DE69928932T2

DE69928932T2 - Antisense oligonukleotide zur behandlung von atopischen krankheiten und neoplastischer zellvermehrung

Info

Publication number: DE69928932T2
Application number: DE69928932T
Authority: DE
Inventors: Paolo Renzi
Original assignee: Topigen Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Topigen Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1998-06-17
Filing date: 1999-06-17
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2019-06-18
Also published as: JP2002518007A; US6822087B1; EP1088065A2; DE69928932D1; ATE312911T1; CA2235420A1; US20100286239A1; NZ509308A; AU4493299A; EP1088065B1; US20050282762A1; US7629324B2; MXPA00012703A; WO1999066037A2; JP4612188B2; AU758447B2; WO1999066037A3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
(a) Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden, die gegen spezifische Zellrezeptoren gerichtet sind, und zwar allein oder in Kombination, um die Entzündungsreaktion zu hemmen, die bei Asthma, Hypereosinophilie oder atopischen Krankheiten vorliegt, und eine neoplastische Zellvermehrung zu hemmen.
(b) Beschreibung des Standes der Technik
Antisense-Oligonukleotide sind eine neue Klasse von Arzneimitteln. Im Allgemeinen bezieht sich Antisense auf die Verwendung kleiner synthetischer Oligonukleotide, welche die gleichen Bestandteile wie unsere eigene DNA aufweisen und einer einzelsträngigen DNA ähneln. Die Antisense-Oligonukleotide haben die Form einer spiegelbildlichen Sequenz zu einem Genteil, auf das sie zielen, damit sie in der Lage sind, an dieser Sequenz anzuhaften und eine Genexpression zu hemmen. Die Genexpression wird durch Hybridisieren eines Sense-Oligonukleotids mit einer das Sense-Ziel darstellenden spezifischen Messenger-RNA (mRNA) gemäß der Watson-Crick-Basenpaarung gehemmt, bei der Adenosin und Thymidin oder Guanosin und Cytidin mittels Wasserstoffbrückenbindung interagieren. Diese einfachen Basenpaarungsregeln sind bestimmend für die Interaktion zwischen den Antisense-Oligonukleotiden und der Zell-RNA, was das Designen eines Antisense-Oligonukleotids ermöglicht. Ein Hauptvorteil dieser neuen Strategie besteht in der Spezifität der Wirkung, bei möglicher Verringerung von Nebenwirkungen und Toxizität. Diese therapeutische Strategie ließe sich möglicherweise auf jede Krankheit anwenden, bei der man annimmt, dass eine Uberexpression von einem oder mehreren Genen das Auftreten oder Fortbestehen der Krankheit hervorruft. Demzufolge wurden zahlreiche Untersuchungen von Antisense-Oligonukleotiden als therapeutische Wirkstoffe für Krebs- und virale Erkrankungen durchgeführt.
Es wurden nur wenige Studien durchgeführt, um zu untersuchen, ob Antisense-Oligonukleotide eine Rezeptorexpression auf Zelloberflächen für Entzündungsmediatoren hemmen können.
Antisense-Oligonukleotide können verwenden werden, um eine Expression des Interleukin-(IL)-6-Rezeptors und somit die Effekte des Mediators einer akuten Entzündung, Interleukin-5, auf Zellen zu hemmen. Es wurden keine Studien ausgeführt, um zu untersuchen, ob Antisense-Oligonukleotide verwendet werden können, um Rezeptoren an Zellen, die bei einer asthmatischen Entzündung beteiligt sind, oder an Krebszellen zu hemmen.
Die als WO 9622371A (Ponath Paul D.) veröffentlichte internationale Anmeldung beschreibt den C-C-Chemokin-Rezeptor CKR-3. Er ist das Äquivalent des CCR3-Rezeptors. In der Anmeldung gibt es keine Vorabinformation, ob Antisense-Konstrukte für eine Hemmung des CCR-3-Rezeptors effektiv sind. Außerdem gibt es keine Information betreffend die Tatsache, ob diese effektiv sind.
Ikizawa et al. "Inhibition of IL-4 receptor up-regulation on B cells antisense oligodeoxynukleotide suppresses IL-4-induced human IGE production", Clinical and Experimental Immunology, Bd. 100, Nr. 3, S. 383–389 (1995)", beschreibt Antisense-Oligonukleotide gegen den IL-4-Rezeptor. Es wird nicht erwähnt, dass diese gegen den gemeinsamen IL-4-IL-13-Rezeptor wirken. Es gibt keine Erläuterung der gemeinsamen Effekte mit IL-13 oder der Synergieeffekte mit IL-13. Es wird ebenfalls nicht die Notwendigkeit für Synergieeffekte durch Hinzufügen von weiteren Oligos erläutert.
In der als WO 97 20926 veröffentlichten internationalen Anmeldung sind die Alpha- und Beta-Sequenzen des IL-13-Rezeptors identifiziert. Es wird der Begriff Antisene-Oligonukleotide erwähnt, ohne dass irgendwelche weitere Informationen bezüglich irgendeiner Sequenz oder Daten geliefert werden.
Die als WO 9728190 veröffentlichte Anmeldung beschreibt den gemeinsamen Beta-c-Rezeptor für IL-3, IL-5 und GM-CSF. In keinem Teil der Anmeldung erfolgt keine Beschreibung der Verwendung von Antisense-Oligos für die Therapie einer Allergie, von Asthma oder Krebs.
In der als WO 9723244 veröffentlichten internationalen Anmeldung wird offenbart, das ODNs bereitgestellt werden, die auf die Nukleinsäurecodierenden Rezeptor-negativ regulierenden Domänen abzielen. Sie haben dabei EPO im Blick.
Die internationale Anmeldung WO 97 41154 beschreibt den eosinophilen Eotaxin-Rezeptor, der als "CC CKR3" bezeichnet wurde. An keiner Stelle in der Anmeldung gibt es irgendeine Sequenz oder einen Nachweis von Daten für Antisense-Oligonukleotide, die sich an eosinophile Eotaxin-Rezeptornukleotide binden und eine Rezeptorfunktion oder Expression modulieren können.
In dem Schriftstück "Molecular cloning and characterization of a human eotaxin receptor expressed selectively on eosinophils", Ponath PD et al., Journal of Experimental Medicine, Bd. 183, Juni 1996, S. 2437–2448 (Juni 1996), ist lediglich die Sequenz des Eotaxin-Rezeptors CCR3 angegeben.
In der als WO 9741225A veröffentlichten internationalen Anmeldung sind Polynukleotide gegen Chemokin-Rezeptoren für ein Screening offenbart. Es werden Antisense-ODNs gegen die MMLR-CCR- oder MPHG-CCR-Chemokin-Rezeptoren präsentiert, und diese entsprechen nicht den Rezeptoren der Erfindung.
Asthma ist eine Krankheit, die 5 bis 10% der Bevölkerung betrifft, was eine Verdoppelung der Verbreitung in den letzten 25 Jahren bedeutet. Diese Erhöhung wurde insbesondere bei Kleinkindern nach einer Virusinfektion der Atemwege (Broncholitis), bei Kindern und bei berufsbedingtem Asthma bemerkt. Der genaue Grund von Asthma ist noch nicht bekannt. Jedoch glaubt man, dass Erreger wie beispielsweise Viren an der Aufrechterhaltung der abnormen Entzündung, die man in den Atemwegen von an Asthma leidenden Patienten antrifft, und somit am Fortbestehen der Krankheit beteiligt sind.
Aus diesem Grund ist die aktuelle Empfehlung für die zu bevorzugende Therapie von Asthma ein potentes entzündungshemmendes Arzneimittel wie beispielsweise Corticosteroide und Antileukotrine. Auch wenn diese Therapie bei vielen Patienten effektiv ist, sind einige Patienten gegenüber Corticosteroiden resistent. Dieses Arzneimittel ist ebenfalls ein potentes Immunosuppressivum mit Langzeit-Nebenwirkungen und hat sich nicht als effektiv bei der Prävention einer Allergie oder Asthma erwiesen.
Antileukotrine haben eine gewisse Wirkung bei Allergie und Asthma, sind jedoch nicht so effektiv wie Corticosteroide.
Einige Entzündungsmediatoren spielen eine Rolle beim Entstehen und Fortbestehen einer Entzündung in den Atemwegen von Patienten mit Asthma. Einige Mediatoren bewirken eine Attraktion der Entzündungszellen in die Atemwege, entweder mittels Chemotaxie von Eosinophilen (die Chemokine: RANTES, Eotaxin 1,2, MCP-3,4, welche hauptsächlich bei einer asthmatischen Entzündung über einen als CCR3 bezeichneten Rezeptor wirken), oder mittels endothelialer Zellaktivierung (IL-4, 13).
Andere Mediatoren bewirken einen Priming-Effekt und ein verlängertes Überleben von Entzündungszellen in den Atemwegen (IL3, 5, GM-CSF, IL4). Diese Mediatoren bestehen somit entweder aus spezifischen Chemo-kinen für Eosinophile oder aus Zytokinen des T-Helfer-Lymphozyt von Typ-2-Phenotypen (Th2: IL-3, 4, 5, 13 und GM-CSF).
Eine Verbesserung des Asthma zeigte sich, wenn eine Abnahme dieser Entzündungsmediatoren in den Atemwegen vorliegt.
Allergien sind extrem verbreitete Krankheiten, beispielsweise sind ca. 30% der Bevölkerung von atopischer Rhinitis betroffen. Eine Allergie ist durch eine abnorme IgE-Produktion und eine Entzündung gegenüber einem Allergen gekennzeichnet. Bei Vorhandensein des IgE und des Allergens degranulieren die Effektorzellen, wie beispielsweise die Mastzellen, und geben Entzündungsmediatoren frei, die zur Rekrutierung der gleichen Entzündungszellen führen, die auch bei Asthma anzutreffen sind. Bei atopischer Rhinitis, nasaler Polyposis und chronischer Sinusitis ist das gleiche Übermaß an Entzündungsmediatoren anzutreffen wie es auch bei Asthma auftritt. IL-4 und IL-13 sind für die Produktion von IgE und die Induktion der Zellen mit einem Th2-Phenotypen erforderlich.
Krebs ist die zweithäufigste Todesursache beim Menschen und ist durch eine abnorme Proliferation immortalisierter Zellen gekennzeichnet. Einer der Mechanismen, der beim Fortbestehen und der Zunahme dieser Zellen beteiligt ist, besteht in der Freisetzung von Wachstumsfaktoren, die über Rezeptoren wirken und zu einer Zellproliferation führen. Von diesen Wachstumsfaktoren hat sich GM-CSF als wichtiger Wachstumsfaktor für einige Tumorzellen erwiesen. Die Hemmung der Proliferation von Krebszellen durch Blockieren der Rezeptoren für Wachstumsfaktoren könnte bei der Therapie gewisser Krebsarten wichtig sein.
Es wäre wünschenswert, über eine Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden zu verfügen, die gegen zumindest einen spezifischen gemeinsamen Rezeptor entweder für Th2-Zytokine oder einen Rezeptor für Mediatoren gerichtet sind, die Zellen anziehen, die auf Th2-Zytokine antworten, um die Entzündungsreaktion zu hemmen, die bei Asthma oder Atopie vorliegt, und eine neoplastische Zellproliferation zu hemmen.
Es wäre ebenfalls äußerst wünschenswert, über Antisense-Oligonukleotide zu verfügen, die gegen eine für Rezeptoren codierende Nukleinsäuresequenz gerichtet sind, so dass durch Hemmen dieser Rezeptoren diese Oligonukleotide bei der Therapie und/oder Prävention von Asthma, einer Allergie, allgemeinen Entzündungen und Krebs verwendet werden können.
INHALT DER ERFINDUNG
Ein Ziel der Erfindung besteht darin, eine Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden bereitzustellen, die gegen mindestens eine gemeinsame Untereinheit eines Zellrezeptors gerichtet sind, beispielsweise die gemeinsame Beta-Untereinheit für IL-3, IL-5 und GM-CSF, um die Entzündungsreaktion zu hemmen, die bei Asthma oder Atopie vorliegt, und um eine neoplastische Zellvermehrung zu hemmen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, Antisense-Oligonukleotide bereitzustellen, die gegen eine Nukleinsäuresequenz gerichtet sind, die für die gemeinsame Beta-Untereinheit der IL-3, IL-5 und GM-CSF-Rezeptoren codiert, so dass sie durch Hemmen dieser Rezeptoren bei der Behandlung von Prävention von Asthma, Allergien, Hypereosinophilie, allgemeinen Entzündungen oder Krebs verwendet werden können.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, eine therapeutisch wirksame Zusammensetzung bereitzustellen, die mindestens ein Antisense-Oligonukleotid beinhaltet, das gegen Nukleinsäuresequenzen gerichtet ist, die für die gemeinsame Beta-Untereinheit von IL-3, IL-5 und GM-CSF codieren, für einen potenteren Effekt bei der Behandlung und/oder der Prävention von Asthma, Allergien, allgemeinen Entzündungen oder Krebs.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 zeigt eine Zunahme der Produktion von IL-4 reagierend auf das Hausstaubmilben-Antigen bei pfeifender Atmung (wheezing) von Kleinkindern;
2A und 2B zeigen die Produktion von Zytokinen bei Bronchiolitis, um eine Vorhersage über den Schweregrad der pfeifenden Atmung zu treffen;
3A und 3B zeigen die Beziehung zwischen der IFN-Produktion reagierend auf IL-2 von mononuklearen Blutzellen und der Entwicklung von Asthma zwei Jahre nach einer Bronchiolitis bei Kleinkindern;
4A und 4B stellen die Korrelation zwischen der Produktion von Inferon-gamma reagierend auf IL-2 zum Zeitpunkt einer Bronchiolitis bei Kleinkindern zu Vmax FRC (4A) oder PC40-Histamin (4B) dar;
5A bis 5C stellen die Verteilung eines FITC-markierten Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotids acht Stunden nach einem Zerstäuben oder Einatmen in die Lungen einer Ratte dar;
6A und 6B zeigen Entzündungszellen (6A) und ein FITC-markiertes Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotid, das in die Entzündungszellen gelangt ist (grüne Fluoreszenz) (6B), die durch eine Lungenlavage bei Ratten 24 Stunden nach der Verabreichung gewonnen wurden;
7 stellt ein Gel dar, das die noch intakten Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotide zeigt, wenn diese durch die Bronchioalveolar-Lavage (BAL) sowie aus den Lungen (Biopsien) von Ratten 24 Stunden nach Verabreichung gewonnen wurden, verglichen mit einem Kontroll-Antisense-Oligonukleotid (Eot. FITC);
8 stellt die Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotide OD1, OD2 und OD3 dar, welche die IL-4- und IL-13-Rezeptorexpression in RAJI-Zellen hemmen, und zwar erfasst durch Durchfluss-Zytometrie;
9A und 9B zeigen die Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotide OD1, OD2 und OD3 gemäß einer Ausführungsform der Erfindung, welche die Proteinexpression des IL-4-Rezeptors in RAJI-Zellen hemmen, und zwar erfasst durch Immunopräzipitation und "Western";
10 zeigt das Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotid A1.3, das eine mRNA-Expression der Alpha-Untereinheit der IL-4/13-Rezeptoren hemmt;
11A bis 11F stellen die Dosis-Wirkungs-Beziehung des Antisense-Oligonukleotids OD2 bei der Hemmung der Proteinexpression des IL-4- und IL-13-Rezeptors in RAJI-Zellen dar, erfasst durch immunochemische Analytik;
12 zeigt die Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotide OD2 und A1.3, die bei menschlichen Nabelschnurblutzellen-Th2-Vorläuferzellen die Produktion von IL-4 hemmen und die Produktion von IFN☐ vergrößern;
13A und 13B zeigen das Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotid 107A, das eine mRNA-Expression (durch semiquantitative RT-PCR) der gemeinsamen Beta-Untereinheit des IL-3, IL5 und GM-CSF-Rezeptors in TF1 (13A) und U937-Zellen (13B) hemmt;
14 zeigt das Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotid 107A, das eine Protein-Expression der gemeinsamen Beta-Untereinheit der IL-3, IL5 und GM-CSF-Rezeptoren in TF1-Zellen hemmt, und zwar erfasst durch Immunopräzipitation und "Western";
15 zeigt das Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotid 107A, das die Proliferation von TF1-Zellen hemmt, und zwar als Dosis-Wirkungs-Beziehung;
16 stellt das Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotid 107A dar, welches das TF1-Zellwachstum hemmt;
17 stellt das Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotid RB141A dar (wird auch als AS141 bezeichnet), welches die mRNA-Expression der Beta-Untereinheit der GM-CSF, IL-3 und IL-5-Rezeptoren in Knochenmarkzellen von Ratten hemmt;
18A und 18B zeigen die Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotide RB141A (gerichtet gegen die Beta-Untereinheit der GM-CSF, IL-3 und IL-5-Rezeptoren von Ratten), RCC3A4 (gerichtet gegen den CCR3-Rezeptor von Ratten), oder eine Kombination von beiden, welche den eosinophilen Influx in die Peritonealhöhle (links) oder in die Lungen (rechts) nach einer Ovalbumin-Provokation hemmen;
19A bis 19H stellen die Expression und die Zellverteilung von Eotaxin mRNA (19A bis 19D) und des Proteins (19E bis 19H) in den Atemwegen (19A, 19B und 19E) und BAL-Zellen (19C, 19D, 19F bis 19H) allergischer asthmatischer Patienten (19A, 19C, 19E, 19F, 19G) und normaler Kontrollpersonen (19B, 19D, 19H) dar;
20 zeigt die Wirkung des Antisense, das gegen den CCR3-Rezeptor (RC86A, in der Figur bezeichnet als CCR3AS 86) bei einer CCR3-mRNA-Expression in HL60-Zellen (Klon 15) gerichtet ist, die in den eosinophilen Pfad differenziert sind;
21 zeigt die Wirkung des Antisense RC86A, das gegen den CCR3-Rezeptor einer CCR-mRNA-Expression bei Ghost-Zellen gerichtet ist, bei denen eine Transfektion mit dem CCR3-Rezeptor erfolgt ist;
22 zeigt die Wirkung des Phosphorothioat-Antisense RC86A und des Phosphorothioat-Antisense RC 269, die gegen den CCR3-Rezeptor bei einer Kalzium-Mobilisierung bei gereinigtem humanen Eosinophilen gerichtet ist;
23 zeigt den Effekt des Phosphorothioat-Antisense-Oligonukleotids RCC3A4, das gegen den CCR3-Rezeptor von Ratten bei einer CCR3-mRNA-Expression bei Knochenmarkzellen von Ratten gerichtet ist;
24 zeigt den Effekt einer Vorinkubation mit IL-5 auf die durch Eotaxin induzierte Chemotaxie; und
25A bis 25I zeigen die Wirkung einer Übernacht-Vorinkubation mit IL-5 auf die Produktion von Chemokinen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bronchiolitis ist eine Virusinfektion der Atemwege von Kleinkindern, die eine Prädisposition für eine Entwicklung von Asthma bewirkt. Diese Kondition wurde untersucht, da dies beim Menschen der frühestmögliche Zeitpunkt vor einer Entwicklung von Asthma, Atopie und einer allergischen Entzündung ist. Wie nachfolgend gezeigt wird, liegt vor einer Entwicklung von Asthma ein Ungleichgewicht der Th1- zu den Th-2-Zytokinen vor, zum Vorteil der Th2-Zytokine. Bei einer Ausführungsform zielt die Erfindung darauf ab, dieses Ungleichgewicht auszugleichen und somit Asthma und Allergien zu verhindern oder zu behandeln.
Anhand von Ergebnissen, die bei Lymphozyten erhalten wurden, welche aus Blut von an Bronchiolitis leidenden Kindern isoliert wurden, wurde vermutet und bestätigt, dass vor der Entwicklung von frühkindlicher pfeifender Atmung ("early wheezing") ein gestörtes Gleichgewicht bei der Produktion von Th1- und Th2-Zytokinen besteht. Und zwar zeigt 1, dass Lymphozyten von Kindern, bei denen nach einer Bronchiolitis ein pfeifendes Atemgeräusch auftritt, eine verstärkte Produktion von IL-4 (einen Th2-Zytokin) aufweisen, nachdem eine Exposition mit dem Hausstaubmilben-Antigen erfolgt ist. In 1 wurden Lymphozyten aus dem Blut von Kindern fünf Monate nach einer Bronchiolitis isoliert und unter Vorhandensein des Hausstaubmilben-Antigens kultiviert. Das IL-4 wurde im Überstand gemessen, der drei Tage nach der Kultivierung entnommen wurde. Die Ergebnisse sind für Kinder angegeben, bei denen während mindestens einem Tag der vergangenen 90 Tage ein pfeifendes Atemgeräusch auftrat, und bei denen innerhalb der ersten fünf Monate nach der Bronchiolitis überhaupt kein pfeifendes Atemgeräusch auftrat. Ein Stern bezeichnet ein Kind, das einen IL-4-Pegel von 535 pg/ml hatte. Außerdem wurde bei Kindern, bei denen in den ersten fünf Monaten nach der Bronchiolitis das pfeifende Atmen am stärksten auftrat, eine geringere Produktion an Interferon-gamma (IFN, ein Th2-Zytokin) und eine höhere Produktion an IL-4 gefunden.
Der Zustand dieser Kinder wurde zwei Jahre lang überwacht, und im Anschluss daran wurde bestimmt, ob sie kein Asthma, möglicherweise Asthma oder wahrscheinlich Asthma hatten, und zwar anhand des Delphi-Konsens. Das bisherige Rauchverhalten und das Vorliegen einer Atopie oder von Asthma bei den Eltern oder Geschwistern wurden aufgezeichnet, und die IFN- und IL-4-Produktion von mononuklearen Blutzellen reagierend auf IL-2 wurden bei 32 Kindern ausgewertet, die wegen einer Bronchiolitis hospitalisiert waren, sowie bei einer Untergruppe (n = 19), bei der 4,9 Monate später Lungenfunktionsprüfungen durchgeführt wurden.
In den 2A und 2B wurden Lymphozyten von Kindern während einer Bronchiolitis isoliert und unter Vorhandensein von IL-2 drei Tage lang kultiviert. Der Überstand wurde entnommen und die Zytokine mittels ELISA gemessen. Die Ergebnisse sind für die Kinder angegeben, bei denen mehr als 20 Tage lang ein pfeifendes Atmen auftrat (länger dauerndes pfeifendes Atmen, n = 9), und für die Kinder, bei denen ein pfeifendes Atmen für weniger als 20 Tage auftrat (kürzer dauerndes pfeifendes Atmen, n = 6).
Bei Kindern mit möglichem und wahrscheinlichem Asthma lag zum Zeitpunkt der Bronchiolitis und 4,9 Monate danach eine niedrigere IFN-Produktion vor als bei denen, die kein Asthma hatten (p < 0,05, 3A und 3B).
In den 3A und 3B wurden mononuklearen Zellen, die zum Zeitpunkt der Bronchiolitis (3A, n = 32) oder 4,9 Monate später (3B, n = 19) erhalten wurden, die Monozyten teilweise entzogen und mit IL-2 drei Tage lang kultiviert. Der Überstand wurde entnommen und die IFN-Produktion wurde mittels ELISA gemessen. Die Ergebnisse sind für Patienten angegeben, bei denen die Auswertung zwei Jahre nach der Bronchiolitis ergab, dass sie kein Asthma (kein), möglicherweise Asthma (möglicherweise) und wahrscheinlich Asthma (wahrscheinlich) hatten. Für mit "*" gekennzeichnete Ergebnisse wurde eine Wahrscheinlichkeit von p < 0,05 unter Verwendung des Kruskall-Wallis-Tests und des Mann-Whitney-U-Tests für mögliches und wahrscheinliches gegenüber keinem Asthma gefunden. Für durch "**" gekennzeichnete Ergebnisse wurde eine Wahrscheinlichkeit von p = 0,08 unter Verwendung des Kruskall-Wallis-Tests gefunden. Für Ergebnisse, die mit "++" gekennzeichnet sind, wurde eine Wahrscheinlichkeit von p < 0,05 unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Tests für mögliches und wahrscheinliches Asthma gegenüber keinem Asthma gefunden.
Die IL-4-Produktion unterschied sich zwischen den Gruppen nicht. Signifikante positive Korrelationen wurden zwischen der IFN-Produktion zum Zeitpunkt der Bronchiolitis und Merkmalen einer abnormen Funktion der Atemwege (Vmax der funktionalen Restkapazität (FRC), 4A) oder einer vergrößerten Empfindlichkeit der Atemwege (PC40-Histamin, 4B) 4,9 Monate nach der Bronchiolitis gefunden.
In den 4A und 4B wurde eine Zytokin-Produktion zum Zeitpunkt der Bronchiolitis gemessen und die Lungenfunktion 4,9 Monate später gemessen. Die Lungenfunktion wurde mit Methoden ausgewertet, die von der "American Thoracic Society" empfohlen werden. Die maximale Ausatmungsströmung bei der funktionalen Restkapazität (Vmax FRC) wurde mittels des 'schnellen thoracoabdominalen Kompressionsverfahrens' (RTC) unter Verwendung der folgenden Prozedur ausgewertet. Patienten, die zuvor mit 100 mg Chloralhydrat pro kg Körpergewicht sediert wurden (Maximaldosis 1000 mg) wurden mit geringfügig überstrecktem Hals auf dem Rücken liegend in eine aufblasbare Jacke gesteckt, die Abdomen und Thorax bedeckte, und mit einem Druckbehälter verbunden. Beginnend bei einem Druck von 30 cm H2O und in Schritten von 5 cm H2O wurden Messungen der Atmungsströmung bei FRC erhalten, bis Fmax FRC erzielt wurde. Die Strömungen wurden mit einer weich gepolsterten Maske gemessen, die mit einem Pneumotachographen "Fleisch Nr. 1" verbunden und integriert war. Drei zusätzliche technisch korrekte Manöver wurden bei diesem Druck ausgeführt, von denen der höchste Wert gewählt wurde, um die Basis Vmax FRC zu repräsentieren. Alle nachfolgenden Vmax FRC-Manöver wurden unter Verwendung der gleichen Prozedur ausgeführt.
Eine bronchiale Reaktivität gegenüber Histamin wurde unter Verwendung eines mit 8 l/min betriebenen Zerstäubers "Hudson updraft #2" bewertet, und sich verdoppelnde Konzentrationen von Histamin wurden beginnend bei 0,0625 mg/ml bis zu einem Maximum von 8,0 mg/ml 1 Minute lang in Intervallen von 5 Minuten verabreicht. Nach jeder Zerstäubung wurde das Vmax FRC bestimmt. Der Expositionstest wurde beendet, wenn eine Ver ringerung des Vmax FRC von mindestens 40% gegenüber dem Basiswert erreicht wurde, oder wenn die maximale Konzentration an Histamin verabreicht war. Der Puls und die Sauerstoffsättigung wurden während der gesamten Untersuchung mit einem Puls-Oximeter "Ohmeda BIOX 3740" überwacht.
Ein Defekt bei der IFN-Produktion trägt primär zur Entwicklung von Asthma bei Kindern bei. Interessanterweise liegt dieser Defekt bei Erwachsenen mit Asthma und bei Neugeborenen vor, bevor diese eine Atopie entwickeln. Es besteht somit ein Ungleichgewicht bei der relativen Produktion von Th2 (IL-4, IL-13, IL-5, etc.) gegenüber Th1 (IFN)-Zytokinen, die bereits vorhanden ist, bevor jemand Asthma oder eine Allergie entwickelt, und das Verhältnis der Th2 gegenüber den Th1-Zytokinen ist vor der Entwicklung dieser Krankheiten und in deren Verlauf erhöht.
Um die Entwicklung einer Allergie, von Asthma oder einer neoplastischen Zellvermehrung, die von einer abnormen Vergrößerung bei der Produktion oder den Wirkungen der Th2-Zytokine abhängen, zu behandeln oder zu verhindern, wurde es somit als wünschenswert gefunden, die Wirkung der Th2-Zytokine zu verringern.
Demgemäß wird nachfolgend ein Nachweis geliefert, dass Antisense-Oligonukleotide gemäß einer Ausführungsform der Erfindung, die in die Lungen eingeatmet werden, dort abgelagert werden und in Zellen eintreten, in denen sie aktiv sind und in einem nicht abgebauten und somit potenten Zustand für mindestens 24 Stunden verbleiben (siehe 5 und Beispiel I).
Antisense-Oligonukleotide gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind gegen mindestens eine gemeinsame Untereinheit der IL-4 und IL-13-Rezeptoren gerichtet. Diese Antisense-Oligonukleotide sind effektiv bei einer Hemmung der funktionalen Untereinheiten dieser Rezeptoren, wie dargestellt in Beispiel II.
Antisense-Oligonukleotide gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind gegen die gemeinsame Beta-Untereinheit der IL-3, 5 und GM-CSF-Rezeptoren gerichtet. Diese Antisense-Oligonukleotide sind wirksam bei einer Hemmung dieser Rezeptoren und somit bei einer Verhinderung der Proliferation oder Funktion von Krebs- oder Entzündungszellen, die für ihr Überleben von diesen Wachstumsfaktoren abhängig sind (siehe Beispiel III).
Antisense-Oligonukleotide gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind gegen den CCR3-Rezeptor von Chemokinen gerichtet. Diese Antisense-Oligonukleotide sind wirksam bei der Hemmung dieses Rezeptors und somit bei einem Verhindern des Influx, des Überlebens und einer Proliferation oder Funktion von Entzündungszellen und Krebszellen oder infektiösen Organismen, die von diesem Rezeptor abhängig sind (siehe Beispiel IV).
Die Erfindung lässt sich anhand der folgenden Beispiele leichter verstehen, die zur Erläuterung der folgenden Erfindung dienen und deren Schutzumfang nicht einschränken sollen.
Beispiel I
Effektive Verabreichung von Antisense-Oligonukleotiden
Bei jeder Therapie muss, damit sie wirksam ist, die verabreichte Substanz in die Lungen und zu den Zellen gelangen, bei denen sie ihre Wirkung entfalten soll, und zweitens intakt bleiben, ohne dass irgendwelche Nebenwirkungen auftreten. Antisense-Oligonukleotide, die in die Lungen eingeatmet werden, werden in den Lungen und Atemwegen abgelagert, um in die Zellen einzutreten, in denen sie ihre Wirkung entfalten sollen, und verbleiben im nicht abgebauten Zustand für mindestens 24 Stunden ohne die Physiologie der Lunge zu beeinträchtigen. Eine Menge von einem Mikrogramm (1 μg) eines Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotids der Erfindung, das zuvor mit FITC markiert wurde, wurde durch Zerstäuben in die Lungen von Ratten verabreicht. Die Ratten wurden mit Urethan (1 g/kg, i.p.) anästhesiert. Ein Heizkissen wurde verwendet, um die Körpertemperatur während des Versuchs konstant zu halten, und die Rektaltemperatur wurde kontinuierlich mit einem elektronischen Thermometer überwacht. Nach blinder orothrachealer Intubation mit 6 cm eines Katheters aus PE-240-Polyethylen wurde der pulmonare Widerstand während einer Spontanatmung bei auf dem Rücken liegenden Tieren gemessen. Die Strömung wurde dadurch gemessen, dass das vordere Ende des Trachealtubus in einen kleinen Plexiglas^®-Kasten eingesetzt wurde (265 ml Rauminhalt). Es wurde ein Pneumotachograph "Fleisch Nr. 0", der mit einem piezoresistivem Differenzialdruck-Messfühler (Microswitch 163PCOID36, Honeywell, Scarborough Ont. Canada) verbunden war, am anderen Ende des Kastens befestigt, um die Luftströmung zu messen. Der transpulmonare Druck (Ptp) wurde unter Verwendung eines wassergefüllten Katheters gemessen, der in das untere Drittel der Speiseröhre eingesetzt wurde und mit einer Öffnung eines Differenzialdruck-Messfühlers (Transpac II, Abbott, Illinois) verbunden war, wobei die andere Öffnung mit dem Plexiglas-Kasten verbunden war. Der Speiseröhren-Katheter bestand aus einem Polyethylen-Tubus (PE-240, 10 cm lang) mit einem Endstück (6 cm) aus einem einen geringeren Durchmesser aufweisenden Tubus (PE-160).
Die Druck- und Strömungssignale wurden verstärkt und durch achtpolige Bessel-Filter (9 Model 901LPF, Frequency Devices, Haverhill, MA) hindurchgeleitet, wobei deren Abschneidfrequenzen auf 100 Hz eingestellt waren. Die Daten wurden in einem Computer gespeichert. Der Lungenwiderstand wurde durch mehrfache lineare Regression durch Anpassen der Bewegungsgleichung berechnet, und zwar erfolgte dies mit handelsüblicher Software (RHT Infodat Inc. Montreal, PQ).
Nach der Instrumentierung wurde ein Salzaerosol, das 1 μg des markierten Phosphorothioat-Oligonukleotids enthielt, fünf Minuten lang verabreicht.
Dies wurde unter Verwendung eines Hudson-Zerstäubers mit einer Abgabemenge von 0,18 ml/min erzeugt, der mit der an der einen Seite befindlichen Öffnung des Kastens verbunden war. Der Kasten wurde zwischen den Messungen mit einem Strom frischer Luft gespült, um eine CO₂-Anreicherung zu verhindern. Der Lungenwiderstand wurde 5, 10, 15, 20 und 30 Minuten nach der Exposition gemessen und anschließend alle 15 Minuten während einer Gesamtzeit von 8 Stunden gemessen. Der Lungenwiderstand änderte sich während dieses Zeitraums nicht. Die Ratten wurden dann durch Ausbluten getötet und die Lungen entnommen, um zu bestimmen, ob das Oligonukleotid noch vorhanden war. Die Lungen wurden in Paraformaldehyd fixiert und ein mit alkalischer Phosphatase markierter Anti-FITC-Antikörper wurde verwendet, um den Ort des Oligonukleotids zu bestimmen, die Gewebeproben wurden mit "Fast Red" farblich markiert und der Zellkern der Zellen mit einem Gegenfärbemittel von Hoechst gegengefärbt. Aus 5A geht hervor, dass die Oligonukleotide (in rot) in allen Zelltypen verteilt vorhanden sind. Die Oligonukleotide sind in das Zytoplasma der Zellen (5B) eingedrungen und sind auch in einer Entzündungszelle (Makrophage, in der Mitte von 5C) zu finden.
Bei weiteren Versuchen wurden die Ratten mit Pentothal anästhesiert und nach einer Antisense-Zerstäubungsbehandlung wieder zum Aufwachen gebracht. 24 Stunden nach der Vollnarkose wurde eine bronchoalveolare Lungenlavage (BAL) durch Verabreichen von 5 ml an Salzlösung und sanftem Ansaugen durchgeführt. Das BAL-Fluid wurde bei 400 × g 10 Minuten lang zentrifugiert, der Überstand eingefroren und die Zellen zur Analyse auf Objektträger zentrifugiert. Aus 6A geht hervor, dass Makrophagen der vorherrschende Zelltyp sind. Das mit FITC markierte Oligonukleotid (grüne Fluoreszenz) in 6B liegt im Zytoplasma der Zellen vor. Das mit FITC markierte Oligonukleotid wurde entweder aus dem Lavagefluid oder den Lungen der Ratten 24 Stunden nach der Antigen-Exposition extrahiert. Aus 7 geht hervor, dass das Antisense-Oligonukleotid auch 24 Stunden nach Verabreichung intakt ist, und zwar im BAL (Spur 1), der Lunge (Spur 2), im Vergleich zu seiner Kontrollprobe (Spur 3) oder einem weiteren Oligonukleotid, das mit FITC markiert ist (Eotaxin, Spur 4).
Wie aus den 5 bis 7 zu ersehen werden die Antisense-Oligonukleotide der Erfindung in die Lungen eingeatmet, um in die Zellen einzudringen, und bleiben für mehr als 24 Stunden intakt.
Beispiel II
Antisense-Oligonukleotide, welche die gemeinsamen Untereinheiten der IL-4 und IL-13-Rezeptoren hemmen
Interleukin-4 ist bei der IgE-Produktion, der Entwicklung und dem Fortbestehen von Asthma und Atopie beteiligt. Zwar können Therapien, die gegen die Wirkungen von IL-4 gerichtet sind, bei der Prävention von Asthma, Allergien oder neoplastischer Zellvermehrung (die von diesem Mediator abhängt) wirksam sein, es wurde jedoch kürzlich gezeigt, dass ein weiteres Th2-Zytokin (IL-13) die gleichen Effekte wie IL-4 hat. Interessanterweise haben IL-4 und IL-13 mindestens zwei gemeinsame Untereinheiten, die erforderlich sind, damit eine Signal-Transduktion der Nachricht auftritt.
Versuche wurden ausgeführt, um zu untersuchen, ob Antisense-Oligonukleotide, die gegen die gemeinsamen Untereinheiten der IL-4 und IL-13-Rezeptoren gerichtet sind, die Expression dieser Rezeptoren hemmen können. RAJI-Zellen exprimieren hohe Pegel der IL-4 und IL-13-Rezeptoren. Diese Zellen wurden in RPMI 1640, mit Zusatz von 10 wärmeinaktiviertem fötalen Kälberserum, Penicillin, Streptomycin und 1-Glutamin bei 37°C in 5% CO₂ kultiviert. Zwölf Stunden lang wurden die Zellen entweder im Medium allein oder im Medium mit Sense- oder Antisense-Oligonukleotiden für die gemeinsame Untereinheit der IL-4/IL-13 kultiviert. Die Zellen wurden gewonnen, dreimal gespült und dann mit einem Anti-Human-IL-4-Rezeptor-Antikörper eingefärbt (R and D Systems, Katalognr. MAB230), wobei gezeigt wurde, dass die durch den hu manen Zelloberflächenrezeptor als Mediator erfolgenden Bioaktivitäten, die durch IL-4 oder IL-13 bedingt sind, blockiert werden. Aus 8 geht hervor, dass das Antisense-Oligonukleotid OD1: 5'-agaccttcat gttcccagag-3' (SEQ ID NO:1, OD2: 5'-gttcccagag cttgccacct-3' (SEQ ID NO:2) oder OD3: 5'-cctgcaagac cttcatgtt-3' (SEQ ID NO:3) die Expression der bioaktiven Form des IL-4-Rezeptors hemmt, wenn dies mittels Durchfluss-Zytometrie untersucht wird. Die erste Linie zeigt das Fehlen von Fluoreszenz in Zellen, die entweder nicht gefärbt (links) oder einem nichtspezifischen monoklonalen Antikörper (rechts) ausgesetzt waren. Die zweite Linie zeigt, dass RAJI-Zellen den IL-4-Rezeptor exprimieren (92 %) und dass die Fluoreszenz-Intensität sehr hoch ist (viele Rezeptoren). Auf der rechten Seite wurden die RAJI-Zellen 12 Stunden lang mit 10 μMOL des Antisense-Oligonukleotids OD1 inkubiert, was zeigt, dass lediglich 66% der Zellen diesen Rezeptor exprimieren und dass die Fluoreszenz-Intensität sehr gering ist (wenige Rezeptoren an jeder Zelle). Die dritte Linie zeigt die gleichen Ergebnisse nach einer 12-stündigen Inkubation mit den Antisense-Oligonukleotiden OD2 (52%) und OD3 (58%).
Zusätzliche Experimente wurden durchgeführt, um zu untersuchen, ob Antisense-Oligonukleotide (OD3, OD2 und OD1) eine Expression des IL-4-Rezeptors an RAJI-Zellen hemmten, und zwar durch Immunopräzipitation und "Western blot". Aus 9 geht hervor, dass dreißig Millionen RA-JI-Zellen 12 Stunden lang wie zuvor beschrieben im kompletten Medium mit entweder 20 μM des Sense-Oligonukleotids OD4 (erste Spur von links), 10 μM von OD4 (zweite Spur von links), 10 μM des Antisense-Oligonukleotids OD3 (dritte Spur von links), 10 μM des Antisense-Oligonukleotids OD2 (vierte Spur von links), 10 μM des Antisense-Oligonukleotids OD1 (fünfte Spur von links), dem Medium allein (sechste Spur von links und letzte Spur von rechts des zweiten Gels), 20 μM des Antisense-Oligonukleotids OD2 (erste Spur von links des Gels auf der rechten Seite) kultiviert wurden. Das gesamte Protein wurde extrahiert und mit 2 μg von IL-4 über Nacht inkubiert. 10 μg/ml eines Anti-IL-4- Antikörpers (R and D Systems), die an 50 μl einer Protein-A- und Protein-G-Sepharose^TM gekoppelt waren, wurden dann zwei Stunden lang bei 20°C zugesetzt. Die Sepharose^TM Beads wurden 10-mal gespült und ein Agarose-Gel wurde verwendet, um die verbleibenden Proteine abzutrennen. Die verbleibenden Proteine wurden dann auf eine Immobilon-P-Millipore^TM-Membran transferiert und durch "Western"-Analyse durch einen Rabbit-Polyclonal Anti-IL-4-R-alpha-Antikörper kenntlich gemacht (Santa Cruz Biotechology Inc., cat# sc-684). Die Ergebnisse zeigen, dass Antisense-Oligonukleotide eine Expression des IL-4-Rezeptors nicht beeinflussen, dass 10 μM der effektiven Antisense-Oligonukleotide gemäß einer Ausführungsform der Erfindung eine Expression des IL-4-Rezeptors hemmen, und dass 20 μM des Antisense-Oligonukleotids OD2 fast vollständig effektiv sind.
Da es mindestens zwei Untereinheiten gibt, die den IL-4 und IL-13-Rezeptoren gemeinsam sind, wurden zusätzliche Experimente ausgeführt, um zu bestimmen, ob Antisense-Oligonukleotide, die gegen die alpha'-Kette des IL-13-Rezeptors gerichtet sind, auch eine Expression des IL-4/13-Rezeptors an RAJI-Zellen hemmen. Es ist angemerkt, dass in 10 die Antisense-Oligonukleotide A1.3: 5'-CGCCCACAGC CCGCAGAGCC-3' (SEQ ID NO:4) eine alpha'-Rezeptorexpression in RAJI-Zellen hemmten. RAJI-Zellen wurden drei Stunden lang in einem Medium inkubiert, das Antisense- (10 oder 20 μM) oder Sense-Oligonukleotide (10 μM) enthielt, und dann neun Stunden lang im kompletten Medium inkubiert. Danach wurde mRNA extrahiert. Eine IL-13Ralpha'-Kette und eine zur Kontrolle dienende IL-2Rgamma-Kette und G3PDH-Transkripte wurden mittels semiquantitativer RT-PCR untersucht. Von links nach rechts sind die Ergebnisse wiedergegeben für: Unbehandelte periphere mononukleare Blutzellen (PBMNC, Spur 2), RAJI-Zellen im kompletten Medium (Spuren 3, 4), RAJI-Zellen mit 10 μM von A1.3 (Spur 5), RAJI-Zellen mit 10 μM von A1.3 und deren Sense-Gegenstück (S1.3, Spur 6), RAJI-Zellen mit 20 μM von A1.3 (Spur 7) und kein cDNA (Spur 8). Sequenzen von weiteren Antisense-Oligonukleotiden, die in vitro ebenfalls effektiv waren, beinhalten: A1.1: 5'-CTCCATGCAG CCTCTCGCCT3' (SEQ ID NO:5); A1.4: 5'-CCGCCGGCGC AGAGCAGCAG-3' (SEQ ID NO:6); und A1.5: 5'-CGCCCCCGCC CCCGCCCCCG-3' (SEQ ID NO:7).
Versuche betreffend die Dosis-Wirkungs-Beziehung wurden mit dem Antisense-Oligonukleotid OD2 durchgeführt, um die optimale Konzentration zu bestimmen, die eine Expression des IL-4/IL13-Rezeptors in RAJI-Zellen blockiert. Aus 10, die Immunostain-Versuche zeigt, geht hervor, dass das OD2 ebenfalls eine Rezeptorexpression hemmte, wenn mittels Immunostain-Untersuchungen untersucht wurde. RAJI-Zellen wurden 12 Stunden lang im kompletten Medium kultiviert, das 5 μM OD2 (oben links), 10 μM OD2 (Mitte links), 20 μM OD2 (unten links), kein Oligonukleotid (oben rechts), 10 μM des Sense-Oligonukleotids für die gleiche Sequenz wie OD2 (Mitte rechts) oder 20 μM des Sense-Oligonukleotids für die gleiche Sequenz wie OD2 (unten rechts) enthielt. Objektträger wurden in Methanolaceton bei –20°C zehn Minuten lang fixiert. Nach einer 15-minütigen Behandlung mit Tris-gepufferter Salzlösung, die universelle Blockierlösung (DAKO) enthielt, wurden die Objektträger mit einem Anti-IL-4-Rezeptorserum (Santa Cruz Biotechnology, Inc., cat# sc-684) mit einer Endverdünnung von 1/200 über Nacht bei 4°C inkubiert, gefolgt von einem Inkubieren mit 5 μg/ml durch alkalische Phosphatase markierten Goat-Anti-Rabbit-IgG. Die Zellkerne wurden 1 Minute lang in Haematoxylin gefärbt. Unter diesen Versuchsbedingungen hemmten 20 μM von OD2 eine Expression des IL-4-Rezeptors fast vollständig.
Eine Produktion von IgE-Antikörpern stellt einen wichtigen Bestandteil einer Allergie, von Asthma und gewissen neoplastischen Zuständen dar. Es wurden Versuche ausgeführt, um die Wirkung von Antisense-Phosphorothioat-Oligonulcleotiden zu untersuchen, die gegen die gemeinsamen alpha- (OD2) und alpha' (A1.3) Untereinheiten der IL-4 und IL-13-Rezeptoren bei der IgE-Produktion gerichtet sind. Human-B-Lymphozyten wurden aus Tonsilien (Mandeln) isoliert, die aus einer Vielzahl von Indikationen chirurgisch entfernt wurden. Mononukleare Zellen wurden durch eine Ficoll-Hypaque^TM-(Pharmacia)-Dichtezentrifugation gereinigt. B-Lymphozyten wurden von T-Zellen separiert, und zwar durch ein E-Rosetting-Verfahren mit Neuramidase-behandelten (Calbiochem. La Jolla, Calif.) roten Blutzellen von Schafen. Es erfolgte während zwei Stunden ein Entziehen von Monozyten durch Adhärenz auf Kunststoff-Petrischalen. Die Reinheit der B-Lymphozyten betrug routinemäßig 98%. B-Zellen (2 × 105/200 μl/well) wurden in einem kompletten Medium kultiviert, das aus RPMA 1640 bestand, dem 10% FCS, 10 mg/ml L-Glutamin, 50 U/ml Penicillin und 50 ng/ml Streptomycin zugesetzt waren. Die Zellen wurden mit einer Kombination aus 200 U/ml von IL-4 (R&D System) und 0,1 μg/ml von Anti-CD46 mAb (Pharmingen) unter Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Antisense- oder Sense-Oligonukleotiden bei 10 μM 16 Tage lang kultiviert. Die Überstände wurden geerntet und der IgE wurde mittels ELISA (Kallestad, Sanofi Diagnostics, Caska, Minn.) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Tabelle 1 ist zu entnehmen, dass sowohl A1.3 als auch OD2-Antisense-Phosphorothioat-Oligonulcleotide, verglichen mit ihren Sense-Gegenstücken, eine Produktion von Human-IgE hemmen.
Tabelle 1 Hemmung der IgE-Produktion durch Antisense-Oligonukleotide in Anti-CD40 + IL-4-stimulierten Human-B-Zellen
Wie zuvor erwähnt, wurde ein Ungleichgewicht zwischen der Produktion des Th2-Zytokin Interleukin-4 und dem Th1-Zytokin IFN-⎕ bei Allergien und Asthma beschrieben. Es wurden Versuche durchgeführt, um die Wir kung von Antisense-Phosphorothioat-Oligonulcleotiden zu untersuchen, die gegen die gemeinsamen alpha- (OD2) und alpha' (A1.3) Untereinheiten der IL-4 und IL-13-Rezeptoren bei der Produktion von IL-4 und IFN-⎕ gerichtet sind. Humane mononukleare Zellsuspensionen wurden aus Nabelschnurblut (UCB) durch 30-minütiges Zentrifugieren über Ficoll-Hypaque^TM-Gradient bei 400 g erzielt. Monozyten wurden durch Adhärenz an Plastikflaschen entzogen, und zwar für zwei Stunden bei 37°C in RPMI 1640 unter Zusatz von 7,5% fötalem Kälberserum (FCS) in einem 5%-Co₂-Brutschrank. Nabelschnurblut-T-Zellen wurden mit PHA (1 μg/ml) unter TH1-polarisierenden Bedingungen [human rIL-12 (2 ng/ml; R&D Systems) plus Neutralisieren von mAb zu IL-4 (200 ng/ml; R&D Systems)] oder TH2-polarisierenden Bedingungen [humanes rekombinantes IL-4 (200 U/ml) plus Neutralisieren von mAb zu humanem IL-12 (2 μg/ml; R&D Systems)] bei Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von 10 μM von Antisense- oder Sense-Oligonukleotiden. Jedes Oligonukleotid wurde der Kultur drei Stunden vor dem Zusetzen der Zytokine zugesetzt. IL-2 wurde an Tag 3 zugesetzt. Nach einer und zwei Wochen wurden die Kulturen in den gleichen polarisierenden Bedingungen bei Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Oligonukleotiden restimuliert und nach zehn Kultivierungstagen analysiert. Die Zellen wurden geerntet, dreimal gespült und mit PMA (50 ng/ml) plus Ionomycin (500 ng/ml) 48 h bei 37°C restimuliert, für eine Analyse der IL-4 und der IFN-⎕-Produktion in den Überständen mittels ELISA (R&D Systems) gemäß den Herstelleranweisungen. Aus 12 ist zu entnehmen, dass Antisense-Oligonukleotide, die gegen die gemeinsamen Untereinheiten der IL-4/13-Rezeptoren gerichtet sind, die IL-4-Produktion hemmen und die IFN-⎕-Produktion erhöhen. Von links nach rechts wurde gereinigtes UBC in Th2 stimulierenden Bedingungen kultiviert: Th2 stimulierende Bedingungen bei Vorhandensein des Sense-Oligonukleotids für OD2; Th2 stimulierende Bedingungen bei Vorhandensein des Antisense-Oligonukleotids OD2 und Th2 stimulierenden Bedingungen bei Vorhandensein des Antisense-Oligonukleotid A1.3.
Wie aus den 8 bis 12 gezeigt werden kann, sind die Antisense-Oligonukleotide gemäß einer Ausführungsform der Erfindung, die gegen die gemeinsamen Untereinheiten alpha und alpha' des IL-4/IL-13-Rezeptors gerichtet sind, effektiv bei der Hemmung der IL-4/13-Rezeptorexpression, dessen funktionalen Bauteils, der IgE-Produktion und dem Switchen der Vorläuferzellen zu den Zellen vom Th2-Typ.
Beispiel III
Antisense-Oligonukleotide, welche die gemeinsame Beta-Untereinheit von IL-3, IL-5 und GM-CSF-Rezeptoren hemmen
Interleukin-3, 5 und GM-CSF sind wichtige Zytokine, die bei eosinophiler Proliferation und Weiterbestand beteiligt sind. Diese Zytokine treten bei Asthma und atopischen Krankheiten vermehrt auf und sind bei der undefinierten Proliferation von gewissen neoplastischen Krankheiten beteiligt. Interessanterweise haben IL-3, IL-5 und GM-CSF eine gemeinsame Beta-Untereinheit, die bei der Signal-Transduktion beteiligt ist.
Versuche wurden durchgeführt, um zu untersuchen, ob Antisense-Oligonukleotide der Erfindung, die gegen die gemeinsame Beta-Untereinheit des IL-3, IL-5 und GM CSF-Rezeptors gerichtet sind, die Expression und die Funktion dieses Rezeptors hemmen können. TF1 und U937-Zellen exprimieren hohe Pegel der GM-CSF-Rezeptoren. Außerdem sind die TF1-Zellen für das Überleben von GM-CSF abhängig. Diese Zellen wurden in RPMI 1640 kultiviert, und zwar unter Zusatz von 10% wärmeinaktiviertem fötalem Kälberserum, Penicillin, Streptomycin und 1-Glutamin bei 37°C in 5% CO₂ (den TF1-Zellen wurde GM-CSF zugesetzt). Zwölf Stunden lang wurden sie entweder im Medium allein oder im Medium mit Sense-(107S: 5'-ACCATCCCGC TGCAGACCC-3' (SEQ ID NO:8)) oder Antisense-(107A: 5'-GGGTCTGCAG CGGGATGGT-3' (SEQ ID NO:9))-Oligonukleotiden der gemeinsamen Beta-Untereinheit des IL-3, IL-5 und GM-CSF-Rezeptors kultiviert. Die Zellen wurden entnommen und dreimal gespült. RNA wurde dann entnommen und das Vorhandensein der Beta-Kette des Rezeptors wurde durch semiquantitatives RT-PCR untersucht. Aus 13 ist zu entnehmen, dass die Antisense-Oligonukleotide die Expression des mRNA für den gemeinsamen Beta-Rezeptor in TF1-Zellen (13A) und U937-Zellen (13B) hemmen. In 13A sind, von links nach rechts dargestellt, eine mRNA-Expression für Beta-Aktin in der Kontrollgruppe, in Sense- und Antisense-behandelten Zellen (Spuren 2, 3, 4) dargestellt; eine mRNA-Expression für den gemeinsamen Rezeptor ist in der Kontrollgruppe, in Sense- und Antisensebehandelten Zellen dargestellt (Spuren 5, 6, 7). Das Nichtvorhandensein einer Bande in Spur 7 zeigt die Wirksamkeit des Antisense-Oligonukleotids beim Hemmen der mRNA-Expression der gemeinsamen Beta-Untereinheit in TF1-Zellen an. In 13B sind; von rechts nach links betrachtet, eine mRNA-Expression für die gemeinsame Beta-Untereinheit bei Inkongruenz, Antisense-, Sense- und Zellen der Kontrollgruppe (unbehandelt) dargestellt (Spuren 1, 2, 3, 4); eine mRNA-Expression für G3PDH ist bei Inkongruenz, Antisense-, Sense- und Zellen der Kontrollgruppe (unbehandelt) dargestellt (Spuren 6, 7, 8, 9). Das Nichtvorhandensein einer Bande in Spur 2 ist bezeichnend für die Effektivität des Antisense-Oligonukleotids beim Hemmen der mRNA-Expression der gemeinsamen Beta-Untereinheit in U937-Zellen.
Zusätzliche Experimente wurden durchgeführt, um zu untersuchen, ob Antisense-Oligonukleotide (107A) die gemeinsame Beta-Untereinheit von IL-3, IL-5 und GM-CSF-Rezeptoren in TF1-Zellen hemmten, und zwar durch Immunopräzipitation und "Western blot". Bei 14 wurden 30 Millionen TF1-Zellen 12 Stunden lang wie zuvor beschrieben im kompletten Medium mit entweder 10 μM des Sense-Oligonukleotids 107S oder des Antisense-Oligonukleotids 107A (erste Spur von rechts) kultiviert. Das Protein wurde durch Immunopräzipitation mit einem monoklonalen Antikörper gegen den GM-CSF-Beta-Ketten-Rezeptor extrahiert. Das Extrakt wurde dann auf eine Immobilon-P-Millipore-Membran nach einer Elektrophorese auf einem Polyacrylamid-Gel transferiert, und die GM-CSF-Beta-Kette des Rezeptors wurde dann durch einen polyklonalen Rab bit-Anti-GM-CSF-R-Beta-Antikörper kenntlich gemacht. Die Ergebnisse zeigen, dass bei der gleichen Konzentration (10 μM) Sense-Oligonukleotide die Expression der gemeinsamen Beta-Kette nicht beeinflussen, hingegen die Antisense-Oligonukleotide der Erfindung die gemeinsame Beta-Untereinheit der IL-3, IL-5 und GM-CSF-Rezeptoren hemmen.
Experimente zur Dosis-Wirkungs-Beziehung wurden mit den Antisense-Oligonukleotid 107A durchgeführt, um die optimale Konzentration für ein Blockieren des TF1-Zellwachstums zu bestimmen. Wie aus 15 zu erkennen, können Antisense-Oligonukleotide der Erfindung zum Hemmen des Zellwachstums verwendet werden. TF1-Zellen wurden bei Vorliegen zunehmender Konzentrationen an Oligonukleotiden in serumfreiem Medium zwei Stunden lang kultiviert und dann fötales Rinderserum und GM-CSF bis zu einer Endkonzentration von 10% bzw. 1 ng/ml zugesetzt. Die Kultur wurde für weitere zwei Tage weitergeführt, und dann wurden Zellen auf ihre Fähigkeit hin untersucht, einen MTT-Farbstoff über einen vierstündigen Zeitraum in ein farbiges Formazan-Produkt als Anzeiger für Überleben und Proliferation der Zelle zu reduzieren. Die Ergebnisse sind als Absorptionsanteil des von MTT stammenden Formazan ausgedrückt, das durch unbehandelte Zellen entwickelt wurde. Punkt = Mittelwert ± SDEV. Das Experiment wurde dreifach ausgeführt. Es wurde eine Absorption von 570–595 nm gemessen.
Aus 16 ist zu entnehmen, dass das Antisense-Oligonukleotid 107A, im Vergleich zur Sense-Testgruppe oder einer Kontrollgruppe ohne Antisense-Oligonukleotide, das Zellwachstum signifikant hemmen kann. TF1-Zellen wurden unter Vorhandensein des Antisense-Oligonukleotids (erstes von rechts), des Sense-Oligonukleotids (zweites von rechts), des Kontrollmediums (einschließlich GM-CSF, drittes von rechts) oder eines Mediums ohne GM-CSF (viertes von rechts) zwei Tage lang kultiviert, und dann wurden die Zellen auf ihre Fähigkeit hin untersucht, einen MTT-Farbstoff zu reduzieren, wie zuvor beschrieben.
Weitere Antisense-Oligonukleotide gemäß der Erfindung haben eine Wirksamkeit bei einer Konzentration von 20 μMol gezeigt. Diese Antisense-Oligonukleotide sind beispielsweise, jedoch nicht darauf eingeschränkt, die Oligonukleotide 106: 5'-ggtctgcagc gggatggtt-3' (SEQ ID NO:10); 108: 5'-agggtctgca gcgggatgg-3' (SEQ ID NO:11); 110: 5'-gcagggtctg cagcgggat-3' (SEQ ID NO:12); 101: 5'-gcagcgggat ggtttcttc-3' (SEQ ID NO:13); 100: 5'-cagcgggatg gtttcttct-3' (SEQ ID NO:14); und 105: 5'-gtctgcagcg ggatggttt-3' (SEQ ID NO:15).
Versuche wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob Antisense-Oligonukleotide, die gegen die gemeinsame Beta-Kette der GM-CSF, IL-3 und IL-5-Rezeptoren gerichtet sind, den Influx von Eosinophilen in vivo hemmen können. Aus 17 ist zu erkennen, dass die Antisense-Oligonukleotide RB141A: 5'-TGGCACTTTA GGTGGCTG-3' (SEQ ID NO:16) effektiv bei der Hemmung der mRNA-Expression der gemeinsamen Beta-Kette der GM-CSF, IL-3 und IL-5-Rezeptoren von Ratten in vitro ist. Auf der linken Seite sind die Ergebnisse der semiquantitativen RT-PCR für die G3PDH-Gene in der Kontrollgruppe, den RB141A und den Sense-behandelten SS141-Markzellen angegeben. Rechts sind, von rechts nach links, die Ergebnisse der semiquantitativen RT-PCR der gemeinsamen Beta-Untereinheit der GM-CSF, IL-3 und IL-5-Rezeptoren angegeben; Spur 2 zeigt die Hemmung der Gen-Expression mit RB141A (AS141). Brown-Norway-Raten wurden mit Pentothal (65 mg/kg i.p.) anästhesiert. Sie wurden dann getötet, die unteren Extremitäten abgenommen und die Oberschenkelknochen (Femur) isoliert. Die Knochen wurden in 70% Ethanol 10 Minuten lang inkubiert. Die zwei Enden der Knochen wurden abgeschnitten und Knochenmark wurde durch Injizieren und Aspirieren von 15 ml von RPMI 1640 gewonnen. Die Zellen wurden zweimal gespült und sechs Stunden lang in RPMI 1640 bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert, und zwar mit dem Medium allein, 10 μM RB141A oder 10 μM des Sense-Oligonukleotids RB141S: 5'-CAGCCACCTA AAGTGCCA-3' (SEQ ID NO:17).
Bei weiteren Versuchen wurden Brown-Norway-Ratten aktiv auf Ovalbumin sensibilisiert, und zwar durch subkutanes Injizieren von 1,25 mg Ovalbumin, vermischt mit 200 mg Aluminiumhydroxid. Am 14. Tag erhielten Ratten intraperitoneal 500 μg von RB141A in 500 μl an 0,9%igem NaCl. Am nächsten Tag wurden, nach einer Vollnarkose mit 65 mg/kg Pentothal und endotrachealer Intubation, 200 μg des Antisense entweder intratracheal oder intraperitoneal in 50 μl von 0,9%iger NaCl-Lösung verabreicht. 20 Minuten später wird eine Ovalbumin-Exposition durch Injizieren von 200 μg Ovalbumin in 50 μl entweder intratracheal oder intraperitoneal durchgeführt. Nach 8 Stunden werden die Ratten nach einer Vollnarkose erneut intubiert und eine Lungenlavage, die aus fünfmaligen Eintröpfelungen von 5 ml oder einer Peritoneallavage mit 8 ml bestehen, wird durchgeführt. Die Zellen werden gespült, gezählt und in einem Cytospin III auf Objektträger zentrifugiert. Eine Differential-Zellzählung wird durchgeführt. Aus Fig. A ist zu erkennen, dass die Antisense-Oligonukleotide RB141A, die gegen die gemeinsame Beta-Kette der GM-CSF-, IL-3- und IL-5-Rezeptaren gerichtet sind, einen eosinophilen Influx in die Lungen oder die Peritonealhöhle um ca. 50% hemmen. 18A zeigt die Ergebnisse, die aus dem Peritonealfluid erhalten wurden, wobei die Effekte von RB141 (AS141) gezeigt sind. In 18B sind die Ergebnisse von einer Lungen-BAL dargestellt, wobei die Wirkungen von RB141 (AS141) gezeigt werden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Antisense-Oligonukleotide, die gegen die gemeinsame Beta-Kette der GM-CSF-, IL-3- und IL-5-Rezeptoren gerichtet sind, bei der Prävention des eosinophilen Influx und/oder Fortbestehen wichtig sind, das bei verschiedenen allergischen Krankheiten auftritt.
Wie aus den 15 bis 18 gezeigt weiden kann, sind die Antisense-Oligonukleotide der Erfindung, die gegen die gemeinsame Beta-Untereinheit der IL-3-, IL-5- und GM-CSF-Rezeptoren gerichtet sind, ef fektiv bei der Hemmung einer Rezeptorexpression, eines Zellwachstums, einer eosinophilen Rekrutierung sowie Fortbestehen.
Beispiel IV
Antisense-Oligonukleotide, welche den CCR3-Rezeptor für Chemokine hemmen
Es gibt zwei Betrachtungen im Hinblick auf den CCR3-Rezeptor: 1) Er wird an den Th2- und nicht an den Th1-Lymphozyten exprimiert, 2) der CCR3-Rezeptor ist für die Rekrutierung von Eosinophilen zu den Orten einer allergischen oder asthmatischen Entzündung wichtig. Die Chemokine Eotaxin, MCP-4 und RANTES vermitteln die meisten ihrer Wirkungen mittels des CCR3-Rezeptors. Dieses Chemokine sind in vermehrter Zahl in den Lungen von Patienten mit Allergie und Asthma vorhanden (Lamkhioued et al., Journal of Immunology, 159: 4593–4601, 1997). 19 zeigt, dass Eotaxin in epithelialen Zellen und in Entzündungszellen in den Lungen von Patienten mit Allergie und Asthma vermehrt auftritt. Die Expression und Zellverteilung von Eotaxin mRNA (19A bis 19D) und Protein (19E bis 19H) in den Atemwegen (19A, 19B, 19E) und BAL-Zellen (19C, 19D, 19F bis 19H) von asthmatischen Patienten und normalen Kontrollpersonen wurden untersucht. Eine Eotaxin-mRNA-Expression ist bei asthmatischen (19A) im Vergleich zu normalen Atemwegen (19B) vergrößert. Eine hervorgehobene Färbung ist bei epithelialen Zellen (Ep) und bei vielen Entzündungszellen (Pfeilspitzen) der allergischen asthmatischen Atemwege zu beobachten. 19C und 19D sind repräsentative Beispiele einer In-situ-Hybridisierung von Cytospin-Präparaten von BAL-Zellen, die von einem asthmatischen Patienten bzw. einer normalen Kontrollperson erhalten wurden. Biopsie-Zellproben und Biopsie-Schnitte wurden mit einer FITC-markierten Antisense-Ribosonde hybridisiert, die zum Eotaxin-mRNA komplementär ist. Die überwiegende Menge von erfolgreich hybridisierten Zellen im BAL wiesen eine mit den Makrophagen (Pfeilspitzen) konsistente Morphologie auf. 19E zeigt eine immunohisto chemische Erfassung von Eotaxin in einem repräsentative Biopsie-Schnitt eines asthmatischen Patienten. Die Eotaxin-Immunoreaktivität wurde mit dem Fast-Red-Chromogen sichtbar gemacht und an den Epithelial- und den Entzündungszellen (Pfeilspitzen) lokalisiert. 19F ist eine Colokalisation einer Eotaxin-Immunoreaktivität (Rot) mit positiven CD-68-Makrophagen (Braun) in BAL-Zellen von einem asthmatischen Patienten durch doppelte immunohistochemische Analyse. Beispiele von doppelten positiven Zellen sind mit Pfeilspitzen bezeichnet. 19G und 19H zeigen eine Eotaxin-Immunofluoreszenzfärbung von BAL-Zellen, die von einem asthmatischen Patienten bzw. einer normalen Kontrollperson erhalten wurden. Man beachte die Eotaxin-Immunofärbung bei Eosinophilen (Pfeilspitzen).
Der Beitrag der unterschiedlichen Chemokinen, die in den Lungen von allergischen Patienten mit Asthma vorhandenen waren, zu einer Chemotaxie gereinigter Eosinophile wurde ebenfalls untersucht. Demgemäß wurde eine bronchoalveolare Lungenlavage bei Asthmatikern durchgeführt. Der Überstand wurde mit Centricon^TM-Kolonnen zehnfach konzentriert. Die hemmende Wirkung von gegen unterschiedliche Chemokine gerichteten Antikörpern auf eine eosinophile Migration reagierend auf ein BAL-Fluid wird in Tabelle 2 untersucht. BAL-Fluid wurde mit einem Puffer, Antikörpern der Kontrollgruppe, polyklonalen Rabbit-Anti-Exotaxin, Anti-MCP-4, Anti-RANTES-Antikörpern oder einer Kombination dieser Antikörper eine Stunde lang vorinkubiert, bevor die Chemotaxie-Untersuchung durchgeführt wurde. Die Konzentration des Eotaxin, die beim BAL bei jeder Untersuchung verwendet wurde, ist angegeben. Versuche wurden mit einer 48-Loch-Mikro-Chemotaxiskammer (NeuroProbe) durchgeführt. Eine Migration von humanen Eosinophilen wurde auf einem Polycarbonat-Filter (Porengröße 5 μm) durchgeführt. Eosinophile (2 × 106 Zellen/ml) wurden in einem RPMI-Medium resuspendiert, in die Kammern gefüllt, bei 37°C, 5% CO₂ 60 min inkubiert, und die Filter wurden mit einem RAL-Kit (Labonord, France) fixiert und gefärbt. Eosinophile wurden mikroskopisch in fünf ausgewählten High Power Fields (Vergrößerung × 400) gezählt. Zum Vergleich der Ergebnisse unterschiedlicher Chemotaxis- Untersuchungen wurde ein chemotaktischer Index (CI) wie folgt berechnet: CI = (Proben-Zählwert)/(Kontrollmedium-Zählwert). In der Formel repräsentiert der Proben-Zählwert die Anzahl der zu BAL oder Eotaxin migrierten Zellen, und Kontroll-Zellwert ist die mittlere Migration der Zellen, reagierend auf RPMI. Der Prozentsatz der Bewegungshemmung und das Vertrauensintervall sind für Versuche angegeben, die bei von 3 Personen erhaltenen Eosinophilen durchgeführt wurden. Der Prozentsatz der Hemmung wurde durch folgende Formel berechnet; 100 – {(mittlere Anzahl von migrierten Zellen in mit Antikörpern behandelten Fluiden)/(mittlere Anzahl von migrierten Zellen im unbehandelten Fluid)} × 100.
In Tabelle 2 sind die 3 Chemokine, die in der Hauptsache über den CCR3-Rezeptor wirken, für ca. 50% der Chemotaxis der Eosinophilen in asthmatischer BAL verantwortlich.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Chemokine (die über den CCR3-Rezeptor wirken), vermehrt auftreten und bei allergischem Asthma von Bedeutung sind, und eine Hemmung des CCR3-Rezeptors mit Antisense-Oligonukleotiden bei der Therapie von Allergien und Asthma somit wichtig ist.
Experimente wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob Antisense-Oligonulcleotide, die gegen den CCR3-Rezeptor gerichtet sind, die mRNA-Expression dieses Rezeptors hemmen können. Aus 20 ist zu ersehen, dass die gegen den CCR3-Rezeptor gerichteten Antisense-Oligonukleotide (CCR3AS 86 (RC86A): 5'-CTGGGCCATC AGTGCTCTG-3' SEQ ID NO:18), bei der Hemmung der Expression von mRNA für CCR3 in HL60-Zellen effektiv ist, die in den eosinophilen Pfad differenziert sind. Das Haushalts-Gen, das zum Standardisieren des mRNA-Präparates verwendet wurde, war G3PDH (451-bp-Bande, Gel auf der rechten Seite). Das Gel auf der linken Seite zeigt, dass im Vergleich zum Sense-Oligonukleotid (CCR3SS 86: 5'-CAGAGCACTG ATGGCCCAG-3'; SEQ ID NO:19), RC86A die mRNA für CCR3 hemmt (mittlere Spur). HL60-Zellen (Klon 15) wurden in Eosinophil-artige Zellen differenziert, und zwar durch 10-tägige Inkubation in RPMI 1640, unter Zusatz von 10% wärmeinaktiviertem fötalem Kälberserum, Penicillin, Streptomycin, 1-Glutamin und 0,5 molarer Essigsäure bei 37°C in 5% CO₂ mit dem Medium allein, 10 μM CCCR3AS1 oder 10 μM CCR3Ss, und zwar 6 Stunden lang. Es erfolgte eine Isolierung der mRNA mit Trizol, und nach einer Standardisierung der Menge der mRNA mit G3PDH wurde die Expression von mRNA für CCR3 in mRNA untersucht, die von Zellen erhalten wurden, die im Medium (Kontrollgruppe), mit CCR3AS 86 (mittlere Spur) oder mit CCR3SS 86 (rechte Spur) kultiviert wurden.
Versuche wurden auch durchgeführt, um zu untersuchen, ob Antisense-Oligonukleotide, die gegen den CCR3-Rezeptor gerichtet sind, die mRNA-Expression dieses Rezeptors an Ghost-Zellen hemmen können, bei denen eine Transfektion mit dem CCR3-Rezeptor erfolgt ist. Diese Zellen wurden aus dem NIH erhalten, und das CCR3-Gen wurde mittels einer retroviralen Infektion mit dem MLV-BABE-puro-Vektor induziert. Aus 21 ist zu erkennen, dass, beim Gel auf der rechten Seite, das Antisense-Oligonukleotid, das gegen den CCR3-Rezeptor (RC86A) gerichtet ist, bei einer Hemmung der mRNA-Expression des CCR3-Rezeptors effektiv ist, und zwar verglichen mit der Steuergruppe, bei der keine Inkubation mit einem 10 μMol-Antisense erfolgt ist. Das Gel auf der linken Seite zeigt die Ergebnisse, die für das Haushalts-Gen G3PDH erzielt wurden.
Weitere Versuche wurden durchgeführt, um zu untersuchen, ob Antisense-Oligonukleotide, die gegen den CCR3-Rezeptor gerichtet sind, die Funktion dieses Rezeptors hemmen können. Aus 22 ist zu entnehmen, dass das gegen den CCR3-Rezeptor gerichtete Antisense-Oligonukleotid (RC269AS: 5'-CCTGACATA GTGGATC-3' SEQ ID NO: 20) und RC86A bei der Hemmung einer Kalzium-Mobilisierung (ein Zeichen von Chemotaxis) in Eosinophilen effektiv ist. Human Eosinophile wurden aus Blut purifiziert, das von Patienten mit Asthma erhalten wurde, und zwar durch Ficoll-Hypaque-Zentrifugierung, Lyse von roten Blutzellen, gefolgt von negativer Auswahl mit anti-CD16-beschichteten magnetischen Beads auf einem MACS-Zellensortierer (um Neutrophile zu eliminieren). Die Eosinophilen wurden dann gespült und mit humanem rekombinanten IL-5 (1,6 ng/ml) in RPMI 1640 inkubiert, dem 10% wärmeinaktiviertes fötales Kälberserum, Penicillin, Streptomycin und 1-Glutamin zugesetzt war, und zwar über Nacht bei 37°C in 5% CO₂. Die Zellen wurden gespült und dann 4 Stunden lang in RPMI 1640 unter Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein von 10 μM RC269AS oder 10 μM RC269S 5'-GATCCACTAT GTCAGGG-3' (SEQ ID NO:21) inkubiert, gespült und resuspendiert bei 2,5 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI 1640 und mit Fura-2M bei einer Konzentration von 3 μM 45 Minuten lang inkubiert. Die Zellen wur den zweimal mit PBS gespült und in einem Kalzium-Puffer (PBS, 1 mM HEPES, 1 mM Ca++) resuspendiert. Der Kalzium-Efflux nach sofortiger Stimulation mit Eotaxin wurde mit einem Perkin Elmer L50B Spektrophotometer (Erregung bei 34 nm, Schlitz 5 nm und Emission bei 492 nm, Schlitz 5 nm).
Versuche wurden dann durchgeführt, um zu bestimmen, ob Antisense-Oligonulcleotide, die gegen den CCR3-Rezeptor gerichtet sind, den Influx von Eosinophilen in vivo hemmen können. Aus 23 ist zu entnehmen, dass das Phosphorothioat-Antisense-Oligonukleotid RCC3A4 5'-ACTCATATTC ATAGGGTG-3' (SEQ ID NO:22) bei der Hemmung der mRNA-Expression eines CCR3 von Ratten in vitro effektiv ist. Auf der linken Seite sind die Ergebnisse einer semiquantitativen RT-PCR für das G3PDH-Gen dargestellt, und zwar im Kontrollmedium ohne Antisense, im Medium mit CCR3A2 (5'-GCCAACACAG CATGAACG-3', SEQ ID NO:23), einem Antisense, das sich als ineffektiv gegen eine CCR3-Rezeptorexpression erwiesen hat und im Medium mit RCC3A4 (10 μMol)behandelten Markzellen. Auf der rechten Seite, von rechts nach links, sind die Ergebnisse einer semiquantitativen RT-PCR des CCR3-Rezeptors von Ratten dargestellt; Spur 1 zeigt die Hemmung der Gen-Expression mit RCC3A4. Brown-Norway-Raten wurden mit Pentothal (65 mg/kg i.p.) anästhesiert. Sie wurden dann getötet, die unteren Extremitäten abgenommen und die Oberschenkelknochen (Femur) isoliert. Die Knochen wurden in 70% Ethanol 10 Minuten lang inkubiert. Die beiden Enden der Knochen wurden abgeschnitten und Knochenmark wurde durch Injizieren und Aspirieren von 15 ml von RPMI 1640 gewonnen. Die Zellen wurden zweimal gespült und sechs Stunden lang in RPMI 1640 bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert, und zwar mit dem Medium alleine, dem Medium mit 10 μM von RC3A2 oder mit 10 μM RCC3A4.
Weitere Versuche zeigen, dass Antisense-Oligonukleotide, die gegen den CCR3-Rezeptor gerichtet sind, bei einer Hemmung des eosinophilen In flux in die Peritonealhöhle und in die Lungen in vivo effektiv sind. Brown-Norway-Ratten wurden aktiv auf Ovalbumin sensibilisiert, und zwar durch subkutanes Injizieren von 1,25 mg Ovalbumin, vermischt mit 200 mg Aluminiumhydroxid. Am 14. Tag erhielten die Ratten 500 μg von RCC3A4 in 500 μl von 0,9%iger NaCl-Lösung oder 0,9%ige NaCl-Lösung intraperitoneal. Am nächsten Tag wurden die Ratten durch Verabreichen von 1,25 mg von Ovalbumin intraperitoneal provoziert. Acht Stunden später wurden die Ratten mit 65 mg/kg Pentothal anästhesiert, die Abdominalhöhle wurde geöffnet und mit 8 ml von RPMI 1640 gespült. Die Spüllösung wird gewonnen, die Zellen gespült, gezählt und auf Objektträgern in einem Cytospin III zentrifugiert. Eine Differentialzellzählung wird durchgeführt. Aus 18A ist zu entnehmen, dass das Antisense-Oligonukleotid RCC3A4, das gegen den CCR3-Rezeptor gerichtet ist, einen eosinophilen Influx in die Peritonealhöhle um ca. 60% hemmt.
Bei weiteren Experimenten wurden Brown-Norway-Ratten auf Ovalbumin aktiv sensibilisiert, und zwar durch subkutanes Injizieren von 1,25 mg Ovalbumin, gemischt mit 200 mg Aluminiumhydroxid. Am 14. Tag erhielten die Ratten 500 μg von RCC3A4 in 500 μl von 0,9%iger NaCl-Lösung oder 0,9%ige NaCl-Lösung intraperitoneal. Am nächsten Tag wird, nach Vollnarkose mit 65 mg/kg Pentothal und einer Endotrachealintubation 200 μg des Antisense intratracheal in 50 μl von 0,9%iger NaCl-Lösung verabreicht. 20 Minuten später wird eine Ovalbumin-Provokation durch intratracheales Injizieren von 200 μg von Ovalbumin in 50 μl durchgeführt. Nach 8 Stunden wurden die Ratten nach Vollnarkose erneut intubiert und eine Lungenlavage wird durchgeführt, die aus fünfmaligen Einträufelungen von 5 ml besteht. Die Zellen werden gespült, gezählt und auf Objektträger in einem Cytospin III zentrifugiert. Ein Differentialzellzählung wird durchgeführt. Aus 18B ist zu erkennen, dass das Antisense-Oligonukleotid RCC3A4, das gegen den CCR3-Rezeptor gerichtet ist, einen eosinophilen Influx in die Lungen um ca. 66% hemmt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Antisense-Oligonukleotide, die gegen den CCR3-Rezeptor gerichtet sind, bei der Prävention von eosinophilem In flux, der bei verschiedenen allergischen Krankheiten auftritt, und somit dessen Effekten wichtig sind.
Außerdem kann ein Priming mit dem Zytokin IL-5 (das über den IL-5-Rezeptor wirkt) entweder die Chemotaxis von Zellen oder das Freisetzen von Chemokinen verstärken, wenn die Zellen stimuliert werden.
24 zeigt, dass ein Priming von Eosinophilen mit IL-5 die Chemotaxis von Eosinophilen verstärkt, wenn diese mit Eotaxin stimuliert werden. Eine Vorinkubation von Eosinophilen im IL-5 (das über den IL-5-Rezeptor wirkt) verstärkt die durch Eotaxin induzierte Chemotaxis bei jeder getesteten Dosis. Der Höchstwert der Chemotaxis ist höher mit Priming, was einen Synergieeffekt des IL-5 auf die Wirkungen des Eotaxin nahelegt. Dosis-Wirkungs-Kurven zeigen die chemotaktische Aktivität von gereinigten humanen Eosinophilen auf Eotaxin (gefüllte Quadrate) und eine Transmigration durch einen Polycarbonat-Filter nach einer Vorinkubation mit IL-5 (geschlossene Kreise). Mononukleare Zellen und Granulozyten wurden aus peripherem Blut durch eine Ficoll-Paque-Dichtezentrifugation (Pharmacia) purifiziert. Granulozyten wurden durch Dextran-Sedimentation erhalten. Humane Eosinophile wurden weiter durch negative Selektion mit Anti-CD16- und Anti-CD3-beschichteten immunomagnetischen Microbeads unter Verwendung eines magnetischen Zellsortiersystems (Miltenyi Biotec) bei 4°C purifiziert. Der Grad der Reinheit von eosinophilen Populationen, der nach einer Färbung mit Giemsa beurteilt wurde, lag zwischen 92 und 100%. Die Ergebnisse sind angegeben als mittlere ± SD von 5 High Power Fields. Das Kontrollgruppen-Serum hatte keinen Einfluss auf eine Chemotaxis. Durch "*" gekennzeichnete Ergebnisse repräsentieren eine Abweichungsweichungswahrscheinlichkeit von p < 0,01, verglichen mit Eosinophilen, die keiner Priming-Behandlung unterzogen wurden, bei einer jeweiligen Eotaxin-Konzentration.
25A bis 25I zeigen, dass ein Priming mit Eosinophilen mit IL-5 die Menge an Chemokinen in den Zellen vergrößert und deren Freisetzung nach einer Stimulierung mit Immunoglobulin verstärkt. Eine Vorinkubation von Eosinophilen mit IL-5 über Nacht verstärkte die Expression von Eotaxin (25A) und MCP-4 (25B) im Vergleich zu den Kontrollproben (25F). Wenn Eosinophile mit IgE-anti-IgE stimuliert werden, setzen sie ebenfalls Eotaxin (25C, 25D, 25E) oder MCP-4 (25G, 25H, 25I) frei. Eosinophile wurden wie zuvor beschrieben purifiziert und über Nacht mit rekombinantem Human-IL-5 inkubiert (1 ng/ml). Diese Inkubation vermehrte das Eotaxin (25A) und MCP-4 (25B) in den Zellen im Vergleich zu den im Medium allein inkubierten Zellen der Kontrollgruppe (25F). Eine Stimulation der Eosinophilen durch eine 15-minütige Vorinkubation mit IgE, gefolgt von einer Exposition zu Anti-IgE, führen zu einer progressiven Freisetzung von Eotaxin (25C, 25D, 25E) oder MCP-4 (25G, 25H, 25I) bei 15 Minuten (25C, 25G), 2 Stunden (25D, 25H) oder 12 Stunden (25E, 25I).
Demgemäß hat die Kombination von Antisense-Oligonukleotiden gemäß einer Ausführungsform der Erfindung, die gegen unterschiedliche Rezeptoren (beispielsweise die IL-5- und die CCR3-Rezeptoren) gerichtet sind, einen Synergieeffekt bei der Therapie von Allergien, Asthma oder einer neoplastischen Zellvermehrung.
Versuche wurden mit Brown-Norway-Ratten durchgeführt, um zu untersuchen, ob die Kombination des Antisense-Phosphorothioats RB141A, das gegen die gemeinsame Beta-Kette der GM-CSF-, IL-3 und IL-5-Rezeptoren gerichtet ist, und dem Antisense-Phosphorothioat RCC3A4, das gegen den CCR3-Rezeptor gerichtet ist, Synergieeffekte auf eine eosinophile Rekrutierung in die Lungen nach einer Antigen-Provokation hat, jeweils verglichen mit einem von diesen allein. Brown-Norway-Ratten wurden auf Ovalbumin aktiv sensibilisiert, und zwar durch subkutanes Injizieren von 1,25 mg Ovalbumin, gemischt mit 200 mg Alummiumhydroxid. Am 14. Tag erhielten die Ratten 500 μg von RCC3A4 und 500 μg von RB141A in 500 μl von 0,9%iger NaCl-Lösung oder 0,9%ige NaCl- Lösung intraperitoneal. Am nächsten Tag wird, nach Vollnarkose mit 65 mg/kg Pentothal und einer Endotrachealintubation 180 μg von jedem Antisense intratracheal in 60 μl von 0,9%iger NaCl-Lösung verabreicht. 20 Minuten später wird eine Ovalbumin-Provokation durch intratracheales Injizieren von 200 μg von Ovalbumin in 60 μl durchgeführt. Nach 8 Stunden wurden die Ratten nach Vollnarkose erneut intubiert und eine Lungenlavage wird durchgeführt, die aus fünfmaligen Einträufelungen von 5 ml besteht. Die Zellen werden gespült, gezählt und auf Objektträger in einem Cytospin III zentrifugiert. Ein Differentialzellzählung wird durchgeführt. Aus 18B ist zu ersehen, dass die Kombination des Antisense-Oligonukleotids RCC3A4 und RB141A, die gegen den CCR3-Rezeptor und die gemeinsame Beta-Untereinheit der GM-CSF-, IL-3- und IL-5-Rezeptoren gerichtet sind, einen Synergieeffekt auf den eosinophilen Influx in die Lungen haben. Die Hemmung des eosinophilen Influx betrug ca. 90%.
Die Antisense-Oligonukleotide gemäß einer Ausführungsform der Erfindung haben, verglichen mit der Verwendung von löslichen IL-4-Rezeptoren bei Allergien und Asthma, die folgenden Vorteile: a) Wie in Beispiel 1 dargestellt, erlaubt die viel geringere Größe dieser Moleküle diesen, in die Gewebe einzudiffundieren und in die Zellen einzudringen, welche die Rezeptoren exprimieren (Epithelialzellen, glatte Muskelzel-len); b) die Verwendung eines Antisense-Oligonukleotids gegen die gemeinsame Untereinheit der IL-4- und IL-13-Rezeptoren erlaubt einen breiteren Effekt durch Blockieren der Effekte des IL-13, die in vieler Hinsicht bei der IgE-Produktion ähnlich denen von IL-4 sind, da IL-13 auch bei Allergien und Asthma vermehrt auftritt; und c) die Kombination der Anti-Rezeptor-Oligonukleotide gegen Rezeptoren für viele Zytokine (IL-3, IL-5 und GM-CSF oder IL-4 und IL-13 oder CCR3 (Eotaxin, RANTES und MCP-4)) erlaubt breitere Effekte bei einer Krankheit, bei der zwischen verschiedenen Personen eine Heterogenität bei der Entzündungskaskade auftritt.
Außerdem haben die Antisense-Oligonukleotide der Erfindung die folgenden Vorteile: a) Die Antisense-Anti-Rezeptor-Oligonukleotide wirken direkt auf Gewebe oder Entzündungszellen, die sich am Ort der Verabreichung befinden, und nicht indirekt durch potentielles Blockieren der Freisetzung von Mediatoren (wenn sie gegen die Zytokine selbst gerichtet sind); b) die Antisense-Anti-Rezeptor-Oligonukleotide werden nicht durch die Diffusion von Zytokinen beeinflusst, die im Blut von Patienten mit Allergien und Asthma erzeugt werden und vermehrt vorhanden sind; c) ein Antisense-Anti-Rezeptor-Oligonukleotid der Erfindung blockiert die Effekte von zwei oder drei Mediatoren, deren vermehrtes Auftreten bei Allergien oder Asthma gezeigt wurde, wodurch es eine breitere Wirkung als ein einziges Antisense-Oligonukleotid hat, das lediglich gegen einen einzigen Mediator oder Rezeptor gerichtet ist, und stellt daher einen Vorteil dar.
Zwar wurde die Erfindung in Verbindung mit speziellen Ausführungsformen beschrieben, es versteht sich jedoch, dass weitere Modifikationen vorgenommen werden können und diese Anmeldung jegliche Variationen, Verwendungen oder Adaptierungen der Erfindung einschließt, die allgemein den Prinzipien der Erfindung folgen, und solche Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung enthalten seien, wie sie innerhalb bekannter oder üblicher Praxis auf dem technischen Gebiet, zu dem die Erfindung gehört, üblich sind und die auf die zuvor ausgeführten wesentlichen Merkmale angewandt werden können, wie aus dem Schutzumfang der anliegenden Ansprüche folgt.
AUFLISTUNG DER SEQUENZEN

Claims

Antisense-Oligonukleotid zum Behandeln und/oder zum Verhindern von Asthma, Allergien, Hypereosinophilie, Entzündungen oder einem Wachstumsfaktor-empfindlichen Krebs, wobei das Oligonukleotid gegen eine Nukleinsäuresequenz gerichtet ist, die für eine gemeinsame Untereinheit der IL-3, IL-5 und GM-CSF-Rezeptoren codiert, wobei das Oligonukleotid eine Sequenz aufweist, die aus der Gruppe gewählt ist, welche besteht aus SEQ ID Nr:9, SEQ ID Nr:10, SEQ ID Nr:11, SEQ ID NR:12, SEQ ID Nr:13, SEQ ID Nr:l4, SEQ ID Nr:15, SEQ ID Nr:16.
Pharmazeutische Zusammensetzung zum Behandeln und/oder Verhindern von Asthma, Allergien, Hypereosinophilie, Entzündungen oder einem Wachstumsfaktor-empfindlichen Krebs, wobei die Zusammensetzung mindestens ein Antisense-Oligonukleotid wie definiert in Anspruch 1 beinhaltet, in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Verwendung eines Oligonukleotids wie definiert in Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln und/oder Verhindern von Asthma, Allergien, Hypereosmophilie, Entzündungen oder einem Wachstumsfaktorempfindlichen Krebs.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung wie definiert in Anspruch 2 zur Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln und/oder Verhindern von Asthma, Allergien, Hypereosinophilie, Entzündungen oder einem Wachstumsfaktor-empfindlichen Krebs.
Pharmazeutische Zusammenesetzung, die mindestens ein Oligonukleotid beinhaltet, das gegen eine Nukleinsäure gerichtet ist, die eine gemeinsame Untereinheit der IL-3, IL-5 und GM-CSF-Rezeptoren codiert, und mindestens ein Oligonukleotid, das gegen eine Nukleinsäure gerichtet ist, die eine gemeinsame Untereinheit der IL-4 und IL-13-Rezeptoren codiert, wobei mindestens ein Oligonukleotid, das gegen eine Nukleinsäure gerichtet ist, die eine gemeinsame Untereinheit der IL-3, IL-5 und GM-CSF-Rezeptoren codiert, aus der Gruppe gewählt ist, die aus den Oligonukleotiden besteht, die in den Sequenzlisten aufgelistet sind als SEQ ID Nr:9, SEQ ID Nr:10, SEQ ID Nr:11, SEQ ID NR:12, SEQ ID Nr:13, SEQ ID Nr:14, SEQ ID Nr:15, SEQ ID Nr:16.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, bei der mindestens ein Oligonukleotid, das gegen eine Nukleinsäure gerichtet ist, die eine gemeinsame Untereinheit der IL-4 und IL-13-Rezeptoren codiert, aus der Gruppe gewählt ist, die aus den Oligonukleotiden besteht, die in den Sequenzlisten aufgelistet sind als SEQ ID Nr:1, SEQ ID Nr:2, SEQ ID Nr:3, SEQ ID NR:4, SEQ ID Nr:5, SEQ ID Nr:6, SEQ ID Nr:7.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, die weiter mindestens ein Oligonukleotid aufweist, das gegen eine Nukleinsäure gerichtet ist, die einen CCR3-Rezeptor codiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, bei der mindestens ein Oligonukleotid, das gegen eine Nukleinsäure gerichtet ist, die einen CCR3-Rezeptor codiert, aus der Gruppe gewählt ist, die aus den Oligonukleotiden besteht, die in den Sequenzlisten aufgelistet sind als SEQ ID Nr:18, SEQ ID Nr:20, SEQ ID Nr:22 und SEQ ID Nr:23.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens ein Oligonukleotid beinhaltet, das gegen eine Nukleinsäure gerichtet ist, die eine gemeinsame Untereinheit der IL-3, IL-5 und GM-CSF-Rezeptoren codiert, und mindestens ein Oligonukleotid, das gegen eine Nukleinsäure gerichtet ist, die einen CCR3-Rezeptor codiert, wobei mindestens ein Oligonukleotid, das gegen eine Nukleinsäure gerichtet ist, die eine gemeinsame Untereinheit der IL-3, IL-5 und GM-CSF-Rezeptoren codiert, aus der Gruppe gewählt ist, die aus den Oligonukleotiden besteht, die in den Sequenzlisten aufgelistet sind als SEQ ID Nr:9, SEQ ID Nr:10, SEQ ID Nr:11, SEQ ID NR:12, SEQ ID Nr:13, SEQ ID Nr:14, SEQ ID Nr:15, SEQ ID Nr:16.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, bei der mindestens ein Oligonukleotid, das gegen eine Nukleinsäure gerichtet ist, die einen CCR3-Rezeptor codiert, aus der Gruppe gewählt ist, die aus den Oligonukleotiden besteht, die in den Sequenzlisten aufgelistet sind als SEQ ID Nr:18, SEQ ID Nr:20, SEQ ID Nr:22 und SEQ ID Nr:23.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung wie definiert in Anspruch 5 zur Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln und/oder Verhindern von Asthma, Allergien, Hypereosinophilie, Entzündungen oder einem Wachstumsfaktor-empfindlichen Krebs.
Verwendung nach Anspruch 11, bei der mindestens ein Oligonukleotid, das gegen eine Nukleinsäure gerichtet ist, die eine gemeinsame Untereinheit der IL-4 und IL-13-Rezeptoren codiert, aus der Gruppe gewählt ist, die aus den Oligonukleotiden besteht, die in den Sequenzlisten aufgelistet sind als SEQ ID Nr:1, SEQ ID Nr:2, SEQ ID Nr:3, SEQ ID NR:4, SEQ ID Nr:5, SEQ ID Nr:6, SEQ ID Nr:7.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung wie definiert in Anspruch 7 zur Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln und/oder Verhindern von Asthma, Allergien, Hypereosinophilie, Entzündungen oder einem Wachstumsfaktor-empfindlichen Krebs.
Verwendung nach Anspruch 13, bei der mindestens ein Oligonukleotid, das gegen eine Nukleinsäure gerichtet ist, die eine gemeinsame Untereinheit der IL-4 und IL-13 Rezeptoren codiert, aus der Gruppe gewählt ist, die aus den Oligonukleotiden besteht, die in den Sequenzlisten aufgelistet sind als SEQ ID Nr:1, SEQ ID Nr:2, SEQ ID Nr:3, SEQ ID NR:4, SEQ ID Nr:5, SEQ ID Nr:6, SEQ ID Nr:7.
Verwendung nach Anspruch 13, bei der mindestens ein Oligonukleotid, das gegen eine Nukleinsäure gerichtet ist, die einen CCR3-Rezeptor codiert, aus der Gruppe gewählt ist, die aus den Oligonukleotiden besteht, die in den Sequenzlisten aufgelistet sind als SEQ ID Nr:18, SEQ ID Nr:20, SEQ ID Nr:22 und SEQ ID Nr:23.
Verwendung nach Anspruch 13, bei der eine gemeinsame Untereinheit der IL-4 und IL-13 Rezeptoren codiert, aus der Gruppe gewählt ist, die aus den Oligonukleotiden besteht, die in den Sequenzlisten aufgelistet sind als SEQ ID Nr:1, SEQ ID Nr:2, SEQ ID Nr:3, SEQ ID NR:4, SEQ ID Nr:5, SEQ ID Nr:6, SEQ ID Nr:7; und mindestens ein Oligonukleotid, das gegen eine Nukleinsäure gerichtet ist, die einen CCR3-Rezeptor codiert, aus der Gruppe gewählt ist, die aus den Oligonukleotiden besteht, die in den Sequenzlisten aufgelistet sind als SEQ ID Nr:18, SEQ ID Nr:20, SEQ ID Nr:22 und SEQ ID Nr:23.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung wie definiert in Anspruch 9 zur Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln und/oder Verhindern von Asthma, Allergien, Hypereosinophilie, Entzündungen oder einem Wachstumsfaktor-empfindlichen Krebs.
Verwendung nach Anspruch 17, bei der mindestens ein Oligonukleotid, das gegen eine Nukleinsäure gerichtet ist, die einen CCR3-Rezeptor codiert, aus der Gruppe gewählt ist, die aus den Oligonukleotiden besteht, die in den Sequenzlisten aufgelistet sind als SEQ ID Nr:18, SEQ ID Nr:20, SEQ ID Nr:22 und SEQ ID Nr:23.