DE69913158T2

DE69913158T2 - Eine phytoen und phytofluen enthaltende carotenoide zubereitung

Info

Publication number: DE69913158T2
Application number: DE69913158T
Authority: DE
Inventors: Etienne Soudant; Lea Bezalel; Hedva Schickler; Judith Paltiel; Ami Ben-Amotz; Aviv Shaish; Inon Perry
Original assignee: IBR Israeli Biotechnology Research Ltd; IBR Ltd
Current assignee: IBR Ltd
Priority date: 1998-09-04
Filing date: 1999-09-05
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2019-09-06
Also published as: EP1107723B1; JP4050869B2; WO2000013654A3; EP1107723A2; IL126076A; BR9913397B1; AU5529199A; ATE254903T1; HK1040051A1; JP2008001721A; WO2000013654A2; DE69913158D1; BR9913397A; IL126076A0; US7482032B2; US20020131940A1; JP2002524403A; US6383474B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine carotinoidhaltige Zubereitung. Die Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung kann in Nahrungsmitteln, in Kosmetika sowie in einer Vielzahl von medizinischen Anwendungen usw. eingesetzt werden. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der Carotinoide.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Carotinoide sind Pigmente, die von Mikroorganismen, Pilzen und Pflanzen hergestellt werden und von diesen als Antioxidationsmittel und Schutzmittel gegen übermäßige Bestrahlung verwendet werden. Die am häufigsten verwendeten Carotinoide in Nahrungsmitteln, medizinischen Zubereitungen oder Kosmetika sind β-Carotin und Lycopen. β-Carotin und Lycopen sind licht- und oxidationsempfindlich, eine Eigenschaft, die ihre Anwendung beträchtlich einschränkt und die Haltbarkeit von Produkten, die diese enthalten, verkürzt (in: Carotenoids, Chemistry and Biology, Krinski, N. I., Matthews-Roth, M. M., Taylor, R. F., (Eds), Planum Press, New York, London, 1989). Ferner weisen β-Carotin und Lycopen eine charakteristische orange Farbe auf und diese Farbe stellt eine starke Beschränkung für eine Vielzahl von Kosmetik- oder Nahrungsmittelanwendungen dar.
Phytoen (7,8,11,12,7',8',11',12'-Octahydro-γ,γ-carotin) und Phytofluen (15Z, 7, 8,11,12,7',8'-Hexahydro-γ,γ-Carotin) sind Carotinoide (C-40 Isoprenoidkette), die in dem biosynthetischen Weg, der zur Herstellung von β-Carotin, Lycopen und weiteren Carotinoiden führt (Phytoen ist der erste carotinoidspezifische Vorläufer und Phytofluen wird daraus in einem anschließenden Desaturierungsschritt hergestellt), Vorläufer darstellen. Phytoen ist völlig farblos, während Phytofluen eine leicht gelbe Farbe aufweist. In der japanischen Patentanmeldung Nr. 90-40520 wurde offenbart, dass die Einführung einer DNS-Sequenz, die zur Expression von Phytoen führt, in gewisse transfizierte Krebszellen zur Inhibierung von deren Wachstum und zur Inhibierung der Aktivierung des Epstein Barr Virus (EBV) führte.
Aus dem Stand der Technik sind Zubereitungen bekannt, die Phytoen und Phytofluen enthalten, siehe z. B. LH Tonucci et al., ). Agric. Chem. 1995, 43, 579–586.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, dass Phytoen und Phytofluen antioxidative Eigenschaften aufweisen und ferner fähig sind, ultraviolettes Licht (UV) zu absorbieren. Ferner konnte festgestellt werden, dass Phytoen und Phytofluen trotz dieser Eigenschaften sehr viel stabiler gegenüber Oxidation als beispielsweise β-Carotin sind. Diese Befunde führten zu dem Gedanken, dass Phytoen und Phytofluen in Kombination zur Prävention von umweltbedingten Schäden verschiedener Art geeignet sein könnten.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird folglich eine Zubereitung bereitgestellt, die eine Menge an Phytoen und eine Menge an Phytofluen umfasst, die in Kombination zur Prävention von Schäden wirksam sind, die sich aus Oxidation und aus UV-Lichteinwirkung ergeben.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist unter der Bezeichnung "Schaden" irgendein Schaden zu verstehen, der aus einer Vielzahl von oxidativen Mitteln wie z. B. Sauerstoff selbst, Hydroxylradikal, Wasserstoffperoxid, weiterer freier Radikale, Ozon usw. oder aus jeder Art von schädlicher UV-Bestrahlung wie z. B. UVA-Bestrahlung und UVB-Bestrahlung resultiert. Der Schaden würde von dem Zweck abhängen, für das das Präparat angewendet wird. Wenn das Präparat auf der Haut angewendet wird, so kann es sich folglich bei dem Schaden um irgendeinen Hautschaden handeln wie z. B. Verbrennungen, Blasen, ein Schaden, der nach chronischer Sonneneinwirkung auftritt, z. B. frühzeitige Alterung der Haut, usw. Wenn das Präparat als Nahrungskonservierungsmittel eingesetzt wird, so kann solch ein Schaden in Form einer Verringerung der Produktstabilität, einer chemischen Modifizierung, die beispielsweise zur Ranzigkeit führt, eines beschleunigten Alterns usw., vorliegen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine topische Hautzubereitung zum Schutz der Haut gegenüber Umweltgefahren bereitgestellt, die Phytoen und Phytofluen in einer wirksamen Menge umfasst, so dass diese Carotinoide in Kombination eine Oxidationsschutzwirkung und UV-Schutzwirkung auf der Haut ausüben.
Die Bezeichnung "Umweltgefahren" bezieht sich auf jedes Mittel aus der Umwelt, das einen Schaden wie UV-Bestrahlung oder oxidative Mittel ausüben kann.
Die Bezeichnung "wirksame Menge" ist als eine Phytoenmenge und Phytofluenmenge zu verstehen, die die erwünschte Schutzwirkung erzielt, wenn sie in Kombination verabreicht wird.
Das Phytoen und das Phytofluen in der Zubereitung gemäß der vorliegenden Ertindung können entweder in ihren trans- oder ihren cis-Formen vorliegen.
Das Gewichtsverhältnis zwischen dem Phytoen und dem Phytofluen in der Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung kann in dem Bereich zwischen 200 : 1 bis 1 200 liegen, im allgemeinen zwischen etwa 50 : 1 bis 1 : 50, bevorzugt von 10 : 1 bis 1 : 10, wobei 10 : 1 (Phytoen : Phytofluen) ein besonderes Beispiel darstellt. Die vorstehend genannten Verhältnisse von Phytoen zu Phytofluen können erreicht werden, indem ein Extrakt, der die beiden Carotinoide in dem gewünschten Verhältnis enthält, verwendet wird, oder indem eine zusätrliche Menge eines der Carotinoide zu einem Extrakt zugegeben wird, der beide Carotinoide umfasst, so dass das gewünschte Verhältnis erhalten wird, oder indem zwei separate Carotinoide (wobei jedes davon nach einem der zuvor oder im folgenden angegebenen oder beschriebenen Verfahren erhalten wird), um das gewünschte Verhältnis zu erreichen.
Eine der neuen Merkmale der erfindungsgemäßen Zubereitung besteht darin, dass während die Zubereitung die vorstehend genannten Eigenschaften aufweist, die Kombination von Phytoen und Phytofluen im wesentlichen keine Farbe aufweist (außer einem schwach gelben Farbton des Phytofluens, nur schwer sichtbar). Durch die Tatsache, dass die Zubereitung im wesentlichen farblos ist, wird gewährleistet, dass diese Carotinoide keinerlei Auswirkungen auf die ästhetischen Eigenschaften des Präparats, das sie enthält, ausüben. Zudem führt die Abwesenheit einer Absorption von Licht in dem sichtbaren Bereich (was eine Manifestation der Tatsache ist, dass sie im wesentlichen farblos sind) dazu, dass sie gegenüber einer Zersetzung unter sichtbarem Licht stabil sind.
In Übereinstimmung mit der vorstehend genannten bevorzugten Ausführungsform kann das Präparat als topisches kosmetisches oder pharmazeutisches Präparat verwendet werden, um die Haut vor Umweltgefahren wie den vorstehend beschriebenen einschließlich UV (UVA und/oder UVB) Bestrahlung oder Schäden, die durch eine Vielzahl von Oxidationsmitteln verursacht werden können, zu schützen. Eine topische Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung kann in Form eines Gels, einer Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Emulsion, einer Salbe oder eines Balsams usw. vorliegen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann die Zubereitung als Additiv in Nahrungsmittelpräparaten verwendet werden, sie kann beispielsweise als Konservierungsmittel dienen, um vor einer Oxidation von verschiedenen Nahrungsmittelbestandteilen wie z. B. Ölen oder Fetten zu schützen.
Die Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung kann zum Teil auch zusätzliche Komponenten enthalten, die die Grundeigenschaften der Zubereitung nicht wesentlich verändern. Ein Beispiel für so eine Komponente ist Zetacarotin (7,8,7',8'-Tetrahydro-γ,γ-Carotin).
Die Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung kann natürlich, abhängig von der Verwendung, auch noch weitere Bestandteile umfassen, kosmetisch oder pharmazeutisch verträgliche Träger, Konservierungsstoffe, weitere Antioxidationsmittel, verschiedene pharmazeutisch oder kosmetisch wirksame Bestandteile wie topisch wirksame Arzneimittel usw.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zubereitung ferner einen hydrophoben Träger, der aus Ölen ausgewählt werden kann, die üblicherweise in der Kosmetikindustrie, der pharmazeutischen Industrie oder der Nahrungsmittelindustrie eingesetzt werden, wie z. B. pflanzliche, mineralische oder synthetische Öle.
Das Phytoen und das Phytofluen können aus einer Vielfalt von Quellen erhalten werden, üblicherweise können sie aus Organismen, die Carotinoide produzieren, erhalten werden, wie z. B. einer Reihe von Pflanzen, verschiedenen Algen und insbesondere der Mikroalge Dunaliella sp, die ein spezifisches Beispiel darstellt. β-Carotinoidproduzierende Organismen produzierten nur sehr geringe Mengen an Phytoen und Phytofluen. Um selbst diese geringen Mengen der Carotinoide zu erhalten, wurden die Organismen unter schwachen Lichtbedingungen gezüchtet. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, das es ermöglicht, substantielle Mengen von wenigstens einer der Verbindungen Phytoen oder Phytofluen aus solchen Carotinoid-produzierenden Organismen zu erhalten. Der Ausdruck "substantielle Mengeri" bezieht sich auf eine Menge an Phytoen oder eine Menge an Phytofluen im Bereich von etwa 0,1 mg/l Kultur bis etwa 30 mg/l Kultur, üblicherweise zwischen etwa 1 mg/l bis etwa 20 mg/l. Wenn es sich bei dem Carotinoid-produzierenden Organismus um die Alge Dunaliella sp handelt, liegt die typische Menge an Phytoen und Phytofluen, die produziert werden kann, zwischen etwa 1 mg/l bis etwa 15 mg/l.
In Übereinstimmung mit dem Vertahren gemäß der vorliegenden Erfindung können die Carotinoid-produzierenden Organismen, üblicherweise Algen, unter verschiedenen Arten von Bedingungen gezüchtet werden.
Gemäß einer Ausführungsform dieses Erfindungsaspekts werden die Carotinoidproduzierenden Organismen draußen gezüchtet, z. B. im Fall von Dunaliella sp in Außenbecken in einem Wachstumsmedium, das Meerwasser und recycliertes Salzwasser enthält, bei einer Temperatur von zwischen etwa 10°C bis etwa 40°C. Die Organismen können unter Sonnenlicht in einem Bereich von 80% Verschattung bis vollem Sonnenlicht gezüchtet werden. Nach einer bevorzugten Ausführungsform werden die Carotinoid-produzierenden Organismen unter hellem Licht im Bereich von etwa 40% Verschattung bis vollem Sonnenlicht gezüchtet.
Nach einer weiteren Ausführungsform werden die Carotinoid-produzierenden Organismen in einer Wachstumskultur gezüchtet, üblicherweise in einem Fermenter und im allgemeinen bei Raumtemperatur, in diesem Fall wird das Wachstumsmedium üblicherweise verschiedene Salze und Mineralien in unterschiedlichen Kombinationen umfassen (siehe z. B. das folgende Beispiel 1.1). Gemäß dieser Ausführungsform werden die Organismen unter einem Licht breiten Spektrums (Licht, das sich über einen wesentlichen Teil des sichtbaren Lichts erstreckt) von mehr als etwa 10 W/m² und das im Bereich von etwa 10 W/m² bis etwa 200 W/m² liegen kann.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden substantielle Mengen an Phytoen und/oder Phytofluen im allgemeinen nach mehreren Tagen Wachstum des Organismus produziert (z. B. etwa 4–6 Tage).
Das Phytoen und das Phytofluen werden unter Bedingungen erhalten, die die Akkumulierung von Phytoen und Phytofluen in den Zellen der Organismen begünstigen, üblicherweise durch Züchten eines β-Carotin-produzierenden Organismus in Gegenwart von Carotinoid-Biosyntheseinhibitoren, welche Inhibitoren darstellen, die in den folgenden Reaktionsschritten des biochemischen Wegs zur Herstellung von Carotinoiden wirken können. Ein Beispiel dafür ist "der 4-Chlor-Inhibitor" ("the 4-chloro inhibitor"). Wenn es sich bei der Phytoen- und Phytofluen-Quelle um die Mikroalge Dunaliella handelt, wird der 4-Chlor-Inhibitor üblicherweise in das Wachstumsmedium in einer Konzentration von etwa 0,1 μM eingeführt (Ben-Amotz et al., Plant Physiol., 86 : 1286, 1988). Weitere Inhibitoren, die eingesetzt werden können, sind z. B. J334 (Ben-Amotz et al., supra), Sandoz N 6706 (Kümmel, H. W. et al., Z. Naturforsch 30c, 333, 1975), Diphenylamin (DPA) (Foppen F.H., Ann. Ist. Super. Sanita, 439, 1969) und Nikotin (Shaish et al., Plant Cell Physiolo 31 : 689, (1990)).
Gemäß einer Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung wird folglich ein Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung, die wenigstens eine der Verbindungen Phytoen oder Phytofluen umfasst, bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(i) Inkubieren eines Carotinoid-produzierenden Organismus in einer Wachstumskultur unter Licht breiten Spektrums, das eine Intensität über etwa 10 W/m² aufweist, in Gegenwart von einem oder mehreren Carotinoid-Synthese-Inhibitoren;
(ii) Züchten dieser Carotinoid-produzierenden Organismen, bis der Spiegel von wenigstens Phytoen oder Phytofluen zwischen etwa 1 mg/l Kultur bis etwa 50 mg/l Kultur liegt; und
(iii) Abtrennen der Organismen von der Kultur.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein Vertahren zur Herstellung einer Zubereitung, die wenigstens eine der Verbindungen Phytoen oder Phytofluen umfasst, bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(i) Inkubieren eines Carotinoid-produzierenden Organismus in einer Wachstumskultur unter Sonnenlicht in einem Bereich von etwa 80% Verschattung bis vollem Sonnenlicht in Gegenwart von einem oder mehreren Carotinoid-Synthese-Inhibitoren;
(ii) Züchten dieser Carotinoid-produzierenden Organismen, bis der Spiegel von wenigstens Phytoen oder Phytofluen zwischen etwa 1 mg/l Kultur bis etwa 50 mg/l Kultur liegt; und
(iii) Abtrennen der Organismen von der Kultur.

Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung können das Phytoen und das Phytofluen, die in den gezüchteten Organismen erhalten werden, ohne Auftrennung eingesetzt werden.
Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung können das Phytoen und das Phytofluen, die in den gezüchteten Organismen erhalten werden, eingesetzt werden, ohne von der Trockenmasse des produzierenden Organismus abgetrennt zu werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird jedoch nach der Abtrennung des Carotinoid-produzierenden Organismus von der Kultur ferner ein Präparat aus dem Organismus, der Phytoen, Phytofluen oder beide enthält, hergestellt. Üblicherweise ist das Präparat ein Extrakt, der aus den Carotinoid-produzierenden Organismen mittels jeder im Stand der Technik bekannten Extraktionsmethoden hergestellt werden kann, z. B. durch Ethanol : Hexan-Extraktion.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden üblicherweise sowohl Phytoen als auch Phytofluen aus den Carotinoid-produzierenden Organismen erhalten und das Verhältnis von Phytoen zu Phytofluen kann von den Bedingungen abhängen, unter denen der Organismus gezüchtet worden ist, und wenn ein Präparat hergestellt worden ist, kann das Verhältnis von der Art der Methoden abhängen, die zum Erhalt des Präparats eingesetzt worden sind. Jedoch kann zum Teil unter gewissen Bedingungen das Züchten der Carotinoid-produzierenden Organismen gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung dazu führen, das vorwiegend eines oder nur eines der beiden Carotinoide erhalten wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ferner festgestellt, dass das Carotinoidverhältnis ferner zugunsten von Phytoen und Phytofluen durch die Zugabe von Aktivkohle während der Carotinoidextraktion verstärkt werden kann. Die Kohle kann zugegeben werden, wenn ein Inhibitor verwendet wird, aber auch, wenn der Carotinoid-produzierende Organismus ohne den Inhibitor gezüchtet wird. Die Kohle wird später aus der Kultur oder dem Präparat abfiltriert, wobei jede der bekannten Zentrifugations- oder Filtrationsmethoden verwendet werden kann.
Zusätrlich zu dem Vorstehenden können die Carotinoide in der Zubereitung gemäß der Erfindung erfindungsgemäß auch nach jedem der bekannten chemischen oder biochemischen Verfahren oder rekombinanten (gentechnischen) Verfahren hergestellt werden. Chemisch kann Phytoen z. B. aus zwei Geranylgeranylpyrophosphaten (C-20) in einer Reaktion, die durch Phytoensynthase vermittelt werden kann, synthetisiert werden. Das Geranylgeranylpyrophosphat kann direkt, durch Umsetzung von Mevalonsäure oder durch die Kondensation von Pyruvat und Glyceraldehyd-3-phosphat erhalten werden. Phytofluen kann durch Desaturierung von Phytoen hergestellt werden, eine Reaktion, die durch die Phytoen-Desaturase vermittelt werden kann. Die rekombinanten Verfahren umfassen z. B. die Mutagenese von Enzymen, die abwärts (downstream) vom Phytofluen aktiv sind. Diese synthetisierten Phytoene und Phytofluene weisen Aktivitäten auf, die im wesentlichen ähnlich sind zu den Aktivitäten des Phytoens und Phytofluens, die wie vorstehend beschrieben aus Carotinoid-produzierenden Organismen erhalten werden.
Die Stabilität der Carotinoide in der Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung kann untersucht werden, indem die Carotinoidzubereitung mit Licht bestrahlt und/oder die Zubereitung oxidierenden Mitteln ausgesetzt wird. Die Wirkung solcher Behandlungen auf die Carotinoide in den Zubereitungen gemäß der vorliegenden Erfindung ist geringer als die Wirkung solcher Behandlungen auf andere Carotinoide wie z. B. β-Carotin. In Zubereitungen aus dem Stand der Technik, die eine wirksame Menge Carotinoide enthalten, führte solch eine Behandlung üblicherweise zur Zersetzung der Carotinoide, was sich z. B. durch eine Veränderung der Lichtabsorption, d. h. der Farbe, manifestierte. Die antioxidative Wirkung der Zubereitung gemäß der Erfindung kann beispielsweise durch Bestimmung der Antioxidationsschutzwirkung auf DNS bestimmt werden (Salles et al., Anal. Biochem., 232 : 37, 1995).
Im folgenden wird die Erfindung durch die folgende Beschreibung bestimmter Ausführungsformen näher erläutert.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN:
1 zeigt das UV-Absorptionsspektrum einer Zubereitung umfassend Phytoen, das aus mit dem 4-Chlor-Inhibitor gezüchteter Dunaliella sp, extrahiert worden ist.
2 zeigt das UV-Absorptionsspektrum von Phytofluen, das aus mit dem 4-Chlor-Inhibitor gezüchteter Dunaliella sp, extrahiert worden ist.
BEISPIELE
I. MATERIALIEN UND METHODEN
1. Wachstumsmedien
Es wurden die folgenden Wachstumsmedien eingesetzt:
1.1 Ein Wachstumsmedium umfassend:
MgSO₄, 5 mM; CaCl₂, 0,2 mM; KHP₂O₄, 0,2 mM; FeCl₃ + Na₂EDTA, 2 μM + 5 μM; MnCl₂, 7 μM; CuCl₂, 1 μM; ZnCl₂, 1 μM; CoCl₂, 1 μM; (NH₄)₆MO₇O₂₄, 1 μM; NaCl, 1 M; NaHCO₃, 50 mM; KCl, 5 mM.
Dieses Wachstumsmedium wird üblicherweise zum Züchten von Carotinoidproduzierenden Organismen drinnen unter künstlichen Bedingungen verwendet.
1.2 Ein Wachstumsmedium umfassend Meerwasser und rerycliertes Salzwasser in einer Menge, das zu einer 2M Salinität führt. Solch ein Medium wird üblicherweise eingesetzt, wenn ein Carotinoid-produzierender Organismus draußen unter Sonnenlicht gezüchtet wird.
Der finale pH des Wachstumsmediums lag bei 7,0 bis 8,0.
2. Chemikalien
β-Carotin-Biosyntheseinhibitor 4-Chlor-5(methylamino)-2-(3-(trifluormethyl)phenyl)-3(2H-pyridazinon. Der 4-Chlor-Inhibitor wurde für die Phytoen- und Phytofluenherstellung eingesetzt. Der Konzentrationsbereich des 4-Chlor-Inhibitors lag zwischen etwa 0,07 μM bis etwa 0,5 μM.
Es wurde unbehandelte Aktivkohle eingesetzt, um das Verhältnis von Phytoen und Phytofluen zu weiteren Carotinoiden zu erhöhen. Die Kohle wurde bei den letzten Schritten der Herstellung des Extrakts aus dem Extrakt filtriert.
Es wurden verschiedene kommerziell verwendete Öle eingesetzt, um das Phytoen und das Phytofluen zu lösen.
3. Wachstum von Dunaliella sp.
Die Alge Ounaliella sp, wurde unter den folgenden Bedingungen gezüchtet:
3.1 In dem wie vorstehend unter 1.1 beschriebenen Wachstumsmedium in einem Fermenter bei Raumtemperatur unter künstlichem Licht, das in dem Bereich von verdunkeltem Licht (etwa 1 W/m²) bis hellem Licht (über etwa 10 W/m²) lag, üblicherweise unter einem Licht von mehr als 10 W/m² in dem Bereich von 10 W/m² bis etwa 200 W/m².
3.2 In Außenbecken bei einer Temperatur zwischen etwa 10°C bis etwa 40°C unter Lichtbedingungen in dem Bereich von etwa 80% Verschattung bis vollem Sonnenlicht, üblicherweise zwischen 40% Verschattung bis vollem Sonnenlicht.
4. Carotinoid-Extraktionsmethode
Phytoen und Phytofluen wurden durch Inhibierung der β-Carotinsynthese in der Alge Dunaliella sp, hergestellt. Die Konzentration des 4-Chlor-Inhibitors lag bei 0,07 μM bis 1,0 μM.
Die Algen wurden nach 4–6 Tagen Wachstum der Algen entweder drinnen oder draußen, wie vorstehend beschrieben, gesammelt und das Zellpellet wurde mit Ethanol Hexan (1 : 2) v/v extrahiert. Ethanol wurde zuerst zu dem Zellpellet in einem Verhältnis von Algen : Ethanol von wenigstens 1 : 10 zugegeben. In diesem Stadium wurde eine basische Hydrolyse der Esterbindungen durch Zugabe von 0,5M NaOH unter Rühren für wenigstens 30 Minuten durchgeführt. Die Ethanol : Hexan-Phasentrennung wurde durch Zugabe von NaCl in geeigneter Menge erzielt. Die Hexanfraktion wurde spektrophotometrisch untersucht.
Das Hexan wurde unter Vakuum getrocknet und die Carotinoide wurden in Hexan oder Öl erneut aufgelöst.
5. Spektrophotometrische Analyse
Die Absorptionsspektren des Phytoen- und Phytofluenextraktes wurden mittels einem Hewlett Packard 8452A Diodenarray-Spektrophotometer bestimmt.
6. Stabilität von Phytoen und Phytofluen unter aeroben Bedingungen in UV-Licht und verschiedenen Inkubationstemperaturen
Die Stabilität der Carotinoide unter verschiedenen Temperaturen wurde mittels einer Langzeitinkubation von Phytoen und Phytofluen in verschiedenen Arten von Ölen und Lösungsmitteln bei 4°C, 23°C, 30°C und 60°C untersucht. Die Menge an übriggebliebenem Phytoen und Phytofluen wurde spektrophotometrisch bestimmt. Der Prozentsatz an zurückgebliebenem Phytoen und Phytofluen wurde wie folgt bestimmt: Phytoen und Phytofluen nach Behandluna (mg/ml)·100 = % PH und PF zurückgeblieben Phytoen und Phytofluen vor Behandlung (mg/ml)
Die Stabilität unter UV-Licht (254 nm, 365 nm, 254 + 365 nm) für 30 Minuten bei 300/310 μw/cm² wurde untersucht.
7. Stabilität von Phytoen und Phytofluen unter aeroben Bedingungen in sichtbarem Licht
Die Stabilität von Phytoen und Phytofluen unter sichtbarem Licht wurde unter Sonnenlicht (Sommertag mit vollem Sonnenlicht in Rehovot, Israel, Mittagszeit) bestimmt, das durch einen "Hot-Mirror-Filter" filtriert worden war (Andover Corporation, Salem, NH, Durchlässigkeit 400–650 nm). Die Proben wurden in Ethanol gelöst, dem Licht für 30–150 Minuten ausgesetzt und anschließend in Hexan nach basischer Hydrolyse (wie in der vorstehend angegebenen Extraktionsmethode) extrahiert. Die Phytoen-, Phytofluen- und β-Carotinmengen wurden spektrophotometrisch gemessen, und die Prozentsätze Zurückgebliebenes wurden wie vorstehend in Abschnitt 5 dargestellt berechnet.
8. Anti-freies Radikal-Aktivität
8.a Quenchen der Hydroxylradikale:
Die Fähigkeit der Verbindung, die Aktivität von Hydroxylradikalen (°OH) zu quenchen, wurde mittels paramagnetischer Elektronenresonanz (Electron Paramagnetic Resonance, EPR) bestimmt, indem die Signalintensität mit und ohne Verbindung verglichen wurden. Die Hydroxylradikale wurden durch Zersetzung von Wasserstoffperoxid durch Eisen generiert [(FeSO₄) Fentonreaktion]. Das °OH wird durch das DMPO gefangen, um ein DMPO-OH Addukt zu ergeben, das ein charakteristisches Signal im EPR aufweist. Die Verbindung, die aus Phytoen und Phytofluen in einem Verhältnis von jeweils 6,66 : 1 aufweist, wurde zu dem System in drei Endverdünnungen von 1/20, 1/50 und 1/200 zugegeben.
Da mehrere Verbindungen das Signal reduzieren können, nicht durch Fangen des °OH, sondern durch Addition an das DMPO-OH Addukt, ist es notwendig, auch das Signal zu bestimmen, wenn das Produkt nach der Fentonreaktion zugegeben wird (Post-Addition). Die Fähigkeit, das Hydroxylradikal zu fangen, wird theoretisch durch den Unterschied zwischen dem Wert des EPR-Signals, das der Präaddition des Produktes entspricht, und dem Wert des Signals, das aus der Post-Addition resultiert, abgeschätzt.
8.b DNS-Schutz durch Antioxidationswirkungen:
Der Schutz von DNS durch die Antioxidationswirkung der Verbindung wurde auf der Grundlage des Verfahrens von Salles et al. (supra) bestimmt. In diesem Test wurde die Schutzwirkung der Verbindung gegen durch reaktive Sauerstoffspezies (Reactive Oxygen Species, ROS) generierte oxidative DNS-Schädigung gemessen, indem die Inhibierung von DNS-Läsionenbildung unter Verwendung von Plasmid-DNS-Zielen quantifiziert wurde.
II. ERGEBNISSE
Beispiel 1 Phytoen- und Phytofluenherstellung
Phytoen und Phytofluen wurden aus der Alge Dunaliella sp. produziert, indem die Alge in Gegenwart von 0,1 bis 0,5 μg des β-Carotin-Biosyntheseinhibitors, des vorstehend beschriebenen 4-Chlor-Inhibitors, gezüchtet wurde. Die Kulturen wurden anschließend extrahiert und das Extrakt wurde mittels Verdampfung getrocknet und erneut in Hexan oder Öl aufgelöst. In den extrahierten Carotinoiden konnten keine Rückstände des 4-Chlor-Inhibitors gefunden werden.
Wie in der 1 dargestellt, zeigte sich der Hauptabsorptionspeak von Phytoen bei 286 nm (UVB) und wie in der 2 dargestellt, zeigte sich der Hauptabsorptionspeak von Phytofluen bei 348 nm (UVA). Wie erwartet lag der Hauptabsorptionspeak für β-Carotin bei 450 nm. Das β-Carotin wurde aufgrund der Syntheseinhibierung vermindert, während Phytoen und Phytofluen anstiegen.
Beispiel 2 Beispiel für die Stabilität des extrahierten Phytoens und Phytofluens unter UV-Licht
Die Stabilität der Phytoen- und Phytofluenextrakte, die wie in Beispiel 1 vorstehend beschrieben erhalten wurden, wurden mittels spektrophotometrischer Analyse bestimmt. Phytoen und Phytofluen wurden in Hexan oder in Öl gelöst. Die Absorption des Präparats wurde bei 220 bis 600 nm bestimmt und die Menge jeder der vorstehend genannten Carotinoide in jeder Probe wurde berechnet, um den Prozentsatz der Carotinoide, die nach der Bestrahlung des Extrakts gemessen wurden, geteilt durch die Menge der gleichen Carotinoide, die in dem Extrakt gemessen wurden, bevor dieser der Bestrahlung ausgesetzt wurde, zu bestimmen (siehe Materialien und Methoden 5, vorstehend angegeben). Die Stabilität des Phytoens und des Phy tofluens wurden gemessen, indem das Extrakt sowohl UVA-licht (365 nm) als auch UVB-Licht (254 nm) Bestrahlung wie auch einer Kombination von UVA- und UVB-Bestrahlung ausgesetzt wurde.
Wie in der Tabelle 1 im folgenden dargestellt, waren Phytoen und Phytofluen, die in Öl oder in Hexan gelöst waren, gegenüber der Aussetzung von UVA-, UVB- und UVA-B-Bestrahlung sehr stabil.
Tabelle 1 PH und PF Stabilität bei UV-Bestrahlung (30 Minuten Aussetzung)
Die Stabilität von Phytoen und Phytofluen unter verschiedenen Temperaturbedingungen (4°C, 23°C, 30°C und 60°C) in Hexan oder in anderen kommerziell verwendeten Ölen wurde ebenfalls gemessen.
Die Messungen wurden über einen Zeitraum von 4 Monaten durchgeführt.
Es konnte festgestellt werden, dass Phytoen und Phytofluen über den gesamten gemessenen Temperaturbereich stabil waren, ohne dass die Art des verwendeten Öls, in welchem die Carotinoide gelöst wurden, einen merkbaren Einfluss ausübte.
Beispiel 3 Stabilität von dem extrahierten Phytoen und Phytofluen in sichtbarem Licht
Die Stabilität von Phytoen und Phytofluen wurde mit jener von β-Carotin (wie vorstehend in Materialien und Methoden beschrieben) unter sichtbarem Licht verglichen. Die Absorption des Präparats wurde von 220 bis 600 nm Wellenlänge bestimmt und die Menge jeder der vorstehend genannten Carotinoide in jeder Probe wurde berechnet, um den Prozentsatz Carotinoide, die nach Bestrahlung des Extrakts gemessen wurden, mit den Messungen vor der Bestrahlung zu vergleichen (siehe Beispiel 2, vorstehend angegeben).
Wie in der Tabelle 2 dargestellt, verursacht die Aussetzung gegenüber sichtbarem Licht hoher Intensität einen deutlich höheren Abbau von β-Carotin im Vergleich zu Phytoen und Phytofluen.
Tabelle 2 PH und PF Stabilität in sichtbarem Licht (15-150 Minuten Aussetzung)
Beispiel 4 Anti-freies Radikal-Aktivität
4.a Quenchen von Hydroxylradikalen
Das Quenchen von Hydroxylradikalen wurde wie vorstehend in Materialien und Methoden beschrieben mittels EPR gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse (Tabelle 3) zeigen eine dosisabhängige Aktivität des Produkts, das Hydroxylradikal zu fangen.
Tabelle 3
Der Produkt bestand aus Phytoen und Phytofluen in einem Verhältnis von je 6,66 : 1 bei einer Anfangskonzentration von Phytoen von 0,02 mg/ml und von Phytofluen von 0,003 mg/ml.
Der Mittelwert jeder dieser Ergebnisse entspricht 3 Messungen.
4.b Antioxidationswirkung:
Der Schutz von DNS durch die Antioxidationswirkung von Phytoen und Phytofluenextrakten wurde auf der Grundlage der Salles-Methode (supra), wie vorstehend in Materialien und Methoden 7.b beschrieben, bestimmt.
Wie im folgenden in Tabelle 4 dargestellt, waren wie vorstehend beschrieben erhaltenes Phytoen und Phytofluen in der Lage, gegen Hydroxylradikale zu schütren.
Beispiel 5 Die Schutzwirkungen auf DNS durch Phytoen und Phytofluen
Genotoxische Wirkung
Die Genotoxizität wird als die Induktion der DNS-Reparatursyntheseaktivität gemessen und wird durch das Verhältnis (R) ausgedrückt : während R ≤ 2 keine toxische Wirkung anzeigt Tabelle 4 PH und PF Antioxidationsaktivität
Wie in der folgenden Tabelle 5 dargestellt, sind Phytoen und Phytofluen nicht genotoxisch.
Der R-Parameter liegt deutlich unter 2 (Schutzwirkung) und ist im Vergleich zu der positiven Kontrolle, die eine bekannte genotoxische Verbindung ist, sehr viel niedriger.
Tabelle 5 Genotoxische Wirkung von Phytoen und Phytofluen
Beispiel 6

Im folgenden werden Beispiele von Zubereitungen angegeben, die gemäß der vorliegenden Erfindung angewendet werden können: A – Emulgiertes O/W Gel (topischer Weg):

Carbopol 981 (erhältlich bei Goodrich)	0,6 g
Ethylalkohol	15 g
flüchtiges Siliconöl	3 g
Purcellinöl	7 g
Konservierungsmittel	0,3 g
Parfum	0,4 g
Triethanolamin	0,2 g
Phytoen	0,01 g
Phytofluen	0,001 g
destilliertes Wasser.qs	100 g

B – Wasserfreies Gel (topischer Weg):

Propylenglycol	25 g
Hydroxyethylcellulose	0,8 g
Polyethylenglycol	25 g
Phytoen	1 g
Phytofluen	1 g
absoluter Ethanol	100 g

C – Emulsion vom O/W-T to ischer We

flüssiges Paraffin	6 g
flüssiges Lanolin	3 g
Arlacel 165 (erhältlich bei Atlas)	6 g
Tween 60 (erhältlich bei Atlas)	2 g
Cetylalkohol	1,2 g
Stearinsäure	2,5 g
flüchtiges Siliconöl	10 g
Triethanolamin	0,1 g
Konservierungsmittel	0,3 g
Antioxidationsmittel	0,3 g
-Phytoen	0,3 g
Phytofluen	0,2 9
destilliertes Wasser.qs	100 g

D – Liposomhaltige Creme (topischer Weg):

Sonnenblumenöl	35 g
Cetylalkohol	4 g
B-Sitosterol	4 g
Dicetylphosphat	0,5 g
Konservierungsmittel	0,3 g
Parfum	0,6 g
Carbopol 981 (erhältlich bei Goodrich)	0,2 g
Triethanolamin	0,2 g
Sphingosin	0,05 g
Phytoen	0,00001 g
Phytofluen	0,000001 g
destilliertes Wasser.qs	100 g

E – Per os Zubereitung:

Talk	5 g
Aerosil	200 5 g
Zn-Stearat	5 g
Phytoen	0,0000015 g
Phytofluen	0,000001 g
Lactose qs	400 g

F – Emulsion W.O. (topischer Weg):

Protegin (erhältlich bei Goldschmidt)	19 g
Glycerin	3 9
Vaselineöl	g g
Phytofluen	0,5 g
Phytoen	0,5 g
Mg-Sulfat	0,5 g
Parfum	0,8 g
Konservierungsmittel	0,2 g
Wasser.qs	100 g

Claims

Eine Zubereitung, die bei der Vorbeugung von Oxidation oder UV-Lichteinwirkungsschaden wirksam ist, dadurch gekennzeichnet, dass – sie als einen aktiven Inhaltsstoff eine Kombination aus Phytoen und Phytofluen umfasst, – sie im wesentlichen farblos ist, – sie ein Absorptionsspektrum im UV-Wellenbereich aufweist.
Eine Zubereitung gemäß Anspruch 1, die ein topisches Haut-Präparat zum Schutz der Haut gegen Umweltrisiken ist und Phytoen und Phytofluen in einer wirksamen Menge enthält, so dass diese Carotinoide in Kombination eine Oxidationsschutz- und UV-Schutz-Wirkung auf der Haut ausüben.
Eine Zubereitung gemäß Anspruch 2, welche eine kosmetische oder pharmazeutische Zubereitung ist.
Eine Zubereitung gemäß Anspruch 1, welche ein Lebensmittelzusatz ist.
Eine Zubereitung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Gewichtsverhältnis zwischen Phytoen und Phytofluen in der Zubereitung im Bereich von 200 : 1 bis 1 : 200 liegt.
Eine Zubereitung gemäß Anspruch 5, worin das Gewichtsverhältnis zwischen Phytoen und Phytofluen in der Zubereitung bei 50 : 1 bis 1 : 50 liegt.
Eine Zubereitung gemäß Anspruch 6, worin das Gewichtsverhältnis zwischen Phytoen und Phytofluen in der Zubereitung im Bereich von 10 : 1 bis 1 : 10 liegt.
Eine Zubereitung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, die einen hydrophoben Träger umfasst.
Eine Zubereitung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, die zusätrlich Zetacarotin umfasst.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung, die wenigstens eine Kombination von Phytoen und Phytofluen umfasst, umfassend die Schritte: (i) Inkubieren eines Carotinoid-produzierenden Organismus in einer Wachstumskultur unter Licht breiten Spektrums, das eine Intensität über 10 W/m² aufweist, in Gegenwart von einem oder mehreren Carotinoid-Synthese-Inhibitoren; (ii) Züchten dieser Carotinoid-produzierenden Organismen, bis der Spiegel von wenigstens Phytoen oder Phytofluen zwischen 1 mg/l Kultur bis 50 mg/l Kultur liegt; (iii) Abtrennen der Organismen von der Kultur; und (iv) Herstellen eines Präparats, das eine Kombination aus Phytoen und Phytofluen oder beide umfasst, aus dem abgetrennten Organismus.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 10, worin das Licht eine Intensität im Bereich von zwischen 20 W/m² bis 200 W/m² aufweist.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung, die wenigstens eine Kombination von Phytoen oder Phytofluen umfasst, umfassend die Schritte: (i) Inkubieren eines Carotinoid-produzierenden Organismus in einer Wachstumskultur unter Sonnenlicht in einem Bereich von 80% Verschattung bis volles Sonnenlicht in Gegenwart von einem oder mehreren Carotinoid-Synthese-Inhibitoren; (ii) Züchten dieser Carotinoid-produzierenden Organismen, bis der Spiegel von wenigstens Phytoen oder Phytofluen zwischen 1 mg/l Kultur bis 50 mg/l Kultur liegt; (iii) Abtrennen der Organismen von der Kultur; und (iv) Herstellen eines Präparats, das eine Kombination aus Phytoen und Phytofluen oder beide umfasst, aus dem abgetrennten Organismus.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 12, worin der Sonnenlicht-Bereich zwischen 80% Verschattung bis vollem Sonnenlicht liegt.
Ein Vertahren gemäß Anspruch 12, worin die Organismen unter vollem Sonnenlicht gezüchtet werden.
Ein Vertahren gemäß einem der Ansprüche 10 bis 14, worin das Präparat ein Extrakt ist.
Ein Vertahren gemäß Anspruch 15, worin das Extrakt ein Ethanol : Hexan-Extrakt ist.
Ein Vertahren gemäß einem der Ansprüche 10 bis 16, worin der Carotinoidproduzierende Organismus eine Mikro-Alge ist.
Ein Vertahren gemäß Anspruch 17, worin die Mikro-Alge Dunaliella sp. ist.
Ein Vertahren gemäß einem der Ansprüche 10 bis 18, worin der Carotinoid-Synthese-Inhibitor 4-Chlor-5(methylamino)-2-(3-(trifluormethyl)phenyl)-3(2H)pyridazinon ist.
Ein Vertahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 19, worin das Extrakt keine Spuren des Inhibitors umfasst.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 20, das zusätzlich die Zugabe von Kohle zum Carotinoid-Präparat während dessen Herstellung umfasst.
Eine Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das Phytoen und das Phytofluen durch chemische Synthese hergestellt werden.
Eine Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das Phytoen und das Phytofluen durch rekombinante Verfahren hergestellt werden.