist, einen negativ-geladenen Aminosäurerest in Position 76 zu ersetzen.
16. Protease nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Mutation
N76D oder N76E ist.
17. Protease nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine
weitere Mutation in mindestens einer oder mehr der Positionen 120, 170, 195, 235,
and 251 besitzt.
18. Protease nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte mindestens
eine weitere Mutation ausgewählt ist aus H120D, Rl 7OY, G195E, K235L und
K251E.
DE/EP O 94 5 502 TI
-6-
19. Protease nach einem der Ansprüche 5 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine
weitere Mutation besitzt, die anderswo in dem Proteasemolekül eine weitere positive
Ladung einfugt.
20. Protease nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Mutation in
Position 213 ist.
21. Protease nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation T213K ist.
22. Protease nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass
sie eine Mutation einer Ausgangsprotease darstellt, ausgewählt aus Subtilisin BPN',
Subtilisin amylosacchariticus, Subtilisin 168, Subtilisin Mesentericopeptidase, Subtilisin
Carlsberg, Subtilisin DY, Subtilisin 309, Subtilisin 147, Thermitase, Aqualysin,
Bacillus PB92 Protease, Proteinase K, Protease TW7 und Protease TW3.
23. Protease nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangssubtilisin
Subtilisin 309 ist.
24. Protease nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass sie irgendeine der folgenden
Substitutionen hat
RlOF5RlOL,
R10F+R45A+E89S+E136Q+R145A+D181N+R186P+E271Q,
R10F+R19Q+E89S+E136Q+R145A+D181N+E271Q+R275Q,
Q12K, Q12R,
Q12K+P14D+T22K+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E+A158R+A172D- +N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R,
Q12K+P14D+T22K+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E+A158R+A172D- +N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R,
Q12R+P14D+T22R+N43R+ Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E+A158R+A172D-
+N173K+T213R+N248D+T255E+ S256K+S259D+A272R,
Q12K+P14D+T22K+T3 8K+N43R+Q59E+N76D+A98R+ S99D+S156E-
+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259+A272R,
+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259+A272R,
OE/EP 0 945502T1
-7-
Q12R+P14D+T22R+T38R+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E-
+Al 58R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R,
Q12K+P14D+T22K+T38K+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+S141R+ S156E+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R,
Q12R+P14D+T22R+T38R+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140+S141R--S156E+A15
8R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R,
P14D, P14K, P14K+*36D, P14K+N218D, P14K+P129D, A15K, A15R, R19Q,
T22K, T22R, D32*, *36, *36D+R170Y+G195E+K251E, *36D+- H120D+R170Y+G195E+K235L, *36D+H120D+R170Y+G195E+K235L+K251E,
*36D+H120D+G195E+K235L, T38K, T38R, D41E, N43R, N43K, R45A, E53R, E53K, E53G+K235L, E54G, E54Y, Q59E,
Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+-
S256K+S259D+A272R,
D60N, N76D, E89S, E89S+K251N, Y91F, K94R, G97D, G97D+H120K, A98K, A98R, S99D, S99D+N140K, El 12T, H120K, H120D, H120D+K235L, H120D+G195E+K235L,H120D+R170Y+G195E+K235L, H120D+R170Y+G195E+K235L+K251E, P129D, E136Q, E136K, E136R, E136Q+R10L, N140D, N140K, N140R, S141K, S141R, R145A, S156E, S156E+A158R+A172D+N173K, S156E+A158R+A172D+N173K+T213R, S156E+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R, A158R, A158K, Y167V, R170Y+G195E, R170Y+K251E, R170Y+G195E+K251E, R170Y+G195E+K235L, Y171E, Y171T, A172D, N173K, D181N, N184K, N184R, N185D, R186P, Y192V, Y192V, Y192A, G195E+T213R, G195E+K251E, G195E+K235L, D197N, D197K, D197E, Q206D, Q206E, Y209L, T213R, T213K, Y214T, Y214S, N218D, K235L, K235R, K237R, W241Y5 W241L, W241Y+H249R, W241L+H249R, N248D, H249R, K251R, K251E, K251N, T255E, S256R, S256K, S259L, S259D, Y263W, S265K, S265R, E271Q, E271G, E271G+K27V, E271Q, E271G, A272R, A272R, R275Q.
D60N, N76D, E89S, E89S+K251N, Y91F, K94R, G97D, G97D+H120K, A98K, A98R, S99D, S99D+N140K, El 12T, H120K, H120D, H120D+K235L, H120D+G195E+K235L,H120D+R170Y+G195E+K235L, H120D+R170Y+G195E+K235L+K251E, P129D, E136Q, E136K, E136R, E136Q+R10L, N140D, N140K, N140R, S141K, S141R, R145A, S156E, S156E+A158R+A172D+N173K, S156E+A158R+A172D+N173K+T213R, S156E+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R, A158R, A158K, Y167V, R170Y+G195E, R170Y+K251E, R170Y+G195E+K251E, R170Y+G195E+K235L, Y171E, Y171T, A172D, N173K, D181N, N184K, N184R, N185D, R186P, Y192V, Y192V, Y192A, G195E+T213R, G195E+K251E, G195E+K235L, D197N, D197K, D197E, Q206D, Q206E, Y209L, T213R, T213K, Y214T, Y214S, N218D, K235L, K235R, K237R, W241Y5 W241L, W241Y+H249R, W241L+H249R, N248D, H249R, K251R, K251E, K251N, T255E, S256R, S256K, S259L, S259D, Y263W, S265K, S265R, E271Q, E271G, E271G+K27V, E271Q, E271G, A272R, A272R, R275Q.
25. Protease nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation
mindestens eine der folgenden ist:
DE/EP O 9455.02 Tl
-8-
-9-
DE/EP O 945 502 Tl
5202) N76D+G195E
5203) N76D+R17OY+G195E
5204) H120D+G195E+K235L+K251E
5223) Q59E+N76D+A98R+S99D+T213K+K235L+N248D+T255E- -S256K+S259D+A272R
5224) Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+S141R- +K235L+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R
5225) ♦36D+Q59E+N76D+A98R+S99D+R170Y+S156E+A158R-
+A172D+N173R+K235L+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R
S226) *36Q
5227) *36D+Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D +S141R+R170Y+G195E+K235L+N248D+T255E-
+S256K+S259D+A272R
5228) *36D+Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+S141R+ S156E+A158R+A172D+N173K+K235L+N248D+-
T255E+S256K+S259D+A272R
5229) Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+S141R-
+S156E+A158R+A172D+N173K+K235L+N248D+T255E+- S256K+ 259D+A272R
S234) Q206D
S235) *36D+N76D
S242) *36Q+N76D+H120D+G195E+K235L
26. Protease nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangssubtilisin
Subtilisin 147 ist.
27. Protease nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangssubtilisin
Subtilisin Carlsberg ist.
28. Protease nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine der folgenden
Substitutionen hat:
D14K, D14K+D120K, D14K+D120K+D140K, D14K+D120K+D140K+D172K,
E54T, E54Y, N97D, N97D+S98D, N97D+T213D, S98D, S98D+T213D, D120K, D140K, S156E, D172K, T213D, N218D.
DE/EP O 945 5.02 &Tgr;1
-10-
29. Protease nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation eine
der folgenden ist:
COOl) D14K
C002) D120K
C003) D140K
C004) D14K+D120K
C008) D172K
C009) D14K+D120K+D140K
COlO) D14K+D120K+D140K+D172K
CO13) N97D.
CO14) S98D
C015) T213D
COl 7) S156E
CO18) N97D+S98D
CO19) N97D+T213D
C022) S98D+T213D
C028) N218D
ClOO) V51D
ClOl) E54T
C102) E54Y.
30. Protease nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangssubtilisin
die Bacillus PB92 Protease ist.
31. Protease nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass sie irgendeine der folgenden
Substitutionen hat
RlOF5RlOL, R10F+R45A+E89S+E136Q+R145A+D181N+R186P+E271Q,
R10F+R19Q+E89S+E136Q+R145A+D181N+E271Q+R275Q, Q12K, Q12R, Q12K+P14D+T22K+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E+A158R+A172D-
DE/EP O 94 5 5.02 Tl
-11-
+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R,
Q12R+P14D+T22R+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+S156&Egr;+&Agr;158R+A172D-
+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R, Q12K+P14D+T22K+T38K+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E-
+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259+A272R, Q12R+P14D+T22R+T38R+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E-
+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R,
Q12K+P14D+T22K+T38K+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+- S141R+S156E+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+-
A272R,
Q12R+P14D+T22R+T38R+N43R+Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140+S141R—
S156E+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R, P14D, &Rgr;14&Kgr;, P14K+*36D, P14K+N218D, P14K+P129D,
A15K, A15R, R19Q, T22K, T22R, D32*,
*36D, *36D+R170Y+G195E+K251E,
*36D, *36D+R170Y+G195E+K251E,
*36D+H120D+R170Y+G195E+K235L,
*36D+H120D+R170Y+G195E+K235L+K251E,
*36D+H120D+G195E+K235L,
T38K, T38R, D41E, N43R, N43K, R45A, E53R, E53K, E53G+K235L,
E54G, E54Y, Q59E,
Q59E+N76D+A98R+S99D+S156E+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E^-
S256K+S259D+A272R,
D60N, N76D, E89S, E89S+K251N, Y91F, K94R, G97D,
G97D+H120K, A98K, A98R, S99D, S99D+N140K, El 12T, H120K,H120D,H120D+K235L,H120D+G195E+K235L,
H120D+R170Y+G195E+K235L,
H120D+R170Y+G195E+K235L+K251E,
P129D, E136Q, E136K, E136R, E136Q+R10L, N140D, NHOK, N140R,
SHlK, SHlR, R145A, S156E, S156E+A158R+A172D+N173K, S156E+A158R+A172D+N173K+T213R,
S156E+A158R+A172D+N173K+T213R+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R,
A158R, A158K, Y167V, R170Y+G195E, R170Y+K251E, R170Y+G1-
-12-
DE/EP O 945502T1
95E+K251E, R170Y+G195E+K235L, Y171E, Y171T, A172D, N173K, D181N,
N184K, N184R, N185D, R186P, Y192V, Y192V, Y192A, G195E+T213R, G195E+K251E, G195E+K235L, D197N, D197K, D197E, Q206D, Q206E,
Y209L, T213R, T213K, Y214T, Y214S,N218D, K235L, K235R, K237R,
W241Y, W241L, W241Y+H249R, W241L+H249R, N248D, H249R, K251R,
K251E, K251N, T255E, S256R, S256K, S259L, S259D, Y263W, S265K,
S265R, E271Q, E271G, E271G+K27V, E271Q, E271G, A272R, A272R,
R275Q .
32. Protease nach Anspruch 30 oder 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation
mindestens eine der folgenden ist:
5004) R170Y+G195E
5005) K251E
5006) H120D
S008) H120D+G195E
5009) T71D
5010) T71D+G195E SOU) R170Y+K251E
S012) -R170Y+G195E+K251E S013) T71D+R170Y+K251E S014) T71D+R170Y+G195E+K251E
•S015) K235L
5016) H120D+K235L
5017) H120D+G195E+K235L SO 18) G195E+K251E
5019) H120D+R170Y+G195E+K235L
5020) H120D+R170Y+G195E+K235L+K251E
5021) *36D
5022) *36D+R170Y+G195E+K251E
S023) *36D+H120D+R170Y+G195E+K235L
5024) *36D+H120D+R170Y+G195E+K235L+K251E
5025) *36D+H120D+G195E+K235L
-13-
5026) E136R
5027) E89S
5028) D181N
5029) E89S+E136R SO3O) E89S+D181N
5031) D197N+E271Q
5032) D197N
5033) E271Q
SO35) *36D+N76D+H120D+G195E+K235L S041) G195F
5201) N76D
5202) N76D+G195E
5203) N76D+R170Y+G195E
5204) H12OD+G195E+K235L+K251E
S223) Q59E+N76D+A98R+S99D+T213K+K235L+N248D+T255E-
+S256K+S259D+A272R
5224) Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+S141R-
+K235L+N248D+T255E+S256K+S259D+A272R
5225) *36D+Q59E+N76D+A98R+S99D+R170Y+S156E+A158R-
+Al 72D+N173R+K235L+N248D+T255E+S256K+S259D+
A272R
5226) *36Q
5227) *36D+Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D
+S141R+R170Y+G195E+K235L+N248D+T255E- +S256K+S259D+A272R
5228) *36D+Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+S141R+
S156E+A158R+A172D+N173K+K235L+N248D+-
T255E+S256K+S259D+A272R
S229) Q59E+N76D+A98R+S99D+H120D+N140D+S141R- +S156E+A158R+A172D+N173K+BC235L+N248D+T255E+-
S256K+ 259D+A272R S234) Q206D
- 14 -
S235) *36D+N76D
S242) ♦36Q+N76D+H120D+G195E+K235L.
33. Verfahren zur Bestimmung oder Selektion der in einem Ausgangsenzym zu deletierenden,
zu substituierenden oder zu inserierenden Position(en) und Aminosäure(n), dadurch gekennzeichnet, dass die Selektion in einer Weise durchgeführt wird, dass
die berechnete Nettoladung (=NEC) in einem erwägtem Mutanten-Enzym im Vergleich zu der NEC des Ausgangsenzyms der Wahl verändert wurde, berechnet bei
gleichem pH Wert und dass der ausgewählte Aminosäurerest aus den Aminonsäureresten
an irgendeiner oder mehreren der Positionen ausgewählt wird:
1, 2, 3, 4, 10, 14,15, 17, 18,20,40, 43, 44, 51, 52, 60, 61, 62, 91, 98, 100, 105, 106,
108, 112, 113, 117, 133, 134, 137,141, 143, 144, 145,146, 165, 167, 173, 183, 184,
185, 191, 192, 209, 210, 211, 212, 239, 240, 242, 243, 244, 245, 247, 248, 251, 252,
253, 255, 256, 257, 259, 263, 269, 271, 272,
34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die gewählte Aminosäurereste
so ausgewählt sind, dass sie einen Aminosäurerest bewirken, der eine der Positionen belegt ausgewählt aus der Gruppe von Positionen
1, 2, 3, 4, 10, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 40, 43, 44, 49, 51, 52, 60, 61, 62, 91, 98, 100,
105, 106, 108, 112, 113, 117, 133, 134, 137, 141, 143, 144, 145, 146,165, 167, 173,
183, 184, 185, 191, 192, 209, 210, 211, 212, 239, 240, 242, 243, 244, 245, 247, 248,
251, 252, 253, 255, 256, 257, 259, 263, 269, 271, 272,
und mindestens ein weiterer bewirkt einen Aminosäurerest, der eine der Positionen
belegt, ausgewählt aus der Gruppe der Positionen:
1, 2, 3, 4, 6, 9, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 36, 37, 38, 40, 41, 43,
44, 45, 46, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 75, 76, 77, 78, 79,
87, 89, 91, 94, 97, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 112, 113,
115, 116, 117, 118, 120, 126, 128, 129, 130, 131, 133, 134, 136, 137, 140, 141, 143,
144, 145, 146, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 170, 171,
172,173, 181, 182,183, 184, 185,186, 188, 189, 191,192, 194, 195,197, 204,206,
DE/EP 0
HL/ L. &igr; — -
-15-
209, 210, 211, 212, 213, 214, 215,216, 217, 218,235, 236, 237, 238, 239, 240, 241,
242, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 259, 260, 261,
262,263,265,269,271,272,275.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass das
Ausgangsenzym ausgewählt ist aus Subtilisin BPN', Subtilisin amylosacchariticus,
Subtilisin 168, Subtilisin mesentericopeptidase, Subtilisin Carlsberg, Subtilisin DY,
Subtilisin 309, Subtilisin 147, Thermitase, Bacillus PB92 Protease, Proteinase K,
Protease TW7 und Protease TW3.
36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangssubtilisin
Subtilisin 309 ist.
37. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangssubtilisin
Subtilisin 147 ist.
38. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangssubtilisin
Subtilisin Carlsberg ist.
39. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangssubtilisin
Bacillus PB92 Protease ist.
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