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DE69927369T2 - Hemmung xenoreaktiver antikörper - Google Patents

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DE69927369T2 DE69927369T DE69927369T DE69927369T2 DE 69927369 T2 DE69927369 T2 DE 69927369T2 DE 69927369 T DE69927369 T DE 69927369T DE 69927369 T DE69927369 T DE 69927369T DE 69927369 T2 DE69927369 T2 DE 69927369T2
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antibodies
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S. John LOGAN
W. Guerard BYRNE
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Mayo Foundation for Medical Education and Research
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Description

  • Die Erfindung liegt auf dem allgemeinen Gebiet von Pharmazeutika zur Behandlung von Zuständen, die durch xenoreaktive Antikörper verursacht sind.
  • Hintergrund
  • Organtransplantation:
  • Organtransplantationen werden heute vielfach als die bevorzugte Behandlung für Organversagen im Endstadium angesehen, und zwar auf der Basis sowohl der Lebensqualität als auch der Kosten. Eine Transplantat-Überlebensdauer von einem Jahr bei Nieren- und Herztransplantationen in den wichtigsten Transplantationszentren ist nunmehr größer als 90 %, wobei akute Abstoßungsraten geringer als 30 % sind. Jährlich werden in den USA ungefähr 2500 Herztransplantationen und 12.500 Nierentransplantationen durchgeführt. Die hauptsächliche Begrenzung für eine weitergehende Nutzung dieses Verfahrens ist ein Mangel an verfügbaren Organen. Man sieht dies bei einem Blick auf die Transplantat-Warteliste, die zeigt, daß mehr als die doppelte Anzahl Menschen auf ein Organ wartet, als jemals eines empfangen können. Außerdem sterben täglich 10 Menschen, während sie auf eine Transplantation warten. Die Nachfrage nach Organen ist jedoch viel größer als die Zahl der Menschen auf der Transplantat-Warteliste. Es gibt 125.000 Patienten mit Nierenversagen im Endstadium, die theoretisch Nutzen aus einer Transplantation ziehen könnten. Ferner wird geschätzt, daß 25.000 bis 40.000 Menschen eine Herztransplantation nützen könnte, wenn ein Spenderorgan verfügbar wäre.
  • Die Verfügbarkeit menschlicher Organe wird sich wahrscheinlich über die nächsten Jahre nicht signifikant steigern, und selbst wenn alle potentiellen menschlichen Spenderorgane verwendet werden könnten, würde das die Zahl der transplantierten Organe nur um ungefähr das Doppelte steigern, also weit weniger, als es dem tatsächlichen Bedarf entspricht. Mögliche mechanische Lösungen dieses Problems wie etwa Unterstützungseinrichtungen für den linken Ventrikel bei Herzversagen sind zwar zumindest zur vorübergehenden Unterstützung adäquat, können aber kaum eine Langzeitlösung bieten, und bisher gibt es keine implantierbare Einrichtung für eine Niere. Dabei wird die Transplantation einer Niere im Hinblick auf die Lebensqualität als der Dialyse überlegen und bevorzugt angesehen. In Anbetracht dieser Alternativen legen Mediziner und Wissenschaftler die Aufmerksamkeit auf Tiere, um eine Lösung des Problems des Organmangels zu erreichen.
  • Tiere als Spender:
  • Die bevorzugte tierische Spezies für Transplantationen in Menschen ist das Schwein. Die nahe verwandten nicht-menschlichen Spezies sind zwar immunologisch den Menschen ähnlicher, und daher könnte der Abstoßungsprozeß, der bei Transplantationen eintritt, mit einer Reihe von modernen Immunsuppressiva wohl leichter gesteuert werden, aber eine Reihe von Gründen sprechen gegen diese Möglichkeit. Erstens wäre ein nicht-menschlicher Primat geeigneter Größe für eine Herztransplantation bei einem erwachsenen Menschen ein Schimpanse oder ein ähnlich großes Tier. Diese Tiere stehen auf der Liste gefährdeter Spezies, so daß erhebliche ethische Fragen entstehen würden, selbst wenn es möglich wäre, eine große Anzahl in Gefangenschaft zu züchten. Der am zahlreichsten vorkommende nicht-menschliche Primat, der Pavian, ist klein und könnte keine Herzen zur Transplantation in erwachsene Menschen bereitstellen, obwohl es denkbar ist, daß Nieren oder Lebern möglich sein können. Der Pavian enthält jedoch eine Reihe von potentiell pathogenen Organismen, die bei Übertragung auf einen Menschen ein Problem darstellen könnten, und die Erzeugung großer Mengen von spezifischen, pathogenfreien Tieren wäre äußerst kostspielig und zeitaufwendig. Das Schwein, ein domestiziertes Haustier, hat dagegen geeignete Größe, kann zum Erhalt spezifischer, pathogenfreier Tiere gezüchtet werden und ist in großer Zahl verfügbar. Wenn daher die immunologischen Probleme überwunden werden könnten, wäre das Schwein offensichtlich der ideale Spender, um das Problem des Organmangels zu beheben.
  • Das immunologische Problem:
  • Die erste Barriere bei der Transplantation eines Schweineorgans auf Primaten ist ein Prozeß der hyperakuten Abstoßung, der im Verlust des Transplantats innerhalb einiger Minuten bis Stunden nach der Transplantation resultiert und histologisch gekennzeichnet ist durch Thrombose, Einblutung, Ödeme und einen Mangel an Zellinfiltration (J.L. Platt et al., Immunology Today 11:450-456, 1990). Dieser Prozeß wird ausgelöst durch die Bindung des Antikörpers, der in dem Empfänger bereits vorhanden ist, an das Transplantatendothel und die resultierende Aktivierung der Komplementkaskade. Ein ähnlicher Prozeß läuft bei Allotransplantaten ab, wenn vor der Transplantation Antikörper beim Empfänger vorhanden ist. Bei Überlegungen in bezug auf das Schwein als Spender ist es nützlich, die Wirkung von bereits existierenden Antikörpern auf das Überleben von Allotransplantaten nochmals zu überprüfen und zu bedenken, welche Strategien wichtig sind, um ein langes Überleben von Transplantaten zu erreichen.
  • Die Anwesenheit von Antikörper im Serum eines Allotransplantat-Empfängers, der ein am Spenderendothel anwesendes Antigen erkennt, kann ein Indikator für eine schlechte Prognose des Langzeitüberlebens des Transplantats sein. Tatsächlich kann bei einem Prozentsatz dieser Allotransplantate ein rascher Abstoßungsprozeß auftreten, wie er oben für Xenotransplantate vom Schwein zum Primaten beschrieben wird, wobei das Transplantat innerhalb einiger Minuten bis Stunden nach der Reperfusion verloren ist. Ein Beispiel dieser Situation ist zu sehen, wenn der Spender und der Empfänger in bezug auf das Blutgruppen-AB0-System inkompatibel sind. Das Blutgruppen-Antigen, das ein Kohlenwasserstoff ist, ist an dem Spenderendothel vorhanden. Wenn ein Transplantat von einem Spender mit der Blutgruppe A in einen Empfänger mit der Blutgruppe 0 implantiert wird, in dem Antikörper gegen das Antigen der Blutgruppe A vorhanden ist, gelangt Antikörper in das Transplantat. In dem Fall dieser Transplantate, bei denen eine hyperakute Abstoßung eintritt, bewirkt die Bindung des Antikörpers an das Transplantatendothel, daß das Komplement vollständig aktiviert wird, was in einer Schädigung des Endothels und dem anschließenden Verlust der endothelialen Sperrfunktion resultiert, was wiederum in Thrombose, Einblutung, Ödemen und irreversiblem Versagen des Transplantats resultiert. Wenn eine hyperakute Abstoßung nicht eintritt, gehen viele, wenn auch nicht alle Transplantate infolge von Gefäßabstoßung in den folgenden Wochen oder Monaten verloren. Diese Transplantationen wurden ursprünglich in der Zeit vor dem Aufkommen von Cyclosporin durchgeführt und haben zu dem Vorschlag geführt, daß eine Anpassung in bezug auf AB0-Kompatibilität vor der Transplantation erfolgen sollte.
  • Mit zunehmendem Erfolg von Allotransplantationen führte ein dramatischer Mangel an Verfügbarkeit von Organen dazu, daß eine Reihe von Gruppen die Möglichkeit von Transplantationen über die AB0-Barriere hinweg neu überdachten, speziell im Fall von lebenden verwandten Nierenspendern. Diese Forscher fanden heraus, daß für eine routinemäßige Vermeidung der hyperakuten Abstoßung und ein optimales Langzeitüberleben des Transplantats, das vergleichbar mit AB0-angepaßten Transplantaten war, der zum Zeitpunkt der Transplantation anwesende Antikörper vorübergehend entfernt werden mußte, und zwar gewöhnlich durch physikalische Mittel wie Immunapherese. Dann wird ein Standard- oder in manchen Fällen ein erweitertes Immunsuppressions-Protokoll angewandt. Unter diesen Umständen ist das Langzeitergebnis für diese Transplantate ebenso gut wie das, welches mit AB0-kompatiblen Transplantaten erzielt würde. Bei einem Prozentsatz dieser AB0-inkompatiblen Transplantate kehrt der Antikörper anscheinend wieder in den Kreislauf zurück, aber das Transplantat wird nicht abgestoßen, und dieses Phänomen wird als "Akkomodation" bezeichnet. Es ist jedoch noch keineswegs klar, daß dieser Antikörper, wie er bei Standard-Hämagglutinationsreaktionen nachgewiesen wird, tatsächlich imstande ist, an das Transplantat gebunden zu werden. In vielen Fällen kehrt der Antikörper nicht in nachweisbarer Form in den Kreislauf zurück, obwohl es natürlich denkbar ist, daß Antikörper an das Transplantat gebunden wird.
  • Bei einem Xenotransplantat vom Schwein zu einem Primaten erkennt der xenoreaktive Antikörper, der vor der Transplantation im Empfänger gefunden wird, in den meisten Fällen, wenn auch nicht ausschließlich, die spezielle Kohlenwasserstoffstruktur αGal(1,3)Gal. Diese Struktur findet sich als der terminale Zucker an Glykolipiden und Glykoproteinen, die an dem Endothel des Spenderschweins anwesend sind. Das Schwein und viele andere Säuger, jedoch nicht Menschen oder europäische Affen, synthetisieren dieses Epitop. Dieses Szenario erinnert in vieler Hinsicht an die oben beschriebenen Allotransplantate, die nicht an die AB0-Blutgruppe angepaßt waren. Auf ähnliche Weise wie die Säugerblutgruppen-Antigene wie etwa die menschliche Blutgruppe A resultiert das Nichtvorhandensein des Antigens bei einem Tier in der Synthese von Antikörpern, die es erkennen. Dieser Antikörper wird möglicherweise dauernd von Darmbakterien induziert und stimuliert, die eine verwandte Struktur haben. Tatsächlich zeigten Galili et al. (1988), daß Anti-Gal-Antikörper sich an eine Vielzahl von Darmbakterien wie E.coli, Klebsiella und Salmmonella banden.
  • Die Gal-reaktive Struktur war unter den Bakterien veränderlich und war entweder das Lipopolysaccharid oder das kapselförmige Polysaccharid (Hamadeh et al. 1992). Diese beiden Klassen von Antigenen sind als T-Zellen-unabhängige Antigene wohlbekannt. Außerdem ist der Isotyp der AB0- und α-Gal-Antikörper gleichartig, die Antikörperspiegel im Serum sind gleichartig, und die Dichte der Kohlenwasserstoff-Antigene an dem Spenderendothel liegen ebenfalls innerhalb des gleichen Bereichs. Wenn jedoch eine Organtransplantation vom Schwein zu einem Primaten durchgeführt wird, wird das Transplantat nahezu immer innerhalb weniger Minuten bis Stunden abgestoßen, wobei nur ganz gelegentlich ein Transplantat höchstens einige Tage überlebt. Dies ist in direktem Gegensatz zu dem, was bei dem Allotransplantat geschieht, wobei ab und zu ein Transplantat hyperakut abgestoßen wird und der größte Teil über längere Zeiträume (Wochen oder Monate) überlebt. Ein signifikanter Unterschied zwischen dem Überleben von Allotransplantaten und Xenotransplantaten unter diesen Bedingungen geht höchstwahrscheinlich auf die Inkompatibilität der komplementregulativen Proteine zurück. Bei den Xenotransplantaten bindet der Antikörper an das Transplantatendothel und resultiert in der Aktivierung der Komplementkaskade. Im Fall des Allotransplantats ist eine Serie von Proteinen an dem Spenderendothel anwesend, welche die Aktivität des Komplements regulieren und als ein primitiver Selbst-/Nichtselbst-Erkennungsprozeß gedacht werden können, wobei dann, wenn Komplement ungewollt am Endothel aktiviert wird, dieses inaktiviert werden kann, bevor ein Schaden eintritt. Diese Proteine umfassen Decay Accelerating Factor (DAF:CD55), Membrane Cofactor Protein (MCP: CD4G) und CD59. Im Fall des Schweins funktioniert das Schweineäquivalent zu menschlichen CRPs nicht effektiv, um die Wirkung von Humankomplement zu begrenzen. Wenn daher in dem Xenotransplantat infolge des funktionellen Mangels der CRPs Komplement aktiviert wird, wird das Endothel schwer geschädigt, was zu Thrombose, Einblutung, Ödemen und Verlust des Transplantats führt. Diese Hypothese ist durch die Züchtung von transgenen Schweinen bestätigt worden, die Human-CRPs exprimieren und routinemäßig eine hyperakute Abstoßung überwinden.
  • Wenn dies der einzige Unterschied zwischen einem Allotransplantat und einem Xenotransplantat wäre, könnte man annehmen, daß durch Hinzufügen von Immunsuppression oder Entfernen von Antikörper plus Immunsuppression und die Verwendung von transgenen Tieren ein Überleben von Xenotransplantaten mit einem ähnlichen zeitlichen Verlauf wie bei einem Allotransplantat zu beobachten wäre. Die einfache Zugabe von Immunsuppression verlängert jedoch das Überleben des Transplantats nicht wesentlich, und das Organ erfährt unweigerlich eine Gefäßabstoßung. Das Entfernen von Antikörper zum Zeitpunkt der Transplantation in Kombination mit einer Immunsuppression kann zwar das Überleben verlängern, jedoch keine Überlebenswerte erreichen, die mit einem Allotransplantat vergleichbar sind, und es ist wiederum unvermeidlich, daß die Gefäßabstoßung erfolgt. Diese Gefäßabstoßung ist histologisch wie die hyperakute Abstoßung durch Einblutung, Thrombose und einen Mangel an Zellinfiltration charakterisiert; aber anders als bei der hyperakuten Abstoßung gibt es signifikante Bereiche von Ischämie. Die immunpathologische Analyse zeigt, daß Antikörper an das Transplantat gebunden ist, aber nur sehr wenige Komplementkomponenten vorhanden sind.
  • Es gibt Ausnahmen dieses Verlaufs der Ereignisse, und diese treten auf, wenn entweder ausnehmend hohe Dosen von Immunsuppressiva, deren Wirkmechanismus mit ihrem Antiausbreitungseffekt in Beziehung steht, verwendet werden oder das physikalische Entfernen von Antikörper durch Immunapherese in der Post-Transplantationsperiode aggressiv fortgesetzt wird. In Verbindung mit dem Mangel an Zellinfiltration weisen diese Ergebnisse darauf hin, daß die Organe infolge eines Gefäßabstoßungsprozesses verlorengehen, was am wahrscheinlichsten ein durch Antikörper vermitteltes Ereignis ist, obwohl der Mechanismus, nach dem dieser Abstoßungsprozeß durch Antikörper verursacht wird, noch nicht klar ist.
  • Wenn das Transplantat im Empfänger vorliegt, ist es schwierig, den Gehalt und die Spezifität von xenoreaktivem Antikörper zu bestimmen, da das Transplantat als Senke wirken und den Antikörper festhalten kann. Wir haben nach einer Möglichkeit zur Umgehung dieses Problems gesucht, indem wir die Antikörper in dem Tier nach dem Entfernen eines abgestoßenen, nicht lebensstützenden heterotopischen Herztransplantats verfolgt und gleichzeitig das immunsuppressive Regime nach Entfernen des Transplantats aufrechterhalten haben. Unter diesen Umständen beobachten wir bald nach dem Entfernen des Transplantats und in den folgenden paar Tagen einen raschen Anstieg von xenoreaktiven Antikörperwerten in dem Tier. Dieser ist charakterisiert durch eine 4-10fache Erhöhung in IgM und eine 100-200fache Erhöhung in IgG. Diese Antikörper erkennen nahezu ausschließlich die αGal(1,3)Gal-Struktur. Ein ähnlicher Anstieg in αGal(1,3)Gal-Antikörpern ist bei Menschen zu sehen, welche die Empfänger von zellulären Schweine-Xenotransplantaten wie etwa Pankreasinseln sind oder in einem ex-vivo-Perfusionskreislauf einer Schweineleber ausgesetzt wurden. Diese Daten weisen darauf hin, daß die Transplantate infolge der verstärkten Produktion von αGal(1,3)Gal-Antikörpern verlorengehen.
  • Die Beobachtung, daß die Antikörper, die wir hypothetisch als Vermittler der Transplantatabstoßung in der Spezieskombination Schwein-zu-Primat betrachten, vorwiegend ein einziges chemisch definiertes Epitop erkennen, führt zu der Möglichkeit, diese Antikörperproduktion auf eine spezifische Weise zu steuern bzw. zu kontrollieren. Spezifität bei der Steuerung der Immunantwort wäre vorteilhaft, weil dadurch die Gefahr von infektiösen Komplikationen verringert würde, die mit der allgemeinen Immunsuppression einhergehen. Wie oben erörtert wurde, sind diese Antworten durch derzeitige Immunsuppression in klinisch relevanten Anteilen nicht leicht zu steuern, was die Gründe für eine größere Spezifität noch bedeutsamer macht.
  • In vivo-Neutralisierung von Antikörper durch die Verabreichung eines löslichen Liganden wurde sowohl für AB0-inkompatible Allotransplantate als auch Schwein-zu-Primat-Xenotransplantate vorgeschlagen. Bei beiden Systemen ist die Infusion großer Mengen Zucker erforderlich infolge einer Kombination einer geringen Affinität des Liganden für Antikörper und einer kurzen Halbwertszeit im Serum. Bei experimentellen AB0-inkompatiblen Herz-Allotransplantationen von Pavian zu Pavian kann, wenn die Zuckerinfusion über eine Reihe von Tagen in Anwesenheit von Immunsuppressiva aufrechterhalten wird, die Infusion abgebrochen und ein Langzeitüberleben des Transplantats erreicht werden. In vieler Hinsicht erinnert dies an die Beobachtung, daß die temporäre Entfernung von Antikörper durch physikalische Mittel, z. B. Plasmaaustausch oder spezifische Immunapherese in Kombination mit Immunsuppression, in einem Langzeitüberleben des Transplantats resultieren kann.
  • Im Fall des Schwein-zu-Primat-Xenotransplantats hat die Verabreichung von löslichen Formen des αGal(1,3)Gal-Kohlenwasserstoffs eine hyperakute Abstoßung verhindert, sobald jedoch die Zuckerinfusion gestoppt wird, wird das Transplantat abgestoßen. Bisher ist die Infusion nicht über einen ausreichend langen Zeitraum aufrechterhalten worden, um auszuwerten, wann und ob überhaupt die Infusion gestoppt werden kann, wie das bei dem Allotransplantat der Fall war. Es ist denkbar, daß zwischen Allotransplantat- und Xenotransplantat-Abstoßung ein erheblicher Unterschied besteht, so daß eine Infusion in der überwiegenden Zahl der Fälle nicht gestoppt werden kann. Dieses Experiment könnte zumindest vom Konzept her verbessert werden, wenn es möglich wäre, entweder die Halbwertszeit des Zuckers dramatisch zu verbessern oder die Affinität zu erhöhen oder beide Ziele zu erreichen, so daß viel weniger erforderlich wäre oder die Dosierung weniger häufig erfolgen würde.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Polymer bereit, das synthetisiert ist durch eine Kreuzkupplungsreaktion von
    • (i) Polymergerüsteinheiten, die eine Vielzahl von nukleophilen oder elektrophilen funktionellen Gruppen aufweisen, und
    • (ii) einem oder mehreren Oligosaccharid-Xenoantigenen, wobei jedes Xenoantigen aufweist: (a) einen Oligosaccharid-Anteil und (b) eine funktionelle Gruppe, die imstande ist, mit den an der Polymergerüsteinheit präsentierten funktionellen Gruppen zu reagieren,
    wobei die Reaktion in Anwesenheit eines Vernetzungsreagenzes unter Bedingungen ausgeführt wird, unter denen Polymergerüsteinheiten mit Xenoantigenen gekuppelt und separate Polymergerüsteinheiten miteinander vernetzt werden.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen sind die funktionellen Gruppen für die Polymergerüsteinheiten und Xenoantigene aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus: Amin und Carbonsäure, Alkohol und Alkylhalogenid oder -sulfonat, Thiol und Alkylhalogenid oder -sulfonat, Phosphin und Alkylhalogenid oder -sulfonat, Phosphit und Alkylhalogenid oder -sulfonat und Aldehyd oder Keton und Amin. Bei bevorzugten Ausführungsformen erzeugen die funktionellen Gruppen beim Kreuzkuppeln eine Amid-, Ether-, Thioether- oder Phosphatbindung zwischen der Polymergerüsteinheit und dem Xenoantigen.
  • Das Kreuzkuppeln kann beispielsweise in Gegenwart eines Aktivierungsmittels ausgeführt werden, das die funktionellen Gruppen der Polymergerüsteinheiten und Xenoantigene aktiviert, um eine kovalente Bindung zwischen ihnen zu bilden. Beispielsweise kann die Aktivierungsgruppe ein Dehydratisierungsmittel, Brönsted-Säure, Brönsted-Base, Lewis-Säure, Lewis-Base, Acylhalogenid und Phosphorylhalogenid sein. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Aktivierungsmittel ein Diimid, z. B. Dicyclohexyldiimid [DCC] oder Ethyl-3-(dimethylamino)propyldiimid [EDC].
  • Bei bestimmten Ausführungsformen sind die Polymergerüsteinheiten pharmakologisch akzeptable, nicht-immunogene Moleküle. Beispielsweise können die Polymergerüsteinheiten Polyethylenglykol, ein Oligopeptid oder Oligosaccharid (z. B. Dextran, Dextrin oder ein Cyclodextrin) tragende nukleophile oder elektrophile funktionelle Gruppen sein. Geeignete nukleophile oder elektrophile funktionelle Gruppen umfassen Amine, Alkohole, Thiole, Selenole, Phosphine, Aldehyde, Ketone, Säurechloride, Säuren, Ester, Alkylhalide und Alkylsulfonate. Bei speziellen Ausführungsformen ist die funktionelle Gruppe an der Polymergerüsteinheit ein Amino- oder Carboxylat-Anteil, und die funktionelle Gruppe des Xenoantigens reagiert damit, um eine Amidbindung zu bilden.
  • Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die Polymergerüsteinheit ein vielfach aminiertes Polyethylenglycol, z. B. Octa(amino)polyethylenglycol. Bei weiteren Ausführungsformen ist die Polymergerüsteinheit aminiertes Dextran oder ein aminiertes Cyclodextrin. Bei weiteren Ausführungsformen ist die Polymergerüsteinheit ein dendritisches Polyamin.
  • Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen weist das Xenoantigen ein Epitop auf, das mit einem xenoreaktiven Antikörper gegen α-Galactosyl-Anteile kreuzreaktiv ist, und stärker bevorzugt ist das Xenoantigen ein Oligosaccharid, das einen αGal(1,3)Gal-Anteil hat, der durch die folgende allgemeine Formel repräsentiert ist:
    Figure 00090001
    wobei:
    R unabhängig oder bei jedem Auftreten H oder ein C1-C6-Alkyl oder eine andere Hydroxylschutzgruppe repräsentiert;
    R' abwesend ist oder ein Oligosaccharid von 1-8 Saccharidresten repräsentiert; und
    X einen Bindungs- oder Linker-Anteil repräsentiert, der den Oligosaccharid-Anteil an das Polymergrundgerüst bindet und beispielsweise bevorzugt eine cyclische, verzweigt- oder geradkettige aliphatische Gruppe mit einer Länge von 2 bis 10 Bindungen, Cycloalkyl, Alkenyl, Cycloalkenyl, Alkynyl, Aryl, Heteroalkyl oder Heteroaryl-Anteil ist.
  • Beispielsweise kann das Xenoantigen ein Oligosaccharid aufweisen, das durch eine von den folgenden allgemeinen Formeln repräsentiert ist:
    Figure 00100001
    wobei:
    R1 unabhängig bei jedem Auftreten H, -OR, -SR oder -N(H)-Y-R ist;
    R unabhängig oder bei jedem Auftreten H oder ein C1-C6-Alkyl oder eine andere Hydroxylschutzgruppe repräsentiert;
    R2 ein C1-C6-Alkyl ist;
    Y unabhängig bei jedem Auftreten abwesend oder -C(S)-, -S(O)2, -C(O)-A- ist;
    X einen Bindungs- oder Linker-Anteil repräsentiert, der den Oligosaccharid-Anteil an das Polymer-Grundgerüst bindet;
    Z O oder S ist; und
    A -NH-, -NH-(C1-C6-Alkyl)-, -NH-(C1-C6-Alkenyl)-, -O-, -O-(C1-C6-Alkyl)-, -O-(C1-C6-Alkenyl)-, -S-, -S-(C1-C6-Alkyl)-, -S-(C1-C6-Alkenyl)- ist.
  • Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen weist das Xenoantigen einen oder mehrere der folgenden auf: αGal(1,3)βGal; αGal(1,3)βGal(1,4)βGlcNAc; oder αGal(1,3)βGlc-Anteile. Bei anderen Ausführungsformen kann das Xenoantigen einen oder mehrere der folgenden aufweisen: αGal(1,2)Gal, αGal(1,4)Gal, βGal(1,3)GalNAc oder 3-O-sulfatierte Galactose (SO4-3Gal).
  • Das Xenoantigen kann ein Di-, Tri-, Tetra- oder Penta-Oligosaccharid aufweisen.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen ist das Polymer in bezug auf das daran gezeigte Xenoantigen homogen. Bei anderen Ausführungsformen weist das Polymer zwei oder mehr verschiedene Xenoantigene z. B. an demselben Molekül auf.
  • Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen hat das Vernetzungsmittel wenigstens zwei funktionelle Gruppen, die fähig sind, mit den Polymergerüsteinheiten, der kovalenten Bindung des Gerüsts mit dem Xenoantigen oder einer Kombination davon zu reagieren. Beispielsweise kann das Vernetzungsmittel von N-Hydroxysulfosuccinimid abgeleitet sein.
  • Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird die Kreuzkupplungsreaktion in dem pH-Bereich von 4 bis 7 ausgeführt.
  • Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird die Kreuzkupplungsreaktion in dem Temperaturbereich von 0 °C bis 40 °C ausgeführt.
  • Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird die Kreuzkupplungsreaktion bei einer Temperatur, einem pH, einer Reagenzkonzentration und über eine Zeitdauer ausgeführt, die ausreichen, um ein Polymer zu ergeben, das ein nominelles Molekulargewicht von 100.000 bis 500.000 Dalton hat. Bei bestimmten Ausführungsformen, z. B. für tolerogene Formen des Xenopolymers, wird die Kreuzkupplungsreaktion bei einer Temperatur, einem pH, einer Reagenzkonzentration und über eine Zeitdauer ausgeführt, die ausreichen, um ein Polymer zu ergeben, das ein nominelles Molekulargewicht von weniger als 100.000 Dalton hat.
  • Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen induziert das Xenopolymer der vorliegenden Erfindung eine B-Zellen-Anergie für das Xenoantigen.
  • Für viele Anwendungszwecke wird das betroffene Xenopolymer mit einem pharmazeutischen Träger formuliert und wird bevorzugt als sterile Formulierung formuliert.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen eines Medikaments unter Verwendung des vorliegenden Xenopolymers, wobei das Medikament einem Patienten, der ein Transplantat von diskordantem Gewebe empfangen soll oder empfangen hat, in einer Menge verabreicht wird, die ausreicht, um die Schwere der Abstoßung des Transplantats zu verringern.
  • Bei bevorzugten Ausführungsformen ist das Medikament mit einem Xenopolymer formuliert, das einen therapeutischen Index zum Verhindern der Abstoßung eines diskordanten Transplantats von mindestens 10 hat.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht ein Set vor, das zwei oder mehr von den vorliegenden Xenopolymeren aufweist, wobei jedes Polymer von den anderen getrennt und in bezug auf das daran gezeigte Xenoantigen homogen ist, jedoch von wenigstens einem anderen Polymer des Sets verschieden ist.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Polymer bereit, das eine Vielzahl von Untereinheiten aufweist, die durch Vernetzungs-Anteile miteinander verbunden sind. Siehe dazu allgemein 25. Jeder Vernetzungs-Anteil ist kovalent an wenigstens zwei Untereinheiten gebunden, obwohl die einzelnen Bindungen zwischen einem Vernetzer und einer Untereinheit nicht vom gleichen Typ zu sein brauchen oder die gleichen Atome) der Untereinheiten aufweisen müssen. Die einzelnen Untereinheiten weisen ein Grundgerüst oder Gerüst und eine Vielzahl von Xenoantigenen auf. Die Xenoantigene sind kovalent an dem Grundgerüst oder Gerüst festgemacht bzw. daran gebunden, typischerweise über eine Bindung, die aus zwischen 10 und 20 Nicht-Wasserstoffatomen besteht. Das Grundgerüst oder Gerüst kann selber ein Polymer sein, z. B. ein Oligoethylenglykol, Oligosaccharid oder Oligopeptid. Die Synthese eines Polymers dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann in einer einzigen Reaktion oder in einer Serie von Reaktionen erreicht werden. Wenn die Synthese des Polymers in einer einzigen Reaktion erfolgt, weist der Prozeß auf: Kombinieren des Grundgerüsts oder Gerüsts mit dem Vernetzungsmittel und den Xenoantigenen, um ein Produkt zu ergeben, das Untereinheiten aufweist, d. h. einzelne Grundgerüst- oder Gerüstgruppen, an die Xenoantigene gebunden sind, die über Vernetzungs-Anteile kovalent miteinander verbunden sind. Siehe 25. Wenn die Synthese des Polymers in einer Serie von Reaktionen erfolgt, weist der Gesamtprozeß folgendes auf: Kombinieren des Grundgerüsts oder Gerüsts mit den Xenoantigenen unter Bedingungen, unter denen die beiden reagieren, um Untereinheiten zu erzeugen, die eine Vielzahl von gebundenen Xenoantigenen tragen; und Kombinieren der Untereinheiten, die eine Vielzahl von gebundenen Xenoantigenen tragen, mit dem Vernetzungsmittel zur Bildung von Vernetzungen zwischen den einzelnen Untereinheiten.
  • Bestimmte Ausführungsformen dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung ergeben ein Polymer, das ein Polymergrundgerüst von Polyethylenglykol-Untereinheiten aufweist, wobei an wenigstens einem Teil davon ein Saccharid-Anteil anhaftet, der durch die folgende allgemeine Formel repräsentiert ist:
    Figure 00130001
    wobei:
    R1 unabhängig für jedes Auftreten H, -OR, -SR oder -N(H)-Y-R ist;
    R5 H, -OE, NH-Y-R2 oder -L-E ist;
    Y unabhängig für jedes Auftreten abwesend, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR)-, O, S oder Se ist;
    B für das eine Auftreten -R ist und für das andere Auftreten -R oder 1-9 Saccharidreste ist;
    R unabhängig für jedes Auftreten H oder ein C1-C6-Alkyl, eine Schutzgruppe oder -L-E repräsentiert;
    R2 C1-C6-Alkyl ist;
    X2 einen Linker einer Länge von 1-10 Atomen repräsentiert;
    L einen Linker einer Länge von 1-20 Atomen repräsentiert und z. B. bevorzugt eine cyclische, verzweigte oder geradkettige aliphatische Gruppe einer Länge von 2 bis 15 Bindungen, Cycloalkyl, Alkenyle, Cycloalkenyl, Alkynyl, Aryl, Heteroalkyl oder Heteroaryl-Anteil ist; und
    E eine zweite PEG-Untereinheit des Polymers repräsentiert, wobei unabhängig für jedes Auftreten von E die Linkergruppe L über R5 oder B eines Saccharid-Anteils der zweiten PEG-Untereinheit oder über ein Amin der zweiten PEG-Untereinheit oder über einen Amid-Anteil in der Bindung zwischen dem Saccharid und der entsprechenden Polyethylenglykol-Untereinheit koavlent angelagert ist.
  • Bestimmte Ausführungsformen dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung stellen ein Polymer bereit, das ein Polymergrundgerüst von Polyethylenglycoluntereinheiten aufweist, von dem wenigstens ein Teil einen daran anhaftenden Saccharid-Anteil hat, der durch die allgemeine Formel (VII) repräsentiert ist:
    Figure 00140001
    wobei:
    R1 unabhängig für jedes Auftreten H, -OR, -SR oder -N(H)-Y-R ist;
    R5 H, -OR, NH-Y-R2 oder -L-E ist;
    Y unabhängig für jedes Auftreten abwesend, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR)-, O, S oder Se ist;
    B für das eine Auftreten -R ist und für das andere Auftreten -R oder 1-9 Saccharidreste ist;
    R unabhängig für jedes Auftreten H oder ein C1-C6-Alkyl oder eine andere Hydroxylschutzgruppe repräsentiert;
    R2 ein C1-C6-Alkyl ist;
    X2 einen Linker einer Länge von 1 bis 10 Atomen repräsentiert;
    D H oder -L-E repräsentiert;
    L einen Linker einer Länge von 1 bis 20 Atomen repräsentiert; und
    E eine zweite PEG-Untereinheit des Polymers repräsentiert, wobei unabhängig für jedes Auftreten von E die Linkergruppe L über R5 oder B eines Saccharid-Anteils der zweiten PEG-Untereinheit oder über ein Amin der zweiten PEG-Untereinheit kovalent angeheftet ist.
  • Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung richtet sich auf ein Polymer, das repräsentiert ist durch die allgemeine Formel
    Figure 00150001
    wobei:
    R1 unabhängig für jedes Auftreten H, -OR, -SR oder -N(H)-Y-R ist;
    R5 H, -OR, NH-Y-R2 oder -L-E ist;
    Y unabhängig für jedes Auftreten abwesend, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR)-, O, S oder Se ist;
    B für das eine Auftreten -R ist und für das andere Auftreten -R oder 1-9 Saccharidreste ist;
    R unabhängig für jedes Auftreten H oder ein C1-C6-Alkyl oder eine andere Hydroxylschutzgruppe repräsentiert;
    R2 ein C1-C6-Alkyl ist;
    X2 einen Linker einer Länge von 1 bis 10 Atomen repräsentiert;
    D H oder -L-E repräsentiert;
    L einen Linker einer Länge von 1 bis 20 Atomen repräsentiert;
    E eine andere Polyethylenglycol-Untereinheit des Polymers repräsentiert, an die ein Saccharid-Anteil VII angeheftet ist, wobei unabhängig für jedes Auftreten von E die Linkergruppe L über R5 oder B in dem Saccharid-Anteil kovalent angeheftet ist;
    PEG eine Polyethylenglykol-Untereinheit repräsentiert; und
    X3 eine oder mehrere zusätzliche Polyethylenglycoluntereinheiten repräsentiert, die mit einem Saccharid-Anteil aus Formel VII derivatisiert sein können, wobei das Polymer ein mittleres Molekulargewicht in dem Bereich von 10.000 Dalton bis 1.000.000 Dalton hat.
  • Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die folgendes aufweist: einen nicht-immunogenen pharmakologisch akzeptablen vernetzten Träger; und eine Vielzahl von αGal(1,3)Gal-Anteilen, die kovalent an den Träger gebunden sind.
  • Die Erfindung richtet sich ferner auf eine Zusammensetzung, die nützlich ist, um Plasmaspiegel von Anti-(αGal(1,3)Gal)-Antikörpern in einem Primatsubjekt zu reduzieren, das ein Organtransplantat vom Schwein benötigt. Dabei soll der Ausdruck "Primat" Menschen einschließen. Die Verringerung der Spiegel von zirkulierenden Anti-(αGal(1,3)Gal)-Antikörpern soll eine hyperakute Abstoßung des gespendeten Schweineorgans verhindern oder mildern, was eine Langzeitfunktion des transplantierten Organs zuläßt.
  • Die Zusammensetzung der Erfindung weist einen nicht-immunogenen pharmakologisch akzeptablen vernetzten Träger auf, der kovalent an eine Vielzahl von αGal(1,3)Gal-Anteilen gebunden ist.
  • Die Erfindung richtet sich auch auf Verfahren zur synthetischen Herstellung der Zusammensetzung.
  • Ein bevorzugtes Verfahren besteht darin, in einer Lösung mit einem pH von 4 bis 7 die folgenden Reagenzien in Reaktion zu bringen:
    • – ein verzweigtes Polymer, beispielhaft Polyethylenglykol, das wenigstens drei Arme und ein Minimum von 6 aktiven Gruppen wie etwa Aminogruppen oder Hydrazingruppen an seinen freien Enden hat,
    • – αGal(1,3)Gal, das eine kovalent gebundene Carboxylgruppe hat,
    • – N-(e-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid (EDC), und
    • – ein Vernetzungsmittel.
  • Ein zweites bevorzugtes Verfahren wird wie oben ausgeführt mit der Ausnahme, daß das verzweigte Polymer kovalent gebundene Carboxylgruppen hat und das αGal(1,3)Gal eine kovalent gebundene aktive Gruppe wie etwa eine Amino- oder Hydrazingruppe hat.
  • Ein drittes bevorzugtes Verfahren besteht darin, in einer Lösung mit einem pH-Bereich von 4 bis 7 die folgenden Reagenzien umzusetzen:
    • – ein verzweigtes Polymer, das wenigstens drei Arme hat und wenigstens sechs aktive Gruppen wie etwa Amino- oder Hydrazingruppen, die kovalent an die freien Enden der Arme gebunden sind,
    • – αGal(1,3)Gal, das einen kovalent gebundenen Aldehyd hat, und
    • – ein Vernetzungsmittel.
  • Ein viertes bevorzugtes Verfahren wird wie das obige dritte Verfahren ausgeführt mit der Ausnahme, daß das verzweigte Polymer wenigstens sechs Aldehyde hat, die kovalent an seine Arme gebunden sind, und das obige αGal(1,3)Gal eine kovalent gebundene Aminogruppe oder Hydrazingruppe hat.
  • Ein fünftes bevorzugtes Verfahren besteht darin, in einer Lösung mit einem pH-Bereich von 4 bis 7 die folgenden Reagenzien umzusetzen:
    • – ein verzweigtes Polymer, das wenigstens drei Arme und wenigstens drei kovalent gebundene aktive Gruppen wie etwa Amino- oder Hydrazingruppen hat,
    • – αGal(1,3)Gal, das eine kovalent gebundene Carboxylgruppe hat,
    • – EDC, und
    • – N-Hydroxysulfosuccinimid (NHSS).
  • Ein sechstes bevorzugtes Verfahren wird wie das obige fünfte Verfahren ausgeführt mit der Ausnahme, daß das verzweigte Polymer kovalent gebundene Carboxylgruppen und das αGal(1,3)Gal kovalent gebundene Amino- oder Hydrazingruppen hat.
  • Zusammensetzungen der Erfindung können eingesetzt werden, um Plasmaspiegel von Anti-(αGal(1,3)Gal)-Antikörpern in Primatsubjekten einschließlich Humansubjekten durch Verabreichen der Zusammensetzung der Erfindung zu reduzieren.
  • Die Erfindung ist ferner auf ein Set und auf Verfahren zum Nachweisen und Quantifizieren von Anti-(αGal(1,3)Gal)-Antikörper sekretierenden Zellen in dem Blut eines Subjekts gerichtet.
  • Zusammensetzungen der Erfindung können eingesetzt werden, um die Abstoßung von Gewebe von einem Spendertier einer Spezies, das einem Empfängertier einer anderen Spezies transplantiert wurde, zu mildern durch Verabreichen an das Empfängertier einer Menge eines Polymers, das mit xenoreaktiven Antikörpern des Empfängertiers reaktionsfähig und wirksam ist, um die Schwere einer Transplantatabstoßungs-Antwort zu verzögern oder zu verringern, wobei das Polymer Epitope hat, die mit einem Xenoantigen des Transplantats kreuzreaktionsfähig sind, und die Abstoßung des Gewebes wenigstens teilweise durch Exprimieren des Xenoantigens an dem Gewebe gemildert wird.
  • Das vorliegende Verfahren kann als Teil eines Vorbehandlungsprogramms für einen Patienten genützt werden, dem Gewebe oder Zellen von einer diskordanten Spezies transplantiert werden sollen, und/oder für die Behandlung eines Patienten, dem Gewebe oder Zellen von einer diskordanten Spezies transplantiert worden sind. Bei bevorzugten Ausführungsformen findet durch das Verfahren eine Verringerung oder sonstige Abschwächung der Schwere einer hyperakuten Abstoßung der transplantierten Gewebe statt. Bei bestimmten Ausführungsformen wird das Polymer in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um Wirts-Antikörper zu neutralisieren, die mit dem Xenoantigen immunreaktionsfähig sind.
  • Bei bevorzugten Ausführungsformen besitzt der Empfänger weder eine UDP-Galactose:β-D-Galactosyl-1,4-N-Acetyl-D-glucosamin-α(1,3)Galactosyltransferase(α1,3-GT)-Wirksamkeit noch erzeugt oder zeigt er anderweitig das αGal(1,3)Gal-Xenoantigen an seinen Zellen, Geweben oder Organen. Beispielsweise kann der Empfänger ein Mensch oder ein europäischer Primat sein.
  • Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen stammt das Xenotransplantat vom Schwein und stärker bevorzugt vom Zwergschwein.
  • Das xenotransplantierte Gewebe kann ein Organ, z. B. ein vaskularisiertes Organ wie etwa eine Niere, ein Herz, eine Lunge oder eine Leber sein. Das Xenotransplantatgewebe kann auch in Form von Teilen von Organen, Zellclustern und Drüsen wie etwa Pankreasinselzellen, Haut, Hornhautgewebe und Knochenmark oder von anderen Präparationen von hämopoetischen Zellen sein.
  • Die Zusammensetzungen können bei einem Verfahren zum Herabsetzen von Plasmaspiegeln von Anti-(αGal(1,3)Gal)-Antikörpern in einem Primatsubjekt eingesetzt werden, wobei dem Subjekt eine Zusammensetzung verabreicht wird, die aufweist:
    einen nicht immunogenen pharmakologisch akzeptablen Träger; und
    eine Vielzahl von αGal(1,3)Gal-Anteilen, die kovalent an den Träger gebunden sind.
  • Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt einen Komplex bereit, der eine oder mehrere einer Zusammensetzung zugeordnete B-Zellen aufweist, wobei der Komplex folgendes aufweist:
    einen nicht immunogenen pharmakologisch akzeptablen Träger und
    eine Vielzahl von αGal(1,3)Gal-Anteilen, die an den Träger kovalent gebunden sind.
  • Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt einen Komplex bereit, der einen oder mehrere einer Zusammensetzung zugeordnete Antikörper aufweist, wobei der Komplex folgendes aufweist:
    einen nicht immunogenen pharmakologisch akzeptablen Träger, und
    eine Vielzahl von αGal(1,3)Gal-Anteilen, die an den Träger kovalent gebunden sind.
  • Die Polymere der Erfindung können eingesetzt werden zur Bildung eines Sets zum Nachweisen und Quantifizieren von Anti-(αGal(1,3)Gal)-Antikörper sekretierenden Zellen in dem Blut eines Subjekts, wobei das Set folgendes aufweist:
    eine Vielfachvertiefungsplatte, an die ein αGal(1,3)Gal kovalent gekuppelt ist; Blockierlösung, die einen Puffer und Humanserumalbumin aufweist;
    serumfreies komplettes Kultursubstrat;
    Anti-Humanimmunglobulin-Antikörper; und
    Mittel zum Markieren der an die Platte gebundenen Anti-Humanimmunglobulin-Antikörper.
  • Die Polymere der Erfindung können eingesetzt werden bei einem Verfahren zum Nachweisen und Quantifizieren von Anti-(αGal(1,3)Gal)-Antikörper sekretierenden Zellen im Blut eines Subjekts, wobei das Verfahren aufweist:
    Bereitstellen von einkernigen Zellen von peripherem Blut, die aus einer Blutprobe des Subjekts isoliert wurden;
    Bereitstellen einer Vielfachvertiefungs-Platte, an die αGal(1,3)Gal kovalent gekuppelt ist; Inkubieren der einkernigen Zellen von peripherem Blut auf der Platte für einen ausreichenden Zeitraum und unter geeigneten Bedingungen, um zuzulassen, daß sich Anti-(αGal(1,3)Gal)-Antikörper sekretierende Zellen und ihre Antikörper spezifisch an das auf die Platte gestrichene αGal(1,3)Gal binden;
    Waschen der Platte, um nicht-bindende Zellen zu entfernen;
    Inkubieren der Anti-(αGal(1,3)Gal)-Antikörper sekretierenden Zellen und ihrer Antikörper, die an das auf die Platte gestrichene αGal(1,3)Gal gebunden sind, mit Anti-Humanimmunglobulin-Antikörpern;
    Waschen der Platte, um nicht-bindende Anti-Humanimmunglobulin-Antikörper zu entfernen; Aufbringen eines Mittels zum Markieren von an die Platte gebundenen Anti-Humanimmunglobulin-Antikörpern; und
    Quantifizieren von einzelnen Anti-(αGal(1,3)Gal)-Antikörper sekretierenden, Tüpfel bildenden Zellen, die durch Tüpfel bezeichnet sind, die auf der Platte durch die Bindung der markierten Anti-Humanimmunoglobulin-Antikörper gebildet sind.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die chemischen Strukturen von 4-Arm- und 8-Arm-Polyethylenglycol mit aktiven Gruppen am Ende jedes Arms. Bei der Synthese einer beispielhaften Zusammensetzung der Erfindung (TPC) wird αGal(1,3)Gal-β-1-4GlcNAc kovalent an Aminostellen an den Enden der Arme gebunden.
  • 2 zeigt die chemische Struktur von αGal(1,3)Gal-β-1-4GlcNAc (Zucker), das kovalent an einen Arm eines vielarmigen Polyethylenglycols (PEG-NH2) gebunden ist.
  • 3 zeigt die Konzentration verschiedener Zuammensetzungen, die für eine 50 % Inhibierung der xenoreaktiven Antikörper-Wirksamkeit erforderlich sind.
  • 4 zeigt die Wirkung der TPC-(410S)-Verabreichung auf Anti-Gal-IgM-Spiegel bei cynomolgosen Affen.
  • 5 zeigt die Wirkung der TPC-(410S)-Verabreichung auf Anti-Gal-IgG-Spiegel bei cynomolgosen Affen.
  • 6 zeigt xenoreaktive Antikörperspiegel bei einem cynomolgosen Affen, der anstelle von TPC (410S) einen Kontrollträger erhielt. "Tx" bezeichnet den Tag der heterotopischen Herztransplantation.
  • 7 zeigt die Suppression von xenoreaktiven Antikörperspiegeln in einem cynomolgosen Affen, der 250 mg TPC (410S) durch Infusion entsprechend dem in Beispiel 17 beschriebenen Plan erhielt. "Tx" bezeichnet den Tag der heterotopischen Herztransplantation.
  • 8 zeigt ebenfalls die Suppression von xenoreaktiven Antikörperspiegeln bei einem zweiten Affen, der wie in Beispiel 17 beschrieben behandelt wurde.
  • 9 zeigt ebenfalls die Suppression von xenoreaktiven Antikörperspiegeln bei einem dritten Affen, der wie in Beispiel 17 beschrieben behandelt wurde.
  • 10 zeigt die Inhibierung von Anti-Gal-IgM sekretierenden B-Zellen, erreicht mit einer beispielhaften Zusammensetzung der Erfindung. TPC = 410S.
  • 11 zeigt die Inhibierung von Anti-Gal-IgG sekretierenden B-Zellen mit TPC (410S).
  • 12 zeigt die Suppression von xenoreaktiven IgM-Spiegeln bei einem Pavian, der mit TPC (410S) wie in Beispiel 19 beschrieben behandelt wurde.
  • 13 zeigt ebenfalls die Suppression von xenoreaktiven IgM-Spiegeln bei einem zweiten Pavian, der mit TPC (410S) wie in Beispiel 19 beschrieben behandelt wurde.
  • 14–23 zeigen ausgewählte Oligosaccharid-Anteile.
  • 24 zeigt die IC50-Werte verschiedener Moleküle in dem Inhibierungs-Assay.
  • 25 ist eine schematische Darstellung einer möglichen Struktur für die mit den vorliegenden Prozessen erzeugten Produkte.
  • 26 ist ein Diagramm von IgM-XNA-Spiegeln: 810S- versus IP-behandelte Paviane. Paviane wurden entweder mit 810S (50 mg/kg) alle 3 Tage über insgesamt 6 Behandlungen behandelt oder erhielten insgesamt 6 Immunapherese-Behandlungen unter Einsatz von α-Gal-Säulen alle 3 Tage. Serum von jedem Pavian wurde mittels ELISA auf IgM-Antikörper, die gegen das αGal-Epitop gerichtet sind, analysiert. Der Prozentsatz von verbleibenden IgM-XNAs wurde errechnet unter Anwendung von Grundlinienwerten von jedem Tier als 100 %.
  • 27 ist ein Diagramm von IgG-XNA-Spiegeln: 810S- versus IP-behandelte Paviane. Paviane wurden entweder mit 810S (50 mg/kg) alle 3 Tage insgesamt 6mal behandelt oder erhielten insgesamt 6 Immunapherese-Behandlungen unter Einsatz von α-Gal-Säulen alle 3 Tage. Serum von jedem Pavian wurde mittels ELISA auf IgG-Antikörper, die gegen das α-Gal-Epitop gerichtet sind, analysiert. Der Prozentsatz von verbleibenden IgM-XNAs wurde errechnet unter Anwendung von Grundlinienwerten von jedem Tier als 100 %.
  • 28 ist ein Diagramm einer Pavian-46-98-Antikörperantwort auf 810S. Pavian 46-98 wurde mit 810S (50 mg/kg) alle 3 Tage insgesamt 6mal behandelt. Serum wurde auf IgM- und IgG-Antikörper analysiert, die gegen das α-Gal-Epitop (XIgM oder XIgG) gerichtet sind, sowie auf Gesamt IgM (TotIgM) oder Gesamt-IgG (TotIgG) mittels ELISA analysiert. Der verbleibende Antikörper-Prozentsatz wurde unter Anwendung von Grundlinienwerten als 100 % errechnet.
  • 29 ist ein Diagramm der Pavian-52-98-Antikörperantwort auf 810S. Pavian 52-98 wurde mit 810S (50 mg/kg) alle 3 Tage insgesamt 6mal behandelt. Serum wurde auf IgM- und IgG-Antikörper, die gegen das α-Gal-Epitop (XIgM oder XIgG) gerichtet sind, sowie auf Gesamt-IgM (TotKgM) oder Gesamt-IgG (TotIgG) mittels ELISA analysiert. Der verbleibende Antikörper-Prozentsatz wurde unter Anwendung von Grundlinienwerten als 100 % errechnet.
  • 30 ist ein Diagramm der Pavian-50-98-Antikörperantwort auf 810S. Pavian 50-98 wurde mit 810S (50 mg/kg) alle 3 Tage insgesamt 6mal behandelt. Serum wurde auf IgM- und IgG-Antikörper, die gegen das α-Gal-Epitop (XIgM oder XIgG) gerichtet sind, sowie auf Gesamt-IgM (TotIgM) oder Gesamt-IgG (TotIgG) mittels ELISA analysiert. Der verbleibende Antikörper-Prozentsatz wurde unter Anwendung von Grundlinienwerten als 100 % errechnet.
  • 31 ist ein Diagramm der Pavian-51-98-Antikörperantwort auf IP. Pavian 51-98 erhielt insgesamt 6 Immunapherese-Behandlungen unter Einsatz von α-Gal-Säulen alle 3 Tage. Serum wurde auf IgM- und IgG-Antikörper, die gegen das α-Gal-Epitop (XIgM oder XIgG) sowie auf Gesamt-IgM (TotIgM) oder Gesamt-IgG (TotIgG) mittels ELISA analysiert. Der verbleibende Antikörper-Prozentsatz wurde unter Anwendung von Grundlinienwerten als 100 % errechnet.
  • 32 ist ein Diagramm der Pavian-48-98-Antikörperantwort auf IP. Pavian 48-98 erhielt insgesamt 6 Immunaphererse-Behandlungen unter Einsatz von α-Gal-Säulen alle 3 Tage. Serum wurde auf IgM- und IgG-Antikörper, die gegen das α-Gal-Epitop gerichtet sind (XIgM oder XIgG) sowie auf Gesamt-IgM (TotIgM) oder Gesamt-IgG (TotIgG) mittels ELISA analysiert. Der verbleibende Antikörper-Prozentsatz wurde unter Anwendung von Grundlinienwerten als 100 % errechnet.
  • 33 ist ein Diagramm der Pavian-47-98-Antikörper-Antwort auf IP. Pavian 47-98 erhielt insgesamt 6 Immunaphererse-Behandlungen unter Einsatz von α-Gal-Säulen alle 3 Tage. Serum wurde auf IgM- und IgG-Antikörper, die gegen das α-Gal-Epitop gerichtet sind (XIgM oder XIgG) sowie auf Gesamt-IgM (TotIgM) oder Gesamt-IgG (TotIgG) mittels ELISA analysiert. Der verbleibende Antikörper-Prozentsatz wurde unter Anwendung von Grundlinienwerten als 100 % errechnet.
  • 34 vergleicht die IgG-Antwort von mit IP und mit TPC (810) behandelten Pavianen. Die Paviane wurden entweder alle 3 Tage insgesamt 6mal mit 810S (50 mg/kg) behandelt oder erfuhren insgesamt 6 Immunapherese-Behandlungen unter Einsatz von α-Gal-Säulen alle 3 Tage. Einkernige Zellen von peripherem Blut wurden gesammelt und mittels einer ELISPOT-Analyse auf die Anzahl von Zellen untersucht, die IgG-Antikörper sekretierten, die gegen α-Gal gerichtet sind. Die Änderung der Vervielfachung der Antikörper sekretierenden Zellen (ASCs) wurde errechnet durch Normierung auf Grundlinienwerte. Die Werte sind als das Mittel von 3 Pavianen je Gruppe dargestellt.
  • Genaue Beschreibung
  • (i) Übersicht
  • Das Haupthindernis für alle Formen der Organtransplantation ist die Abstoßung des Transplantats durch das Immunsystem des Empfängers. Je enger verwandt der Spender und der Empfänger sind, um so geringer ist die Wahrscheinlichkeit, daß das transplantierte Organ abgestoßen wird. Bei der Allotransplantation, der Transplantation von Organen zwischen der gleichen Spezies, kann das Problem der Immunabstoßung durch immunsuppressive Arzneimittel weitgehend überwunden werden. Der derzeitige Mangel an Humangewebe für die Humantransplantetion hat jedoch zum Einsatz von Xenotransplantaten als einer Organquelle geführt. Ein Problem, das auftritt, wenn Gewebe von nichtmenschlichen Spezies in Menschen transplantiert werden, ist das Problem der hyperakuten Abstoßung, die infolge des Vorhandenseins natürlicher Antikörper im Humanserum erfolgt, die mit Antikörpern reagieren, die in diesen Spezies vorhanden sind. Diese Erscheinung ist im allgemeinen abhängig von der Anwesenheit von einigen oder allen von Antikörpern, Komplement, Neutrophilen, Plättchen und anderen Vermittlern von Entzündungen.
  • Schweine sind primäre Kandidaten als Spender von Xenotransplantaten, weil ihre Physiologie und Anatomie derjenigen des Menschen gleichen und weil es sie in großen Mengen gibt und sie unter Reinbedingungen gezüchtet werden können, um dadurch die Infektionsgefahr zu minimieren. Im Zusammenhang mit der Transplantation von Schweinegewebe auf Menschen hängt die hyperakute Abstoßung zumindest teilweise mit Wirts-Antikörpern zusammen, die mit Galactosyl-Antigenen reaktionsfähig sind, die an dem Schweinegewebe anwesend sind, etwa α-Galactosyl-(1,3)-Galactoye-Anteilen (dem "αGal(1,3)Gal"- oder "αGal"-Epitop). Die Inhibierung der Wechselwirkung zwischen Wirts-Antikörpern, die mit den αGal(1,3)Gal-Epitopen von Xenotransplantatgewebe reaktionsfähig sind, kann zum Verhindern der Abstoßung genutzt werden.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zum Abschwächen der Xenotransplantat-Abstoßung, indem einem das Xenotransplantat empfangenden Tier eine Menge eines Polymer-derivatisierten Xenoantigens (nachstehend "Xenopolymer") verabreicht wird, die wirksam ist, um die Schwere der hyperakuten Abstoßungsantwort (HAR) oder einer anderen immunologischen Antwort auf das Transplantat zu verringern, die von der Anwesenheit des Xenoantigens an den transplantierten Geweben oder Zellen abhängig ist. Bei bestimmten Ausführungsformen wird das Xenopolymer in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um Wirts-Antikörper ("xenoreaktive Antikörper" oder "XNA") zu neutralisieren, die mit dem Xenoantigen immunreaktiv sind. Das Xenopolymer kann zusätzlich oder alternativ als ein Tolerogen (oder Anergen) für das Xenoantigen eingesetzt werden, das z. B. imstande ist, in gewissem Maß die Produktion/Sekretion von XNAs durch das Immunsystem des Wirts zu unterdrücken.
  • Das Xenoantigen (die Xenoantigene), das an dem Polymer angelagert ist, ist mit Wirts-XNAs gegen Kohlenwasserstoff-Epitope des Xenotransplantats immunreaktiv und stärker bevorzugt mit Wirts-Antikörpern gegen α-Galactosyl-Epitope wie etwa ein αGal(1,3)Gal-Epitop immunreaktiv.
  • Die Polymerkomponente, z. B. das Grundgerüst der betroffenen Xenopolymere, ist bevorzugt von einem Polymer derivatisiert, das wasserlöslich und im wesentlichen nicht toxisch und nicht immunogen ist. Beispielhafte Polymere dieses Typs umfassen Polyethylenglycole, Polyvinylpyrrolidone, Polyacrylamide, Dextrane und Polyglycomere. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist jedoch das Xenopolymer aus einem Polyamin wie etwa aminierten Polyethylenglycolen, Polyalkylaminen, Polypeptiden (wie Polylysin, Polyornithin, Polyarginin, Polyasparagin, Polyglutamin), Polyallylaminnen, Poly[N(2-Aminoethyl)]methacrylamiden und Polyaminokohlenwasserstoffen wie Aminodextran oder Chitosan gebildet. Das Polymer kann homopolymer oder copolymer sein, und im letztgenannten Fall kann es ein Block- oder statistisches Copolymer sein.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen kann das vorliegende Verfahren angewandt werden, um die Toleranz für das αGal(1,3)Gal-Antigen in einem Empfänger-Säuger zu fördern, der keine endogene UDP-Galactoye:β-D-Galactosyl-1,4-N-acetyl-D-glucosamid-α(1,3)Galactosyltransferase(α1,3-GT)-Wirksamkeit besitzt oder der auf andere Weise das αGal(1,3)Gal-Antigen an seinen Zellen, Geweben oder Organen nicht erzeugt. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist daher das Empfängertier ein Mensch oder ein europäischer Primat, z. B. ein Pavian (etwa Papio anubis) oder ein cynomolgoser Affe (etwa Macaca fascicularis).
  • Xenotransplantiertes Gewebe stammt bevorzugt vom Schwein, obwohl Gewebe von anderen nicht-humanen Säugern ebenfalls zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung vorstellbar sind. Bevorzugt ist das xenotransplantierte Gewebe in Form eines Organs, und stärker bevorzugt eines vaskularisierten Organs, beispielsweise eine Niere, ein Herz, eine Lunge oder eine Leber. Xenotransplantatgewebe kann auch in Form von Organteilen, Zellclustern, Drüsen und dergleichen sein. Beispiele umfassen Linsen, Pankreasinselzellen, Haut, Hornhautgewebe und Knochenmark oder andere Präparate von hämatopoetischen Zellen.
  • Die Xenopolymere der vorliegenden Erfindung haben interessante Eigenschaften. Insbesondere haben sie eine Affinität für menschliche polyklonale XNAs, die in Körperflüssigkeiten, beispielsweise Blut, anwesend sind, und sind als Verarmungsmittel nützlich. Bei bestimmten Ausführungsformen können die betroffenen Xenopolymere für die intrakorporale Verarmung von XNAs genutzt werden, z. B. durch Injektion, Infusion oder Perfusion des Polymers in einen Xenotransplantat-Empfänger vor und/oder nach der Transplantation. Die Xenopolymere der vorliegenden Erfindung können bei bestimmten Ausführungsformen auch als Pharmazeutikum genutzt werden, um eine Toleranz oder Anergie für xenoantigene Epitope oder für insbesondere Ziel-B-Zellen mit Xenoantigen-Rezeptoren zu induzieren. Die Verabreichung kann nach Bedarf wiederholt werden, um eine Toleranz zu erreichen.
  • Bei einer Ausführungsform weist daher das Verfahren zur Verwendung der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung einen Schritt des Vorbehandelns eines Patienten, dem Gewebe oder Zellen von einer diskordanten Spezies transplantiert werden soll, mit einer wirksamen Menge des vorliegenden Xenopolymers auf, um das Risiko der hyperakuten Abstoßung oder einer anderen nachteiligen immunologischen Reaktion auf das Xenotransplantat bei der Transplantation zu verringern.
  • Alternativ weist das Verfahren einen Schritt des Behandelns eines Patienten, dem Gewebe oder Zellen von einer diskordanten Spezies transplantiert wurden, mit einer wirksamen Menge des vorliegenden Xenopolymers auf, um dadurch das Risiko der hyperakuten Abstoßung oder einer anderen nachteiligen immunologischen Reaktion auf das Xenotransplantat zu verringern.
  • Die Behandlung unter Einsatz der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verhindert nicht unbedingt alle Aspekte einer Abstoßung, ist aber wirksam, um die Antikörper-abhängige Komponente der Transplantat-Abstoßung zu unterdrücken. Auch eine teilweise Unterdrückung der Abstoßung ist günstig, weil die Milderung der Abstoßungserscheinungen die Rettung eines Teils des Gewebes in dem Transplantat in einem lebensfähigen Zustand erlaubt. Beispielsweise kann selbst eine teilweise funktionierende Niere dem Empfänger ermöglichen, die Dialyse zu vermeiden oder die Perioden zwischen Dialysevorgängen zu verlängern, auch wenn eine gewisse Zell-Lyse aufgetreten ist. Ebenso ist zwar ein voll funktionsfähiges Herztransplantat zu bevorzugen, aber die Milderung der Abstoßung in ausreichendem Maß, um eine gewisse Steigerung der Belastung durch den Empfänger relativ zu dessen Zustand vor der Transplantation zuzulassen, ist wertvoll. Eine teilweise Rettung von Lebergewebe in einem Lebertransplantat, das eine Abstoßung; erfährt, ist ebenfalls wertvoll, weil das verbleibende lebensfähige Lebergewebe sich erholen und regenerieren kann, während der Patient mit Koagulationsproteinen und anderen Substanzen unterstützt wird, die normalerweise von der Leber erzeugt werden.
  • Wie noch im einzelnen beschrieben wird, kann das vorliegende Verfahren mit anderen Transplantationstherapien wie Immunapherese und anderen Behandlungsprotokollen zum Induzieren der Akkommodation, immunsuppressiver Therapie und der Anwendung von gentechnisch verändertem Spendergewebe kombiniert werden.
  • Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Zusammensetzungen, welche die vorliegenden Xenopolymere aufweisen, insbesondere Polymere, die Xenoantigene zeigen, die mit Wirts-Antikörpern gegen α-Galactosyl-Epitope wie αGal(1,3)Gal immunreaktiv sind. Bei bevorzugten Ausführungsformen sind die Polymerpräparate mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger formuliert, sind steril und im wesentlichen nicht pyrogen.
  • Für bestimmte der vorliegenden Xenopolymere sind es die kombinierten Eigenschaften der Wirksamkeit bei einer sehr niedrigen molaren Konzentration plus Langzeitstabilität, wodurch die Zusammensetzungen der Erfindung als Pharmazeutika praktisch verwendbar und nützlich sind. Diese Eigenschaften ermöglichen eine Wirksamkeit in niedrigen Dosen, von denen zu erwarten ist, daß sie von Patienten gut vertragen werden, die eine chronische Verringerung von zirkulierenden Anti-Gal-Antikörpern benötigen. Die Stabilität der Zusammensetzungen ermöglicht die Langzeitlagerung bei Temperaturen, die in einer Haushaltsumgebung erreicht werden, was die Möglichkeit bietet, daß sich Patienten die Pharmazeutika über einen langen Zeitraum, eventuell auch während ihrer gesamten Lebensdauer nach Erhalt eines Schweineorgan-Transplantats, selbst verabreichen können.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der vorliegenden Xenopolymere bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung der Abstoßung eines diskordanten Transplantats, wobei das Medikament einem Patienten entweder als Vorbereitung vor einer Transplantation oder zur Aufrechterhaltung nach der Transplantation oder beides verabreicht wird, und zwar in einer Menge, die ausreichend ist, um die Schwere der Abstoßung des Transplantats zu verringern.
  • (ii) Definitionen
  • Aus Gründen der Zweckmäßigkeit sind hier bestimmte Ausdrücke, die in der Beschreibung und den beigefügten Patentansprüchen verwendet werden, aufgeführt.
  • Der Ausdruck "Gal" bezieht sich auf Galactose; "Glc" bezieht sich auf Glucose, und "GlcNAc" bezieht sich auf N-Acetylglucosamin.
  • "Zuckermonomere" oder "Saccharid-Untereinheiten", die austauschbar verwendet werden, beziehen sich auf natürlich vorkommende Zucker wie Galactose, Glucose und dergleichen sowie Zuckermonomere, die Modifikationen davon sind. Beispielsweise umfaßt der Ausdruck geschützte, teilweise geschützte oder ungeschützte Desoxyzucker der D- und L-Konfigurationen, bevorzugt 2-, 3-, 4-, 5- und 6-Desoxyaldosen wie Fucose, Thamnose und Digitoxose, 1,2-Didesoxyaldosen wie Glucal, Galactal und Fucal und 1-, 3-, 4-, 5- und 6-Desoxyketosen, 2-, 3-, 4-, 5- und 6-Desoxyaminozucker der D- und L-Konfigurationen wie Glucosamin, Mannosamin, Galactosamin und Fucosamin und Desoxyacylaminozucker wie N-Acylglucosamin, N-Acylmannosamin, N-Acylgalactosamin und N-Acylfucosamin, bevorzugt ihre C1-C4-Alkylester. Außerdem sollen diese Modifikationen bedeuten: Aldon-, Aldar- und Uronsäuren wie etwa Gluconsäure oder Glucuronsäure und außerdem Ascorbinsäure und Aminosäure tragende Zuckermonomere. Modifizierte Zuckermonomere sollen ebenfalls diejenigen bedeuten, die eine Kohlenstoffkette haben, die länger als 6 C-Atome ist, etwa Heptosen, Octosen, Nonosen, Heptulosen, Octulosen und Nonulosen, und außerdem ihre Repräsentanten, die entsprechend den oben angegeben Kriterien substituiert sind, etwa Ketodesoxyoctansäure, Ketodesoxynonansäure, N-Acylneuraminsäuren und N-Acylmuraminsäuren.
  • Oligosaccharide sollen ein reduzierendes Ende und ein nicht-reduzierendes Ende haben, wobei es keine Rolle spielt, ab das Saccharid am reduzierenden Ende tatsächlich ein reduzierender Zucker ist. In Übereinstimmung mit der anerkannten Nomenklatur sind Oligosaccharide hier so dargestellt, daß das nicht-reduzierende Ende auf der linken Seite und das reduzierende Ende auf der rechten Seite ist.
  • Alle Oligosaccharide sind hier mit dem Namen oder der Abkürzung für das nicht-reduzierende Saccharid (z. B. Gal), gefolgt von der Konfiguration der Glycosidbindung (α oder β), der Ringbindung, der Ringposition des reduzierenden Saccharids in der Bindung und dem Namen oder der Abkürzung des reduzierenden Saccharids (z. B. GlcNAc) beschrieben. Die Bindung ist bevorzugt α-O-glycosidisch oder β-O-glycosidisch, z. B. (1→2)-, (1→3)-, (1→4)-, (1→5)-, (1→6)-m(2→3)- und (2→6)-Glycosidbindungen. Beispiele von Disacchariden sind etwa Trehalose, Sophorose, Kojibiose, Laminaribiose, Maltose, Cellobiose, Isomaltose, Gentibiose, Sucrose und Lactose und deren Abkömmlinge. Beispiele von Trisacchariden sind Raffinose und Melezitose. Ferner können die Oligosaccharide über S-, N- und C-Glycosidbindungen verknüpft sein, z. B. -S-, -NR12-, -NR12C(O)- oder -CR13R14-, wobei R12, R13 und R14 unabhängig voneinander sind: H,C1-C12-Alkyl, C5- oder C6-Cycloalkyl, C5- oder C6-Cycloalkylmethyl oder -ethyl, -phenyl, -benzyl oder -phenethyl. Im allgemeinen ist jede Saccharid-Untereinheit eine Pyranose.
  • Ein "αGal(1,3)Gal-Anteil" oder ein αGal-Anteil bezieht sich auf zwei Galactosylreste, wobei der Gal-Rest am reduzierenden Ende ein α-Galactosyl-Anteil ist, die durch eine 1-3-Glycosidbindung kovalent verbunden sind.
  • Der Ausdruck "αGal-Oligosaccharid" bezieht sich auf Oligosaccharide (die z. B. zwei oder mehr Saccharidanteile enthalten), die den αGal(1,3)Gal-Anteil aufweisen.
  • Der Ausdruck "XNA" bezieht sich auf xenoreaktive natürliche Antikörper wie etwa Human-Antikörper, die mit dem Kohlenwasserstoff-αGal(1,3)Gal-Epitop an Schweinegewebe immunreaktiv sind.
  • Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich "hyperakute Abstoßung" auf die rasche Transplantatabstoßung, die Minuten nach dem Implantieren einsetzt und durch vorher vorhandene Antikörper zu dem Transplantat vermittelt wird.
  • Definitionsgemäß kann ein "Xenotransplantat" ein Organ, ein Gewebe, Zellaggregate oder Zellen sein, die hier mit dem Sammelbegriff "Gewebe" bezeichnet werden. Das Transplantat kann aus jedem geeigneten Gewebe des Körpers des Gewebespenders ausgewählt sein. Diese Gewebe umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Herz, Niere, Lunge, Inselzellen, Leber, Eingeweide, Haut und hämopoetische Zellen.
  • Die Ausdrücke "Xenotransplantat-Abstoßung reduzieren" und "Xenotransplantat-Abstoßung abschwächen", die hier austauschbar verwendet werden, haben die Bedeutung, daß sie die Schwere von Prozessen, die in einer hyperakuten Abstoßung resultieren, beispielsweise – ohne daß dies eine Einschränkung bedeuten soll – Ischämie, Thrombose, Herzmuskelstauung und Gewebsnekrose, hemmen, beeinträchtigen oder anderweitig verringern.
  • Die Ausdrücke "xenogen" und "Xenotransplantat" beziehen sich auf Zellen oder Gewebe, das von einer Spezies stammt oder abgeleitet ist, die von derjenigen des Empfängers verschieden ist.
  • Der Ausdruck "Autolog" bezieht sich auf Gewebe oder Zellen, die von dem Empfänger stammen oder davon abgeleitet sind, wogegen die Ausdrücke "allogen" und "Allotransplantat" Gewebe und Zellen betreffen, die von einem Spender derselben Spezies wie der Empfänger stammen oder davon abgeleitet sind.
  • Ein "immunsuppressives Mittel" ist im vorliegenden Kontext ein Mittel, z. B. ein chemisches Mittel wie etwa ein Arzneimittel, das bei Verabreichung in einer geeigneten Dosierung in der Hemmung von T-Zellen resultiert. Beispiele solcher Mittel sind Cyclosporin, FK-506 und Rapamycin.
  • "Hämopoetische raumerzeugende Bestrahlung" bezieht sich im vorliegenden Kontext auf eine Bestrahlung, die auf das hämopoetische Gewebe gerichtet ist, d. h. auf Gewebe, in dem Stammzellen gefunden werden, z. B. das Knochenmark. Sie ist von hinreichender Stärke, um eine erhebliche Anzahl von hämopoetischen Zellen zu desaktivieren oder abzutöten. Häufig wird sie als Gesamtkörperbestrahlung angewandt.
  • "Toleranz" bedeutet im vorliegenden Kontext eine Hemmung der Immunantwort eines Transplantat-Empfängers, die andernfalls auftreten würde, z. B. als Antwort auf die Einführung eines nicht-eigenen Antigens in den Empfänger. Toleranz kann humorale, zelluläre oder sowohl humorale als auch zelluläre Antworten umfassen. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich Toleranz nicht nur auf die komplette immunologische Toleranz für ein Antigen, sondern auf partielle immunologische Toleranz, d. h. ein Maß an Toleranz für ein Antigen, das größer ist als das, welches erkennbar wäre, wenn ein Verfahren nach der Erfindung nicht angewandt werden würde. Außerdem bezieht sich Toleranz im vorliegenden Kontext auf eine Spenderantigenspezifische Inhibierung des Immunsystems im Gegensatz zu der ein breites Spektrum umfassenden Inhibierung des Immunsystems, die mit Immunsuppressiva erkennbar ist.
  • "Inhibieren von Immunzellenwirksamkeit" bezieht sich auf die Verringerung der Anzahl von aktiven Immunzellen, z. B. Thymocyten, T-Zellen, B-Zellen oder NK-Zellen, bevorzugt spenderreaktive Zellen oder spenderreaktive Vorläuferzellen in einem Subjekt. Das Inhibieren kann eine partielle Inhibierung oder partielle Verringerung (im Gegensatz zu einer vollständigen Eliminierung) der Zahl von aktiven Immunzellen, z. B. T-Zellen umfassen.
  • "Diskordante Kombination von Spezies" bezieht sich im vorliegenden Zusammenhang auf zwei Spezies, bei denen die hyperakute Abstoßung erfolgt, wenn ein Transplantat von der einen zu der anderen transplantiert wird. Im allgemeinen sind diskordante Spezies von unterschiedlicher Ordnung, wogegen nicht-diskordante Spezies von derselben Ordnung sind. Beispielsweise sind Ratten und Mäuse nicht-diskordante (d. h. konkordante) Spezies. Konkordante Spezieskombinationen zeigen keine hyperakute Abstoßung. Bei xenogenen Verfahren der Erfindung können der Spender und der Empfänger (das Subjekt) eine diskordante Spezieskombination sein.
  • "Zwergschwein" bezieht sich im vorliegenden Zusammenhang auf ein Zwergschwein, das bevorzugt vollständig oder partiell an wenigstens einem MHC-Locus durch Inzucht erzeugt ist. Der Inzucht-Koeffizient der Herde, welche das Zwergschwein liefert, sollte wenigstens 0,70 und stärker bevorzugt wenigstens 0,82 sein. Die Herde, aus der Spendertiere entnommen werden, sollte an den SLA-Genen homozygot sein.
  • Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich "nicht-myeloablativ" auf eine Behandlung, die Kochenmarkzellen abtötet, aber bei einer signifikanten Zahl von Empfängern nicht zum Tod durch Knochmarkversagen führt.
  • Der Ausdruck "Subjekt" bedeutet im vorliegenden Kontext einen Säuger, z. B. einen Menschen.
  • Der Ausdruck "ED50" bedeutet die Dosis eines Arzneimittels, z. B. eines Polymers der Erfindung, das 50 % seiner maximalen Antwort oder Wirkung erzeugt. Alternativ bedeutet er die Dosis, die eine vorbestimmte Antwort bei 50 % von Testsubjekten oder Präparaten erzeugt.
  • Der Ausdruck "LD50" bedeutet die Dosis eines Arzneistoffs, die bei 50 % von Testsubjekten tödlich ist.
  • Der Ausdruck "therapeutischer Index" bezieht sich auf den therpeutischen Index eines Arzneistoffs, definiert als LD50/ED50.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind die chemischen Elemente in Übereinstimmung mit dem Periodensystem der Elemente, CAS-Version, Handbook of Chemistry and Physics, 67. Ausgabe, 1986-87, Umschlaginnenseite, identifiziert. Ebenfalls für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll der Ausdruck "Kohlenwasserstoff" alle zulässigen Verbindungen umfassen, die wenigstens ein Wasserstoff- und ein Kohlenstoffatom haben. In einem umfassenderen Aspekt weisen die zulässigen Kohlenwasserstoffe auf: acyclische und cyclische, verzweigte und unverzweigte, carbocyclische und heterocyclische, aromatische und nichtaromatische organische Verbindungen, die substituiert oder unsubstituiert sein können.
  • Der Ausdruck "Schutzgruppe" bedeutet im vorliegenden Kontext temporäre Substituenten, die eine potentiell reaktive funktionelle Gruppe vor unerwünschten chemischen Umwandlungen schützen. Beispiele von solchen Schutzgruppen umfassen Ester von Carbonsäuren, Silylether von Alkoholen sowie Acetale und Ketale von Aldehyden und Ketonen. Das Gebiet der Schutzgruppenchemie ist durchgesehen worden (Greene, T.W.; Wuts, P.G.M. Protective Groupr in Organic Synthesis, 2nd ed.; Wiley: New York, 1991).
  • Wenn nichts anderes angegeben ist, verwendet die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung herkömmliche Techniken der Zellbiologie, Zellkultur, der Molekularbiologie, der transgenen Biologie, Mikrobiologie, der rekombinierten DNA und der Immunologie, die dem Fachmann geläufig sind. Diese Techniken sind in der Literatur ausführlich erläutert. Siebe beispielsweise Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. von Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989), DNA Cloning, Vol. I und II (D.N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed., 1984); Mullis et al. US-PS 4 683 195; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds., 1984); Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds., 1984); Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); die Abhandlung Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells Q.H. Miller und M.P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vol. 154 und 155 (Wu et al. eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Vol. I-IV (D.M. Weir und C.C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).
  • (iii) Illustrative Ausführungsbeispiele
  • Nach einem Aspekt sieht die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen vor, die imstande sind, Plasmaspiegel von Anti-αGal(1,3)Gal-("Anti-αGal")-Antikörpern in Primatsubjekten einschließlich Humanpatienten zu verringern. Die Zusammensetzungen sind für die Verabreichung an Patienten gedacht, die auf die Übertragung eines Gewebes oder von Zellen von einem diskordanten Spender, etwa eines Schweineorgans, einer -niere oder eines -herzens vorbereitet werden, oder an Patienten, die bereits solche Transplantate empfangen haben und eine Herabsetzung von Anti-α-Gal-Antikörpern benötigen, um eine Abstoßung oder eine andere Antikörper-abhängige Verschlechterung der Leistungsfähigkeit des Schweineorgans zu verhindern oder zu verringern, z. B. eine hyperakute Abstoßung des Organs zu verringern.
  • A. Beispielhafte Xenopolymere
  • Eine bevorzugte Zusammensetzung der Erfindung ist ein Polymer, das abgeleitet ist aus der Reaktion eines Polymergrundgerüsts, das eine Vielzahl von nukleophilen oder elektrophilen funktionellen Gruppen aufweist, mit einem Xenoantigen, das eine funktionelle Gruppe aufweist, die imstande ist, mit den funktionellen Gruppen zu reagieren, die an dem strukturellen Grundgerüst präsentiert werden, und zwar in Anwesenheit eines Reagenzes, das imstande ist, eine Menge der vorgenannten funktionellen Gruppen für die Reaktion mit der anderen Menge von funktionellen Gruppen zu aktivieren, und zwar sämtlich in Anwesenheit eines Vernetzungsmittels (siehe 25). Bei bestimmten Ausführungsformen werden die komplementären Paare von funktionellen Gruppen aus der Gruppe ausgewählt, die aus den folgenden besteht:
    Amin/Carbonsäure, Alkohol/Alkylhalogenid oder -sulfonat, Thiol/Alkylhalogenid oder -sulfonat, Phosphin/Alkylhalogenid oder -sulfonat, Phosphat/Alkylhalogenid oder -sulfonat und Aldehyd oder Keton/Amin. Geeignete komplementäre Paare von funktionellen Gruppen sind solche, die zwischen dem Antigen und dem Gerüst eine Bindung erzeugen, die unter physiologischen Bedingungen robust ist, z. B. ein Amid, Ether, Thioether oder Phosphat. Bei bestimmten Ausführungsformen weist die Bindung zwischen dem Geräst und dem Antigen einen Amidanteil auf.
  • Das aktivierende Reagenz, d. h. das Reagenz, welches die Bildung der kovalenten Bindung zwischen dem Gerüst und dem Xenoantigen erleichtert, ist jedes Reagenz, das imstande ist, eine nukleophile oder elektrophile funktionelle Gruppe zur Reaktion mit einer komplementären elektrophilen oder nukleophilen funktionellen Gruppe zu aktivieren, um eine neue kovalente Bindung zu bilden. Bei bestimmten Ausführungsformen ist das aktivierende Reagenz ein Dehydrationsmittel, ein Diimid, eine Bronsted-Säure oder -Base, eine Lewis-Säure oder -Base, ein Acylhalogenid oder Phosphorylhalogenid. Bei bestimmten Ausführungsformen ist das Aktivierungs-Reagenz ein Diimid, z. B. Dicyclohexyldiimid [DCC] oder Ethyl-3-(dimethylamino)propyldiimid [EDC].
  • Bei bevorzugten Ausführungsformen hat die Zusammensetzung ein strukturelles Grundgerüst, das ein nicht-immunogenes, pharmakologisch akzeptables Gerüst aufweist, z. B. Polyethylenglycol, das eine Vielzahl von nukleophilen oder elektrophilen funktionellen Gruppen trägt. Das Gerüst ist bevorzugt in dem Molekulargewichtsbereich von 1000 Dalton bis 100.000 Dalton, stärker bevorzugt in dem Bereich von 3000 bis 70.000 Dalton, am meisten bevorzugt in dem Bereich von 5000 bis 30.000 Dalton. Wie in den beigefügten Beispielen beschrieben wird, kann jedoch das Molekulargewicht des polymeren Endprodukts viel höher sein, was primär auf die Vernetzung der Gerüsteinheiten zurückgeht.
  • Die nukleophilen oder elektrophilen funktionellen Gruppen an dem Gerüst sind ausgewählt aus der Gruppe, die aufweist: Amine, Alkohole, Thiole, Selenole, Phosphine, Aldehyde, Ketone, Säurechloride, Ester, Alkylhalogenide und Alkylsulfonate. Bei bestimmten Ausführungsformen ist die funktionelle Gruppe an dem Gerüst ein Amino- oder Carboxylat-Anteil, und die von dem Antigen umfaßte funktionelle Gruppe reagiert damit unter Bildung einer Amidbindung.
  • Das Antigen der vorliegenden Erfindung ist ein Oligosaccharid, von dem bekannt ist, daß es xenoantigen ist, d. h. es wird dem Immunsystem des Subjekts von dem Xenotransplantat präsentiert und ist dafür antigen. Xenoantigene Gruppen können mit Verfahren, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind, ohne weiteres identifiziert werden. Beispielsweise können XNAs aus menschlichem Blut isoliert werden durch Perfusion des Bluts über Xenotransplantatmaterial, Isolieren derjenigen XNAs aus dem Transplantat, die spezifisch daran gebunden wurden, und Nutzen dieser Antikörper zum Screening von Kandidaten-Epitopen, z. B. mittels Immunoassay. Es wurde beobachtet, daß xenoreaktive Human-Antikörper in bezug auf ihre Bindungsspezifität für Oligosaccharide einschließlich des αGal(1,3)Gal-Epitops polymorph sein können, beispielsweise Spezies aufweisen können, die an Di-, Tri-, Tetra-, Penta-Oligosaccharide und solche höherer Ordnung einschließlich des αGal(1,3)Gal-Anteils binden. Bei bestimmten Ausführungsformen sieht daher die Erfindung Xenoantigen-Polymere vor, die von αGal(1,3)Gal-endständigen Oligosacchariden abgeleitet sind und z. B. 1 bis 10 Saccharidreste, stärker bevorzugt 1 bis 5 Saccharidreste aufweisen.
  • αGal-Oligosaccharide der Erfindung umfassen diejenigen Saccharidzusammensetzungen, die zwei oder mehr Saccharidanteile aufweisen, wobei ein Galactose-Anteil durch eine α(1,3)Glycosidbindung mit einem anderen Galactose-Anteil verbunden ist. Bei bevorzugten Ausführungsformen befindet sich das αGal-Motiv (Galα1-3Gal) innerhalb von 15, 10, 5, 4, 3, 2 oder 1 Saccharideinheit(en) von dem nicht-reduzierenden Ende des Oligosaccharids. Bei einer am meisten bevorzugten Ausführungsform repräsentiert das αGal-Motiv das Ende (d. h. das nicht-reduzierende Ende) des Oligosaccharids. Die αGal-Oligosaccharide können eines oder eine Vielzahl von αGal-Motiven aufweisen. Beispielsweise kann das αGal-Oligosaccharid ein verzweigter Kohlenwasserstoff sein, der eine Vielzahl von endständigen Galα-3Gal-Resten hat, oder ein lineares Oligosaccharid sein, das sowohl endständige als auch innere Galα-3Gal-Reste enthält. Zur weiteren Veranschaulichung können die betroffenen Polymere Xenoantigene aufweisen, die durch die allgemeine Formel (I) repräsentiert sind:
    Figure 00360001
    wobei:
    R unabhängig oder bei jedem Auftreten H oder ein C1-C6-Alkyl oder eine andere Hydroxylschutzgruppe repräsentiert und stärker bevorzugt bei jedem Auftreten H repräsentiert;
    R' abwesend ist oder ein Oligosaccharid repräsentiert, das z. B. 1–8 Saccharidreste hat; und
    X eine Bindung oder einen Bindungsanteil repräsentiert, der den Oligosaccharid-Anteil an das Polymergrundgerüst bindet.
  • Bestimmte Versuche haben gezeigt, daß die stärkste Bindung von xenoreaktiven Human-Antikörpern an Oligosaccharide mit einem endständigen α-Galactosylrest die Oligosaccharide αGal(1,3)Gal, αGal(1,3)Galβ, αGal(1,3)Galβ(1,4)GlcNAcβ und αGal(1,3)Galβ(1,4)Glcβ aufwiesen. Siehe beispielsweise Cooper et al. (1994) Immunol Rev 141:31. Daher ist bei bestimmten Ausführungsformen das Xenoantigen durch die allgemeine Formel (II) repräsentiert:
    Figure 00360002
    wobei R und R' wie oben definiert sind.
  • Bei anderen Ausführungsformen ist das Xenoantigen ein endständiges αGal-Saccharid oder Oligosaccharid, repräsentiert beispielsweise durch eine der allgemeinen Formeln (III-VI):
    Figure 00370001
    wobei:
    R1 unabhängig oder bei jedem Auftreten H, -OR, -SR oder -N(H)-Y-R ist;
    R unabhängig oder bei jedem Auftreten H oder ein C1-C6-Alkyl oder eine andere Hydroxylschutzgruppe repräsentiert und stärker bevorzugt bei jedem Auftreten H repräsentiert;
    R2 ein C1-C6-Alkyl ist und stärker bevorzugt CH3 repräsentiert;
    Y unabhängig oder bei jedem Auftreten abwesend ist oder -C(S)-, -S(O)2 oder -C(O)-A- ist;
    X eine Bindung oder einen Bindungsanteil repräsentiert, der den Oligosaccharid-Anteil an das Polymergrundgerüst bindet;
    Z O oder S ist; und
    A -NH-, -NH-(C1-C6-Alkyl)-, -NH-(C1-C6-Alkenyl)-, -O-, -O-(C1-C6-Alkyl)-, -O-(C1-C6-Alkenyl)-, -S-, -S-(C1-C6-Alkyl)-, -S-(C1-C6-Alkenyl)- ist.
  • Bei bevorzugten Ausführungsformen weisen die αGal-Oligosaccharide der Erfindung eine Saccharidsequenz auf, die dem antigenen Glycolipid entspricht, das an Endothelzellmembranen vom Schwein, z. B. vaskulärem Endothel- oder anderem Endothelgewebe von Herz-, Nieren-, Leber- oder Lungengewebe, exprimiert wird. Diese αGal-Oligosaccharide umfassen Galα1-3Gal; Galα1-3Galβ1-4GlcNAc; Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Gal; und Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc.
  • Andere beispielhafte Oligosaccharide zum Einbau in die vorliegenden Xenoantigen-Polymere sind in den 14 bis 23 gezeigt.
  • Ferner zeigen zwar Ergebnisse aus dem Stand der Technik, daß das meiste menschliche xenoreaktive IgM und ein gewisser Anteil an menschlichem xenoreaktivem IgG für das αGal(1,3)Gal-Epitop spezifisch ist, aber einige xenoreaktive Human-Antikörper, die gegen andere Determinanten gerichtet sind, können ebenfalls für die hyperakute Abstoßung verantwortlich sein. Siehe beispielsweise Parker et al. (1995) Transplant Immunol 3:181; Ye et al. (1994) Transplantation 58:330; und Collins et al. (1994) Xenotransplantation 1:36. Bisher sind zusätzlich zu dem αGal(1,3)Gal-Epitop mehrere andere Kohlenwasserstoff-Epitope vom Schwein als mit natürlichen Antikörpern in Humanserum immunreaktiv identifiziert worden, was αGal(1,2)Gal, αGal(1,4)Gal, βGal(1,3)GalNAc und 3-O-sulfatierte Galactose (SO4-3Gal) umfaßt, von denen jedes als ein Xenoantigen zum Einbau in die vorliegenden Polymere verwendet werden kann. Siehe z. B. Holgersson et al. (1990) Biochem 108:766; Holgersson et al. (1991) Glycoconi J 8:172; und Good et al. (1992) Transplant Proc 24:559. Andere berichten von Oligosaccharid-Epitopen für xenoreaktive Human-Antikörper, die A- oder A-ähnliche Kohlenwasserstoffe aufweisen (und zwar A-Disaccharid, A-Trisaccharid, A-Tetrasaccharide und linearen A-Typ 6), Forssman-Disaccharid und -Trisaccharid, α-L-Rhamnose und Rhamnose enthaltende Oligosaccharide sowie βGlcNac enthaltende Oligosaccharide. Siehe Cooper et al. (1993) Transplan Immunol 1:198; und Good et al. (1992) Transplan Proc 24:559. Auf die Möglichkeit von anderen Kohlenwasserstoff-Xenoantigenen deutet ferner die Tatsache hin, daß andere Spezies wie etwa Schweine, Ziegen, Hunde, Ratten usw. – die keine Anti-αGal(1,3)Gal-Antikörper erzeugen – natürliche xenoreaktive Antikörper haben, die vermutlich andere Epitope erkennen. Cameron et al. (1983) J Surg Oncol 22:157. Somit können die betroffenen Xenoantigen-Polymere hergestellt werden unter Verwendung von xenoantigenen Oligosacchariden, die von αGal verschieden sind und beispielsweise mit natürlichen xenoreaktiven Human-Antikörpern kreuzreaktiv sind.
  • Beispiele von modifizierten αGal-Oligosacchariden (d. h. Abkömmlingen), die von der Erfindung ebenfalls abgedeckt sind, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Salze und Sulfatsubstituenten von αGal-Oligosacchariden sowie αGal-Oligosaccharide, in denen einer oder mehrere der Pyranringe mit einem Piperidin-Ringsystem und/oder einem Tetrahydrothiopyran-Ringsystem substituiert worden sind.
  • αGal-Oligosaccharid-Azazucker, bei denen der Sauerstoff von einem oder mehreren der Pyranringe des Oligosaccharids durch Stickstoff ersetzt ist, um ein Piperidin-Ringsystem zu bilden, können mit im Stand der Technik bekannten Methoden hergestellt werden, indem das geeignete Azasaccharid als Akzeptorsubstrat verwendet wird. Alternativ können Azazucker-Anteile des Spenders durch die entsprechende Glycosyltransferase für den natürlichen Zucker transferiert werden. Azaglucose kann aus natürlichen Quellen isoliert und durch die Wirkung einer Galactosyltransferase in Gegenwart eines Galactosespenders wie beispielsweise UDP-Galactose zu Azalactose umgewandelt werden.
  • Die Polymerzusammensetzung der Erfindung kann auch αGal-Oligosaccharidthiozucker aufweisen, in denen beispielsweise der Sauerstoff von einem oder mehreren der Pyranringe des Oligosaccharids durch Sulfur ersetzt ist, um ein Tetrahydrothiopyran-Ringsystem zu bilden. Das Monothiosaccharid kann mit bekannten Techniken der organischen Chemie aus dem entsprechenden Monosaccharid präpariert werden, und der von αGal-Oligosaccharid stammende Thiozucker kann unter Anwendung von enzymatischen Methoden und unter Einsatz des geeigneten Thiosaccharids als Akzeptorsubstrat hergestellt werden.
  • Der Fachmann erkennt ohne weiteres, daß Oligosaccharid-Bibliotheken auf einfache Weise erzeugt werden können und daß die Fähigkeit einzelner Mitglieder der Bibliothek, alleine oder an einem Polymer gezeigt, an xenoreaktive Human-Antikörper zu binden, ohne weiteres bewertet werden kann. Außerdem können solche Bibliotheken genützt werden, um Oligosaccharide zu identifizieren, die xenoreaktive Antikörper zwar selektiv binden, jedoch nicht wesentlich immunreaktiv mit menschlichen Antikörpern (oder solchen eines anderen Wirts) beispielsweise für bakterielle Kohlenwasserstoff-Epitope sind. Auf diese Weise können die Xenoantigene von den vorliegenden Polymeren optimiert werden.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen können die vorliegenden Polymere so abgeleitet werden, daß einzelne Moleküle von Polymer gleichzeitig zwei oder mehr verschiedene Xenoantigene zeigen. Bei anderen Ausführungsformen können die Polymerzusammensetzungen ein Gemisch von verschiedenen diskreten Xenoantigen-Polymeren sein, um ein breiteres Spektrum der XNA-Neutralisierungswirkung zu bieten.
  • In dieser Hinsicht beschreibt McKane et al. (1998) Transplantation 66:626 einen enzymgekoppelten Neoglycoprotein-Immunsorptions-Assay zur Untersuchung der präzisen antigenen Anforderungen für die Bindung von Anti-αGal(1,3)Gal-Epitopen in Humanseren. Diese Studie zeigte eine Antikörper-Heterogenität unter der Bevölkerung. In dieser Studie hatten nahezu zwei Drittel der Individuen IgG, der αGal(1,3)Gal-Di-, -Tri- und -Pentasacchaxide (D bzw. T bzw. P) erkannte, als "DTP-Phänotyp" bezeichnet. Die Häufigkeit anderer Phänotypen war -P13 %; -TP 12 %; D-P 8 %; und DT-1 %. Angesichts des Polymorphismus in dem Anti-αGal(1,3)Gal-Repertoire kann das vorliegende Verfahren einen Schritt aufweisen, bei dem der Anti-αGal-Phänotyp des Patienten bestimmt wird und ein Xenoantigen-Polymer der vorliegenden Erfindung, das αGal-Oligosaccharide, beispielsweise Di-, Tri-, Tetra- und Pentasaccharide aufweist, in einem Verhältnis verabreicht wird, das durch den Phänotyp des zu behandelnden Individuums bestimmt ist, wobei z. B. das Verhältnis an das phänotypische Verhältxs von Anti-αGal-Antikörpern angenähert ist.
  • Bei anderen Ausführungsformen kann das Xenoantigen ein Protein oder einen Peptidylanteil davon aufweisen, der mit einem Xenotransplantat um xenoreaktive Human-Antikörper konkurriert. Zum Beispiel wurde erkannt, daß Anti-Schwein-Antikörper an Proteinkomponenten an der Oberfläche des Transplantats binden. Beispielsweise können HLA-spezifische Antikörper bei hochempfindlichen Patienten eine positive Kreuzprobe gegen Schweinelymphozyten bewirken. Taylor et al. (1998) Transplantation 65:1634.
  • Das Vernetzungsmittel, das zum Erzeugen der vorliegenden Polymere eingesetzt wird, weist bevorzugt wenigstens zwei funktionelle Gruppen auf, die imstande sind, mit dem Gerüst, dem Antigen, der funktionellen Gruppe, die durch die kovalente Bindung des Gerüsts mit dem Antigen gebildet ist, oder jedem oder allen davon zu reagieren. Bei bestimmten Ausführungsformen ist das Vernetzungsmittel sterisch oder elektronisch vordisponiert, oder beides, zur Vernetzung im Gegensatz zu einer Reaktion mit zwei Stellen innerhalb desselben Moleküls (tatsächlich keine Vernetzungsreaktion, sondern eher eine Cyclisierungsreaktion). Bei bestimmten Ausführungsformen wird das Vernetzungsmittel in situ aus einem Vorläufer erzeugt.
  • Bei bevorzugten Ausführungsformen wird das Vernetzungsmittel (48; wobei X eine austretende Gruppe ist) in situ aus N-Hydroxylsulfosuccinimid (47) erzeugt.
  • Figure 00410001
  • Ohne Festlegung auf eine bestimmte Theorie gehen die Anmelder bei bestimmten Ausführungsformen davon aus, daß das Vernetzungsmittel mit den Amidbindungen reagiert, die durch die Reaktion von Aminen an dem Gerüst mit Carboxylaten an den Antigenen gebildet sind; durch 48 repräsentierte Vernetzungsmittel sind bei diesen Ausführungsformen besonders wirkungsvoll. Bei bestimmten Ausführungsformen ist das mittlere Molekulargewicht der Oligomere proportional zu der Reaktionszeit, auch wenn sämtliche funktionellen Gruppen an den Gerüsten mit funktionellen Gruppen an den Antigenen innerhalb der ersten fünfzehn Minuten der Reaktionszeit reagieren. Die Bedeutung des Molekulargewichts wird weiter unten erläutert. Bei diesen Ausführungsformen läuft die Vernetzung weiter, nachdem die Bildung der kovalenten Bindungen zwischen den Gerüsten und Antigenen abgeschlossen ist.
  • Die Polymere der vorliegenden Erfindung können in einer einzigen chemischen Reaktion synthetisiert werden, d. h. durch Einbringen aller erforderlichen Reagenzien in ein einziges Reaktionsgefäß, oder sie können in zwei oder mehr chemischen Reaktionen, die nacheinander durchgeführt werden, synthetisiert werden. Wenn die Polymere der vorliegenden Erfindung durch eine Serie von Reaktionen synthetisiert werden, können die Zwischenverbindungen gereinigt werden, bevor sie der nächsten Reaktion in der Serie unterzogen werden, oder sie können ohne Reinigung eingesetzt werden. Bei bestimmten Ausführungsformen können in Reihe durchgeführte chemische Reaktionen in einem einzigen Reaktionsgefäß bis zum Ende geführt werden, indem beispielsweise zugelassen wird, daß eine bestimmte Gruppe von Reagenzien für einen gewünschten Zeitraum in dem Gefäß reagiert, worauf in das Gefäß die Reagenzien eingebracht werden, die für die nächste Reaktion der Serie erforderlich sind. Bei bestimmten Ausführungsformen weisen die mit diesen verschiedenen Vorgehensweisen erhaltenen Produkte die gleichen molekularen Komponenten auf, unterscheiden sich jedoch hinsichtlich ihrer Eigenschaften oder Wirksamkeit in einem Subjekt oder Assay aufgrund von Unterschieden ihrer mikroskopischen Strukturen, z. B. des Vernetzungsgrads oder der Identitäten, Lokationen oder Verhältnisse der an den Vernetzungsvorgängen beteiligten funktionellen Gruppen. Der Durchschnittsfachmann ist imstande, nur mit üblichen Experimenten das Reaktionsprotokoll und die Bedingungen zu bestimmen, die erforderlich sind, um ein Produkt der vorliegenden Erfindung zu erzeugen, dessen Eigenschaften für einen spezifischen Assay oder ein spezifisches Subjekt optimiert sind.
  • Das Polymer kann also ein Polymer-Grundgerüst aufweisen, das aus Polyethylenglycol- bzw. PEG-Untereinheiten besteht, von denen an einigen ein Saccharid-Anteil angelagert ist, der durch die allgemeine Formel (VII) repräsentiert ist:
    Figure 00420001
    wobei
    R1 unabhägig oder für jedes Auftreten H, -OR, -SR oder -N(H)-Y-R ist;
    R5 H, -OR, NH-Y-R2 oder -L-E ist;
    Y unabhängig für jedes Auftreten abwesend, -C(O)-, -C(NR)-, O, S oder Se ist;
    B für ein Auftreten -R ist und für das andere Auftreten 1 bis 9 Saccharidreste ist;
    R unabhängig für jedes Auftreten H oder ein C1-C6-Alkyl oder eine andere Hydroxylschutzgruppe repräsentiert und stärker bevorzugt für jedes Auftreten H repräsentiert;
    R2 ein C1-C6-Alkyl ist und stärker bevorzugt CH3 repräsentiert;
    X2 einen Linker von 1 bis 10 Atomen Länge, bevorzugt -O-Alkyl, stärker bevorzugt -O-(CH2)5 repräsentiert;
    D H oder -L-E repräsentiert;
    L einen Linker von 1 bis 20 Atomen Länge, bevorzugt
    Figure 00430001
    repräsentiert;
    R6 H oder SO3 ist;
    E eine zweite PEG-Untereinheit des Polymers repräsentiert, wobei unabhängig für jedes Auftreten von E die Linkergruppe L über R5 oder B eines Saccharidanteils der zweiten PEG-Untereinheit oder über ein Amin der zweiten PEG-Untereinheit kovalent angelagert ist.
  • Beispielsweise kann das Polymer durch die allgemeine Formel repräsentiert sein:
    Figure 00430002
    wobei
    R1, R5, B, X2 und L wie oben beschrieben sind, und
    PEG eine Polyethylenglycol(PEG)-Untereinheit des Polymers repräsentiert; und
    X3 eine oder mehrere zusätzliche PEG-Untereinheiten des Polymers repräsentiert, von denen jede mit einem Saccharid-Anteil der Formel VII derivatisiert sein kann,
    wobei das Polymer ein mittleres Molekulargewicht in dem Bereich von 10.000 Dalton bis 1.000.000 Dalton hat.
  • Eine beispielhafte Zusammensetzung der Erfindung ist von einem Octa(amino)polyethylenglycol-Gerüst abgeleitet, an das mehrere αGal(1,3)Gal-Anteile über eine kovalente Bindung gebunden sind, wobei die einzelnen Moleküle des Gerüsts, welche die Disaccharid-Anteile tragen, vernetzt sind, um ein oligomeres Material zu ergeben, das zwei oder mehr Gerüst-Disaccharidmoleküle aufweist.
  • Im allgemeinen werden die Reaktionen des Polyamino-PEG-Gerüsts mit Oligosaccharid im pH-Bereich von 4 bis 7 und am meisten bevorzugt im pH-Bereich von 5 bis 6 ausgeführt. Der bevorzugte Temperaturbereich für die Reaktionen liegt zwischen 0 °C und 40 °C und liegt stärker bevorzugt im Bereich von 4 °C bis 27 °C. Die Beispiele 17 und 20 unterstreichen die Beziehung zwischen dem pH und der Reaktionstemperatur und der Wirksamkeit der erzeugten Zusammensetzung.
  • Es kann ein polares erotisches oder aprotisches Lösungsmittel eingesetzt werden. Wie in den Beispielen beschrieben wird, können die Reaktionen in wäßrigen Lösungen ablaufen. Alternativ können polare aprotische Lösungsmittel wie α-Stickstoff-dialkyliertes Carboxyimid, Lactam, Sulfoxid oder Sulfon wie etwa Dimethylformamid eingesetzt werden. In diesen Fällen können die Reaktionen mit oder ohne Zugabe von Wasser ablaufen, beispielsweise bis zu Mengen, bei denen das Polymer in Lösung bleibt. Nichteinschränkende Herstellungsbeispiele sind in den Beispielen erläutert.
  • Wie in den Beispielen gesagt wird, kann das Molekulargewicht des resultierenden Polymers von Faktoren wie der Reaktionszeit, dem pH, der Temperatur und den Reaktionsmittel-Konzentrationen abhängig sein. In den Fällen, in denen das resultierende Xenopolymer zur Verarmung von xenoreaktiven Antikörpern eingesetzt werden soll, können Polymere mit höherem Molekulargewicht eingesetzt werden, z. B. Polymerzusammensetzungen mit einem mittleren Molekulargewicht von 100.000 bis 1.000.000 Dalton, obwohl der Bereich von 100.000 bis 500.000 Dalton stärker bevorzugt wird und der Bereich von 300.000 bis 500.000 Dalton noch stärker bevorzugt wird.
  • Wenn jedoch das resultierende Xenopolymer wenigstens teilweise als Tolerogen verwendet werden soll, z. B. um eine Toleranz oder Anergie für die Xenoantigene zu induzieren, werden bevorzugt Polymerformulierungen mit niedrigerem Molekulargewicht eingesetzt, z. B. solche mit einem mittleren Molekulargewicht von 10.000 bis 300.000 Dalton, stärker bevorzugt mit einem Molekulargewicht von weniger als 100.000 Dalton, z. B. 25.000 bis 100.000 Dalton. Diese Polymere mit niedrigerem Molekulargewicht haben, selbst wenn sie nicht tolerogen sind, eine verringerte immunogene Wirksamkeit.
  • Ferner können geeignete tolerogene Zusammensetzungen gemäß diesem Aspekt der Erfindung nach den folgenden Kriterien identifiziert werden. Erstens sind sie bevorzugt nicht-immunogen, wenn sie einem Primaten einschließlich einem Menschen verabreicht werden. Bei der praktischen Anwendung kann das bewertet werden durch Vergleichen des Spiegels von Antikörpern, die für ein Kandidaten-Polymer im peripheren Blut eines Primaten einschließlich eines Menschen spezifisch sind, und zwar vor und nach der Verabreichung des Kandidaten-Polymers. Tolerogene Zusammensetzungen gemäß diesem Aspekt der Erfindung können ferner pharmazeutisch akzeptable Träger, Verdünnungsmittel und/oder Mittel zur kontrollierten Freisetzung aufweisen. Bestimmte nicht-einschränkende Beispiele von solchen Trägern, Verdünnungsmitteln und/oder Mitteln zur kontrollierten Freisetzung umfassen gepufferte Kochsalzlösung, Öle, implantierbare Pumpen und umkapselte Kügelchen.
  • In bestimmten Fällen wie etwa für die Formulierungen des Polymers zur therapeutischen Verwendung beim Menschen ist es ferner erwünscht, daß die Zusammensetzung in bezug auf die Polymergröße relativ homogen ist. Das bedeutet, die Polymere können so formuliert werden, daß sie eine enge Molekularverteilung oder Polydispersität gemäß der Definition durch das Verhältnis Mw:Mn haben, wobei Mw das massegemittelte Molekulargewicht des Polymers und Mn das zahlengemittelte Molekulargewicht des Polymers ist. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen haben daher die betreffenden Polymerzusammensetzungen eine Polydispersität für das Xenopolymer von 20 oder weniger, stärker bevorzugt von 10 oder weniger und noch stärker bevorzugt von 5 oder weniger.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen ist das vorliegende Verfahren zum Erzeugen der Xenopolymere der vorliegenden Erfindung Teil eines Gesamtverfahrens zum Herstellen eines Medikaments. Daher wird das Xenopolymer mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Arzneimittelträgern, wie nachstehend beschrieben, in einer Menge und in Konzentrationen formuliert, um wenigstens die effektive Dosis (ED50) zur Verarmung von xenoreaktiven Antikörpern im Patienten zu erzielen, Toleranz oder Anergie für das Xenoantigen zu induzieren. Beispielsweise kann das Polymer so formuliert werden, daß hinsichtlich seines Abgabemodus eine Dosis von wenigstens ED50 für die Inhibierung von HAR an den Patienten verabreicht werden kann.
  • Bei bevorzugten Ausführungsformen haben die Faktor-VIII-Polymere einen therapeutischen Index von wenigstens 10 und stärker bevorzugt wenigstens 100, 1000 oder sogar 10.000 für den speziellen Verabreichungsmodus.
  • Als Teil eines Prozesses zum Herstellen eines Medikaments der vorliegenden Erfindung kann das Polymer unter sterilen Bedingungen synthetisiert und gehandhabt werden oder kann vor der Formulierung sterilisiert werden. Ebenso können Verunreinigungen einschließlich der nichtumgesetzten Reaktionsmittel und Nebenprodukte der Synthese entfernt werden. Das resultierende Medikament sollte steril und im wesentlichen frei von pyrogenen oder anderen toxischen Verunreinigungen sein.
  • Bei einem ersten bevorzugten synthetischen Verfahren wird ein verzweigtes Polymer, das wenigstens drei Arme und wenigstens sechs kovalent gebundene aktive Gruppen wie Amino- oder Hydrazingruppen hat, in Anwesenheit von N-(3-Dimethylaminopropyl)N'-ethylcarbodiimid (EDC) mit Gal α 1,3 Gal umgesetzt, das eine kovalent gebundene Carboxylgruppe hat. Bei einem zweiten bevorzugten Verfahren, das die Umkehrung des ersten Verfahrens ist, hat das verzweigte Polymer kovalent gebundene Carboxylgruppen, wogegen das Gal α 1-3 Gal eine kovalent gebundene Amino- oder Hydrazingruppe hat.
  • Bei einem dritten bevorzugten Verfahren hat das verzweigte Polymer wenigstens drei Arme und wenigstens sechs aktive Gruppen wie Amino- oder Hydrazingruppen, und das αGal(1,3)Gal hat eine kovalent gebundene Aldehydgruppe. Bei einem vierten bevorzugten Verfahren, das die Umkehrung des dritten Verfahrens ist, hat das verzweigte Polymer wenigstens sechs Aldehydgruppen, wogegen das αGal(1,3)Gal eine kovalent gebundene Amino- oder Hydrazingruppe hat. Bei dem dritten und vierten Verfahren ist EDC nicht notwendig, um die Reaktion ablaufen zu lassen.
  • Bei einem fünften bevorzugten synthetischen Verfahren hat das verzweigte Polymer wenigstens drei Arme, wobei wenigstens drei aktive Gruppen wie Amino- oder Hydrazingruppen kovalent an die freien Enden der Arme gebunden sind, und das αGal(1,3)Gal hat eine kovalent gebundene Carboxylgruppe. Bei einem sechsten bevorzugten Verfahren, das die Umkehrung des fünften Verfahrens ist, hat das verzweigte Polymer wenigstens drei koavlent gebundene Carboxylgruppen, während das αGal(1,3)Gal eine kovalent gebundene Amino- oder Hydrazingruppe hat. Das fünfte und das sechste Verfahren werden in Anwesenheit von EDC und N-Hydroxysulfosuccinimid (NHSS) durchgeführt. Die bei dem fünften und dem sechsten Verfahren resultierenden Zusammensetzungen haben eine kovalent gebundene Aktivierungsgruppe, die N-Hydroxysulfosuccinimid ist.
  • "Gemischtarmige" Synthesen können ebenfalls mit allen Arten von Kombinationen von Gruppen an den Enden der Arme, beispielsweise 7 Amino/1 Carboxy oder 5/3 oder 4/4 ausgeführt werden. Im Hinblick auf die Anleitung der folgenden experimentellen Beispiele ist der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der chemischen Synthese imstande, zahlreiche Kombinationen von Reagenzien zu entwickeln, die funktionelle Zusammensetzungen im Rahmen der vorliegenden Erfindung ergeben.
  • Zahlreiche Zusammensetzungen der Erfindung sind in 3 und durchweg in Übereinstimmung mit der folgenden Nomenklatur bezeichnet:
    • – Der Buchstabe E bezeichnet eine Synthese, die nur EDC zum Kuppeln verwendete.
    • – Der Buchstabe N bezeichnet eine Synthese, die sowohl EDC als auch N-Hydroxysuccinimid (NHS) verwendete.
    • – Der Buchstabe S bezeichnet eine Synthese, die sowohl EDC als auch N-Hydroxysulfosuccinimid (NHSS) verwendete.
    • – Der Buchstabe L bezeichnet ein Lysin, das mit den Enden von verzweigtem PEG-Amino gekuppelt ist, und EDC zum Kuppeln.
    • – Die Buchstaben LS bezeichnen eine Synthese, die Lysin und NHSS verwendete.
    • – Die Buchstaben ES bezeichnen eine Synthese, die EDC zum Kuppeln, und eine Sulfogruppe, die mit dem PEG-Ausgangsmataerial gekuppelt war, verwendete.
    • – Die erste Zahl in dem Numerierungssystem bezeichnet die Anzahl von Verzweigungen an dem PEG, und die zweite Zahl (10 oder 20) bezeichnet das Molekulargewicht des Ausgangs-PEG-Amins (10.000 oder 20.000 Dalton).
  • Das Produkt der Synthese 410L erwies sich als 100fach wirksamer pro gekuppeltem Zucker als der freie Zucker (IC50 = 0,5 mg/mL für 410L gegenüber 50 mg/mL für den freien Zucker). Überraschenderweise erzielten die Zusammensetzungen, die unter Einsatz von N-Hydroxysulfosuccinimid (NHSS; NHS mit einer Sulfogruppe) synthetisiert wurden, eine 50 % Inhibierung der Anti-Gal-Antikörper-Reaktionsfähigkeit bei sehr geringen Konzentrationen von ungefähr 10–5 mg/mL bis 10–7 mg/mL. Außerdem waren diese Zusammensetzungen während 12 Monaten stabil, wenn sie bei einem pH im Bereich von 4 bis 7 und bei Temperaturen zwischen 1 und 10 °C gelagert wurden.
  • Bei anderen beispielhaften Ausführungsformen wird das vorliegende Xenopolymer gebildet durch Derivatisieren eines Aminodextrans mit dem Xenoantigen. Bei einem beispielhaften Verfahren zum Herstellen eines Xenoantigen-Konjugats mit einem Aminodextran kann man mit einem Dextranpolymer beginnen. Das Dextran wird mit einem Oxidationsmittel umgesetzt, um eine gesteuerte Oxidation eines Teils seiner Kohlenwasserstoffringe zu bewirken, um Aldehydgruppen zu erzeugen. Die Oxidation erfolgt zweckmäßig mit glycolytischen chemischen Reagenzien, z. B. NaIO4 entsprechend herkömmlichen Vorgehensweisen. Das oxidierte Dextran wird dann mit einem Polyamin wie etwa einem Diamin umgesetzt. Geeignete Amine umfassen beispielsweise Ethylendiamin, Propylendiamin oder ähnliche Polymethylendiamine, Diethylentriamin oder ähnliche Polyamine, 1,3-Diamino-2-hydroxypropan oder andere ähnliche hydroxylierte Diamine oder Polyamine. Eine reduzierende Stabilisierung des resultierenden Zwischenprodukts erfolgt durch Umsetzen des Schiffschen Basen-Zwischenprodukts mit einem reduzierenden Mittel, z. B. NaBH4, NaBH3CN. Das resultierende Addukt kann weiter ausgereinigt werden, indem es durch eine herkömmliche Klassierkolonne geschickt wird, um vernetzte Dextrane zu entfernen. Eine Schätzung der Anzahl von verfügbaren primären Aminogruppen an dem Aminodextran kann erfolgen durch Umsetzen einer gewogenen Probe mit Trinitrobenzolsulfonsäure und Korrelation der optischen Dichte bei 420 nm mit einem Standard. Alternativ kann das Dextran mit herkömmlichen Methoden derivatisiert werden, um Aminfunktionen einzuführen, z. B. durch Reaktion mit Cyanbromid, gefolgt von Umsetzung mit einem Diamin.
  • Andere Polyamine, die in den Xenopolymeren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, umfassen die nicht-antigenen Amin-derivatisierten Polymere der US-PS 5 730 990 von Greenwald et al. und die nicht-antigenen verzweigten Polymerkonjugate der US-PS 5 643 575 von Martinez et al.
  • B. Assays für die kompetitive Inhibierung von αGalXNA
  • Die Quantifizierung von zirkulierenden Anti-αGal-Antikörpern im Serum eines Individuums und die Fähigkeit von Polymeren, Anti-αGal-Antikörper zu entfernen, zu binden und/oder zu neutralisieren, kann routinemäßig bestimmt werden durch Anwendung von bekannten Immunoassays, die routinemäßig für eine solche Bestimmung ausgebildet sein können. Solche Immunoassays umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, kompetitive und nichtkompetitive Assaysysteme mit Anwendung von Techniken wie Western Blots, Radioimmunoassays, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), "Sandwich"-Immunoassays, Immunpräzipitationsassays, Präcipitinreaktionen, Geldiffusions-Precipitinreaktionen, Immundiffusionsassays, Agglutinationsassays (z. B. Hämagglutination), Komplement-Fixierungsassays, Immunradiometerassays, Fluoreszenzimmunoassays und Protein-A-Immunoassays. Diese Assays können ferner angewandt werden, um die zu verabreichende Dosierung der αGal-Oligosaccharidpolymere der Erfindung zu bestimmen und um die Neutralisierung und/oder das Entfernen von Anti-αGal-Antikörpern durch die αGal-Oligosaccharidpolymere der Erfindung zu überwachen.
  • Assays zur Messung von zirkuilerenden Anti-αGal-Antikörpern können durch verschiedene immunologische Verfahren erreicht werden, wobei ELISA-Assays den Vorteil bieten, daß sie für den immobilisierten Liganden standardisierbar sind, quantitativ reproduzierbar sind und durch den Einsatz von geeigneten sekundären Nachweisreagenzien für verschiedene Immunglobulin-Isotypen schematisiert werden können. ELISA-Einfangliganden für die Prüfung von Serumantikörpern von Menschen oder europäischen Affen können fixierte Zellen, Glycolipide, Glycoproteine oder Oligosaccharide verwenden. Solche Einfangliganden umfassen Maus-Laminin, PK-15-Nierenzellen vom Schwein, immobilisierte BSA-αGal-Neoglycokonjugate und immobilisierte αGal-Oligosaccharide. Die kovalente Immobilisierung eines spezifischen αGal-Oligosaccharids an einer immobilisierten ELISA-Oberfläche unter Anwendung von bekannten Techniken erlaubt das vorbestimmte Aufbringen von bekannten antigenen Liganden mittels kovalenter Chemie. Zusätzlich zu der Bestimmung der Fähigkeit der αGal-Oligosaccharidpolymere, an Anti-αGal-Antikörper zu binden und/oder diese zu neutralisieren, ist ein solcher ELISA auch nützlich für die klinische Überwachung von Anti-αGal-Antikörpern im Blut von Patienten vor und nach der Xenotransplantatin von tierischen Organen, die das αGal-Epitop exprimieren.
  • Die Zugabe von seriellen Verdünnungen von Sera in den ELISA-Assays erlaubt die Bestimmung von reaktiven Antikörpertitern, die dazu dienen können, die zirkulierende Anti-αGal-Aktivität zu quantifizieren. Spezifische Immunglobulinisotypen können überwacht werden unter Einsatz geeigneter Reagenzien, z. B. von Anti-Human-IgG oder -IgM.
  • Bei einer anderen Ausführungsform wird die Quantifizierung von Anti-αGal-Antikörpern und/oder der Grad der Neutralisierung oder Entfernung von xenoreaktiven Antikörpern bei Behandlung mit den αGal-Oligosaccharidpolymeren der Erfindung unter Anwendung eines Zytotoxizitäts-Assays der Zellen gemessen. Ein solcher Assay kann aufweisen: In-Kontakt-Bringen von Serum, das von einem Patienten isoliert ist, unter Anwendung von bekannten Techniken, mit αGal exprimierenden Zellmonoschichten, z. B. Schweinenierenzellen (PK-15), aortischen Schweineendothelzellen oder aortischen Mausendothelzellen (MAE). Bevorzugt stammen diese Zellen von derselben Spezies wie der Spender des Xenotransplantats und am meisten bevorzugt von demselben Gewebetyp wie das zu transplantierende Gewebe. Gemäß diesem Assay wird die Zytotoxizität entweder durch endogenes Komplement oder durch die Sera, die mittels Wärme desaktiviert sind (z. B. durch Erwärmen der Sera auf 56 °C für 30 min), vermittelt, und exogenes Komplement (z. B. vom Kaninchen oder Meerschweinchen) wird hinzugefügt. NachAuswaschen von überschüssigem Serum werden die Zellen mit einem lebensfähigen Farbstoffgemisch "lebend/tot" (Calcein-AM/Ethidium-Homodimer) aufbereitet, das in Form eines Lebend/Tot-Zytotoxizitäts-Sets im Handel erhältlich ist (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon), und werden mittels Fluoreszenzmikroskopie auf Lebensfähigkeit ausgezählt. Das Anfärben mit dem "lebend/tot"-Farbstoffgemisch erlaubt eine deutliche Unterscheidung zwischen lebenden Zellen, die cytoplasmische grüne Fluoreszenz zeigen, und toten Zellen, die dunkles Zytoplasma und rot fluoreszierende Kerne zeigen. Das Ausmaß der Zell-Lyse, die Komplement-vermittelt wird, kann bestmmit werden durch Vergleichen der in der Kontrolle beobachteten Ergebnisse, bei der keine Desaktivierung des Komplements erfolgt, wobei die Lyse mit Komplement beobachtet wird, das durch Wärmebehandlung desaktiviert wurde.
  • Die Erfindung umfaßt auch Modellsysteme auf Tierbasis, die Paviane, andere europäische Affen oder andere Tiere umfassen kann, die Serum haben, das Anti-αGal-Antikörper enthält. Solche Tiermodelle können die Fähigkeit von Zusammensetzungen bewerten, die ein αGal-Oligosaccharidpolymer als aktiven Bestandteil enthalten, an Anti-αGal-Antikörper zu binden und/oder sie zu neutralisieren, die Abstoßung eines Xenotransplantats zu mildern, welches das αGal-Epitop exprimiert, und/oder B-Lymphocyten zu unterdrücken, die Anti-αGal-Idiotypen exprimieren. Im allgemeinen kann dieser Assay umfassen, daß Tiermodelle dem αGal-Oligosaccharidpolymer oder einem pharmazeutisch akzeptablen Derivat als aktivem Bestandteil in ausreichender Konzentration und über einen Zeitraum ausgesetzt werden, der ausreicht, um die gewünschte Wirkung bei den exponierten Tieren zu erreichen. Die Antwort der Tiere auf diese Einwirkung kann überwacht werden durch Auswerten des Spiegels von Anti-αGal-reaktiven Antikörpern im Serum des Tiers, Bewerten des Auftretens von Abstoßungen des xenotransplantierten Organs und/oder Quantisieren von B-Lymphozyten, die Anti-αGal-Idiotypen exprimieren. Dosismengen von Testmitteln können durch Ableiten von Dosis-Antwort-Kurven bestimmt werden.
  • Aufgrund der vielen Ähnlichkeiten zwischen den Immunsystemen von Menschen und Pavianen [Neubauer et al., J. Immunogenetics, 8:433-442, 1981; Garver et al., Cytogenetics & Cell Genetics, 27:238-245, 1980; Brodsky et al., Immunogenetics, 155:151-166, 1982; Hammer, C., in Hardy, M.A. (ed.), Xenograft 25, 115-123 (Elsevier New York, 1989); Stark et al., Transplantation 52(6): 1072-1078 (1991); Hammer, C., in Cooper, D.K.C., et al. (eds.), Xenotransplantation, 429-438 (Springer-Verlag 1991)] und wegen der großen Größe von Pavianen sind diese Tiere im Versuchsmodell geeignete Empfänger von Schweineorganen. Diese nicht-menschlichen Primaten exprimieren außerdem Anti-Schwein-Antikörper und stoßen Schweineorgane hyperakut ab [Lexer et al., J. Heart Transplant, 4:411-418, 1986; Ye, Y., Cooper, D.K.C., in Cooper, D.K.C. et al (eds), Xenotransplantation, 389-393 (Springer-Verlag 1991); Cooper et al., J. Heart Transplant, 7:238-246, 1988; Platt et al., Transplantation, 52(2):214-220, 1991]. Da Human- und Pavian-Immunglobuline strukturell sehr ähnlich sind, sollten einige der anti-idiotypischen Antikörper gegen menschliche Anti-Schwein-Antikörper an Pavian-Anti-Schwein-Antikörper binden und die Abstoßung von Xenotransplantaten Schwein-zu-Pavian inhibieren. Geller et al., Transplantation, 55:168-172, 1993, haben beispielsweise einen Idiotyp beschrieben, den Human- und Pavian-Anti-Schwein-Antikörper gemeinsam haben.
  • Durch Anwendung dieser Assays kann die relative Anti-αGal-Bindungsaktivität, die ein αGal-Oligosaccharidpolymer gegen das Anti-αGal-Antikörper-Profil des Serums eines Individuums zeigt, bestimmt werden, und die Polymerformulierung kann bestimmt werden, die am besten zur Neutralisierung und/oder Bindung des Anti-αGal-Profils eines Individuums geeignet ist.
  • Andere Methoden zur Analyse des Grads der xenoreaktiven Antikörper-Neutralisierung und/oder -Entfernung sind dem Fachmann bekannt und liegen im Umfang der Erfindung.
  • C. Formulierungen
  • Pharmazeutische Zusammensetzung, welche die vorliegenden Xenopolymere aufweisen, oder pharmazeutisch akzeptable Derivate davon können einem Patienten, bevorzugt einem Menschen oder einem europäischen Affen, entweder allein oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen, in denen sie mit geeigneten Trägern vermischt sind, in Dosismengen verabreicht werden, die mit der Abstoßung eines Xenotransplantats einhergehende Symptome mildern, das Überleben eines Xenotransplantats in einem Patienten verlängern oder einen komplement-vermittelten lysierenden Angriff auf Zielgewebe oder -zelltypen lenken.
  • Die Verwendung von pharmazeutisch akzeptablen Arzneimittelträgern zur Formulierung der hier angegebenen Verbindungen für die praktische Durchführung der Erfindung in Dosismengen zur systemischen Verabreichung liegt im Rahmen der Erfindung. Bei richtiger Wahl des Trägers und geeigneten Herstellungsschritten können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung und speziell diejenigen, die als Lösungen formuliert sind, parenteral etwa durch i.v. Injektion verabreicht werden. Die Verbindungen können auf einfache Weise unter Verwendung von pharmazeutisch akzeptablen Arzneimittelträgern, die auf dem Gebiet bekannt sind, zu Dosismengen formuliert werden, die für die gewünschte Verabreichungsform geeignet sind.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können unter Anwendung von Techniken verabreicht werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Bevorzugt werden die Mittel systemisch formuliert und verabreicht. Techniken für die Formulierung und Verabreichung der Verbindungen der Erfindung finden sich in "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18th ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA, neueste Ausgabe. Geeignete Verabreichungsrouten können beispielsweise umfassen: die orale, rektale, transmukosale oder intestinale Verabreichung; die parenterale Abgabe einschließlich intramuskulärer, subkutaner, intramedullärer Injektionen, sowie als intrathekale, direkte intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale, intranasale oder intraokulare Injektionen; transdermal, topisch und vaginal. Die bevorzugten Verabreichungsrouten sind mittels i.v. Infusion, i.v. Injektion und i.m. Injektion. Dosisformen umfassen Tabletten, Pastillen, Dispersionen, Suspensionen, Suppositorien, Lösungen, Kapseln, Gele, Syrupe, dünne Breie, Pflaster und Minipumpen. Pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können also auf herkömmliche Weise formuliert werden unter Verwendung von einem oder mehreren physiologisch akzeptablen Trägern, die Arzneimittelträger und Hilfsstoffe aufweisen, welche die Verarbeitung der aktiven Verbindungen zu Präparaten erleichtern, die pharmazeutisch verwendbar sind. Die richtige Formulierung ist von der gewählten Verabreichungsroute abhängig.
  • Für Injektionen können die Mittel der Erfindung in wäßrigen Lösungen formuliert werden, bevorzugt in physiologisch kompatiblen Puffern wie Hank-Lösung, Ringer-Lösung oder physiologischem Kochsalzpuffer. Für die transmukosale Verabreichung werden in der Formulierung Penetriermittel verwendet, die für den Durchtritt durch die zu durchdringende Schranke geeignet sind. Solche Penetriermittel sind im Stand der Technik allgemein bekannt.
  • Für die orale Verabreichung können die Verbindungen ohne weiteres formuliert werden durch eine Kombination der wirksamen Verbindungen mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind. Solche Träger ermöglichen es, daß die Verbindungen der Erfindung als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Syrupe, dünne Breie, Suspensionen und dergleichen für die orale Aufnahme durch einen zu behandelnden Patienten formuliert werden. Pharmazeutische Zubereitungen für den oralen Gebrauch können erhalten werden in Form eines festen Arzneimittelträgers, fakultativ durch Vermahlen eines resultierenden Gemischs, und Verarbeiten des Granulatgemischs nach Zugabe geeigneter Hilfsstoffe, falls gewünscht, zum Erhalt von Tabletten oder Drageekernen. Geeignete Arzneimittelträger sind insbesondere Füllstoffe wie Zucker, was Lactose, Sucrose, Mannitol oder Sorbitol umfaßt; Cellulosepräparate wie beispielsweise Maisstärke, Weizenstärke, Reisstäke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragantgummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxylmethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Falls gewünscht, können Aufschlußmittel zugegeben werden wie etwa das vernetzte Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder ein Salz davon wie Natriumalginat. Drageekerne werden mit geeigneten Überzügen versehen. Zu diesem Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die fakultativ folgendes enthalten können: Gummiarabikum, Talkum, Polyvinylpyrrolidon, Carbopolgel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische. Farbstoffe oder Pigmente können den Tabletten oder Drageeüberzügen hinzugefügt werden zum Zweck der Kennzeichnung oder um verschiedene Kombinationen von wirksamen Dosen einer Verbindung zu charakterisieren.
  • Pharmazeutische Zubereitungen, die oral verwendet werden können, umfassen zusammenschiebbare Kapseln aus Gelatine sowie weiche hermetische Kapseln aus Gelatine und einem Weichmacher, etwa Glycerin oder Sorbitol. Die zusammenschiebbaren Kapseln können die wirksamen Bestandteile in Beimischung mit Füllstoff wie etwa Lactose, Bindemitteln wie etwa Stärken und/oder Schmierstoffen wie Talkum oder Magnesiumstearat und fakultativ Stabilisatoren enthalten. In weichen Kapseln können die wirksamen Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten wie Fettölen, flüssigem Paraffin oder flüssigen Polyethylenglycolen gelöst oder in Suspension sein. Außerdem können Stabilisatoren hinzugefügt sein. Alle Formulierungen für die orale Verabreichung sollten in für diese Verabreichung geeigneten Dosen sein.
  • Für die bukkale Verabreichung können die Zusammensetzungen in Form von Tabletten oder Pastillen vorliegen, die auf herkömmliche Weise formuliert sind.
  • Zur Verabreichung mittels Inhalation werden die Verbindungen zum Gebrauch gemäß der Erfindung zweckmäßig in Form eines Aerosolsprays zur Abgabe aus Druckverpackungen oder Verneblern unter Anwendung eines geeigneten Treibgases, z. B. Freon 12, Freon 11, R21, Kohlendioxid oder eines anderen Gases geliefert. Im Fall eines unter Druck stehenden Aerosols kann die Dosiseinheit bestimmt werden durch Vorsehen eines Ventils, das eine abgemessene Menge abgibt. Kapseln und Kartuschen z. B. aus Gelatine zur Verwendung in einem Inhalations- oder Insufflationsapparat können formuliert werden und enthalten ein Pulvergemisch der Verbindung und eine geeignete Pulverbasis wie etwa Lactose oder Stärke.
  • Die Verbindungen können für die parenterale Verabreichung mittels Injektion formuliert werden, z. B. mittels Bolusinjektion oder Dauerinjektion.
  • Formulierungen zur Injektion können in Einzeldosisform beispielsweise in Ampullen oder in Vielfachdosisbehältern mit einem hinzugefügten Konservierungsmittel bereitgestellt werden. Die Zusammensetzungen können als Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wäßrigen Trägern vorliegen oder können Formulierungsmittel wie Suspensions-, Stabilisierungs- und/oder Dispersionsmittel enthalten.
  • Pharmazeutische Formulierungen für die parenterale Verabreichung umfassen wäßrige Lösungen der wirksamen Verbindungen in wasserlöslicher Form. Außerdem können Suspensionen der wirksamen Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Träger umfassen Fettöle wie Sesamöl oder synthetische Fettsäureester wie Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposome. Wäßrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, welche die Viskosität der Suspension erhöhen, etwa Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbitol oder Dextran. Fakultativ kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder Mittel enthalten, welche die Löslichkeit der Verbindungen steigern, um die Herstellung von hochkonzentrierten Lösungen zu erlauben.
  • Alternativ kann der wirksame Bestandteil in Pulverform zur Konstitution vor dem Gebrauch mit einem geeigneten Träger, z. B. sterilem pyrogenfreiem Wasser, vorliegen.
  • Die Verbindungen können auch in rektalen Zusammensetzungen formuliert sein wie etwa Suppositorien oder Rückhalteklistiere, die z. B. herkömmliche Suppositorienbasen wie Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten.
  • Zusätzlich zu den vorher beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch als ein Depotpräparat formuliert sein. Diese langwirkenden Formulierungen können mittels Implantierung (beispielsweise subkutan oder intramuskulär) oder mittels intramuskulärer Injektion verabreicht werden. So können die Verbindungen beispielsweise mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (z. B. als Emulsion in einem akzeptablen Öl) oder Ionenaustauschharzen oder als schwerlösliche Derivate, etwa als schwerlösliches Salz, formuliert sein.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch geeignete Fest- oder Gelphasenträger oder Arzneimittelträger sein. Beispiele solcher Träger oder Arzneimittelträger umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zucker, Stärken, Cellulosederivate, Gelatine und Polymere wie Polyethylenglycole. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für den Gebrauch bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Zusammensetzungen, in denen die aktiven Wirkstoffe in einer wirksamen Menge enthalten sind, um den gewünschten Zweck zu erreichen. Die Bestimmung der wirksamen Mengen liegt im Können des Fachmanns, insbesondere im Hinblick auf die hier gebotene detaillierte Offenbarung.
  • D. Illustrative therapeutische Verfahren
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Neutralisieren von Anti-αGal-Antikörpern umfaßt die Verabreichung der vorliegenden αGal-Oligosaccharidpolymere oder von pharmazeutisch akzeptablen Derivaten davon in ausreichender Menge, um die Bindung des zirkulierenden Antikörpers an das Spenderendothel zu blockieren und dadurch einen von dem Anti-αGal-Antikörper ausgehenden, Komplement-vermittelten lysierenden Angriff auf das transplantierte Gewebe zu verhindern.
  • Es ist eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen zur Schwächung einer Xenotransplantat-Abstoßung oder zur Milderung von Trauma, das durch eine Anti-αGal-Antikörper-geleitete Komplementaktivierung verursacht ist, durch Störung der Bindung eines Anti-αGal-Antikörpers an Zelloberflächen, speziell an Spenderorgan-Endothel, bereitzustellen. Daher können die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung für sich, gemeinsam mit oder nacheinander mit anderen Therapieregimen verabreicht werden, um das Ausmaß der Bindung von Anti-αGal-Antikörper an Spenderorganzellen oder -gewebe zu verringern.
  • Bei einer spezifischen Ausführungsform wird das therapeutische Verfahren der Erfindung als Monotherapie durchgeführt, d. h. als das einzige Mittel, das zur Milderung der Xenotransplantat-Abstoßung vorgesehen ist.
  • Bei einer anderen Ausführungsform wird die Verabreichung des αGal-Oligosaccharidpolymers der Erfindung mit anderen Regimen kombiniert, welche die Neutralisierung und/oder Verarmung von Anti-αGal-Antikörpern durch Gebrauch der vorliegenden αGal-Oligosaccharidpolymere begleiten können und – ohne darauf beschränkt zu sein – folgendes aufweisen: eine extrakorporale Behandlung mit kolonnen-immobilisierten antitierischen Human-idiotypischen Antikörpern (siehe z. B. die US-PS 5 560 911), Plasmapherese (wobei alle Antikörper oder ein oder mehr spezifische Antikörpertypen, die für antigene Epitope an der Oberfläche von Spender-Endothelzellen spezifisch sind, aus dem Plasma entfernt worden sind) und Perfusion von Blut, das dem Patienten durch Organe, Gewebe oder Zellen zu verabreichen ist, die αGal-Antigene exprimieren (wie beispielsweise Herzen, Nieren, Erythrozyten und Zellinien, die von Schweinenieren, aortischem Schweineendothel, Mausendothel usw. abgeleitet sind).
  • Die Verarmung von zirkulierendem Anti-αGal-Antikörper ist eine kurzzeitige Lösung, welche die HAR-Krise überwinden kann. Aber die Antikörper produzierenden B-Lymphozyten fahren fort, Antikörper zu produzieren, was eine Gefahr für längerfristige, Antikörper-vermittelte Gefäßabstoßung darstellen kann. Diese B-Lymphozyten tragen an ihrer Membranoberfläche Immunglobulin, wobei die αGal-bindende Domäne exponiert ist (Geller et al. (1993) Transplantation 55:168172). Bei bestimmten Ausführungsformen wird das vorliegende Polymer nach seiner Fähigkeit ausgewählt, eine klonale Toleranz für das Xenoantigen zu induzieren. Bei diesen Ausführungsformen kann das Polymer auch in einem Schritt der Neutralisierung und/oder Verarmung von zirkulierenden XNAs eingesetzt werden. Bei anderen Ausführungsformen kann das vorliegende Polymer hauptsächlich als ein Tolerogen verwendet werden, und zirkulierende XNAs können durch Immunapherese oder ein anderes Regime zum Entfernen von Antikörper entfernt werden.
  • E. Gemeinsame Therapien
  • Die Xenopolymere der vorliegenden Erfindung können entweder für sich oder in Kombination mit anderen Mitteln verabreicht werden, die für die Schwächung der Xenotransplantat-Abstoßung nützlich sind, was die folgenden einschließt: herkömmliche nichtspezifische immunsuppressive Mittel wie Steroide, Cyclosporin, Cyclosporin-Analoga, Cyclophosphamidmethylprednison, Prednison, Azathioprin, FK-506, 15-Desoxyspergualin und andere Immunsuppressiva, die im Stand der Technik bekannt sind. Bei einer weiteren Ausführungsform weisen die pharmazeutischen Zusammensetzungen ein antibiotisches Mittel auf, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Tetracyclin, Metronidazol, Amoxicillin, P-Lactarmasen, Aminoglycosiden, Macroliden, Chinolonen, Fluorchinolonen, Cephalosporinen, Erythromycin, Ciprofloxacin und Streptomycin besteht. In einer weiteren Ausführungsform weist die pharmazeutische Zusammensetzung einen Entzündungshemmer auf. Solche Entzündungshemmer umfassen Glucocorticoide und die nicht-steroiden Entzündungshemmer, Aminoarylcarbonsäure-Derivate, Arylessigsäure-Derivate, Arylbuttersäure-Derivate, Arylcarbonsäuren, Arylpropionsäure-Derivate, Pyrazone, Pyrazonone, Salicylsäure-Derivate, Thiazincarboxamide, c-Acetamidcapronsäure, Sadenosylmethionin, 3-Amino-4-hydroxybuttersäure, Amixetrin, Bendazac, Benzydamin, Bucolom, Difenpiramid, Ditazol, Emorfazon, Guaiazulen, Naburneton, Nimesulid, Orgotein, Oxaceprol, Paranylin, Perisoxal, Pifoxim, Proquazon, Proxazon und Tenidap.
  • Kombinationen können entweder gleichzeitig, z.B. als Gemisch, separat aber gleichzeitig oder parallel; oder sequentiell verabreicht werden. Dies umfaßt Darbietungen, bei denen die kombinierten Mittel gemeinsam als ein therapeutisches Gemisch verabreicht werden, und auch Abläufe, bei denen die kombinierten Mittel separat, jedoch gleichzeitig verabreicht werden, beispielsweise durch separate i.v. Leitungen in dasselbe Individuum. Die Verabreichung "in Kombination" umfaßt ferner die separate Verabreichung eines der Mittel, das zuerst gegeben wird, gefolgt vom zweiten Mittel.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen kann die Verabreichung der betroffenen Xenopolymere Teil eines Behandlungsregimes sein, das die Gesamtkörperbestrahlung und Milzentfernung umfaßt. Siehe beispielsweise Cooper et al. (1997) World J Surg 21:901.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen umfassen die vorliegenden Therapien einen oder mehrere Schritte einer reduktiven Rückenmarksbehandlung, speziell dann, wenn das Xenotransplantat Knochenmark oder andere hämopoetische Stammzellenpräparate sind. Ein solches Verfahren kann beispielsweise aufweisen: Behandeln des Subjekts vor dem Einbringen der Spenderstammzellen mit einem cytoreduktiven Mittel, das aus einem oder mehreren der folgenden ausgewählt ist: Alkylierungsmitteln (z. B. Stickstoff-Lost [wie Mechloretamin], Cyclophosphamid, Melphalan und Chlorambucil), Alkylsulfonaten (z. B. Busulfan), Nitrosoharnstoffen (z. B. Carmustin, Lomustin, Semustin und Streptozocin), Triazenen (z. B. Dacarbazin), Antimetaboliten (z. B. Folsäure-Analoga wie Methotrexat), Pyrimidin-Analoga (z. B. Fluorouracil und Cytarabin), Purin-Analoga (z. B. Fludarabin, Idarubicin, Cytosinarabinosid, Mercaptopurin und Thioguanin), Vinca-Alkaloiden (z. B. Vinblastin, Cincristin und Vendesin), Epipodophyllotoxinen (z. B. Etoposid und Teniposid), Antibiotika (z. B. Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Bleomycin, Plicamycin und Mitomycin), Dibrommannitol, Desoxyspergualin, Dimethylmyleran und Thiotepa.
  • Bevorzugte myeloreduktive, nicht-myeloablative Mittel sind Alkylierungsmittel, z. B. Cyclophosphamid, oder Fludarabin oder ähnliche Substanzen, es können aber Zellvermehrungs-Inhibitoren wie DSG oder ein Antimetabolit, z. B. Brequinar, oder ein Anti-T-Zell-Antikörper, z. B. einer oder beide von einem Anti-CD4- oder Anti-CD8-Antikörper, als ein myeloreduktives, nicht-myeloablatives Mittel verwendet werden.
  • Andere Verfahren zur Inhibierung der T-Zellaktivität, die zum Gebrauch bei den hier beschriebenen Verfahren geeignet sein können, umfassen:
    die Verabreichung von Anti-T-Zell-Antikörpern, z. B. eines ATG-Präparats, polyklonaler oder monoklonaler Antikörper gegen CD4, CD8 oder CD2 (besonders nützlich ist ein Anti-CD2-Antikörper, z. B. der monoklonale Anti-CD2-Antikörper BTI-322 oder eine humanisierte Version davon, oder ein Antikörper, der das von BTI-322 erkannte Epitop überlappt oder bindet);
    die Verabreichung eines Mittels, z. B. eines Antikörpers, der einen Pfad, z. B. einen kostimulierenden Pfad der T-Zellaktivierung blockiert oder anderweitig inhibiert (besonders geeignet zum Gebrauch bei diesem Verfahren sind Mittel, z. B. Antikörper, die den CD28-B7-Pfad blockieren, z. B. ein CTLA4-IgG-Fusionsprotein, oder Mittel, z. B. ein Antikörper, der den CD40-gp39-Pfad blockiert, z. B. ein Anti-gp39-Antikörper), oder allgemein die Verabreichung einer Behandlung, einen oder mehrere von dem T-Zellrezeptor, dem CD4-Korezeptor, dem CD8-Korezeptor oder einem anderen Rezeptor oder Korezeptor, der die T-Zellaktivierung oder -Ausreifung herabmoduliert oder anderweitig inhibiert;
    die Verabreichung eines IL-12-Rezeptorproteins (funktionaler Antagonist, US-PS 5 831 007);
    die Verabreichung von substituierten Dihydrobenzofuranen, Spirobenzofuran-2(3H)-Cycloalkanen gemäß US-PS 5 808 109;
    die Verabreichung von Anti-Asialo-Antiseren;
    die Verabreichung eines immunsuppressiven Mittes, z. B. eines Macrolids, z. B. Cyclosporin, FK506 oder Rapamycin; und
    die Verabreichung von Thymusbestrahlung oder einer anderen Behandlung, die Thymusraum schafft.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen umfaßt die myeloreduktive Behandlung das Behandeln des Subjekts mit einem immunsuppressiven Regime vor der Einbringung der Spender-Stammzellen, und zwar in einer Menge, die ausreicht, um die Abstoßung der Spender-Stammzellen durch das Wirts-Immunsystem zu verhindern. Beispielsweise können solche immunsuppressiven Regime unabhängig von der Prä- und Post-Transplantierung, falls beide ausgeführt werden, eine Behandlung des Subjekts aufweisen, die Wirts-T-Lymphocyten und/oder natürliche Killerzellen (NK-Zellen) im Subjekt desaktiviert und/oder verarmt. Beispielsweise umfaßt das immunsuppressive Regime die Behandlung mit T-Zellverarmungs-Anti-CD4- und/oder -CD8-Antikörpern wie etwa Anti-Thymocytglobulin (ATG), OKT3, LO-CD2a oder Minnesota Anti-Lymphoblast-Globulin (MALG). Bevorzugt umfaßt das immnunsuppressive Regime sowohl vor als auch nach der Transplantation die Verabreichung von ATG.
  • Bei anderen Ausführungsformen umfaßt das immunsuppressive Regime die Behandlung mit einem oder mehreren von einem Makrolid-Immunsuppressivum, Azathioprin, Steroiden (z. B. Prednison, Methylprednisolon) oder die sub-letale nicht-myeloablative Bestrahlung von Lymphocyten enthaltendem Gewebe.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen kann das Verfahren auch die Inhibierung von natürlichen Killerzellen des Subjekts, bevorzugt vor dem Einbringen des Xenotransplantats aufweisen, z. B. durch Einbringen eines Antikörpers in das Subjekt, der imstande ist, an natürliche Killerzellen des Subjekts zu binden. Eine Quelle von Anti-NK-Antikörper ist polyklonales Anti-Humanthymocyt-Antiserum. Ein zweiter Anti-Reifungs-T-Zellen-Antikörper kann ebenfalls verabreicht werden, der T-Zellen sowie auch NK-Zellen inhibiert. Anti-T-Zellen-Antikörper sind zusammen mit Anti-NK-Antikörpern in Anti-Thymocyt-Antiserum vorhanden. Wiederholte Dosen von Anti-NK- oder Anti-T-Zellen-Antikörper sind eventuell vorzuziehen. Monoklonale Präparate können bei den Verfahren der Erfindung verwendet werden.
  • Zusätzlich oder alternativ zu Behandlungsprotokollen für den Empfänger kann das vorliegende Verfahren zum Verabreichen eines Xenopolymers mit einer Behandlung des Spenders und/oder des Spendergewebes kombiniert werden.
  • Beispielsweise kann das Xenotransplantat mit glycolytischen Enzymen vor dem Implantieren behandelt werden, um die Anwesenheit des αGal-Epitops zu reduzieren. Die αGal-Epitope können mit spezifischen Endo- oder Exoglycosidasen und Mannosidasen enzymatisch entfernt werden. Diese glycolytischen Enzyme und allgemeine Methoden für ihren Gebrauch sind auf dem Gebiet wohlbekannt. Beispiele von Glycosidasen und Mannosidasen, die zum Gebrauch bei diesem Aspekt der Erfindung geeignet sind, umfassen α- oder β-Galactosidase, β-N-Acetylhexosaminidase, α- oder β-Mannosidase, Endoglycosidase H oder F und Peptid-N-Glycosidase F. Diese Enzyme sind sämtlich im Handel zu erhalten von Oxford Glycosystems (Rosedale, N.Y.), und werden typischerweise entsprechend den Angaben des Herstellers verwendet.
  • Antisinn-RNAs können verwendet werden, um spezifisch die Genexprimierung von beispielsweise α1,3-GT-Aktivität in dem Spendertier zu inhibieren. Bei anderen illustrativen Ausführungsformen kann der Antisinn verwendet werden, um die Humanserum-Reaktivität auf Schweine-Endothelzellen durch Antisinn-vermittelte Abwärtsregulierung der GpIIIa-Exprimierung zu reduzieren (Kearns-Jonker et al. (1997) Transplantation 63:588), und Gewebe von solchen Tieren könnte in Kombination u. a. mit den vorliegenden Xenopolymeren verwendet werden.
  • Ein anderes Verfahren zur Verringerung der Exprimierung von αGal-Epitopen wäre die Durchführung von genetischen Manipulationen, die auf dem Gebiet als "Gendisruption" oder "Gen-Knockout" bezeichnet werden. Gen-Knockout ist eine Methode der Genmanipulation über eine homologe Rekombination. Diese Techniken können die Verwendung von speziell konstruierten DNA-Molekülen (Gen-Knockout-Konstruktionen) ermöglichen, um eine gezielte Desaktivierung (Knockout) eines bestimmten Gens bei Einführung der Konstruktion in eine Zelle zu erreichen.
  • Bei einer Ausführungsform kann die Behandlung eines Xenotransplantat-Empfängers mit den vorliegenden Polymeren mit der Transplantation eines Organs oder Gewebes kombiniert werden, das von solchen transgenen "Knockout"-Tieren abgeleitet ist, beschrieben beispielsweise in der US-PS 5 821 117 mit dem Titel "Xenotransplantation Therapies".
  • Bei anderen Ausführungsformen können die vorliegenden Polymere als Teil eines Behandlungsregimes für Empfänger von xenogenen Transplantaten von transgenen Tieren verwendet werden, die gentechnisch verändert sind, um folgendes zu exprimieren: Human-Zerfallsbeschleunigungsfaktor, wie er etwa von den Tieren isoliert werden kann, die von Cozzi et al (1994), Transplant Proc 26:1402, beschrieben werden; oder die das humane Komplementregulierende Protein CD59 und DAF exprimieren, wie Byrne et al. (1996) Transplant Proc Apr. 1996, 28(2):759 lehrt; Human-α1,2-Fucosyltransferase, die etwa nach Chen et al. (1998) Transplantation 65:832 erzeugt werden kann; ein kombiniertes transgenes Tier, das α-Galactosidase und α1,2-Fucosyntransferase exprimiert, wie sie nach den Methoden von Osman et al. (1997) PNAS 94:14677 erzeugt werden könnte; ein kombiniertes transgenes Tier, das den Zerfallsbeschleunigungsfaktor exprimiert und bei dem das α1,3-TGalactosyltransferase-Gen knockout ist (siehe z. B. van Denderen et al. (1997) Transplantation 64:882.
  • (iv) Beispiele
  • Die allgemein beschriebene Erfindung wird leichter verständlich durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die nur zum Zweck der Veranschaulichung bestimmter Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung angegeben werden.
  • Beispiel 1
  • Synthese von 410S: 4 Arme, Molekulargewicht 10.000, (αGal(1,3)Gal β 1-4cNAc)4-PEG unter Verwendung von EDC und N-Hydroxysulfosuccinimid (NHSS) zum Kuppeln.
  • In einem 500 mL Glasbecher mit Stöpsel wurde 12,5 g 4-armiges PEG-(NH2)4, Molekulargewicht 10.000, 31,25 g EDC, 3,5 g NHSS (Pierce, Rockford, IL 61105) und 7,5 g αGal(1,3)Gal-β-1,4GlcNAc in 250 mL 0,1M MES-Puffer, pH 5,5, aufgelöst. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht auf einem Orbitalschüttler geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde in Dialyseröhrchen mit einem Molekulargewicht-Grenzwert von 3500 abgefüllt und fünfmal gegen 20 L DI-Wasser dialysiert. Das dialysierte Material wurde zu einem gelblichen Pulver gefriergetrocknet. Die Aminogruppenanalyse zeigte, daß mehr als 98 % der Aminogruppen modifiziert waren.
  • Beispiel 2
  • Synthese von 810S: 8 Arme, Molekulargewicht 10.000, αGal(1,3)Gal β 1-4cNAc)8-PEG, unter Verwendung von EDC und NHSS zum Kuppeln.
  • In einen 500 mL Glasbecher mit Stöpsel wurde 12,5 g 8-armiges PEG-(NH2)8, Molekulargewicht 10.000, 62,5 g EDC, 7 g NHSS und 15 g αGal(1,3)Gal-β-1-4GlcNAc in 250 mL von 0,1M MES-Puffer, pH 5,5, aufgelöst. Das Reaktionsgemisch wurde auf einem Orbitalschüttler über Nacht geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde in Dialyseröhrchen mit einem Molekulargewicht-Grenzwert von 3500 abgefüllt und fünfmal gegen 20 L DI-Wasser dialysiert. Das dialysierte Material wurde zu einem gelblichen Pulver gefriergetrocknet. Die Aminogruppenanalyse zeigte, daß mehr als 98 % der Aminogruppe modifiziert waren.
  • Beispiel 3
  • Synthese von 820S: 8Arme, Molekulargewicht 20.000, (αGal(1,3)Gal β 1-4cNAc)8-PEG, unter Verwendung von EDC und NHSS zum Kuppeln
  • In einem 500 mL Glasbecher mit Stöpsel wurde 12,5 g 8-armiges PEG-(NH2)8, Molekulargewicht 20.000, 31,25 g EDC, 3,5 g NHSS und 7,5 g αGal(1,3)Gal-β-1,4GlcNAc in 250 mL 0,1M MES-Puffer, pH 5,5, aufgelöst. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht auf einem Orbitalschüttler geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde in Dialyseröhrchen mit einem Molekulargewicht-Grenzwert von 3500 abgefüllt und fünfmal gegen 20 L DI-Wasser dialysiert. Das dialysierte Material wurde zu einem gelblichen Pulver gefriergetrocknet. Die Aminogruppenanalyse zeigte, daß mehr als 98 % der Aminogruppen modifiziert waren.
  • Beispiel 4
  • Synthese von 410LS: 4 Arme, Molekulargewicht 10.000, acht Lys-gekuppelte Aminogruppen (αGal(1,3)Gal-β-1-4GlcNAc)8-PEG unter Verwendung von EDC und NHSS zum Kuppeln.
  • PEG-(NH2)8 wurde synthetisiert durch kovalentes Kuppeln eines Lysinrests an jedes der Aminenden des 4-armigen PEG, 10.000 MW. Da ein Lysin 2 Aminogruppen und eine Carboxylgruppe enthält, wurde die Carboxylgruppe an die Aminogruppe des PEG gekuppelt, wodurch die Anzahl Aminogruppen an dem PEG verdoppelt wurde.
  • In einem 15 mL Zentrifugenrohr wurde 50 mg 4-armiges PEG-(NH2)8, 10.000 MW, 1000 mg EDC, 100 mg NHSS und 79 mg αGal(1,3)Gal-β-1-4GlcNAc in 3,125 mL von 0,1M MES-Puffer, pH 5,5, aufgelöst. Das Reaktionsgemisch wurde Überkopf für 4,5 h rotiert. Das Reaktionsgemisch wurde in ein Dialyserohr mit einer Molekulargewichtsgrenze von 3500 abgefüllt und fünfmal gegen 4 Liter DI-Wasser dialysiert. Das dialysierte Material wurde gefriergetrocknet und ergab ein gelbliches Pulver. Die Aminogruppenanalyse zeigte, daß mehr als 98 % der Aminogruppen modifiziert wurde.
  • Beispiel 5
  • Synthese von 410SS: 4 Arme, 10.000 MW, vier Aminogruppen αGal(1,3)Gal-β-1-4GlcNAc)4sulfo-PEG unter Verwendung von EDC und NHSS zum Kuppeln.
  • In einem 15 mL Zentrifugenröhrchen wurde 50 mg 4-armiges Sulfo-PEG-(NH2)4, 10.000 MW, 500 mg EDC, 50 mg NHSS und 39,5 mg αGal(1,3)Gal-β-1-4GlcNAc in 3,125 mL von 0,1M MES-Puffer, pH 5,5 aufgelöst. Das Reaktionsgemisch wurde Überkopf für 4,5 h rotiert. Das Reaktionsgemisch wurde in ein Dialyserohr mit einem Molekulagewichts-Grenzwert von 3500 abgefüllt und fünfmal gegen 4 Liter DI-Wasser dialysiert.
  • Beispiel 6
  • Synthese von 610S2: gemischte 8 Arme (6 Aminogruppen und zwei Carboxylgruppen), MW 10.000 (αGal(1,3)Gal-β-1-4GlcNAc)6(sulfo-NHS)2-PEG.
  • In einem 15 mL Kunststoff-Zentrifugenröhrchen wurde 300 mg αGal(1,3)Gal-β-1-4GlcNAc mit 1000 mg EDC, 100 mg NHSS in 6 mL von 0,1M MES-Puffer, pH 5,5, für zwei Stunden inkubiert. 100 mg 8-armiges PEG (6 Aminogruppen und zwei Carboxylgruppen), 10.000 MW, wurden der Lösung zugefügt, und die Reaktion lief für drei Stunden ab, wonach 1000 mg EDC zugegeben wurde und das Reaktionsgemisch über Nacht Überkopf rotiert wurde. Die resultierende Lösung wurde fünfmal gegen DI-Wasser dialysiert und gefriergetrocknet.
  • Beispiel 7
  • Chemische Analyse von synthetisierten Molekülen:
  • 410S wurde für die Elementaranalyse in ein externes Labor gegeben. Die Schwefelanalyse zeigte, daß das Produkt 2,53 % Schwefel enthielt.
  • 810S wurde in drei verschiedenen Puffern gelöst, und die optische Dichte wurde bei 270 nm gemessen. Bei einem pH von 3 war die OD 1,4, bei pH 7 war die OD 1,7, und bei pH 10 war die OD 4,8, was auf den Einbau von Sulfo-beta-Alanineinheiten hinweist. Auch die Gelfiltrationsanalyse unter Verwendung einer Aquagel-OH (Polymer Labs, Amhearst, MA)-Gelfiltrationssäule zeigte, daß alle mit NHSS synthetisierten Produkte starke Adsorption bei 270 nm aufwiesen, was mit dem Molekulargewicht des modifizierten PEG zusammenhing. Dies schloß die Möglichkeit aus, daß die beobachtete Adsorption von einer Verunreinigung des Endprodukts aus dem verwendete NHSS stammte. Die Elementaranalyse von 810S zeigte einen Schwefelgehalt von 2,34 %.
  • Beispiel 8
  • Inhibierung der Wirksamkeit von xenoreaktivem Antikörper (IC50)
  • Prinzip des Assays: Ein Konkurrenz-ELISA wurde so eingerichtet, daß Gal-Moleküle, die an Humanserumalbumin gekuppelt und auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert sind, und Gal-Moleküle, die an PEG gekuppelt sind, für Anti-Gal-Antikörper in Pavianserum konkurrieren. Die an das Gal-HSA bindenden Antikörper wurden sichtbar gemacht unter Verwendung von sekundären Antikörpern zu diesen Antikörpern mit geeigneten Farbentwicklungsmitteln. Die Farbe in dem Fall, in dem kein Gal-PEG hinzugegeben wurde, wurde als 100 % definiert. Die IC50 wurde für 3 als die Konzentration von Gal-PEG definiert, die notwendig ist, um 50 % der Farbentwicklung zu inhibieren, wenn versucht wird, auf der Gal-HSA-Platte immobilisierte Antikörper nachzuweisen. Für 24 ist die IC50 als Masse pro Volumen, z. B. mg/mL, von Polymer definiert.
  • Kurz gesagt wurde eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen mit 100 μl/Vertiefung einer 30 μg/mL-Lösung von αGal(1,3)Gal-β-1-4GlcNAc-Humanserumalbumin (Gal-HSA) beschichtet und für 90 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation mit Gal-HSA wurde die Platte mit 1 % HSA in PBS für 60 min blockiert.
  • Während die Mikrotiterplatte beschichtet und blockiert wurde, wurden Proben wie folgt präpariert: Fünfzehn Lösungen mit unterschiedlicher Verdünnung wurde für 1 Platte präpariert. Die erste Verdünnungslösung war 1 % HSA in PBS. Verdünnungslösungen 3 bis 5 wurden erhalten durch Herstellen einer 2,5 mL Vorratslösung von 10mM αGal(1,3)Gal-β-1-4GlcNAc in 1 % HSA/PBS und anschließendes dreimaliges serielles Verdünnen 1/10. Verdünnungslösungen 6 bis 15 wurden erhalten durch Herstellen einer 2,5 mL Vorratslösung der ersten Konzentration von modifiziertem PEG und anschließendes neunmaliges serielles Verdünnen 1/10 in 1 % HSA in PBS.
  • Die Platte wurde für 90 min bei 4 °C inkubiert. Die Platte wurde fünfmal mit PBS, das 0,5 % Tween 20 enthielt, gewaschen und mit Fließapier getrocknet.
  • Bei der Analyse auf xenoreaktives IgM wurde 100 μl/Vertiefung von Ziege-Antihuman-IgM-Biotinantikörper, verdünnt 1/4000 in 1 % HSA/PBS, zugefügt.
  • Bei der Analyse auf xenoreaktives IgG wurde 100 μl/Vertiefung Ziege-Antihuman-IgG-Biotinantikörper, verdünnt 1/4000 in 1 % HSA/PBS, zugefügt.
  • Der biotinylierte sekundäre Antikörper wurde für eine Stunde bei 4 °C inkubiert, und danach wurde die Platte fünfmal mit PBS, das 0,5 % Tween 20 enthielt, gewaschen und mit Fließpapier getrocknet. Danach wurde 100 μl/Vertiefung Streptavidin-alkalische-Phosphatase-Konjugat in einer Verdünnung von 1/4000 in 1 % HSA/PBS zugefügt und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mikrotiterplatte wurde fünfmal mit PBS, das 0,5 % Tween 20 enthielt, gewaschen und mit Fließpapier getrocknet. 150 μl Entwickler pro Vertiefung wurde zugefügt, und die Platte wurde für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Farbentwicklung wurde durch Zugabe von 40 μl/Vertiefung von 3M NaOH gestoppt. Die Platte wurde in einem Plattenlesegerät mit einer Wellenlänge von 405 nm gelesen.
  • Die IC50-Daten wurden aus der prozentualen Inhibierung aus der Verdünnung der Paviankonttolle in 1 % HSA/PBS errechnet, was diesen höchsten Punkt innerhalb des linearen Bereichs ergab. % Inhibierung = (([OD von BC in HSA]-[OD von BC in αGal(1,3)Gal-β-1-4GlcNAc oder PEG-(αGal(1,3)Gal-β-1-4GlcNAc)x)/OD von BC in HSA)·100
  • Ergebnisse: Wie 24 zeigt, erzielten die unter Verwendung von NHSS erhaltenen Moleküle eine Inhibierung von 50 % der Wirksamkeit des xenoreaktiven Antikörpers in viel niedrigeren Konzentrationen als diejenigen, die unter alleiniger Verwendung von EDC erhalten wurden. 24 zeigt ebenfalls IC50-Werte für zahlreiche verschiedene Polymerformulierungen. Als Versuchsprotokoll ausgedrückt war der einzige signifikante Unterschied zwischen den Experimenten, welche die Daten der 3 und 24 ergaben, die Verwendung einer neuen Pipettenspitze für Zugaben von αGal-Präparaten zu den Vertiefungen der ELISA-Platte, wodurch jede ungewollte Kontaminierung mit höheren Konzentrationen der αGal-Probe vermieden werden sollte. Ferner sind die in 24 angegebenen Werte in Form von Masse pro Volumen und nicht molar. Gemäß 24 hatte das 810S-Präparat einen IC50 von 5 × 10–6 mg/mL im Vergleich mit dem 810E-Präparat mit einem IC50 von 0,1 mg/mL. Beispielsweise erzielte das 810S-Molekül 50 % Inhibierung bei 1 × 10–5M im Vergleich mit dem 810E-Molekül, das für die gleiche Wirkung 1 × 10–1 M benötigte.
  • Beispiel 9
  • Enzymgekoppelte Immunospot-(ELISPOT)Assays
  • Jeder Vertiefung der ersten Spalten einer sterilen Hydrazin-modifizierten Polystyrolplatte mit 96 Vertiefungen (Corning Costar, Cambridge, MA) wurde in einem abgedunkelten kalten Raum 100 μL pro Vertiefung einer Lösung zugefügt, die 3,2 mg/mL αGal(1,3)Gal-β-1-4GlcNAc, 3,1 mg/mL EDC und 2,4 mg/ml NHS enthielt, und die Reaktion lief für vier Stunden ab. Nach sorgfältigem Waschen mit sterilem H2O wurden die Platten vollständig mit Kunststoffstreifen abgedeckt und bei 4 °C bis zum Gebrauch gelagert. Die Platten wurden mit 400 μl/Vertiefung von sterilem PBS/1 % HSA für 2 h bei 37 °C blockiert. Einkernige Zellen von peripherem Blut wurden mit Ficoll-Hypaque (relative Dichte 1,077 g/mL; Pharmacia fine chemicals, Piscatawy, NJ) Dichtegradienten bei 400 g für 30 min bei 22 °C isoliert. Einkernige Zellen niedriger Dichte an den Grenzflächen wurden geerntet, zweimal mittels Zentrifugierung (400g für 10 min) gewaschen und erneut in serumfreier kompletter Nährlösung suspendiert, die aus RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY), supplementiert mit 1 % HSA, 2mM L-Glutamin und 100 E/mL Penicillin/100 μg/mL Streptomycin (GIBSO, Grand Island, NY) bestand. Manuelle Hämocytometer-Zellzählungen und Bestimmungen der Lebensfähigkeit wurden durchgeführt unter Verwendung von Trypanblau-Ausschlußfarbstoff. Danach wurden serielle Verdünnungen von PBMNCs (beginnend mit 5 × 105 Zellen) in 100 μl serumfreier kompletter Nährlösung jeder Vertiefung zugefügt und für 18 bis 24 h bei 37 °C in 5 % CO2 inkubiert. Nach achtmaligem Waschen unter Verwendung von PBS/0,1 % Tween 20 wurden die Platten mit biotinylierten isotyp-spezifischen Ziegen-Antihuman-Antikörpern (Biotin-Ziege-Antihuman-IgM (Cat#62-7540; Biotin-Ziege-Antihuman-IgG (H&L) Cat#62-7140, Zymed, San Francisco, CA) (1:1000) bei 37 °C für 4 h inkubiert. Nach dem Waschen wurde für 30 min bei 37 °C Streptavidin-konjugierte alkalische Phosphatase (Cat# 43-4322, Zymed, San Francisco, CA) (1:1000) zugegeben. Schließlich nach zusätzlichem achtmaligem Waschen mit PBS/0,1% Tween-20 wurde Brom-4-chloro-3Indolylphosphat (Cat# B-8503, Sigma, St. Louis, MO), gelöst in 1 % niedrigschmelzender Meeresplaque-Agarose (FMC Bioproducts, Cat#50101), als Gelsubstrat jeder Vertiefung zugefügt. Die Platten wurden über Nacht in der Dunkelheit bei Raumtemperatur inkubiert, und einzelne Absekretierende, Tüpfel bildende Zellen (ASC) wurden mit niedriger Vergrößerung unter Verwendung eines Mikroskops mit umgekehrter Phase sichtbar gemacht, analysiert und gezählt. Die Daten repräsentieren die gesamten Isotyp-spezifischen Anti-gal-Ab sekretierenden Zellen/106PBMNCs, errechnet aus seriell verdünnten Zellproben.
  • Die kurzzeitigen in vitro Effekte von TPC an von peripherem Blut abgeleiteten ASCs:
    Die kurzzeitigen in vitro Effekte von TPC an ASCs von peripherem Blut wurden bewertet durch Inkubation (2 h bei 37 °C mit Rotation von 6 U/min) von heparinisiertem peripherem Blut von einem normalen Spender in An- oder Abwesenheit von 50 μg/mL TPC (410S). Nach 2 h wurden einkernige Zellen sowohl von den unbehandelten als auch den TPC-behandelten Blutproben gewonnen und auf ASCs analysiert. TPC allein schien keine Wirkung auf die Gesamtzellausbeute und Lebensfähigkit oder auf die Zahl von nachweisbaren ASCs zu haben (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, daß unter diesen in vitro Kulturbedingungen TPC anscheinend nicht cytotoxisch für eine bestimmte einkernige Zellpopulation (T-Zellen, B-Zellen und Monocyten/Makrophagen) von peripherem Blut ist und keine direkte inhibierende oder stimulierende Wirkung auf Anti-Gal-ASC hat.
  • Wirkung von TPC auf T-Zell-unabhängige Aktivierung von Anti-Gal-B-Zellen:
    Gereinigte CD19+ B-Zellen wurden durch positive Selektion durch Verwendung von Anti-CD19+ immunmagnetischen Perlen (PanB (CD19); Dynal, Lake Success, NY) erhalten. Die erhaltene B-Zellpopulation war >95 % reaktionsfähig mit dem Anti-CD20-mAB (CD20-PE, Klon L27; Becton Dickinson, San Jose CA). Gereinigte CD19+ B-Zellen (1 × 105/Vertiefung) wurden mit formalinisierten Staphylococcus-aureus-Zellen (SAC, Cowan-Strain, Calbiochem) (1:10.000) plus IL-2 (50 ng/mL), IL-4 (50 ng/mL) (R&D Systems, Minneapolis, MN) und Anti-CD40 (1 μg/mL, Cat#33070D; Pharmingen, San Diego, CA) in Rundbodenkulturplatten mit 96 Vertiefungen (Corning) in 0,2 mL RPMI 140-Medium, das ergänzt war mit 10 % Human-AB-Serum (Anti-Galverarmt), 2mM L-Glutamin, 25mM Hepes und 100 E/mL Penicillin/100 μg/mL Streptomycin (GIBCO, Grand Island, NY) in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 für 5 Tage gezüchtet. Zur Untersuchung der Wirkungen von TPC auf xenoreaktive ASC wurden die B-Zellen mit TPC (410S; 1 mg/mL) für 30 min bei 37 °C vorbehandelt und dann nach ausgiebigem Waschen den Kulturen zugefügt. Bei einigen Experimenten wurde 50 μg/mL TPC (410S) den Kulturen direkt bei der Initiation und danach täglich zugefügt. Nach der fünftägigen Kulturperiode wurden die Zellen ausgiebig gewaschen, gezählt, die Lebensfähigkeit bestimmt und die Anzahl von ASC bestimmt unter Anwendung des Anti-Gal-ELISPOT-Assays. Im Vergleich zu nicht mit TPC behandelten Kulturen schien TPC keine Wirkung auf die Gesamtzellausbeute und Lebensfähigkeit oder auf die Zahl von nachweisbaren ASCs zu haben (Daten nicht gezeigt).
  • Beispiel 10
  • Effekt von TPC auf xenoreaktive Antikörperspiegel in cynomolgosen Affen
  • TPC-Molekül 410S wurde wie in Beispiel 1 beschrieben präpariert. 410S- oder PEG-Kontrolle wurde cynomolgosen Affen in Dosen von entweder 50 mg oder 250 mg jeden dritten Tag über zwei Wochen verabreicht. Blut für Serum wurde vor und nach jeder Verabreichung entnommen. Während der anschließenden Periode von 2 Wochen wurde jeden Montag und Freitag Blut entnommen. Serumproben wurden auf xenoreaktiven IgG (X IgG) und xenoreaktiven IgM (X IgM) analysiert.
  • Die Ergebnisse sind für IgM in 4 und für IgG in 5 gezeigt. Im Fall der Anti-Gal-IgM-Spiegel reduzierten sowohl die 50-mg- als auch die 250-mg-Dosen den Spiegel dramatisch im Vergleich mit Kontrolltieren, die mit dem blockierten PEG behandelt wurden. Nach 6 TPC-Behandlungen war der IgM-Spiegel bei der 250-mg-Dosis ungefähr 5 % des ursprünglichen Spiegels, und der IgM-Spiegel bei der 50-mg-Dosis war ungefähr 15 % des ursprünglichen Spiegels. Dieser niedrige Anti-Gal-IgM-Spiegel blieb auch erhalten, nachdem die Dosierung mit TPC beendet war. Tatsächlich lag er 15 Tage nach der Behandlung der Spiegel bei den 250-mg-Tieren bei durchschnittlich 15 % des ursprünglichen Spiegels. Bei den 50-mg-Tieren war der Spiegel ungefähr 40 % des ursprünglichen Spiegels. Diese Daten weisen deutlich darauf hin, daß TPC IgM-Spiegel verringern kann und daß diese Verarmung eine lang anhaltende Wirkung hat. Ähnliche Daten wurden bei den Anti-Gal-IgG-Spiegeln erhalten, obwohl die Wirkung nicht so dramatisch war und keine so offensichtliche Dosis-Antwort-Wirkung auftrat. Die Gründe hierfür sind nicht klar, es ist aber wichtig zu erkennen, daß die wichtigsten Antikörper in bezug auf die hyperakute Abstoßung diejenigen der IgM-Klasse sind.
  • Beispiel 11
  • TPC-Behandlung bei diskordantem Xenotransplantat in cynomolgosen Affen
  • Das TPC-Molekül 410S wurde wie in Beispiel 1 beschrieben präpariert. Drei Affen erhielten 250 mg TPC (#19-97, 18-97, 21-97), und zwei Affen erhielten 250 mg Kontrollvehikel (#28-97, 23-97) jeden dritten Tag für zwei Wochen (insgesamt 6 Dosen/Tier) mittels i.v. Infusion. 250 mg/5 mL pro Phiole wurden als sterile Lösung geliefert zur Injektion in 50 mL sterile physiologische Kochsalzlösung in einem i.v. Beutel und i.v. mit einer Rate von ungefähr 2-3 mL/min i.v. verabreicht. Vor der Verabreichung und 15 bis 60 Minuten nach Beendigung der Verabreichung wurde 1 bis 3 mL Blut für Serum von jedem Affen an einer Stelle entnommen, die von der Verabreichungsstelle entfernt war. Am Tag der 6. Dosis erhielt jeder Affe nach der Arzneimittelinfusion eine heterotopische Herztransplantation. Ein Herz von einem transgenen Schwein, das Human-CD59 und Human-CD55 exprimiert, wurde in der abdominalen Position plaziert, wie beschrieben (Byrne et al., 1997, Transplantatin 63:149-155), und verblieb dort bis zu 6 Stunden, bevor es entnommen wurde.
  • Anschließend an die Transplantation und Explantation erhielten die Affen weiterhin wie oben eine Infusion entweder von TPC oder Kontrollvehikel, und zwar einmal täglich über 9 Tage. Blut für die Serumanalyse wurde vor und nach jeder Verabreichung entnommen. Die Affen wurden für wenigstens 15 Tage nach Beendigung der TPC-Verabreichung überwacht, und Blut wurde zweimal wöchentlich für die Serumanalyse entnommen. Ein Affe starb 2 Tage nach der Transplantation.
  • Die Ergebnisse sind in den 6 bis 9 gezeigt.
  • Das Kontrolltier (Cyno 23-97, siehe 6) erfuhr eine 28fache Steigerung der IgG-XNA-Spiegel und eine 25fache Steigerung der IgM-XNA-Spiegel nach der Transplantation. Es ist am wahrscheinlichsten, daß dies auf Stimulation von B-Zellen durch das Schweineherz zurückging, die IgM-Anti-Gal-Antikörper produzieren, um sich in IgM-XNA-erzeugende Plasmazellen zu differenzieren, und auf die Stimulation von B-Zellen zurückging, die IgM-Anti-Gal-Antikörper erzeugen, um die Klasse zu ändern und IgG-XNA-erzeugende B-Zellen zu werden und dann zu IgG-XNA-erzeugenden Plasmazellen zu differenzieren. Im Gegensatz dazu hielten die Affen, die TPC empfinden, niedrige Spiegel von xenoreaktiven Antikörpern während der 9 Tage der TPC-Verabreichung nach der Explantation des Schweineherzens. Nach Beendigung von TPC stiegen die XNA-Spiegel an, aber nicht so dramatisch wie bei der nicht-TPC-behandelten Kontrolle.
  • Beispiel 12
  • In vivo Effekte der TPC-Verabreichung auf zirkulierende Anti-Gal-ASC:
  • Zur Untersuchung der in vivo Antwort von zirkulierenden Anti-Gal-ASC auf die Verabreichung von TPC wurde die Anzahl ASC pro 106 einkernige Zellen aus peripherem Blut gemessen, die von cynomologen Affen isoliert wurden, die entweder mit TPC (410S) oder blockiertem PEG als Kontrolle behandelt wurden. Blockiertes PEG ist ein 4-Arm-, 10.000 MW-PEG-Amin, das mit Essigsäureanhydrid umgesetzt wurde, um die Amingruppen des PEG zu blockieren. Kurz gesagt, wurden heparinisierte periphere Blutproben (2 bis 3 mL) von mit TPC und PEG behandelten Affen vor der Durchführung des Experiments, nach 6 Dosen von TPC, 7 Tage nach der Schweineherztransplantation mit täglichen Infusionen, 7 Tage nach Beendigung der Infusion und 18 Tage nach der Infusion gewonnen. Einkernige Zellen wurden mittels Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugierung isoliert und auf Anti-Gal-IgM- und -IgG-ASC analysiert unter Anwendung des ELISPOT-Assays, wie in Beispiel 9 beschrieben. Zirkulierende Anti-Gal-ASC-(IgM und IgG)Mengen wurden nach 6 Dosen TPC über 18 Tage 70 bis 99 % inhibiert; wogegen die PEG-Behandlung in einer mäßigen (9-35 %) Abnahme in IgM-ASC resultierte ohne signifikante Änderungen der Anzahl von IgG-ASC (2 und 3). Am Tag 7 nach der Transplantation (transgenes Schweineherz) nahmen zirkulierende IgM- und IgG-ASC-Spiegel 98,5-100 % bzw. 70-99,7 % bei Affen ab, die täglich mit TPC behandelt worden waren. Dagegen stieg die Zahl von IgG-ASC in dem PEG-behandelten Tier 14,9fach an ohne nachweisbare Änderung der Anzahl von IgM-ASC. Sieben Tage nach Abschluß der TPC-Behandlung, 14 Tage nach der Transplantation waren zirkulierende IgG- und IgM-ASC 27-84 % bzw. 1,3-9,8 % von Grundlinienwerten. Bei dem PEG-behandelten Affen waren IgG-ASC 4,4 über der Grundlinien, und IgM-ASC-Spiegel waren 51 % reduziert. IgG-ASC-Werte von TPC-behandelten Affen kehrten jedoch 18 Tage nach TPC-Beendigung auf nahezu normale Grundlinienwerte zurück, wogegen die Anzahl IgG-ASC bei dem PEG-behandelten Affen erhöht blieb (5,3fach über Grundlinie). Insgesamt weisen diese Ergebnisse darauf hin, daß TPC für die Abnahme von Anti-Gal-ASC aus dem Kreislauf während der Behandlung und für mehrere Wochen nach der Behandlung hochwirksam ist.
  • Beispiel 13
  • Wirkung von TPC auf xenoreaktiven Antikörperspiegel bei Pavianen
  • Das TPC-Molekül 410S wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisch hergestellt. Die Paviane wurden zuerst der Immunapherese unterzogen unter Verwendung von αGal-Säulen, um im Kreislauf befindliche αGal-Antikörper zu entfernen und eine Grundlage zum Vergleich der Fähigkeit von TPC herzustellen, αGal-Antikörper aus dem Kreislauf zu entfernen.
  • Paviansubjekte waren nach den Bundesrichtlinien für Forschungseinrichtungen, in denen Experimente mit Tieren durchgeführt werden, untergebracht und versorgt. Diese Richtlinien sind als Publikation #86-23 der National Institutes of Health (NIH) unter dem Titel The Guide for Care and Use of Laboratory Animals veröffentlicht.
  • Die Vorgehensweisen für die Behandlung und das Transplantieren der Paviane sind in Shu S. Lin et al., Transplant Immunol. 5:212-218, 1997 beschrieben. Beschreibungen von Verfahren zum Herstellen von αGal-Kolonnen sind in den US-PS'en 5 695 759 und 5 651 968 beschrieben, die hier summarisch eingeführt werden. Kurz gesagt, wurde jedes Paviansubjekt für eine Plasmabehandlung vorbereitet durch die Einleitung der Anästhesie mit Ketamin HCl und Pentamin, und die Betäubung wurde dann während sämtlicher Prozesse unter Inhalation und ForaneTM-Gas beibehalten. Der Blutstrom des Subjekts wurde mittels intravenöser Punktion aseptisch an eine Plasmapheresemaschine angeschlossen, die das Plasma von den Zellen und Plättchen trennte. Das Plasma wurde aseptisch einer αGal-Kolonne zugeführt; der Abfluß aus der Säule wurde online gepumpt und erneut mit den Zellen und Plättchen vermischt und in das Subjekt reinfundiert. Dieser Ablauf wurde kontinuierlich mit 2 bis 3 Plasmavolumen durchgeführt. Die Blutdurchflußrate von 75 bis 100 cm3/min (bei einer Plasmadurchflußrate von 35 bis 40 cm3/min) wurde von dem Subjekt gut toleriert. Der gesamte Kolonnenvorgang dauerte 1 bis 1,5 h.
  • 250 mg TPC (410S wie in dem obigen Beispiel 1 beschrieben) wurde verabreicht, wie in den 12 und 13 angegeben.
  • Resultate:
  • Pavian 377-96 (14)
  • Die Immunapherese #1 entfernte 75 % IgM-αGal-Antikörper aus dem Kreislauf. Fünf Tage später stiegen die IgM-XNAs erneut auf ungefähr 80 % der Spiegel vor der Behandlung. Ein zweiter Immunapheresevorgang brachte zirkulierende IgM-XNAs auf 25 % der Vorbehandlungsspiegel. Einen Tag später stiegen die XNAs wieder auf ungefähr 55 % der Ausgangsspiegel. Eine dritte Immunapherese brachte die XNA-Spiegel auf 30 % der Grundlinienwerte, und eine anschließende Infusion von 250 mg TPC nach der Immunapherese resultierte in nichtnachweisbaren Spiegeln von IgM-XNAs. Drei Tage später waren die IgM-XNA-Spiegel erneut auf ungefähr 15 % der Spiegel vor der Behandlung gestiegen. Das Tier entwickelte eine Infektion am Ort des Katheters, und das Experiment wurde beendet. Diese Daten zeigten, daß TPC mindestens ebenso wirksam und vielleicht wirksamer zur Verringerung von zirkulierenden IgM-XNA-Spiegeln war gegenüber der Immunapherese.
  • Pavian 376-96 (15)
  • Die Immunapherese #1 reduzierte zirkulierende IgM-XNA-Spiegel auf 40 % der Vorbehandlungsspiegel. Zwei Tage später wurde ein erneuter Anstieg auf ungefähr 50 % der Vorbehandlungsspiegel beobachtet, und nach einer zweiten Immunapherese plus Verabreichung von 250 mg TPC waren zirkulierende IgM-XNA-Spiegel nicht nachweisbar. Drei Tage später erfolgte ein erneuter Anstieg von IgM-XNA auf 35 % der Vorbehandlungsspiegel, und die Verabreichung von 250 mg TPC brachte diese Spiegel auf ungefähr 5 %. Sechs anschließende Verabreichungen von 250 mg TPS jeden 3. oder 4. Tag brachten zirkulierende Spiegel von IgM-XNA jedesmal niedriger, und es wurde ein weniger dramatischer Wiederanstiegseffekt beobachtet. Am Tag 31 wurde in den Pavian eine Niere von einem transgenen Schwein transplantiert, die Human-CD59, Human-CD46 und Human-DAF exprimierte, und eine zweiseitige Nephrektomie wurde an den eigenen Nieren des Pavians durchgeführt. Daher war der Pavian für die physiologischen Funktionen von den Schweinenieren abhängig. Die transplantierte Niere zeigte primäre Nichtfunktion, und der Pavian wurde am Tag 4 nach der Operation euthanasiert. Die pathologische Analyse der explantierten Niere zeigte keine Anzeichen von hyperakuter Abstoßung.
  • Beispiel 14
  • Großtechnische Einstufen-Herstellung unter Verwendung von NHSS
  • In einem Ein-Liter-Glasbecher werden 25 g 8-Arm-PEG-NH2, MW 10.000, 30 g Trisaccharid Free Acid und 14 g NHSS durch Zugabe von 500 ml von 0,1M MES-Puffer, pH 5,5, aufgelöst. Wenn sämtliche Komponenten gelöst sind, werden der Lösung 125 g EDC zugefügt. Die Lösung wird in einer Stufe-2-Haube bei Umgebungstemperatur für wenigstens 12 h gerührt.
  • Die Diafiltrationsvorrichtung wird nach Maßgabe der Anweisungen des Herstellers eingerichtet und sterilisiert. Das Diafiltrationssystem wird entleert und mit keimfreiem Wasser gespült, bis der pH sowohl des Permeat- als auch des Retentatstroms zwischen pH 5,5 und 7,0 ist. Mindestens 5 Pufferaustauschvorgänge werden gegen sterile Kochsalzlösung ausgeführt. Der Ballonanschluß wird abgeklemmt, und die Luftfilterleitung wird geöffnet. Die diafiltrierte Lösung wird auf ein Drittel des ursprünglichen Volumens eingeengt. Das Volumen wird auf 750 mL sterile Kochsalzlösung erhöht und durch ein 0,2μm-Filter sternfiltriert und bei 4 °C aufbewahrt.
  • Beispiel 15
  • Produktwirksamkeit als Funktion der NHSS-Konzentration bei der Einstufen-Synthese
  • In fünf 15-mL-Zentrifugenröhrchen wurden 250 mg PEG-(NH2)8 mit einem Molekulargewicht von 20.000, 150 mg GalGalGlcNAc, 625 mg EDC und 90 mg, 70 mg, 50 mg, 30 mg bzw. 10 mg NHSS jeweils in 5 mL von 50mM MES-Puffer, pH 5,5, gelöst, und die Reaktionen über Nacht ausgeführt. Die jeweiligen Lösungen wurden gegen DI-Wasser mit vier Wechselvorgängen dialysiert und lyophilisiert. Die ungefähren IC50's wurden wie oben beschrieben gemessen und sind nachstehend aufgeführt.
    NHSS [mg] IC50 [mg/mL]
    10 5 × 10–3 mg/mL
    30 1 × 10–3 mg/mL
    50 5 × 10–5 mg/mL
    70 5 × 10–6 mg/mL
    90 2 × 10–6 mg/mL
  • Beispiel 16
  • Produktwirksamkeit als Funktion der Zuckerkonzentration bei der Einstufen-Synthese
  • In fünf 15 mL Zentrifugenröhrchen wurde 250 mg PEG-(NH2)8, Molekulargewicht 20.000, 650 mg EDC, 70 mg NHSS und 210 mg, 150 mg, 125 mg, 100 mg bzw. 75 mg GalGalGlcNAc jeweils in 5 mL, von 50mM MES-Puffer, pH 5,5, gelöst und die Reaktionen über Nacht durchgeführt. Die jeweiligen Lösungen wurden gegen DI-Wasser mit vier Austauschvorgängen dialysiert und lyophilisiert. Die ungefähren IC50's wurden wie oben beschrieben gemessen und sind nachstehend angegeben.
    Zucker [mg] IC50 [mg/mL]
    210 5 × 10–6 mg/mL
    150 5 × 10–6 mg/mL
    125 4 × 10–5 mg/mL
    100 8 × 10–4 mg/mL
    75 1 × 10–3 mg/mL
  • Beispiel 17
  • Produktwirksamkeit als Funktion des pH bei der Einstufen-Synthese
  • In sechs 15 mL Zentrifugenröhrchen wurden 250 mg PEG-(NH2)8, Molekulargewicht 20.000, 625 mg EDC, 70 mg NHSS und 150 mg GalGalGlcNAc in 5 mL von 50mM MES-Puffer, pH 5, 5,5 und 6, und 0,1M MOPS Puffer pH 7 bzw. 7,5 und zusätzlich in DI-Wasser gelöst. Die Reaktionen wurden über Nacht durchgeführt. Die jeweiligen Lösungen wurden gegen DI-Wasser mit vier Austauschvorgängen dialysiert und lyophilisiert. Die ungefähren IC50's wurden wie oben beschrieben gemessen und sind nachstehend angegeben
    pH IC50 [mg/mL]
    5 5 × 10–6 mg/mL
    5,5 5 × 10–6 mg/mL
    6 5 × 10–6 mg/mL
    7 9 × 10–1 mg/mL
    7,5 6 × 10–3 mg/mL
    DI-Wasser 1 × 10–5 mg/mL
  • Beispiel 18
  • Produktwirksamkeit als Funktion der EDC-Konzentration bei der Einstufen-Synthese
  • In sieben 15 mL Zentrifugenröhrchen wurden 250 mg PEG-(NH2)6, Molekulargewicht 20.000, 70 mg NHSS, 150 mg GalGalGlcNAc und 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 625 mg und 800 mg EDC jeweils in 5 mL von 50mM MES-Puffer, pH 5,5, gelöst. Die Reaktionen wurden über Nacht durchgeführt. Die jeweiligen Lösungen wurden gegen DI-Wasser mit vier Austauschvorgängen dialysiert und lyophilisiert. Die ungefähren IC50's wurden wie oben beschrieben gemessen und sind nachstehend angegeben.
    EDC [mg] IC50 [mg/mL]
    100 9 × 10–6 mg/mL
    200 9 × 10–6 mg/mL
    300 7 × 10–6 mg/mL
    400 5 × 10–6 mg/mL
    500 5 × 10–6 mg/mL
    625 5 × 10–6 mg/mL
    800 5 × 10–6 mg/mL
  • Beispiel 19
  • Produktwirksamkeit als Funktion der Temperatur der Einstufen-Synthese
  • In drei 50 mL Zentrifugenröhrchen wurden 500 mg PEG-(NH2)8, Molekulargewicht 20.000, 300 mg GalGalGlcNAc, 1250 mg EDC und 140 mg NHSS in 10 mL von 100mM MES-Puffer, pH 5,5, gelöst. Die Reaktionen wurden über Nacht bei 4 °C, bei Raumtemperatur und bei 37 °C durchgeführt. Die jeweiligen Lösungen wurden gegen DI-Wasser mit vier Austauschvorgängen dialysiert und lyophilisiert. Die ungefähren IC50's wurden wie oben beschrieben gemessen und sind nachstehend angegeben.
    Temperatur IC50 [mg/mL]
    4 °C 2 × 10–6 mg/mL
    RT5 × 10–6 mg/mL
    37 ° C 5 × 10–4 mg/mL
  • Beispiel 20
  • Produktwirksamkeit als Funktion des pH bei der Zweistufen-Synthese
  • In sechs 15 mL Zentrifugenröhrchen wurden 250 mg 820E, 625 mg EDC und 70 mg NHSS in 5 mL von 50mM MES-Puffer, pH 5, 5,5, 6 und 6,5 bzw. 0,1M MOPS-Puffer, pH 7 bzw. 7,5, gelöst.
  • Die Reaktionen wurden über Nacht ausgeführt. Die jeweiligen Lösungen wurden gegen DI-Wasser mit vier Austauschvorgängen dialysiert und lyophilisiert. Die ungefähren IC50's wurden wie oben beschrieben gemessen und sind nachstehend angegeben.
    pH IC50 [mg/mL]
    5 5 × 10–5 mg/mL
    5,5 5 × 10–5 mg/mL
    6 8 × 10–5 mg/mL
    6,5 5 × 10–4 mg/mL
    7 5 × 10–4 mg/mL
    7,5 8 × 10–3 mg/mL
  • Beispiel 21
  • Produktwirksamkeit als Funktion der EDC-Konzentration bei der Zweistufen-Synthese
  • In drei 15 mL Zentrifugenröhrchen wurden 250 mg 820E, 70 mg NHSS, 100 mg, 200 mg und 375 mg EDC jeweils in 5 mL von 50mM MES-Puffer, pH 5,5, gelöst. Die Reaktionen wurden über Nacht durchgeführt. Die jeweiligen Lösungen wurden gegen DI-Wasser mit vier Austauschvorgängen dialysiert und lyophilisiert. Die ungefähren IC50's wurden wie oben beschrieben gemessen und sind nachstehend angegeben.
    EDC [mg] IC50 [mg/mL]
    100 8 × 10–3 mg/mL
    200 4 × 10–4 mg/mL
    375 8 × 10–4 mg/mL
  • Beispiel 22
  • Produktwirksamkeit als Funktion der 820E-Konzentration bei der Zweistufen-Synthese
  • In drei 15 mL Zentrifugenröhrchen wurden 70 mg NHSS, 625 mg EDC und 250 mg, 200 mg und 125 mg 820E jeweils in 5 mL von 50mM MES-Puffer, pH 5,5, gelöst. Die Reaktionen wurden über Nacht durchgeführt. Die jeweiligen Lösungen wurden gegen DI-Wasser mit vier Austauschvorgängen dialysiert und lyophilisiert. Die ungefähren IC50's wurden wie oben beschrieben gemessen und sind nachstehend angegeben.
    820E [mg/mL] IC50 [mg/mL]
    25 8 × 10–3 mg/mL
    40 4 × 10–5 mg/mL
    50 5 × 10–5 mg/mL
  • Beispiel 23
  • Reaktionskinetik der Einstufen-Synthese
  • Um die Bildung von 810S zu verfolgen, wurde 1 g von 8-Arm-PEG-NH2, Molekulargewicht 10.000, 5 g EDC, 0,56 g NHSS und 1,2 g Trisaccharid Free Acid in 20 mL von 0,1M MES-Puffer, pH 5,5, gelöst. 2-mL-Proben wurden nach 5 min, 30 min, einer Stunde, 2 h, 2,5 h, drei Stunden, vier Stunden, fünf Stunden und über Nacht entnommen. Die Reaktion wurde beendet durch Zugabe von 1M Tris, pH 8,5. Die jeweiligen Lösungen wurden gegen DI-Wasser mit vier Austauschvorgängen dialysiert und lyophilisiert. Die ungefähren IC50's wurden wie oben beschrieben gemessen und sind nachstehend angegeben.
    Zeit [nun] IC50 [mg/mL]
    5 2 × 10–2 mg/mL
    30 3 × 10–3 mg/mL
    60 6 × 10–4 mg/mL
    120 8 × 10–5 mg/mL
    150 6 × 10–5 mg/mL
    180 5 × 10–5 mg/mL
    240 3 × 10–5 mg/mL
    300 2 × 10–5 mg/mL
    960 5 × 10–6 mg/mL
  • Beispiel 24
  • Wirksamkeit verschiedener Fraktionen von 810S
  • 810S wurde fraktioniert mittels Diafiltration durch Membranen mit zunehmend höheren Molekulargewichtsgrenzen. 50 g von 810S (Los#808003) wurde zuerst 6mal durch eine Membran mit einem nominellen MW-Grenzwert von 3000 gegen keimfreies Wasser diafiltriert, um Salz zu entfernen. Das Retentat wurde dann nacheinander sechsmal durch Membranen mit einem nominellen MW-Grenzwert von 30.000, 100.000, 300.000 und 500.000 gegen keimfreies Wasser diafiltriert. Die Permeate und das letzte Retentat wurden lyophilsiert. Die trockenen Pulver wurden gewogen und eine Stoffbilanz etabliert, wie nachstehend angegeben ist. Die ungefähren IC50's wurden wie oben beschrieben gemessen und sind nachstehend aufgeführt.
  • Figure 00800001
  • Beispiel 25 (kein Beispiel der Erfindung)
  • Synthese und Wirksamkeit einer Zusammensetzung die, ein dendritisches Polyamin aufweist, das sechzehn Amine trägt
  • 200 mg eines dendritischen Polyamidoamins mit 16 Aminen, wobei an jedes Ende ein PEG-Amin mit MW 2000 gekuppelt ist, wurde in 0,1 MES-Puffer, pH 5,5 gelöst, und 250 mg GalGalGlcNAc wurde zugegeben und der pH erneut auf pH 5,5 eingestellt. 500 mg EDC wurde zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht kopfüber rotiert. Die Lösung wurde dreimal gegen 4 L DI-Wasser dialysiert und lyophilisiert. Ein IC50-ELISA wie oben beschrieben wurde durchgeführt, und der ungefähre IC50 wurde mit 1 mg/mL bestimmt.
  • Beispiel 26 (kein Beispiel der Erfindung)
  • Synthese und Wirksamkeit einer Zusammensetzung die, ein dendritisches Polyamin aufweist, das 32 Amine trägt
  • 200 mg eines dendritischen Polyamidoamins mit 32 Aminen, wobei an jedes Ende ein PEG-Amin mit MW 2000 gekuppelt ist, wurde in 0,1 MES-Puffer, pH 5,5, gelöst, und 250 mg GalGalGlcNAc wurde zugegeben und der pH erneut auf pH 5,5 eingestellt. 500 mg EDC wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht kopfüber rotiert. Die Lösung wurde dreimal gegen 4 L DI-Wasser dialysiert und lyophilisiert. Ein IC50-ELISA wie oben beschrieben wurde durchgeführt, und der ungefähre IC50 wurde mit 1 mg/mL bestimmt.
  • Beispiel 27 (kein Beispiel der Erfindung)
  • Synthese und Wirksamkeit einer Zusammensetzung, die ein Dextranamin (MI~10.000) aufweist
  • 200 mg eines Dextranamins mit einem Molekulargewicht von 10.000 (Molecular Probes, Oregon) wurde in 0,1 MES-Puffer, pH 5,5 gelöst, und 250 mg GalGalGlcNAc wurde zugefügt und der pH erneut auf pH 5,5 eingestellt. 500 mg EDC wurde zugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht kopfüber rotiert. Die Lösung wurde dreimal gegen 4 L DI-Wasser dialysiert und lyophilisiert. Ein IC50-ELISA wie oben beschrieben wurde durchgeführt, und der ungefähre IC50 wurde mit 10–3 mg/mL bestimmt.
  • Beispiel 28 (kein Beispiel der Erfindung)
  • Synthese und Wirksamkeit einer Zusammensetzung, die ein Dextranamin (MI~40.000) aufweist
  • 200 mg eines Dextranamins mit einem Molekulargewicht von 40.000 (Molecular Probes, Oregon) wurde in 0,1 MES-Puffer, pH 5,5, gelöst, und 250 mg GalGalGlcNAc wurde zugegeben und der pH erneut auf pH 5,5 eingestellt. 500 mg EDC wurde zugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht kopfüber rotiert. Die Lösung wurde dreimal gegen 4 L DI-Wasser dialysiert und lyophilisiert. Ein IC50-ELISA wie oben beschrieben wurde durchgeführt, und der ungefähre IC50 wurde mit 5 × 10–6 mg/mL bestimmt.
  • Beispiel 29 (kein Beispiel der Erfindung)
  • Synthese und Wirksamkeit einer Zusammensetzung, die ein Dextranamin (MI~70.000) aufweist
  • 200 mg eines Dextranamins mit einem Molekulargewicht von 70.000 (Molecular Probes) wurde in 0,1 MES-Puffer, pH 5,5, gelöst, und 250 mg GalGalGlcNAc wurde zugegeben und der pH erneut auf pH 5,5 eingestellt. 500 mg EDC wurde zugegeben, und das Reaktionsgemisch über Nacht kopfüber gedreht. Die Lösung wurde dreimal gegen 4 L DI-Wasser dialysiert und lyophilisiert. Ein IC50-ELISA wie oben beschrieben wurde durchgeführt, und der ungefähre IC50 wurde mit 10–5 mg/mL bestimmt.
  • Beispiel 30 (kein Beispiel der Erfindung)
  • Synthese und Wirksamkeit einer Zusammensetzung, die ein Poly(lysin)amin (MI~30.000) aufweist.
  • 200 mg eines Polylysins (Sigma) mit einem Molekulargewicht von 30.000 wurde in 0,1 MES-Puffer, pH 5,5, gelöst, und 500 mg GalGalGlcNAc wurde zugegeben und der pH erneut auf pH 5,5 eingestellt. 1400 mg EDC wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch kopfüber über Nacht gedreht. Die Lösung wurde viermal gegen 4 L DI-Wasser dialysiert und lyophilisiert. Ein IC50-ELISA wie oben beschrieben wurde durchgeführt, und der ungefähre IC50 wurde mit 10–5 mg/mL bestimmt.
  • Beispiel 31
  • Synthese von 810S: 8-armiges, MW 10.000 (αGal(1,3)Gal-β-1-4GlcNAc)8-PEG unter Verwendung von EDC und NHSS zum Kuppeln.
  • 62,5 g EDC, 7 g NHSS und 15 g αGal(1,3)Gal-β-1-4GlcNAc wurden in 50 mL von 0,1M MES-Puffer, pH 5,5 gelöst. Die resultierende Lösung wurde dann in einen 500-mL-Glasbecher mit Stöpsel überführt, in dem 12,5 g 8-armiges, MW 10.000, PEG-(NH2)8 in 100 mL von 0,1M MES- Puffer, pH 5,5, gelöst war. Die Lösung wurde auf 250 mL gebracht durch Zugabe von 0,1M MES-Puffer, pH 5,5. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Orbitalschüttler über Nacht geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde in Dialyseröhrchen mit einem Molekulargewicht-Grenzwert von 3500 abgefüllt und fünfmal gegen 20 L DI-Wasser dialysiert. Das dialysierte Material wurde zu einem gelblichen Pulver gefriergetrocknet. Die Aminogruppenanalyse zeigte, daß mehr als 98 % Aminogruppen modifiziert waren.
  • Beispiel 32
  • Vergleich von 810S mit Immunapherese
  • Eine Serie von Experimenten wurde begonnen, um die Wirkungen von 810S gegen die Immunapherese an zirkulierenden αGal-Antikörpern und peripheren αGal-Antikörper sekretierenden Zellen (ASCs) bei Pavianen zu vergleichen
  • A. Experimentelles Design:
  • Insgesamt 6 Paviane wurden verwendet. Drei Paviane (mit 51-98, 48-98 und 47-98 bezeichnet) wurden der Immunapherese (IP) unterzogen unter Anwendung von αGal-Kolonnen, wobei Plasma alle 3 Tage für insgesamt 6 Behandlungen aus 3 Blutmengen über die Kolonnen geleitet wurde. Drei andere Paviane (mit 46-98, 52-98, 50-98 bezeichnet) erhielten i.v. Infusionen von 810S mit 50 mg/kg alle 3 Tage über insgesamt 6 Behandlungen. Es war keine Immunsuppression oder Belastung mit Schweineorganen in dem Protokoll vorgesehen.
  • In beiden Gruppen wurden Serumproben und Blut während der Behandlungsperiode und einer Nachfolgeperiode bis zu ungefähr 150 bis 180 Tagen gesammelt, um αGal-Antikörperspiegel und ASCs zu messen.
  • B. Ergebnisse:
  • Jede IP-Behandlung entfernte zirkuliernde IgM- und IgG-XNAs auf 10 bis 20 % der Anfangsspiegel, wobei zwischen jeder Behandlung ein erneuter Anstieg von 50 % der Ausgangsspiegel stattfand. Dies unterscheidet sich geringfügig von dem, was gewöhnlich beobachtet wird, obwohl unsere Erfahrungen auf dem Gebiet von Tieren unter Immunsuppression liegen. Typischerweise sind, nachdem Plasma von 3 Blutvolumen über eine αGal-Kolonne gelaufen ist, XNAs in dem Serum nach der Behandlung nicht nachweisbar. Ein erneuter Anstieg von XNAs auf 20 bis 60 % der Anfangsspiegel wird gewöhnlich nach der ersten Behandlung beobachtet, und dieser erneute Anstiegseffekt wird im allgemeinen mit jeder IP-Behandlung geringer.
  • Unmittelbar nach der letzten IP-Behandlung waren die IgG- und IgM-XNA-Spiegel bei 7 bis 17 % bzw. 3 bis 15 % der ursprünglichen Grundlinienspiegel. Siehe die 26 und 31 bis 33. Zwei Wochen nach dem Ende der IP-Behandlung (Tag 30) waren die zirkulierenden IgG-XNA-Spiegel bei 2 der Paviane bei ungefähr 60 % der Anfangsspiegel und blieben bis zum Tag 145 relativ konstant, wogegen bei dem dritten Tier die XNAs am Tag 30 auf ungefähr 90 % der Ausgangsspiegel zurückgekehrt waren und bis zum Tag 145 ungefähr 1,5fache Grundlinienspiegel erreichten. Siehe die 27 und 31 bis 33. Die Gesamt-IgM- und -IgG-Spiegel bei allen drei Tieren blieben während des gesamten Experiments relativ konstant. Siehe die 31 bis 33.
  • Nach der ersten Behandlung mit 810S fielen die zirkulierenden IgG- und IgM-XNA-Spiegel bei allen drei Pavianen auf Werte zwischen 1 und 13 % der Anfangsspiegel. Siehe die 26 und 28 bis 30. Nach der letzten Behandlung mit 810S waren die IgG-XNA-Spiegel 1 bis 9 % der Grundlinienwerte, und die IgM-XNA-Spiegel waren 1 bis 3 % der Grundlinienwerte. Siehe die 27 bis 30. Am Tag 30 hatten die IgG-XNA-Spiegel 20 bis 33 % der Grundlinienwerte erreicht, und die IgM-XNA-Spiegel waren 8 bis 18 % der Grundlinienwerte. Siehe die 26 und 27.
  • Die 34 und 35 zeigen die mittlere Vervielfachungsänderung bei der IgG- und IgM-Antwort für jedes der mit IP und 810S behandelten Tiere.
  • Zur Untersuchung, ob 810S am Tag 30 immer noch in Pavianserum vorhanden war, wurde Serum mit Humanserum vermischt und mittels ELISA analysiert, um mit Human-XNA zu komkurrieren, das an GAL-HSA bindet. Die Ergebnisse zeigten, daß Pavianserum vom Tag 30 nicht mit Human-XNA, das an GAL bindet, in Konkurrenz tritt, und zeigen daher, daß 810S nicht mehr im Kreislauf vorhanden ist.
  • Am Tag 184 waren die IgG-XNA-Spiegel bei 2 der mit 810S behandelten Paviane immer noch bei 30 bis 38 % der Grundlinienwerte, wogegen bei einem Pavian die IgG-XNA-Spiegel zur Grundlinie zurückgekehrt waren. Die IgM-XNA-Spiegel bei diesem dritten Pavian erreichten bis zum Tag 184 60 % der Grundlinienwerte, wogegen die IgM-XNA-Spiegel bei den beiden anderen Pavianen 24 bis 39 % der Grundlinienwerte erreichten. Die Gesamt-IgM- und -IgG-Spiegel bei allen drei Tieren blieben während des gesamten Experiments relativ konstant.
  • Pavianblut wurde auch periodisch auf IgG- und IgM-XNA-ASCs analysiert. Wie erwartet, hatte die IP eine minimale Wirkung auf ASCs. Zum Zeitpunkt des zweiten Experiments mit 810S waren die IgM- und IgG-ASC-Spiegel auf 20 bis 40 % der Anfangsspiegel verringert, zum Zeitpunkt der vierten Behandlung waren die IgM- und IgG-ASCs ungefähr 10 % der Anfangsspiegel, und nach der sechsten Behandlung waren sie ungefähr 3 bis 6 % der Ausgangsspiegel. Am Tag 30, zwei Wochen nach Beendigung der 810S-Behandlung, waren die IgM- und IgG-ASC-Spiegel auf ungefähr 38 % der Ausgangsspiegel zurückgekehrt, und eine Woche später waren sie bei ungefähr 62 % der Ausgangsspiegel.
  • C. Zusammenfassung:
  • Die Analyse von XNA-Spiegeln in Pavianen, die mit IP behandelt wurden, zeigt eine Verringerung der XNA-Spiegel nach jeder Behandlung, wobei zwischen den Behandlungen erneute Anstiege und nach Beendigung der Behandlung eine allmähliche Rückkehr von Antikörper beobachtet werden. IgG-XNA-Spiegel bei 2 Tieren kehrten nur auf ungefähr 60 % der Ausgangswerte zurück, was im Vergleich mit dem, was typischerweise beobachtet wird, ungewöhnlich ist. Die IgG-XNAs bei dem dritten Tier und die IgM-XNAs bei allen drei Tieren kehrten jedoch zu Grundlinienwerten zurück, wobei dieser Spiegel bei einem Tier geringfügig überschritten wurde. Im Vergleich werden XNA-Spiegel bei Infusion von 810S sofort verringert, und die Spiegel bleiben während des gesamten Verlaufs der Behandlung reduziert. Bei mit 810S behandelten Pavianen zeigen die XNAs eine viel langsamere Rückkehr nach dem Abschluß der 810S-Behandlung im Vergleich mit Pavianen, die mit IP behandelt wurden. Zum Vergleich siehe die IP- und 810S-Diagramme in den 34 und 35.
  • Die Analyse von zirkulierenden IgM- und IgG-ASCs zeigt, wie erwartet, keine Wirkung, wenn die Tiere der IP unterzogen werden. Eine Auswirkung auf die Spiegel dieser Zellen infolge der 810S-Infusion wurde jedoch deutlich beobachtet. Die ASC-Spiegel fielen bald nach dem Beginn der 810S-Behandlung, und drei Wochen nach Beendigung der 810S-Behandlung waren die ASCs noch nicht auf die Anfangsspiegel zurückgekehrt.
  • Die IP entfernt zirkulierende Antikörper physikalisch, und ihre Rückkehr in den Kreislauf wird aufgrund der Re-Synthese erwartet. Der Wirkungsmodus von 810S ist zwar weniger klar, es ist aber aus ELISA-Versuchen in vitro ersichtlich, daß 810S XNAs binden und sie daran hindern kann, αGal-Epitope zu binden. Die fortgesetzte Abnahme von XNA-Spiegeln mehrere Wochen nach Beendigung der 810S-Behandlung und die Abwärtsregulation von αGal-ASCs deutet darauf hin, daß 810S auch eine immunregulierende Funktion hat, beispielsweise tolerogen ist.

Claims (50)

  1. Polymer, das synthetisiert ist durch eine Kreuzkupplungsreaktion von (i) Polymergerüsteinheiten, die eine Vielzahl von nukleophilen oder elektrophilen funktionellen Gruppen aufweisen, und (ii) einem oder mehreren Oligosaccharid-Xenoantigenen, wobei jedes Xenoantigen aufweist: (a) einen Oligosaccharid-Anteil und (b) eine funktionelle Gruppe, die imstande ist, mit den an der Polymergerüsteinheit präsentierten funktionellen Gruppen zu reagieren, wobei die Reaktion in Anwesenheit eines Vernetzungsreagenzes unter Bedingungen ausgeführt wird, unter denen Polymergerüsteinheiten mit Xenoantigenen gekuppelt und separate Polymergerüsteinheiten miteinander vernetzt werden.
  2. Polymer nach Anspruch 1, wobei die funktionellen Gruppen für die Polymergerüsteinheiten und Xenoantigene aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus: Amin und Carbonsäure, Alkohol und Alkylhalogenid oder -sulfonat, Thiol und Alkylhalogenid oder -sulfonat, Phosphin und Alkylhalogenid oder -sulfonat, Phosphit und Alkylhalogenid oder -sulfonat und Aldehyd oder Keton und Amin.
  3. Polymer nach Anspruch 1, wobei die funktionellen Gruppen beim Kreuzkuppeln eine Amid-, Ether-, Thioether- oder Phosphatbindung zwischen der Polymergerüsteinheit und dem Xenoantigen erzeugen.
  4. Polymer nach Anspruch 1, wobei die funktionellen Gruppen beim Kreuzkuppeln eine Amidbindung zwischen der Polymergerüsteinheit und dem Xenoantigen erzeugen.
  5. Polymer nach Anspruch 1, wobei das Kreuzkuppeln in Gegenwart eines Aktivierungsmittels ausgeführt wird, das die funktionellen Gruppen der Polymergerüsteinheiten und Xenoantigene aktiviert, um eine kovalente Bindung zwischen ihnen zu bilden.
  6. Polymer nach Anspruch 5, wobei die Aktivierungsgruppe aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: Dehydratisierungsmitteln, Brönsted-Säure, Brönsted-Base, Lewis-Säure, Lewis-Base, Acylhalogenid und Phosphorylhalogenid.
  7. Polymer nach Anspruch 5, wobei das Aktivierungsmittel Diimid ist.
  8. Polymer nach Anspruch 7, wobei das Aktivierungsmittel Dicyclohexyldiimid [DCC] oder Ethyl-3-(dimethylamino)propyldiimid [EDC] ist.
  9. Polymer nach Anspruch 1, wobei die Polymergerüsteinheiten pharmakologisch akzeptable, nicht immunogene Moleküle sind und bevorzugt das gesamte Polymer nicht immunogen ist.
  10. Polymer nach Anspruch 9, wobei die Polymergerüsteinheiten Polyethylenglykol tragende nukleophile oder elektrophile funktionelle Gruppen aufweisen.
  11. Polymer nach Anspruch 10, wobei die nukleophilen oder elektrophilen funktionellen Gruppen an den Polymergerüsteinheiten aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus: Aminen, Alkoholen, Thiolen, Selenolen, Phosphinen, Aldehyden, Ketonen, Säurechloriden, Säuren, Estern, Alkylhalogeniden und Alkylsulfonaten.
  12. Polymer nach Anspruch 11, wobei die funktionelle Gruppe an der Polymergerüsteinheit ein Amino- oder Carboxylat-Anteil ist, und die funktionelle Gruppe des Xenoantigens damit reagiert, um eine Amidbindung zu bilden.
  13. Polymer nach Anspruch 12, wobei die Polymergerüsteinheit Octa(amino)polyethylenglykol ist.
  14. Polymer nach Anspruch 1, wobei die Polymergerüsteinheiten ein Molekulargewicht im Bereich von 1.000 Da bis 100.000 Da haben.
  15. Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Xenoantigen ein Oligosaccharid aufweist, das einen αGal(1,3)Gal-Anteil hat, der durch die folgende allgemeine Formel repräsentiert ist:
    Figure 00890001
    wobei: R unabhängig bei jedem Auftreten H oder ein C1-C6-Alkyl oder eine andere Hydroxylschutzgruppe repräsentiert; R' abwesend ist oder ein Oligosaccharid von 1-8 Saccharidresten repräsentiert; und X einen Bindungs- oder Linker-Anteil repräsentiert, der den Oligosaccharid-Anteil an das Polymer-Grundgerüst bindet.
  16. Polymer nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Xenoantigen ein Oligosaccharid aufweist, das durch eine von den folgenden allgemeinen Formeln repräsentiert ist:
    Figure 00890002
    wobei R1 unabhängig bei jedem Auftreten H, -OR, -SR oder -N(H)-Y-R ist; R unabhängig bei jedem Auftreten H oder ein C1-C6-Alkyl oder eine andere Hydroxylschutzgruppe repräsentiert; R2 ein C1-C6-Alkyl ist; Y unabhängig bei jedem Auftreten abwesend oder -C(S)-, -S(O)2-, -C(O)-A- ist; X einen Bindungs- oder Linker-Anteil repräsentiert, der den Oligosaccharid-Anteil an das Polymer-Grundgerüst bindet; Z O oder S ist; und A -NH-, -NH-(C1-C6-Alkyl)-, -NH-(C1-C6-Alkenyl)-, -O-, -O-(C1-C6-Alkyl)-, -O-(C1-C6-Alkenyl)-, -S-, -S-(C1-C6-Alkyl)-, -S-(C1-C6)-Alkenyl)- ist.
  17. Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Xenoantigen einen oder mehrere der folgenden aufweist: αGal(1,3)βGal-; αGal(1,3)βGal(1,4)βGlcNAc-; oder αGal(1,3)βGal(1,4)βGlc-Anteile.
  18. Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Xenoantigen Di-, Tri-, Tetra- und Penta-Oligosaccharide aufweist.
  19. Polymer nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Xenoantigen eines oder mehrere der folgenden aufweist: αGal(1,2)Gal, αGal(1,4)Gal, βGal(1,3)GalNAc oder 3-O-sulfatierte Galactose (SO4-3Gal).
  20. Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das zwei oder mehr verschiedene Xenoantigene aufweist.
  21. Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Vernetzungsmittel zwei funktionelle Gruppen aufweist, die imstande sind, mit den Polymergerüsteinheiten, dem Xenoantigen, der kovalenten Bindung des Gerüsts mit dem Xenoantigen oder einer Kombination davon zu reagieren.
  22. Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Vernetzungsmittel von N-Hydroxysulfosuccinimid (NHSS) abgeleitet ist.
  23. Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Vernetzungsmittel NHSS ist.
  24. Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das B-Zellen-Anergie für das Xenoantigen induziert.
  25. Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das eine Polydispersität von 20 oder weniger hat.
  26. Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polymer eine Toleranz Xenoantigene induziert.
  27. Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das mit einem pharmazeutischen Arzneimittelträger formuliert ist.
  28. Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das als eine sterile Formulierung formuliert ist.
  29. Zusammensetzung, die folgendes aufweist: ein nicht immunogenes pharmakologisch akzeptables vernetztes Polymer; und eine Vielzahl von αGal(1,3)Gal-Anteilen, die an das vernetzte Polymer kovalent gebunden sind.
  30. Zusammensetzung nach Anspruch 29, wobei das Polymer Poly(amino)polyethylenglykol aufweist.
  31. Zusammensetzung nach Anspruch 29 oder 30, wobei die αGal(1,3)Gal-Anteile durch die folgende allgemeine Formel repräsentiert sind:
    Figure 00920001
    wobei R unabhängig bei jedem Auftreten H oder ein C1-C6-Alkyl oder eine andere Hydroxylschutzgruppe repräsentiert; R' abwesend ist oder ein Oligosaccharid von 1-8 Saccharidresten repräsentiert; und X einen Bindungs- oder Linker-Anteil repräsentiert, der den Oligosaccharid-Anteil an den Träger bindet.
  32. Zusammensetzung nach Anspruch 29, wobei der αGal(1,3)Gal-Anteil aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: αGal(1,3)βGal-Anteilen, αGal(1,3)βGal(1,4)βGlcNAc-Anteilen; und αGal(1,3)βGal(1,4)βGlc-Anteilen.
  33. Zusammensetzung nach Anspruch 29, wobei der αGal(1,3)Gal-Anteil ein Di-, Tri-, Tetra- oder Penta-Oligosaccharid ist.
  34. Zusammensetzung nach Anspruch 29, wobei die Polymergerüsteinheiten durch ein von N-Hydroxysulfosuccinimid abgeleitetes Reagenz vernetzt sind.
  35. Zusammensetzung nach Anspruch 29, wobei die Polymergerüsteinheiten durch N-Hydroxysulfosuccinimid vernetzt sind.
  36. Verfahren zum Synthetisieren einer Zusammensetzung, die nützlich ist, um Plasmaspiegel von Anti-(αGal(1,3)Gal)-Antikörpern in einem Primatensubjekt zu reduzieren, wobei das Verfahren das Umsetzen der folgenden Reagenzien in einer Lösung in einem pH-Bereich von 4 bis 7 aufweist: a) ein verzweigtes Polymer, das mindestens drei Arme und mindestens drei Carboxygruppen hat, die an die freien Enden der Arme kovalent gebunden sind; b) einen αGal(1,3)Gal enthaltenden Anteil, an den eine Aminogruppe oder eine Hydrazinogruppe kovalent gebunden ist; c) N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid; und d) N-Hydroxysulfosuccinimid.
  37. Verfahren nach Anspruch 36, wobei der αGal(1,3)Gal-Anteil in einem ein- bis zehnfachen molaren Überschuß an den Armen des verzweigten Polymers umgesetzt wird.
  38. Verfahren zum Formulieren einer Zusammensetzung, die nützlich ist, um Plasmaspiegel von Anti-Xenotransplantat-Antikörpern in einem Subjekt zu reduzieren, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: A. Erzeugen eines Polymers oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 35 durch eine Kreuzkupplungsreaktion von (i) Polymergerüsteinheiten, die eine Vielzahl von nukleophilen oder elektrophilen funktionellen Gruppen aufweisen, und (ii) Xenoantigenen, die eine funktionelle Gruppe aufweisen, die imstande ist, mit den an der Polymergerüsteinheit präsentierten funktionellen Gruppen zu reagieren, wobei die Kreuzkupplungsreaktion in Anwesenheit eines Vernetzungsreagenzes unter Bedingungen ausgeführt wird, unter denen Polymergerüsteinheiten mit Xenoantigenen gekuppelt und Polymergerüsteinheiten des Polymers miteinander vernetzt werden; und B. Formulieren des Polymers als ein steriles pharmazeutisches Präparat.
  39. Polymer oder Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 35 zur Verwendung in der Medizin.
  40. Verwendung eines Polymers oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 35 bei der Herstellung eines Medikaments zum Abschwächen der Abstoßung von Gewebe oder Zellen, die einem Empfängertier von einem Spendertier transplantiert werden.
  41. Verwendung nach Anspruch 40, wobei das Medikament nach Anspruch 40 der Verabreichung an das Tier als ein Vorbehandlungsregime dient, bevor dem Tier das Gewebe oder die Zellen transplantiert werden.
  42. Verwendung nach Anspruch 40, wobei das Medikament 40 der Verabreichung an das Tier dient, nachdem dem Tier das Gewebe oder die Zellen transplantiert worden sind.
  43. Verwendung nach Anspruch 42, wobei das Medikament der Verabreichung in einer Menge dient, die ausreicht, um hyperakute Abstoßung des transplantierten Gewebes oder der transplantierten Zellen zu unterdrücken.
  44. Verwendung nach Anspruch 40, wobei das Empfängertier keine endogene UDP-Galactose: β-D-Galactosyl-1,4-N-acetyl-D-glucosaminid-α(1,3)Galactosyltransferase(α1,3-GT)-Aktivität besitzt oder das αGal(1,3)Gal-Xenoantigen nicht an seinen Zellen, seinem Gewebe oder seinen Organen erzeugt oder zeigt.
  45. Komplex, der eine oder mehrere einer Zusammensetzung zugeordnete B-Zellen aufweist, wobei der Komplex folgendes aufweist: ein nicht immunogenes pharmakologisch akzeptables vernetztes Polymer; und eine Vielzahl von αGal(1,3)Gal-Anteilen, die an das vernetzte Polymer kovalent gebunden sind.
  46. Komplex, der einen oder mehrere einer Zusammensetzung zugeordnete Antiköper aufweist, wobei der Komplex folgendes aufweist: ein nicht immunogenes pharmakologisch akzeptables vernetztes Polymer; und eine Vielzahl von αGal(1,3)Gal-Anteilen, die an das vernetzte Polymer kovalent gebunden sind.
  47. Verfahren zum Erzeugen eines Polymers nach einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei die Kreuzkupplungsreaktion bei einem pH von 4 bis 7 ausgeführt wird.
  48. Verfahren zum Erzeugen eines Polymers nach einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei die Kreuzkupplungsreaktion in einem Temperaturbereich von 0 °C bis 40 °C ausgeführt wird.
  49. Verfahren zum Erzeugen eines Polymers nach einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei die Kreuzkupplungsreaktion bei einer Temperatur, einem pH, einer Reagenzkonzentration und über eine Zeitdauer ausgeführt wird, die ausreichen, um ein Polymer zu ergeben, das ein nominelles Molekulargewicht von 100.000 bis 500.000 Dalton hat.
  50. Verfahren zum Erzeugen eines Polymers nach einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei die Kreuzkupplungsreaktion bei einer Temperatur, einem pH, einer Reagenzkonzentration und über eine Zeitdauer ausgeführt wird, die ausreichen, um ein Polymer zu ergeben, das ein nominelles Molekulargewicht von weniger als 100.000 Dalton hat.
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