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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG 1. Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung betrifft transkutane
Immunisierung unter Verwendung eines ADP-ribosylierenden Exotoxins, dessen bindende
B-Untereinheit, oder Toxoid eines ADP-ribosylierenden Exotoxins als Adjuvanz
mit einem Antigen, und die Verwendung von Penetationsförderern
und für
die Zerstörung
der oberen Hautschichten geeigneten Mitteln zur Verstärkung der
Immunantwort. Die Erfindung betrifft außerdem die Aktivierung des Antigens,
Adjuvanz, deren Targets in der Haut, oder eine Kombination davon,
zur Verstärkung
der antigenspezifischen Immunantwort, die dagegen induziert wurde.
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2. Beschreibung des Stands
der Technik
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Die Haut, das größte Organ des menschlichen
Körpers,
ist ein wichtiger Teil der Körperabwehr
gegen die Invasion von infektiösen
Agentien und Kontakt mit schädlichen
Chemikalien (siehe Bos. 1997). Unerwünschte Hautreaktionen wie allergische
oder atopische Dermatitis sind bekannt, aber das Auslösen einer systemischen
Immunantwort durch Anwendung eines Adjuvanz und Antigens, das spezifische
Immuneffektoren freisetzt und einen therapeutischen Vorteil vermittelt,
durch die einfache Anwendung von Adjuvanz und Antigen auf der Haut
scheint vor unserer Erfindung noch nicht gelehrt oder vorgeschlagen
worden sein.
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Choleratoxin (CT) und hitrelabiles
Enterotoxin von E. coli (LT) sind Beispiele für eine schädliche Chemikalie, von der
man erwarten würde,
dass die schützenden
Schichten der Haut gegen die Penetration durch diese schädlichen
Substanzen schützen.
Craig (1965) berichtete, dass Stuhlfiltrate von Cholerapatienten,
die intrakutan in Kaninchen oder Meerschweinchen induziert wurden,
eine charakteristisch verzögerte,
anhaltende, ödemartige
Verhärtung
(Schwellung) hervorriefen, die durch die Anwesenheit von Toxin in
der Haut induziert wurde. Die Schwellung und das Austreten von Flüssigkeit
aus den Gefäßen (engl. "vascular leakage") war so dramatisch,
dass es einem unbekannten Permeabilitätsfaktor zugesprochen wurde,
von dem später
gezeigt wurde, dass es sich um CT selbst handelte. Daher konnte
man vernünftigerweise
erwarten, dass CT extrem reaktionsfreudig (reaktogen) sein würde, wenn
es auf die Haut aufgebracht wird, ähnliche Röte und Schwellung verursachend,
wenn es in die Haut eindringt. Der Craig-Test des Injizierens von
CT in die Haut wurde eine Standardmessung für die Anwesenheit und die Menge
von CT in Stuhlfiltraten oder Kulturmedien. Daten bestätigten,
dass diese Hautreaktivität
auf Choleratoxin zurückzuführen war
(siehe Finkelstein und LoSpallutto, 1969).
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Craig (1965) warnte "Die Abwesenheit von
Hautschäden
bei klinischer Cholera schließt
sicherlich nicht die Möglichkeit
aus, dass die Schadstoffe, die für
die Darmschädigung
verantwortlich sind, auch eine schädliche Auswirkung auf die Haut
haben können,
vorausgesetzt, dass sie in ausreichender Konzentration auf die Haut
angewendet werden." Die
extreme Fähigkeit
von Choleratoxin, eine Reaktion (Reaktogenität) in der Haut hervorzurufen,
wurde als ein Test für
seine Toxizität
verwendet und der Stand der Technik bewies eine Erwartung, dass
Choleratoxin reaktogen sein würde,
wenn es auf der Haut angewendet würde, eine unerwünschte Reaktion
hervorrufend. Solche nachteiligen Reaktionen sind durch bekannte
Autoritäten
auf dem Gebiet gut dokumentiert (Craig, 1972).
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Im Gegensatz dazu haben wir gezeigt,
dass Choleratoxin immunogen ist, sowohl als Antigen als auch als
Adjuvanz wirkt, wenn auf die Haut aufgetragen wird, aber ohne irgendwelche
daraus resultierende lokale oder systemische Nebenwirkungen. Dieses
Fehlen von Reaktogenität,
wenn Choleratoxin für
transkutane Immunisierung auf die Haut aufgetragen wurde, war überraschend
und stand im Gegensatz zu Schlussfolgerungen, die man aus dem Stand
der Technik gezogen hätte.
Insbesondere wirkt CT, das erfindungsgemäß auf die Haut aufgetragen
wurde, als ein nicht toxisches, nicht reaktogenes Adjuvanz, im Gegensatz
zu den Erwartungen von Craig, während
Injektion von CT in die Haut Schwellung und Rötung hervorruft. Daher war
es vor unserer Erfindung nicht naheliegend, dass Choleratoxin oder
andere ADP-ribosylierende Exotoxine, wenn sie topisch angewendet
werden, für
transkutane Immunisierung verwendbar sind. Tatsächlich ist gezeigt worden, dass
hohe Dosen von hitzelabilem Enterotoxin (LT), das auf die Haut von
Menschen aufgetragen wurde, eine systemische Immunantwort ohne lokale
oder systemische Toxizität
induziert.
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Diese unerwartete Fehlen von Reaktogenität ist sehr
wichtig für
die Verwendung von Vakzinen. Vakzin-Antigene und -Adjuvanzien sind
verwendbar, wenn die Immunisierung eine schützende Immunantwort ohne signifikante,
unerwünschte
Reaktionen hervorruft. Historisch gesehen wurde die Reaktogenität von Vakzinen
wie Schwellung, Schmerzempfindlichkeit und Schmerzen an der Injektionsstelle
in einigen Fällen
(z. B. Typhoid und Pertussis) wegen der Vorteile der Vakzinierung
akzeptiert. Hohe Grade an Reaktogenität und andere Nebenwirkungen
sind jedoch unerwünscht
und wären
problematisch für
die Entwicklung von neuen Vakzine-Adjuvanz und Antigenkandidaten.
Forschungsbemühungen
konzentrieren sich auf die Herstellung von Vakzine-Adjuvanzien,
die stimulatorisch sind, aber keine unerwünschten Reaktionen hervorrufen.
Gesamtrellpertussis-Vakzinien induzieren systemische und lokale
Nebenwirkungen und als Ergebnis wird diese wirksame Vakzine und
bewährte
Vakzine durch azelluläre
Pertussisvakzinien ersetzt, nur weil diese weniger reaktogen sind.
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Die vorliegende Erfindung unterscheidet
sich von der des Patents Nr. 5,830,877, welches die Verwendung eines
nackten Plasmids lehrt, das biologisch aktive Peptide in einem Säugerwirt
kodiert. Die hier beschriebene Erfindung lehrt die Verwendung von
einem ADP-ribosylierenden Exotoxin-Adjuvanz und -Antigen oder Nukleinsäure, die
zusammen auf der Haut verabreicht werden, um eine Immunantwort zu
induzieren. Die hier beschriebene Erfindung unterscheidet sich weiterhin
von der des Patents Nr. 5,830,877, die von der Verwendung von Peptiden
wegführt,
die nicht auf einer Nukleinsäure
kodiert sind und von der Wirtszelle produziert werden, wegen der
Toxizität,
die mit biologisch aktiven Peptiden assoziiert ist, den Problemen
und Kosten der Isolierung, Aufreinigung und Synthese von Peptiden
und ihren kurzen Halbwertszeiten in vivo, die sich aus der Degradation
durch Proteasen, die im Targetgewebe vorhanden sind, ergeben. Dies
führt weg
von dem Zusatz eines Adjuvanz, wie einem Choleratoxin, zu einem
gemeinsam verabreichten Antigen oder einer Nukleinsäure. Tatsächlich hat
die Neuheit der Fähigkeit
eines großen
Moleküls
wie CT, eine Immunantwort durch Anwendung durch die Haut ohne Toxizität zu induzieren,
zu einer Vielzahl von wissenschaftlichen Veröffentlichungen geführt, die
diese Neuheit und öffentliche
Aufregung über
die möglichen
Implikationen eines Proteintransfers für Vakzinierung durch Hautanwendung
beschrieben. Im Gegensatz zu Patent Nr. 5,830,877 hängt die
Erfindung nicht von lokaler Entzündung
oder Reizung ab, um die Permeabilität von Zellmembranen zu erhöhen, um
die Aufnahme des Antigens, Plasmids oder RNA zu verstärken. Tatsächlich ist
das herausragende Merkmal in Bezug auf die transkutane Immunisierung
das Fehlen von lokaler Entzündung.
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Im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung
lehrt Patent Nr. 5,824,313 die Anwendung von extrem kleinen (weniger
als 500 Daltons) Lymphoidorgan-modifizierenden Agentien wie 1,25-Dihydroxy-l6-en
Vitamin D3 und Calzipotrien oder Dehydroepiandrosteron
(DHEA), DHEA-Artverwandte und DHEA-Derivative mit der intramuskulären Injektion
von einem Antigen, um Antikörperantworten
zu bewirken.
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Transkutane Immunisierung erfordert
sowohl die Passage eines Antigens durch die äußeren Barrieren der Haut, von
denen angenommen wurde, dass sie undurchlässig für eine solche Passage sind,
und einer Immunantwort auf das Antigen. Fisher's Kontaktdermatitis stellt fest, dass
Moleküle
von mehr als 500 Daltons die Haut normalerweise nicht durchdringen
können.
Es gibt einen Bericht bei Paul et al. (1995) über die Induktion einer Immunantwort
mit Transferosomen, einer Lipidstruktur, die sich von Liposomen
unterscheidet. In dieser Veröffentlichung
wurden die Transferosome als ein Vehikel für Antigen (Rinderserumalbumin
und Gap-junction-Proteine) verwendet, und die Komplement-vermittelte
Lyse von Antigen-sensibilisierten Liposomen wurde gemessen. Die
Grenze für
die Durchdringung der Haut durch Antigen wurde mit 750 Daltons beschrieben.
In ihrer Studie wurde keine Immunantwort induziert, wenn eine Antigen-enthaltende
Lösung
auf die Haut aufgebracht wurde; nur Transferosome waren in der Lage,
eine Immunantwort zu induzieren. Paul und Cvec (1995) stellten außerdem fest,
dass es „unmöglich ist,
mit einfachen Peptid- oder Proteinlösungen epikutan zu immunisieren".
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Solche Referenzen erklären, warum
unsere erfolgreiche Verwendung eines Moleküls wie Choleratoxin (das 85.000
Daltons aufweist) als ein Antigen oder Adjuvanz in der Immunisierung
durch das Fachgebiet mit Überraschung
aufgenommen wurde, weil von solch großen Molekülen nicht erwartet wurde, dass
sie die Haut durchdringen, und daher wurde von ihnen nicht erwartet,
dass sie eine spezifische Immunantwort induzieren. Wir haben jedoch
in der US-Anmeldung Nr. 08/749,164 (eingereicht am 14. November
1996,
US 5,910,306 ); der
US-Anmeldung Nr. 08/896,085 (eingereicht am 17. Juli 1997,
US 5,980,989 ) und in der
internationalen Anmeldung PCT/US97/21324 (eingereicht am 14. November
1997, WO 98/20734) gezeigt, dass die Verwendung eines ADP-ribosylierenden Exotoxin
wie Choleratoxin als ein Antigen eine starke Antikörperantwort
auslösen kann,
die hoch reproduzierbar ist. Wenn ein ADP-ribosylierendes Exotoxin
wie Choleratoxin als Immun-Adjuvanz verwendet wurde und in einer
Salzlösung
mit einem separaten Antigen (z. B. Diphtheriatoxoid) auf die Haut
aufgebracht wurde, konnte eine systemische und mukosale Antigen-spezifische
Antikörperantwort
ausgelöst
werden. In der vorliegenden Anmeldung offenbaren wir, dass transkutane
Immunisierung unter Verwendung eines Penetationsförderers,
eines für
die Zerstörung
der oberen Hautschichten geeigneten Mittels oder Kombinationen davon,
die adjuvante Aktivität
eines bakteriellen Exotoxins verbessern können.
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Wir haben gezeigt, dass hitzelabiles
Enterotoxin von E. coli (LT), Pseudomonas Exotoxin A (ETA), Pertussistoxin
(PT) und eine große
Vielzahl von Antigenen, einschließlich abgetöteten Rabiesvirus, Rekombinante wie
HIV p55 gag, Polysaccharidkonjugate wie Hib, Ultraschallextrakte,
zum Beispiel Pertaktin, wie Choleratoxin (CT) in der Lage sind,
die Haut zu durchdringen und eine Immunantwort auszulösen. Zusätzlich können CT,
LT, ETA und PT und bakterielle DNA als Adjuvanzien wirken, um eine
Immunantwort gegen Antigene zu induzieren, die mit auf die Haut
verabreicht wurden. Daher kann Tetanustoxoid, das selbst auf der
Haut nicht immunogen ist, eine starke Immunantwort induzieren, wenn
es mit CT auf die Haut aufgebracht wird. Wir haben vorgeschlagen,
dass die Population von Langerhans-Zellen, die unterhalb der Aufbringungsstelle
liegt, bevorzugte Antigen-präsentierende
Zellen für
den Transfer von Antigen zum Immunsystem darstellen. Das Adjuvanz
kann auf die Antigen-präsentierende
Zelle direkt oder durch Lymphozyten, die das Antigen erkennen, einwirken.
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Wir schlagen vor, die Immunantwort
auf transkutanes Adjuvanz und/oder Antigen durch Verwendung von
penetrationsfördernden
Techniken zu verstärken.
Nach Hurley "verdankt
die Haut ihre Haltbarkeit der Dermis, aber die chemische Undurchlässigkeit
befindet sich in der Epidermis und nahezu ausschließlich in
ihrer toten äußeren Schicht,
dem Stratum Corneum." Für transkutane
Immunisierung unter Verwendung von beispielsweise einem ADP-ribosylierenden
Exotoxin als Adjuvanz und einem löslichen Proteinantigen, wie
Diphtherietoxoid, muss eine Penetration des Stratum Corneum stattfinden.
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Penetrationsfördernde Techniken würden so
ausgestaltet werden, dass sie die Bewegung von transkutanen Antigenen
und Adjuvanzien durch die Stratum Corneum-Schicht der Haut verstärken.
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Des Weiteren schlagen wir vor, dass
transkutane Immunisierung unter Verwendung von Aktivierung von mindestens
einem der Antigen-, Adjuvanz- oder Hautkomponente, die Immunantwort
verstärken
wird, gemessen an quantitativen und qualitativen Parameter. Das
Antigen-Adjuvanz der Formulierung kann durch Trypsinspaltung eines
bakteriellen Exotoxins (z. B. Trypsin-gespaltenes LT, mit oder ohne
Reduktion) aktiviert werden. Aktivierung der Haut an der Auftragsstelle
der Formulierung kann durch die Verwendung von für die Zerstörung der oberen Hautschichten
geeigneten Mitteln (z. B. Aceton, Alkohol) erreicht werden, was
die Größe oder
Aktivierung der unterhalb liegenden Langerhans-Zellpopulation erhöht, oder durch ein Enzym oder Kombination
von Enzymen (z. B. Enzymen mit Sialidaseaktivität), was die Erreichbarkeitsmenge
von Gangliosid GM1-Rezeptor
erhöht.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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In einem Aspekt stellt die vorliegende
Erfindung die Verwendung von mindestens einem Antigen bereit, mindestens
einem ADP-ribosylierenden Exotoxin, dessen bindender B-Untereinheit oder
Toxoid eines ADP-ribosylierenden Exotoxins als Adjuvanz, und eines
pharmazeutisch akzeptablen Trägers
bereit, zur Herstellung einer Zusammensetzung für die transkutane Immunisierung
durch Induzieren einer antigenspezifischen Immunantwort in einem
Subjekt, wobei die Formulierung in einer therapeutisch wirksamen
Menge auf die vorbehandelte Fläche
der Haut des Subjekts, die nicht perforiert ist, aufgebracht wird
und die Vorbehandlung mindestens das Stratum Corneum der Haut angreift.
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In einem anderen Aspekt stellt die
Erfindung einen Artikel für
transkutane Immunisierung bereit, umfassend (i) eine Zusammensetzung,
die mindestens ein Antigen und mindestens ein ADP-ribosylierendes
Exotoxin, dessen bindende B-Untereinheit oder ein Toxoid eines ADP-ribosylierenden
Exotoxins als Adjuvanz einschließt; (ii) ein Verband, der zur
Adhäsion
geeignet ist; und (iii) einen Verstärker der Hautpenetration, wobei der
Artikel so angepasst ist, dass die Zusammensetzung unter dem Verband
auf die Haut des Subjekts aufgebracht wird und der Verstärker der
Hautpenetration so angepasst ist, dass er zumindest das Stratum
Corneum der Haut ohne Perforation angreift.
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Erfindungsgemäß wird auch ein Kit für dies transkutane
Immunisierung bereitgestellt, umfassend:
mindestens ein Antigen
und mindestens ein ADP-ribosylierendes Exotoxin, dessen bindende
B-Untereinheit oder Toxoid eines ADP-ribosylierenden Exotoxins als
Adjuvanz in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger; und
mindestens ein
Verstärker
der Hautpenetration oder eine Vorrichtung zum Angreifen einer Barriere,
wobei der Verstärker
der Hautpenetration oder die Vorrichtung zum Angreifen einer Barriere
so ausgelegt sind, das sie zumindest das Stratum Corneum der Haut
des Subjekts angreifen, ohne die Haut des Subjekts zu perforieren, um
eine Immunantwort zu induzieren, die für das Antigen spezifisch ist.
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Die Erfindung stellt außerdem eine
Vorrichtung zum Überwinden
einer Barriere mit einer Vielzahl von Zinken bzw. Zacken für die transkutane
Immunisierung bereit, wobei die Zacken mit einer Zusammensetzung beschichtet
sind, die mindestens ein Antigen und mindestens ein ADP-ribosylierendes
Exotoxin, dessen bindende B-Untereinheit oder Toxoid des ADP-ribosylierenden
Exotoxins enthält,
und wobei die Zacken so ausgebildet sind, dass sie zumindest das
Stratum Corneum der Haut des Subjekts angreifen, ohne die Haut des Subjekts
zu perforieren.
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung
betrifft eine Treibmittelvorrichtung für die transkutane Immunisierung,
wie ein Abschussgerät,
wobei die Vorrichtung eine Formulierung umfasst, die mindestens
ein Antigen und mindestens ein ADP-ribosylierendes Exotoxin, dessen
bindende B-Untereinheit oder Toxoid eines ADP-ribosylierenden Exotoxins
als Adjuvanz enthält,
und wobei die Vorrichtung so ausgelegt ist, dass sie die Formulierung
durch Penetration in die Epidermis oder oberflächliche Dermis der Haut eines
Subjekts verabreicht, aber die Dermis nicht penetriert.
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Insbesondere kann das Adjuvanz oder
Antigen oder die Haut die Penetration des Stratum Corneum oder der
Epidermis unterstützen,
um den Antigen-präsentierenden
Zellen des Immunsystems (z. B. Langerhanszellen in der Epidermis,
dermale dendritische Zellen, dendritische Zellen, follikuläre dendritische
Zellen, Makrophagen, B-Lymphozyten) zu begegnen und/oder die Antigen-präsentierenden
Zellen zu veranlassen, das Antigen zu phagozytieren. Die Antigen-präsentierenden
Zellen präsentieren
dann das Antigen den T- und B-Zellen.
Im Fall der Langerhanszellen können
die Antigen-präsentierenden
Zellen dann von der Haut zu den Lymphknoten wandern und Antigen
den Lymphozyten präsentieren
(z. B. B- und/oder T-Zellen), wodurch sie eine antigenspezifische
Immunantwort induzieren.
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Zusätzlich kann die Aktivierung
des Antigens, Adjuvanz, der Haut oder einer Kombination davon erreicht
werden, um den Immunisierungsprozess zu unterstützen.
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Zusätzlich zum Auslösen von
Immunreaktionen, die zur Bildung eines antigenspezifischen B-Lymphozyten
und/oder T-Lymphozyten einschließlich eines zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL)
führen,
ist es eine weitere Aufgabe der Endung, durch Verwendung des transkutanen
Immunisierungssystems, Komponenten des Immunsystems positiv und/oder
negativ zu regulieren, um antigenspezifische Helfer (Th1 und/oder
Th2) oder Hypersensitivität
(DTH) T-Zelluntergruppen vom verzögerten Typ zu beeinflussen.
Dies kann durch das unterschiedliche Verhalten von CT und LT veranschaulicht
werden, das unterschiedliche T-Helferantworten oder unterschiedliche
Grade von Schutz in in vivo Challenge Formen bei Verwendung von
transkutaner Immunisierung zur Folge haben kann.
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BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1a–f sind Photographien, die
keine Entzündung
an der Stelle der Immunisierung (A, B), Aktivierung von Langerhanszellen
durch LT in menschlicher Haut an der Stelle der Immunisierung (C,
E) und das Fehlen der Aktivierung von Langerhanszellen in der Haut
des kontralateralen Arms (D, F) zeigen.
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2a–d sind Photographien, die
normale Langerhanszellen (A, B, 200- und 400-fach) und die Aktivierung
von Langerhanszellen durch Choleratoxin in Maushaut (C, D, 200-fach
und 400-fach) zeigen.
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BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
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Die verschiedenen Aspekte der Erfindung,
für die
um Schutz ersucht wird, sind in den anhängenden Ansprüchen definiert.
In einer Ausführungsform
der Erfindung wird eine erfindungsgemäß hergestellte Formulierung,
die ein Antigen und Adjuvanz wie CT und DT enthält, nach Förderung der Penetration der
Haut auf die intakte Haut eines Organismus aufgebracht, das Antigen
wird Immunzellen präsentiert
und eine antigenspezifische Immunantwort wird induziert, ohne die
Haut zu perforieren. Die Formulierung kann zusätzliche Antigene und Nukleinsäuren enthalten,
so dass eine transkutane Anwendung der Formulierung eine Immunantwort
gegen mehrere Antigene induziert oder Nukleinsäuren, die für Antigene kodieren, vorzugsweise
von 2 bis 20, aber möglicherweise
bis zu 200. In einem solchen Fall kann, muss aber nicht, das Antigen
aus der gleichen Quelle stammen, die Antigene werden aber unterschiedliche
chemische Strukturen haben, so dass Immunantworten spezifisch für die unterschiedlichen
Antigene induziert werden. Antigenspezifische Lymphozyten können an
der Immunantwort beteiligt sein, und im Fall der Beteiligung von
B-Lymphozyten können
antigenspezifische Antikörper
Teil der Immunantwort sein.
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Die erfindungsgemäß hergestellte Formulierung
kann verwendet werden, um einen Organismus zu behandeln. Wenn das
Antigen von einem Pathogen abgeleitet ist, vakziniert die Behandlung
den Organismus gegen Infektion durch das Pathogen oder gegen seine
pathogene Wirkungen wie solche, die durch Toxinsekretion verursacht
werden. Eine Formulierung, die ein Tumorantigen beinhaltet, kann
eine Krebsbehandlung bereitstellen; eine Formulierung, die ein Allergen
beinhaltet, kann dazu verwendet werden, eine allergische Erkrankung
zu behandeln; eine Formulierung, die ein Autoantigen beinhaltet,
kann eine Behandlung für
eine Erkrankung, die durch das eigene Immunsystem des Organismus
bewirkt wird (z. B. Autoimmunerkrankungen) bereit stellen. Die Erfindung
kann therapeutisch verwendet werden, um vorhandene Erkrankungen
zu behandeln, schützend,
um eine Erkrankung zu verhindern, oder um die Schwere und/oder die
Dauer der Erkrankung zu verringern.
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In einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird eine Auflage zur Verwendung in den obigen Verfahren
bereitgestellt. Die Auflage kann einen Verband umfassen und wirksame
Mengen von Antigen oder Nukleinsäuren
und Adjuvanz. Der Verband kann durchlässig oder undurchlässig sein.
Der Verband kann Penetrationsförderer
enthalten oder er kann eine Vorrichtung für physische Penetrationsförderung
einschließen.
Die Auflage kann zusätzliche
Antigene einschließen,
so dass die Anwendung der Auflage eine Immunantwort gegen mehrere
Antigene induziert. In einem solchen Fall können die Antigene, müssen aber
nicht, von der gleichen Quelle stammen, aber die Antigene werden
unterschiedliche chemische Strukturen haben, so dass sie eine Immunantwort
spezifisch für
die unterschiedlichen Antigene induzieren. Für eine wirksame Behandlung können mehrere
Auflagen in häufigen
Intervallen oder konstant über
einen Zeitraum angewendet werden.
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Ferner wird in einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung die Formulierung auf intakter Haut angewendet, die
ein Gebiet überdeckt,
das von einem Lymphknoten drainiert wird, unter Verwendung von entweder einzelnen
oder mehreren Applikationen oder in einer separaten Auflage für Adjuvanz
oder Antigen/Nukleinsäure.
Die Formulierung kann zusätzliche
Antigene enthalten, so dass die Anwendung auf intakter Haut eine
Immunantwort gegen mehrere Antigenen induziert. In einem solchen
Fall können
die Antigene, müssen
aber nicht, von der gleichen Quelle stammen, aber die Antigene werden
unterschiedliche chemische Strukturen haben, so dass sie eine Immunantwort
spezifisch für
die unterschiedlichen Antigene induzieren.
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Die Formulierung kann auf der Haut
angewendet werden, um die Immunantwort zusammen über andere Wege der Immunisierung
aufzufrischen oder zu starten. Daher kann das Starten mit entweder
einer einzelnen oder mehreren Anwendungen mit transkutaner Immunisierung
gefolgt werden von oralen, nasalen oder parenteralen Techniken zum
Auffrischen der Immunisierung mit den gleichen oder veränderten
Antigenen. Die Formulierung kann zusätzliche Antigene enthalten,
so dass die Anwendung auf intakter Haut eine Immunantwort gegen
mehrere Antigene induziert. In einem solchen Fall können die
Antigene, müssen
aber nicht, von der gleichen Quelle stammen, aber die Antigene werden
unterschiedliche chemische Strukturen haben, so dass sie eine Immunantwort
spezifisch für
die unterschiedlichen Antigen induzieren.
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Zusätzlich zum Antigen und aktivierten
Adjuvanz kann die Formulierung ein Vehikel umfassen. Zum Beispiel
kann die Formulierung AQUAPHOR® (eine Emulsion aus Rohvaseline,
Mineralöl,
Mineralwachs, Wollwachs, Panthenol, Bisabolol und Glyzerin), Emulsionen
(z. B. wässrige
Cremes), Mikroemulsionen, Gele, Öl-in-Wasser-Emulsionen
(z. B. ölige
Cremes), wasserfreie Lipide und Öl-in-Wasser-Emulsionen,
wasserfreie Lipide und Wasser-in-Öl-Emulsionen, Fette, Wachse, Öle, Silikone
und Netzmittel (z. B. Glyzerol) umfassen.
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Das Antigen kann von einem Pathogen
abgeleitet sein, das den Organismus infizieren kann (z. B. Bakterium,
Virus, Pilz oder Parasit) oder von einer Zelle (z. B. Tumorzelle
oder normale Zelle) oder von einem Allergen oder einem biologischen
Kriegsführungsmittel.
Das Antigen kann ein Tumorantigen oder ein Autoantigen sein. Chemisch
gesehen kann das Antigen ein Kohlenhydrat, Glykolipid, Glykoprotein,
Lipid, Lipoprotein, Phospholipid, Polypeptid oder Fusionsprotein
(rekombinant) oder ein chemisches Konjugat davon sein. Das molekulare
Gewicht des Antigens kann größer als
500 Daltons sein, vorzugsweise größer als 800 Daltons, und weiter
bevorzugt größer als
1000 Daltons.
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Das Antigen kann durch rekominante
Mittel, chemische Synthese oder Aufreinigung aus einer natürlichen
Quelle erhalten werden. Ein Vorteil der transkutanen Immunisierung
kann darin bestehen, dass eine Aufreinigung eines Antigens nicht
notwenig ist, z. B. kann ein gesamter Organismus mit Ultraschall
behandelt und zur Immunisierung verwendet werden. Der Grad der Toxizität, die mit
der Injektion eines Produkts aus einer solchen Herstellung verbunden
ist, ist häufig
zu hoch, um toleriert zu werden, wie bei LPS, das tödlich sein kann,
wenn es injiziert wird, aber auf der Haut nicht-toxisch ist. Bevorzugt
sind proteinartige Antigene oder Konjugate mit Polysaccharid. Das
Antigen kann zumindest teilweise in zellfreier Form aufgereinigt
werden. Als Alternative kann das Antigen bereitgestellt werden in
Form eines lebenden Virus, eines abgeschwächten lebenden Virus oder eines
inaktivierten Virus, einem ultraschallbehandelten oder lysierten ganzen
Bakterium, eines Parasiten oder eines mit Detergenz behandelten
Virus oder einer Fraktion davon.
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Das Einbeziehen eines Adjuvanz kann
die Potenzierung oder Modulation der Immunantwort ermöglichen.
Darüber
hinaus kann die Auswahl eines geeigneten Antigens oder Adjuvanz
die bevorzugte Induzierung einer humoralen oder zellulären Immun-
oder Mukosaantwort, spezifischer Antikörperisotypen (z. B. IgM, IgD, IgA1,
IgA2, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, und/oder IgG4) und/oder spezifische
Untergruppen von T-Zellen (z. B. CTL, Th1, Th2 und/oder TDTH) ermöglichen.
Wahlweise können
Antigen oder Adjuvanz in der Formulierung bereitgestellt werden
mittels einer Nukleinsäure
(z. B. DNA, RNA, cDNA, cRNA), die das Antigen oder Adjuvanz kodiert,
wahlweise mit einem Antigen oder Adjuvanz, das zu der Nukleinsäure hinzugefügt wurde.
Diese Technik wird genetische Immunisierung genannt.
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Der Begriff "Antigen" wie in der Erfindung verwendet, soll
eine Substanz beschreiben, die eine spezifische Immunantwort induziert,
wenn sie den Immunzellen eines Organismus präsentiert wird. Ein Antigen kann
ein einzelnes immunogenes Epitop umfassen oder eine Mehrheit von
immunogenen Epitopen, die von einem B-Zellrezeptor (d. h. Antikörper auf
der Membran der B-Zelle) oder einem T-Zellrezeptor erkannt werden.
Ein Molekül
kann sowohl ein Antigen als auch ein Adjuvanz (z. B. Choleratoxin)
darstellen, und daher kann die Formulierung nur eine Komponente
enthalten. Das Antigen kann als ein ganzer Organismus bereitgestellt
werden, wie zum Beispiel ein Bakterium oder Virion; das Antigen
kann aus einem Extrakt oder Lysat gewonnen werden, entweder von
gesamten Zellen oder der Membran allein; oder das Antigen kann chemisch synthetisiert
oder durch rekombinante Mittel hergestellt werden.
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Der Begriff "Adjuvanz", wie in der Erfindung verwendet, soll
eine Substanz beschreiben, die der Formulierung hinzugefügt wird,
um die Induktion einer Immunantwort gegen das Antigen zu fördern.
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Der Begriff "wirksame Menge", wie in der Erfindung verwendet, soll
die Menge an Antigen beschreiben, die eine antigenspezifische Immunantwort
induziert. Eine solche Induktion einer Immunantwort kann eine Behandlung
bereitstellen, wie zum Beispiel Immunschutz, Desensitivierung, Immunsuppression,
Modulation von Autoimmunerkrankungen, Potenzierung von Krebsimmunüberwachung
oder therapeutische Vakzinierung gegen eine etablierte Infektionserkrankung.
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Unter Epidermis verstehen wir die
Zellen der Haut von der Basalschicht aus Keratinozyten oder Basallamina
bis zum und durch das Stratum Corneum.
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Die Definition von „transdermal" wird generell angesehen
als: betreffend, sein oder bereitstellen einer Medikation in einer
Form für
die Absorption durch die Haut in den Blutstrom (~ Wirkstofffreisetrung)(~
Nitroglyzerin)(~ Nikotinpflaster). 2Frederick
C. Mish et al., Hrsg., Merriam-Webster's Collegiate Dictionary, 10. Aufl. (Springfield,
MA.: Merriam-Webster, Incorporated, 1997), 861.
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Der Begriff „drainierendes Lymphknotenfeld", wie in der Erfindung
verwendet, bezeichnet ein anatomisches Gebiet, aus dem die gesammelte
Lymphe durch eine Reihe von definierten Gruppen von Lymphknoten gefiltert
wird (z. B. zervikal, axial, inguinal, epitrochelear, popliteal
und jene des Abdomen und Thorax).
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Die Hautpenetration kann durch Verwenden
von Techniken, welche die Hauthydratation erhöhen, verstärkt werden. Gemäß Roberts
und Walker (1993) "ist
der Zustand der Hydratation des Stratum Corneum (SC) einer der wichtigsten
Faktoren, welche die Rate der perkutanen Absorption einer gegebenen
gelösten
Substanz bestimmen".
Der Zustand der Hydration wirkt in der Bestimmung der Absorptionsrate
einer Substanz durch die Haut mit dem Diffusionsprinzip zusammen.
Des Weiteren stellt Hurley fest:
"Es wird angenommen, dass die Absorption
von Substanzen durch das Stratum Corneum durch Diffusion gemäß den Fick'schen Gesetzen der
Diffusion stattfindet, in denen die Rate der Absorption einer Chemikalie
proportional zum Konzentrationsunterschied über der Membran ist. Daher
ist ein Konzentrationsgradient zwischen der hohen Konzentration
einer gelösten
Substanz auf der Hautoberfläche
und seinem Fehlen oder geringen Konzentration unterhalb des Stratum
Corneum die treibende Kraft in diesem Prozess. Die transcorneale Bewegung
der Absorption wird klassisch als "perzellulär" dargestellt, d. h. direkt durch die
Zellwände
des verdichteten Corneums und nicht intrazellulär. Intrazelluläre Proteinfilamente
werden als Wege für
polare (wasserlösliche)
Bestandteile beschrieben, und das Medium zwischen den Filamenten
dient als Weg für
nichtpolare (lipidlösliche)
Substanzen. (...) Hydratation erhöht die Permabilität des Stratum
Corneum für
die meisten Substanzen durch eine Zahl von zytophysiologischen Mechanismen,
die noch nicht vollständig
geklärt
sind."
-
Während
allgemein bekannt ist, dass Hauthydratation die Hautpenetration
verstärkt,
sind die Mechanismen, durch die dies stattfindet, nicht vollständig geklärt und waren
somit vor der vorliegenden Erfindung nicht vorhersagbar, und es
wurde nicht erwartet, dass sie die Penetration von großen Molekülen (7750
Daltons) ermöglichen.
-
Die Verwendung von Vehikeln zur Erhöhung der
Hydratation ist gut bekannt. Undurchlässige Verbände, wie dampfundurchlässige Plastikfilme
(z. B. Polyvinyliden, Polyethylen), verstärken die Absorption im Prinzip
durch die erhöhte
Hydratation des Stratum Corneum, ein Ergebnis des Anschwellens der
Corneozyten, und der Aufnahme von Wasser in die intrazellulären Korridore.
Hydrokolloidauflagen können
auch dazu verwendet werden, die Hautpenetration zu verstärken. Die
Absoprtion von Steroiden kann unter Verwendung von undurchlässigem Plastikfilm
mehr als 100-fach erhöht
werden. Im Allgemeinen induzieren Fette, Öle oder undurchlässiges Plastik
die meiste Hydratation durch Undurchlässigkeit. Siehe zum Beispiel
Idson (1978); Hollingsbee (1995); und McKenzie und Stoughton (1962).
Die Verwendung von Hydratation oder eines Vehikels zur Hydratation
mit einem Antigen und Adjuvanz waren vor unserer Erfindung nicht
als Penetration bekannt. Es wurde angenommen, dass die Haut sogar
im hydratisierten Zustand auf kleine Moleküle begrenzt ist.
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Geeignete Agentien, von denen bekannt
ist, dass sie die Absorption von Wirkstoffen durch die Haut verstärken, sind
in Sloan, Use of Solubility Parameters from Regular Solution Theon
to Describe Partitioning-Driven Processes, Kap. 5, "Prodrugs: Topical
and Ocular Drug Delivery" (Marcel
Dekker, 1992) und an anderen Stellen im Text beschrieben.
-
Es wird erwartet, dass diese Techniken
(und andere, die bestimmungsgemäß dazu verwendet
werden, den Wirkstofftransfer zu fördern) an Nukleinsäurepräparationen
ohne unangemessene Experimente angepasst werden können, wenn
der Durchschnittsfachmann sie in den Verfahren der Erfindung verwendet.
Spezifische Beispiele, die diese Eignung erläutern, werden unten aufgeführt.
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Der Stand der Technik in der Förderung
der Hautpenetration wird beschrieben in Pharmaceutical Skin Penetration
Enhancement, herausgegeben von Kenneth A. Walters und Jonathan Hadgraft,
veröffentlicht
von Marcel Dekker, Inc., New York, 1993.
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Die Hautpermabilität und/oder
Hauthydratation kann erwartet werden durch Auswählen eines angemessenen Vehikels
aus verschiedenen Klassen, wie Netzmittel (z. B. Glykole, Glyzerole),
Pulver (z. B. Kaoline, Schüttellotionen), Öl/Wasser
(O/W) Emulsion (z. B. wässrige
Cremes), Wasser/Öl
Emulsion (z. B. ölige Cremes),
emulgierende Grundlage (z. B. wasserfreies Lipid und O/W Emulgatoren),
Absorbtionsgrundlage (z. B. wasserfreies Lipid und W/O Emulgatoren),
Lipophile (z. B. Fette, Wachse, Öle,
Silikone) und undurchlässige Verbände (z.
B. Plastikfolie).
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Andere Verfahren, die Proteine des
Stratum Corneum angreifen, um die Penetration der vorliegenden Erfindung
zu verstärken,
können
angewandt werden. Salizylsäure
ist ein Keratinolytikum, das die Absorption erhöhen kann. Harnstoff wirkt sowohl
als Keratinolytikum als auch als Hydratisierungsmittel der Haut
und kann als Penetrationsförderer
wirken. Phospholipase A2 und Phosphatidylcholin-abhängige Phospholipase
C können
als epidermale Enzyme zur Förderung
der Penetration verwendet werden. Andere Penetrationsförderer können Ethanol,
Aceton, Detergentien, Basen, Nair®, Propylenglykol,
Pyrriolidone, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid,
Alkylsulfoxid, Phosphinoxid, Tenside und Caprolaktame wie Azon einschließen. Andere
Verbindungen, die zur Penetrationsförderung verwendet werden können, schließen Amine
und Amide, Alkyl N,N-verteilte Aminoacetate, Decylmethylsulfoxid,
Pyrrolidone, Pirotiodekane (HPE-101), Benzylalkonium, Benzylalkonium-chlorid-Polymere,
silikonbasierte Polymere, Fettsäuren,
zyklische Harnstoffe, Terpene, Liposome und Cyclodextrine ein. Penetrationsförderer sind
im Stand der Technik gut bekannt, zum Beispiel wie beschrieben in
Pharmaceutical Penetration Enhancement, (Marcel Dekker, 1993). Andere
Techniken, die zur Penetrationsförderung
angewendet werden können,
schließen
Iontophorese, Ultraschall, Elektroporation, die Abrissmethode (engl.: "tape stripping"), die Verwendung
von Genkanonen oder anderen Treibmittelvorrichtungen, Zacken, wie
für den
TB-Zackentest verwendet (wie bereitgestellt durch Mono-Vacc-System), oder
Mikronadeln, welche die äußere Oberfläche der
Haut durchdringen, oder Scheuermittel, welche die äußeren Schichten
der Haut entfernen, und Lipidextraktion ein.
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Eine Vorrichtung, die zum Angreifen
des Stratum Corneum verwendet werden kann (die in den USA durch
Connaught Laboratories, Inc. aus Swiftwater, PA, vertrieben wird),
besteht aus einem Plastikbehälter, der
an einem Ende einen Spritzenkolben und am anderen Ende eine Zackenscheibe
aufweist. Die Zackenscheibe unterstützt eine Vielzahl von Zacken
mit geringem Durchmesser mit einer Länge, welche die oberste Schicht
der epidermalen Zellen gerade kratzen wird, aber die Epidermis nicht
durchdringt. Jede der Zacken im MONO-VACC® Kit
ist mit altem Tuberkulin beschichtet: In der vorliegenden Erfindung
kann jede Nadel mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung aus Antigen/Nukleinsäure und
Adjuvanz beschichtet sein. Die Verwendung der Vorrichtung in der
vorliegenden Erfindung kann nicht gemäß den dem Vorrichtungsprodukt
beiliegenden schriftlichen Anweisungen des Herstellers erfolgen,
weil man bei Verwendung in der vorliegenden Erfindung die Epidermis
nicht durchdringt. Hierzu kann die Vorrichtung zum Angriff auf die
Oberfläche
verwendet werden, um die äußeren Schichten
der Haut, das Stratum Corneum und die obere Epidermis anzugreifen,
um die transkutane Immunisierung zu verstärken. Ähnliche Vorrichtungen, die
ebenfalls in dieser Ausführungsform verwendet
werden können,
sind jene, die gegenwärtig
dazu verwendet werden, Allergietests durchzuführen.
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Andere Ansätze schließen den Angriff auf eine Barriere
ein. Die Inhibierung von Cholesterolsynthese unter Verwendung von
systemisch verabreichten HMG CoA-Reduktase-Inhibitoren
und ähnlichen
Wirkstoffen interferieren mit der Barrierefunktion und können eine
verstärkte
Penetration der Formulierungskomponente ermöglichen.
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Es ist auch vorstellbar, dass die
Haut so transformiert wird, dass sie die transkutane Immunantwort verstärkt. CT
und LT üben
ihre Wirkung über
die Gangliosid GM1-Bindung durch die B-Untereinheit aus. Gangliosid
GM1 ist ein allgegenwärtiges
Zellmembran-Glykolipid,
das in allen Säugerzellen
gefunden wird. Im gastrointestinalen Trakt bildet sich eine hydrophile
Pore, wenn die pentamere CT B-Untereinheit an die Zelloberfläche bindet,
was der A-Untereinheit ermöglicht, über die
Lipiddoppelschicht einzudringen. Die Haut enthält Ganglioside in einer Konzentration
von 30 bis 35 nmol NeuAC/gm. Hautganglioside stellen mögliche Targets für die Initiierung
von transkutaner Immunisierung dar, über Mechanismen wie Aktivierung
von Langerhanszellen, wie oben beschrieben.
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Ein mögliches Verfahren, um die Haut
zu aktivieren zur Verstärkung
der Wirkung von transkutaner Immunisierung mit ADP-ribosylierenden
Exotoxinen, besteht in der Erhöhung
der Anzahl von GM1-Gangliosidmolekülen in Hautrellen. Dies kann
durch Aktivierung von Rezeptorzellen unter Verwendung von Sialidase
erreicht werden, um Ganglioside, die nicht an das Toxin binden,
in die Sialidase-stabilen Choleratoxin-bindenden Ganglioside GGnSLC
(Gangliosid GM1) umzusetzen:
„Es ist interessant, dass
das Cholera-Vibrion wahrscheinlich die am besten bekannte Quelle
für Sialidase
(oder Neuraminidase, wie sie oft genannt wird), ist. Könnte diese
Sialidase eine Rolle in der Naturgeschichte der Erkrankung spielen
dadurch, dass sie mehr Rezeptoren für das Toxin zugänglich macht?
Wenn dem so ist, sollte jedes aktive Immunisierungsagens der Krankheit
ein Anti-Neuraminidase-Element enthalten? Die Inkubation von Darmabschabungen
mit Sialidase führt
zu einer beträchtlichen
Erhöhung
in ihrer Fähigkeit,
das Toxin zu binden, die nicht nur auf die Umwandlung von Sialidase-labilen
Gangliosiden in Choleratoxin-bindende Ganglioside zurückzuführen ist,
sondern offenbar auch auf das Freilegen von anderenfalls nicht erreichbaren
Gangliosid-Bindungsstellen, möglicherweise
durch Abbau von Glykoproteinen. Die Vorbehandlung von Hundedarm
mit Sialidase bewirkt, dass er als Antwort auf Choleratoxin mehr
Flüssigkeit
produziert; die Behandlung von adrenalen Zellen mit Sialidase erhöht deren
Ansprechbarkeit auf Choleratoxin; die Vorbehandlung von roten Zellen
von Tauben mit Sialidase erhöht
in ihnen die Aktivierung der Adenylatcyclase durch Choleratoxin."
-
The biochemistry of cholera, in:
Cholera: The American Scientific Experience, 1947– 1980,
van Heyningen, W. E., und Seal, J. R., Hrsg., Waterview Press, Boulder,
1983, Seite 263 (Zitate ausgelassen).
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Die Wirkung der Behandlung der Haut
mit Sialidase kann die Bindung eines ADP-ribosylierenden Exotoxins wie CT an
die Immunzellen verstärken,
auf welche die transkutane Immunisierung abzielt. Dies stellt eine
Art der Aktivierung der Haut für
transkutane Immunisierung dar. Zusätzlich kann Neuraminidase als
ein epidermales Enzym wirken, das gleichzeitig die Penetration verstärkt.
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Die Verwendung eines Penetrationsförderers
kann in Verbindung mit der Aktivierung der Haut angewandt werden.
Die Aktivierung der Haut für
transkutane Immunisierung kann auch nach Behandlungen wie dem Betupfen
mit Alkohol oder Aceton erfolgen. Es wurde gezeigt, dass das Angreifen
der Hautbarriere durch Betupfen der Haut mit Aceton die Dichte der
Langerhanszellen um 80% und die Reaktion auf Kontaktallergene in
vivo erhöhte.
Wenn die Dichte der Langerhanszellen erhöht ist, kann auch die Stärke der
Immunantwort erhöht
sein. Es kann erwartet werden, dass ein ähnlicher chemischer Angriff
die Zahl der Langerhanszellen erhöht und eine Aktivierung der
Hautkomponenten durch transkutanen Immunisierung zur Folge hat durch
die Abrissmethode, Natriumdodecylsulfat, die Verwendung von Alkoholtupfern
oder eines Enthaarungsmittels wie Kalziumhydroxid. Siehe Proksch
und Brasch (1996, 1997) zur Verwendung von Penetrationsförderern
und Barriereangriff in allergischer Kontaktdermatitis.
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Die Penetrationsförderung kann auch durch Ausführen von
einfachen Aktionen erreicht werden, wie dem Betupfen mit Alkohol
unmittelbar vor der Immunisierung, durch gleichzeitige Verwendung
von penetrationsfördernden
Mitteln und Techniken oder durch Techniken wie das Betupfen mit
Aceton 24 Stunden vorher, um die Anzahl der Langerhanszellen zu
erhöhen.
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Die Verfahren zur Herstellung einer
pharmazeutischen Formulierung sind im Stand der Technik gut bekannt,
wobei das Antigen und Adjuvanz mit einem pharmazeutisch akzeptablen
Trägervehikel
kombiniert wird. Geeignete Vehikel und ihre Herstellung sind beispielsweise
beschrieben in Remington's
Pharmaceutical Sciences von E. W. Martin. Solche Formulierungen
werden eine wirksame Menge des Antigens und Adjuvanz, zusammen mit
einer geeigneten Menge des Vehikels, enthalten, um pharmazeutisch
akzeptable Zusammensetzungen herzustellen, die für die Verabreichung an einen
Menschen oder ein Tier geeignet sind. Die Formulierung kann angewendet
werden in Form einer Creme, Emulsion, Gel, Lotion, Salbe, Paste,
Lösung,
Suspension oder anderen Formen aus dem Stand der Technik. Insbesondere
werden Formulierungen bevorzugt, welche die Hauthydratisierung,
-penetration oder beides verstärken.
Andere pharmazeutisch akzeptable Zusätze können ebenfalls mit eingeschlossen
werden einschließlich
beispielsweise Verdünnungsmittel,
Trägerbindemittel,
Stabilisatoren, Konservierungsmittel und Farbstoffe.
-
Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden
zu sein, sondern nur um eine Erklärung für unsere Beobachtungen bereit
zu stellen, wird angenommen, dass das transkutane Immunisierungs-Transfersystem
Antigen zu den Zellen des Immunsystems trägt, wo eine Immunantwort induziert
wird. Das Antigen kann sich durch die normalen schützenden äußeren Schichten
der Haut (d. h. Stratum Corneum) bewegen und die Immunantwort direkt
induzieren, oder durch eine Antigen-präsentierende Zelle (z. B. Makrophage,
Gewebsmakrophage, Langerhanszelle, dendritische Zelle, dermale dendritische
Zelle, B-Lymphozyt
oder Kupffer-Zelle), die einem T-Lymphozyten prozessiertes Antigen
präsentiert
(siehe Stingl et al., 1989; Streilein und Grammer, 1989; Tew et
al., 1997). Wahlweise kann sich das Antigen durch das Stratum Corneum über ein
Haarfollikel oder eine Hautorganelle (z. B. Schweißdrüse, Fettdrüse) bewegen.
Transkutane Immunisierung mit bakteriellen ADP-ribosylierenden Exotoxinen
(bAREs) kann auf die epidermale Langerhanszelle abzielen, von der
bekannt ist, dass sie zu den effizientesten der Antigen-präsentierenden
Zellen (APCs) gehört.
Wir haben herausgefunden, dass bAREs Langerhanszellen aktivieren,
wenn sie epikutan in einer Salzlösung
auf der Haut angewendet werden. Adjuvanzien wie aktiviertes LT können die
Aktivierung von Langerhanszellen stark fördern. Die Langerhanszellen
steuern spezifische Immunantworten durch Phagozytose des Antigens
und Wanderung zu den Lymphknoten, wo sie als APCs wirken, um das
Antigen den Lymphozyten zu präsentieren,
und induzieren dadurch eine wirksame Antikörper-Antwort. Obwohl die Haut
im Allgemeinen als Barriere für
eindringende Organismen betrachtet wird, wird die Unvollkommenheit
dieser Barriere durch die zahlreichen Langerhanszellen bestätigt, die über die
Epidermis verteilt und so gestaltet sind, dass sie die Immunantwort
gegen Organismen, die über
die Haut eindringen, instrumentieren. Nach Udey (1997):
„Langerhanszellen
sind vom Knochenmark abgeleitete Zellen, die in allen geschichteten
Plattenepithelien von Säugern
vorkommen. Sie umfassen die gesamte akzessorische Zellaktivität, die in
nicht entzündeter
Epidermis vorhanden ist, und sind im gegenwärtigen Musterbeispiel wesentlich
für die
Initiierung und Weiterführung von
Immunantworten, die gegen epikutan applizierte Antigene gerichtet
sind. Langerhanszellen sind Mitglieder einer Familie von wirksamen akzessorischen
Zellen („dendritischen
Zellen"), die weit
verbreitet sind, aber selten in Epithelien und festen Organen oder
auch in Lymphgewebe vorkommen.
-
Es wird nun erkannt, dass Langerhanszellen
(und vermutlich andere dendritische Zellen) einen Lebenszyklus mit
mindestens zwei deutlich unterscheidbaren Stadien aufweisen. Langerhanszellen,
die in der Epidermis lokalisiert sind, bilden ein regelmäßiges Netzwerk
von Antigen-einfangenden „Wächter"-Zellen. Epidermale
Langerhanszellen können
Partikel, einschließlich
Mikroorganismen, aufnehmen und sind effiziente Prozessierer von
komplexen Antigenen. Sie exprimieren jedoch nur geringe Mengen von
MHC-Antigenen der Klassen I und II sowie ko-stimulatorischen Molekülen (ICAM-1,
B7-1 und B7-2) und sind schlechte Stimulatoren von nicht induzierten
T-Zellen. Nach Kontakt mit Antigen werden einige Langerhanszellen
aktiviert, treten aus der Epidermis aus und wandern zu T-Zellen-abhängigen Regionen
der regionalen Lymphknoten, wo sie sich als reife dendritische Zellen
niederlassen. Im Verlauf des Austretens aus der Epidermis und der
Wanderung zu den Lymphknoten zeigen Antigen-tragende epidermale
Langerhanszellen (nun die „Boten") dramatische Veränderungen
in Morphologie, Oberflächen-Phänotyp und
Funktion. Im Gegensatz zu epidermalen Langerhanszellen sind lymphoide
dendritische Zellen im Wesentlichen nicht phagozytisch und prozessieren
Protein-Antigene
ineffizient, aber exprimieren hohe Mengen an MHC-Antigenen der Klassen
I und II, sowie verschiedene ko-stimulatorische Moleküle und sind
die besten Stimulatoren für
naive T-Zellen, die bislang identifiziert wurden."
-
Wir stellen uns vor, dass die wirksamen
Antigen-präsentationsfähigkeiten
der epidermalen Langerhanszellen für transkutan übertragene
Vakzinien ausgenutzt werden kann. Eine transkutane Immunantwort
unter Verwendung des Hautimmunsystems würde erfordern, dass das Vakzine-Antigen
nur den Langerhanszellen im Stratum Corneum (der äußersten
Schicht der Haut, bestehend aus verhornten Zellen und Lipiden) über passive
Diffusion zugeführt
wird und nachfolgende Aktivierung der Langerhanszellen, um das Antigen
aufzunehmen, zu B-Zell-Follikeln und/oder T-Zellen-abhängigen Regionen
zu wandern und das Antigen den B- und/oder T-Zellen zu präsentieren.
Wenn andere Antigene als bAREs (z. B. Diphtherietoxoid) von den
Langerhanszellen phagozytiert werden sollen, dann können diese
Antigene auch zur Präsentation
gegenüber
T-Zellen zu den Lymphknoten gebracht werden und nachfolgend eine
Immunantwort, die spezifisch für
das Antigen ist (z. B. Diphtherietoxoid), induzieren. Daher ist
eine Eigenschaft der transkutanen Immunisierung die Aktivierung
der Langerhanszelle, vermutlich durch bakterielle ADP-ribosylierende Exotoxine,
ADP-ribosylierende Exotoxin-bindende Untereinheiten (z. B. Choleratoxin
B-Untereinheit) oder anderen Adjuvanzien oder eine die Langerhanszelle
aktivierende Substanz. Es könnte
dann erwartet werden, dass die Erhöhung der Hautpopulation von
Langerhanszellen unter Verwendung von Strategien wie dem Betupfen
mit Aceton die transkutane Immunantwort verstärkt.
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Das Spektrum der allgemein bekannten
Hautimmunantworten wird durch Kontaktdermatitis und Atopie repräsentiert.
Kontaktdermatitis, eine pathogene Manifestation der LZ-Aktivierung,
wird durch Langerhanszellen gesteuert, die Antigen phagozytieren,
zu den Lymphknoten wandern, Antigen präsentieren und T-Zellen sensibilisieren,
die zur Haut wandern und eine intensive zerstörerische zelluläre Antwort
bewirken, die an betroffenen Hautstellen auftritt (Dahl, 1996; Leung,
1997). Die atopische Dermatitis kann die Langerhanszelle in ähnlicher
Weise verwenden, wird aber mit Th2-Zellen identifiziert und ist im Allgemeinen
mit hohen Mengen von IgE-Antikörpern
verbunden (Dahl, 1996; Leung, 1997).
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Die transkutane Immunisierung mit
Choleratoxin und verwandten bAREs stellt auf der anderen Seite eine
neue Immunantwort ohne oberflächliche
und mikroskopische, nach der Immunisierung auftretende Hautauffälligkeiten
(d. h. nicht entzündete
Haut) dar, wie durch das Fehlen von Lymphozyten-Infiltration 24,
48 und 120 Stunden nach der Immunisierung gezeigt. Dies wird auffallend
durch die Vollendung einer Phase-I-Studie gezeigt, in der Menschen
mit LT unter einer einfachen, undurchlässigen Auflage immunisiert
wurden. Wirksame Anti-LT-IgG und -IgA-Antikörper wurden stimuliert. Zwei
Freiwilligen wurden Biopsien an der Stelle der Immunisierung entnommen.
Die mikroskopische Auswertung bestätigte die klinische Beobachtung, dass
keine Entzündung
zu sehen war. Dies legt nahe, dass Langerhanszellen rekrutiert worden
sein könnten, die „alle akzessorischen
Zellaktivitäten
umfassen, die in nicht entzündeter
Epidermis vorhanden sind, und die im gegenwärtigen Musterbeispiel essentiell
für die
Initiierung und Fortführung
von Immunantworten sind, die gegen epikutan aufgetragene Antigene
gerichtet sind" (Udey,
1997). Die Einmaligkeit der transkutanen Immunantwort wird hier
also sowohl durch die hohen Mengen von antigenspezifischen IgG-Antikörpern als
auch durch den Typ des Antikörpers,
der produziert wurde (z. B. IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 und IgA), sowie
durch das Fehlen von Anti-CT-IgE-Antikörpern angedeutet. Es können jedoch
auch andere Immunzellen beteiligt sein, und Spekulationen über den
Mechanismus sollten die Erfindung nicht einschränken.
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Wir haben daher herausgefunden, dass
von Bakterien abgeleitete Toxine, die auf die Hautoberfläche aufgetragen
werden, Langerhanszellen aktivieren können und dass TCI eine wirksame
Immunantwort induziert, die sich in hohen Mengen von antigenspezifischen
zirkulierenden IgG-Antikörpern äußert, und
man würde
erwarten, dass eine Verstärkung
der Penetration die Immunantwort verstärken würde. Transkutanes Adjuvanz
und Penetrationsförderer
können
bei transkutaner Immunisierung verwendet werden, um die IgG-Antikörper oder
die T-Zellen-Antwort auf Proteine zu steigern, die sonst selbst
nicht immunogen wirken, wenn sie auf der Haut platriert werden.
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Das transkutane Targeting von Langerhanszellen
kann auch dazu verwendet werden, ihre Antigen-präsentierende Funktion zu deaktivieren
und dadurch eine Immunisierung oder Sensibilisierung zu verhindern.
Techniken zum Mobilisieren, sogar negativ Modulieren, von Langerhanszellen
oder anderen Hautimmunzellen schließen z. B. die Verwendung von
entründungshemmenden,
steroidalen oder nicht steroidalen Agentien (NSAID), Cyclophosphamid
und anderen Immunsuppressoren, Interleukin-10, TGFβ, monoklonalen
Antikörpern
gegen Interleukin-1, ICE-Inhibitoren oder Verminderung durch Super-Antigene, wie durch
Staphylococcus Enterotoxin-A (SEA) induzierte epidermale Verminderung
von Langerhanszellen, ein.
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Die transkutane Immunisierung kann über die
Gangliosid-GM1-Bindungsaktivität
von CT, LT oder Untereinheiten wie CTB induziert werden. Gangliosid
GM1 ist ein allgegenwärtiges
Zellmembran-Glykolipid, das in allen Säugerzellen gefunden wird. Wenn
die pentamere CTB-Untereinheit an die Zelloberfläche bindet, wird eine hydrophile
Pore gebildet, die der A-Untereinheit erlaubt, über die Lipid-Doppelschicht
einzudringen.
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Wir haben gezeigt, dass transkutane
Immunisierung durch CT oder CTB Gangliosid-GM1-Bindungsaktivität erfordern kann. Wenn Mäuse transkutan
mit CT, CTA und CTB immunisiert werden, ergaben nur CT und CTB eine
Immunantwort. CTA enthält
die ADP-ribosylierende
Exotoxinaktivität,
aber nur CT und CTB enthalten die Bindungsaktivität, die fähig ist,
eine Immuantwort zu induzieren, was darauf hinweist, dass die B-Untereinheit
notwendig und ausreichend war, um durch die Haut zu immunisieren.
Wir schließen daraus,
dass die Langerhanszelle oder andere Immunzellen durch CTB-Bindung
an ihre Zelloberfläche
aktiviert werden kann, aber stärker
aktiviert wird durch die gleichzeitige Anwesenheit der A-Untereinheit.
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Zusätzlich zur Aktivierung der
Hautkomponente in dem Immunisierungsprozess der vorliegenden Erfindung
kann das Antigen und/oder Adjuvanz aktiviert werden, um die Immunisierung
zu verstärken.
Wenn CT sezerniert wird, findet eine Spaltung an der Trypsin-Erkennungsstelle
statt, und das Toxin wird aktiviert. LT jedoch wird mit seiner intakten
Trypsin-Erkennungsstelle sezerniert. Wenn LT in den gastro-intestinalen
Trakt sezerniert und dadurch gastro-intestinalen Agentien wie Trypsin
ausgesetzt wird, werden die proteolytisch sensitiven Reste gespalten,
welche die A1- und A2-Untereinheiten von LT verbinden, was der A1-Untereinheit
ermöglicht,
G-Proteine zu ADP-ribosylieren und dadurch seine toxischen Wirkungen
auszuüben.
Das Fehlen von Trypsin und verwandten Agentien in der Haut kann
eine Trypsinspaltung der proteolytisch sensitiven Reste verhindern,
welche die A1- und A2-Untereinheit verbinden, was seine Adjuvanz-Aktivität vermindert.
-
Diese beiden bakteriellen Enterotoxine
haben viele Eigenschaften gemeinsam. LT und CT haben die gleiche
Anzahl und Anordnung von Untereinheiten (A2 : B5) und den gleichen
biologischen Wirkmechanismus. Eine Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit von 75–77% wird
für beide
Ketten gefunden, wenn LT und CT verglichen werden, und der signifikanteste
Unterschied tritt in den jeweiligen A-Ketten an Positionen 192–195 auf.
An dieser Stelle findet die Spaltung der A-Kette durch Trypsin statt,
und die Stelle liegt zwischen zwei Cysteinresten, welche die interne
Disulfidbrücke
der A-Kette bilden. Siehe z. B. Mekalanos et al., (1979), Spangler
(1992) und Sniderman (1995). Wir schlagen vor, dass diese strukturellen
Unterschiede zwischen den Molekülen
einen signifikanten Einfluss darstellen, nicht nur auf deren enterotoxische
Eigenschaften, sondern auch auf ihre Fähigkeit, als Adjuvanzien zu
wirken.
-
Im Gegensatz zu CT, hergestellt durch
V. cholerae, ist LT nicht vollständig
biologisch aktiv, wenn es zunächst
aus der bakteriellen Zelle isoliert wird. Übereinstimmend mit dem A-B-Modell
für bakterielle
Toxine benötigt
LT Trypsinproteolyse und Disulfidreduktion, um voll aktiv zu sein
(Sniderman, 1995). Beim Fehlen von proteolytischer Prozessierung
ist der enzymatisch aktive A1-Anteil nicht in der Lage, von der
A2-Komponente zu dissoziieren, und kann sein Zielsubstrat (Adenylatcyclase)
auf der basolateralen Oberfläche
der intestinalen Epithelzelle nicht erreichen. Dieser Unterschied
in der Aktivierung des isolierten Materials führt zu Unterschieden in den
Antwort-Schwellenwerten
für LT
und CT in biologischen Systemen. Beispielsweise induziert CT nachweisbare
Netto-Flüssigkeitssekretion
im Mäusedarm
bei einer Dosis von 5 bis 10 μg.
-
LT induziert in diesem Test eine
nachweisbare Netto-Sekretion bei 50 bis 100 μg. Im Kaninchen-„ligated
illeal loop"-Test
ist der Unterschied dramatischer und eindeutig. Wenn LT proteolytischen
Enzymen mit trypsinähnlicher
Spezifität
ausgesetzt wird, wird das Molekül
jedoch bezeichnenderweise in jedem biologischen Testsystem ununterscheidbar
von CT (Clements und Finkelstein, 1979; Dickenson und Clements,
1995).
-
Nach Spangler (1992, Zitate ausgelassen):
„Die Untereinheit
A wird als einzelnes Polypeptid sowohl in V. cholerae als auch in
E. coli. synthetisiert. CTA wird proteolytisch zwischen den Resten
192 und 195 „eingekerbt" während der
Sekretion vom Vibrion durch V. cholerae Hämagglutinin/Protease, was zwei
Polypeptide begründet,
A1 (Mr = 28.826) und A2 (Mr = 5.407), die durch eine Disulfidbrücke zwischen
den Resten 187 und 199 kovalent miteinander verbunden sind. Im Gegensatz
dazu bleibt LT im E. coli-Periplasma
und wird nicht eingekerbt. Nach Einführen in einen genetisch veränderten
Stamm von V. cholerae blieb LT ungespalten, obwohl es in der gleichen
Weise sezerniert wurde wie CT. Die proteolytische Prozessierung
ist daher keine Voraussetzung für
Sekretion. Aufgereinigtes LTh kann jedoch in vitro eingekerbt werden,
was eher andeutet, dass das mutierte Vibrion, das von Hirst et al.
verwendet wurde, nicht ausreichend lösliches Hämagglutinin enthielt, um die
Einkerbung zu katalysieren, als eine Unfähigkeit von LTA anzudeuten,
eingekerbt werden zu können.
CT bleibt ungespalten und in E. coli zellassoziiert, wenn es über ein
verändertes
Plasmid in E. coli eingeführt
wird. Daher hängt
der Defekt in der Prozessierung von CT und LT in E. coli mit dem
Scheitern von E. coli zusammen, eines der Toxine zu spalten und
zu sezernieren. Dieser Defekt kann die verringerte Ernsthaftigkeit
von E. coli-induzierter Darmerkrankung im Vergleich zu Cholera erklären. Sowohl
bei CT als auch LT bleibt die Disulfidbindung, die A1 mit A2 verbindet,
unreduziert, und das Toxin ist daher im Wesentlichen inaktiv, bis
es in eine Zelle eindringt.
-
Sowohl die intakte A1-Untereinheit
als auch das Holotoxin sind relativ inaktive ADP-Ribosyltransferasen verglichen mit dem
A1-Polypeptid. Katalytische Aktivität erfordert die Reduktion der
Disulfidbindung (A1:Cys-187-A2:Cys-199), die A1 und A2 verbindet.
Die Spaltung (Einkerbung) zwischen Resten A1-Arg-192 und dem Beginn
des A2-Polypeptids bei A2:Met-195 findet während der Sekretion von CT
aus dem Vibrion statt. Tryptischer Verdau erfüllt diesen Zweck in vitro für LT. Die Reduktion,
die CTA1 von CTA2 freigibt, kann durch eine Vielzahl von Agentien
erreicht werde, normalerweise Dithiothreitol oder 2-Mercaptoethanol
in vitro oder eine Thiol : Proteinoxireductase. Das endogene reduzierende
Agens und der Reduktionsmechanismus sind unbekannt. Eine beobachtete,
zeitliche Verzögerung
von ca. 16 Minuten zwischen dem offensichtlichen Binden des Toxins
an den Membranrezeptor und dem ersten Auftauchen des modifizierten
Substrats intrazellulär
kann mit der Zeit zusammenhängen,
die für
diesen Schritt, nachfolgend oder während Insertion oder Translokation,
erforderlich ist."
-
LTh steht für LT-Holoenzym. Daher erwarten
wir, dass, falls trypsinbehandeltes LT für transkutane Immunisierung
verwendet werden würde, ähnliche
Mechanismen für
die Unterbrechung der Disulfidbindungen aufträten. Dies kann für Trypsiniaktivierung
von LT gezeigt werden, in der trypsinaktiviertes LT ähnlich wirksam oder
von größerer Wirksamkeit
im Vergleich mit CT, und von sehr viel größerer Wirksamkeit als unbehandeltes LT
im Maus-Y-1-Biotest (siehe Dickinson und Clements, 1995), ist.
-
Wir schlagen vor, Komponenten der
Formulierung wie LT vor der Anwendung auf der Haut unter Verwendung
von Trypsin oder ähnlichen
Verbindungen zu aktivieren, um die Ajduvansaktivität und die
Immunogenität
von LT zu verstärken.
Man kann auch erwarten, dass die Aktivierung von LT die Immunantwort
auf LT als ein Antigen verstärkt.
Das aktivierte Adjuvanz für
transkutane Immunisierung ist ein ADP-ribosylierendes Exotoxin,
dessen bindende B-Untereinheit oder Toxoid eines ADP-ribosylierenden
Exotoxins. Wahlweise können
Hydratation oder undurchlässige
Verbände
im transkutanen Transfersystem, zusätzlich zur Aktivierung des
Adjuvanz, verwendet werden.
-
Zusätzlich weist LT eine ungewöhnliche
Affinität
zu Kohlenhydrat-enthaltenden Matrices auf. Insbesondere bindet LT
an eine Reihe von biologischen Molekülen, die Galaktose enthalten,
einschließlich
Glykoproteinen und Lipopolysacchariden. Diese lektinähnliche
Bindungseigenschaft von LT bewirkt eine breitere Rezeptorverteilung
auf Säugerzellen
für LT
als für
CT, das nur an GM1 bindet. Die zwei Moleküle besitzen auch viele immunologische
Unterschiede, wie durch Immundiffusionsstudien gegen LT-assoziierte
E. coli-Diarrhoe in Freiwilligen gezeigt, die B-Untereinheit-Gesamtzell-Cholera-Vakzinien
erhielten. LT und CT induzieren unterschiedliche Helfer-T-Zellantworten.
Wenn es als Mucosa-Adjuvanz verwendet wird, induziert CT selektiv
in einigen Fällen
Th2-Typ-Zellen in Peyerschen Drüsen
und Milzen, was sich in der Produktion von Interleukinen 4 und 5,
aber nicht Interleukin 2 oder Gamma-Interferon äußert; während LT sowohl Th1 als auch Th2-Zellen induziert,
sowie vorwiegend antigenspezifische IgA-Antworten. Zusammen genommen
zeigen diese Ergebnisse, dass LT und CT einzigartige Moleküle sind,
trotz ihrer offensichtlichen strukturellen Ähnlichkeiten. Solch ein unterschiedliches
Verhalten macht die Fähigkeit,
LT zu aktivieren, so dass es eine ähnliche Wirksamkeit wie CT
aufweist, nutzbar zur Manipulation des Typs der Immunantwort, die
sowohl durch das Toxin selbst hervorgebracht wird als auch gegenüber Antigenen,
für die
LT als Adjuvanz verwendet werden kann. Es kann auch möglich sein,
dass genetisch veränderte
Toxoide wie Mutanten der Trypsinspaltstelle durch transkutane Immunisierung
aktiv sein können.
Solch ein mutiertes Toxin kann nützlich
sein, weil es die Risiken vermeidet, die mit der Aufnahme oder Inhalieren
von nativen Toxinen verbunden sind.
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In einer ähnlichen Weise kann PT aktiviert
werden, um seine Adjuvanz- und Antigenaktivitäten zu verstärken. Die
S1-Untereinheit des hexameren PT-Proteins enthält die ADP-Ribosyltransferase-Aktivität während die
verbleibenden Untereinheiten die B-Domäne
bilden. Ähnlich
wie LT, weist PT sowohl Trypsinspaltstellen als auch Disuifidbindungsstellen
auf, die eine Rolle in der Assoziierung der S1-Untereinheit mit
dem B-Oligomer spielen. Es ist vorstellbar, dass die Aktivierung
durch Trypsinspaltung, Unterbrechung der Disulfidbindung oder beides
die Adjuvanz- und Antigenaktivitäten
von PT im Zusammenhang mit transkutaner Immunisierung verstärken. Aktivierung
kann auch die Form von Targeting annehmen, die durch Aufbrechen
des Hexamers in Untereinheiten erreicht wird. Beispielsweise bindet
die PT-Untereinheit S3 ausschließlich an die Glykolipide von
Monozyten und könnte
dafür verwendet
werden, auf Langerhanszellen in der Haut abzuzielen.
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Die Aktivierung des Antigens oder
Adjuvanz könnte
auf das Konzept der transkutanen Immunisierung unter Verwendung
von DNA durch Herstellung eines Fusionsproteins, das Antigen- und
Adjuvanzdomänen umfasst,
ausgeweitet werden. Mit diesem Verfahren könnte ein Plasmid, das ein ADP-ribosylierendes
Exotoxin wie CT oder LT kodiert und so aufgebaut ist, dass es ein
separates Antigen wie ein Malaria- oder HIV-Antigen gleichzeitig
exprimiert, auf der Haut, in einer hydratisierenden Lösung oder
einer undurchlässigen
Auflage, platriert und dann durch Langerhanszellen aufgenommen werden.
Expression der ADP-ribosylierenden Exotoxinkomponente des Fusionsproteins
wie CT oder LT könnte
die Langerhanszelle aktivieren, bewirken, dass sie wandert und das
Antigen in den Lymphknoten präsentiert,
und dadurch gegen das kodierte Antigen eine Immunantwort induzieren.
Eine weitere Ausführungsform
könnte
die Konjugation eines Adjuvanz mit einem Plasmid einschließen: ein
Fc-Anteil von IgG an ein Plasmid, um auf APCs abzuzielen. Eine ähnliche
Immunisierung könnte
durch Verwendung von getrennten Plasmiden für die Expression eines ADP-ribosylierenden Exotoxins
wie CT oder LT und einem weiteren für die Expression des Antigens
wie ein Malaria- oder HIV-Antigen erreicht werden. Es ist vorstellbar,
dass mehrere Gene auf einem einzelnen Konstrukt für mehrere
Antigene verwendet werden können,
oder es können
mehrere Plasmide verwendet werden, um gleichzeitig Antigene für eine multivalente
Immunisierung einzubringen. Plasmide, die Choleratoxin B oder andere
ADP-ribosylierende Exotoxine kodieren, können mit Protein-Antigenen
eingebracht werden.
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Andere Mittel zur Aktivierung des
transkutanen Adjuvanz können,
wie die Zugabe von Detergenzien und Phospholipid zu der Formulierung
wirksam sein, um CT-Aktivität
durch den ADP-Ribosylierungsfaktor zu verstärken (siehe z. B. Spangler,
1992).
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Für
die Immunisierung unter Verwendung von Adjuvanz- oder Antigenaktivierung
kann die Modifizierung der Adjuvanz- oder Antigenkomponente der
Formulierung dessen Wirksamkeit in parenteraler Immunisierung reduzieren,
ohne dass die Verwendbarkeit der Formulierung für transkutane Immunisierung
zerstört wird,
wenn das Adjuvanz und/oder Antigen aktiviert ist. Unerwünschte Eigenschaften
(z. B. Toxizität,
allergische Reaktivität
und Nebenwirkungen) des Antigens oder Adjuvanz in der Formulierung
können
durch Modifikation verringert werden, ohne dass dessen Wirksamkeit
in transkutaner Immunisierung zerstört wird. Die Aktivierung eines
solchen modifizierten Adjuvanz oder Antigens kann z. B. die Entfernung
einer reversiblen chemischen Modifikation (z. B. Proteolyse) oder
eine Beschichtung, die eine Komponente der Formulierung reversibel
vom Immunsystem isoliert (d. h. eine eingekapselte Formulierung),
einschließen.
Alternativ können
das Adjuvanz und/oder Antigen, das die Formulierung umfasst, in
einem Partikel eingekapselt sein (z. B. Mikrosphären, Nanopartikel). Die Phagozytose
des Partikels selbst kann die Aktivierung einer Antigen-präsentierenden
Zelle durch Hochregulieren der Expression von Haupthistokompatibilitäts-Antigenen
und/oder ko-stimulatorischen Molekülen (z. B. MHC Klasse II, B7-2)
verstärken.
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ANTIGEN
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In der Erfindung verwendetes Antigen
kann durch rekombinante Mittel exprimiert werden, vorzugsweise als
eine Fusion mit einem Affinitäts-
oder Epitop-Tag (Summers und Smith, 1987; Goeddel, 1990; Ausubel et
al., 1996); die chemische Synthese eines Oligopeptids, entweder
frei oder konjugiert an Trägerproteine, kann
verwendet werden, um Antigen zu erhalten, das in der Erfindung verwendet
wird (Bodanszky, 1993; Wisdom, 1994). Oligopeptide werden als eine
Art Polypeptid betrachtet. Oligopeptidlängen von 6 Resten bis 20 Resten
sind bevorzugt. Polypeptide können
auch als verzweigte Strukturen synthetisiert werden, wie solche, die
in den US-Patenten Nr. 5,229,490 und 5,390,111 offenbart werden.
Antigene Polypeptide schließen
zum Beispiel ein: synthetische oder rekombinante B-Zell- und T-Zell-Epitope,
Universal-T-Zell-Epitope und gemischte T-Zell-Epitope aus einem Organismus oder einer
Erkrankung, und B-Zell-Epitope von einem/r anderen. Antigen, das
durch rekombinante Mittel oder Peptidsynthese erhalten wurde, wie
auch in der Erfindung verwendetes Antigen, das aus natürlichen
Quellen oder Extrakten erhalten wurde, kann mittels der physikalischen
oder chemischen Eigenschaften des Antigens aufgereinigt werden,
vorzugsweise durch Fraktionierung oder Chromatographie (Janson und
Ryden, 1989; Deutscher, 1990, Scopes 1993). Eine mulitvalente Antigenformulierung
kann verwendet werden, um eine Immunantwort gegen mehr als ein Antigen
zur gleichen Zeit zu induzieren. Konjugate können verwendet werden, um eine
Immuantwort gleichzeitig gegen mehrere Antigene zu induzieren, um
die Immunantwort aufzufrischen oder für beides. Zusätzlich können Toxine
durch die Verwendung von Toxoiden aufgefrischt werden oder Toxoide
durch die Verwendung von Toxinen. Transkutane Immunisierung kann
verwendet werden, um Antworten aufzufrischen, die ursprünglich durch
andere Wege der Immunisierung induziert worden waren, wie durch
orale, nasale oder parenterale Wege. Antigen schließt zum Beispiel
ein: Toxine, Toxoide, Untereinheiten davon oder Kombinationen davon
(z. B. Choleratoxin, Tetanustoxoid); zusätzlich können Toxine, Toxoide und Untereinheiten
davon oder Kombinationen davon als Antigen und Adjuvanz wirken.
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Das Antigen kann in einem Puffer
aufgelöst
werden. Geeignete Puffer schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf phosphatgepufferte Salzlösung,
Ca++/Mg++-frei (PBS),
normale Salzlösung
(150 mM NaCl in Wasser) und Trispuffer. Glycerol kann ein geeigneter
nicht- wässriger
Puffer für
die Verwendung in der vorliegenden Erfindung sein. Das Antigen kann
auch in Suspension vorliegen. Das Detergens kann in der Immunisierungslösung bleiben,
um die Penetration zu verstärken.
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Hydrophobes Antigen kann in einem
Detergens aufgelöst
werden, zum Beispiel ein Polypeptid, das eine membrandurchspannenden
Domäne
enthält.
Des Weiteren kann für
Formulierungen, die Liposome enthalten, ein Antigen in einer Detergenslösung (z.
B. ein Zellmembranextrakt) mit Lipiden gemischt werden, und Liposome
können
dann durch Entfernen des Detergens durch Verdünnung, Dialyse oder Säulenchromatographie
gebildet werden, siehe Gregoriadis (1993). Bestimmte Antigene, wie
zum Beispiel solche eines Virus (z. B. Hepatitis A), müssen als
solche nicht löslich
sein, sondern können
direkt in eine Lipidmembran eingebaut werden (z. B. ein Virosom,
wie beschrieben durch Morein und Simons, 1985), in eine Suspension
eines Virions allein oder Suspensionen von Mikrosphären, Nanopartikeln
oder hitre-inaktivierten Bakterien, die durch Antigen-präsentierende
Zellen aufgenommen und aktiviert werden können (z. B. Opsonisation).
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Plotkin und Mortimer (1994) stellen
Antigene bereit, die dazu verwendet werden können, Tiere oder Menschen zu
vakzinieren, um für
bestimmte Pathogene eine spezifische Immunantwort zu induzieren,
wie auch Verfahren zur Herstellung von Antigen, Bestimmung einer
geeigneten Dosis von Antigen, Testen auf die Induktion einer Immunantwort
und Behandeln von Infektionen durch ein Pathogen (z. B. Bakterium,
Virus, Pilz oder Parasit).
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Bakterien schließen zum Beispiel ein: Anthrax,
Campylobacter, Cholera, Clostridia, Diphtherie, enterotoxigene E.
coli, Giardia, Gonococcus, Helicobacter pylori oder Unease, produziert
durch H. pylori (Lee und Chen, 1994), Hämophilus influenza B, Hämophilus
influenza nicht typisierbar, Meningococcus, Mycobakterium, Pertussis,
Pneumococcus, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus
B, Tetanus, Vibrio cholerae, Borrelia burgdorfi und Yersinia; und
deren Produkte.
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Viren schließen zum Beispiel ein: Adenovirus,
Dengue Serotypen 1 bis 4 (Delenda et al., 1994; Fonseca et al.,
1994; Smucny et al., 1995), Ebola (Jahrling et al., 1996), Enterovirus,
Hantavirus, Hepatitis Serotypen A bis E (Blum, 1995; Katkov, 1996; Lieberman
und Greenberg, 1996; Mast, 1996; Shafara et al., 1995; Smedila et
al., 1994; US-Patent Nr. 5,314,808 und 5,436,126), Herpes simplex
Virus 1 oder 2, menschliches Immundefizienzvirus (Deprez et al.,
1996), menschliches Papillomvirus, Influenza, Masern, Norwalk, japanische
Pferdeenzephalitis, Papillomvirus, Parvovirus B19, Polio, Tollwut,
Respiratory Syncytial Virus, Rotavirus, Röteln, Rubeola, St. Louis Enzephalitis,
Vaccinia, Vacciniakonstrukte, die Gene enthalten, die andere Antigene wie
Malaria-Antigene,
Varizella und Gelbfieber kodieren; und deren Produkte.
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Parasiten schließen zum Beispiel ein: Entamoeba
histolytica (Zhang et al., 1995); Plasmodium (Bathurst et al., 1993;
Chang et al., 1989, 1992, 1994; Fries et al., 1992a, 1992b; Herrington
et al., 1991; Khusmith et al., 1991; Malik et al., 1991; Migliorini
et al., 1993; Pessi et al., 1991; Tam, 1988; Vreden et al., 1991;
White et al., 1993; Wiesmüller
et al., 1991), Leishmania (Frankenburg et al., 1996) und die Darmwürmer; und
Produkte davon.
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Andere Viren, die in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
werden in Gordon, 1997, offenbart und schließen zum Beispiel ein: Adenovirus
(Atemwegserkrankung), Coronavirus (Atemwegs- und Darmerkrankung),
Cytomegalovirus (Mononukleose), Dengue-Virus (Dengue-Fieber, Schocksyndrom),
Epstein-Barr-Virus (Mononukleose, Burkitt-Lymphom), Hepatitis A-,
B- und C-Virus (Lebererkrankung), Herpes simplex Virus Typ 1 (Enzephalitis,
Stomatitis), Herpes simplex Virus Typ 2 (Genitalschäden), menschliches Herpesvirus
6 (unbekannt, möglicherweise
Kaposi Sarkom), menschliches Immundefizienzvirus Typen 1 und 2 (erworbenes
Immundefizienzsyndrom AIDS), menschliches T-Zell-lymphotropes Virus
Typ 1 (T-Zell-Leukämie), Influenza
A, B und C (Atemwegserkrankung), japanisches Enzephalitisvirus (Lungenentzündung, Enzephalopathie),
Masernvirus (subakute sklerotisierende Leukoenzephalitis), Mumpsvirus
(Meningitis, Enzephalitis), Papillomvirus (Warzen, Zervixkarzinom),
Parvovirus (Atemwegserkrankung, Anämie), Poliovirus (Lähmung),
Polyomavirus JC (multifokale Leukoenzephalopathie), Polyomavirus
BK (hämorrhagische
Zystitis), Rabiesvirus (Nervenfehlfunktion), Respiratory Syncytial
Virus (Atemwegserkrankung), Rhinovirus (einfache Erkältung),
Rotavirus (Diarrhoe), Rubellavirus (fötale Missbildungen), Vacciniavirus
(allgemeine Infektion), Gelbfiebervirus (Gelbsucht, Nieren- und
Leberversagen) und Varizella zoster Virus (Windpocken).
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Andere Bakterien, die in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
werden in Gordon, 1997, offenbart und schließen zum Beispiel ein: Bacillus
anthracis (Anthrax), Bordetella pertussis (Keuchhusten), Borrelia
burgdorferi (Lyme-Borreliose), Campylobacter jejuni (Gastroenteritis),
Chlamydia trachomatis (entzündliche
Beckenerkrankung, Blindheit), Clostridium botulinum (Botulismus),
Corynebacterium diphtheriae (Diphtherie), Escherichia coli (Diarrhoe,
Harntraktinfektionen), Hämophilus
influenzae (Lungenentzündung), Helicobacter
pylori (Gastritis, Zwölffingerdarmgeschwür), Legionella
pneumophila (Legionärskrankheit),
Listeria monozytogenes (Meningitis, Sepsis), Mycobacterium leprae
(Lepra), Mycobacterium tuberculosis (Tuberkulose), Neisseria gonorrhoea
(Gonorrhoea), Neisseria meningitidis (Sepsis, Meningitis), Pseudomonas
aeruginosa (im Krankenhaus entstehende Infektionen), Rickettsia
(Rocky-Mountain-Fleckfieber),
Salmonella (typhusartiges Fieber, Gastroenteritis), Shigella (Dysenterie),
Staphylococcus aureus (Eiterflechte, toxisches Schocksyndrom), Streptococcus
pneumoniae (Lungenentründung,
Mittelohrentründung),
Streptococcus pyogenes (rheumatisches Fieber, Rachenkatarrh), Treponema
pallidum (Syphilis), Vibrio cholerae (Cholera), Yersinia pestis
(Beulenpest).
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Andere Parasiten, die in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
werden in Gordon, 1997, offenbart und schließen zum Beispiel ein: afrikanische
Trypanosomen (Schlafkrankheit), Entamoeba histolytica (amöbe Dysenterie),
Giardia lamblia (Durchfallerkrankung), Leishmania (Schäden der
Milz, tropische Geschwüre),
Plasmodium (Malaria), Microfilariae (Fadenwürmerbefall), Schistosomen (Bilharziose),
Toxoplasma gondii (Toxoplasmose), Trichomonas vaginalis (Vaginitis),
Trypanosoma cruzi (Chagas Krankheit).
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Pilze, die in der vorliegenden Erfindung
verwendet werden können,
werden in Gordon, 1997, offenbart und schließen zum Beispiel ein: Candida
albicans (Schleimhautinfektionen), Histoplasma (Lungen- und Lymphknoteninfektionen),
Pneumocystis carinii (Lungenentründung
bei AIDS), Aspergillus fumigatis (Aspergillose).
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ADJUVANZ
-
Die Formulierung enthält auch
ein Adjuvanz, einschließlich
eines ADP-ribosylierenden Exotoxins, dessen bindende B-Untereinheit
oder Toxoid eines ADP-ribosylierende Exotoxins, wobei ein einzelnes
Molekül
sowohl Adjuvanz- als auch Antigeneigenschaften (z. B. Choleratoxin)
(Elson und Dertzbaugh, 1994) enthalten kann. Adjuvanzien sind Substanzen,
die dafür
verwendet werden können,
spezifisch oder unspezifisch eine antigenspezifische Immunantwort
zu potenzieren. Normalerweise werden das Adjuvanz und die Formulierung vor
der Präsentation
des Antigens gemischt, aber als Alternative können sie innerhalb eines kurzen
Zeitintervalls getrennt präsentiert
werden.
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Choleratoxin ist ein bakterielles
Exotoxin aus der Familie der ADP-ribosylierenden Exotoxine (bezeichnet
als bAREs). Die meisten bAREs sind als A : B-Dimere mit einer bindenden
B-Untereinheit und einer A-Untereinheit, welche die ADP-Ribosyltransferase
enthält,
organisiert. Solche Toxine schließen Diphtherie, Pseudomonas-Exotoxin
A, Choleratoxin (CT), E. coli hitrelabiles Enterotoxin (LT), Pertussistoxin
(PT), C. botulinum-Toxin
C2, C. botulinum-Toxin C3, C. limosum-Exoenzym, B. cereus-Exoenzym,
Pseudomonas-Exotoxin S, Staphylococcus aureus EDIN und B. sphaericus-Toxin
ein.
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Choleratoxin ist ein Beispiel für ein bARE,
das mit A- und B-Untereinheiten organisiert ist. Die B-Untereinheit
ist die bindende Untereinheit und besteht aus einem B-Untereinheit-Pentamer, das nicht-kovalent
an die A-Untereinheit gebunden ist. Das B-Untereinheit-Pentamer ist in einer
symmetrischen Doughnut-förmigen Struktur
angeordnet, die an ein GM1-Gangliosid auf der Zielzelle bindet.
Die A-Untereinheit dient zum ADP-Ribosylieren der Alpha-Untereinheit
eines Teils der heterodimeren GTP-Proteine (G-Proteine), einschließlich des Gs-Proteins,
was zu einer erhöhten
intrazellulären
Menge von zyklischem AMP führt.
Dies stimuliert die Freisetzung von Ionen und Flüssigkeit aus intestinalen Zellen
im Fall von Cholera.
-
Choleratoxin (CT) und seine B-Untereinheit
(CTB) haben Adjuvanzeigenschaften, wenn sie entweder als ein intramuskuläres oder
orales Immunogen verwendet werden (Elson und Dertzbaugh, 1994; Trach
et al., 1997). Hitzelabiles Enterotoxin aus E. coli (LT) ist zu
75– 77%
mit CT auf der Aminosäurebene
homolog und besitzt ähnliche Bindungseigenschaften;
es scheint ebenfalls an den GM1-Gangliosid-Rezeptor im Darm zu binden
und hat ähnliche
ADP-ribosylierende Exotoxinaktivitäten. Ein weiteres bARE, Pseudomonas
Exotoxin A (ETA) bindet an das α2-Makroglobulinrezeptor-Low-Density-Lipoproteinrezeptorverwandte
Protein (Kounnas et al., 1992). bAREs sind in einem Übersichtsartikel
von Krueger und Barbieri (1995) beschrieben. CT, CTB, LT, ETA und
PT stellen, obwohl sie unterschiedliche zelluläre Bindungsstellen aufweisen,
wirksame Adjuvanzien für
transkutane Immunisierung dar, die hohe Mengen von IgG-Antikörpern, nicht
aber IgE-Antikörpern,
induzieren. CTB ohne CT kann ebenfalls hohe Mengen von IgG-Antikörpern induzieren.
Daher können sowohl
bAREs als auch deren Derivative wirksam immunisieren, wenn sie epikutan
in einer einfachen Lösung auf
die Haut aufgebracht werden.
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Alle lizensierten Vakzinien erfordern
einen Antikörperspiegel
für die
Zulassung – es
wird keine andere Immunkomponente, wie T-Zell-Proliferation, verwendet.
Schutz gegen die lebensbedrohlichen Infektionen, Diphtherie, Pertussis
und Tetanus (DPT), kann durch Induzieren von hohen Mengen von zirkulierenden
Antitoxin-Antikörpern
erreicht werden. Pertussis kann dahingehend eine Ausnahme sein,
dass einige Forscher glauben, dass Antikörper, die gegen andere Teile
des eindringenden Organismus gerichtet sind, für den Schutz notwendig sind,
obwohl dies kontrovers ist (siehe Schneerson et al., 1996) und die
meisten azellulären
Pertussisvakzinien der neuen Generation PT als eine Komponente der
Vakzine aufweisen (Krueger und Barbieri, 1995). Die Pathologien
in den Erkrankungen, die durch DPT verursacht werden, hängen direkt
mit der Wirkung ihrer Toxine und Antitoxin-Antikörper zusammen und spielen mit
Sicherheit eine Rolle für
den Schutz (Schneerson et al., 1996).
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Im Allgemeinen können Toxine chemisch inaktiviert
werden, um Toxoide zu bilden, die weniger toxisch sind aber immunogen
bleiben. Wir stellen uns vor, dass eine Ausführungsform des transkutanen
Immunisierungssystems toxinbasierte Immunogene und Adjuvanzien verwenden
wird, um Antitoxinspiegel zu erzielen, die adäquat für den Schutz gegen diese Erkrankungen
sind. Die Antitoxin-Antikörper
können
durch Immunisierung mit den Toxinen, den genetisch detoxifizierten
Toxoiden selbst oder mit Toxoiden und Adjuvanzien wie CT induziert
werden. Man kann sich vorstellen, dass genetisch toxoidierte Toxine,
die veränderte
ADP-ribosylierende Exotoxinaktivität aufweisen, oder Trypsinspaltstellenmutationen
oder andere Mutationen als nicht toxische Aktivatoren von Antigen-präsentierenden
Zellen, die in transkutaner Immunisierung verwendet werden, besonders
nützlich
sind. Mutanten basierend auf der Inaktivierung der katalytischen
Aktivität
der ADP-Ribosyltransferase durch genetische Deletion behalten die
Bindungsfähigkeiten
aber ihnen fehlt die Toxizität
der natürlichen
Toxine. Dieser Ansatz wird von Burnette et al. (1994), Rappouli
et al. (1995) und Rappouli et al. (1996) beschrieben. Solche genetisch
toxoidierten Exotoxine könnten
für ein
transkutanes Immunisierungssystem insoweit verwendbar sein, als
dass sie keine Sicherheitsbedenken hervorrufen würden, weil die Toxoide als
nicht toxisch angesehen würden.
Es gibt andere genetisch veränderte
Toxine, die zum Beispiel eine Deletion der Trypsinspaltstelle aufweisen,
und sowohl nicht toxische als auch immunogene auf der Haut verwenden.
Man würde
jedoch erwarten, dass die Aktivierung durch eine Technik wie Trypsinspaltung,
die Adjuvanzqualitäten von
LT durch die Haut erhöht,
der eigenen Trypsinenzyme fehlen. Zusätzlich existieren mehrere Techniken, um
Toxine chemisch zu toxoidieren, wodurch das gleiche Problem angegangen
werden kann (Schneerson et al., 1996). Diese Techniken könnten für bestimmte
Anwendungen wichtig sein, insbesondere pädiatrische Anwendungen, bei
denen in den Verdauungsapparat aufgenommene Toxine (z. B. Diphtherietoxin)
möglicherweise
schädliche
Reaktionen hervorrufen können.
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Wenn ein immunisierendes Antigen
ausreichende Langerhanszellen-aktivierende Fähigkeiten aufweist, dann muss
ein getrenntes Adjuvanz nicht erforderlich sein, wie im Fall von
CT, das sowohl Antigen als auch Adjuvanz darstellt. Es ist vorgesehen,
dass Gesamtrellpräparationen,
lebende Viren, abgeschwächte
Viren, DNA-Plasmide und bakterielle DNA zur transkutanen Immunisierung
ausreichend sein können,
wenn ein Adjuvanz vorhanden ist. Es kann möglich sein, geringe Konzentrationen
von Kontaktsensibilisatoren oder anderen Aktivatoren von Langerhanszellen
zu verwenden, um eine Immunantwort zu induzieren, ohne Hautschäden zu induzieren.
-
PRAKTISCHE
ASPEKTE DER TRANSKUTANEN IMMUNISIERUNG
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Eine wirksame Immunisierung kann
mit der vorliegenden Erfindung erreicht werden, weil transkutaner Transfer
von Antigen auf die Langerhanszelle abzielen kann. Diese Zellen werden
im Überfluss
in der Haut gefunden und sind wirksame Antigen-präsentierende
Zellen, die zu T-Zell-Gedächtnis
und wirksamen Immunantworten führen.
Durch die Anwesenheit einer großen
Zahl von Langerhanszellen in der Haut kann die Effizienz des transkutanen
Transfers mit dem Oberflächenareal
zusammenhängen,
das dem Antigen und Adjuvanz ausgesetzt war. Tatsächlich kann
der Grund dafür,
dass transkutane Immunisierung so effizient ist, darin liegen, dass
sie auf eine größere Zahl
von diesen wirksamen Antigen-präsentierenden
Zellen abzielt als intramuskuläre
Immunisierung.
-
Wir sehen vor, dass die vorliegende
Erfindung den Zugang zur Immunisierung verbessern wird, während eine
wirksame Immunantwort induziert wird. Da transkutane Immunisierung
keine physikalische Durchdringung der Haut und daraus resultierende
Komplikationen und Schwierigkeiten beinhaltet, werden die Erfordernisse
an geschultem Personal, sterilen Techniken und steriler Ausrüstung verringert.
Des Weiteren werden die Hindernisse für Immunisierung an mehreren
Stellen oder für
mehrere Immunisierungen verringert. Immunisierung durch eine einzelne
Anwendung der Formulierung ist ebenfalls vorgesehen, aber Auffrischen
wird im Allgemeinen nötig
sein. Die nadelfreie Immunisierung ist eine Priorität für die Weltgesundheitsorganisation (WHO)
wegen der Wiederverwendung von Nadeln, was nadelbedingte Erkrankung
bewirkt.
-
Eine Immunisierung kann erzielt werden
durch Verwenden von epikutaner Anwendung einer einfachen Lösung von
Antigen und Adjuvanz, imprägniert
in Gaze unter einer undurchlässigen
Auflage oder durch Verwenden von anderen Auflagetechnologien: Cremes,
Gels, Immersionen, Salben und Sprays sind andere mögliche Verfahren
der Anwendung. Die Immunisierung könnte durch nicht geschultes
Personal verabreicht werden und ist der Eigenanwendung zugänglich.
Eine Feldimmunisierung könnte
in großem
Maßstab
stattfinden angesichts des einfachen Zugangs zur Immunisierung.
Zusätzlich
würde ein
einfaches Immunisierungsverfahren den Zugang zur Immunisierung durch
pädiatrische
Patienten und ältere
Menschen und den Bevölkerungen in
Ländern
der Dritten Welt verbessern.
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Bei früheren Vakzinien wurden ihre
Formulierungen durch die Haut mit Nadeln injiziert. Injektion von Vakzinien
unter Verwendung von Nadeln bringt bestimmtem medizinischen Personal,
um die Vakzinien zu verabreichen, Unbehagen durch die Injektion
und mögliche Komplikationen,
die das Punktieren der Haut mit der Nadel mit sich bringt. Die Immunisierung
durch die Haut ohne die Verwendung von Nadeln (d. h. transkutane Immunisierung)
stellt durch Vermeiden der zuvor erwähnten Nachteile einen wichtigen
Fortschritt für
den Vakzinetransfer dar.
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Darüber hinaus kann transkutane
Immunisierung der Immunisierung unter Verwendung von Nadeln überlegen
sein, da mehr Immunzellen erreicht werden würden durch die Verwendung von
mehreren Stellen, die auf große
Oberflächenbereiche
der Haut abzielen. Eine therapeutisch wirksame Menge von Antigen,
die ausreichend ist, um eine Immunantwort zu induzieren, kann transkutan
eingebracht werden, entweder an einer einzelnen kutanen Stelle oder über ein
Gebiet von intakter Haut, das mehrere drainierende Lymphknotenfelder abdeckt
(z. B. zervical, axial, inguinal, epitrocheal, popliteal und jene
des Abdomen und Thorax). Solche Gebiete in der Nähe von vielen unterschiedlichen
Lymphknoten, an Stellen überall
auf dem Körper,
werden dem Immunsystem einen weiter verbreiteten Stimulus bieten,
als wenn eine geringe Menge von Antigen an einer einzelnen Stelle
durch intradermale, subkutane oder intramuskuläre Injektion injiziert wird.
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Antigen, das durch oder in die Haut
wandert, kann Antigen-präsentierenden
Zellen begegnen, die das Antigen in einer Weise prozessieren, dass
eine Immunantwort induziert wird. Mehrere Immunisierungsstellen können eine
größere Zahl
von Antigen-präsentierenden
Zellen rekrutieren und die größere Population
von rekrutierten, Antigen-präsentierenden
Zellen würde
zu einer stärkeren
Induktion der Immunantwort führen.
Es ist vorstellbar, dass die Absorption durch die Haut Antigen zu
phagozytischen Zellen der Haut bringt, wie zum Beispiel dermalen
dendritischen Zellen, Makrophagen und anderen Antigen-präsentierenden
Zellen der Haut; Antigen kann auch zu phagozytischen Zellen der
Leber, Milz und des Knochenmarks gebracht werden, von denen bekannt
ist, dass sie als die Antigen-präsentierenden
Zellen dienen, durch den Blutstrom oder das lymphatische System.
Langerhanszellen, dendritische Zellen und Makrophagen können spezifisch
gezielt angegangen werden, unter Verwendung von Fc-Rezeptor, konjugiert
mit Adjuvanz oder rekombinant hergestellt als Fusionsprotein; außerdem können Komplementrezeptoren
(C3, C5) an Protein A oder Protein G konjugiert werden oder als
Fusionsprotein rekombinant hergestellt werden, um auf das Oberflächenimmunglobulin von
B-Zellen abzuzielen. Das Ergebnis wäre eine gezielte Verteilung
von Antigen auf Antigen-präsentierende
Zellen in einem Ausmaß,
das selten, wenn überhaupt,
durch gegenwärtige
Immunisierungspraktiken erreicht wird.
-
Das transkutane Immunisierungssystem
kann direkt auf die Haut aufgebracht werden und an der Luft getrocknet
werden; in die Haut oder die Kopfhaut eingerieben werden; an der
Stelle mit einem Verband, einer Auflage oder absorbierendem Material
festgehalten werden; Eintauchen; auf andere Weise festgehalten werden,
durch eine Vorrichtung wie einen Strumpf, Pantoffel, Handschuh oder
Hemd; oder auf die Haut gesprüht werden,
um den Kontakt mit der Haut zu maximieren. Die Formulierung kann
in einem absorbierenden Verband oder Gaze angewendet werden. Die
Formulierung kann mit einem undurchlässigen Verband bedeckt werden,
wie zum Beispiel AQUAPHOR® (eine Emulsion von Rohpetroleum,
Mineralöl,
Mineralwachs, Wollwachs, Panthenol, Bisabolol und Glyzerin von Beiersdorf,
Inc.), Plastikfolie, COMFEEL® (Coloplast) oder Vaseline;
oder einem undurchlässigen
Verband wie z. B. DUODERM© (3M) oder OPSITE® (Smith & Napheu). Ein undurchlässiger Verband
verhindert vollständig
das Durchdringen von Wasser. Die Formulierung kann auf eine einzelne
oder mehrere Stellen, einzelne oder mehrere Gliedmaßen oder
auf große
Oberflächenbereiche
der Haut durch vollständiges
Eintauchen aufgetragen werden. Die Formulierung kann direkt auf
die Haut aufgebracht werden.
-
Die genetische Immunisierung wurde
in den US-Patenten Nr. 5,589,466, 5,593,972 und 5,703,055 beschrieben.
Die in der Formulierung enthaltene(n) Nukleinsäure(n) kann (können) das
Antigen, das Adjuvanz oder beide kodieren. Es würde im Allgemeinen erwartet
werden, dass die Immunantwort durch die gemeinsame Verabreichung
von einem Adjuvanz, zum Beispiel CT, LT oder CpGs, gegenüber der
Nukleinsäure,
die das Antigen kodiert, verstärkt
werden würde.
Die Nukleinsäure
kann, muss aber nicht, fähig
sein zur Replikation; sie kann nicht integrierend und nicht infektiös sein.
Zum Beispiel kann die Nukleinsäure
ein Fusionspolypeptid kodieren, umfassend das Antigen und eine Ubiquitindomäne, um die
Immunantwort auf eine Klasse I beschränkte Antwort zu richten. Die
Nukleinsäure
kann weiterhin eine regulatorische Region umfassen (z. B. Promotor,
Enhancer, Silencer, Transkriptionsinitiations- und -terminationsstellen,
RNA-Splice Akzeptor-
und Donorstellen, Polyadenylierungssignal, interne Ribosomenbindungsstelle,
Translationsinitiations- und -terminationsstellen), die funktionell verknüpft sind
mit den Sequenzen, die das Antigen kodieren. Die Nukleinsäure kann mit
einem Agens komplexiert werden, das die Transfektion fördert, wie
einem kationischen Lipid, Kalziumphosphat, DEAE-Dextran, Polybren-DMSO
oder einer Kombination davon; auch können Immunzellen direkt angegangen
werden, durch Konjugation von DNA an den Fc-Rezeptor oder Protein
A/G, oder Einkapseln der DNA in ein Agens, das mit Fc-Rezeptor oder Protein
A/G verknüpft
ist. Die Nukleinsäure
kann Regionen umfassen, die von viralen Genomen abgeleitet sind.
Solche Materialien und Methoden sind von Kriegler (1990) und Murray
(1991) beschrieben worden.
-
Eine Immunantwort kann humorale (d.
h. antigenspezifische Antikörper)
und/oder zelluläre
(d. h. antigenspezifische Lymphozyten wie B-Zellen, CD4+ T-Zellen,
CD8+ T-Zellen, CTL, Th1-Zellen, Th2-Zellen und/oder
TDTH-Zellen) Wirkungszweige umfassen. Darüber hinaus
kann die Immunantwort NK-Zellen umfassen, die antikörperabhängige zellvermittelte
Zytotoxizität
(ADCC) vermitteln.
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Die Immunantwort, die durch die erfindungsgemäß hergestellte
Formulierung induziert wird, kann das Hervorrufen von antigenspezifischen
Antikörpern
und/oder zytotoxischen Lymphozyten (CTL, beschrieben in einem Übersichtsartikel
von Alving und Wassef, 1994) umfassen. Antikörper können durch Immunoassaytechniken
nachgewiesen werden, und der Nachweis von verschiedenen Isotypen
(z. B. IgM, IgD, IgA1, IgA2, sezerniertes IgA, IgE, Igel, IgG2,
IgG3 oder IgG4) kann erwartet werden. Eine Immunantwort kann auch
durch einen Neutralisierungstest festgestellt werden. Antikörper sind
schützende
Proteine, die durch B-Lmyphozyten produziert werden. Sie sind hochspezifisch
und zielen im Allgemeinen auf ein Epitop eines Antigens ab. Häufig spielen
Antikörper
eine Rolle beim Schutz gegen Erkrankungen, durch spezifisches Reagieren
mit Antigenen, die von den Pathogenen abgeleitet sind, welche die
Erkrankung bewirken.
-
CTLs sind besonders schützende Immunzellen,
die produziert werden, um gegen die Infektion durch ein Pathogen
zu schützen.
Sie sind ebenfalls hochspezifisch. Die Immunisierung kann CTLs spezifisch
für das Antigen
induzieren, so wie ein synthetisches Oligopeptid, basierend auf
einem Malariaprotein, in Verbindung mit einem Eigen-Haupthistokompatibilitäts-Antigen.
CTLs, die durch Immunisierung mit dem transkutanen Transfersystem
induziert wurden, können
Pathogen-infizierte Zellen abtöten.
Die Immunisierung kann auch eine Gedächtnisantwort hervorrufen,
wie nahegelegt wird durch die Auffrischungs-Antworten in Antikörpern und
CTLs, Lymphozytenproliferation durch Kultur von Lymphozyten, die
mit Antigen stimuliert wurden und Hypersensitivitätsantworten
vom verzögerten
Typ auf einen intradermalen Haut-Challenge-Versuch
mit dem Antigen allein.
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In einem viralen Neutralisierungstest
werden Reihenverdünnungen
von Seren zu Wirtszellen hinzugefügt, die dann nach dem Challenge
mit einem infektiösen
Virus Infektion hin beobachtet werden. Als Alternative können Reihenverdünnungen
von Seren mit infektiösen
Titern von Virus vor der Animpfung eines Tieres inkubiert werden
und die angeimpften Tiere werden dann auf Zeichen von Infektion
beobachtet.
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Das transkutane Immunisierungssystem
der Erfindung kann unter Verwendung von Challenge-Modellen in entweder
Tieren oder Menschen beurteilt werden, welche die Fähigkeit
der Immunisierung mit dem Antigen beurteilen, das Subjekt vor der
Erkrankung zu schützen.
Ein solcher Schutz würde
eine antigenspezifische Immunantwort zeigen. Anstatt eines Challenge
wird zum Beispiel generell angenommen, dass das Erreichen eines
Anti-Diphtherie-Antikörpertiters
von 5 IU/ml oder darüber
einen optimalen Schutz anzeigt und als Ersatzmarker für Schutz
dient (Plotkin und Mortimer , 1994).
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Vakzinierung ist auch als Behandlung
für Krebs
und Autoimmunerkrankungen verwendet worden. Zum Beispiel kann die
Vakzinierung mit einem Tumorantigen (z. B. prostataspezifisches
Antigen) eine Immunantwort in der Form von Antikörpern, CTLs und Lymphozytproliferation
induzieren, die es dem Immunsystem des Körpers erlaubt, Tumorzellen
zu erkennen und abzutöten.
Tumorantigene, die für
die Vakzinierung verwendbar sind, sind beschrieben worden für Melanom
(US-Patente Nr. 5,102,663, 5,141,742 und 5,262,177), Prostatakarzinom
(US-Patent Nr. 5,588,866) und Lymphom (US-Patente Nr. 4,816,249,
5,068,177 und 5,277,159). Vakzinierung mit T-Zellrezeptor-Oligopeptid kann
eine Immunantwort induzieren, die das Fortschreiten einer Autoimmunerkrankung
aufhält
(US-Patente Nr. 5,612,035 und 5,614,192; Antel et al., 1996; Vandenbark
et al., 1996). Das US-Patent Nr. 5,552,30 ) beschreibt ebenfalls
Antigene, die für
die Behandlung von Autoimmunerkrankungen geeignet sind.
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Das Folgende soll die vorliegende
Erfindung beispielhaft darstellen, wobei Beispiele 7 und 9 nicht
unter den Schutzanspruch der Ansprüche fallen, die Ausübung der
Erfindung ist jedoch in keiner Weise begrenzt oder eingeschränkt durch
die Beispiele.
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BEISPIELE
Immunisierungsverfahren
-
Vierundzwanzig Stunden vor der Immunisierung
wird der Rücken
der Maus von der distalen Seite des Schulterblatts bis 0,5 cm oberhalb
des Schwanzansatzes rasiert. Im Fall von C57BL/6 Mäusen werden
die Tiere vor dem Rasieren leicht anästhesiert (40 mg/kg Ketamin:
4 mg/kg Xylazinmischung in Salzlösung).
Am Tag der Immunisierung werden die Tiere mit 0,04 ml einer Anästhesiemischung
(2,3 ml sterile Salzlösung
(Sigma): 5 ml Ketamin (100 mg/ml, Parke-Davis): 0,5 ml Xylazin (100
mg/ml, Phoenix Pharmaceuticals)) immunisiert, was einer Enddosis
von ca. 110 mg/kg Ketamin und 11 mg/kg Xylazin ergibt. Für Verfahren,
die Alkoholtupfen erfordern, wird der Rücken zehnmal (5 × den Rücken Hochwischen
in Richtung des Kopfes, Umdrehen des Alkoholtupfers und weitere
5 × Zurückwischen)
unter Verwendung eines Isopropyltupfers abgewischt. Den Alkohol
lässt man
für 5 Minuten
evaporieren. Hydratation des Rückens
wird erreicht durch sanftes Reiben des Rückens mit einem sterilen, wassergesättigten
Gazetupfer, so dass sich ein Wasservorrat auf dem Rücken bildet.
Nach 5-minütiger
Hydratisierungsdauer wird der Rücken
mit einem trockenen Gazetupfer trocken getupft. Als nächstes wird
das Antigen – im
Allgemeinen ≤ 100 μg Antigen
und Adjuvanz in 100 μl
Endvolumen – auf den
Rücken
aufgetragen unter Verwendung einer Pipette und Spitze, und für 60 bis
120 Minuten auf der Haut belassen. Nachdem die definierte Immunisierungsdauer
erreicht worden ist, wird jede überschüssige Lösung im
immunisierten Bereich mit Baumwollgaze abgetupft. Die Tiere werden
dann unter einem langsamen, ständigen
Strom von lauwarmem Leitungswasser für zehn Sekunden abgespült, um jedes überschüssige Antigen zu
entfernen, trocken getupft und das Abspülverfahren wird wiederholt.
Die Käfige
werden dann auf Heizmatten platriert, bis sie (die Tiere) sich vollständig von
der Anästhesie
erholt haben.
-
Messung von
menschlichen Anti-LT-Antikörpertitern
-
Anti-LT-IgG-Titer wurden wie zuvor
beschrieben bestimmt (Svennerholm, A-M., Holmgren, J., Black, R.,
Levine, M. und Merson, M. Serologic differentiation between antitoxin
responses to infection with Vibrio cholerae and enterotoxin-producing
Escherichia coli. J. Infect. Dis 147, 541–522 (1983)). 96-Lochplatten
(Typ Russell) wurden über
Nacht mit Monosialogangliosid-GM1 (Sigma,
St. Louis MO) von LT (Sigma), blockiert mit 5% Trockenmilch in PBS-0,05%
Tween beschichtet. Antworten wurden nachgewiesen unter Verwendung
von Ziege-Anti-Mensch-IgG(γ)-HRP
(Kirkegaard und Perry, Gaithersburg, MD) und 2,2'-Azino-di(3-ethylbenzthiazolin)-sulfonat
(Kirkegaard und Perry) als Substrat, und die Platten wurden bei
405 nm ausgelesen. Die Ergebnisse werden als ELISA-Einheiten (EE)
wiedergegeben, die definiert sind als die inverse Verdünnung der
Probe, die eine OD von 1,0 ergibt. Anti-LT-IgA wurde in der gleichen
Weise bestimmt wie Anti-LT-IgG, mit der Ausnahme, dass Ziegen-Anti-Mensch-IgA(α)-HRP (Kirkegaard und
Perry) als zweiter Antikörper
verwendet wurde, und ODs wurden gegen eine Standard-IgA-Kurve aufgetragen,
was Ergebnisse ausgedrückt
in ng/ml ergab. Die IgA-Standardkurve und Gesamtserum IgA wurden
unter Verwendung von nicht markiertem Ziegen-Anti-Mensch-IgA (Kirkegaard
und Perry), gefolgt durch Blockieren wie oben und dann Auftragen
von Reihenverdünnungen
von IgA-Standard, bestimmt.
-
Beispiel 1.
-
Es wird angenommen, dass Abtupfen
der Haut mit einem behandelten oder unbehandelten Tupfer physikalisch
und chemisch einen kleinen Teil des Stratum Corneum entfernt und
daher die Hautpenetration fördert.
Tupfer können
aus Materialien wie zum Beispiel Baumwolle, Nylon, Viskose und Polyethylen
hergestellt werden. Es wird angenommen, dass Tupfen mit Alkohol
einen kleinen Teil des Stratum Corneum entfernt und sowohl als physikalisches
als auch als chemisches Mittel zur Penetrationsförderung wirkt. Im obigen Beispiel kann
die Förderung
der Immunantwort auf transkutane Immunisierung mit dieser Penetrationsförderungsmethode
gesehen werden. 6 bis 8 Wochen alte BALB/c-Mäuse wurden anästhesiert
und wie im „Immunisierungsverfahren" beschrieben rasiert.
24 Stunden später
wurden die Rücken
der Tiere abgewischt, entweder mit einem Gazetupfer, der mit Wasser
gesättigt
war „Wasser", oder für ca. 10
Sekunden mit einem Alkohol-Präptupfer
abgewischt, der 70% Isopropylalkohol „Isopropanol" enthielt. Man ließ den Alkohol
für ca.
5 Minuten evaporieren. Das überschüssige Wasser
wurde von den Rücken
der „Wasser"-Gruppe durch Tupfen
entfernt. Alle Tiere wurden dann mit 20 μg CT (100 μl einer 0,2 mg/ml-Lösung) behandelt.
Die Entfernung von überschüssigem Antigen
wurde wie im „Immunisierungsverfahren" beschrieben, durchgeführt.
-
Die Anti-CT-Antikörpertiter wurden unter Verwendung
von ELISA, wie oben beschrieben für „ELISA-IgG (N + L)", drei Wochen nach
einer einzelnen Immunisierung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle
1 gezeigt. Während
CT deutlich immunogen in beiden Gruppen war, zeigte die Gruppe,
die mit dem Alkohol-Präptupfer
behandelt worden war, einen Titer, dessen geometrisches Mittel 6-fach
höher war,
und die individuellen Titer waren einheitlicher als bei den „Wasser"-Tieren. Es hat also
den Anschein, dass chemische und physikalische Störung der
Hautoberfläche
mit Alkoholtupfern den Transfer von Antigen über den transkutanen Weg verstärkt.
-
Tabelle
1. Förderung
der transkutanen Immunisierung durch chemische Penetrationsförderung:
Anti-CT-Titer in Mäusen,
deren Haut vor dem Auftragen des Antigens mit einem Alkohol-Präptupfer
behandelt worden war.
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Beispiel 2.
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Um abzuschätzen, ob chemische Penetrationsförderung
allein die transkutane Immunisierung steigern kann, wurde ein Detergens
auf der Haut verwendet. 6 bis 8 Wochen alte BALB/c-Mäuse wurden
anästhesiert
und rasiert, wie im „Immunisierungsverfahren" beschrieben. Vierundzwanzig
Stunden später
wurden die Rücken
der „Wasser"-Gruppe mit einem
Gazetupfer, der mit Wasser gesättigt
war, abgewischt und ein Wasservorrat auf dem Rücken platziert. Ca. 5 Minuten
später
wurde jegliches überschüssiges Wasser
entfernt und 25 μg
CT (50 μl
einer 0,5 mg/ml-Lösung)
wurden auf dem Rücken
aufgetragen. Als Alternative wurden die Rücken der „5%-SDS"-Gruppe
24 Stunden nach dem Rasieren durch Betropfen von 300 μl 5%-SDS
(Natriumdodecylsulfat – eine
1 : 1-Mischung von deionisiertem Wasser und kommerzieller Vorratslösung von
10%-SDS), einem Detergens, für
ca. 12 Minuten behandelt, gefolgt durch Abtupfen von jeglichem überschüssigem SDS mit
einem trockenen Gazetupfer. SDS kann in einem Träger, wie zum Beispiel einem
Tupfer, auf die Haut aufgebracht werden, dann kann das überschüssige SDS
mit einem trockenen Gazetupfer entfernt werden. Danach wurden die
Tiere hydratisiert und wie die „Wasser"-Gruppe immunisiert. Das Entfernen von überschüssigem Antigen
erfolgte wie im „Immunisierungsverfahren" beschrieben.
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Die Anti-CT-Antikörpertiter wurden unter Verwendung
von ELISA, wie oben beschrieben für „ELISA-IgG (H + L)", zwei Wochen nach
einer einzelnen Immunisierung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2a
und 2b gezeigt. Während
CT deutlich immunogen in beiden Gruppen war, ist das geometrische
Mittel des Titers in der mit 5% SDS behandelten Gruppe zweifach
höher und
die Titer waren einheitlicher bei den letztgenannten Tieren im Vergleich
zu den „Wasser"-Tieren. Man kann
also annehmen, dass die chemische Störung der Hautoberfläche mit
Detergens (5% SDS) den Transfer von Antigen über den transkutanen Weg verstärkt.
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Tabelle
2a. Förderung
der transkutanen Immunisierung durch chemische Penetrationsförderung:
Anti-CT-Titer in Mäusen,
deren Haut vor dem Auftragen des Antigens mit Detergens (5% SDS)
behandelt worden war.
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Tabelle
2b. Förderung
der transkutanen Immunisierung durch chemische Penetrationsförderung:
Anti-CT-Titer in Mäusen,
deren Haut vor dem Auftragen des Antigens mit Detergens (5% SDS)
behandelt worden war.
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Beispiel 3.
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Eine andere Form von chemischer Penetrationsförderung,
ein Enthaarungsmittel (wie zum Beispiel Kalziumhydroxid oder Ähnliches)
wird in dermatologischen Experimenten häufig verwendet, und es wurde
gezeigt, dass es die transkutane Immunisierung verstärkt. 6 bis
8 Wochen alte BALB/c-Mäuse
wurden anästhesiert
und, wie im „Immunisierungsverfahren" beschrieben, rasiert.
Vierundzwanzig Stunden später
wurden die Rücken
der „Wasser"-Gruppe mit einem
Gazetupfer, der mit Wasser gesättigt
war, abgewischt, und ein Wasservorrat wurde auf dem Rücken platziert.
Ca. 5 Minuten später
wurde jegliches überschüssige Wasser
entfernt, und 25 μg
CT (50 μl
einer 0,5 mg/ml-Lösung)
wurden auf dem Rücken
aufgetragen. Als Alternative wurden die Rücken der „Nair®"-Gruppe vierundzwanzig
Stunden nach dem Rasieren mit 100 ml einer Nair®-Creme für ca. 12
Minuten behandelt, gefolgt von Abwischen der Formulierung mit einem
Gazetupfer, der mit Wasser gesättigt
war. Eine solche Behandlung kann für ca. 0,1 bis 30 Minuten fortgeführt werden,
vorzugsweise für
ca. 20 Minuten und weiter bevorzugt für ca. 12 Minuten. Danach wurden
die Tiere hydratisiert und wie in der „Wasser"-Gruppe immunisiert. Das Entfernen von überschüssigem Antigen
wurde durchgeführt,
wie im „Immunisierungsverfahren" beschrieben.
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Die Anti-CT-Antikörpertiter wurden unter Verwendung
von ELISA, wie oben beschrieben, für „ELISA-IgG (H + L)" zwei Wochen nach
einer einzelnen Immunisierung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3a
und 3b gezeigt. Während
CT deutlich immunogen in beiden Gruppen war, war das geometrische
Mittel des Titers in der „Nair®"-Gruppe dreifach
höher,
und die Titer waren einheitlicher innerhalb der letztgenannten Tiere im
Vergleich zu den „Wasser"-Tieren. Es hat also
den Anschein, dass chemische Störung
der Hautoberfläche mit
Kalziumhydroxid, dem aktiven Inhaltsstoff in Nair®-Creme,
den Transfer von Antigen über
den transkutanen Weg verstärkt.
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Tabelle
3a. Förderung
der transkutanen Immunisierung durch chemische Penetrationsförderung:
Anti-CT-Titer in Mäusen,
deren Haut vor dem Auftragen des Antigens mit Kalziumhydroxid (Nair
® behandelt
wurde.
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Tabelle
3b. Förderung
der transkutanen Immunisierung durch chemische Penetrationsförderung:
Anti-CT-Titer in Mäusen,
deren Haut vor dem Auftragen des Antigens mit Kalziumhydroxid (Nair
® behandelt
wurde.
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Beispiel 4.
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Weitere Studien wurden durchgeführt, um
die Wirkung von chemischer Penetrationsförderung unter Verwendung von
keratinolytischen Formulierungen (wie Salicylat) zu beurteilen.
6 bis 8 Wochen alte BALB/c-Mäuse
wurden anästhesiert
und, wie im „Immunisierungsverfahren" beschrieben, rasiert.
Vierundzwanzig Stunden später
wurden die Rücken
der „Wasser"-Gruppe mit einem
Gazetupfer, der mit Wasser gesättigt
war, abgewischt, und ein Vorrat von Wasser wurde auf den Rücken platziert.
Ca. 5 Minuten später
wurde jegliches überschüssige Wasser
entfernt, und 25 μg
CT (50 μl
einer 0,5 mg/ml-Lösung)
wurden auf dem Rücken
aufgetragen. Als Alternative wurden vierundzwanzig Stunden nach
dem Rasieren die Rücken
der „Salicylat/Wasser"-Gruppe mit einem
Gazetupfer behandelt, der mit 10%-Salicylatsuspension gesättigt war
(1 Tablette (325 mg) zugelassenes Markenaspirin gelöst in 3,25
ml deionisiertem Wasser). Eine solche Behandlung kann für ca. 0,1
bis 30 Minuten, vorzugsweise für
ca. 20 Minuten und weiter bevorzugt für ca. 10. Minuten fortgeführt werden.
Ca. 10 Minuten später
wurde jede verbliebene Lösung
abgetupft, die Rücken
der Tiere wurden für
5 Minuten mit Wasser hydratisiert, gefolgt von Entfernen des überschüssigen Wassers
und dann topischer Applikation von 25 μg CT. Das Entfernen von überschüssigem Antigen
wurde durchgeführt
wie im „Immunisierungsverfahren" beschrieben.
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Die Anti-CT-Antikörpertiter wurden unter Verwendung
von ELISA wie oben beschrieben für „ELISA-IgG
(N + L)" zwei Wochen
nach einer einzelnen Immunisierung bestimmt. Die Ergebnisse sind
in Tabelle 4 gezeigt. Während
CT deutlich immunogen in beiden Gruppen war, war das geometrische
Mittel des Titers in der salicylatbehandelten Gruppe 4-fach höher, und
die Titer waren einheitlicher bei den letztgenannten Tieren im Vergleich
zu den „Wasser"-Tieren. Es hat also
den Anschein, dass die chemische Störung der Hautoberfläche mit
Salicylat den Transfer von Antigen über den transkutanen Weg verstärkt.
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Tabelle
4. Förderung
der transkutanen Immunisierung durch chemische Penetrationsförderung:
Anti-CT-Titer in Mäusen,
deren Haut vor dem Auftragen des Antigens mit Salicylat (Aspirin)
behandelt worden war.
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Beispiel 5.
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Um die Rolle von physikalischer/mechanischer
Penetrationsförderung
einzuschätzen,
wurde ein Schleifmittel in Form einer gewöhnlichen Nagelfeile verwendet,
um einen Teil des Stratum Corneum zu entfernen. 6 bis 8 Wochen alte
BALB/c-Mäuse
wurden anästhesiert
und, wie im „Immunisierungsverfahren" beschrieben, rasiert.
Vierundzwanzig Stunden später
wurden die Rücken
der Tiere entweder mit einem Gazetupfer, der mit Wasser „Wasser" gesättigt war,
abgewischt oder 10 mal mit einer mittelkörnigen Nagelfeile „Nagelfeile" gebürstet und
dann mit einem Gazetupfer abgewischt, der mit Wasser gesättigt war.
Ca. 5 Minuten nach der Wasserbehandlung wurde jegliches überschüssige Wasser
entfernt und 20 μg
CT (100 μl
einer 0,2 mg/ml-Lösung)
auf den Rücken
aufgetragen. Das Entfernen von überschüssigem Antigen
wurde durchgeführt, wie
im „Immunisierungsverfahren" beschrieben.
-
Die Anti-CT-Antikörpertiter wurden unter Verwendung
von ELISA, wie oben beschrieben für „ELISA-IgG (H + L)", drei Wochen nach
einer einzelnen Immunisierung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle
5 gezeigt. Während
CT deutlich immunogen in beiden Gruppen war, war das geometrische
Mittel des Titers in der mit der Nagelfeile behandelten Gruppe 10-fach
höher,
und die Titer waren einheitlicher bei den letztgenannten Tieren
im Vergleich zu den „Wasser"-Tieren. Es hat daher
den Anschein, dass die physikalische Störung der äußeren Hautoberfläche mit
einer Nagelfeile den Transfer von Antigen über den transkutanen Weg verstärkt. Dies
kann von Techniken unterschieden werden, die darauf abzielen, die
Haut zu durchstechen und das Antigen durch die Haut zu transferieren
wie bei subkutaner, intradermaler oder intramuskulärer Injektion.
-
Diese einfache Vorrichtung könnte durch
andere physikalische Störungsvorrichtungen
ersetzt werden, um Antigene und Adjuvanzien in die Epidermis zu
bringen wie Mikronadeln, die eine Länge aufweisen, welche nur das
Stratum Corneum oder die oberflächliche
Epidermis angreift, Vorrichtungen, die für TB-Zacken-Tests verwendet
werden, mit Gas betriebene Kanonen, welche die Dermis nicht durchdringen,
Klebeband für
die Abrissmethode oder andere für
die Zerstörung
der oberen Hautschicht geeigneten Vorrichtungen, von denen bekannt
ist, dass sie nur das Stratum Corneum oder die oberflächliche
Epidermis stören.
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Tabelle
5. Förderung
der transkutanen Immunisierung durch physikalische Penetrationsförderung:
Anti-CT-Titer in Mäusen,
deren Haut vor dem Auftragen des Antigens mit einer Nagelfeile behandelt
worden war.
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Beispiel 6.
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Ein weiteres Mittel für die physikalische/mechanische
Penetrationsförderung
wurde angewandt mittels eines Schleifmittels, um einen Teil des
Stratum Corneum zu entfernen und Zugang zu der darunter liegenden Epidermis
zu ermöglichen.
6 bis 8 Wochen alte BALB/c-Mäuse
wurden anästhesiert
und, wie im „Immunisierungsverfahren" beschrieben, rasiert.
Vierundzwanzig Stunden später
wurden die Rücken
der Tiere entweder mit einem Gazetupfer, der mit Wasser, „Wasser", gesättigt war,
oder mit einem Gazetupfer, der mit Wasser gesättigt war, abgewischt, gefolgt
von Reiben für
10 Sekunden mit einem Nylonschwamm (buf-puf®),„buf-puf®, um
die äußersten
Schichten des Stratum Corneum zu entfernen. Überschüssiges Wasser wurde von den
Rücken
der „Wasser"-Gruppe entfernt,
und dann wurden 20 μg
CT (100 μl
einer 0,2 mg/ml-Lösung)
auf die Rücken
aller Tiere aufgetragen. Das Entfernen von überschüssigem Antigen wurde durchgeführt, wie
im „Immunisierungsverfahren" beschrieben.
-
Die Anti-CT-Antikörpertiter wurden unter Verwendung
von ELISA, wie oben beschrieben für „ELISA-IgG (H + L)", drei Wochen nach
einer einzelnen Immunisierung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle
6 gezeigt. Während
CT deutlich immunogen in beiden Gruppen war, war das geometrische
Mittel des Titers in der buf-puf®-behandelten
Gruppe 2-fach höher,
und die Titer bei den einzelnen Tieren waren einheitlicher bei den
letztgenannten Tieren verglichen mit den „Wasser"-Tieren. Es hat also den Anschein, dass
die physikalische Störung
der Hautoberfläche
mit einem buf-puf® den Transfer von Antigen über den
transkutanen Weg verstärkt.
-
Diese einfache Vorrichtung könnte durch
andere physikalische Penetrationsvorrichtungen ersetzt werden, um
Antigene und Adjuvanzien in die Epidermis zu bringen, wie eine Nadel
und Tuberkulinspritze, die für intradermale
Injektion verwendet wird, Mikronadeln, die eine Länge aufweisen,
die nur das Stratum Corneum oder die oberflächliche Dermis durchdringt,
Vorrichtungen, die für
TB-Zacken-Tests verwendet werden, aufscheuernde Auflagen, die lösliche Kristalle
aufweisen, wie Sukrose oder Natriumchlorid, oder biologisch abbaubare
Polymere, die in die Auflage imprägniert wurden, und über die
Haut gerieben werden, bevor die Auflage befestigt wird, wobei das
Antigen entweder in den Kristallen oder in der Matrix enthalten
ist, mit Gas betriebene Kanonen, Klebeband für die Abrissmethode oder andere
Vorrichtungen, von denen bekannt ist, dass sie nur in die Epidermis
oder die oberflächliche
Dermis eindringen.
-
Tabelle
6. Förderung
der transkutanen Immunisierung durch physikalische Penetrationsförderung:
Anti-CT-Titer in Mäusen,
deren Haut vor dem Auftragen des Antigens mit einem Schleifmittel
(wie zum Beispiel buf-puf
®) behandelt worden war.
-
Beispiel 9.
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Die transkutane Immunisierung mit
bakteriellen ADP-ribosylierenden Exotoxinen wie CT und LT, scheint
dem Immunsystem signifikante „Gefahr"-Signale zu liefern,
die eine wirksame Immunantwort stimulieren. Solche Verbindungen
wirken als Adjuvanzien. Es war eine Überraschung festzustellen,
dass einfache Mischungen von solchen Adjuvanzien in einer Weise
auf der Haut platriert, welche die Haut hydratisiert, zu wirksamen
Immunantworten führen.
Dies wurde in einer früheren
Patentanmeldung (PCT/US97/21324 – WO 98/20734) beschrieben.
Vorausgesetzt, dass ein Adjuvanz wie CT (86 KD) als ein Adjuvanz
auf der Haut wirken kann, würde
man jedoch erwarten, dass andere Adjuvanzien, insbesondere jene,
die auf bakteriellen Produkten oder Motiven basieren, stimulatorisch
wären,
wenn sie in einer Weise auf der Haut platriert würden, welche die Haut hydratisiert
und/oder mit der Verwendung von Penetrationsförderern.
-
Wir verwendeten bakterielle DNA,
um zu bestätigen,
dass diese Erwartung richtig ist. 6 bis 8 Wochen alte BALB/c-Mäuse wurden,
wie oben im „Immunisierungsverfahren" beschrieben, rasiert
und anästhesiert. Am
Tag der Immunisierung wurden die Rücken der Mäuse mit Isopropanol abgewischt,
um die Penetration zu fördern.
Nachdem der Alkohol evaporiert war (ungefähr 5 Minuten), wurden 100 μl phosphatgepufferte
Salzlösung
(PBS), enthaltend 100 μg
DNA (CpG1 oder CpG2) und 100 μg
Diphtherietoxoid (DT) für
90 bis 120 Minuten auf dem Rücken
aufgetragen. Es wurden Oligonukleotide durch Oligos Etc mit einem
Phosphothioat-Rückgrat
zur Verbesserung der Stabilität
synthetisiert. Das Entfernen von überschüssigem Antigen wurde durchgeführt wie
im „Immunisierungsverfahren" beschrieben. Die
Immunisierung wurde 4 und 8 Wochen später wiederholt. 10 Wochen nach
der ersten Immunisierung wurde den Tieren eine Blutprobe entnommen
und die Anti-DT-Titer wurden unter Verwendung eines ELISA, wie oben
beschrieben für „ELISA-IgG
(N + L)", bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7a gezeigt.
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Die gemeinsame Verabreichung von
DT und einer Kontroll-DNA-Sequenz (CpG2: TCCAATGAGCTTCCTGAGTCT)
induzierte keinen nachweisbaren Anstieg in den Anti-DT-Titern. Im Gegensatz
dazu führte
die Zugabe einer DNA-Sequenz, die ein nicht-methyliertes CpG-Dinukleotid, flankiert
durch zwei 5'-Purine
und zwei 3'-Pyrimidine
(CpG1 (immunstimulatorische DNA): TCCATGACGTTCCTGACGTT), zu einem
nachweisbaren Anstieg im Serum-Anti-DT-IgG-Titer in 5 von 5 Tieren.
Es hat daher den Anschein, dass bakterielle DNA die entsprechenden
Motive wie CpGs (6 KD) enthält,
als Adjuvanz verwendet werden kann, um den Transfer von Antigen
durch die Haut zur Induktion von antigenspezifischen Antikörperantworten
zu verstärken.
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Tabelle
7a. Adjuvanzaktivität
von bakterieller DNA, aufgetragen auf die Haut unter Verwendung
von Penetrationsförderung:
humorale Immunantwort.
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Die transkutane Wirkung von transkutaner
Immunisierung kann auch durch T-Zell- Proliferation nachgewiesen werden.
6 bis 8 Wochen alte BALB/c-Mäuse
wurden, wie oben im „Immunisierungsverfahren" beschrieben, rasiert
und anästhesiert.
Am Tag der Immunisierung wurden die Rücken der Mäuse mit Isopropanol abgewischt.
Nachdem der Alkohol evaporiert war (ungefähr 5 Minuten), wurden 100 μl phosphatgepufferter Salzlösung (PBS),
enthaltend 100 μg
DNA (CpG1 oder CpG2) und 100 μg
Diphtherietoxoid (DT), für
90 bis 120 Minuten auf dem Rücken
aufgetragen. Es wurden Oligonukleotide durch Oligos Etc mit einem
Phosphothioat-Rückgrat
zur Verbesserung der Stabilität
synthetisiert. Das Entfernen von überschüssigem Antigen wurde durchgeführt, wie
im „Immunisierungsverfahren" beschrieben. Die
Immunisierung wurde 4 und 8 Wochen später wiederholt. 12 Wochen nach
der ersten Immunisierung wurden drainierende (inguinale) LK entfernt
und von 5 immunisierten Tieren vereinigt. Die Proliferationskapazität als Antwort
auf Medium oder Antigen (DT) wurde in einem Standard 4-Tage-Proliferationstest
unter Verwendung von 3-H-Einbau als ein ablesbares Ergebnis festgestellt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7b gezeigt. Die gemeinsame Verabreichung
von DT und einer DNA-Sequenz, die ein nicht-methyliertes CpG-Dinukleotid,
flankiert durch zwei 5'-Purine
und zwei 3'-Pyrimidine
(CpG1 (immunstimulatorische DNA): TCCATGACGTTCCTGACGTT) enthielt,
führte
zu einem nachweisbaren Anstieg in der antigenspezifischen proliferativen
Antwort. Es hat daher den Anschein, dass bakterielle DNA, die entsprechende
Motive enthält,
als Adjuvanz verwendet werden kann, um den Transfer von Antigen durch
die Haut zur Induktion von proliferativen Antworten zu verstärken.
-
Tabelle
7b. Adjuvanzeffekt von bakterieller DNA, aufgetragen auf die Haut:
LK-Zell-Proliferation
-
Beispiel 8.
-
Die transkutane Immunisierung mit
bakteriellen ADP-ribosylierenden Exotoxinen, wie CT und LT, scheint
dem Immunsystem signifikante „Gefahr"-Signale zu liefern,
die eine wirksame Immunantwort stimulieren. Solche Verbindungen
wirken als Adjuvanzien. Es war eine Überraschung festzustellen,
dass einfache Mischungen von solchen Adjuvanzien in einer Weise
auf der Haut platziert, welche die Haut hydratisiert, zu wirksamen
Immunantworten führen.
Dies wurde in einer früheren
Patentanmeldung (PCT/US97/21324 – WO 98/20734) beschrieben.
Vorausgesetzt, dass ein Adjuvanz wie CT als ein Adjuvanz auf der
Haut wirken kann, würde.
man jedoch erwarten, dass andere Adjuvanzien, insbesondere jene,
die auf bakteriellen Produkten oder Motiven basieren, stimulatorisch
wären,
wenn sie in einer Weise auf der Haut platziert würden, welche die Haut hydratisiert
und/oder mit der Verwendung von Penetrationsförderern. Es wurden genetisch
veränderte Toxine
verwendet, um diese Erwartung zu bestätigen. 6 bis 8 Wochen alte
BALB/c-Mäuse
wurden rasiert, anästhesiert
und immunisiert, wie oben im „Immunisierungsverfahren" beschrieben. Die
Tiere erhielten 3 bis 5 Wochen nach der ersten Immunisierung eine
Auffrischungsimpfung und zwei Wochen nach der letzten Immunisierung
wurde Serum gesammelt. Die verwendeten Adjuvanzien waren die genetisch
veränderten
Toxine: LTK63, ein enzymatisch inaktives LT-Derivat und LTR72, ein
LT-Derivat, das 0,6% der enzymatischen Aktivität behalten hat. 100 μg Diphtherietoxoid
(DT) wurde als Antigen verwendet.
-
Die Anti-DT-Antikörpertiter wurden unter Verwendung
von ELISA, wie oben beschrieben für „ELISA-IgG (N + L)", bestimmt. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 8 gezeigt. Anti-DT-Titer waren deutlich erhöht im Serum
von Tieren, die entweder mit LTK63 oder LTR72 und DT immunisiert
worden waren, verglichen mit Titern im Serum, das vor der Immunisierung
gesammelt wurde (Kontrollblut vor Immunisierung). Es hat daher den
Anschein, dass genetisch detoxifizierte Mutanten des hitzelabilen
Enterotoxins (LT) als Adjuvanzien auf der Haut verwendet werden
können.
-
Tabelle
8. Verwendung von genetisch veränderten
Toxinen, LTK63 und LTR72 als Adjuvanz auf der Haut.
-
Beispiel 9.
-
Eine andere Klasse von Verbindungen,
Cytokine, von denen bekannt ist, dass sie als Adjuvanzien wirken,
veranschaulicht das Prinzip, dass man von Adjuvanzien im Allgemeinen
erwarten kann, dass sie ähnlicher Weise
wie Choleratoxin wirken. Von TNFα ist
auch bekannt, dass es eine Verbindung ist, die Langerhanszellen aktiviert.
-
6 bis 8 Wochen alte BALB/c-Mäuse wurden
rasiert und anästhesiert,
wie für
das „Immunisierungsverfahren" beschrieben. Am
Tag der Immunisierung wurden die Rücken der Mäuse mit Isopropanol abgewischt. Nachdem
der Alkohol evaporiert war (ungefähr 5 Minuten) wurden 100 μl phosphatgepufferte
Salzlösung (PBS),
enthaltend 0,83 μg
TNF-alpha (rekombinantes
Maus-TNF-alpha, Endogen), IL-2 (1 μg rekombinantes Maus-IL-2 (Sigma))
oder Mock Adjuvanz (CpG2) auf die Haut auf dem Rücken aufgetragen, zusammen
mit 100 μg
Diphtherietoxoid (DT) für
90 bis 120 Minuten. Es wurden Oligonukleotide von Oligo Etc mit
einem Phosphothioat-Rückgrat
zur Verbesserung der Stabilität
synthetisiert. Das Entfernen von überschüssigem Antigen wurde durchgeführt, wie
im „Immunisierungsverfahren" beschrieben. Die
Immunisierung wurde 4 und 8 Wochen später wiederholt. 10 Wochen nach
der ersten Immunisierung wurde den Tieren eine Blutprobe entnommen
und die Anti-DT-Titer unter Verwendung eines ELISA, wie oben beschrieben
für „ELISA-IgG
(H + L)", bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt.
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Die gemeinsame Verabreichung von
DT und einem Mock Adjuvanz (CpG2) induzierte keinen nachweisbaren
Anstieg in den Anti-DT-Titern. Im Gegensatz dazu ergab die topische
Anwendung von TNF-alpha (0,8 μg)
einen nachweisbaren Anstieg im Serum-Anti-DT-IgG-Titer bei 3 von 5 Tieren
im Vergleich zu entweder Anti-DT-Titern der mit Mock Adjuvanz behandelten
Mäuse,
oder Seren, die vor der Immunisierung gesammelt wurden (Kontrollblut
vor Immunisierung). In ähnlicher
Weise ergab die topische Anwendung von IL-2 (1 μg) einen messbaren Anstieg im
Serum-Anti-DT-IgG-Titer bei 4 von 5 Tieren im Vergleich mit entweder
Anti-DT-Titern von mit ScheinAdjuvanz behandelten Mäusen oder
Seren, die vor der Immunisierung gesammelt wurden (Kontrollblut
vor der Immunisierung). Es hat daher den Anschein, dass die Cytokine
wie IL-2 und TNF-alpha als Adjuvanzien auf der Haut verwendet werden
können
und dass Verbindungen, die Langerhanszellen aktivieren, für die transkutane
Immunisierung verwendet werden können.
-
Tabelle
9. Adjuvanzaktivität
des Cytokins TNF-alpha aufgetragen auf die Haut.
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Beispiel 10.
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Die B-Untereinheit von Choleratoxin
ist eine andere Klasse von Adjuvanzien, der die A-Untereinheit und
damit die ADP-Ribosyltransferaseaktivität von CT fehlt. Als solche
stellt CTB ein Adjuvanz dar, das einzigartig ist und nützlich sein
kann, weil es nicht toxisch ist, wenn es in den Verdauungsapparat
aufgenommen wird.
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6 bis 8 Wochen alte C57BL/6 Mäuse wurden
anästhesiert
und rasiert, wie im "Immunisierungsverfahren" beschrieben. Am
Tag der Immunisierung wurden die Rücken der Mäuse mit Isopropanol abgewischt. Nachdem
der Alkohol evaporiert war (ungefähr 5 Minuten), wurden 100 μl phosphatgepufferte
Salzlösung (PBS),
enthaltend 100 μg
aufgereinigte Choleratoxin B-Untereinheit (CTB) und/oder 100 μg Diphtherietoxoid (DT)
für 90
bis 120 Minuten auf dem Rücken
aufgetragen. Das Entfernen des überschüssigen Antigens
wurde durchgeführt
wie beschrieben im "Immunisierungsverfahren". Die Immunisierung
wurde 4 und 8 Wochen später
wiederholt. Zehn Wochen nach der ersten Immunisierung wurden den
Tieren Blutproben entnommen und die Anti-DT-Titer unter Verwendung
eines ELISAs, wie oben beschrieben für "ELISA-IgG (H + L)", bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle
10 gezeigt.
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Die Anti-DT-Titer waren deutlich
erhöht
im Serum von Tieren, die mit CTB und DT immunisiert worden waren
im Vergleich zu den Titern im Serum von Tieren, die mit DT allein
behandelt wurden, oder jenen im Serum der Kontrollblutprobe vor
der Immunisierung, wie in Tabelle 10 gezeigt. Es hat daher den Anschein,
dass aufgereinigtes CTB als Adjuvanz auf der Haut verwendet werden
kann.
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Tabelle
10. Verwendung von aufgereinigter Choleratoxin B-Untereinheit von
V. cholerae als ein Adjuvanz auf der Haut.
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Beispiel 11.
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Adjuvanzien, die strukturell unterschiedlich
sind, werden ihre Verstärkung
wahrscheinlich durch unterschiedliche Wirkungen erzielen. Adjuvanzien,
die ihre Wirkung durch unterschiedliche Mechanismen induzieren,
können
entweder additive oder synergistische Wirkungen auf die Verstärkung der
Immunantwort haben. Wir haben herausgefunden, dass die Verwendung
von zwei Adjuvanzien gleichzeitig die Antwort auf transkutane Immunisierung
im Vergleich zu den individuellen Adjuvanzien allein förderte.
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6 bis 8 Wochen alte BALB/c Mäuse wurden
rasiert und anästhesiert,
wie für
das "Immunisierungsverfahren" beschrieben. Am
Tag der Immunisierung wurden die Rücken der Mäuse mit Isopropanol abgewischt. Nachdem
der Alkohol evaporiert war (ungefähr 5 Minuten) wurde 100 μl phosphatgepufferte
Salzlösung
(PBS), enthaltend 100 μg
der immunstimmulatorischen DNA (CpG1) und/oder 100 μg Choleratoxin
(CT), auf dem Rücken
mit 100 μg
eines löslichen
leishmanialen Antigenextrakts (SLA) für 90 bis 120 Minuten aufgetragen.
SLA ist ein Antigenextrakt, der am Walter Reed Army Institute of
Research durch zentrifugale Isolation der löslichen Proteine der promastigoten
Form von Leishmania major in einem Ultraschalllysat für 90 bis
120 Minuten, hergestellt wurde. Das Entfernen von überschüssigem Antigen
wurde durchgeführt,
wie im "Immunisierungsverfahren" beschrieben. Die
Immunisierung wurde 4 und 8 Wochen später wiederholt. 12 Wochen nach
der ersten Immunisierung wurden drainierende (inguinale) LK entfernt
und von zwei immunisierten Tieren vereinigt. Die Proliferationskapazität als Antwort
auf Medium oder Antigen (SLA) wurde in einem Standard 4-Tage-Proliferationstest
unter Verwendung von 3-H-Einbau als ablesbares Ergebnis festgestellt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt.
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Die gemeinsame Verabreichung von
SLA und CpG1 (immunstimmulatorische DNA, die ein nicht-methyliertes
CpG Dinukleotid, flankiert durch zwei 5'-Purine und zwei 3'-Pyrimidine, enthält TCCATGACGTTCCTGACGTT), oder
CT führte
zu einem nachweisbaren Anstieg in der antigenspezifischen, proliferativen
Antwort. Die Antigen-(SLA)-spezifische, proliferative Antwort war
jedoch ungefähr
20-mal höher
in Lymphknotenzellkulturen von Tieren, die gleichzeitig sowohl CpG1,
als auch CT ausgesetzt waren, im Vergleich zu Kulturen, die von
Tieren abgeleitet waren, die dem jeweiligen Adjuvanz allein ausgesetzt waren.
Es hat daher den Anschein, dass bakterielle DNA, die entsprechende
Motive enthält,
mit ADP-ribosylierenden Exotoxinen wie CT als Adjuvanz auf der Haut
synergetisch wirken können,
um höhere
Immunantworten zu induzieren, als jedes Adjuvanz allein.
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Tabelle
11. Synergie zwischen immunstimmulatorischer DNA und ADP-ribosylierenden
Exotoxin (CT) als Adjuvanzien, wenn sie auf die Haut aufgetragen
werden.
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Beispiel 12.
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Die transkutane Immunisierung induziert
wirksame Immunantworten, wenn sie allein als Transferverfahren verwendet
wird. Wir haben auch herausgefunden, dass transkutane Immunisierung
nacheinander mit anderen Transferwegen verwendet werden kann, um
eine Immunantwort zu stimulieren.
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6 bis 8 Wochen alte BALB/c Mäuse. Am
Tag 0 erhielten beide Tiergruppen eine 50 μl intramuskuläure (im.)
Injektion von DT (5 μg),
gemischt mit Alaun (Rehydrogel – 25 μg in NaCl)
in den hinteren Oberschenkel. Acht und 16 Wochen später wurden
Mäuse in
der im/tc/tc Gruppe rasiert, anästhesiert
und über
den transkutanen Weg immunisiert, wie beschrieben für das "Immunisierungsverfahren", unter Verwendung
von 100 μg Choleratoxin
als Adjuvanz und 100 μg
Diphtherietoxoid als Antigen. Die Immunisierungslösung wurde
auf dem Rücken
für 90
bis 120 Minuten aufgetragen. Das Entfernen von überschüssigem Antigen wurde durchgeführt, wie
im "Immunisierungsverfahren" beschrieben. Zweiundzwanzig
Wochen nach der ersten Immunisierung wurde den Tieren eine Blutprobe
entnommen und die anti-DT-Titer unter Verwendung eines ELISA, wie
oben beschrieben für "ELISA-IgG (H + L)", bestimmt. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 12 gezeigt.
-
Eine einzelne im. Injektion von 5 μg DT induziert
einen nachweisbaren Anstieg in den Serum-Anti-DT-Titern im Vergleich
mit Titern in Seren, die dem gleichen Tier vor der Immunisierung
(Kontrollblut vor Immunisierung) entnommen wurden. Das Auffrischen
der Impfung der erstmals im. immunisierten Tiere unter Verwendung
des transkutanen Immunisierungsverfahren ergab einen 60-fachen Anstieg
im geometrischen Mittel des Titers, und alle transkutan auffrischungs-geimpften
Tiere wiesen eindeutig höhere
Anti-DT-Titer auf als
jene, die in der erstmals im. immunisierten Gruppe beobachtet wurden.
Daher kann die transkutane Immunisierung zur Auffrischung von antigenspezifischen
Titern in Mäusen
verwendet werden, in denen die primäre Immunisierung mit dem Antigen über den
im. Weg erfolgte. Wir haben außerdem
herausgefunden, dass erstmals im. immunisierte Tiere durch transkutane
Immunisierung (TCI) aufrischungs-geimpft werden können. Verschiedene
Kombinationen von TCI Erstimmunisierung oder Auffrischungsimpfung über andere
Wege und Schemata kann man sich vorstellen einschließlich oralen,
bukkalen, nasalen, rektalen, vaginalen, intradermalen, über Kanonen
oder anderen Mitteln des Transports. Zusätzlich können sich Antigene in Weg und
Zusammensetzung unterscheiden, einschließlich Protein abwechselnd mit
Glykoprotein, Untereinheit mit Holotoxin, DNA Erstimmunisieren gefolgt
durch Protein, Nukleinsäure über im.
gefolgt durch Nukleinsäure
durch TCI. Die transkutane Immunisierung kann dazu verwendet werden,
die Immunisierung von Kindern aufzufrischen, die im Kleinkindalter
erstmals immunisiert wurden, oder von Erwachsenen, die in der Kindheit
erstmals immunisiert wurden. Die Einfachheit des Transports kann
die Effizienz von Vakzinien, wie die von Influenzavakzinien verstärken, dadurch
dass mehrfache Auffrischungen durch Verwendung einer Auflage möglich werden.
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Tabelle
12. Auffrischungsimpfen von erstmals im. immunisierten Tieren unter
Verwendung des transkutanen Immunisierungsverfahrens.
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Beispiel 13.
-
Weil TCI das Immunsystem in einer
solch wirksamen Weise zu stimulieren scheint, ist es möglich, dass ein
Adjuvanz, das an einer Stelle auf der Haut platriert wurde, als
ein Adjuvanz für
ein Antigen wirkt, das an anderer Stelle platriert wurde. 6 bis
8 Wochen alte BALB/c Mäuse
wurden anästhesiert
und rasiert, wie im "Immunisierungsverfahren" beschrieben. Die
Tiere wurden nicht am Ohr markiert, sondern in Käfigen gehalten, die mit A,
C oder G markiert waren. Am Tag der Immunisierung wurde die dorsale
Oberfläche
des Mausohrs durch sanftes Reiben der äußeren Hautoberfläche mit
einem Auftragsmittel mit einer Wattespitre behandelt, die 70% Isopropanol
enthielt. Nach 5 Minuten wurde das überschüssige Wasser von wasserbehandelten
Ohren abgetupft, und Adjuvanz (50 μg CT) und/oder Antigen (100 μg Rinderserumalbumin
(BSA) wurde auf die Oberfläche
des linken oder rechten Ohrs (beschrieben in der Tabelle) in 50 μl phosphatgepufferter
Salzlösung aufgetragen.
Nach zweieinhalb Stunden wurden die Ohren zweimal abgespült und trockengetupft.
Die Immunisierung der Mäuse
wurden in ähnlicher
Weise 4 und 8 Wochen später
aufgefrischt. 12 Wochen nach der ersten Immunisierung wurde den
Tieren eine Blutprobe entnommen und die Anti-BSA-Titer unter Verwendung
eines ELISAs, wie oben beschrieben für "ELISA-IgG (H + L)", bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle
13 gezeigt.
-
Das Auftragen von BSA allein auf
die Haut war nur schwach immunogen, wobei nur 1 von 5 Tieren einen
ELISA-Titer entwickelte, der über
100 ELISA-Einheiten lag. Im Gegensatz dazu entwickelten 9 von 9
Tieren, die CT und BSA auf der Haut erhalten hatten, Titer über 100
ELISA-Einheiten. Von den Tieren, die Antigen und Adjuvanz erhalten
hatten, entwickelten die Mäuse,
denen das Material auf der gleichen Seite (linkes Ohr) gegeben worden
war, höhere
(10-fach) Anti-BSA-Titer als die Tiere, die Antigen und Adjuvanz
auf verschiedenen (linkes und rechtes) Ohren erhalten hatten. Die
Tiere, die Antigen auf einem Ohr und Adjuvanz auf dem anderen Ohr
erhalten hatten, entwickelten jedoch eine Anti-BSA Immunantwort,
die ungefähr
30-mal höher war
als in Tieren, denen BSA allein gegeben wurde. Antigen und Adjuvanz
können
daher während
der TCI an verschiedenen Stellen topisch aufgetragen werden, um
eine humorale Immunantwort auszulösen. Es wird erwartet, dass
diese Immunstimulation mit Antigen auftreten kann, das über verschiedene
Wege transportiert wird, und man kann sich Schemata vorstellen, einschließlich oraler,
bukkaler, nasaler, rektaler, vaginaler, intradermaler, durch Kanonen
oder anderer Mittel des Transports. Zusätzlich können Adjuvanzien mit Nukleinsäureimmunisierung
verwendet werden, um die Antwort zu verstärken. Ein solcher Transport
muss nicht notwendigerweise gleichzeitig erfolgen, um die Immunantwort
zu verstärken.
Zum Beispiel kann eine im. Injektion von Plasmid-DNA später durch
transkutanes Verabreichen eines Adjuvanz gefolgt werden. Immunstimulation durch
CT, LT, TNFα,
CpGs oder ähnlichen
Adjuvanzien ist ein überraschendes
Ergebnis, weil gedacht wurde, dass Moleküle von 5000 Daltons die Haut
nicht durchdringen können.
-
Tabelle
13. Transport von Antigen und Adjuvanz an der gleichen oder entfernten
Stelle(n) auf der Haut mit Penetrationsförderung.
-
Beispiel 14. Transkutane
Immunisierung bei Menschen
-
Die Erfindung kann unter Verwendung
eines geeigneten Vehikels oder Trägers ausgeführt werden. Zum Beispiel kann
eine Auflage als ein solches Vehikel verwendet werden und kann mit
der erfindungsgemäß hergestellten
Formulierung behandelt werden oder kann dazu verwendet werden, die
Hautfläche
abzudecken, die mit der erfindungsgemäß hergestellten Formulierung
behandelt wurde. Eine geeignete Auflage kann beispielsweise aus
Baumwolle, Nylon, Kunstseide, Polyester oder Kombinationen davon
hergestellt werden. Solche Auflagen können mit einer klebenden oder
nichtklebenden Rückseite
bereitgestellt werden. Auflagen mit einer nichtklebenden Rückseite
können
durch nichtklebende Mittel an dem Tier befestigt werden, wie beispielsweise
durch Wickeln. Geeignete Rückseiten
können
zum Beispiel aus Materialien wie Silikon, Acrylat oder Gummi hergestellt
werden. Andere Vehikel oder Träger
schließen
die oben aufgelisteten ein, wie zum Beispiel Pulver, Öle, Wasser,
Creme und ähnliches.
Um das Potential der TCI bei Menschen einzuschätren, wurde eine Phase 1 Studie
unter Verwendung von LT durchgeführt,
um zu versuchen, Serum Anti-LT Antikörper zu induzieren. Sechs Freiwillige
erhielten eine Dosis von 100 μg
LT, eine Dosis ähnlich
der von oralen Adjuvanzdosen, die für Choleravakzine verwendet
werden (1 mg CTB). LT wurde unter GMP-Bedingungen im Swiss Serum and
Vaccine Institute (Bern, Schweiz) hergestellt und wurde durch Oravax
Inc., Cambridge, MA, bereitgestellt. Die Freiwilligen erhielten
500 μg LT,
gemischt mit 500 μl
steriler Salzlösung,
die auf einer 2 in2 Baumwollgazeauflage
mit Polyvinylrückseite
absorbiert war und durch eine 4 × 4 in2 TegadermTM Wundauflage bedeckt wurde. Die Immunisierung
wurde durch Platrieren der Auflage auf nichtmanipulierter Haut für 6 Stunden
durchgeführt,
danach wurde die Stelle gründlich
mit 500 ml steriler Salzlösung
abgespült.
Die Personen wurden nach 12 Wochen in ähnlicher Weise erneut immunisiert.
Die Freiwilligen wurden nach Tag 1, 2, 3 und 7 auf Zeichen von Entzündung an
der Stelle der Immunisierung untersucht und nach Symptomen, die
mit der Vakzinierung zusammenhängen,
gefragt. Die Immunisierung wurde durch Platrieren der Auflage auf
nichtmanipulierter Haut für
6 Stunden durchgeführt,
danach wurde die Auflage entfernt und die Stelle gründlich mit
Salzlösung
gespült. Die
Personen wurden nach 12 Wochen erneut immunisiert. Es wurden keine
Nebenwirkung beobachtet, weder systemisch noch an der Stelle der
Immunisierung nach der ersten oder zweiten Immunisierung. Anti-LT
IgG-Titer wurden, wie vorher beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse
werden in ELISA- Einheiten
(EE) angegeben, die definiert sind als die inverse Verdünnung einer
Probe, die eine OD von 1,0 ergibt. Anti-LT-IgA wurde in gleicher
Weise bestimmt wie Anti-LT-IgG unter Verwendung von Ziege-Anti-Mensch-IgG
(α)-HRP
(Kirkegaard und Perry, Gaithersburg, MD) gegen eine Standard IgA-Kurve,
die unter Verwendung von menschlichem IgA (ICN) hergestellt wurde.
Wie in Tabelle 14 gezeigt, sprachen 6 von 6 Personen durch Hervorbringen
eines Anstiegs der Serum Anti-LT-IgG- oder IgA-Antikörper an,
definiert als ein vierfacher Anstieg in Antikörpertitern. Der mittlere vielfache
Anstieg an Anti-LT-IgG betrug 10,2, der mittlere vielfache Anstieg
an Serum Anti-LT-IgA betrug 7,2. Die Biopsien von der Immunisierungsstelle
und dem kontralateralen Arm zeigten keine Zeichen von Entzündung der
Haut. Diese Ergebnisse bestätigen,
dass TCI im Menschen ohne Hautirritationen oder Entzündung durchgeführt werden
kann.
-
Geeignete Auflagenmaterialien sind
bereits beschrieben worden. Im Allgemeinen kann die Auflage beispielsweise
aus einer drucksensitiven Wundauflage, einer Grundsubstanz für eine absorbierende
Schicht, die Vakzinien und Adjuvanz trägt, einer vakzineundurchlässigen Rückseite
und einer Abgabeschicht bestehen. Diese und andere geeignete Auflagenbeispiele
sind beschrieben in dem US Patent Nr. 4,915,950 und 3,734,097.
-
Die Auflagen können so hergestellt werden,
dass sie gewebte und nichtgewebte Grundsubstanzen von Materialien
einschließen,
die beispielsweise Polyester/Zellulose, Polypropylen, Polyester,
Polyester/Kunstseide und ähnliches
einschließen.
-
Beispiele für nichtgewebte Auflagengrundsubstanzen
können
einschließen:
-
BBA Vliese
-
- a. Sorte # 1313290, nass beschichtetes Vlies,
Zusammensetzung = Polyesterzellulose, Gewicht (gsy) = 35,4, Gewicht
(gsm) = 42,3, Dicke (mils) = 7,9, Stabilität MD = 3,4, Stabilität CD = 2,4.
- b. Sorte # 2006086, termisch gebundenes Vlies, Zusammensetzung
= Polypropylen, Gewicht (gsy) = 16,0, Gewicht (gsm) = 19,1, Dicke
(mils) = 10,2, Stabilität
MD = 3,3, Stabilität
CD = 0,7.
- c. Sorte # 149146, termisch gebundenes Vlies, Zusammensetzung
= Polyester, Gewicht (gsy) = 25,6, Gewicht (gsm) = 30,6, Dicke (mils)
= 6,5, Stabilität
MD = 5,3, Stabilität
CD = 0,9.
- d. Sorte # 149020, termisch gebundenes Vlies, Zusammensetzung
= Polyester/Kunstseide, Gewicht (gsy) = 30,5, Gewicht (gsm) = 36,4,
Dicke (mils) = 13,2, Stabilität
MD = 5,5, Stabilität
CD = 1,1.
- e. Sorte # 140–027,
hydroverschlungenes Vlies, Zusammensetzung = Polyester/Kunstseide,
Gewicht (gsy) = 28,0, Gewicht (gsm) = 33,5, Dicke (mils) = 22,4,
Stabilität
MD = 10,4, Stabilität
CD = 3,8.
-
Ein drucksensitives Haftmittel, das
in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, schließt beispielsweise
Haftmittel, basierend auf Acrylat, Silikon, Gummi und ähnlichem,
ein.
-
Tabelle
14. Mittlerer vielfacher Anstieg an menschlichem Anti-LT-IgG und
IgA
-
Beispiel 15.
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Es wurde gezeigt, dass LT wirksam
für die
Immunisierung von Menschen über
den transkutanen Weg ist. Wir haben auch herausgefunden, dass LT
als ein Adjuvanz für
TCI wirkt. 6 bis 8 Wochen alte C57BL/6 Mäuse wurden anästhesiert
und rasiert, wie im „Immunisierungsverfahren" beschrieben. Am
Tag der Immunisierung wurden die Rücken der Mäuse mit Isopropanol abgewischt.
Nachdem der Alkohol evaporiert war (ungefähr 5 Minuten) wurden 100 μl phosphatgepufferte
Salzlösung
(PBS), enthaltend 100 μg
des hitzelabilen Enterotoxins (LT) und/oder 100 μg Diphtherietoxoid (DT) auf
dem Rücken
für 90
bis 120 Minuten aufgetragen. Das Entfernen des überschüssigen Antigens wurde durchgeführt, wie
im „Immunisierungsverfahren" beschrieben. Die
Immunisierung wurde 4 und 8 Wochen später wiederholt. 10 Wochen nach
der ersten Immunisierung wurde den Tieren eine Blutprobe entnommen
und die Anti-DT-Titer unter Verwendung eines ELISA, wie oben beschrieben
für "ELISA-IgG (H + L)", bestimmt. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 15 gezeigt.
-
Die Anti-DT-Titer im Serum von Tieren,
die mit LT und DT immunisiert wurden, waren eindeutig erhöht im Vergleich
zu Titern im Serum von Tieren, die mit DT allein behandelt wurden,
und jenen im Serum von Kontrollblutproben vor Immunisierung. Es
hat daher den Anschein, dass das hitzelabile Enterotoxin (LT) als
Adjuvanz auf der Haut verwendet werden kann.
-
Tabelle
15. Verwendung von hitrelabilem Enterotoxin (LT) von E. coli als
Adjuvanz auf der Haut.
-
Beispiel 16.
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Um die Rolle der physikalischen/mechanischen
Penetrationsförderung
abzuschätzen,
wurden die oberflächigen
Schichten des Stratum Corneum durch Abziehen (Abreißen) von
Klebeband entfernt. Das Abreißen
von Klebeband ist ein Eingreifen, das im Stand der Technik gut bekannt
ist, um die äußere Schicht
des Stratum Corneum zu entfernen. 6 bis 8 Wochen alte C57BL/6 Mäuse wurden
anästhesiert
und rasiert, wie im „Immunisierungsverfahren" beschrieben. Vierundzwanzig
Stunden später
wurde CT (25 μg)
in 50 μl
phosphatgepufferter Salzlösung
auf die Rücken
der Mäuse
aufgetragen; "keine" Eingriffsgruppe.
Als Alternative wurde die Haut auf den Rücken einer zweiten Gruppe von
Tieren sanftem Klebebandabreißen
ausgesetzt; "Klebebandabreißen" Eingriffgruppe.
Das Abreißverfahren
wurde durch Anbringen von Scotch Cellophan-Klebeband auf die Rücken, auf die Hautoberfläche binden
lassen für
3 Minuten, gefolgt durch sanftes Entfernen des Klebebands, durchgeführt. Die
Binden-/Entfernen-Schritte wurden 3-mal wiederholt. CT (25 μg) in 50 μl phosphatgepufferter
Salzlösung
wurde dann auf die Rücken
der Mäuse
aufgetragen. Das Antigen verblieb für ungefähr 1,5 Stunden auf den Rücken, zu
diesem Zeitpunkt wurde das Entfernen des überschüssigen Antigens durchgeführt, wie
beschrieben im „Immunisierungsverfahren".
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Die Anti-CT Antikörpertiter wurden unter Verwendung
von ELISA, wie oben beschrieben für "ELISA-IgG (H + L)", bestimmt unter Verwendung von Seren,
die 11 Tage nach der ersten Immunisierung entnommen wurden. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 16 gezeigt. CD war immunogen in beiden
Gruppen, verglichen mit Seren, die vom gleichen Tier vor der Immunisierung
(Kontrollblut vor Immunisierung) entnommen wurden. Das geometrische
Mittel im Titer der mit Klebebandabreißen behandelten Gruppe war
jedoch 100-fach höher,
und die Titer waren in der letztgenannten Gruppe von Tieren einheitlicher
im Vergleich zu den "keine" Tieren. Es hat daher
den Anschein, dass physikalische Störung der Hautoberfläche unter
Verwendung von Klebebandabreißen
den Transfer von Antigen über
den transkutanen Weg fördert.
-
Diese einfache Vorrichtung kann durch
andere Vorrichtungen zur physikalischen Penetration ersetzt werden,
um Antigene und Adjuvanzien in die Epidermis einzubringen, wie eine
Nadel und Tuberkulinspritze, die für intradermale Injektion verwendet
werden, Mikronadeln, die eine Länge
aufweisen, die nur das Stratum Corneum oder die oberflächliche
Epidermis durchdringen, Vorrichtungen, die für den TB-Zackentest verwendet werden,
gasbetriebene Kanonen, Klebeband für die Abrissmethode, oder andere
Vorrichtungen, von denen bekannt ist, dass sie nur die Epidermis
oder oberflächliche
Dermis durchdringen. Klebebandabreißvorrichtungen können zusammen
mit anderen Penetrationsförderern
verwendet werden. Klebebandabreißvorrichtungen können zusammen
mit einem Marker verwendet werden, um die Stelle für die Platzierung
der Auflage abzugrenzen, und können
in einer Rolle oder individuellen Einheiten verabreicht werden.
-
Tabelle
16. Förderung
der transkutanen Immunisierung durch physikalische Penetrationsförderung:
Anti-CT-Titer in Mäusen,
denen die Haut unter Verwendung von Cellophan-Klebeband vor dem
Auftragen des Antigens abgerissen wurde.
-
Beispiel 17.
-
Es können Nukleinsäuren wie
Plasmid-DNA oder RNA verwendet werden, um eine Immunantwort zu induzieren,
und sind im Stand der Technik gut bekannt. Die Verwendung von Nukleinsäuren in
transkutaner Immunisierung wurde in früheren Patenten beschrieben
(PCT/US97/21324). Die Verwendung von Nukleinsäuren (auch als genetische Immunisierung
bekannt) auf der Haut mit Penetrationsförderungstechniken wird in dem
folgenden Beispiel veranschaulicht.
-
6 bis 8 Wochen alte C57BL/6 Mäuse wurden
anästhesiert
und rasiert wie im „Immunisierungsverfahren" beschrieben. Für die "NP DNA"-Gruppe wurden die
Mäuse mit
Isopropanol abgewischt, nachdem der Alkohol evaporiert war (ungefähr 10 Minuten)
wurden die Rücken
mit Wasser unter Verwendung eines gesättigten Gazetupfers hydratisiert.
Ungefähr
10 Minuten später
wurde das überschüssige Wasser
abgetupft und 100 μg
eines DNA-Plasmids (pCMV-NP), welches das Influenza-Nukleoprotein
kodiert, wurden auf dem Rücken
in 100 μl
Salzlösung
aufgetragen. Die zweite Gruppe von NP-DNA Mäusen wurden dem gleichen Immunisierungsprotokoll
ausgesetzt mit der Ausnahme, dass die Rücken durch 3 × Klebebandabreißen vor
dem Alkoholbetupfen behandelt wurden; "NP DNA-Klebebandabreißen". Das Klebebandabreißverfahren
wurde durch Anbringen von Scotch Cellophan-Klebeband auf die Rücken erzielt,
Bindenlassen auf der Hautoberfläche
für 5 Minuten,
gefolgt durch sanftes Entfernen des Klebebands. Eine dritte Gruppe
von Mäusen
wurde in das beschriebene Klebebandabreiß-/Immunisierungsprotokoll eingebunden,
und 100 μg
des adjuvanten hitzelabilen Enterotoxins (LT) wurden in die Immunisierungslösung eingeschlossen.
16 Tage nach der ersten Immunisierung wurde den Tieren eine Blutprobe
entnommen und die Anti-Influenza-NP-Titer
unter Verwendung eines ELISAs, wie beschrieben für "ELISA-IgG (H + L)", bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle
17 gezeigt.
-
Anti-Influenza-Titer wurden unter
Verwendung einer gespaltenen Virusantigen (Fluzon) Zubereitung, um
die ELISA-Platten zu beschichten, bestimmt. Die ELISA-Titer wurden
in fünf
individuellen Tieren bestimmt, und der mittlere optische Dichtewert
für jede
Gruppe ist gezeigt. Alle drei Immunisierungsgruppen entwickelten Anti-Influenza-Titer
im Vergleich mit Titern im Serum, das vom gleichen Tier vor der
Immunisierung (Kontrollblut vor Immunisierung) abgenommen wurde.
Im Vergleich mit der „NP
DNA alleine" Gruppe
förderte
das Klebebandabreißen
vor der Immunisierung den Anti-Influenza-Titer in allen drei Serumverdünnungen,
die getestet wurden (1 : 100, 1 : 200, 1 : 400), und die Zugabe
eines Adjuvanz (LT) verstärkte
diese Antwort weiter. Daher kann DNA auf der Haut verwendet werden,
um Immunantworten auf Vakzineantigene zu induzieren und ihre Wirksamkeit
kann durch die Zugabe von Adjuvanz, und Penetrationförderung
wie Klebebandabreißen
verstärkt
werden.
-
Tabelle
17. Immunogenität
von DNA, die als Antigen auf die Haut aufgetragen wurde unter Verwendung
von Alkoholpenetrationsförderung.
-
Beispiel 18.
-
Die transkutane Immunisierung (TCI)
ermöglicht
wegen des einfachen Transfers, dass die Anwendung über verschiedene
entwässernde
Lyhmphknoten gegeben wird. Dies kann einen zusätzlichen Vorteil darstellen,
da es die Immunantwort verstärkt.
Kaninchen wurden anästhesiert,
rasiert und wie oben beschrieben immunisiert. Die Tiere wurden mit
100 μg Choleratoxin
(CT) und 100 μg
Influenzahämagglutinin
(HA) an einer Stelle oder an zwei Stellen auf dem Rücken immunisiert.
HA und CT wurden bei 0, 3 und 5 Wochen aufgetragen. Sieben Wochen
nach der ersten Immunisierung wurde den Tieren eine Blutprobe entnommen
und die Anti-HA-Titer unter Verwendung eines ELISAs, wie oben beschrieben
für „ELISA-IgG
(N + L)", bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 18 gezeigt.
-
Die Anti-NA-Titer waren im Serum
von 10 von 10 Tieren, die mit CT und HA immunisiert worden waren, im
Vergleich zu Titern im Serum der gleichen Tiere vor der Immunisierung
(Kontrollblut vor der Immunisierung), erhöht. Das geometrische Mittel
des Titers in der Zwei-Stellen-Gruppe war dreifach höher als
das in der Eine-Stelle-Gruppe, was nahe legt, dass der Antigentransfer
an mehreren Stellen dazu verwendet werden kann, TCI zu verstärken. Daher
können
Antigene durch TCI eingebracht werden entweder an einer einzelnen
oder an mehreren Stellen auf der Haut.
-
Tabelle
18. Transkutaner Transfer von Antigen in einer einzelnen oder mehreren
Stellen.
-
Beispiel 19.
-
Die Vielzahl von Antigenen, die durch
TCI eingebracht werden kann, wird weiter durch die Verwendung einer
Polysaccharid konjugierten Vakzine veranschaulicht, um Anti-Polysaccharidantikörper zu
induzieren. 6 bis 8 Wochen alte BALB/c Mäuse wurden anästhesiert,
rasiert und immunisiert, wie in dem Immunisierungsverfahren beschrieben.
Die Mäuse
wurden mit Choleratoxin (CT) und Haemophilus influenza B Polysaccharid (Hib-PS) bei 0, 3 und
5 Wochen immunisiert. Sieben Wochen nach der ersten Immunisierung
wurden den Tieren eine Blutprobe entnommen und die Anti-Hib-PS-Titer
wurde unter Verwendung eines ELISAs, wie oben beschrieben für „ELISA-IgG
(H + L)", bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 gezeigt.
-
Anti-Hib-PS-Titer waren im Serum
von 4 von 10 Tieren, die mit CT und Hib-PS immunisiert worden waren,
erhöht
im Vergleich zu Titern im Serum von den gleichen Tieren vor der
Immunisierung (Kontrollblut vor Immunisierung). Daher kann TCI verwendet
werden, um Anti-Polysaccharidantigene durch die Haut zu induzieren.
Dies ist ein häufiges
Vakzineantigen für
menschliche Verwendung und repräsentiert
eine wichtige Strategie für
die Immunisierung.
-
Tabelle
19. Transfer eines konjugierten Polysaccharids durch transkutane
Immunisierung.
-
Beispiel 20.
-
Transkutane Immunisierung
von Mäusen
mit Vakzineantigenen für
menschliche Verwendung
-
Es ist gezeigt worden, das CT als
Adjuvanz für
transkutane Immunisierung mit einzelnen Toxoiden und BSA wirken
kann. Wir haben Mäuse
transkutan immunisiert mit einer Vielzahl von Vakzineantigenen für menschliche
Verwendung, einschließlich
einer multivalenten Toxoidvakzine (Tetanus und Diphtherietoxoide), einem
hefeexprimierten rekombinanten Protein (HIV p55 gag) und gesamter,
abgetöteter
Rabiesviren unter Verwendung von CT als Adjuvanz, wie in Tabelle
20 gezeigt. BALB/c Mäuse
(n = 5) wurden immunisiert und zweimal aufgefrisch, wie vorher beschrieben
(Glenn, G. M., Scharton-Kersten,
T., Vassell, R., Matyas, G. T Alving, C. R. Transcutaneous immunization
using bacterial ADP-ribosylating exotoxins as antigens and adjuvants.
Infect. Immun.) (im Druck). Immunisierungsdosen schlossen 100/50/50 μg CT/TT/DT über TCI
gegen 3/1/1 für
Alaun/TT/DT IM; 100/100 μg
für LT
+ DT gegen 100 μg
DT allein ein. 100/100 μg
für CT/p55 über TCI gegen
100 μg p55
allein. Mäuse,
die mit 17 IE des abgetöteten
Rabiesvirus (n = 10) immunisiert worden waren, wurden 2 × intramuskular
erstimmunisiert und dann transkutan (17 IE) aufgefrischt nach leichtem
Alkoholwischen der Haut und mit 3 × IM Rabies-Immunisierung verglichen.
Es wurden Antikörperspiegel
gegen DT, TT, p55 und Rabies bestimmt unter Verwendung eines ELISA,
wie vorher beschrieben (Grassi, M. Wandler, A. & Peterhans, E. Enzyme-linked immunoabsorbant
assay for determination of antibodies to the envelope glycoproteine
of rabies virus. J. Clin. Microbiol. 27, 899–902 (1989). Miyamura, K.,
Tajiri, E., Ito, A., Murata, R. & Kono,
R. Micro cell culture method for determination of diphtheria toxin
and antitoxin titres using VERO cells. II. Comparison with the rabbit
skin method and practical application for seroepidemiological studies.
J. Biol. Stand. 2, 203–209
(1974)). TCI ergab ähnliche
Anstiege in den Antikörper-Antworten
auf TT und DT und die Anti-DT-Neutralisationstiter waren vergleichbar
zu jenen, die durch intramuskuläre
Immunisierung (IM) hervorgerufen wurden. Diese Daten zeigen, dass
TCI verwendet werden kann, um eine Immunantwort von vergleichbarer
Stärke
zu induzieren wie solche, die durch existierende Immunisierungsverfahren
induziert werden. TCI-Auffrischung
von Tieren, die erstmals IM immunisiert wurden, ergaben auch einen
signifikanten Anstieg in Anti-Rabies-Titeen in allen 10 getesteten
Tieren (0,53 bis 1,03 IU, p < 0,02,
Student's t-test).
Die Antikörper gegen
die Antigene DT und p55, die ohne Adjuvanz verabreicht wurden, waren
sehr niedrig oder nicht nachtweisbar oder in Übereinstimmung mit unseren
früheren
Beobachtungen, dass Antigene nur schwach immunogen sind, wenn sie
ohne Adjuvanz aufgetragen werden. LT wirkte auch als Adjuvanz (Tabelle
20) in ähnlicher Weise
zu vorherigen Studien unter Verwendung von CT (1,2). Obwohl die
Immunisierungen nicht optimiert worden waren im Vergleich zu intramuskulärem Transfer,
bestätigen
diese antigenspezifischen Antworten, dass TCI verwendet werden kann
für eine
Vielzahl von Vakzinien für
menschliche Verwendung aus einer Vielzahl von Quellen und einer
Vielzahl von Größen, so
dass LT als Adjuvanz für
gemeinsam verabreichte Vakzineantigene wirken kann.
-
Tabelle
20. Mausantikörperantworten
auf Vakzineantigene für
menschliche Verwendung verabreicht durch TCI.
-
- ND
- nicht durchgeführt
- ELISA-Einheiten (EE)
- geyeigt als geometrisches
Mittel und Bereich in Klammern
-
Beispiel 21.
-
Langerhans'sche Zellaktivierung
-
Bei zwei Versuchspersonen wurde die
Immunisierungsstelle und der gegenüberliegende nicht-immunisierte
Arm biopsiert, bei einer 24 Stunden nach der Immunisierung und bei
einer 48 Stunden nach der zweiten Immunisierung. Eine Hämatoxilin
und Eosin (H&E)
Färbung
der Proben bestätigte
die klinischen Beobachtungen, die nahe legten, dass keine Entzündung nach
der Immunisierung zu sehen war (1A, B). Obwohl die routinehistologischen
Schnitte unauffällig
waren, zeigten LCs, die unter Verwendung von Anti-CD1a Färbung der
Proben von der Immunisierungsstelle sichtbar gemacht wurden, stark
vergrößerte Zellkörper, aber andererseits
normale Anzahl von Zellen im Vergleich zu den Kontrollbiopsien vom
gegenüberliegenden
Arm sowohl nach 24 als auch nach 48 Stunden (1C, D, E, F). Ähnliche
Beobachtungen wurden unter Verwendung von Anti-HLA-DR und Anti-S-100 gesehen, um LCs
sichtbar zu machen (nicht gezeigt). Die LC-Morphologie in der TCI-immunisierten
Haut hatte ein ähnliches
Erscheinungsbild wie mandelkrypte LCs, von denen angenommen wird,
dass sie chronisch sind durch Lipopolysaccharide aus der Mundflora
(Noble) aktiviert.
-
Wegen der begrenzten Größe und Anzahl
von menschlichen Haut-Biopsieproben, die untersucht wurden, sind
komplementäre
Mausstudien durchgeführt
worden. LC-Aktivierung
in Maussystemen bei Verwendung von Kontaktsensibilatoren, LPS und
entründungsfördernden
Cytokinen, ist gekennzeichnet durch sowohl Änderungen in der Morphologie
(Aiba) als auch durch die Erhöhung
der Expression von Oberflächenmarkern (Jakob
und Udey). Mausohrenhaut wird häufig
für Studien
der LC-Aktivierung verwendet, und es ist gezeigt worden, dass dies
eine hervorragende Stelle für
transkutane Immunisierung ist (Scharton-Kersten). Epidermale Schichten
wurden 24 Stunden nach dem Auftragen von CT auf das Ohr präpariert
und auf MHC Klasse II gefärbt,
einem Marker in der Maushaut, der auf LC beschränkt ist. Im Vergleich zu den
PBS-behandelten Ohren, 2A,
zeigten LC in CT-behandelten Ohren merkliche Veränderungen in der LC-Morphologie mit Verlust von
dentritischen Fortsätzen,
vergrößerten Zellkörpern und
intensiver Anfärbung
der Zellen – Merkmale
der LC-Aktivierung (Alba) (2B, C). Das LC-Aktivierungspotenzial
von CT wurde unter Verwendung von Durchfluss-Zytometrie bestätigt. LC
aus CT-behandelter Haut exprimierten erhöhte Spiegel von MHC Klasse
II Antigenen und CD 86 (B7-2) und verringerte Spiegel von E-Cadherin,
was mit LC-Aktivierung übereinstimmt,
wie an anderer Stelle beschreiben (Pierre, Aiba, Jakob).
-
Immunisierungsverfahren, das für Beispiel
22 verwendet werden kann.
-
BALB/c Mäuse können mit #40 Haarschneidegerät rasiert
werden. Dieses Rasieren kann durchgeführt werden ohne irgendwelche
Zeichen von Verletzung der Haut. Das Rasieren kann durchgeführt werden
von der Mitte des Brustkorbs bis gerade unterhalb des Nackens. Die
Mäuse können dann
für 24
Stunden ruhen gelassen werden. Zuvor könnten die Mäuse zur Identifizierung am
Ohr markiert werden und eine Blutprobe entnommen werden, um ein
Prä-Immunserum
zu erhalten. Die Mäuse
können
auch transkutan immunisiert werden, ohne Rasieren durch Auftragen
von 5–500 μl der Immunisierungslösung auf
jedes Ohr. Die Mäuse
könnten
in der folgenden Weise immunisiert werden. Die Mäuse könnten mit 0,03–0,06 ml
einer 20 mg/ml Lösung
von Xylazin und 0,5 ml und 100 mg/ml Ketamin anästhesiert werden und durch
diese Anästhesiedosis
für ungefähr 1–3 Stunden
immobilisiert werden. Die Mäuse
könnten
mit der Bauchseite nach unten auf einer Wärmedecke platriert werden.
-
Die Immunisierungslösung und
Penetratsionsförderungsverbindung
(oder Technik) können
auf der dorsalen rasierten Haut einer Maus in der folgenden Weise
platriert werden: Ein 1,2 cm × 1,6
cm aus Polystyren gefertigter Stempel wird sanft auf den Rücken gelegt
und eine mit Salzlösung
benetzte sterile Gaze könnte verwendet
werden, um die Haut teilweise anzufeuchten (was die gleichmäßige Auftragung
der Immunisierungslösung
erlaubt), die Immunisierungslösung
könnte
dann mit einer Pipette aufgetragen werden auf das Gebiet, das durch
den Stempel abgegrenzt wird, um einen 2 cm2 Bereich
mit Immunisierungslösung
zu erhalten. Es könnte
Sorgfalt angewandt werden, um die Haut mit der Pipettenspitze nicht
zu kratzen oder zu reiben. Die Immunisierungslösung könnte über das Gebiet, das abgedeckt
werden soll, mit der glatten Seite der Pipettenspitze verteilt werden.
Als Alternative könnte
die Immunisierungslösung
direkt auf der Haut ohne Anfeuchten oder mit Anfeuchten, ohne die
Verwendung eines Stempels, platriert werden.
-
Die Immunisierungslösung (zwischen
ungefähr
5 μl und
ungefähr
200 μl)
könnte
für 60
bis 120 Minuten auf dem Rücken
der Maus belassen werden. Am Ende der Immunisierungszeit könnte die
Maus sanft am Nacken und am Schwanz unter einem reichlichen Strom
von lauwarmem Leitungswasser gehalten und für 10 Sekunden gewaschen werden.
Die Maus könnte
dann sanft mit einem Stück
steriler Gaze trockengetupft werden, und ein zweites Waschen könnte dann
für 10
Sekunden durchgeführt
werden; die Maus könnte
dann ein zweites Mal trockengetupft und im Käfig gelassen werden. Die Maus
würde keine
ungünstigen
Wirkungen der Anästhesie,
Immunisierung, Waschverfahren oder Toxizität der Exotoxine zeigen. Es
würde nach
der Immunisierung keine Hautirritation, Anschwellung oder Rötung zu
sehen sein, und die Maus würde
zu gedeihen scheinen. Eine Immunisierung unter Verwendung des Ohrs
könnte,
wie oben beschrieben, durchgeführt
werden mit der Ausnahme, dass das Fell nicht vor der Immunisierung
entfernt werden würde.
-
Antigen
-
Die folgenden Antigene könnten für Immunisierung
und ELISA verwendet werden und könnten
unter Verwendung von sterilem PBS oder normaler Salzlösung gemischt
werden. Choleratoxin oder CT (List Biologicals, Katalog-Nr. 101B,
Chargen-Nr. 10149CB), CT B-Untereinheiten
(List Biologicals, Katalog-Nr. BT01, Chargen-Nr. CVXG-14E), CT A-Untereinheit (List
Biologicals, Katalog-Nr. 102A, Chargen-Nr. CVXA-17B), CT A-Untereinheit (Calbiochem.,
Katalog Nr. 608562); salzfreies Pertussistoxin (List Biologicals,
Chargen-Nr. 181120a); Tetanustoxoid (List Biologicals, Chargen-Nr.
1913a und 1915a); Pseudomonas Exotoxin A (List Biologicals, Chargen-Nr.
ETA25a); Diphtherietoxoid (List Biologicals, Chargen-Nr. 15151);
hitrelabiles Enterotoxin von E. coli (Sigma, Chargen-Nr. 9640625);
Rinderserumalbumin oder BSA (Sigma, Katalog-Nr. 3A-4503, Chargen-Nr.
31F-0116); und Hemophilus
influenza B Konjugat (Connaught, Chargen-Nr. 6J81401).
-
ELISA-IgG (H + L)
-
Antikörper spezifisch für CT, LT,
ETA, Pertussistoxin, Diphtherietoxoid, Haemophilus influenzua B
Konjugat und BSA könnten
bestimmt werden unter Verwendung von ELISA in einer Technik ähnlich der
von Glenn et al. (1995).
-
Beispiel 22.
-
Die Aktivierung von LT kann unter
Standardreaktionsbedingungen durchgeführt werden durch Inkubieren
des LTs mit Trypsin (oder Trypsin immobilisiert auf Kügelchen)
mit oder ohne reduzierenden Agentien (z. B. Dithiotheritol), um
die Disulfidbrücken
nahe der Trypsinspaltstelle aufzubrechen. Natives LT kann durch
Inkubation von 100 μg
Protein mit 0,1 μg
Trypsin in einem Gesamtreaktionvolumen von 100 μl für 45 min bei 37°C aktiviert
werden. Als Alternative kann das Trypsin auf Kügelchen fixiert werden, und
das LT kann über die
Trypsinkügelchen
eluiert werden. Die Trypsinspaltung kann durch SDS-PAGE (Laemilli,
U. K., 1970, Cleavage of structural proteins during the assembly
of the head of bacteriophage T4, Nature 227: 680–685) nachgewiesen warden.
LT, entweder behandelt oder nicht-behandelt mit Trypsin, kann mit
Puffer, enthaltend das Dithiothreitol, gemischt und für 5 min
vor der SDS-PAGE Analyse auf 100°C
erhitzt werden. Trypsinbehandeltes LT könnte ein proteolytisches Fragment
von 21 K Daltons aufweisen in Übereinstimmung
mit Trypsinspaltung des A1 und A2, was der A1-Untereinheit ermöglicht,
G-Proteine zu ADP-ribosylieren und dadurch seine toxische Wirkung
zu erzielen, während
nicht-behandeltes
LT übereinstimmend
mit einer intakten A-Untereinheit bei 28 K Daltons eine Bande zeigen
würde.
Die Aktivierung kann weiterhin gezeigt werden durch den Maus-Y-1-Zelltest, in dem
natives LT 1.000-fach weniger aktiv wäre als CT, aber Trypsinbehandeltes
LT ebenso aktiv sein würde
wie CT. Die Aktivierung kann auch unter Verwendung eines enzymatischen
Assays gezeigt werden, dem NAD:Agmatin ADP-Ribosyltransferasetest. In einem solchen
Test würde
erwartet werden, dass nicht-Trypsinbehandeltes LT geringe oder nicht
nachweisbare Aktivität
zeigt, während
man erwarten würde, dass
Trypsin-behandeltes LT ähnliche
Aktivität
aufweist wie jene, die durch CT gezeigt wird.
-
Beispiel 23.
-
Die transkutane Immunisierung kann
nützlicher
sein, wenn die Immunisierung über
einen kurzen Zeitraum ausgeführt
werden kann. Es kann zum Beispiel für eine Immunisierung nützlich sein,
dass sie während eines
Routineklinikbesuchs, der 30 min dauert, durchgeführt werden
kann. In diesem Beispiel zeigen wir, dass transkutane Immunisierung
auf hydratisierter alkoholbetupfter Haut in einer solch kurzen Zeit
durchgeführt werden
kann.
-
6 bis 8 Wochen alte C57BL/6 Mäuse wurden
anästhesiert
und rasiert, wie im „Immunisierungsverfahren" beschrieben. Am
Tag der Immunisierung wurden die Rücken der Mäuse mit Isopropanol abgewischt. Nachdem
der Alkohol evaporiert war (ungefähr 10 Minuten) wurden 200 μl Wasser
auf den Rücker
zur Hydratisierung aufgetragen. 15 Minuten später wurde die Immunisierungslösung auf
den Rücken
aufgetragen und dort für
die angegebene Zeit belassen. Das Entfernen des überschüssigen Antigens wurde durchgeführt, wie im „Immunisierungsverfahren" beschrieben. Die
Mäuse wurden
mit CT allein immunisiert (100 μg
in 50 μl)
bei d0 und mit CT plus DT (100 μg
jeweils in 100 μl
Volumen) bei 4, 6 und 9 Wochen. Zwölf Wochen nach der ersten Immunisierung
wurde den Tieren eine Blutprobe entnommen und die Anti-DT-Titer
wurden unter Verwendung eines ELISAs, wie oben beschrieben für „ELISA-IgG
(H + L)", bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 23 gezeigt.
-
Anti-DT-Titer waren deutlich erhöht im Serum
von all den Tieren, die mit CT und DT immunisiert worden waren im
Vergleich zu Titern im Serum der selben Tiere vor der Immunisierung
(Kontrollblut vor der Immunisierung). Die maximale Wirkung der Immunisierung
scheint in Tieren aufzutreten, die für einen Zeitraum von 60 Minuten
vakziniert wurden, obwohl die Titer bei 30 und 120 Minuten ähnlich waren.
Fünfzehn
Minuten Immunisierung scheinen weniger wirksam zu sein, da die Titer
in dieser Gruppe ungefähr
10-fach geringer waren als jene, die in der 30, 60 und 120-Minuten-Gruppen
beobachtet wurden. Es hat daher den Anschein, dass TCI innerhalb
von 15 Minuten nach Auftragen des Antigens erreicht werden kann.
-
Tabelle
23. Wirkung der Dauer der Antigen-Anwendung auf die humorale Immunität, induziert
durch transkutane Immunisierung.
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