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Verfahren zur Reinigung der Vitamine der B12.-Gruppe
Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Reinigung der Vitamine der Bl2-Gruppe.
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Es ist bekannt, daß in der Natur ein antianämisch wirksamer Stoff
vorkommt, der als Vitamin El bezeichnet wird (Rickes c. s., Science Io8, 396 [1948j).
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Dieser Stoff wird des öfteren in Begleitung anderer Stoffe angetroffen,
die wie auch das Vitamin Bla dadurchs gekennzeichnet sind, daß sie das Wachsen gewisser
Bakteriengattungen, namentlich Lactobacillus ,Lactis Dorner oder L. Leichmannii,
fördern. Diese gemeinsam vorkommenden, biologisch wirksamen Stoffe werden von L.
Smith als Vitamine der B12-Gruppe bezeichnet.
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Es ist weiterhin bekannt, daß die Faktoren der Vitamine der Gruppe
mittels Chromatographie auf Papier mit Hilfe von Butanol voneinander unterscheidbar
sind. Dieses bekannte Verfahren ist bisher nur für die Analyse von Gemischen dieser
Faktoren von Bedeutung geworden. Zu präparativen Zwecken läßt sich die Methode nicht
verwenden, da der Verteilungskoeffizient der Faktoren sehr stark auf der Seite der
wäßrigen Phase liegt.
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Lediglich das Thymidin, das zwar das Wachsen des Lactobacillus Lactis
Dorner fördert, aber klinisch bei perniziöser Anämie unwirksam ist, ließe sich auf
diese Weise vielleicht entfernen. In J. Pharm. Pharmacol. I, 60 (I949) wird ein
Verfahren beschrieben, um diese Faktoren als Ganzes in Butanol hinüberzutreiben,
indem man in der wäßrigen Phase große Mengen Ammoniumsulfat auflöst; eine Trennung
der verschiedenen Faktoren ist jedoch in dieser Weise noch nicht ausgeführt worden.
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Es hat sich nun gezeigt, daß eine besonders wirksame Trennung der
Faktoren der Vitamine der B12-Gruppe erfindungsgemäß dadurch erreicht wird, daß
man die wäßrige Lösung mit einer Lösung von Phenol in einem apolaren Lösungsmittel,
wie Chloroform, Benzol und Äther, behandelt, und zwar vorzugsweise durch Ausschütteln
im Gegenstrom.
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Man wählt zweckmäßigerweise Lösungsmittel, die später durch Destillation
leicht wieder entfernt werden können. Die Benutzung halogenierter Rohlenwasserstoffe
mit nicht mehr als zwei C-Atomen, welche der obenenvähnten Anforderung entsprechen,
hat überdies noch den Vorteil, daß die Phasentrennung durch das hohe spezifische
Gewicht der Lösung besonders glatt verläuft. Man kann jedoch auch sehr gut arbeiten
mit Gemischen von Phenol und Benzol in Systemen, die nicht zu stark die Neigung
zur Emulsionsbildung zeigen.
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Nach der deutschen Patentschrift 696390 kann man die antianämischen
Stoffe durch Ausschütteln mit Phenol reinigen. Man erhält dabei jedoch nahezu alle
anwesenden Proteine, Polypeptide und Aminosäuren mit in die Phenolphase, und von
einer Trennung in Faktoren kann überhaupt keine Rede sein.
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Mft kleinen Mengen der Vitamine der B32-Gruppe ist es ebenfalls möglich,
die Reinigung nicht in Scheidetrichtern oder ähnlichen Behältern, wohl aber an einer
Säule von feuchtem Kieselsäuregel durchzuführen, die man mit phenolhaltigen Lösungsmitteln
durchströmt, vorausgesetzt, daß man ein die Vitamine der B,2-Gruppe nicht adsorbierendes
Kieselsäuregel benutzt.
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Zur Trennung der Faktoren ist eine Phenolkonzentration von 15 g je
100 ccm Flüssigkeit am besten geeignet. Mit weniger Phenol ist die Trennung weniger
leicht, so daß je nach dem Verfahren mehr Scheidetrichter benutzt werden müssen
oder eine geringere Laufgeschwindigkeit der roten Bänder in der Säule wahrnehmbar
ist. Bei Verwendung von mehr Phenol läuft die in Wasser lösliche Gruppe zu stark
mit der in Phenol löslichen mit, und die Trennung der beiden Fraktionen ist deshalb
schwieriger, wenn nicht unmöglich.
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Bei einer Konzentration mit 25°lo Phenol trennt sich die B32-Gruppe
nicht mehr, aber man entfernt nur noch Proteine, Polypeptide und Aminosäuren. Die
Brauchbarkeitsgrenzen der Methode liegen, je nach dem Ziel, zwischen 10 und 250/0
Phenol.
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Beispiel I 459 mg eines weitgereinigten roten Präparates, erhalten
aus 450 kg Leber, werden in einer Reihe von 10 Scheidetrichtern nach dem Gegenstrom-Ausschüttel-Prinzip
verteilt zwischen einer organischen und einer Wasserschicht, erhalten durch Schütteln
von 40 g Phenol, 240 ccm Benzol und 200 ccm Wasser. In jedem der Scheidetrichter
befinden sich stets I5 ccm jeder der Schichten.
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Bei dieser Reinigung wird die schwerere Wasserschicht jedesmal von
einem vorhergehenden einem nachfolgenden Scheidetrichter zugeführt, wo sie jedesmal
eine frische Phenollösung findet. Im Scheidetrichter 1 wird nach jedem Ablassen
der Wasserschicht frisches Wasser zugesetzt.
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Nachdem man zehn Scheidetrichter benutzt hat, stellt sich heraus,
daß die organische Schicht in dem ersten Scheidetrichter einen braunroten Stoff
enthält, während die Wasserschicht farblos ist. Die Aufarbeitung der organischen
Schicht nach untenstehender Methode ergibt Fraktion I.
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Die organische Schicht in dem zweiten Scheidetrichter enthält einen
heliroten Stoff, der nicht in Wasser übergeht. Nach Aufarbeitung liefert diese die
Fraktion II. Die Wasserschichten der Scheidetrichter, die alle erst vom zehnten
Scheidetrichter abgelassen wurden, wurden zu Fraktion III aufgearbeitet.
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Die organischen Schichten in den Scheidetrichtern 3 bis 10 enthalten
einen starkroten Stoff, der eine maximale Intensität in dem sechsten Scheidetrichter
zeigt, während die der Scheidetrichter 3 und 4 und 10 nahezu farblos sind. Diese
organischen Schichten werden zusammen zu Fraktion IV aufgearbeitet.
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Die Aufarbeitung der verschiedenen Schichten geschieht wie folgt:
Im Vakuum wird das Benzol abdestilliert bei einer maximalen Außentemperatur von
40° C. Darauf fügt man der erhaltenen Lösung das zehnfache Volumen an Äther hinzu
und extrahiert die roten Stoffe mit Wasser. Nachdem man einige Male mit Äther gewaschen
und eingedampft hat, erhält man schließlich die nachfolgenden Fraktionen, wobei
die Totalaktivitäten, auf Wirksamkeit in y's kristallinisches B12 berechnet, erwähnt
sind.
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Fraktion I 27,4 mg 103 y B12 Aktivität Fraktion II 23,6 mg 230 y
B12 Aktivität Fraktion III 110,0 mg 4000 y B12 Aktivität Fraktion 162,3 mg 857I4
y B12 Aktivität.
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- Beispiel z Ein bereits ein wenig gereinigter Hefeextrakt mit einem
Volumen von 1,15 1 und einem Trockenrest von total 275 g wird dreimal ausgeschüttelt
mit einem Gemisch von I Gewichtsanteil Phenol und 3 Volumanteilen Chloroform. Für
jedes Ausschütteln gebraucht man 1 1 dieses Gemisches. Man entfernt das Chloroform
der versammelten organischen Schichten im Vakuum und destilliert darauf das Phenol
mit Wasserdampf im Vakuum bei einer Temperatur von 400 C. Der Rest wird mit Äther
ausgeschüttelt zwecks Entfernung der letzten Spuren an Phenol.
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Der erhaltene braune, wäßrige Extrakt enthält nur II g Trockenrest
und innerhalb des Probefehlers die ganze Aktivität, gemessen mit Lactobacillus Lactis
Dorner.
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Beispiel 3 Eine Lösung eines Konzentrates der Vitamine der Bl2-Gruppe,
nach der Eichung auf Lactobacillus Lactis Dorner äquivalent mit 1,2 mg kristallinischem
B12, wird in einem Volumen von 0,2 ccm auf eine Säule von feuchtem Kieselsäuregel
von 7,5 g gebracht.
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Die Säule hat eine Länge von I5 cm. Man spült mit einem Gemisch von
Ig Gewichtsteilen Phenol, zu 100 Volumteilen mit Tetrachlorkohlenstoff angefüllt.
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Man erhält zwei rote Bänder, ein sehr schnell laufendes
breites
und ein schmales, das ganz oben an der Säule hängenbleibt. Letzteres wird entfernt
durch Nachspülen mit 22°/o Phenol-Tetrachlorkohlenstoff- Gemisch.
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PATENTANSPROCHE: I. Verfahren zum Gewinnen und Reinigen der Vitamine
der Bl2-Gruppe, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung eines diese
Vitamine enthaltenden Stoffes mit einer IO- bis 250/0eigen Phenollösung in einem
apolaren organischen Lösungsmittel behandelt und darauf die erhaltene(n) organische(n)
Phase(n) aufarbeitet.