DE69937354T2

DE69937354T2 - Promotoren der fettsäuren-desaturase aus pflanzen

Info

Publication number: DE69937354T2
Application number: DE69937354T
Authority: DE
Inventors: Basil S. Fort Collins SHORROSH
Original assignee: Cargill Inc
Current assignee: Cargill Inc
Priority date: 1998-08-04
Filing date: 1999-08-04
Publication date: 2008-07-24
Anticipated expiration: 2019-08-05
Also published as: CN1328415A; EP1107661B1; EP1107661A2; CA2339084A1; ATE375712T1; CN1219064C; AU771958B2; WO2000007430A3; US6537750B1; WO2000007430A2; EP1107661A4; CA2339084C; AU5464999A; WO2000007430A9; BR9912745A; DE69937354D1; JP2003512810A

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft regulatorische Elemente aus Pflanzen, die zur Expression verschiedener Nukleinsäuremoleküle in transgenen Pflanzen verwendet können.
Hintergrund der Erfindung
Ein wesentliches Merkmal für gentechnische Veränderungen von Pflanzen ist die Fähigkeit, Gene in verschiedenen pflanzlichen Geweben zu exprimieren. Promotorelemente enthalten spezifische Sequenzen, die die Bindung von Proteinen steuern, die für die Bildung eines Transkriptionskomplexes notwendig sind, und es folglich erlauben, dass die Transkription beginnt. Konstitutive Promotoren wie z. B. die 35S- und 19S-Promotoren aus dem Blumenkohlmosaikvirus (CaMV; cauliflower mosaic virus) wie auch von Agrobacterium abgeleitete Promotoren wie z. B. die Promotoren der Nopalinsynthase und der Octopinsynthase werden oft zum Exprimieren von Genen transformierter Pflanzen verwendet.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung basiert auf der Identifikation regulatorischer Elemente von Fettsäuredesaturasegenen aus Pflanzen, die es erlauben, jedes beliebige heterologe Nukleinsäuremolekül in Pflanzenzellen und Pflanzen zu exprimieren. Folglich können Pflanzen hergestellt werden, die einen erhöhten Nährwert, eine modifizierte Fettsäurezusammensetzung oder einen modifizierten Gehalt an Kohlenhydraten, Protein oder Sekundärmetaboliten haben. Zusätzlich können die regulatorischen Elemente verwendet werden, um neue pharmazeutische Erzeugnisse in Pflanzen herzustellen.
In einem Aspekt offenbart die Anmeldung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein regulatorisches Element eines Fettsäuredesaturasegens einschließt, wobei das regulatorische Element 5' von dem Fettsäuredesaturasegen in einem natürlich vorkommenden Genom lokalisiert ist. Das Fettsäuredesaturasegen kann z. B. ein fad2D-Gen von Brassica oder ein fad2F-Gen von Brassica sein.
Die Erfindung bietet auch ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 5, der Nukleotide 5113 bis 5796 von SEQ ID NR: 4 oder der Nukleotide 3197 bis 3867 von SEQ ID NR: 5 sowie die komplementären Sequenzen solcher Nukleinsäuremoleküle. Das Nukleinsäuremolekül kann auch mindestens 600 Nukleotide (z. B. 600 oder 800 Nukleotide) lang sein und mindestens 80% Sequenzidentitiät (z. B. 80%, 90% oder 95%) mit solchen Nukleinsäuremolekülen aufweisen. In einigen Ausführungsformen schließt das isolierte Nukleinsäuremolekül die Nukleotide 5113 bis 5796 von SEQ ID NR: 4 oder die Nukleotide 3197 bis 3867 von SEQ ID NR: 5 ein.
Die Erfindung bietet auch ein Nukleinsäurekonstrukt. Das Konstrukt schließt ein erstes Nukleinsäuremolekül ein, das funktionsfähig mit einem zweiten Nukleinsäuremolekül verbunden ist, das hinsichtlich des ersten Nukleinsäuremoleküls heterolog ist. Das erste Nukleinsäuremolekül schließt ein regulatorisches Element eines Fettsäuredesaturasegens ein, wobei das regulatorische Element 5' von dem Fettsäuredesaturasegen in einem natürlich vorkommenden Genom gelegen ist. Das erste Nukleinsäuremolekül fördert die Expression des heterologen zweiten Nukleinsäuremoleküls, welches z. B. ein Ribozym oder ein Polypeptid, wie z. B. ein Polypeptid, das eine Herbizidresistenz verleiht, kodieren kann.
Das Nukleinsäurekonstrukt kann weiterhin ein drittes Nukleinsäuremolekül einschließen, das funktionsfähig mit dem 3'-Ende des zweiten Nukleinsäuremoleküls verbunden ist. Das dritte Nukleinsäuremolekül schließt eine 3'-untranslatierte Region des Fettsäuredesaturasegens ein, wobei die 3'-untranslatierte Region in dem natürlich vorkommenden Genom 3' von dem Fettsäuredesaturasegen lokalisiert ist. Das dritte Nukleinsäuremolekül kann ein Nukleinsäuremolekül einschließen, das die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, der Nukleotide 1-894 von SEQ ID NR: 6 oder der Nukleotide 1-814 von SEQ ID NR: 7 wie auch die komplementären Sequenzen dieser Moleküle besitzt. Das Molekül kann mindestens 100 Nukleotide lang sein und mindestens 70% Sequenzidentität mit einem Nukleinsäuremolekül der Nukleotide 1-894 von SEQ ID NR: 6 oder der Nukleotide 1-814 von SEQ ID NR: 7 besitzen.
Das Nukleinsäurekonstrukt kann weiterhin ein viertes Nukleinsäuremolekül einschließen, das funktionsfähig mit den ersten und zweiten Nukleinsäuremolekülen verbunden ist, wobei das vierte Nukleinsäuremolekül ein Transitpeptid oder ein Intron ist.
In einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäurekonstrukt, das ein erstes Nukleinsäuremolekül einschließt, das funktionsfähig mit einem zweiten Nukleinsäuremolekül verbunden ist, das hinsichtlich des ersten Nukleinsäuremoleküls heterolog ist. Das erste Nukleinsäuremolekül umfasst eine 3'-untranslatierte Region eines Fettsäuredesaturasegens, wobei die 3'-untranslatierte Region in einem natürlich vorkommenden Genom 3' von dem Fettsäuredesaturasegen lokalisiert ist. Die Erfindung bietet auch transformierte Pflanzenzellen und transgene Pflanzen. Die transformierten Pflanzenzellen und transformierten Pflanzen schließen ein Nukleinsäurekonstrukt ein. Das Nukleinsäurekonstrukt schließt ein regulatorisches Element eines Fettsäuredesaturasegens ein, das funktionsfähig mit einem heterologen Nukleinsäuremolekül verbunden ist, wobei das regulatorische Element die Expression der heterologen Nukleinsäure fördert, und wobei das regulatorische Element in einem natürlich vorkommenden Genom 5' von dem Fettsäuredesaturasegen lokalisiert ist. Die transformierte Zelle kann eine Dikotyledone (z. B. Alfalfa, Sojabohne, Raps oder Sonnenblume) oder eine Monokotyledone (z. B. Mais, Weizen, Roggen, Reis oder Hirse) sein. Die Samen der transgenen Pflanzen werden auch dargeboten.
Soweit nicht anders definiert, besitzen alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hierin verwendet werden, die Bedeutung, in der sie im Allgemeinen vom Fachmann auf dem technischen Gebiet, zu dem die Erfindung gehört, verstanden werden. Geeignete Verfahren und Materialien sind nachfolgend beschrieben, wenngleich auch Verfahren und Materialien, die den hierin beschriebenen ähnlich oder mit ihnen äquivalent sind, verwendet werden können, um die Erfindung auszuführen. Außerdem dienen die Materialien, Verfahren und Beispiele nur der Veranschaulichung und sind nicht als beschränkend beabsichtigt.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und aus den Ansprüchen offensichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Schema des Plasmids pMB103, das das genomische DNA-Fragment 1-3A1A SalI aus Brassica napus ,Bridger' enthält, das in die SalI-Schnittstelle von pSP72 subkloniert wurde, wobei die Positionen des fad2D-Promotors, des fad2D-Introns und der 3'-untranslatierten Region (UTR; untranslated region) von fad2D in Bezug zu der kodierenden Sequenz von fad2D angegeben sind.
2 ist ein Schema des Plasmids pMB102, das das genomische DNA-Fragment 1-2A1A SalI aus B. napus ,Bridger' enthält, welches in die SalI-Schnittstelle von pSP72 subkloniert wurde, wobei die Positionen des fd2F-Promotors, des fad2F-Introns und der 3'-untranslatierten Region (UTR; untranslated region) von fad2F in Bezug zu der kodierenden Sequenz von fad2F angegeben isind.
3 ist die Nukleinsäuresequenz des fad2D-Promotors von B. napus.
4 ist die Nukleinsäuresequenz des fad2F-Promotors von B. napus.
5 ist die Nukleinsäuresequenz der 3'-untranslatierten Region von fad2D aus B. napus.
6 ist die Nukleinsäuresequenz der 3'-untranslatierten Region von fad2F aus B. napus.
Ausführliche Beschreibung
Regulatorische Elemente
Die Erfindung bietet ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein regulatorisches Element eines Gens, das eine Fettsäuredesaturase (FAD; fatty acid desaturase) kodiert, einschließt. In einem natürlich vorkommenden Genom ist das regulatorische Element 5' von einem Fettsäuredesaturase-(fad; fatty acid desaturase)-gen wie z. B. einem fad1-, fad2- oder fad3-Gen, einschließlich Introns solcher fad-Gene, lokalisiert. Zum Beispiel kann das regulatorische Element stromaufwärts der fad2D-, fad2F- oder fad2U-Gene von Brassica sein. Wie hierin verwendet, bezieht sich „5' eines fad-Gens" auf Sequenzen innerhalb von 7000 Basenpaaren (bp; base pairs) einer fad kodierenden Region. Wie hierin verwendet, bezieht sich „isoliert" auf eine Nukleotidsequenz, die dem regulatorischen Element eines Fettsäuredesaturasegen entspricht, aber frei von Sequenzen ist, die normalerweise eine oder beide Seiten des regulatorischen Elements in einem Pflanzengenom flankieren. Ein isoliertes regulatorisches Element kann z. B. ein rekombinantes DNA-Molekül sein, vorausgesetzt, dass eine der Nukleinsäuresequenzen, die normalerweise in einem natürlich vorkommenden Genom als dieses rekombinante DNA-Molekül flankierend gefunden würden, entfernt oder abwesend ist. Folglich schließen isolierte regulatorische Elemente, ohne Beschränkung, sowohl eine rekombinante DNA, die als ein separates Molekül (z. B. ein genomisches DNA-Fragment, hergestellt durch PCR oder Restriktionsendonukleasebehandlung), ohne dass flankierende Sequenzen vorhanden sind, existiert, als auch eine rekombinante DNA ein, die in einen Vektor, ein autonom replizierendes Plasmid oder in die genomische DNA einer Pflanze als Teil eines Hybrid- oder Fusionsnukleinsäuremoleküls aufgenommen ist.
Die kodierenden Regionen der fad2D-, fad2F- und fad2U-Gene aus Brassica napus teilen 84 bis 90% Sequenzidentität auf Nukleotidebene, was durch MEGALIGN^®-(DNASTAR, Madison, WI)-Sequenzalignmentsoftware unter Verwendung des „Clustal"-Algorithmus" bestimmt wurde. Die fad2D- und fad2F-Gene kodieren jeweils eine zytosolische delta-12-Desaturase (auch FAD2 genannt), die in die enzymatische Umwandlung von Ölsäure in Linolsäure involviert ist. Siehe US-Patent Nr. 5,850,026 für die Sequenzen der fad2D- und fad2F-Gene. Die Nukleotidsequenz des fad2U-Gens legt nahe, dass es auch eine zytosolische delta-12-Desaturase kodiert. Siehe WO 98/56239 für die Sequenz von fad2U. Alternativ könnte fad2U eine zytosolische Fettsäurehydroxylase oder -epoxidase oder ein anderes Enzym kodieren, da die Nukleinsäuren, die diese Enzyme kodieren, Homologie mit der fad2-Genfamile teilen. Die fad1- und fad3-Gene kodieren delta-9- bzw. delta-15-Desaturasen.
Erfindungsgemäße regulatorische Elemente wurden durch Screenen einer genomischen DNA-Bibliothek aus Brassica napus, Sorte ,Bridger' unter Verwendung der kodierenden Region von fad2D als eine Sonde gescreent. Die Nukleotidsequenz ist in 3 (SEQ ID NR: 4) als ein Beispiel eines erfindungsgemäßen regulatorischen Elements dargestellt und schließt ungefähr 5800 Basenpaare (bp; base pairs) stromaufwärts des 5'-Endes des fad2D-Introns ein. Die Nukleotidsequenz, die in 4 (SEQ ID NR: 5) dargestellt ist, ist ein regulatorisches Element, das ungefähr 3800 bp stromaufwärts des 5'-Endes des fad2F-Introns einschließt. Ein erfindungsgemäßes regulatorisches Element kann eine Nukleotidsequenz haben, die von den in SEQ ID NR: 4 und SEQ ID NR: 5 gezeigten Sequenzen abweicht, und die Fähigkeit beibehält, die Expression eines Nukleinsäuremoleküls zu fördern. Zum Beispiel kann eine Nukleinsäuresequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität mit den Nukleotidsequenzen der SEQ ID NRN: 4 und 5 die Expression eines Nukleinsäuremoleküls fördern. In einigen Ausführungsformen kann die Nukleinsäuresequenz mindestens 90% oder 95% Sequenzidentität mit dem Nukleinsäuremolekül, das in den SEQ ID NRN: 4 oder 5 dargestellt ist, besitzen.
Im Allgemeinen wird die prozentuale Sequenzidentität berechnet, indem die Anzahl der passenden Positionen in den abgeglichenen Sequenzen bestimmt wird, die Anzahl der pas senden Positionen durch die Gesamtzahl der abgeglichenen Nukleotide dividiert wird und mit 100 multipliziert wird. Eine passende Position bezieht sich auf eine Position, in welcher identische Nukleotide in der gleichen Position in abgeglichenen Nukleinsäuresequenzen auftreten. Die Nukleinsäuresequenzen werden abgeglichen und die prozentuale Identität wird unter Verwendung des „Clustal"-Algorithmus der MEGALIGN^®-(DNASTAR, Madison, WI, 1997)-Sequenzalignment-Software berechnet. In diesem Verfahren werden die Sequenzen durch Prüfen der Abstände zwischen allen Paaren in Cluster gruppiert. Die Cluster werden als Paare und dann als Gruppen abgeglichen. Ein „Gap-Penalty" von 100 und ein „Gap-Length-Penalty" von 2 werden in den Alignments verwendet.
Fragmente des regulatorischen Elements, die die Fähigkeit beibehalten, die Expression eines interessierenden Nukleinsäuremoleküls zu fördern, können hergestellt werden. Die 1 und 2 stellen geeignete Restriktionsschnittstellen zur Erzeugung von Fragmenten bereit. Zum Beispiel können Fragmente des regulatorischen Elements von fad2D hergestellt werden, die die Nukleotide 4581 bis 5796 von SEQ ID NR: 4 oder die Nukleotide 5113 bis 5796 von SEQ ID NR: 4 enthalten. Fragmente des regulatorischen Elements von fad2F können die Nukleotide 2081 bis 3867 von SEQ ID NR: 5 oder die Nukleotide 3197 bis 3867 von SEQ ID NR: 5 einschließen. Die Fähigkeit von Fragmenten, die Expression eines Nukleinsäuremoleküls zu fördern, kann unter Verwendung der hierein beschriebenen Verfahren getestet werden. Insbesondere kann das Fragment funktionsfähig mit einer Nukleinsäuresequenz verknüpft werden und verwendet werden, um eine Pflanzenzelle transient oder stabil zu transformieren. Der Expression des Genprodukts, das von der Nukleinsäuresequenz kodiert wird, kann in solchen transformierten Pflanzenzellen unter Verwendung von Standardtechniken beobachtet werden.
Im Allgemeinen besitzen die Fragmente des regulatorischen Elements eine Länge von mindestens 100 Nukleotiden, z. B. ungefähr 200, 400, 600 oder 800 Nukleotiden in der Länge, und weisen mindestens 80% Sequenzidentität mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NR: 4 oder 5 oder Fragmenten hierzu, wie z. B. Nukleotiden 5113 bis 5797 von SEQ ID NR: 4 oder den Nukleotiden 3197 bis 3867 von SEQ ID NR: 5 auf. In einigen Ausführungsformen besitzen die Fragmente mindestens 90% oder 95% Sequenzidentität mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NRN: 4 oder 5. Die Fragmente der regulatorischen Elemente können als Hybridisierungssonden verwendet werden oder sie können verwendet werden, um die Expression eines Nukleinsäuremoleküls zu fördern. Regulatorische Elemente mit weniger als 400 bp wurden identifiziert, die die Expression von Nukleinsäuremolekülen in Pflanzen fördern. Zum Beispiel behielt ein Acyl-Carrier-Protein-(ACP)- Promotor die Funktion nach Deletion von Nukleotiden bis –290 bp stromabwärts des Initiationspunkts der Transkription (diese Region entspricht 358 Nukleotiden vom Initiationspunkt der Translation) bei. Siehe EP-91303098 und US-Patent Nr. 5,767,363 für eine Beschreibung der Isolierung und Verwendung des ACP-Promotors aus B. napus. Die Biotincarboxylaseuntereinheit der Acetyl-CoA-Carboxylase aus Plastiden von Arabidopsis behielt einen funktionstüchtigen Promotor nach Deletion bis zu –47 bp vom Initiationspunkt der Transkription (diese Region entspricht 167 Nukleotiden vom Initiationspunkt der Translation) bei. Zusätzlich war die Expression eines Enoyl-ACP-Reduktasepromotors in Samen nach Deletion bis zu –47 bp von der Transkriptionsstartstelle unverändert, was anzeigt, dass alle Elemente, die für ein hohes Expressionsniveau in Samen benötigt wurden, in dieser kleinen Region vorhanden waren.
Die Fragmente der regulatorischen Elemente, die hierin offenbart sind, können unter hochstringenten Bedingungen mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NR: 4 oder NR: 5 oder Fragmenten hiervon hybridisieren. Die Hybridisierung bezieht typischerweise Southern-Analyse (Southern Blotting) ein. Siehe z. B. Abschnitte 9.37–9.52 von Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Press, Plainview; NY. Hochstringente Bedingungen können die Verwendung von geringer ionischer Stärke und hoher Temperatur zum Waschen einbeziehen, z. B. 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat (0,1 × SSC), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) bei 65°C. Alternativ können Denaturierungsmittel wie z. B. Formamid während der Hybridisierung eingesetzt werden, z. B. 50% Formamid mit 0,1% bovinem Serumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer mit pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C. Ein anderes Beispiel ist die Verwendung von 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt'sche Lösung, mit Ultraschall behandelter Lachsspermien-DNA (50 μg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C mit Waschschrittten bei 42°C in 0,2 × SSC und 0,1% SDS.
Ein erfindungsgemäßes regulatorisches Element kann aus den 5'-flankierenden Sequenzen eines genomischen fad-Gens kloniert werden oder kann durch andere Mittel, einschließlich chemischer Synthese und Polymerasekettenreaktions-(PCR)-technologie erhalten werden. PCR bezieht sich auf eine Verfahrensweise oder Technik, in welcher Zielnukleinsäuren amplifiziert werden. Im Allgemeinen wird eine Sequenzinformation von den Enden der interessierenden Region oder darüber hinaus eingesetzt, um Oligonukleotidprimer zu entwickeln, die mit dem Gegenstrang des zu amplifizierenden Templates bezüglich ihrer Se quenz identisch oder dazu ähnlich sind. Die PCR kann verwendet werden, um spezifische Sequenzen aus sowohl DNA als auch RNA zu amplifizieren, einschließlich Sequenzen genomischer Gesamt-DNA oder zellulärer Gesamt-RNA. Primer sind typischerweise 14 bis 40 Nukleotide lang, aber können im Bereich von 10 Nukleotiden bis Hunderte von Nukleotiden lang sein. PCR ist z. B. in PCR Primer: A Laboratory Manual, hrsg. von Dieffenbach, C. und Dveksler, G., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995, beschrieben. Nukleinsäuren können durch Ligasekettenreaktion, Strangverdrängungsamplifikation, selbsterhaltende Sequenzreplikation oder Amplifikation auf Grundlage der Nukleinsäuresequenzen amplifiziert werden. Siehe z. B. Lewis, R., Genetic Engineering News, 12(9): 1 (1992); Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1874–1878 (1990); und Weiss, R., Science, 254: 1292 (1991).
Nukleinsäurekonstrukte
Erfindungsgemäße regulatorische Elemente können verwendet werden, um Nukleinsäuremoleküle in Pflanzen zu exprimieren. Wie hierin verwendet, bezieht sich "heterologes Nukleinsäuremolekül" auf ein Nukelinsäuremolekül, das von einem 5'-regulatorischen Element der Fettsäuredesaturase und seiner assoziierten kodierenden Sequenz verschieden ist und jede beliebige exogene Nukleinsäure einschließt, die teilweise oder vollständig heterolog (d. h. fremd) für die Pflanze ist, oder das homolog hinsichtlich eines endogenen Nukleinsäuremoleküls der Pflanze ist. Ein regulatorisches Element und ein heterologes Nukleinsäuremolekül können in Sense- oder Antisense-Orientierung verbunden sein. Wie hierin verwendet, bezieht sich "funktionsfähig verknüpft" auf eine kovalente Verknüpfung zweier oder mehrer Nukleinsäuremoleküle in einer Weise, so dass eine Transkription und Translation auftreten kann, d. h. die Produktion eines Polypeptids oder RNA-Moleküls ermöglicht wird.
Antisense-RNA wurde verwendet, um Pflanzenzielgene unter Verwendung sowohl der gesamten cDNA-Sequenz als auch einer partiellen cDNA-Sequenz zu inhibieren. Es gibt auch Hinweise, dass 3'-nichtkodierende Sequenzfragmente oder 5'-kodierende Sequenzfragmente eine wichtige Rolle bei der Antisense-Inhibition spielen können. Antisense-Nukleinsäurekonstrukte schließen ein erfindungsgemäßes regulatorisches Element ein, das funktionsfähig in Antisense-Orientierung mit einem interessierenden Nukleinsäuremolekül verknüpft ist, das für das regulatorische Element heterolog ist.
Konstrukte, die funktionsfähig in Sense-Orientierung verknüpft sind, können verwendet werden, um die Expression eines endogenen Gens zu inhibieren. Die Co-Suppression unter Verwendung einer Volllängen-cDNA-Sequenz wie auch einer partiellen cDNA-Sequenz sind bekannt. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5,231,020 .
Heterologe Nukleinsäuremoleküle können z. B. Ribozyme kodieren, die entwickelt wurden, um besondere mRNA-Transkripte zu spalten, wodurch die Expression eines Polypeptids verhindert wird. Hammerkopfribozyme sind zum Zerstören besonderer mRNA verwendbar, obwohl auch verschiedene Ribozyme, die mRNA an schnittstellenspezifischen Erkennungsstellen schneiden, verwendet können. Hammerkopfribozyme spalten mRNA an Stellen, die durch die flankierenden Regionen vorgegeben werden, die komplementäre Basenpaare mit der Ziel-mRNA bilden. Das einzige Erfordernis ist, dass die Ziel-RNA eine 5'-UG-3'-Nukleotidsequenz enthält. Die Konstruktion und Herstellung von Hammerkopfribozymen sind in der Technik gut bekannt. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5,254,678 . Sequenzen von Hammerkopfribozymen können in stabile RNA, wie z. B. Transfer-RNA (tRNA) eingebettet sein, um die Spaltungseffizienez in vivo zu erhöhen. Perriman, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(13): 6175–6179 (1995); de Fester, R. und Gaudron, J., Methods in Molecular Biology, Bd. 74, Kapitel 43, "Expressing Ribozymes in Plants", hrsg. von Turner, P. C, Humana Press Inc., Totowa, NJ. RNA-Endoribonukleasen, wie z. B. jene, die natürlicherweise in Tetrahymena thermophila auftritt, und die ausführlich von Cech und Mitarbeitern beschrieben wurden, sind auch verwendbar. Siehe z. B. US-Patent Nr. 4,987,071 .
Heterologe Nukleinsäuremoleküle können auch Polypeptide kodieren. Wie hierin verwendet, bezieht sich "Polypeptid" auf eine Aminosäurekette, unabhängig von ihrer Länge oder einer posttranslationalen Modifikation. Polypeptide können Enzyme oder Fragmente davon, die das Wachstum, die Hormonproduktion, photosynthetische Wirksamkeit, den Nährwert und die Öl- oder Proteinzusammensetzung regulieren, oder Reporterpolypeptide wie z. B. grün fluoreszierendes Protein, Neomycinphosphotransferase II oder β-Glucuronidase einschließen. Polypeptide können z. B. auch Resistenz gegenüber Umweltstress wie z. B. Trockenheit oder Kälte, Pathogenen, Insekten oder Herbiziden verleihen. Toxingene aus Bacillus thuringiensis können in Pflanzen exprimiert werden, um Resistenz gegenüber Insekten bereitzustellen. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5,380,831 . Herbizidresistenz gegenüber Glyphosat und Glufosinat kann durch Exprimieren von Nukleinsäuremolekülen bereitgestellt werden, die 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase-(EPSPS)-Polypeptide bzw. Phosphinothricinacetyltransferase-(PAT)-Polypeptide kodieren. Siehe z. B. US-Patent Nrn. 4,940,835 und 5,489,520 . Zusätzlich kann Resistenz gegenüber Glyphosat und Glufosinat durch Exprimieren eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Hygromycinphosphotransfe rase-(HPH)-Polypeptid oder die glpA- und glpB-Gene aus Pseudomonas in Plastiden der Pflanze kodiert, bereitgestellt werden. Siehe z. B. WO 99/05265 . Resistenz gegenüber Herbiziden vom Imidazolintyp kann durch Expression eines Nukleinsäuremoleküls bereitgestellt werden, das ein Acetohydroxysäuresynthase-Polypeptid kodiert. Siehe z. B. US-Patent Nr. 4,761,373 . Resistenz gegenüber Cyclohexandion- oder Aryloxyphenoxypropansäuretypherbiziden kann in Mais durch Expression von Nukleinsäuremolekülen bereitgestellt werden, die herbizidresistente Acetyl-CoA-Carboxylasepolypeptide (ACC1 und ACC2) kodieren. Siehe z. B. WO 98/08963 und Herbert et al., Pestic. Sci., 1997, 50: 67–71. Expression eines Protoporphyrinogenoxidasepolypeptids, das resistent gegenüber Porphyrinherbiziden ist, stellt Herbizidresistenz gegen Protoporphyrinogen inhibierende Herbizide bereit. Siehe z. B. WO 98/29554 . Resistenz gegenüber Herbiziden vom Benzyoylcyclohexandiontyp kann durch Expression eines Nukleinsäuremoleküls bereitgestellt werden, das herbizidresistente 4-Hydroxyphenylpyruvatdioxygenasepolypeptide kodiert. Siehe z. B. Barta und Boger, Pestic. Sci., 1996, 48(2): 109–116; WO 98/02562 ; und WO 99/24586 . Herbizidresistenz kann auch durch Expression von Nukleinsäuremolekülen bereitgestellt werden, die einzelkettige Fv-Antikörper kodieren, die ein Herbizid binden. Die Expression von einzelkettigen Fv-Antikörpern mit spezifischer Bindungsaktivität für virale Hüllproteine, z. B. in dem Zytosol von Pflanzen, kann Resistenz gegenüber viralen Pathogenen verleihen. Siehe z. B. Conrad und Fiedler, Plant Mol. Biol., 1998, 38(1&2): 101–109 und WO 98/42852 .
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt kann ein Nukleinsäuremolekül einschließen, das eine 3'-untranslatierte Region (3'UTR; 3' untranslated region) kodiert, die die Stabilität der transkribierten Sequenzen durch Bereitstellen der Addition von mehreren Adenylatribonukleotiden am 3'-Ende der transkribierten mRNA-Sequenz erhöht. Die 3'UTR kann z. B. die Napolinsynthase-(NOS)-3'UTR oder die 3'UTR eines fad-Gens sein, die in dem natürlich vorkommenden Genom 3' von der fad kodierenden Sequenz lokalisiert ist. Wie hierin verwendet, bezieht sich "3'" auf Sequenzen von 4000 bp oder weniger (z. B. ungefähr 2000 bp oder weniger), die stromabwärts einer fad kodierenden Region gelegen sind. Wie hierin beschrieben, wurden die 3'UTR der fad2D- und fad2F-Gene isoliert und haben die Nukleotidsequenzen, die in 5 (SEQ ID NR: 6) bzw. in 6 (SEQ ID NR:7) dargestellt sind. Ein Teil der 3'-untranslatierten Regionen von fad2D und fad2F waren homolog zu Actingenen verschiedener Pflanzenspezies. In pMB103 endet die actinhomologe Region bei Nukleotidposition 8846 (3'-Ende) und beginnt bei Nukleotid 9341 (5'-Ende). In pMB102 endet die actinhomologe Region bei Nukleotidposition 7007 (3'-Ende) und beginnt bei Nukleotid 7491 (5'-Ende). Fragmente von Nukleinsäuremolekü len der SEQ ID NRN: 6 und 7 können hergestellt werden, wie z. B. Nukleinsäurefragmente, die die Nukleotide 1-894 von SEQ ID NR: 6 oder der Nukleotide 1-817 von SEQ ID NR: 7 einbeziehen, die partielle Actingene ausschließen. Zusätzliche Fragmente, die mindestens 100 Nukleotide lang sind und die mindestens 70% Sequenzidentität mit den Nukleotiden 1-894 von SEQ ID NR: 6 oder den Nukleotiden 1-817 von SEQ ID NR: 7 besitzen, können auch hergestellt und in den erfindungsgemäßen Konstrukten verwendet werden. Zum Beispiel kann eine 3'UTR eines fad-Gens mit dem 3'-Ende eines heterologen Nukleinsäuremoleküls verknüpft werden, das weiter mit jedem beliebigen 5'-regulatorischen Element, einschließlich dem 35S-Promotor von CaMV, verknüpft werden kann.
Nukleinsäurekonstrukte können auch Elemente wie z. B. induzierbare Elemente, Intronsequenzen, Enhancersequenzen oder abzielende Sequenzen enthalten. Solche Elemente sind für die Funktion des heterologen Nukleinsäuremoleküls nicht notwendig, obwohl sie eine bessere Expression bereitstellen oder es erlauben, dass ein Nukleinsäuremolekül auf eine bestimmte Organelle (z. B. einen Plastiden) abgezielt wird. Zum Beispiel kann die 5'UTR der kleinen Untereinheit der Ribulose-Bisphosphat-Carboxylase zur Verstärkung der Expression bereitgestellt werden. Nukleinsäuremoleküle, die ein Transitpeptid aus der kleinen Untereinheit der Ribulose-Bisphosphat-Carboxylase oder anderer auf Plastiden abzielende Proteine kodieren, können verwendet werden, um das kodierte Produkt auf den Plastiden abzuzielen. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5,925,806 und Tingey et al., J. Biol. Chem., 1988, 263(20): 9651–9657. Geeignete Introns zur Verwendung in der Erfindung schließen die fad2D- und fad2F-Introns ein. Die Sequenz des fad2D-Introns ist in WO 98/56239 gezeigt.
Das Timing der Expression eines Nukleinsäuremoleküls, das von einem 5'-reglatorischen Element aus einem fad-Gen kontrolliert wird, wird von dem von Nukleinsäuren, die von den ACP- oder Napinpromotoren kontrolliert werden, auf Grundlage der differentiellen Expression der entsprechenden nativen Gene verschieden sein. Zusätzlich wird das Expressionsniveau und die Regulation der 5'-regulatorischen Elemente von fad von denen der Napin- und ACP-Promotoren verschieden sein. Als solche könnten die 5'-regulatorischen Elemente der fad-Gene spezielle Vorteile gegenüber anderen Promotoren bei der Regulation der Expression von fremden oder endogenen Genen haben.
Überraschenderweise exprimiert jeder der Promotoren aus den fad2D- und fad2F-Genen Nukleinsäuremoleküle in einer Anzahl verschiedener Pflanzen. Da kürzlich identifizierte mutierte fad2D-Gene in einer Veränderung des Ölsäuregehalts in Samen, jedoch nicht in Wurzeln oder Blättern, der Canolapflanzen resultierten, wurde erwartet, dass die fad2D- Genexpression spezifisch für Pflanzensamen war. Zusätzlich besitzen Canolapflanzen, die eine Punktmutation in sowohl den fad2D- als auch fad2F-Genen besitzen, verkrüppelte Wurzeln, wenn sie bei niedrigen Temperaturen oder auf dem Feld wachsen gelassen werden, aber sie enthalten bis zu 85% Ölsäure in den Samen. Die Wurzeln solcher Pflanzen zeigen eine veränderte Lipidzusammensetzung, ähnlich zu dem Ölsäuregehalt in den Samen. Auf Grundlage dieser Daten nahm man an, dass fad2F sowohl in Samen als auch Wurzeln exprimiert wurde und dass fad2D in Samen exprimiert wurde. Allerdings wird fad2D in Wurzeln sogar in höherem Niveau als fad2F, wie hierin beschrieben, exprimiert (auf Grundlage einer RT-PCR-Analyse). Die erfindungsgemäßen regulatorischen Elemente können verwendet werden, um die Expression oder die Co-Suppression von interessierenden Genen in geeigneten Entwicklungsstadien und in Geweben entsprechend ihrer endogenen fad2D- und fad2F-Expression zu steuern.
Erfindungsgemäße regulatorische Elemente sind bei der Steuerung der transienten Expression von β-Glucuronidase (GUS) in Brassica und Sojabohnenblättern und im Callus von Brassica ähnlich zu dem 35S-Promotor. In Wurzeln und embryonalem Gewebe von Brassica scheinen allerdings die fad2D- und fad2F-Promotoren höhere Niveaus an GUS-Expression zu besitzen als der 35S-Promotor. Zusätzlich kann der fad2F-Promotor die Expression von GUS in Maisbättern auf Niveaus steuern, die dem des 35S-Promotors ähnlich sind. Dies bedeutet, dass zusätzlich zur Expression in dikotylen Pflanzen der fad2F-Promotor verwendet werden kann, um ein interessierendes Gen in monokotylen Pflanzen zu exprimieren.
Transgene Pflanzen
Transgene Pflanzen können durch Einführen mindestens eines Nukleinsäurekonstrukts in eine Pflanzenzelle wie hierin beschrieben erhalten werden. Geeignete Pflanzen schließen Dikotyledonen wie z. B. Alfalfa, Sojabohnen, Raps (hoher Gehalt an Erucasäure und Canola) oder Sonnenblumen und Monokotyledonen, wie Mais, Weizen, Roggen, Reis oder Hirse ein. Samen, die von transgenen Pflanzen hergestellt wurden, können wachsen gelassen und über Inzucht vermehrt werden (oder ausgekreuzt und über Inzucht vermehrt werden), um für das Konstrukt homozygote Pflanzen zu erhalten. Die Samen können analysiert werden, um jene Homozygoten mit der gewünschten Expression des Konstrukts zu identifizieren. Transgene Pflanzen können in ein Zuchtprogramm aufgenommen werden, z. B. um die Saat zu steigern, das neue Konstrukt in Linien anderer Spezies zu introgressieren oder für die weitere Selektion anderer wünschenswerter Merkmale. Alternativ können transgene Pflanzen für jene Spezies, die solchen Techniken zugänglich sind, durch vegetative Vermehrung einer transformierten Pflanzenzelle erhalten werden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich eine transgene Pflanze auch auf einen Nachkommen einer ursprünglich transgenen Pflanze. Nachkommen schließen Abkömmlinge einer bestimmten Pflanze oder Pflanzenlinie ein, z. B. Samen, die von einer vorliegenden Pflanze entwickelt wurden. Nachfahren einer vorliegenden Pflanze schließen auch Pflanzen ein, die auf F₁-, F₂-, F₃- und nachfolgenden Generationen von Pflanzen gebildet wurden, oder Samen, die auf BC₁-, BC₂-, BC₃- und nachfolgenden Generationen von Pflanzen gebildet wurden.
Transgene Techniken zur Verwendung in der Erfindung schließen ohne Beschränkung Agrobacterium-vermittelte Transformation, Elektroporation und Teilchenbeschusstransformation ein. Veranschaulichende Beispiel von Transformationstechniken sind in der PCT-Anmeldung Nr. 99/04117 (Teilchenbeschuss von Brassica) und dem US-Patent Nr. 5,188,958 (Agrobacterium) beschrieben. Transformationsverfahren, die Ti- und Ri-Plasmide von Agrobacterium spp. verwenden, verwenden typischerweise Vektoren des binären Typs. Walkerpeach, C. et al., in Plant Molecular Biology Manual, S. Gelvin und R. Schilperoort, Hrsg., Kluwer Dordrecht, C1: 1–19 (1994). Falls Zell- oder Gewebekulturen als Empfängergewebe für die Transformation verwendet werden, können Pflanzen aus transformierten Kulturen durch Techniken gewonnen werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Erfindungsgemäße transgene Pflanzen sind für eine Vielzahl kommerzieller und wissenschaftlicher Zwecke verwendbar, da die erfindungsgemäßen regulatorischen Elemente verwendet werden können, um jedes beliebige interessierende heterologe Nukleinsäuremolekül zu exprimieren. Transformierte Pflanzenzellen sind auch verwendbar, da sie kontinuierlich in Kultur vermehrt werden können. Solche Kulturen sind für die In-vitro-Herstellung einer Vielzahl nützlicher Materialien verwendbar, z. B. sekundärer Metaboliten oder ätherischer Öle.
Die Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen beschrieben, die den Umfang der Erfindung, die in den Ansprüchen beschrieben ist, nicht beschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Identifikation von Promotorsequenzen
Eine genomische DNA-Bibliothek (300.000 Plaques) aus B. napus, Sorte ,Bridger' wurde durch Hybridisierung mit der kodierenden Region von fad2D gescreent. Ungefähr 16 positive Plaques wurden in der dritten Screeningrunde identifiziert und anschließend gereinigt. Die Plaque-DNA der 16 positiven Plaques wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen und durch Southern-Analyse unter Verwendung der kodierenden Region von fad2D als eine Sonde kartiert. Positive genomische DNA-Fragmente (erzeugt durch SalI-Verdau und identifiziert durch Southern-Analyse) aus zwei Plaques (Klone 1-3A1A und 1-2A1A) wurden in den pSP72-Vektor an der SalI-Schnittstelle subkloniert, um die Plasmide pMB103 bzw. pMB102 herzustellen (1 und 2). Die Plasmide pMB102 und pMB103 wurden bei der „American Type Culture Collection" hinterlegt. Subklonierte SalI-DNA-Fragmente in pSP72 wurden mit verschiedenen Restriktionsenzymen kartiert.
Die Gegenwart der fad2D- und fad2F-Gene in den subklonierten SalI-DNA-Fragmenten in pMB103 und pMB102 wurde über PCR verifiziert. Die Reaktionsbedingungen schlossen ein: 5 μl 10 × PCR-Puffer mit Mg²⁺ (Boehringer Mannheim, bereitgestellt mit Taq-Polymerase), 1 μl 10 mM dNTPs (Boehringer Mannheim, Katalognrn. 1 051 458, 1 051 440, 1 051 466 und 1 051 482), 1 μl 10 μM Fad2D-RT-1 (caucaucaucauACCGCTACGCTGCTGTCCAA, SEQ ID NR: 1) oder 1 μl 10 μM Fad2F-RT2 (caucaucaucauCTCTTCCGTTACGCCTTCACGTAG, SEQ ID NR: 2), 1 μl 10 μM BS4 (cuacuacuacuaCATAACTTATTGTTGTACCAG, SEQ ID NR: 3), 0,5 μl Taq-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim, Katalognr. 1 647 679), 40,5 μl ddH₂O und 1,0 μl 10 ng/μl DNA-Template. Die Proben wurden auf 95°C für 4 Minuten erhitzt, dann unter Verwendung von 30 Zyklen von Denaturierung bei 94°C für 1 Minute, Annealen bei 65°C für 2 Minuten und Verlängerung bei 72°C für 3 Minuten, gefolgt von einer endgültigen Verlängerung bei 72°C für 10 Minuten, amplifiziert. Das Primerpaar von Fad2F-RT-1 und BS-4 amplifizierte spezifisch das fad2F-Gen, wohingegen Fad2D-RT-1 und BS-4 spezifisch das fad2D-Gen amplifizierten. Die Reaktionsprodukte, die erzeugt wurden, waren konsistent mit dem 1-2A1A-Fragment, das das fad2F-Gen enthielt, und 1-3A1A, das das fad2D-Gen enthielt.
Zusätzlich wurden die 1-2A1A- und 1-3A1A-Klone unter Verwendung synthetischer Primer aus den kodierenden Regionen von fad2D und fad2F sequenziert. Das Sequenzieren der DNA wurde unter Verwendung des „ABI PRISM 310"-(Perkin Elmer)-Sequenzierers, der AmpliTaq-DNA-Polymerase und Farbstoffterminatoren, wie vom Hersteller beschrieben, durchgeführt. Die kodierenden Sequenzen in den genomischen 1-2A1A- und 1-3A1A-Klonen waren identisch zu den zuvor sequenzierten kodierenden Regionen von fad2F und fad2D, was bestätigte, dass die 1-2A1A- und 1-3A1A-Fragmente die fad2F- bzw. fad2D-Gene enthalten. Die vollständigen Nukleotidsequenzen der genomischen DNA-Fragmente aus jedem Konstrukt wurden erhalten und sind in den 3 und 4 dargestellt. In beiden Klonen war ein Intron vier Nukleotide stromaufwärts des "ATG"-Kodons des Initiationspunkts der Translation vorhanden.
Ein Verdau mit den Restriktionsenzymen SalI und PpuMI von pMB102 und pMB103 wurde verwendet, um DNA-Fragmente von ungefähr 3,9 kB bzw. 5,8 kB herzustellen, die den Promotor enthielten, aber frei von Intron und kodierenden Sequenzen waren. DNA-Fragmente, die durch Restriktionsenzymverdaue freigesetzt wurden, wurden in Agarosegelen gelöst und wie vom Hersteller (Quiagen) beschrieben gereinigt. Die gereinigten Fragmente wurden in die SalI-/SmaI-Schnittstellen von pMB160 ligiert, welcher ein GUS-NOS-DNA-Fragment enthielt, das in die XbalI-/EcoRI-Schnittstelle von pSP72 kloniert war, um die neuen Plasmide pMB168 bzw. pMB166 zu erhalten. DNA-Ligationen wurden mit T4-DNA-Ligase wie vom Hersteller (BRL) beschrieben durchgeführt und dann in DH5α-Bakterienzellen propagiert. Die 5'-regulatorischen Elemente der fad-Gene wurden in pMB160 platziert, so dass die regulatorischen Elemente die Expression von GUS treiben könnten.
Die Nukleotidsequenz der Promotorregion von pMB166 und pMB168 wurde unter Verwendung von MEGALIGN^®-(DNASTAR, Madison, WI)-Sequenzalignmentsoftware und dem Clustal-V-Verfahren und -algorithmus, der von Higgins und Sharp, Gene, 1988, 73(1): 237–44 und Comput. Appl. Biosci., 1989, 5(2): 151–153 beschrieben wurde, abgeglichen. Ein "Gap-Penalty" von 100 und ein "Gap-Length-Penalty" von 2 wurden für Mehrfachalignment verwendet. Die Parameter für paarweises Alignment schlossen einen "K-Tupe" von 2, ein "Gap-Penalty" von 5 und ein "Window" von 4 und ein "Diagonal" von 4 ein. Das Alignment der fad2D- und fad2F-Promotoren in pMB166 bzw. pMB168 identifizierte eine Region mit 86,4% Identität. Diese Region beginnt und endet bei den Nukleotiden 4940 bzw. 5796 in dem fad2D-Promotor (3, SEQ ID NR: 4) und bei den Nukleotiden 3132 bzw. 3867 in dem fad2F-Promotor (4, SEQ ID NO: 5). Es scheint, dass diese konservierte Region alle für die vollständige Funktionstüchtigkeit beider Promotoren erforderlichen Elemente enthält (siehe Beispiel 3). Die fad2D- und fad2F-Intronnukleotidsequenz wurde unter Verwendung des selben Computerprogramms und der gleichen Parameter abgeglichen. Die beiden Introns hatten 73% Identität.
Beispiel 2 – RT-PCR-Analyse der Fad2F- und Fad2D-Expression in verschiedenen Pflanzengeweben:
RNA-STAT-60-RNA-Isolierung: RNA wurde aus Blättern und Wurzeln von Brassica napus-Pflanzen, Sorte Westar, die für 2 Wochen im Gewächshaus gezogen worden waren, und aus Samen, die 10, 20, 30, 30–50 und 45–55 Tage nach dem Blühen von auf dem Feld gezogenen Brassica napus-IMC129 gesammelt worden waren, isoliert. IMC129 ist in US-Patent Nr. 5,668,299 beschrieben. Die Proben wurden bei –70°C vor der RNA-Extraktion gelagert. Die RNA-Isolierung basierte auf dem Protokoll des Herstellers für RNA STAT-60 (Tel-Test-"B" Bulletin Nr. 1). Ungefähr 200 μg Gewebe wurden pro 2 ml Reagens verwendet. Das Gewebe wurde mit Mörser und Stößel unter Stickstoff gemahlen, zu dem Reagens zugegeben und unter Verwendung eines Polytronhomogenisators vor dem Extraktionsschritt homogenisiert. Siehe Chomczynski und Sacchi, Anal. Biochem., 1987, 162: 156–159; und Kedzierski und Porter, Biotechniques, 1991, 10: 210–214.
Reverse Transkription: Das Erststrang-cDNA-Reaktionsgemisch wurde hergestellt und enthielt 10 μl 5 × Erststrangpuffer (BRL), 5 μl jeden dNTPs (5 mM), 1 μl Oligo-dT_(12–18)-Primer (0,5 mg/ml), 1 μl _pd(N)₆-Primer (0,5 mg/ml), 1 μl RNA (1–2 μg gesamt) und 28 μl dH₂O. Nach Inkubation des Reaktionsgemisches bei 65°C für 2 Minuten und Abkühlen auf 35°C bei Raumtemperatur wurden 2 μl 100 mM DTT, 1 μl RNasin (Promega) und 1 μl Superscript-II-Reverse-Transkriptase (BRL) zugefügt und gemischt. Die Reaktion wurde für zusätzliche 5 min bei 25°C, 5 min bei 30°C und 60 min bei 37°C inkubiert. Die PCR wurde unter Verwenden von 2,5 μl Erststrang-cDNA-Reaktionsgemisch oder 0,5 μg pMB102- oder pMB103-DNA-Konstrukt, 5,0 μl 10 × PCR-Puffer II (Perkin-Elmer), 2,5 μl eines jeden dNTPs (5 mM), 1,0 μl Upstream-Primer (50 μM gesamt), 1,0 μl Downstream-Primer (50 μM gesamt), 0,5 μl Amplitaq-Polymerase (Perkin-Elmer) und 37,5 μl dH₂O (50 μl gesamt) durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen schlossen 35 Zyklen von Denaturierung bei 94°C für 15 sec, Annealen bei 60°C für 30 sec und Verlängerung bei 72°C für 60 sec ein. Die Primer, die verwendet wurden, schlossen die Stromabwärts-Primer BS-4 (SEQ ID NR: 3) und entweder Fad2D-RT1 oder Fad2F-RT2 (SEQ ID NRN: 1 bzw. 2) als Stromaufwärts-Primer ein.
Die Amplifikationsprodukte waren 434 Nukleotide für sowohl fad2D als auch fad2F und wurden durch Elektrophorese durch ein Agarosegel und Ethidiumbromidfärbung nachgewiesen. Die Spezifität der amplifizierten Produkte wurde durch Verdau mit BalI- oder SspI-Restriktionsenzymen verifiziert. Ein BalI-Restriktionsverdau erzeugte Fragmente von 274 und 160 Basenpaaren in fad2D, wohingegen ein SspI-Verdau Fragmente von 234 und 200 Basenpaaren in fad2F herstellte. Die RT-PCR-Daten zeigten, dass die fad2F- und fad2D-Gene in allen untersuchten Geweben exprimiert wurden, einschließlich Blättern, Wurzeln und Samen, obwohl das Niveau der fad2D-Genexpression höher war als das des fad2F-Gens. Diese Daten korrelieren mit der Analyse der fad2F- und fad2D-Promotoren, die nachfolgend beschrieben ist.
Beispiel 3 – Fad2D- und Fad2F-Promotoranalyse:

Es wurden Konstrukte hergestellt, die das GUS-Reportergen ohne einen Promotor (pMB160) unter der Kontrolle eines fad2D-Promotors (pMB166) unter der Kontrolle von fad2D-Promotor-5'-Deletionen (pMB179 und pMB180), unter der Kontrolle eines fad2F-Promotors (pMB168), unter der Kontrolle von fad2F-Promotor-5'-Deletionen (pMB167 und pMB176) oder unter der Kontrolle des 35S-Promotors (pMB146) enthielten. Tabelle 1 stellt eine Beschreibung jedes dieser Konstrukte bereit. TABELLE Beschreibung der Plasmide

Plasmid	Beschreibung	Länge des Promotors (bp)
pMB103	1-3A1A SalI-genomisches DNA-Fragment isoliert aus der 'Bridger'-genomischen Bibliothek, enthält das Gen und den Promotor von fad2D. Dieses Fragment wurde in die SalI-Schnittstelle des pSP72-Vektors subkloniert.
pMB102	1-2A1A SalI-genomisches DNA-Fragment isoliert aus der 'Bridger'-genomischen Bibliothek, enthält das Gen und den Promotor fad2F. Dieses Fragment wurde in die SalI-Schnittstelle des pSP72-Vektors subkloniert.
pMB166	Das SalI- und PpuMI-(stumpfendige)-DNA-Fragment (enthaltend die genomische DNA-Sequenz stromaufwärts des fad2D-Introns) aus dem pMB103-Konstrukt wurde an die SalI- und SmaI-Schnittstellen des pMB160-Konstrukts ligiert.	5800
pMB179	Das pMB166-Konstrukt wurde mit PstI verdaut und wieder ligiert, um die Region stromaufwärts des Promotors zu entfernen.	683
pMB180	Das pMB166-Konstrukt wurde mit HindIII verdaut und wieder ligiert, um die Region stromaufwärts des Promotors zu entfernen.	1215
pMB168	Das SalI- und PpuMI-(stumpfendige)-DNA-Fragment (enthaltend die genomische DNA-Sequenz stromaufwärts des Fad2F-Introns) aus dem pMB102-Konstrukt wurde an die SalI- und SmaI-Schnittstellen des pMB160-Konstrukts kloniert.	3800
pMB167	Das pMB168-Konstrukt wurde mit PvuII verdaut und wieder ligiert, um die Region stromaufwärts des Promotors zu entfernen.	1786
pMB175	Das pMB166-Konstrukt wurde mit PstI verdaut und wieder ligiert, um die Region stromaufwärts des Promotors zu entfernen.	670
Kontrollplasmide
pMB146	Das 35S-GUS-NOS-DNA-Fragment wurde aus dem binären Vektor pBI121 (Clontech) durch HindIII- und EcoRI-Verdau freigesetzt und dann in die HindIII- und EcoRI-Schnittstellen von SP72 subkloniert.
pMB160	Das GUS-NOS-DNA-Fragment wurde aus dem binären Vektor pBI121 (Clontech) durch XbaI- und EcoRI-Verdau freigesetzt und dann in die XbaI- und EcoRI-Schnittstellen von SP72 subkloniert. Diese Plasmid enthält keinen Promotor.

Die Stärke der verschiedenen Promotor-GUS-Konstrukte wurde auf Grundlage der Fähigkeit, die transiente GUS-Expression in verschiedenen Pflanzengeweben nach biolistischer Transformation zu steuern, evaluiert. Siehe PCT-Anmeldung Nr. 99/04117 für eine Beschreibung einer biolistischen Transformation von Brassica. Die für den Partikelbeschuss verwendete Vorrichtung war das „Biolistic PDS-1000/HE-System" (Dupont). Die Vorgehensweise für den Partikelbeschuss folgte dem Bio-Rad US/EG Bulletin 1689 unter Verwendung von 0,6 μm Goldpartikeln. Jeder Beschuss verabreichte ungefähr 2 μg DNA. Nach dem Beschuss wurden die Gewebe kultiviert und in einer feuchten Umgebung für 24 Stunden gehalten, wie in der PCT-Anmeldung Nr. 99/04117 beschrieben, und dann durch Färben auf GUS-Expression getestet. Ein GUS-Färbeverfahren ist von Stopm in GUS Protocols: Using the GUS Gene as a Reporter of Gene Expression, Sean R. Gallagher (Hrsg.), 1992, S. 103–13, Academic Press, San Diego, Kalifornien, beschrieben.
Die Promotorstärke wurde aus der GUS-Färbung unter Verwendung eines Beurteilungssystems von 0 bis 5 abgeschätzt. "0" zeigt an, dass keine blauen Punkte beobachtet wurden; "1" zeigt an, dass 1–10 blaue Punkte beobachtet wurden; "2" zeigt an, dass 11–100 blaue Punkte beobachtet wurden; "3" zeigt an, dass 101–1000 blaue Punkte beobachtet wurden; "4" zeigt an, dass 1001–5000 blaue Punkte beobachtet wurden; und "5" zeigt an, dass > 5001 blaue Punkte beobachtet wurden.
Zwischen ein und vier Experimente wurden für Weizen und Sojabohnen durchgeführt. Zwei bis acht Experimente wurden für Brassica-Spezies, Mais und Sonnenblume durchgeführt. Tabelle II zeigt den höchsten in Experimenten beobachteten Grad.
Die Hintergrundexpression des GUS-Gens wurde unter Verwendung des pMB160-Konstrukts evaluiert. In den Blättern, dem Mikrosporenembryo und Wurzeln von Brassica-Species variierte die GUS-Hintergrundexpression in Abhängigkeit von dem getesteten Gewebe zwischen 0 und 1. Die GUS-Hintergrundexpression wurde in Sojabohnenblättern mit einem Niveau von 1 bis 2 nachgewiesen.
Der fad2F-Promotor (3866 bp) in dem pMB160-Konstrukt exprimierte GUS transient in Blättern, Wurzeln, Mikrosporenembryonen, kultivierten Geweben und dem Kotyledon und Hypokotyl von Brassica (B. napus und B. juncea), in Niveaus, die als 5, 2, 2, 3 bzw. 2 eingestuft wurden. Eine hohe GUS-Expression wurde in Sojabohnenblättern (Grad 5) und in Sonnenblumenblättern (Grad 3) beobachtet. Der fad2F-Promotor war in der Lage, die Expression von GUS in Maisblättern (einer monokotolydonen Spezies) bei einem Grad von 1 zu steuern.
Eine Expression von GUS wurde auch erhalten, wenn Fragmente des fad2F-Promotors verwendet wurden. Der fad2F-Promotor aus dem pMB167-Konstrukt, in welchem 5' 1800 Nukleotide deletiert wurden (was die Nukleotide 2081–3867 von SEQ ID NR: 5 übrig lässt), exprimierte GUS transient in Blättern, Mikrosporenembryonen und kultiviertem Gewebe von Brassica, wobei Grade von 4, 2 bzw. 2 erreicht wurden. Der fad2F-Promotor aus dem pMB175-Konstrukt (Nukleotide 3197–3867 von SEQ ID NR: 5) exprimiert GUS transient in Blättern und Mikrosporenembryonen von Brassica mit Niveaus, die die Grade von 3 bzw. 1 erreichten. Der fad2F-Promotor in dem pMB167- und pMB168-Konstrukten exprimierte GUS transient in ähnlichen Niveaus, während eine niedrigere transiente GUS-Expression unter Verwendung des pMB175-Konstrukts nachgewiesen wurde. Diese Daten lassen vermuten, dass der fad2F-Promotor in pMB168 alle notwendigen Elemente besitzt, um die Expression von GUS transient zu steuern, ohne die Expressionsniveaus, die mit dem vollständigen Promotor (Konstrukt pMB167) beobachtet wurden, zu reduzieren. Eine niedrigere GUS-Aktivität, die unter Verwendung des pMB175-Konstrukts beobachtet wurde, könnte anzeigen, dass ein Aktivierungselement oder eine Region entfernt wurde, die die Promotorstruktur beeinflusst.
Der fad2D-Promotor (5800 bp) aus dem pMB166-Konstrukt exprimiert GUS transient in Blättern, Wurzeln, Mikrosporenembryonen und kultivierten Geweben von Brassica mit Niveaus, die die Grade 4, 1 bzw. 2 erreichen. Ein Expressionsniveau von "3" wurde auch in Sojabohnenblättern erhalten.
Fragmente des fad2D-Promotors stellten auch Expression von GUS bereit. Der fad2D-Promotor aus dem pMB179-Konstrukt (685 bp, Nukleotide 5113–5796 von SEQ ID NR: 4) exprimierte GUS transient in Blättern von Brassica in Abhängigkeit von dem Entwicklungsstadium des Gewebes bis zu einem Grad von 3. Der fad2D-Promotor aus dem pMB180-Konstrukt (1216 bp, Nukleotide 4581 bis 5796 von SEQ ID NR: 4) exprimierte GUS transient in Blättern von Brassica in Abhängigkeit von dem Entwicklungsstadium des verwendeten Gewebes, wobei ein Grad von 4 erreicht wurde. Die fad2D-Promotoren in den pMB180- und pMB166-Konstrukten exprimierten GUS transient bei ähnlichen Niveaus, was vermuten lässt, dass der Promotor pMB180 alle notwendigen Elemente enthält, um die Expression von GUS transient zu steuern. Eine leicht niedrigere GUS-Aktivität wurde unter Verwendung des pMB179-Konstrukts beobachtet, was vermuten lässt, dass ein Aktivierungselement oder eine Region entfernt wurde, die die Promotorstruktur beeinflusst.
Als ein Vergleich wurde die Expression von GUS unter Verwendung des 35S-Promotors untersucht. Der 35S-Promotor exprimiert GUS transient in Blättern, Mikrosporenembryonen und kultiviertem Gewebe von Brassica mit Graden von 5, 1 bzw. 2. Der 35S-Promotor war allerdings nicht in der Lage, nachweisbare Niveaus von GUS-Aktivität in Wurzeln zu exprimieren (Tabelle II). Expressionsgrade von 2, 5 und 3 wurden in Mais- und Weizenblättern, Sojabohnenblättern bzw. in Sonnenblumenblättern beobachtet.
Sowohl der fad2D- als auch der fad2F-Promotor in pMB166 und pMB168 steuerten die transiente Expression eines GUS-Reportergens in verschiedenen Pflanzengeweben (Tabelle II) in im Allgemeinen gleicher Stärke. Die vorstehend beschriebene RT-PCR-Analyse zeigte allerdings, dass die fad2D-Genexpression höher ist als fad2F. Die Diskrepanz zwischen der endogenen Expression der fad2D- und fad2F-Gene und der transienten Analyse der fad2D- und fad2F-Promotoren könnte in Unterschieden in der Halbwertszeit der endogenen fad2D- und fad2F-Transkripte begründet sein. Alternativ könnte die endogene Expression der fad2D- und fad2F-Transkripte durch die chromosomale Struktur beeinflusst werden.
Die hierin beschriebenen Daten belegen, dass fad2D- und fad2F-Promotoren funktionstüchtig sind und verwendet werden können, um interessierende Gene in allen Pflanzengeweben, sowohl transient als auch nach stabiler Transformation, zu exprimieren.
Beispiel 4 – Promotoraktivtät in transgenen Pflanzen:
Die binären Vektoren pMB177 und pMB178 wurden mit dem GUS-Reportergen unter der Kontrolle des fad2D- oder fad2F-Promotors konstruiert. Ähnliche Konstrukte, die Nukleinsäuremoleküle enthalten, die HPH, NPTII oder PAT kodieren, können hergestellt werden.
Die stabile Integration in Canolapflanzen wird mit binären Konstrukten, die oben beschrieben sind, unter Verwendung von Agrobacterium-Transformation durchgeführt. Die transgenen Pflanzen werden auf GUS-Aktivität in verschiedenen Geweben bei verschiedenen Entwicklungsstadien evaluiert. Die Expression von GUS unter der Kontrolle der fad2D- oder fad2F-Promotoren wird mit der GUS-Expression ohne Promotor und mit der GUS-Expression unter der Kontrolle eines Napinpromotors unter Verwendung des gleichen Vektorrückgrats verglichen. Die Transformanten, die unter Verwendung binärer Konstrukte mit HPH, NPTII oder PAT hergestellt wurden, werden auf hygromycin-, kanamycin- oder glufosinathaltigen Medien selektioniert. Hygromycin-, kanamycin- oder glufosinatresistente Transformanten wurden in Pflanzen eingeführt und gingen in das Zuchtprogramm ein.
Andere Ausführungsformen
Es sollte verstanden werden, dass die vorstehende Beschreibung dazu beabsichtigt ist, die Erfindung darzustellen und nicht in dem Umfang zu beschränken, der durch den Umfang der angehängten Ansprüche definiert wird, wobei die Erfindung im Zusammenhang mit ihrer ausführlichen Beschreibung beschrieben wurde. Andere Aspekte, Vorteile und Modifikationen sind im Umfang der folgenden Ansprüche.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 4; (b) einem Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 5; (c) einem Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz der Nukleotide 5113 bis 5796 von SEQ ID NR: 4; (d) einem Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz der Nukleotide 3197 bis 3867 von SEQ ID NR: 5; (e) einem Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz, die zu dem Nukleinsäuremolekül von (a), (b), (c) oder (d) komplementär ist; und (f) einem Nukleinsäuremolekül, das die Fähigkeit beibehält, die Expression eines interessierenden Nukleinsäuremoleküls zu betreiben, wobei das Nukleinsäuremolekül mindestens 600 oder mindestens 800 Nukleotide lang ist und mindestens 80%, mindestens 90% oder mindestens 95% Sequenzidentität mit dem Nukleinsäuremolekül von (a), (b), (c), (d) oder (e) aufweist.
Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure die Nukleotide 5113 bis 5796 von SEQ ID NR: 4 umfasst.
Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure die Nukleotide 3197 bis 3867 von SEQ ID NR: 5 umfasst.
Nukleinsäurekonstrukt, umfassend ein erstes Nukleinsäuremolekül, das funktionsfähig mit einem zweiten Nukleinsäuremolekül verbunden ist, das hinsichtlich des ersten Nukleinsäuremoleküls heterolog ist, wobei das erste Nukleinsäuremolekül ein regulatorisches Element eines Fettsäuredesaturasegens umfasst, wobei das erste Nukleinsäuremolekül die Expression des zweiten Nukleinsäuremoleküls betreibt und wobei das erste Nukleinsäuremolekül eine Nukleinsäure gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3 ist.
Nukleinsäurekonstrukt von Anspruch 4, wobei das Konstrukt zusätzlich ein drittes Nukleinsäuremolekül umfasst, das funktionsfähig mit dem 3'-Ende des zweiten Nukleinsäuremoleküls verbunden ist, wobei das dritte Nukleinsäuremolekül die 3'- untranslatierte Region des Fettsäuredesaturasegens umfasst, wobei die 3'-untranslatierte Region in einem natürlich vorkommenden Genom 3' von dem Fettsäuredesaturasegen lokalisiert ist.
Nukleinsäurekonstrukt von Anspruch 5, wobei das dritte Nukleinsäuremolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 6; (b) einem Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 7; (c) einem Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz der Nukleotide 1 bis 894 von SEQ ID NR: 6; (d) einem Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz der Nukleotide 1 bis 817 von SEQ ID NR: 7; (e) einem Nukleinsäuremolekül, das mindestens 100 Nukleotide lang ist und mindestens 70% Sequenzidentität mit dem Nukleinsäuremolekül von (c) oder (d) besitzt; und (f) einem Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz, die zu dem Nukleinsäuremolekül von (a), (b), (c), (d) oder (e) komplementär ist.
Nukleinsäurekonstrukt nach einem beliebigen der Ansprüche 4 bis 6, wobei das Konstrukt zusätzlich ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das ein Transitpeptid kodiert, das funktionsfähig das erste Nukleinsäuremolekül mit dem zweiten Nukleinsäuremolekül verknüpft.
Nukleinsäurekonstrukt nach einem beliebigen der Ansprüche 4 bis 6, wobei das Konstrukt zusätzlich ein Intron umfasst, das funktionsfähig das erste Nukleinsäuremolekül mit dem zweiten Nukleinsäuremolekül verknüpft.
Nukleinsäurekonstrukt nach einem beliebigen der Ansprüche 4 bis 8, wobei das heterologe Nukleinsäuremolekül ein Ribozym kodiert.
Nukleinsäurekonstrukt nach einem beliebigen der Ansprüche 4 bis 8, wobei das heterologe Nukleinsäuremolekül ein Polypeptid kodiert.
Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 10, wobei das Polypeptid eine Herbizidresistenz verleiht.
Transformierte Pflanzenzelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß einem beliebigen der Ansprüche 4 bis 11 enthält.
Transgene Pflanze, enthaltend mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß einem beliebigen der Ansprüche 4 bis 11.
Transgene Pflanze von Anspruch 13, wobei die Pflanze eine Dikotyledone ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 14, wobei die Dikotyledone Alfalfa, Sojabohne, Raps oder Sonnenblume ist.
Transgene Pflanze von Anspruch 13, wobei die Pflanze eine Monokotyledone ist.
Transgene Pflanze von Anspruch 16, wobei die Monokotyledone Mais, Weizen, Roggen, Reis oder Hirse ist.
Transgener Samen aus der transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 13 bis 17, wobei der transgene Same das Nukleinsäurekonstrukt gemäß einem beliebigen der Ansprüche 4 bis 11 umfasst.