Hintergrund der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Renin-aktive Substanz,
die enzymatische Aktivität oder insbesondere Renin-Aktivität
aufweist, und zwar in Form einer Kombination aus dem
Human-Prorenin und einem spezifischen Anti-Peptid-Antikörper, der zur
Bildung eines Immunkomplexes durch Kombination mit dem
Profragment-Peptid von Human-Prorenin fähig ist.
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Prorenin wird hauptsächlich in der Niere als Vorstufe des vollständig
gereiften Renins oder als das vollständig gereiftes Renin, das ein
Profragment mit einer Sequenz aus 43 Aminosäureresten am N-
Ende davon gebunden hat, produziert und ins Blut freigesetzt.
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Während die Konzentration dieses Prorenins im Blut etwa 10-mal
höher ist als die des vollständig gereiften Renins, weist das Prorenin
per se keine enzymatische Aktivität auf, so daß es übliche Praxis ist,
dasselbe in das vollständig gereifte Renin zu überführen, indem der
Profragment-Teil mit einer Protease wie z. B. Trypsin und Pepsin
abgespalten wird.
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Vor einigen Jahren wurden auch nicht enzymatische Verfahren
vorgeschlagen. Z. B. wird ein Verfahren zur Aktivierung bei niedriger
Temperatur in saurem Zustand ohne Veränderung der
Primärstruktur in Nature, Band 288, Seiten 702-705 (1980); Journal of
Biological Chemistry, Band 262, Seiten 2472-2477 (1987);
Clinical Chemistry, Band 37, Seiten 1811-1819 (1991); Journal of
Biological Chemistry, Band 267, Seiten 11753-11759 (1992) und
anderswo vorgeschlagen. Darüber hinaus wird im Journal of
Biological Chemistry, Band 267, Seiten 22837-22842 (1992) ein Verfahren
beschrieben, bei dem ein Renin-Inhibitor mit niedrigem
Molekulargewicht mit dem Renin-aktiven Teil des Prorenins, der in der tiefen
Rille der dreidimensionalen Struktur verborgen ist, in Kombination
gebracht wird, um dieselbe in den offenen Typ zu überführen, so
daß ein Antikörper, der die Nachbarschaft des aktiven Teils des
vollständig gereiften Renins erkennen kann, damit kombiniert werden
kann.
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Obgleich viele Artikel über das Thema der Bildung eines
Immunkomplexes, der entsteht, wenn der Anti-Zwischenprodukt-Teil und
anti-C-terminale Peptid-Antikörper des Prorenin-Profragments mit
Prorenin kombiniert werden, verfügbar sind, deutet keiner der
Artikel auf die dadurch ausgeübte enzymatische Aktivität hin.
Zusammenfassung der Erfindung
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Dementsprechend besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung
in der Bereitstellung einer neuen Renin-aktiven Substanz durch
Verwendung eines Anti-Peptid-Antikörpers, der eine spezifische
Aminosäuresequenz innerhalb des Human-Prorenin-Profragments
erkennen kann.
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Die Erfinder konnten erfolgreich eine Renin-aktive Substanz
bereitstellen, die ein Komplex aus dem Human-Prorenin und einem
Antikörper ist, wobei der Antikörper in spezifischer Weise als Antigen
ein Peptid erkennen kann, das eine Aminosäuresequenz am
N-terminalen Teil des Prorenin-Profragments hat und das aus 15
Aminosäureresten zwischen dem Leucinrest in Position 1 und dem
Argininrest in Position 15 besteht.
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Weitere Untersuchungen haben die Erfinder zur Vervollständigung
der vorliegenden Erfindung auf der Grundlage verschiedener
unerwarteter Feststellungen geführt. Erstens wird eine Renin-aktive
Substanz erhalten, indem das Human-Prorenin mit einem
Antikörper kombiniert wird, welcher in spezifischer Weise ein Peptid
erkennen kann, das eine Aminosäuresequenz hat, die innerhalb der
Aminosäuresequenz liegt, die aus den 33 Aminosäureresten des
Human-Prorenin-Profragments zwischen dem Isoleucinrest in
Position 11 und dem Argininrest in Position 43 besteht. Zweitens kann
durch einen Komplex des Human-Prorenins mit einem gemischten
Antikörper, der aus dem oben beschriebenen Antikörper und
äquivalenten oder äquimolaren Mengen eines zweiten
Anti-Peptid-Antikörpers, der in spezifischer Weise eine Aminosäuresequenz erkennen
kann, die aus den 11 Aminosäureresten im
Human-Prorenin-Profragment zwischen dem Leucinrest in der Position 1 und dem
Isoleucinrest in Position 11 besteht, eine Verbesserung der Renin-Aktivität
verglichen mit der Kombination des Human-Prorenins und jedem
der entsprechenden einzelnen Anti-Peptid-Antikörper erreicht
werden.
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Somit stellt die vorliegende Erfindung nach einem ersten Aspekt
einen Komplex des Human-Prorenin mit einem
Anti-Peptid-Antikörper bereit, welcher eine Aminosäuresequenz, bestehend aus
mindestens 15 Aminosäureresten in einer Aminosäuresequenz,
bestehend aus den 33 Aminosäureresten zwischen dem Isoleucinrest
in Position 11 und dem Argininrest in Position 43 im
Human-Prorenin-Profragment, das eine Aminosäuresequenz hat, die aus 43
Aminosäureresten besteht, spezifisch erkennen kann.
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Die vorliegende Erfindung stellt ferner nach einem zweiten Aspekt
der Erfindung eine Renin-aktive Substanz bereit, die ein Komplex
des Human-Prorenins und eines gemischten Antikörpers ist, welcher
aus äquimolaren Mengen eines ersten Anti-Peptid-Antikörpers, der
eine Aminosäuresequenz, bestehend aus mindestens 15
Aminosäureresten in einer Aminosäuresequenz, bestehend aus den 33
Aminosäureresten zwischen dem Isoleucinrest in Position 11 und
dem Argininrest in Position 43 in dem
Human-Prorenin-Profragment, das eine Aminosäuresequenz hat, die aus 43
Aminosäureresten besteht, spezifisch erkennen kann, und einem zweiten Anti-
Peptid-Antikörper, der eine Aminosäuresequenz, bestehend aus 11
Aminosäureresten innerhalb des oben beschriebenen
Human-Prorenin-Profragments zwischen dem Leucinrest in Position 1 und dem
Isoleucinrest in Position 11 spezifisch erkennen kann, besteht.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Fig. 1 ist ein Diagramm, das die Resultate der
Western-Blot-Analyse des Human-Prorenins und des vollständig gereiften Renins
zeigt.
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Fig. 2 ist ein Diagramm, welches das Bindungsvermögen des Anti-
Peptid-Antikörpers an dem Profragment-Zwischenprodukt-Teil mit
Prorenin als Funktion der Reaktionszeit zeigt.
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Fig. 3 ist ein Diagramm, das das Bindungsvermögen des Anti-
Peptid-Antikörpers am Profragment-C-terminalen Teil mit Prorenin
als Funktion der Reaktionszeit zeigt.
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Fig. 4 ist ein Balkendiagramm, das die Renin-Aktivität der
Komplexe aus Anti-Peptid-Antikörpern und Human-Prorenin zeigt.
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Fig. 5 ist ein Balkendiagramm, das die relativen Aktivitätsgrade bei
Komplexen von Human-Prorenin mit verschiedenen Anti-Peptid-
Antikörpern zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER
AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die vorliegende Erfindung stellt eine Renin-aktive Substanz bereit,
die ein Komplex zwischen einem Anti-Peptid-Antikörper und
Human-Prorenin
ist, der durch die Spezifität des
Anti-Peptid-Antikörpers gekennzeichnet ist, nähmlich daß der Anti-Peptid-Antikörper in
spezifischer Weise ein Peptid erkennt, das eine Aminosäuresequenz,
bestehend aus mindestens 15 Aminosäureresten an beliebigen
Positionen innerhalb der Aminosäuresequenz, bestehend aus 33
Aminosäureresten zwischen dem Isoleucinrest in Position 11 und dem
Argininrest in Position 43 in dem Human-Prorenin-Profragment hat.
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Stark erhöhte Renin-Aktivität kann erzielt werden, indem ein
gemischter Antikörper verwendet wird, der aus äquimolaren Mengen des
oben beschriebenen Anti-Peptid-Antikörpers und einem zweiten
Anti-Peptid-Antikörper besteht, wobei der letztgenannte in
spezifischer Weise eine Aminosäuresequenz erkennen kann, die aus 11
Aminosäureresten im oben beschriebenen
Human-Prorenin-Profragment zwischen dem Leucinrest in Position 1 und dem
Isoleucinrest in Position 11 besteht.
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Dieses Human-Prorenin-Profragment ist eine Substanz mit einer
Aminosäuresequenz, die durch die unten dargestellte Sequenz Nr. 1
dargestellt wird und die im später angegebenen Sequenzprotokoll
aufgelistet ist.
Sequenz Nr. 1
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Die Renin-aktive Substanz der vorliegenden Erfindung kann
hergestellt werden, indem ein erstes Peptid, das im folgenden als Peptid M
bezeichnet wird und das aus 16 Aminosäureresten im Mittelteil des
Prorenin-Profragments, nämlich zwischen dem Isoleucinrest in der
Position 11 und dem Argininrest in der Position 26 besteht, und ein
zweites Peptid, das im folgenden als Peptid C bezeichnet wird und
das aus 15 Aminosäureresten am C-terminalen Ende davon,
nämlich zwischen dem Glycinrest in Position 27 und dem Methioninrest
in Position 41 besteht, synthetisiert werden, wobei beide Peptide
einen Zusatz aus einen Cysrest am C-terminalen Ende aufweisen
und diese beiden Peptide nach dem unten beschriebenen Verfahren
eingesetzt werden.
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Diese Peptide werden jeweils zur Herstellung von immunogenen
Antigenen verwendet, indem sie mit einem Trägerprotein wie z. B.
Rinderserumalbumin, Ovalbumin,
Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin und dgl. kombiniert werden, wobei ein Vernetzungsmittel wie
z. B. eine Maleinimid-Verbindung verwendet wird. Danach werden
die entsprechenden immunogenen Antigene, die mit dem
vollständigen Freundschen Adjuvans vermischt sind, subkutan wiederholt
in Zweiwochenabständen einem ausgewachsenen Kaninchen
verabreicht. Nach der fünfte Verabreichung wird ein kleines
Blutvolumen aus der peripheren Ohrvene entnommen, um den
Antikörperwert zu bestimmen, worauf Ausgeblutet wird, wenn der
Antikörperwert vollständig erhöht ist, um so ein Antiserum zu erhalten. Als
nächstes wird das Antiserum einer Aussalzbehandlung und einer
Reinigungsbehandlung durch Affinitätschromatographie unter
Verwendung von Affinitätsgelen, die die entsprechenden synthetischen
Peptide kombinieren, unterworfen.
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Das Verfahren ab der Herstellung des immunogenen Antigens bis
zur affinitätschromatographischen Reinigung der Antikörper kann
nach einem bekannten Verfahren durchgeführt werden, das z. B. von
S. Ohumi et al. in "Experimental Protocol in Antipeptide Antibodies"
(1994), Seite 48, beschrieben wird.
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Als nächstes wird der Anti-Peptid-Antikörper nach der
affinitätschromatographischen Reinigung zu einer Lösung von
Human-Prorenin, die mit einer physiologischen Salzlösung, die Rinderserum
enthält, verdünnt ist, gegeben, um die Reaktion bei einer
Temperatur von 4ºC für 16 bis 24 h durchzuführen, so daß ein Komplex
erhalten wird.
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Diese Reaktionsgemisch wird dann mit einer Schaf-Angiotensinogen-
Lösung als Human-Renin-Substrat vermischt und bei 37ºC 60 min
inkubiert, um die Reaktion durchzuführen, worauf die Reaktion
durch Abschrecken in einem Eisbad beendet wird, so daß
Angiotensin I im Reaktionsgemisch produziert wird. Daher ist dieser
Komplex eine Substanz, das enzymatische Aktivität oder Renin-Aktivität
zeigen kann.
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Die spezifische Bindung des gereinigten Antikörpers und des
Human-Prorenins kann bestätigt werden, indem die Renin-aktive
Substanz, die auf diese Weise erhalten wird, dem
Western-Blot-Verfahren und der Messung der Protein-Protein-Wechselwirkung durch
Ausnutzung der Oberflächenplasmon-Resonanz unterzogen wird.
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Als nächstes wird jeder der Komplexe mit Schaf-Angiotensinogen als
Renin-Substrat umgesetzt und ein Vergleich der Renin-Aktivität mit
dem Trypsin-behandelten Prorenin als positive Kontrolle und mit
normalen Kaninchenserum als negative Kontrolle anstelle des
Antikörpers durchgeführt.
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Die Resultate dieser Vergleichstest zeigen, daß, während der
Antikörperkomplex Renin-Aktivität aufweist, die der der positiven
Kontrolle entspricht, die negative Kontrolle fast keine Renin-Aktivität
aufweist, so daß daraus geschlossen wird, daß diese Substanz eine
Renin-aktive Substanz ist, die sich von bekannten durch Säure und
niedrige Temperatur aktivierten Substanzen wie auch von durch
einen niedrigmolekularen Renin-Inhibitor geöffneten Substanzen
unterscheidet.
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Fig. 1 der beigefügten Zeichnungen ist ein Diagramm, das die
Resultate der Western-Blot-Analyse zeigt, welche mit Human-Prorenin
und einem vollständig reifen Renin nach einer Trypsin-Behandlung
von Prorenin mit scheinbaren Molekulargewichten von 47 000 bzw.
43 000, wie durch die Pfeile rechts angegeben, als Referenzbeispiele
durchgeführt wurde. Wie in diesem Diagramm dargestellt wird,
werden Flecken in den Bahnen 1 und 3 für das Prorenin gefunden, die
eine Komplexbildung mit den Anti-Peptid-C- bzw. -M-Antikörpern
(siehe unten) bei Wanderungspositionen, die einem
Molekulargewicht von 47 000 entsprechen, anzeigen, während keine Spots in
den Bahnen 2 und 4 für das vollständig gereifte Renin mit den Anti-
Peptid-C- bzw. -M-Antikörpern gefunden werden.
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Die Fig. 2 und 3 sind jeweils ein Diagramm, das die Resultate
der Plasmon-Resonanzanalyse in Resonanzeinheiten (R. E.) bei
verschiedenen Reaktionszeiten als Maß des Bindungsvermögens
zwischen dem Anti-Peptid-Antikörper und Prorenin, bestimmt durch die
Messung der Veränderung in der Oberflächenplasmon-Resonanz
unter Verwendung eines Meßinstruments für die Protein-Protein-
Wechselwirkung (Model BIA Core 100, hergestellt von Pharmacia
Biotech Co.), wobei Human-Prorenin bei einer konstanten
Strömungsrate durch eine Strömungszelle geführt wurde, durch
chemische Bindung des Antikörpers nach der
affinitätschromatographischen Reinigung, zeigt. Fig. 2 betrifft den Anti-Peptid-
Antikörper, der im folgenden als Anti-Peptid-M-Antikörper
bezeichnet wird und der die Aminosäuresequenz, bestehend aus
15 Aminosäureresten im Profragment zwischen dem Glycinrest in
Position 27 und dem Methioninrest in Position 41, in spezifischer
Weise erkennen kann. Die Kurve mit der durchgezogenen Linie und
die Kurve mit der unterbrochenen Linie in jeder dieser Figuren
stellen das Prorenin bzw. die Kontrollpufferlösung dar.
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Wie aus den Figuren verständlich wird, kann für die
Kontrollpufferlösung keine Bindung festgestellt werden, während für jeden der
Anti-Peptid-Antikörper eine Bindung mit Prorenin festgestellt werden
kann.
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Fig. 4 ist ein Balkendiagramm, das die Renin-Aktivität angibt, die
durch den enzymatischen Immunoassay des Angiotensin I bestimmt
wird, welches durch das Enzym oder die Renin-aktive Substanz
produziert wird, wenn Schaf-Angiotensinogen als Renin-Substrat zu
einem Komplex, der durch die Reaktion von Humanprorenin mit
einem Anti-Peptid-Antikörper nach affinitätschromatographischer
erhalten wird, gegeben oder mit ihm umgesetzt wird. Aus dieser
Figur ist zu erkennen, daß, während der Aktivitätsspiegel zwischen
der Renin-Aktivität des durch die Typsin-Behandlung von Prorenin
vollständig gereiften Renins als positive Kontrolle und die Renin-
Aktivität des Komplexes zwischen dem Anti-Peptid-M-Antikörper
oder dem Anti-Peptid-C-Antikörper etwa gleich ist, fast keine Renin-
Aktivität durch die Verwendung von normalem Kaninchenserum
anstelle des Anti-Peptid-Antikörpers als negative Kontrolle gezeigt wird.
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Der daraus gezogene Schluß ist der, daß der
Anti-Peptid-M-Antikörper, der eine Aminosäuresequenz im Mittelteil des Prorenin-
Profragments zwischen der Position 11 und der Position 26 hat, und
der Anti-Peptid-C-Antikörper am C-terminalen Teil davon, der eine
Aminosäuresequenz zwischen der Position 27 und der Position 41
hat, in spezifischer Weise mit Human-Prorenin binden kann und die
so gebildeten Komplexe jeweils Renin-Aktivität aufweisen, so daß sie
jeweils in eine Renin-aktive Substanz umgewandelt werden, die sich
von bisher bekannten aktivierten Materialien deutlich unterscheidet.
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Fig. 5 ist ein Balkendiagramm, das die relativen Renin-Aktivitäten
der Komplexe, einschließlich des Komplexes, der durch Bindung -
mit dem Human-Prorenin - eines gemischten Antikörpers als
äquimolares Gemisch des Anti-Peptid-M-Antikörpers oder Anti-Peptid-C-
Antikörpers und eines anderen Anti-Peptid-Antikörpers, der im
folgenden als Anti-Peptid-N-Antikörper bezeichnet wird, der eine
Aminosäuresequenz, bestehend aus 11 Aminosäureresten zwischen dem
Leucinrest in Position 1 und dem Isoleucinrest in Position 11 im
Human-Prorenin-Profragment in spezifischer Weise erkennt, gebildet
wird, und der Komplexe, die durch Bindung der jeweiligen Anti-
Peptid-Antikörper allein mit dem Human-Prorenin gebildet werden,
wobei der Trypsin-Aktivierungslevel des Prorenins als 100%
verwendet wird, zeigt. Diese Figur zeigt, daß die Renin-Aktivität bei
einem Gemisch aus dem Anti-Peptid-M-Antikörper und dem Anti-
Peptid-N-Antikörper im Vergleich zu dem Anti-Peptid-M-Antikörper
allein um das 1,22-fache erhöht ist und bei einem Gemisch aus dem
Anti-Peptid-C-Antikörper und dem Anti-Peptid-N-Antikörper im
Vergleich zu dem Anti-Peptid-C-Antikörper allein um das 1,52-fach
erhöht ist. Insbesondere die Renin-Aktivität für die Kombination aus
dem Anti-Peptid-C-Antikörper und dem Anti-Peptid-N-Antikörper
erreicht eine Höhe von 128% der bisher bekannten Aktivität bei der
Trypsin-Aktivierung des Prorenins.
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Im folgenden wird die vorliegende Erfindung detaillierter anhand von
Beispielen beschrieben.
BEISPIEL 1
(1) Herstellung des immunogen Antigens Prorenin-Profragment-
Peptid
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Nach der Festphasenmethode, die zur Peptid-Synthese
herkömmlicherweise durchgeführt wird, wurde ein Peptid, bestehend aus 17
Aminosäureresten und mit einer Aminosäuresequenz der Sequenz
Nr. 2, die unten angegeben ist und die im Sequenzprotokoll
aufgeführt ist, unter Anfügung eines Cys-Restes am C-Ende
synthetisiert; das Reaktionsgemisch wurde einer Isolierung und Reinigung
durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie unterworfen.
Sequenz Nr. 2
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Getrennt davon wurde eine 16 mg-Portion Hämocyanin als Träger-
Protein in 1 ml einer 0,1 M Phosphat-Puffer-Lösung mit pH 7,2
gelöst. Die Lösung wurde mit 100 ul einer 15 mg/ml Lösung von
N-(γ-Maleinimdobutyroxy)succinimid in Dimethylformamid
vermischt, um die Reaktion für 3 h bei Raumtemperatur
durchzuführen. Dieses Reaktionsgemisch wurde einer Gel-Filtration
unterzogen, indem das Reaktionsgemisch durch eine Sephadex G-25-
Säule mit einem Innendurchmesser von 15 mm und einer Länge von
300 mm (ein Produkt von Pharmacia Bio Co.) geführt wurde, um
nicht-umgesetztes N-(γ-Maleinimidobutyroxy) succinimid zu
entfernen, worauf eine Elution des Reaktionsproduktes unter
Verwendung einer 0,1 M Phosphat-Pufferlösung mit pH 6,0 als
Elutionsmittel folgte.
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Als nächstes wurde die so erhaltene Eluat-Lösung mit 10 mg des
oben beschriebenen gereinigten Peptids vermischt und die Reaktion
wurde 3 h lang bei Raumtemperatur durchgeführt, um einen Peptid-
Hämocyanin-Komplex als immunogenes Antigen zu erhalten. Das so
erhaltene immunogene Antigen des Profragment-Peptids im Mittelteil
wurde bei -80ºC bis zur Verwendung gelagert.
(2) Herstellung eines Anti-Peptid-Antikörpers
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Das immunogene Antigen des Profragment-Peptids, das im oben
beschriebenen Verfahren (1) erhalten worden war, wurde in
physiologischer Salzlösung zu einer Konzentration von 1 mg Protein/ml
gelöst und die Lösung wurde mit einer äquivalenten Menge
vollständigen Freundschen Adjuvans vermischt. Die gemischte Lösung
wurde in Portionen an verschiedenen Stellen eines Kaninchens des
weißen New Zealand-Stamms mit einem Körpergewicht von etwa
2,5 kg injiziert.
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Danach wurde die subkutane Injektionsbehandlung des Kaninchens
mit dem immunogenen Antigen in Zweiwochen-Intervallen jeweils
mit einer Dosis, die auf die Hälfte der Dosis bei der ersten Injektion
verringert war, wiederholt, bis sich ein vollständig erhöhter
Antikörperwert eingestellt hatte; danach wurde zur Herstellung eines
Antiserums ausgeblutet.
(3) Herstellung von gereinigtem Antikörper durch
Affinitätschromatographie
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Eine affinitätschromatograhische Säule mit einem Volumen von 3 ml
wurde durch chemisches Binden einer 1 mg-Portion des gereinigten
Peptids, das gemäß (1) erhalten worden war, an 3 ml eines
Amingebundenen Gels (Affigel 102, ein Produkt von Biorad Co.), unter
Verwendung von N-(γ-Maleinimidobutyroxy)succimid hergestellt.
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Als nächstes wurde eine 10 ml-Portion des in (2) oben erhaltenen
Antiserums mit einer 0,1 M Phosphat-Pufferlösung mit pH 7,0
vermischt und das Gemisch wurde einer Fraktionierungspräzipitation
unter Verwendung einer 50%igen Ammoniumsulfat-Lösung
unterzogen, wobei die IgG-Fraktion gesammelt wurde. Diese Fraktion
wurde durch Zugabe von 10 ml der 0,1 M Phosphatpuffer-Lösung
solubilisiert und einer 15-stündigen Dialyse bei 4ºC unter
Verwendung von 2000 ml derselben Pufferlösung unterworfen.
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Das ganze Volumen der IgG-Lösung nach der Dialyse wurde durch
die oben beschriebene affinitätschromatographische Säule mit einem
Volumen von 2 ml geleitet, um sie von nicht-adsorbierten Fraktionen
völlig zu befreien; der adsorbierte Antikörper wurde mit einer 0,1 M
Glycinhydrochlorid-Lösung mit pH 2,5 gelöst, worauf sich
unverzüglich eine Neutralisierung mit einer 1 M Tris-Pufferlösung
anschloß.
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Der so erhaltene Anti-Peptid-M-Antikörper wurde in gefrorenem
Zustand bis zur Fraktionierung zur Verwendung gelagert.
(4) Herstellung einer Renin-aktiven Substanz
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Nach einem bekannten Verfahren, das in Journal of Hypertensions,
Band 4, Seiten 388-390 (1986) beschrieben wird, wurden cDNA von
Prorenin, das aus menschlicher Niere stammte, in einen
Expressionsvektor eingeführt und in Eierstockzellen eines chinesischen
Hamsters, die im folgenden CHO-Zellen bezeichnet werden,
eingebaut. Darauf folgte eine Kultivierung in Eagles-Kulturmedium
nach dem modifizierten Dulbecco-Verfahren, das 10% eines
embryonalen Rinderserums enthielt. Nach vollständigem Wachstum der
CHO-Zellen folgt ein Ersatz von serumfreiem Kulturmedium, wobei
ein Kulturüberstand erhalten wurde, der rekombiniertes Human-
Prorenin enthielt.
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Der so erhaltene CHO-Kulturüberstand wurde einer dialytischen
Reinigung mit einer Phosphat-gepufferten physiologischen Salzlösung,
die 5 mM EDTA enthielt, unterworfen.
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Als nächstes wurde eine etwa 8 ng-Portion dieses Human-Prorenins
einer Elektrophorese nach einem herkömmlichen Verfahren an
einem SDS-Polyacrylamid-Gel in einer Konzentration von 7,5%
unterzogen. Danach folgte die Transkription auf einem
Nitrocellulose-Film, um eine Reaktion und Bindung mit dem
affinitätsgereinigtem Antikörper des Peptids im Zwischenteil des Profragments,
das in (3) wie oben beschrieben erhalten worden war,
durchzuführen.
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Dieses Reaktionsprodukt wurde durch Farbentwicklung unter
Verwendung eines ABC-Kits (ein Produkt von Vector Laboratory Co.)
analysiert, um zu bestätigen, daß der Antikörper an der
Transferposition des Human-Prorenin gebunden war.
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Getrennt davon wurde eine 8 nM-Lösung des Human-Prorenins,
gelöst in einer Phosphat-Pufferlösung, mit einer
Strömungsgeschwindigkeit von 10 ul/min durch eine Strömungszelle (ein Produkt
von Pharmacia Biotech Co.) nach Amin-Kupplung des
affinitätschromatographisch gereinigten Antikörpers, der in (3) erhalten
worden war, geleitet und die Änderungen in der
Oberflächenplasmon-Resonanz wurden unter Verwendung eines Meßgeräts für
Protein-Protein-Wechselwirkung beobachtet, um den Bindungszustand
zwischen dem Human-Prorenin und dem
affinitäschromatographisch gereinigten Antikörper zu untersuchen, was zu dem Schluß
führte, daß zwischen diesen ein Komplex gebildet worden war.
BEISPIEL 2
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Nach der Festphasenmethode, die herkömmlicher Weise zur Peptid-
Synthese eingesetzt wird, wurde ein Peptid, bestehend aus 16
Aminosäureresten und mit einer Aminosäuresequenz der Sequenz Nr. 3,
die unten dargestellt ist und im Sequenzprotokoll aufgelistet ist,
unter Anfügung eines Cys-Restes an das C-Ende synthetisiert, und
daraus wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 ein Peptid-
Hämocyanin-Komplex hergestellt.
Sequenz Nr. 3
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Als nächstes wurde aus diesem immunogenen Antigen in der
gleichen Weise wie in Beispiel 1 ein Antiserum hergestellt, worauf sich
eine Behandlung mit einer affinitätschromatographischen Säule, die
unter Verwendung des gereinigten Peptids hergestellt worden war,
durchgeführt, um einen gereinigten Anti-Peptid-C-Antikörper zu
erhalten.
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Der so erhaltene gereinigte Antikörper wurde mit dem
Human-Prorenin, das in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 erhalten worden
war, umgesetzt, wodurch eine Renin-aktive Substanz hergestellt
wurde.
BEISPIEL 3
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Nach der Festphasenmethode, die herkömmlicherweise zur Peptid-
Synthese eingesetzt wird, wurde ein Peptid, bestehend aus 12
Aminosäureresten und mit einer Aminosäuresequenz der Sequenz Nr. 4,
die unten dargestellt ist und die im Sequenzprotokoll aufgeführt ist,
unter Anfügung eines Cys-Restes am C-Ende synthetisiert. Daraus
wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 ein
Peptid-Hämocyanin-Komplex hergestellt, der als immunogenes Antigen dienen
soll.
Sequenz Nr. 4
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Als nächstes wurde aus diesem immunogenen Antigen in der
gleichen Weise wie in Beispiel 1 ein Antiserum hergestellt. Darauf folgte
eine Behandlung mit einer affinitätschromatographischen Säule, die
unter Verwendung des gereinigten Peptids hergestellt worden war,
wodurch ein gereinigter Anti-Peptid-M-Antikörper erhalten wurde.
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Eine 50 ul-Portion einer 0,6 uM Human-Prorenin-Lösung wurde mit
50 ul einer 0,6 uM Lösung des gereinigten
Anti-Peptid-M-Antikörpers, der in Beispiel 1 erhalten worden war, oder des gereinigten
Anti-Peptid-C-Antikörpers, der in Beispiel 2 erhalten worden war,
und 50 ul einer 0,6 uM-Lösung des gereinigten
Anti-Peptid-N-Antikörpers, der in der oben beschriebenen Weise erhalten worden war,
vermischt, worauf die Reaktion zwischen diesen bei 4ºC 20 min
durchgeführt wurde, um so Renin-aktive Substanzen durch die
Reaktion der entsprechenden gemischten Antikörper mit Human-
Prorenin herzustellen.
REFERENZBEISPIEL 1
(1) Herstellung von Enzym-markiertem Angiotensin I
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Eine 5 mg-Portion von Meerrettichperoxydase (ein Produkt von
Boehringer Mannheim Co.) wurde in einer 0,2 M Phosphat-Pufferlösung
gelöst und die Lösung wurde mit 1 ml einer 2,5%igen wäßrigen
Glutaraldehyd-Lösung zur Durchführung der Reaktion vermischt,
worauf sich eine Gelitration zur Entfernung von nicht-umgesetztem
Glutaraldehyd anschloß.
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Danach wurde diese Lösung mit 130 ul einer wäßrigen Lösung, die
durch Lösen von 1 mg synthetischem Angiotensin I (ein Produkt von
Peptide Laboratories) in 1 ml gereinigtem Wasser hergestellt worden
war, vermischt, um die Reaktion durchzuführen; anschließend
erfolgte der Zusatz einer 0,2 M wäßrigen Lysin-Lösung, um die
Reaktion zu beenden. Das nicht umgesetzte Angiotensin I wurde aus der
Lösung entfernt, indem eine weitere Gelfiltrationsbehandlung
durchgeführt wurde, wobei 1,5 ml einer Lösung des
Enzymmarkierten Angiotensins I erhalten wurden.
(2) Herstellung eines Anti-Angiotensin I-Antikörpers
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Eine 3,6 mg-Portion des synthetischen Angiotensin I wurde in einer
0,2 M Phosphat-Pufferlösung gelöst und dieser Lösung wurde
tropfenweise eine Lösung zugesetzt, die durch Lösen von 3,6 mg
N-(γ-Maleinimidobutyroxy)succimid in Tetrahydrofuran hergestellt
worden war, um so die Reaktion bei 30ºC über 30 min
durchzuführen. Anschließend erfolgte die Zugabe von Ethylalkohol und
Diethylether und ein 10-minütiges Stehenlassen bei -80ºC, um
Kristalle auszufällen, die dann zweimal mit Diethylether gewaschen
wurden, wobei ein Komposit des Angiotensin I und des
N-(γ-Maleinimidobutyroxy)succimids erhalten wurde.
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Getrennt davon wurde eine 10 mg-Portion Rinderserumalbumin in
2 ml einer 0,2 M Tris-Hydrochlorid-Pufferlösung mit pH 8,6, die 8 M
Harnstoff enthielt, gelöst. Die Lösung wurde mit 15 umol
Dithiotreitol (ein Produkt von Sigma Co.) zur Durchführung der Reaktion bei
37ºC für 1 h vermischt. Anschließend erfolgte der Zusatz von 3 ml
einer 10%igen Trichloressigsäure, um einen Feststoff auszufällen,
der dann dreimal mit destilliertem Wasser unter Erhalt von
reduziertem Rinderserumalbumin gewaschen wurde.
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Als nächstes wurde das komposit aus Angiotensin I und
N-(γ-Maleinimindobutyroxy)succimid und das reduzierte
Rinderserumalbumin gemeinsam in 1,5 ml 0,2 M wäßriger EDTA-Na-Lösung, die
6 M Harnstoff enthielt, zur Durchführung der Reaktion bei 25ºC für
2 h gelöst. Nach Beendigung der Reaktion wurde das
Reaktionsgemisch einer Dialyse unterworfen, wobei ein Komplex aus dem
Angiotensin I und Rinderserumalbumin als immunogenem Antigen
erhalten wurde. Diese Lösung wurde bis zur Verwendung zur
Immunisierung von Testtieren bei -80ºC gelagert.
(3) Anti-Angiotensin-I-Antikörper
-
Durch die Behandlung des Komplexes aus dem Angiotensin I und
Rinderserumalbumin als das immunogene Antigen in der gleichen
Weise wie in Beispiel 2 wurde ein Antiserum hergestellt.
(4) Anti-Angiotensin-I-Antikörper-Platte
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Der oben genannte Anti-Angiotensin I-Antikörper wurde mit einer
0,05 M Natriumhydrogencarbonat-Lösung mit pH 9,6 auf das 5000-
fache verdünnt. Eine 100 ul-Portion der Lösung wurde in jede
Vertiefung einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen (ein Produkt von
Gleiner Co.) gegeben und bei 4ºC 16 h lang zur Immobilisierung an
der Mikroplatte stehengelassen. Eine 200 ul-Portion einer Phosphat-
Pufferlösung, die 1% Rinderserumalbumin enthielt, wurde dann in
jede Vertiefung der Mikroplatte, die den immobilisierten
Anti-Angiotensin I-Antikörper trug, gegeben.
(5) Renin-Aktivität der Komplexe
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Eine 50 ul-Portion einer 0,6 nM-Human-Prorenin-Lösung wurde mit
50 ul einer 0,6 um-Lösung des affinitätschromatographisch
gereinigten Anti-Peptid-M- oder -C-Antikörpers vermischt und die Reaktion
20 h lang bei 4ºC durchgeführt, um einen Komplex zu bilden. Das
Reaktionsgemisch wurde mit. 100 ul eines Angiotensin-Reagenzes
vermischt, um bei 37ºC 16 min eine Reaktion durchzuführen,
worauf die Beendigung der Reaktion durch Überführung des
Gemisches in ein Eisbad folgte.
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Danach wurde das Gemisch mit 100 ul der oben beschriebenen
Lösung des Enzymmarkierten Angiotensin I vermischt. Eine 100 ul-
Portion des Gemisches wurde auf in die Vertiefungen der oben
genannten Anti-Angiotensin I-Antikörper-Platte überführt, worauf
2 h lang bei 250C leicht verwirbelt wurde.
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Außerdem wurde eine 200 ul-Portion eines chromogenen Reagenzes
zur Entwicklung einer Farbe durch Reaktion bei 25ºC über 5 min in
jede Vertiefung gegeben. Die Reaktion wurde durch Zugabe von
100 ul einer 1 N Phosphorsäure-Lösung beendet. Die
Lichtabsorption wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm unter Verwendung
eines Kolorimeters bestimmt.
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Als positive Kontrolle wurde dasselbe Verfahren, wie es oben
beschrieben ist, durchgeführt, wobei 100 ul des vollständig gereiften
Renins verwendet wurden. Als negative Kontrolle wurde außerdem
dasselbe Verfahren, wie es oben beschrieben wurde, durchgeführt,
wobei der Anti-Peptid-M- oder -C-Antikörper, der der Human-
Prorenin-Lösung zugegeben worden war, durch dieselbe Menge eines
normalen Kaninchenserums ersetzt wurde.
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Als Resultat der Kontrolltests ergab sich, daß Renin-Aktivität
auftrat, wenn das Human-Prorenin einen Komplex mit dem Anti-Peptid-
M- oder -C-Antikörper bildete und die Höhe der Renin-Aktivität im
wesentlichen auf demselben Niveau ist wie die des vollständig
gereiften Renins als positive Kontrolle, wohingegen keine Renin-
Aktivität von dem Human-Prorenin als negativer Kontrolle gezeigt
wurde.
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Diese Resultate stützen die Schlußfolgerung, daß das
Human-Prorenin in einen Komplex umgewandelt worden war, der Renin-
Aktivität zeigen kann, wenn er an den Anti-Peptid-M- oder
-C-Antikörper gebunden ist.
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SEQUENZPROTOKOLL
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< 110> Ishida, Yuichi
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Tokiwa Chemical Industries Co., Ltd.
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< 120> Renin-aktive Substanz
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< 130> 99-116 TKK
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< 140>
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< 141>
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< 150> JP 10-291124
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< 151> 13.10.1998
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< 160> 4
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< 210> 1
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< 211> 43
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< 212> PRT
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< 213> Künstliche Sequenz
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< 220>
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< 223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Peptid
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< 400> 1
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210> 2
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< 211> 16
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< 212> PRT
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< 213> Künstliche Sequenz
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< 220>
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< 223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Peptid
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< 400> 2
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< 210> 3
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< 211> 15
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< 2i2> PRT
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< 213> Künstliche Sequenz
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< 220>
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< 223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Peptid
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< 400> 3
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< 210> 4
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< 211> 11
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< 212> PRT
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< 213> Künstliche Sequenz
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< 220>
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< 223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Peptid
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< 400> 4