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DE69900283T2 - Reninaktive Substanz enthaltend humanes Prorenin und Antikörper gegen das Prorenin Profragment - Google Patents

Reninaktive Substanz enthaltend humanes Prorenin und Antikörper gegen das Prorenin Profragment

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DE69900283T2
DE69900283T2 DE69900283T DE69900283T DE69900283T2 DE 69900283 T2 DE69900283 T2 DE 69900283T2 DE 69900283 T DE69900283 T DE 69900283T DE 69900283 T DE69900283 T DE 69900283T DE 69900283 T2 DE69900283 T2 DE 69900283T2
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DE
Germany
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amino acid
peptide
antibody
acid sequence
prorenin
Prior art date
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DE69900283T
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Yuichi Ishida
Kazuo Murakami
Yukio Nakamura
Fumiaki Suzuki
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tokiwa Chemical Industries Co Ltd
Original Assignee
Tokiwa Chemical Industries Co Ltd
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Publication date
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Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Renin-aktive Substanz, die enzymatische Aktivität oder insbesondere Renin-Aktivität aufweist, und zwar in Form einer Kombination aus dem Human-Prorenin und einem spezifischen Anti-Peptid-Antikörper, der zur Bildung eines Immunkomplexes durch Kombination mit dem Profragment-Peptid von Human-Prorenin fähig ist.
  • Prorenin wird hauptsächlich in der Niere als Vorstufe des vollständig gereiften Renins oder als das vollständig gereiftes Renin, das ein Profragment mit einer Sequenz aus 43 Aminosäureresten am N- Ende davon gebunden hat, produziert und ins Blut freigesetzt.
  • Während die Konzentration dieses Prorenins im Blut etwa 10-mal höher ist als die des vollständig gereiften Renins, weist das Prorenin per se keine enzymatische Aktivität auf, so daß es übliche Praxis ist, dasselbe in das vollständig gereifte Renin zu überführen, indem der Profragment-Teil mit einer Protease wie z. B. Trypsin und Pepsin abgespalten wird.
  • Vor einigen Jahren wurden auch nicht enzymatische Verfahren vorgeschlagen. Z. B. wird ein Verfahren zur Aktivierung bei niedriger Temperatur in saurem Zustand ohne Veränderung der Primärstruktur in Nature, Band 288, Seiten 702-705 (1980); Journal of Biological Chemistry, Band 262, Seiten 2472-2477 (1987); Clinical Chemistry, Band 37, Seiten 1811-1819 (1991); Journal of Biological Chemistry, Band 267, Seiten 11753-11759 (1992) und anderswo vorgeschlagen. Darüber hinaus wird im Journal of Biological Chemistry, Band 267, Seiten 22837-22842 (1992) ein Verfahren beschrieben, bei dem ein Renin-Inhibitor mit niedrigem Molekulargewicht mit dem Renin-aktiven Teil des Prorenins, der in der tiefen Rille der dreidimensionalen Struktur verborgen ist, in Kombination gebracht wird, um dieselbe in den offenen Typ zu überführen, so daß ein Antikörper, der die Nachbarschaft des aktiven Teils des vollständig gereiften Renins erkennen kann, damit kombiniert werden kann.
  • Obgleich viele Artikel über das Thema der Bildung eines Immunkomplexes, der entsteht, wenn der Anti-Zwischenprodukt-Teil und anti-C-terminale Peptid-Antikörper des Prorenin-Profragments mit Prorenin kombiniert werden, verfügbar sind, deutet keiner der Artikel auf die dadurch ausgeübte enzymatische Aktivität hin.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Dementsprechend besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung einer neuen Renin-aktiven Substanz durch Verwendung eines Anti-Peptid-Antikörpers, der eine spezifische Aminosäuresequenz innerhalb des Human-Prorenin-Profragments erkennen kann.
  • Die Erfinder konnten erfolgreich eine Renin-aktive Substanz bereitstellen, die ein Komplex aus dem Human-Prorenin und einem Antikörper ist, wobei der Antikörper in spezifischer Weise als Antigen ein Peptid erkennen kann, das eine Aminosäuresequenz am N-terminalen Teil des Prorenin-Profragments hat und das aus 15 Aminosäureresten zwischen dem Leucinrest in Position 1 und dem Argininrest in Position 15 besteht.
  • Weitere Untersuchungen haben die Erfinder zur Vervollständigung der vorliegenden Erfindung auf der Grundlage verschiedener unerwarteter Feststellungen geführt. Erstens wird eine Renin-aktive Substanz erhalten, indem das Human-Prorenin mit einem Antikörper kombiniert wird, welcher in spezifischer Weise ein Peptid erkennen kann, das eine Aminosäuresequenz hat, die innerhalb der Aminosäuresequenz liegt, die aus den 33 Aminosäureresten des Human-Prorenin-Profragments zwischen dem Isoleucinrest in Position 11 und dem Argininrest in Position 43 besteht. Zweitens kann durch einen Komplex des Human-Prorenins mit einem gemischten Antikörper, der aus dem oben beschriebenen Antikörper und äquivalenten oder äquimolaren Mengen eines zweiten Anti-Peptid-Antikörpers, der in spezifischer Weise eine Aminosäuresequenz erkennen kann, die aus den 11 Aminosäureresten im Human-Prorenin-Profragment zwischen dem Leucinrest in der Position 1 und dem Isoleucinrest in Position 11 besteht, eine Verbesserung der Renin-Aktivität verglichen mit der Kombination des Human-Prorenins und jedem der entsprechenden einzelnen Anti-Peptid-Antikörper erreicht werden.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung nach einem ersten Aspekt einen Komplex des Human-Prorenin mit einem Anti-Peptid-Antikörper bereit, welcher eine Aminosäuresequenz, bestehend aus mindestens 15 Aminosäureresten in einer Aminosäuresequenz, bestehend aus den 33 Aminosäureresten zwischen dem Isoleucinrest in Position 11 und dem Argininrest in Position 43 im Human-Prorenin-Profragment, das eine Aminosäuresequenz hat, die aus 43 Aminosäureresten besteht, spezifisch erkennen kann.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner nach einem zweiten Aspekt der Erfindung eine Renin-aktive Substanz bereit, die ein Komplex des Human-Prorenins und eines gemischten Antikörpers ist, welcher aus äquimolaren Mengen eines ersten Anti-Peptid-Antikörpers, der eine Aminosäuresequenz, bestehend aus mindestens 15 Aminosäureresten in einer Aminosäuresequenz, bestehend aus den 33 Aminosäureresten zwischen dem Isoleucinrest in Position 11 und dem Argininrest in Position 43 in dem Human-Prorenin-Profragment, das eine Aminosäuresequenz hat, die aus 43 Aminosäureresten besteht, spezifisch erkennen kann, und einem zweiten Anti- Peptid-Antikörper, der eine Aminosäuresequenz, bestehend aus 11 Aminosäureresten innerhalb des oben beschriebenen Human-Prorenin-Profragments zwischen dem Leucinrest in Position 1 und dem Isoleucinrest in Position 11 spezifisch erkennen kann, besteht.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Fig. 1 ist ein Diagramm, das die Resultate der Western-Blot-Analyse des Human-Prorenins und des vollständig gereiften Renins zeigt.
  • Fig. 2 ist ein Diagramm, welches das Bindungsvermögen des Anti- Peptid-Antikörpers an dem Profragment-Zwischenprodukt-Teil mit Prorenin als Funktion der Reaktionszeit zeigt.
  • Fig. 3 ist ein Diagramm, das das Bindungsvermögen des Anti- Peptid-Antikörpers am Profragment-C-terminalen Teil mit Prorenin als Funktion der Reaktionszeit zeigt.
  • Fig. 4 ist ein Balkendiagramm, das die Renin-Aktivität der Komplexe aus Anti-Peptid-Antikörpern und Human-Prorenin zeigt.
  • Fig. 5 ist ein Balkendiagramm, das die relativen Aktivitätsgrade bei Komplexen von Human-Prorenin mit verschiedenen Anti-Peptid- Antikörpern zeigt.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Renin-aktive Substanz bereit, die ein Komplex zwischen einem Anti-Peptid-Antikörper und Human-Prorenin ist, der durch die Spezifität des Anti-Peptid-Antikörpers gekennzeichnet ist, nähmlich daß der Anti-Peptid-Antikörper in spezifischer Weise ein Peptid erkennt, das eine Aminosäuresequenz, bestehend aus mindestens 15 Aminosäureresten an beliebigen Positionen innerhalb der Aminosäuresequenz, bestehend aus 33 Aminosäureresten zwischen dem Isoleucinrest in Position 11 und dem Argininrest in Position 43 in dem Human-Prorenin-Profragment hat.
  • Stark erhöhte Renin-Aktivität kann erzielt werden, indem ein gemischter Antikörper verwendet wird, der aus äquimolaren Mengen des oben beschriebenen Anti-Peptid-Antikörpers und einem zweiten Anti-Peptid-Antikörper besteht, wobei der letztgenannte in spezifischer Weise eine Aminosäuresequenz erkennen kann, die aus 11 Aminosäureresten im oben beschriebenen Human-Prorenin-Profragment zwischen dem Leucinrest in Position 1 und dem Isoleucinrest in Position 11 besteht.
  • Dieses Human-Prorenin-Profragment ist eine Substanz mit einer Aminosäuresequenz, die durch die unten dargestellte Sequenz Nr. 1 dargestellt wird und die im später angegebenen Sequenzprotokoll aufgelistet ist. Sequenz Nr. 1
  • Die Renin-aktive Substanz der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden, indem ein erstes Peptid, das im folgenden als Peptid M bezeichnet wird und das aus 16 Aminosäureresten im Mittelteil des Prorenin-Profragments, nämlich zwischen dem Isoleucinrest in der Position 11 und dem Argininrest in der Position 26 besteht, und ein zweites Peptid, das im folgenden als Peptid C bezeichnet wird und das aus 15 Aminosäureresten am C-terminalen Ende davon, nämlich zwischen dem Glycinrest in Position 27 und dem Methioninrest in Position 41 besteht, synthetisiert werden, wobei beide Peptide einen Zusatz aus einen Cysrest am C-terminalen Ende aufweisen und diese beiden Peptide nach dem unten beschriebenen Verfahren eingesetzt werden.
  • Diese Peptide werden jeweils zur Herstellung von immunogenen Antigenen verwendet, indem sie mit einem Trägerprotein wie z. B. Rinderserumalbumin, Ovalbumin, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin und dgl. kombiniert werden, wobei ein Vernetzungsmittel wie z. B. eine Maleinimid-Verbindung verwendet wird. Danach werden die entsprechenden immunogenen Antigene, die mit dem vollständigen Freundschen Adjuvans vermischt sind, subkutan wiederholt in Zweiwochenabständen einem ausgewachsenen Kaninchen verabreicht. Nach der fünfte Verabreichung wird ein kleines Blutvolumen aus der peripheren Ohrvene entnommen, um den Antikörperwert zu bestimmen, worauf Ausgeblutet wird, wenn der Antikörperwert vollständig erhöht ist, um so ein Antiserum zu erhalten. Als nächstes wird das Antiserum einer Aussalzbehandlung und einer Reinigungsbehandlung durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Affinitätsgelen, die die entsprechenden synthetischen Peptide kombinieren, unterworfen.
  • Das Verfahren ab der Herstellung des immunogenen Antigens bis zur affinitätschromatographischen Reinigung der Antikörper kann nach einem bekannten Verfahren durchgeführt werden, das z. B. von S. Ohumi et al. in "Experimental Protocol in Antipeptide Antibodies" (1994), Seite 48, beschrieben wird.
  • Als nächstes wird der Anti-Peptid-Antikörper nach der affinitätschromatographischen Reinigung zu einer Lösung von Human-Prorenin, die mit einer physiologischen Salzlösung, die Rinderserum enthält, verdünnt ist, gegeben, um die Reaktion bei einer Temperatur von 4ºC für 16 bis 24 h durchzuführen, so daß ein Komplex erhalten wird.
  • Diese Reaktionsgemisch wird dann mit einer Schaf-Angiotensinogen- Lösung als Human-Renin-Substrat vermischt und bei 37ºC 60 min inkubiert, um die Reaktion durchzuführen, worauf die Reaktion durch Abschrecken in einem Eisbad beendet wird, so daß Angiotensin I im Reaktionsgemisch produziert wird. Daher ist dieser Komplex eine Substanz, das enzymatische Aktivität oder Renin-Aktivität zeigen kann.
  • Die spezifische Bindung des gereinigten Antikörpers und des Human-Prorenins kann bestätigt werden, indem die Renin-aktive Substanz, die auf diese Weise erhalten wird, dem Western-Blot-Verfahren und der Messung der Protein-Protein-Wechselwirkung durch Ausnutzung der Oberflächenplasmon-Resonanz unterzogen wird.
  • Als nächstes wird jeder der Komplexe mit Schaf-Angiotensinogen als Renin-Substrat umgesetzt und ein Vergleich der Renin-Aktivität mit dem Trypsin-behandelten Prorenin als positive Kontrolle und mit normalen Kaninchenserum als negative Kontrolle anstelle des Antikörpers durchgeführt.
  • Die Resultate dieser Vergleichstest zeigen, daß, während der Antikörperkomplex Renin-Aktivität aufweist, die der der positiven Kontrolle entspricht, die negative Kontrolle fast keine Renin-Aktivität aufweist, so daß daraus geschlossen wird, daß diese Substanz eine Renin-aktive Substanz ist, die sich von bekannten durch Säure und niedrige Temperatur aktivierten Substanzen wie auch von durch einen niedrigmolekularen Renin-Inhibitor geöffneten Substanzen unterscheidet.
  • Fig. 1 der beigefügten Zeichnungen ist ein Diagramm, das die Resultate der Western-Blot-Analyse zeigt, welche mit Human-Prorenin und einem vollständig reifen Renin nach einer Trypsin-Behandlung von Prorenin mit scheinbaren Molekulargewichten von 47 000 bzw. 43 000, wie durch die Pfeile rechts angegeben, als Referenzbeispiele durchgeführt wurde. Wie in diesem Diagramm dargestellt wird, werden Flecken in den Bahnen 1 und 3 für das Prorenin gefunden, die eine Komplexbildung mit den Anti-Peptid-C- bzw. -M-Antikörpern (siehe unten) bei Wanderungspositionen, die einem Molekulargewicht von 47 000 entsprechen, anzeigen, während keine Spots in den Bahnen 2 und 4 für das vollständig gereifte Renin mit den Anti- Peptid-C- bzw. -M-Antikörpern gefunden werden.
  • Die Fig. 2 und 3 sind jeweils ein Diagramm, das die Resultate der Plasmon-Resonanzanalyse in Resonanzeinheiten (R. E.) bei verschiedenen Reaktionszeiten als Maß des Bindungsvermögens zwischen dem Anti-Peptid-Antikörper und Prorenin, bestimmt durch die Messung der Veränderung in der Oberflächenplasmon-Resonanz unter Verwendung eines Meßinstruments für die Protein-Protein- Wechselwirkung (Model BIA Core 100, hergestellt von Pharmacia Biotech Co.), wobei Human-Prorenin bei einer konstanten Strömungsrate durch eine Strömungszelle geführt wurde, durch chemische Bindung des Antikörpers nach der affinitätschromatographischen Reinigung, zeigt. Fig. 2 betrifft den Anti-Peptid- Antikörper, der im folgenden als Anti-Peptid-M-Antikörper bezeichnet wird und der die Aminosäuresequenz, bestehend aus 15 Aminosäureresten im Profragment zwischen dem Glycinrest in Position 27 und dem Methioninrest in Position 41, in spezifischer Weise erkennen kann. Die Kurve mit der durchgezogenen Linie und die Kurve mit der unterbrochenen Linie in jeder dieser Figuren stellen das Prorenin bzw. die Kontrollpufferlösung dar.
  • Wie aus den Figuren verständlich wird, kann für die Kontrollpufferlösung keine Bindung festgestellt werden, während für jeden der Anti-Peptid-Antikörper eine Bindung mit Prorenin festgestellt werden kann.
  • Fig. 4 ist ein Balkendiagramm, das die Renin-Aktivität angibt, die durch den enzymatischen Immunoassay des Angiotensin I bestimmt wird, welches durch das Enzym oder die Renin-aktive Substanz produziert wird, wenn Schaf-Angiotensinogen als Renin-Substrat zu einem Komplex, der durch die Reaktion von Humanprorenin mit einem Anti-Peptid-Antikörper nach affinitätschromatographischer erhalten wird, gegeben oder mit ihm umgesetzt wird. Aus dieser Figur ist zu erkennen, daß, während der Aktivitätsspiegel zwischen der Renin-Aktivität des durch die Typsin-Behandlung von Prorenin vollständig gereiften Renins als positive Kontrolle und die Renin- Aktivität des Komplexes zwischen dem Anti-Peptid-M-Antikörper oder dem Anti-Peptid-C-Antikörper etwa gleich ist, fast keine Renin- Aktivität durch die Verwendung von normalem Kaninchenserum anstelle des Anti-Peptid-Antikörpers als negative Kontrolle gezeigt wird.
  • Der daraus gezogene Schluß ist der, daß der Anti-Peptid-M-Antikörper, der eine Aminosäuresequenz im Mittelteil des Prorenin- Profragments zwischen der Position 11 und der Position 26 hat, und der Anti-Peptid-C-Antikörper am C-terminalen Teil davon, der eine Aminosäuresequenz zwischen der Position 27 und der Position 41 hat, in spezifischer Weise mit Human-Prorenin binden kann und die so gebildeten Komplexe jeweils Renin-Aktivität aufweisen, so daß sie jeweils in eine Renin-aktive Substanz umgewandelt werden, die sich von bisher bekannten aktivierten Materialien deutlich unterscheidet.
  • Fig. 5 ist ein Balkendiagramm, das die relativen Renin-Aktivitäten der Komplexe, einschließlich des Komplexes, der durch Bindung - mit dem Human-Prorenin - eines gemischten Antikörpers als äquimolares Gemisch des Anti-Peptid-M-Antikörpers oder Anti-Peptid-C- Antikörpers und eines anderen Anti-Peptid-Antikörpers, der im folgenden als Anti-Peptid-N-Antikörper bezeichnet wird, der eine Aminosäuresequenz, bestehend aus 11 Aminosäureresten zwischen dem Leucinrest in Position 1 und dem Isoleucinrest in Position 11 im Human-Prorenin-Profragment in spezifischer Weise erkennt, gebildet wird, und der Komplexe, die durch Bindung der jeweiligen Anti- Peptid-Antikörper allein mit dem Human-Prorenin gebildet werden, wobei der Trypsin-Aktivierungslevel des Prorenins als 100% verwendet wird, zeigt. Diese Figur zeigt, daß die Renin-Aktivität bei einem Gemisch aus dem Anti-Peptid-M-Antikörper und dem Anti- Peptid-N-Antikörper im Vergleich zu dem Anti-Peptid-M-Antikörper allein um das 1,22-fache erhöht ist und bei einem Gemisch aus dem Anti-Peptid-C-Antikörper und dem Anti-Peptid-N-Antikörper im Vergleich zu dem Anti-Peptid-C-Antikörper allein um das 1,52-fach erhöht ist. Insbesondere die Renin-Aktivität für die Kombination aus dem Anti-Peptid-C-Antikörper und dem Anti-Peptid-N-Antikörper erreicht eine Höhe von 128% der bisher bekannten Aktivität bei der Trypsin-Aktivierung des Prorenins.
  • Im folgenden wird die vorliegende Erfindung detaillierter anhand von Beispielen beschrieben.
  • BEISPIEL 1 (1) Herstellung des immunogen Antigens Prorenin-Profragment- Peptid
  • Nach der Festphasenmethode, die zur Peptid-Synthese herkömmlicherweise durchgeführt wird, wurde ein Peptid, bestehend aus 17 Aminosäureresten und mit einer Aminosäuresequenz der Sequenz Nr. 2, die unten angegeben ist und die im Sequenzprotokoll aufgeführt ist, unter Anfügung eines Cys-Restes am C-Ende synthetisiert; das Reaktionsgemisch wurde einer Isolierung und Reinigung durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie unterworfen. Sequenz Nr. 2
  • Getrennt davon wurde eine 16 mg-Portion Hämocyanin als Träger- Protein in 1 ml einer 0,1 M Phosphat-Puffer-Lösung mit pH 7,2 gelöst. Die Lösung wurde mit 100 ul einer 15 mg/ml Lösung von N-(γ-Maleinimdobutyroxy)succinimid in Dimethylformamid vermischt, um die Reaktion für 3 h bei Raumtemperatur durchzuführen. Dieses Reaktionsgemisch wurde einer Gel-Filtration unterzogen, indem das Reaktionsgemisch durch eine Sephadex G-25- Säule mit einem Innendurchmesser von 15 mm und einer Länge von 300 mm (ein Produkt von Pharmacia Bio Co.) geführt wurde, um nicht-umgesetztes N-(γ-Maleinimidobutyroxy) succinimid zu entfernen, worauf eine Elution des Reaktionsproduktes unter Verwendung einer 0,1 M Phosphat-Pufferlösung mit pH 6,0 als Elutionsmittel folgte.
  • Als nächstes wurde die so erhaltene Eluat-Lösung mit 10 mg des oben beschriebenen gereinigten Peptids vermischt und die Reaktion wurde 3 h lang bei Raumtemperatur durchgeführt, um einen Peptid- Hämocyanin-Komplex als immunogenes Antigen zu erhalten. Das so erhaltene immunogene Antigen des Profragment-Peptids im Mittelteil wurde bei -80ºC bis zur Verwendung gelagert.
  • (2) Herstellung eines Anti-Peptid-Antikörpers
  • Das immunogene Antigen des Profragment-Peptids, das im oben beschriebenen Verfahren (1) erhalten worden war, wurde in physiologischer Salzlösung zu einer Konzentration von 1 mg Protein/ml gelöst und die Lösung wurde mit einer äquivalenten Menge vollständigen Freundschen Adjuvans vermischt. Die gemischte Lösung wurde in Portionen an verschiedenen Stellen eines Kaninchens des weißen New Zealand-Stamms mit einem Körpergewicht von etwa 2,5 kg injiziert.
  • Danach wurde die subkutane Injektionsbehandlung des Kaninchens mit dem immunogenen Antigen in Zweiwochen-Intervallen jeweils mit einer Dosis, die auf die Hälfte der Dosis bei der ersten Injektion verringert war, wiederholt, bis sich ein vollständig erhöhter Antikörperwert eingestellt hatte; danach wurde zur Herstellung eines Antiserums ausgeblutet.
  • (3) Herstellung von gereinigtem Antikörper durch Affinitätschromatographie
  • Eine affinitätschromatograhische Säule mit einem Volumen von 3 ml wurde durch chemisches Binden einer 1 mg-Portion des gereinigten Peptids, das gemäß (1) erhalten worden war, an 3 ml eines Amingebundenen Gels (Affigel 102, ein Produkt von Biorad Co.), unter Verwendung von N-(γ-Maleinimidobutyroxy)succimid hergestellt.
  • Als nächstes wurde eine 10 ml-Portion des in (2) oben erhaltenen Antiserums mit einer 0,1 M Phosphat-Pufferlösung mit pH 7,0 vermischt und das Gemisch wurde einer Fraktionierungspräzipitation unter Verwendung einer 50%igen Ammoniumsulfat-Lösung unterzogen, wobei die IgG-Fraktion gesammelt wurde. Diese Fraktion wurde durch Zugabe von 10 ml der 0,1 M Phosphatpuffer-Lösung solubilisiert und einer 15-stündigen Dialyse bei 4ºC unter Verwendung von 2000 ml derselben Pufferlösung unterworfen.
  • Das ganze Volumen der IgG-Lösung nach der Dialyse wurde durch die oben beschriebene affinitätschromatographische Säule mit einem Volumen von 2 ml geleitet, um sie von nicht-adsorbierten Fraktionen völlig zu befreien; der adsorbierte Antikörper wurde mit einer 0,1 M Glycinhydrochlorid-Lösung mit pH 2,5 gelöst, worauf sich unverzüglich eine Neutralisierung mit einer 1 M Tris-Pufferlösung anschloß.
  • Der so erhaltene Anti-Peptid-M-Antikörper wurde in gefrorenem Zustand bis zur Fraktionierung zur Verwendung gelagert.
  • (4) Herstellung einer Renin-aktiven Substanz
  • Nach einem bekannten Verfahren, das in Journal of Hypertensions, Band 4, Seiten 388-390 (1986) beschrieben wird, wurden cDNA von Prorenin, das aus menschlicher Niere stammte, in einen Expressionsvektor eingeführt und in Eierstockzellen eines chinesischen Hamsters, die im folgenden CHO-Zellen bezeichnet werden, eingebaut. Darauf folgte eine Kultivierung in Eagles-Kulturmedium nach dem modifizierten Dulbecco-Verfahren, das 10% eines embryonalen Rinderserums enthielt. Nach vollständigem Wachstum der CHO-Zellen folgt ein Ersatz von serumfreiem Kulturmedium, wobei ein Kulturüberstand erhalten wurde, der rekombiniertes Human- Prorenin enthielt.
  • Der so erhaltene CHO-Kulturüberstand wurde einer dialytischen Reinigung mit einer Phosphat-gepufferten physiologischen Salzlösung, die 5 mM EDTA enthielt, unterworfen.
  • Als nächstes wurde eine etwa 8 ng-Portion dieses Human-Prorenins einer Elektrophorese nach einem herkömmlichen Verfahren an einem SDS-Polyacrylamid-Gel in einer Konzentration von 7,5% unterzogen. Danach folgte die Transkription auf einem Nitrocellulose-Film, um eine Reaktion und Bindung mit dem affinitätsgereinigtem Antikörper des Peptids im Zwischenteil des Profragments, das in (3) wie oben beschrieben erhalten worden war, durchzuführen.
  • Dieses Reaktionsprodukt wurde durch Farbentwicklung unter Verwendung eines ABC-Kits (ein Produkt von Vector Laboratory Co.) analysiert, um zu bestätigen, daß der Antikörper an der Transferposition des Human-Prorenin gebunden war.
  • Getrennt davon wurde eine 8 nM-Lösung des Human-Prorenins, gelöst in einer Phosphat-Pufferlösung, mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ul/min durch eine Strömungszelle (ein Produkt von Pharmacia Biotech Co.) nach Amin-Kupplung des affinitätschromatographisch gereinigten Antikörpers, der in (3) erhalten worden war, geleitet und die Änderungen in der Oberflächenplasmon-Resonanz wurden unter Verwendung eines Meßgeräts für Protein-Protein-Wechselwirkung beobachtet, um den Bindungszustand zwischen dem Human-Prorenin und dem affinitäschromatographisch gereinigten Antikörper zu untersuchen, was zu dem Schluß führte, daß zwischen diesen ein Komplex gebildet worden war.
  • BEISPIEL 2
  • Nach der Festphasenmethode, die herkömmlicher Weise zur Peptid- Synthese eingesetzt wird, wurde ein Peptid, bestehend aus 16 Aminosäureresten und mit einer Aminosäuresequenz der Sequenz Nr. 3, die unten dargestellt ist und im Sequenzprotokoll aufgelistet ist, unter Anfügung eines Cys-Restes an das C-Ende synthetisiert, und daraus wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 ein Peptid- Hämocyanin-Komplex hergestellt. Sequenz Nr. 3
  • Als nächstes wurde aus diesem immunogenen Antigen in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 ein Antiserum hergestellt, worauf sich eine Behandlung mit einer affinitätschromatographischen Säule, die unter Verwendung des gereinigten Peptids hergestellt worden war, durchgeführt, um einen gereinigten Anti-Peptid-C-Antikörper zu erhalten.
  • Der so erhaltene gereinigte Antikörper wurde mit dem Human-Prorenin, das in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 erhalten worden war, umgesetzt, wodurch eine Renin-aktive Substanz hergestellt wurde.
  • BEISPIEL 3
  • Nach der Festphasenmethode, die herkömmlicherweise zur Peptid- Synthese eingesetzt wird, wurde ein Peptid, bestehend aus 12 Aminosäureresten und mit einer Aminosäuresequenz der Sequenz Nr. 4, die unten dargestellt ist und die im Sequenzprotokoll aufgeführt ist, unter Anfügung eines Cys-Restes am C-Ende synthetisiert. Daraus wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 ein Peptid-Hämocyanin-Komplex hergestellt, der als immunogenes Antigen dienen soll. Sequenz Nr. 4
  • Als nächstes wurde aus diesem immunogenen Antigen in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 ein Antiserum hergestellt. Darauf folgte eine Behandlung mit einer affinitätschromatographischen Säule, die unter Verwendung des gereinigten Peptids hergestellt worden war, wodurch ein gereinigter Anti-Peptid-M-Antikörper erhalten wurde.
  • Eine 50 ul-Portion einer 0,6 uM Human-Prorenin-Lösung wurde mit 50 ul einer 0,6 uM Lösung des gereinigten Anti-Peptid-M-Antikörpers, der in Beispiel 1 erhalten worden war, oder des gereinigten Anti-Peptid-C-Antikörpers, der in Beispiel 2 erhalten worden war, und 50 ul einer 0,6 uM-Lösung des gereinigten Anti-Peptid-N-Antikörpers, der in der oben beschriebenen Weise erhalten worden war, vermischt, worauf die Reaktion zwischen diesen bei 4ºC 20 min durchgeführt wurde, um so Renin-aktive Substanzen durch die Reaktion der entsprechenden gemischten Antikörper mit Human- Prorenin herzustellen.
  • REFERENZBEISPIEL 1 (1) Herstellung von Enzym-markiertem Angiotensin I
  • Eine 5 mg-Portion von Meerrettichperoxydase (ein Produkt von Boehringer Mannheim Co.) wurde in einer 0,2 M Phosphat-Pufferlösung gelöst und die Lösung wurde mit 1 ml einer 2,5%igen wäßrigen Glutaraldehyd-Lösung zur Durchführung der Reaktion vermischt, worauf sich eine Gelitration zur Entfernung von nicht-umgesetztem Glutaraldehyd anschloß.
  • Danach wurde diese Lösung mit 130 ul einer wäßrigen Lösung, die durch Lösen von 1 mg synthetischem Angiotensin I (ein Produkt von Peptide Laboratories) in 1 ml gereinigtem Wasser hergestellt worden war, vermischt, um die Reaktion durchzuführen; anschließend erfolgte der Zusatz einer 0,2 M wäßrigen Lysin-Lösung, um die Reaktion zu beenden. Das nicht umgesetzte Angiotensin I wurde aus der Lösung entfernt, indem eine weitere Gelfiltrationsbehandlung durchgeführt wurde, wobei 1,5 ml einer Lösung des Enzymmarkierten Angiotensins I erhalten wurden.
  • (2) Herstellung eines Anti-Angiotensin I-Antikörpers
  • Eine 3,6 mg-Portion des synthetischen Angiotensin I wurde in einer 0,2 M Phosphat-Pufferlösung gelöst und dieser Lösung wurde tropfenweise eine Lösung zugesetzt, die durch Lösen von 3,6 mg N-(γ-Maleinimidobutyroxy)succimid in Tetrahydrofuran hergestellt worden war, um so die Reaktion bei 30ºC über 30 min durchzuführen. Anschließend erfolgte die Zugabe von Ethylalkohol und Diethylether und ein 10-minütiges Stehenlassen bei -80ºC, um Kristalle auszufällen, die dann zweimal mit Diethylether gewaschen wurden, wobei ein Komposit des Angiotensin I und des N-(γ-Maleinimidobutyroxy)succimids erhalten wurde.
  • Getrennt davon wurde eine 10 mg-Portion Rinderserumalbumin in 2 ml einer 0,2 M Tris-Hydrochlorid-Pufferlösung mit pH 8,6, die 8 M Harnstoff enthielt, gelöst. Die Lösung wurde mit 15 umol Dithiotreitol (ein Produkt von Sigma Co.) zur Durchführung der Reaktion bei 37ºC für 1 h vermischt. Anschließend erfolgte der Zusatz von 3 ml einer 10%igen Trichloressigsäure, um einen Feststoff auszufällen, der dann dreimal mit destilliertem Wasser unter Erhalt von reduziertem Rinderserumalbumin gewaschen wurde.
  • Als nächstes wurde das komposit aus Angiotensin I und N-(γ-Maleinimindobutyroxy)succimid und das reduzierte Rinderserumalbumin gemeinsam in 1,5 ml 0,2 M wäßriger EDTA-Na-Lösung, die 6 M Harnstoff enthielt, zur Durchführung der Reaktion bei 25ºC für 2 h gelöst. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch einer Dialyse unterworfen, wobei ein Komplex aus dem Angiotensin I und Rinderserumalbumin als immunogenem Antigen erhalten wurde. Diese Lösung wurde bis zur Verwendung zur Immunisierung von Testtieren bei -80ºC gelagert.
  • (3) Anti-Angiotensin-I-Antikörper
  • Durch die Behandlung des Komplexes aus dem Angiotensin I und Rinderserumalbumin als das immunogene Antigen in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 wurde ein Antiserum hergestellt.
  • (4) Anti-Angiotensin-I-Antikörper-Platte
  • Der oben genannte Anti-Angiotensin I-Antikörper wurde mit einer 0,05 M Natriumhydrogencarbonat-Lösung mit pH 9,6 auf das 5000- fache verdünnt. Eine 100 ul-Portion der Lösung wurde in jede Vertiefung einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen (ein Produkt von Gleiner Co.) gegeben und bei 4ºC 16 h lang zur Immobilisierung an der Mikroplatte stehengelassen. Eine 200 ul-Portion einer Phosphat- Pufferlösung, die 1% Rinderserumalbumin enthielt, wurde dann in jede Vertiefung der Mikroplatte, die den immobilisierten Anti-Angiotensin I-Antikörper trug, gegeben.
  • (5) Renin-Aktivität der Komplexe
  • Eine 50 ul-Portion einer 0,6 nM-Human-Prorenin-Lösung wurde mit 50 ul einer 0,6 um-Lösung des affinitätschromatographisch gereinigten Anti-Peptid-M- oder -C-Antikörpers vermischt und die Reaktion 20 h lang bei 4ºC durchgeführt, um einen Komplex zu bilden. Das Reaktionsgemisch wurde mit. 100 ul eines Angiotensin-Reagenzes vermischt, um bei 37ºC 16 min eine Reaktion durchzuführen, worauf die Beendigung der Reaktion durch Überführung des Gemisches in ein Eisbad folgte.
  • Danach wurde das Gemisch mit 100 ul der oben beschriebenen Lösung des Enzymmarkierten Angiotensin I vermischt. Eine 100 ul- Portion des Gemisches wurde auf in die Vertiefungen der oben genannten Anti-Angiotensin I-Antikörper-Platte überführt, worauf 2 h lang bei 250C leicht verwirbelt wurde.
  • Außerdem wurde eine 200 ul-Portion eines chromogenen Reagenzes zur Entwicklung einer Farbe durch Reaktion bei 25ºC über 5 min in jede Vertiefung gegeben. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 ul einer 1 N Phosphorsäure-Lösung beendet. Die Lichtabsorption wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm unter Verwendung eines Kolorimeters bestimmt.
  • Als positive Kontrolle wurde dasselbe Verfahren, wie es oben beschrieben ist, durchgeführt, wobei 100 ul des vollständig gereiften Renins verwendet wurden. Als negative Kontrolle wurde außerdem dasselbe Verfahren, wie es oben beschrieben wurde, durchgeführt, wobei der Anti-Peptid-M- oder -C-Antikörper, der der Human- Prorenin-Lösung zugegeben worden war, durch dieselbe Menge eines normalen Kaninchenserums ersetzt wurde.
  • Als Resultat der Kontrolltests ergab sich, daß Renin-Aktivität auftrat, wenn das Human-Prorenin einen Komplex mit dem Anti-Peptid- M- oder -C-Antikörper bildete und die Höhe der Renin-Aktivität im wesentlichen auf demselben Niveau ist wie die des vollständig gereiften Renins als positive Kontrolle, wohingegen keine Renin- Aktivität von dem Human-Prorenin als negativer Kontrolle gezeigt wurde.
  • Diese Resultate stützen die Schlußfolgerung, daß das Human-Prorenin in einen Komplex umgewandelt worden war, der Renin- Aktivität zeigen kann, wenn er an den Anti-Peptid-M- oder -C-Antikörper gebunden ist.
  • SEQUENZPROTOKOLL
  • < 110> Ishida, Yuichi
  • Tokiwa Chemical Industries Co., Ltd.
  • < 120> Renin-aktive Substanz
  • < 130> 99-116 TKK
  • < 140>
  • < 141>
  • < 150> JP 10-291124
  • < 151> 13.10.1998
  • < 160> 4
  • < 210> 1
  • < 211> 43
  • < 212> PRT
  • < 213> Künstliche Sequenz
  • < 220>
  • < 223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Peptid
  • < 400> 1
  • 210> 2
  • < 211> 16
  • < 212> PRT
  • < 213> Künstliche Sequenz
  • < 220>
  • < 223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Peptid
  • < 400> 2
  • < 210> 3
  • < 211> 15
  • < 2i2> PRT
  • < 213> Künstliche Sequenz
  • < 220>
  • < 223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Peptid
  • < 400> 3
  • < 210> 4
  • < 211> 11
  • < 212> PRT
  • < 213> Künstliche Sequenz
  • < 220>
  • < 223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Peptid
  • < 400> 4

Claims (6)

1. Renin-aktive Substanz, die ein Komplex ist, der aus Human- Prorenin und einem Anti-Peptid-Antikörper gebildet ist, welcher eine Aminosäuresequenz, bestehend aus mindestens 15 Aminosäureresten in einer Aminosäuresequenz, bestehend aus 33 Aminosäureresten zwischen dem Isoleucinrest in Position 11 und dem Argininrest in Position 43 in dem Human-Prorenin-Profragment, das eine Aminosäuresequenz hat, die aus 43 Aminosäureresten besteht, wie sie in Sequenz ID No. 1 definiert ist, spezifisch erkennen kann.
2. Renin-aktive Substanz, die ein Komplex ist, der aus Human- Prorenin und einem Gemisch aus einem ersten Anti-Peptid- Antikörper, der eine Aminosäuresequenz, bestehend aus mindestens 15 Aminosäureresten in einer Aminosäuresequenz, bestehend aus 33 Aminosäureresten zwischen dem Isoleucinrest in Position 11 und dem Argininrest in Position 43 in dem Human-Prorenin-Profragment, das eine Aminosäuresequenz hat, die aus 43 Aminosäureresten besteht, wie sie in Sequenz ID No. 1 definiert ist, spezifisch erkennen kann, und einem zweiten Anti-Peptid-Antikörper, der eine Aminosäuresequenz, bestehend aus 11 Aminosäureresten zwischen dem Leucinrest in Position 1 und dem Isoleucinrest in Position 11 in dem Human-Prorenin-Profragment, wie sie in Sequenz ID No. 4 definiert ist, spezifisch erkennen kann, gebildet ist.
3. Renin-aktive Substanz nach Anspruch 1, wobei der Anti-Peptid-Antikörper eine Aminosäuresequenz, bestehend aus 16 Aminosäure in dem Human-Prorenin-Profragment, das eine Aminosäuresequenz hat, die aus 43 Aminosäureresten besteht, zwischen dem Isoleucinrest in Position 11 und dem Argininrest in Position 26, wie in Sequenz ID No. 2 definiert, spezifisch erkennen kann.
4. Renin-aktive Substanz nach Anspruch 1, wobei der Anti-Peptid-Antikörper eine Aminosäuresequenz, bestehend aus 15 Aminosäureresten in dem Human-Prorenin-Profragment, das eine Aminosäuresequenz hat, die aus 43 Aminosäureresten besteht, zwischen dem Glycinrest in Position 27 und dem Methioninrest in Position 41, wie in Sequenz ID No. 3 definiert, spezifisch erkennen kann.
5. Renin-aktive Substanz nach Anspruch 2, wobei der erste Anti- Peptid-Antikörper eine Aminosäuresequenz, bestehend aus 16 Aminosäureresten in dem Human-Prorenin-Profragment, das eine Aminosäuresequenz hat, die aus 43 Aminosäureresten besteht, zwischen dem Isoleucinrest in Position 11 und dem Argininrest in Position 26, wie in Sequenz ID No. 2 definiert, spezifisch erkennen kann, und der zweite Anti-Peptid-Antikörper eine Aminosäuresequenz, bestehend aus 11 Aminosäureresten in dem Human-Prorenin-Profragment zwischen dem Leucinrest in Position 1 und dem Isoleucinrest in Position 11, wie sie in Sequenz ID No. 4 definiert ist, spezifisch erkennen kann.
6. Renin-aktive Substanz nach Anspruch 2, wobei der erste Anti- Peptid-Antikörper eine Aminosäuresequenz, bestehend aus 15 Aminosäureresten in dem Human-Prorenin-Profragment, das eine Aminosäuresequenz hat, die aus 43 Aminosäureresten besteht, zwischen dem Glycinrest in Position 27 und dem Methioninrest in Position 41, wie in Sequenz ID No. 3 definiert, spezifisch erkennen kann, und der zweite Anti-Peptid-Antikörper eine Aminosäuresequenz, bestehend aus 11 Aminosäureresten in dem Human-Prorenin-Profragment zwischen dem Leucinrest in Position 1 und dem Isoleucinrest in Position 11, wie sie in Sequenz ID No. 4 definiert, spezifisch erkennen kann.
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