DE69931904T2

DE69931904T2 - Einbau aktiver substanzen in trägermatrizen

Info

Publication number: DE69931904T2
Application number: DE69931904T
Authority: DE
Inventors: Marie-Louise Andersson; Catherine Boissier; Marie Anne JUPPO; Anette Larsson
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 1998-04-14
Filing date: 1999-04-09
Publication date: 2006-12-21
Anticipated expiration: 2019-04-10
Also published as: SK14112000A3; CZ20003784A3; NZ507190A; ATE329580T1; HUP0102305A2; KR20010042660A; US6372260B1; IL138635A0; TW542724B; EE200000595A; JP2002511400A; CA2327522A1; CN1201728C; RU2208435C2; CN1309555A; DE69931904D1; AR019262A1; SE9801287D0; WO1999052507A1; ES2267268T3

Description

GEBIET DER EFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Formulierung, die eine wirksame Substanz umfasst, die durch Bilden einer Emulsion der Komponenten und Ausfällen des Systems unter Verwendung einer Fluidgastechnik mit einem Träger kombiniert wird. Die Erfindung betrifft auch die durch dieses Verfahren erhaltene Formulierung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Für das Problem der Einarbeitung wirksamer Substanzen in Trägermatrizen, um teilchenförmige Systeme zu erhalten, wurden bereits mehrere Lösungen vorgeschlagen. Solche Systeme können beispielsweise bei sofort freisetzenden Formulierungen, modifiziert freisetzenden Formulierungen, lang freisetzenden Formulierungen, gepulst freisetzenden Formulierungen, etc. verwendet werden.
Einige Beispiele für solche Techniken sind:

– Hotmelt-Mikroverkapselung (Schwope et al Life Sci. 1975, 17, 1877)
– Grenzflächenpolymerisation (Birrenbach und Speiser, J. Pharm. Sci. 1976, 65, 1763, Thies, In Encyclopedia of Chemical Technology, 4 Ausg. Hrsg. Kirk-Othmer, 1996, 16, S. 632)
– Lösungsmittelverdampfungsverfahren (Cleland, In Vaccine Design. The subunit and adjuvant approach, Hrsg.: Powell and Newman Plenum Press, New York, 1995, 439)
– Lösungsmittelextraktion (Cleland, In Vaccine Design. The subunit and adjuvant approach, Hrsg.: Powell and Newman Plenum Press, New York, 1995, 439)
– Sprühtrocknung (WO 94/15636)

Ein wichtiger Schritt bei der Herstellung solcher Systeme ist der Einarbeitungsschritt der wirksamen Substanz. Die Wahl des Herstellungsverfahrens für das Freisetzungssystem hängt von der Art der wirksamen Substanz, die eingearbeitet werden soll, und von den gewünschten Freisetzungseigenschaften der wirksamen Substanz aus dem Abgabesystem ab. Sämtliche vorstehend aufgeführten Techniken besitzen ihre Vor- und Nachteile. So ist das Hotmelt-Mikroverkapselungsverfahren für wärmeempfindliche wirksame Substanze ungeeignet. Ein Nachteil bei dem Grenzflächenpolymerisationsverfahren besteht darin, dass die hochreaktiven Monomere in dem Wasser-unmischbaren Lösungsmittel sowohl mit dem Kernmaterial als auch mit der verkapselten wirksamen Substanz reagieren können. Ein Nachteil bei dem Lösungsmittelverdampfungsverfahren besteht darin, dass das Verfahren zeitraubend ist und dass es nur chargenweise durchgeführt werden kann. Wie bei der Lösungsmittelverdampfungstechnik ist auch das Extraktionsverfahren zeitraubend, da es nur chargenweise durchgeführt werden kann. Ein Nachteil bei dem Sprühtrocknungsverfahren besteht darin, dass es schwierig ist, Teilchen im Nanometer-Größenbereich herzustellen. Dieses Verfahren ist aufgrund der Exposition gegenüber Wärme und Luft bei diesem Verfahren auch für wärme- Substanzen oder oxidationsempfindliche wirksame Substanzen ungeeignet.
Die superkritische Fluidtechnologie hat in den letzten Jahren Fortschritte gemacht. Kurz gesagt, kann ein superkritisches Fluid als ein Fluid gleichzeitig bei oder oberhalb seines kritischen Druckes und seiner kritischen Temperatur definiert werden. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von superkritischen Fluiden sind hinsichtlich Temperatur und Druck vielseitig und könnten gewählt werden, um auf eine vorgegebene Anwendung zu passen. Es existieren mehrere heutzutage angewandte neue Techniken, eine ist als Rapid Expansion of Supercritical Solutions (RESS) bekannt, und die andere ist als Gas-Antisolvent Precipitation (GAS) bekannt. Bei der GAS-Technik wird eine Substanz von Interesse in einem herkömmlichen Lösungsmittel gelöst, ein superkritisches Fluid, wie Kohlendioxid, wird in die Lösung eingeleitet und führt zu einer schnellen Expansion des Volumens der Lösung. Als Ergebnis nimmt die Lösekraft während kurzer Zeit drastisch ab und löst die Fällung von Teilchen aus. CfJ. W. Tom und P. G. Debenedetti in j. Aerosol Sci., 22 (1991), 555–594; P. G. Debenedetti et al. in J. Controlled Release, 24 (1993), 27–44 und J. W. Tom et al. in ACS Symp Ser 514 (1993) 238–257; EP 437 451 (Upjohn) und EP 322 687 (Schwarz Pharma). Neuerdings wurde eine Modifikation des GAS-Systems entwickelt (WO 95/01221 und WO 96/00610). Sie wird SEDS (solution enhanced dispersion by supercritical fluid)-Verfahren genannt, das die superkritische Fluidtechnologien zur Teilchenbildung einsetzt.
Wie andere wirksame Substanzen kann ein Protein unter Anwendung der vorstehend aufgeführten Verkapselungsverfahren in die Trägermatrizen eingearbeitet werden. Das Protein wird in einer Wasserphase gelöst, suspendiert oder direkt in der Phase, die den Träger enthält, gelöst. Ein Nachteil mit Proteinen, die in organischen Lösungsmitteln gelöst sind, ist die geringe Löslichkeit von Proteinen in organischen Lösungsmitteln und superkritischen Fluiden/modifizierten superkritischen Strömen (Stahl et al, "Dense Gas Results", Fluid Phase Equilibra, 1983, 10, 269). Ein weiterer Nachteil bei dem direkt in dem organischen Lösungsmittel gelösten oder suspendierten Protein besteht darin, dass das organische Lösungsmittel das Protein auffalten oder denaturieren kann. (Dill und Shortle Ann. Rev. Biochem., 1991, 60, 795–825). Dies kann zu einem Verlust von therapeutischer Wirkung, z.B. immunologischer Wirkung, führen.
Bei den superkritischen Fluidtechniken werden bisher die Proteine zur Herstellung von reinen Proteinteilchen direkt in DMSO gelöst (Winters et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 586–594 und Pharm. Res., 1997, 14, 1370–1378) oder als Mitfällung mit Polymer, mit sowohl dem Polymer als auch dem Protein, gelöst in DMSO (WO9629998 und Bertucco et al. In High Pressure Chemical Engineering, 1996, 217–222). Auch ein Gemisch von Ethanol und Wasser wurde als Lösungsmittel für ein Protein und ein Polymer in SAS verwendet ( EP 0542314 und Tom et al., In Supercritical Fluid Engineering Science, ACS Symposium Series, 1993, 514, 238–257).
Bei der SEDS-Technik wurden Proteinteilchen aus wässrigen Lösungen unter Verwendung einer Dreikomponentendüse hergestellt, wobei die Proteinlösung in Wasser zuerst zusammen mit Methanol eingebracht und sodann in der Düse mit superkritischem Kohlendioxid gemischt wird (WO9600610). Auch wenn die Kontaktzeit zwischen der wässrigen Lösung und dem Ethanol sehr kurz ist, kann sie zur Zerstörung der Proteinkonformation führen.
Auch niedermolekulare Substanzen wurden mit superkritischen Fluidtechniken bereits mit Polymeren mitgefällt. In der EP 322687 ist die Herstellung einer Arzneimittelform, welche eine wirksame Substanz und einen Träger umfasst, mit der Antilösungsmitteltechnik und mit RESS dargestellt (Kim et al. Biotechnol. Prog, 1996, 12, 650–661, Chou and Tomasko, The 4^th Int. Symp. On Supercritical Fluids, Sendai, Japan, 1997, 55). Hier, bei der Antilösungsmitteltechnik, werden die wirksame Substanz und der Träger in demselben flüssigen Medium gelöst oder dispergiert und mit superkritischem Fluid kombiniert. Die Beispiele umfassen in diesen Dokumenten nur die Bezugnahme auf die Einarbeitung von hydrophoben Verbindungen in L-PLA-Kügelchen. Über die Verbindungen in wässriger Phase wurde nichts erwähnt, ebenso wie bei anderen Studien nicht über PCA (Bodmeier et al., Pharm. Res., 1995, 12, 1211–1217), SAS (Bertucco et al. In High Pressure Chemical Engineering, 1996, 217–222), GAS (Chou und Tomasko, The 4^th Int. Symp. on Supercritical Fluids, Sendai, Japan, 1997, 55) oder ASES (Bleich und Müller, J. Microencapsulation, 1996, 13, 131–139) berichtet wurde.
Die EP-A-0677332 offenbart Verfahren und eine Apparatur zur Bildung von Teilchen aus einer Substanz, die das Auflösen der Substanz in einem Fluid, wie Wasser, um eine Lösung zu bilden, und das Mischen der Lösung mit einem zweiten Fluid, wie superkritisches Kohlendioxid, welches bei schneller Druckentspannung zu einem Gas wird, und mit dem das erste Fluid mindestens teilweise unmischbar ist, und das Entspannen des Drucks unter Bildung einer von Luft getragenen Dispersion oder eines Aerosols, das Teilchen mit einem mittleren Durchmesser zwischen etwa 0,1 und etwa 6,5 μm umfasst, umfassen.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Es wurde nun gefunden, dass es möglich ist, eine wirksame Substanz oder wirksame Substanzen mit einem Trägersystem durch Bilden einer Emulsion der Komponenten und Ausfällen des Systems unter Anwendung einer Fluidgastechnik zu kombinieren. Die wirksame Substanz oder die wirksamen Substanzen werden in und/oder um das Trägersystem eingearbeitet, was einschließt, dass der Träger auch die wirksame Substanz oder die wirksamen Substanzen umgeben kann.
Dieses verbesserte Verfahren zur Herstellung von wirksame Substanz-enthaltenden Trägersystemen beruhen auf der Verwendung von Emulsionen. Die Emulsion ist ein Gemisch von zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten oder Phasen, wobei eine Flüssigkeit in einer anderen Flüssigkeit fein verteilt ist. Eine der Flüssigkeiten, beispielsweise Wasser oder die wässrige Phase, ist im Vergleich zu der anderen Flüssigkeit, beispielsweise ein organisches Lösungsmittel oder ein Lösungsmittelgemisch (Ölsphase, hier als nicht wässrige Phase bezeichnet), polarer. Die Emulsion kann entweder kinetisch stabil (Makroemulsion) oder thermodynamisch stabil (Mikroemulsion) oder beides sein. Um die Emulsion zu stabilisieren, kann ein Emulgator, entweder allein oder in Kombination mit anderen Emulgatoren, wies beispielsweise oberflächenaktive Mittel, Polymere, Lipide, verwendet werden. Die Emulgatoren werden entweder in der wässrigen Phase und/oder der nicht wässrigen Phase gelöst. Die wirksame Substanz oder die wirksamen Substanzen, die in das Trägersystem eingearbeitet und/oder damit kombiniert werden sollen, werden in der wässrigen Phase gelöst, suspendiert oder solubilisiert. Das Trägermaterial ist entweder in der nicht wässrigen Phase oder der wässrigen Phase gelöst. Die wässrige Phase wird in einer nicht wässrigen Phase emulgiert oder umgekehrt.
Die nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel können beispielsweise Polyoxyethylensorbitanfettsäureester, Sorbitanfettsäureester, Polyoxyethylenalkylether, Saccharoseester und n-Octyl-b,D-glycopyranosid (n-OG) sein.
Die anionischen oberflächenaktiven Mittel können beispielsweise Natriumdodecylsulphat, Natrium-1,4-bis(2-ethylhexyl)sulphosuccinat (AOT) und Salze von Fettsäuren sein.
Die kationischen oberflächenaktiven Mittel können beispielsweise Alkyltrimethylammoniumsalze und Dialkyldimethylammoniumsalze sein.
Die zwitterionischen oberflächenaktiven Mittel können beispielsweise 3-((3-Cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propansulphonat-dodecyl-N-betain sein. Die polymeren Emulgatoren können beispielsweise Poly(vinyl)pyrrolidon), Polyglycerinpolyricinoleat, Poly(vinylalkohol) und Blockcopolymere sein.
Die Lipidemulgatoren können beispielsweise Cholesterin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin und Phosphatidinsäure sein.
Bei der Erfindung ist die wässrige Phase definiert als wässrige Lösungen (mit der nicht wässrigen Phase nicht mischbar) und/oder als andere Lösungen, die mit der nicht wässrigen Phase nicht mischbar und polarer sind als die nicht wässrige Phase.
Die nicht wässrige Phase umfasst zum Beispiel herkömmliche organische Lösungsmittel, wie Methylenchlorid, Chloroform, Ethylacetat oder Gemische von organischen Lösungsmitteln.
Das Trägermaterial kann beispielsweise Polymere, Füllstoffe, Zerfallshilfen, Bindemittel, Löslichkeitsverbesserer und andere Exzipientien und Kombinationen davon sein.
Die Polymere können synthetischen oder natürlichen Ursprungs sein. Sie können biologisch abbaubar sein oder nicht, z.B. Polystyrol. Die Gruppen von Polymeren, die als Träger verwendet werden können, sind beispielsweise Polysaccharide, Polyester, Polyether, Polyanhydride und Polypeptide.
Beispiele für Polysaccharide sind Cellulosen, Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), Ethylcellulose (EC), Pectin, Alginate, Chitosan, Agar, Hydroxyethylcellulose (HEC), Xanthan, Ethylhydroxyethylcellulose (EHEC).
Beispiele für Polyester sind Polylactid (PLA), Polyglycolid (PGA), Copolymere von diesen (PLG), Polyhydroxybutyrat (PHB) und Polycaprolacton.
Beispiele für Polyether sind Polyethylenoxid und Polypropylenoxid.
Beispiele für Polyanhydride sind Poly(sebacinsäure), Poly(carbophenoxypropan), Poly(fumarsäure) oder Copolymere von diesen, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Beispiele für die wirksame Substanz sind medizinische Mittel, Toxine, Insektizide, Viren, diagnostische Hilfsmittel, Agrochemikalien, handelsübliche Chemikalien, Feinchemikalien, Lebensmittel, Farbstoffe, Sprengstoffe, Farben, Polymere oder Kosmetika. Die wirksamen Substanzen können ein hohes Molekulargewicht (hier als über 5000 Dalton definiert), wie beispielsweise Proteine, Antigene, wie ein Helicobacter-Antigen, Polypeptide, Polynucleinsäuren, Polysaccharide, oder ein niedriges Molekulargewicht (hier als 5000 Dalton oder weniger definiert), wie beispielsweise Bodipy^®, aufweisen. Die Enzymaktivität und die immunogene Aktivität der Proteine kann unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens aufrechterhalten werden.
Hier umfasst die Definition für fluides Gas ein Material in seinem superkritischen und nahezu superkritischen Zustand sowie Druckgase. Das superkritische Fluid kann beispielsweise Kohlendioxid, Stickoxid, Schwefelhexafluorid, Xenon, Ethylen, Chlortrifluormethan, Ethan und Trifluormethan sein. Ein nahezu superkritischer Zustand ist hier als Zustand definiert, wobei Druck und/oder Temperatur unterhalb der kritischen Werte liegen. Beispielsweise beträgt die untere Grenze für den nahezu superkritischen Zustand hinsichtlich Kohlendioxid 0,65 T_c (kritische Temperatur) und für Propan 0,30 T_c.
Das beschriebene Emulsionssystem könnte ein oder mehrere Hilfsstoffe enthalten, wie zum Beispiel:

– Puffer, z.B. Phosphat, Carbonat, Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS)
– Substanzen zur Erhöhung der chemischen und/oder physikalischen Stabilität für die Substanz, z.B. Trehalose und Polyethylenglycol (PEG);
– Adjuvantien zur weiteren Verbesserung der Wirkung der wirksamen Substanz, z.B. Immunantwort-Stimulantien, wie Lipid A und seine Derivate, Choleratoxin (CT) oder Absorptionsverstärker, z.B. Mono- oder Diglyceride, Fettsäuren, Gallensäuresalze oder Enzyminhibitoren, z.B. Aprotonin, Ethylendiamintetraessigsäure, Polyacrylsäure oder Adjuvantien für das wirksame Substanz-Targeting, z.B. Antikörper;
– Solubilisierungsmittel, wie n-Octyl-b,D-glycopyranosid (n-OG).

Die vorliegende Erfindung kann kurz als Verfahren zur Herstellung einer Formulierung beschrieben werden, welche eine wirksame Substanz oder wirksame Substanzen in Kombination mit einem Träger umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass

– eine Emulsion hergestellt wird durch Mischen einer flüssigen nichtwässrigen Phase und einer flüssigen wässrigen Phase, wobei die wässrige Phase die wirksame Substanz umfasst und der Trägerin mindestens einer der Phasen vorhanden ist,
– die Emulsion mit einem fluiden Gas unter Verwendung einer Antilösungsmitteltechnik kontaktiert wird,
– Einheiten, die von der flüssigen Phase frei sind, erhalten werden.

Das zur Herstellung des Trägersystems gewählte Verfahren wird durch die folgende allgemeine Beschreibung und in dem nachstehend experimentellen Teil beispielhaft erläutert.
Im Allgemeinen beruhen diese Verfahren auf der Bildung des Trägersystems in den folgenden Schritten:

– Herstellung einer wässrigen Phase, die die wirksame Substanz oder die wirksamen Substanzen enthält,
– Herstellen einer nicht wässrigen Phase(n) (nicht mischbar mit der wässrigen Phase),
– Auflösen des Trägermaterials, des Emulgators und/oder der Hilfsstoffe in der nicht wässrigen Phase und/oder der wässrigen Phase,
– Bildung der aus mindestens einer wässrigen Phase und einer nicht wässrigen Phase bestehenden Emulsion;
– Verwendung der Fluidgastechnik zur Bildung des Trägersystems mit der wirksamen Substanz.

Der erste Schritt kann durch Auflösen, Dispergieren und/oder Solubilisieren der wirksamen Substanz oder der wirksame Substanzen in einer wässrigen Phase durchgeführt werden.
Der vierte Schritt kann unter Verwendung verschiedener Emulgationstechniken, wie Homogenisieren, Ultraschall- und Hochdruck-Homogenisieren, durchgeführt werden. Die Mikro- oder Makroemulsion kann auch eine so genannte Doppelemulsion sein, wobei die nicht wässrige Phase in der wässrigen Phase (enthält die wirksame(n) Substanz(en)) dispergiert ist, welche in einer anderen nicht wässrigen Phase dispergiert ist, oder wobei die wässrige Phase (enthält die wirksame(n) Substanz(en)) in der nicht wässrigen Phase dispergiert ist, die in einer weiteren wässrigen Phase dispergiert ist.
Im fünften Schritt sind die zur Bildung der Trägersysteme mit der wirksamen Substanz angewandten Fluidgastechniken Antilösungsmitteltechniken, wie beispielsweise SEDS, ASES, SAS, GAS und PCA. Wenn die wässrige Phase die äußerste Phase in der Makroemulsion oder Mikroemulsion ist, könnte ein Modifizierer benötigt werden, um mit dem fluiden Gas vermischt oder zusammen mit der Emulsion unmittelbar vor dem Kontakt mit dem fluiden Gas eingebracht zu werden. Dieser Modifizierer ist ein organisches Lösungsmittel, wie beispielsweise Ethanol und Aceton.
Das Trägersystem, das die erfindungsgemäße(n) wirksame(n) Substanz(en) enthält, kann für pharmazeutische Zwecke, wie beispielsweise therapeutische, prophylaktische und diagnostische Zwecke, verwendet werden.
Wenn sich die Erfindung auf pharmazeutische Anwendungen bezieht, kann das mit wirksamer Substanz beladene Trägersystem über verschiedene Verabreichungswege verabreicht werden, wie oval, rektal, tonsillär, buccal, nasal, vaginal, parenteral, intramuskulär, subkutan, intraokular, pulmonal, transdermale Verabreichungsweg, als Implantat oder auf intravenösem Verabreichungsweg, etc.
Die pharmazeutische Dosierungsform, die durch diese angewandte Technik hergestellt wird, kann eine feste, halbfeste oder flüssige Dispersion sein, die unter Verwendung von gut bekannten pharmazeutischen Techniken, wie Mischen, Granulieren, Verdichten oder Überziehen, hergestellt wird.
Weiterhin können die Formulierungen monolithisch sein, wie Tabletten oder Kapseln, oder in Form von Mehrfach-Formulierungen, die in einer Tablette, Kapsel oder in einem Beutel verabreicht werden, vorliegen.
Die Tröpfchengröße kann durch die Emulgatoren beeinflusst werden, da die Emulgatoren in der kontinuierlichen Phase in einem gewissen Ausmaß gelöst werden. Normalerweise setzen die Emulgatoren die Oberflächenenergie herab, was zu einer reduzierten Tröpfchengröße beiträgt.
Die Emulgatoren können die Agglomeration von Trägersystemen beeinflussen, da sie sich in den Tröpfchen/der superkritischen Grenzfläche befinden können. Wenn das Tröpfchen in ein Trägersystem übergeführt wird, können sich die Emulgatoren immer noch auf der Oberfläche des Trägersystems befinden. Dadurch kann der Ort des Emulgators auf der Oberfläche oder auf dem Trägersystem den Agglomerationsgrad des gebildeten Trägersystems herabsetzen, wie bereits für Polymerteilchen beschrieben (Mawson et al., Macromolecules, 1997, 30, 71).
Außerdem könnten die Emulgatoren für die Emulsion, die in das Trägersystem sowie die Substanz oder die Substanzen eingearbeitet sind, die Freisetzungsmerkmale für das Trägersystem beispielsweise durch Solubilisierung der Substanz und schnelleres Wasser-Eindringen in das Trägersystem verbessern.
EXPERIMENTELLER TEIL
MATERIALIEN UND METHODEN
In diesem Abschnitt werden die in den folgenden Beispielen eingesetzten Materialien, Analyseverfahren und Herstellungstechniken beschrieben.
Als Trägermaterialien wurden Poly-(3-hydroxybutyrat) (PHB, Astra Tech, Schweden, Molekulargewicht (MW) 63500 g/mol) oder Poly-(DL-milchsäurecoglycolinsäure) 50 : 50 (PLG RG 502 H, Boehringer Ingelheim, Germany, MW 6000 g/mol) verwendet. Als Stabilisatoren wurden n-Octyl-β-D-glucopyranosid (n-OG, Sigma, MO, USA), Poly(vinylpyrrolidon) (PVP, Aldrich, Deutschland, MW 10000 g/mol) und Natrium-1,4-bis(2-ethylhexyl)sulphosuccinat (AOT, Sigma, MO, USA) verwendet. Als Lösungsmittel wurde Methylenchlorid (99,5%) und als superkritisches Fluid Kohlendioxid verwendet. Als Modifizierer bei der superkritischen Verarbeitung wurde Ethanol (99,5%) verwendet.
Zwei verschiedene Proteine wurden verwendet: hochwasserlösliche Carbonanhydrase (CA, Sigma, MO, USA) und ein lipidiertes wasserunlösliches Helicobacter pylori-Adhäsionsprotein A in einer Stammlösung (HpaA, CSL, Australien). Eine fluoreszierende Substanz, die als niedermolekulare Modellsubstanz verwendet wurde, war Bodipy^® (D3238, Molecular Probes Europe, Holland).
Bei der Proteinanalyse wurde SDS-Laemmli-Reagenslösung durch Verdünnen der Stammlösung auf ein Viertel, die aus 1,25 ml TRIS-HCl 2 M (pH 6,8)-Pufferlösung, 5,05 g Glycerin (99%), 0,8 g Natriumdodecylsulphat (SDS), 1 ml 2-Mercaptoethanol, 1 μl Bromphenolblau und 10 ml Wasser besteht, hergestellt.
ANALYSE DER TEILCHEN
Teilchengröße, Teilchenform und Teilchenmorphologie wurden mit dem Rasterelektronenmikroskop überprüft.
BESTIMMUNG DER BELADUNG MIT WIRKSAMER SUBSTANZ
PHB-Teilchen
a) Gesamtproteingehalt:
Die Teilchen (3–10 mg) wurden in 300 μl Chloroform gelöst. Anschließend wurde SDS-Laemmli (400 μl) zugesetzt, und das Protein wurde aus der organischen Phase in die Wasserphase extrahiert. Die Proben wurden 30 min bei 60°C geschüttelt. Die Wasserphase wurde 15 min auf 95°C erhitzt, und der Proteingehalt wurde durch Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert.
b) Bodipy^®-Gehalt:
Wasser (5 ml) wurde zu 2 mg Teilchen, enthaltend Bodipy^® (Teilchen nicht gelöst), zugesetzt. Bodipy^® wurde aus den Teilchen freigesetzt, und die Konzentration wurde spektroskopisch bestimmt (Extinktion 97000 M^–1 cm³ GBC UV/VIS 920, Australien).
PLG-Teilchen
a) Gesamtproteingehalt
Den PLG-Teilchen (3–10 mg) wurde 1 ml Aceton zugesetzt. Das Polymer löste sich, wohingegen das Protein ausfiel. Der Protein-Niederschlag wurde 15 min bei 17530 × g zentrifugiert, und etwa 2/3 des Überstands wurden mit einer Hamilton-Spritze entfernt. Reines Aceton (1 ml) wurde zum zweimaligen Waschen des Niederschlags zugesetzt. Das restliche Aceton wurde durch Vakuumzentrifugation verdampft. SDS-Laemmli (200 μl) wurde zugesetzt, und die Probe wurde 15 min auf 95°C erwärmt. Die Analyse des Proteingehalts wurde durch SDS-PAGE durchgeführt.
b) Analyse der Menge des Oberflächen-assoziierten Proteins:
Die Analyse der Menge des an der Oberfläche assoziierten Proteins wurde nach Rafati et al. (Journal of Controlled Release 1997, 43, 89–102) durchgeführt. Zu 5–6 mg der PLG-Teilchen wurden 2 ml 2% (Gew./Vol.) SDS in Wasser zugegeben. Die Proben wurden 4 h geschüttelt. Anschließend wurden die Proben 3 min bei 2700 × g zentrifugiert, und der Überstand in ein neues Röhrchen übergeführt. Das Wasser wurde durch Vakuumzentrifugation verdampft, und 1 ml Laemmli-Puffer (ohne SDS) wurde zugesetzt. Die wässrige Phase wurde 15 min auf 95°C erhitzt und die Proteinmenge durch SDS-PAGE analysiert.
HERSTELLUNG DER TEILCHEN
Die Teilchen wurden in einer SEDS-Apparatur (Bradford Particle Design, Bradford, UK) aus der Emulsion, die die wirksame Substanz und den Träger enthielt (WO9501221 und WO9600610), hergestellt.
Die Emulsion und das Antilösungsmittel (CO₂) wurden in eine koaxiale Düse eingebracht, die im Inneren eines Druckgefäßes angeordnet war, welches in einem Ofen angeordnet war. Unter kontrollierten Druck- und Temperaturbedingungen extrahiert das Antilösungsmittel das Lösungsmittel aus den gebildeten Emulsionströpfchen. Die Konzentration des Trägers in den Tröpfchen wird dadurch erhöht und führt zur schnellen Teilchenbildung. Die Teilchen wurden in einem Gefäß gesammelt, während das Antilösungsmittel und das extrahierte Lösungsmittel durch ein Rückschlagventil austraten.
Die verwendete Düse war eine Dreikomponentendüse, angeschlossen entweder im Sandwich- oder Zweilösungsmodus, mit einer Öffnung von 0,2 mm Durchmesser. Im Sandwichmodus läuft das superkritische Fluid durch den innersten und äußersten Durchgang, während die Emulsion durch den Durchgang dazwischen läuft. Im Zweilösungsmodus werden Emulsion und Modifizierer, wie z.B. Ethanol, unmittelbar vor dem Kontakt mit dem superkritischen Fluid vermischt. Das superkritische Fluid läuft durch den äußeren Durchgang, der Modifizierer durch den mittleren Durchgang und die Emulsion durch den inneren Durchgang.
Beispiel 1. HpaA in PHB, Wasser-Gehalt der Emulsion: 20% (Vol./Vol.)
PHB wurde in Methylenchlorid bei 2 bar, 90°C, gelöst. Gleiche Volumina von 2% (Gew./Gew.) PVP (aq.) und HpaA-Stammlösung [1,11 mg/ml HpaA in TRIS-HCl-Puffer; (10 mM, pH 8) und 2% (Gew./Gew.) n-OG] wurden vermischt. Dieses Gemisch (3,8 ml) wurde (unter Homogenisierung bei 20000 U/min) in 15,2 ml Methylenchlorid, enthaltend 1% (Gew./Gew.) PHB und 0,4% (Gew./Gew.) AOT, in einem 25-ml-Kinematica-Dispersionsgefäß injiziert. Die Homogenisierungsgesamtdauer betrug 3 min. Der verwendete Homogenisator war ein Polytron PT3100, Rotor PT-DA 3012/2 (Kinematica AG, Schweiz). Sämtliche Vorgänge wurden bei Umgebungsbedingungen durchgeführt.
Mit dieser Emulsion wurden unter verschiedenen Versuchsbedingungen in der SEDS-Apparatur zwei Versuche durchgeführt. Versuch 1 erfolgte unter Verwendung der Dreikomponentendüse im Zweilösungsmodus mit Ethanol (Fließgeschwindigkeit 0,5 ml/min) als Modifizierer. In Versuch 2 wurde der Sandwichmodus angewandt (Tabelle 1).
Tabelle 1: SEDS-Emulsionsverarbeitung in Beispiel 1
In Übereinstimmung mit den SEM-Graphen betrug die Teilchengröße für beide Versuche 1–3 μm (Versuch 1 und Versuch 2).
Die theoretische Zusammensetzung der Teilchen sollte 55,8% (Gew./Gew.) PHB, 43,5% (Gew./Gew.) oberflächenaktive Mittel, 0,6% (Gew./Gew.) HpaA betragen. Die Analyse der Gesamtmenge von HpaA in den Teilchen ergab sowohl für Versuch 1 als auch Versuch 2 ein Ergebnis von 0,4% HpaA.
Beispiel 2. Bodipy^® in PHB, Wassergehalt der Emulsion: 33% (Vol./Vol.)
Der Zweck bestand darin, ein niedermolekulares Molekül unter Verwendung einer Emulsion mit 33% (Vol./Vol.) Wassergehalt mit der Trägermatrix zu assoziieren. PHB wurde bei 2 bar, 90°C in Methylenchlorid gelöst. Gleiche Volumina von 2% (Gew./Gew.) PVP (aq.) und 2% (Gew./Gew.) n-OG, 1,0 mg/ml Bodipy^® in TRIS-HCl-Puffer (10 mM, pH 8) wurden gemischt. Diese Lösung (2 ml) wurde (unter Homogenisierung bei 20000 U/min) in 4 ml Methylenchlorid, enthaltend 1% (Gew./Gew.) PHB und 0,4% (Gew./Gew.) AOT, in einem 25-ml-Kinematica-Dispersionsgefäß injiziert. Die Homogenisierungsgesamtdauer betrug 3 min. Der verwendete Homogenisator war ein Polytron PT3100, Rotor PT-DA 3012/2 (Kinematica AG, Schweiz). Sämtliche Vorgänge wurden unter Umgebungsbedingungen durchgeführt. Als Modifizierer wurde Ethanol (die dreikomponentige Düse war im Zweilösungsmodus angeschlossen) mit der Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min verwendet. Die Durchführungsbedingungen sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2: SEDS-Emulsionsverarbeitung in Beispiel 2
In Übereinstimmung mit den SEM-Graphen betrug die Teilchengröße 1–3 μm.
Es konnte keine fluoreszierende Substanz nachgewiesen werden, die das Gefäß mit dem Kohlendioxidstrom verließ. Dies bedeutet, dass Bodipy^® nicht durch das superkritische Fluid oder die verwendeten Lösungsmittel extrahiert wurde.
Beispiel 3. Bodipy^® (in PHB, Wassergehalt der Emulsion: 20% (Vol./Vol.))
Der Zweck bestand darin, ein niedermolekulares Molekül mit der Trägermatrix (wie in Beispiel 2 unter Verwendung einer Emulsion mit dem Wassergehalt von 20% (Vol/Vol.)) zu assoziieren. PHB wurde bei 2 bar, 90°C, in Methylenchlorid gelöst. Gleiche Volumina von 2% (Gew./Gew.) PVP (aq.) und 2% (Gew./Gew.) n-OG, 1,0 mg/ml Bodipy^® (in TRIS-HCl-Puffer (10 mM, pH 8) wurden gemischt. Diese Lösung (2 ml) wurde (unter Homogenisieren bei 20000 U/min) in 8 ml Methylenchlorid, enthaltend 1% (Gew./Gew.) PHB und 0,4% (Gew./Gew.) AOT, in einem 25-ml-Kinematica-Dispersionsgefäß injiziert. Die Homogenisierungsgesamtdauer betrug 3 min. Der verwendete Homogenisator war ein Polytron PT3100, Rotor PT-DA 3012/2 (Kinematica AG, Schweiz). Sämtliche Vorgänge wurden unter Umgebungsbedingungen durchgeführt.
Der Versuch 4 erfolgte in der SEDS-Apparatur unter Verwendung der Dreikomponentendüse im Zweilösungsmodus mit Ethanol (Fließgeschwindigkeit 0,5 ml/min) als Modifizierer. In Versuch 5 wurde der Sandwichmodus angewandt (Tabelle 3).
Tabelle 3. SEDS-Emulsionsverarbeitung in Beispiel 3
In Übereinstimmung mit den SEM-Graphen weisen beide Chargen eine Teilchengröße zwischen 1–3 μm auf.
Die theoretische Zusammensetzung der Teilchen war 55,8% (Gew./Gew.) PHB, 43,5% (Gew./Gew.) Tenside und 0,6% (Gew./Gew.) Bodipy^®. Es wurde festgestellt, dass die Menge an Bodipy^®, die mit den Teilchen von Versuch 5 assoziiert war, gemäß Analyse 0,7% (Gew./Gew.) betrug.
Beispiel 4. Carbonanhydrase in PLG, Wassergehalt der Emulsion 20 (Vol./Vol.)
Eine Menge von 200 μl 20 mg/ml Carbonanhydrase (93%) in TRIS-SO₄-Puffer (0,1 M, pH 7,5) wurde unter 3 min Homogenisieren mit einer Ultraschallsonde (CV26, Sonics & Materials Inc., USA) bei etwa 30–50 W zu 800 μl 8% (Gew./Gew.) PLG, 0,4% (Gew./Gew.) Span 85/Tween 80 (Gewichtsverhältnis 80 : 20) gegeben. Die Emulsion wurde in einem 4-ml-Glasgefäß auf Eis hergestellt.
Die Versuchsbedingungen zur Herstellung der Teilchen sind in Tabelle 4 beschrieben. Die Versuche erfolgten mit der Dreikomponentendüse im Sandwichmodus.
Tabelle 4. SEDS-Emulsionsverarbeitung in Beispiel 3
In Übereinstimmung mit den SEM-Graphen wiesen die Teilchen eine Teilchengröße zwischen 10–100 μm auf.
Die theoretische Zusammensetzung der Teilchen betrug 91,4% (Gew./Gew.) PLG, 4,6% (Gew./Gew.) oberflächenaktive Mittel und 4,0% (Gew./Gew.) Carbonanhydrase. Die Analyse der Menge an Protein ergab ein Ergebnis von 4% (Gew./Gew.) Carbonanhydrase, und an der Teilchenoberfläche war kein Protein assoziiert.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Formulierung, die eine wirksame Substanz oder eine mit einem Träger assoziierte wirksame Substanz umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass – eine Emulsion hergestellt wird durch Mischen einer flüssigen nicht wässrigen Phase und einer flüssigen wässrigen Phase, wobei die wässrige Phase die wirksame Substanz oder die wirksamen Substanzen umfasst und der Träger in mindestens einer der Phasen vorhanden ist, – die Emulsion mit einem fluiden Gas unter Verwendung einer Antilösungsmitteltechnik kontaktiert wird und – Einheiten, die von der flüssigen Phase frei sind, erhalten werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wirksame Substanz in der wässrigen Phase gelöst ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wirksame Substanz in der wässrigen Phase dispergiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wirksame Substanz in der wässrigen Phase solubilisiert ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die wirksame Substanz ein Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die wirksame Substanz ein Antigen ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die wirksame Substanz ein Helicobacter-Antigen ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die wirksame Substanz ein lipidiertes wasserunlösliches Helicobacter pylori-Adhäsionsprotein A ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die wirksame Substanz die spezifische vollständig lipidierte Form von Helicobacter pylori-Adhäsionsprotein A ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die wirksame Substanz eine niedermolekulare Substanz ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die nicht wässrige Phase ein organisches Lösungsmittel enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die nicht wässrige Phase ein Gemisch von organischen Lösungsmitteln enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die wässrige Phase polarer ist als die nicht wässrige Phase.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Emulsion eine Makroemulsion ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Emulsion eine Mikroemulsion ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Emulsion eine Kombination einer Makro- und einer Mikroemulsion ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Emulsion einen Emulgator enthält.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Emulgator ein nicht ionisches oberflächenaktives Mittel ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Emulgator ein anionisches oberflächenaktives Mittel ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Emulgator ein kationisches oberflächenaktives Mittel ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Emulgator ein zwitterionisches oberflächenaktives Mittel ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Emulgator ein Polymer ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Emulgator ein Lipid ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger ein Polymer ist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Polymer aus einem Polysaccharid, einem Polyester, einem Polyether, einem Polyanhydrid und einem Polypeptid ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Polymer ein Polysaccharid ist, das ausgewählt ist aus einer Cellulose, Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), Ethylcellulose (EC), Pectin, einem Alginat, Chitosan, Agar, Hydroxyethylcellulose (NEC), Xanthan und Ethylhydroxyethylcellulose (EHEC).
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Polymer ein Polyester ist, der ausgewählt ist aus Polylactid (PLA), Polyglycolid (PGA), Polyhydroxybutyrat (PHB), Polycaprolacton und einem Copolymer von Polylactid und Polyglycolid (PLG).
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Polymer ein Polyether ist, der ausgewählt aus Polyethylenoxid und Polypropylenoxid.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Polymer ein Polyanhydrid ist, das ausgewählt ist aus Poly(sebacinsäure), Poly(carbophenoxypropan), Poly(fumarsäure) und Copolymeren davon.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei der Träger Poly(3-hydroxybutyrat) ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei der Träger Poly(DL-milchsäureco-glycolsäure) ist.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Antilösungsmitteltechnik die Solution Enhanced Dispersion by Supercritical fluid(SEDS)-Technik ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 31, wobei die Antilösungsmitteltechnik die Aerosol Solvent Extraction System(ASES)-Technik ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 31, wobei die Antilösungsmitteltechnik die Supercritical Anti-Solvent(SAS)-Technik ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 31, wobei die Antilösungsmitteltechnik die Gas Anti-Solvent Precipitation(GAS)-Technik ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 31, wobei die Antilösungsmitteltechnik die Compressed Fluid Anti-Solvent(PCA)-Technik ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das fluide Gas Kohlendioxid ist.